猪血清检测

3月17日讯，近日，西藏检验检疫局技术中心收到国家认监委颁发《能力验证合格实验室证书》。根据该证书，西藏检验检疫局技术中心参加的由国家认监委组织开展的猪伪狂犬病血清抗体ELISA试验(CNCA-09-A01-26)能力验证项目，结果为满意。这是西藏检验检疫局在重大动物疫病检测方面首次通过国家认监委组织的能力验证，标志着西藏检验检疫局已具备了检测猪伪狂犬病血清抗体的能力和水平。 　　猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的多种家畜和野生动物的一种高度接触性、急性传染病。猪是伪狂犬病的唯一自然宿主，对其危害大。 往往是分娩高峰的母猪会首先发病，窝发病率可达100%。可致妊娠母猪流产，产死胎及胎儿干尸化。对初生仔猪则引起神经症状，出现运动失调，麻痹，衰竭死亡，病死率100%。成年猪多呈隐性感染，但可引起呼吸道症状。

血清学检测是许多健康问题诊断过程中的关键检测方法，包括器官移植筛查，交叉匹配，疾病诊断，监测等。这些检测在临床决策中起着至关重要的作用，免疫分析是目前可用的最强大，最灵敏的血清学检测方法之一，它基于抗原抗体之间的高度特异性结合，即使在低浓度下也能进行定性和定量检测。有多种免疫测定方法，以下是其中最常见两种检测方法示意图，分别是夹心法（图1A）和直接法（图1B），当选择用于夹心法检测的抗人二抗时（图1A），需要考虑一抗的种属，并使用与该物种有最小交叉反应的二抗。图1：测定方式：A.夹心法，B.直接法免疫分析在多种疾病诊断起重要作用各类免疫测定技术各有优缺点，例如，快速测定法（如胶体金侧向流动法）可在数min 内提供定性结果，可进行即时检测，而ELISA可能需要花费数小时才能完成，但可提供定量数据。而当前严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）大流行更加凸显了侧向流动分析的优势，由于该疾病具有快速传播和较高的死亡率等特征，美国FDA已采取相关措施，允许各州未经FDA批准就可开展新的SARS-CoV-2检测。该修订允许使用快速检测试剂盒，该试剂盒定性检测患者针对SARS-CoV-2产生的IgG和IgM抗体，从而显著加大了SARS-CoV-2的检测能力，尽可能地减少病毒的传播。尽管侧向流动检测具有明显的优势，但这种分析方法无法提供定量的数据。表1.几种类型的免疫测定法的优缺点，检测过程，检测的Ig类型免疫测定方法检测过程可检测免疫球蛋白亚型快速测试/横向流动（胶体金）胶体金层析试纸条主要由4个部分组成：在样品区滴加样品后，借助毛细作用，样品泳动至玻璃纤维膜，金标复合物溶解，并与样品进行抗原抗体反应，形成复合物，继续泳动至硝酸纤维素膜的检测区，带有金标记的复合物被检测区抗原或抗体捕获，呈现条带。而质控线不管有无目的样本，都会与金标抗体进行结合并显色，相当于我们的阳性对照，证明金标抗体是正常的。IgG，IgM流式细胞将血清样品添加到带有抗原的细胞或磁珠中，样本中的人源抗体会捕获抗原，再加入荧光探针偶联的二抗（图1B），然后可以通过流式细胞仪分析荧光以给出定量数据。IgG，IgM，IgA流动注射分析（FIA）与流式细胞术相似，将样品注射到含有固定抗原的柱子中，样品中的人源抗体会与抗原结合（图1B），再加入荧光探针或酶偶联抗人的二抗进行检测，用比色或荧光法进行检测。IgG，IgM，IgAELISA法将一抗固定在固体介质表面上，通常是微孔板，随后会捕获抗原（图1A）或将抗原直接包被在板上（图1B），与来自血清的人源抗体结合，加入酶标记的抗人二抗，最后，添加酶底物，从而得到与分析物浓度成正比的比色读数。IgG，IgM，IgA聚合酶链反应（PCR）该过程类似于ELISA，但是第二抗体是与寡核苷酸缀合。然后通过实时PCR进行DNA扩增和检测。IgG，IgM，IgA抗人二抗是各类免疫分析中的关键试剂尽管免疫测定的功能和目的有所不同，但为了在临床上获得准确，可靠数据，开发血清学试剂盒时，高质量试剂至关重要。抗人二抗的质量是开发免疫测定试剂盒时的关键考虑因素，二抗需要谨慎选择，因为它们会结合一种一抗的多个表位上，从而增强了信号的灵敏度和选择性。表2总结了在进行免疫测定选择合适的二抗时需要考虑的多个方面。表2.在免疫分析中选择合适的二抗时的考虑因素以及我们抗体的特征考虑因素Jackson 二抗抗体来源人体样品的血清学检测应使用抗人二抗，以最大程度地减少非特异性结合，以最大程度降低背景信号和假阳性。我们可以提供多种来源的抗人二抗，包括羊驼，驴，山羊，小鼠和兔子。产品类别(完整的IgG还是片段)二抗可以是完整的免疫球蛋白（Ig）G，也可以是F（ab' ）2和Fab片段，完整的IgG分子可适用于大多数检测，而F（ab' ）2和Fab片段可用于避免与具有Fc受体的活细胞的非特异性结合。我们可以提供完整IgG形式的二抗以及F（ab' ）2和Fab片段特异性根据所需免疫测定的特异性，可以制备针对整个Ig分子的二抗，以及针对于Fc或F（ab' ）2结构域特异性的二抗。我们可以提供针对于对整个人源Ig分子的二抗，以及针对于Fc和F（ab' ）2结构域特异性的二抗。亚型大多数免疫测定均只检测IgG型抗体，这种类型抗体占总血清Ig的?75％，是次级免疫反应的一部分。但是，血清中同时也存在IgM和IgA，而且二抗只对同亚型一抗的具有特异性。我们可以提供对IgG，IgM，IgA，IgG+IgM和IgG+IgM+IgA一种或几种亚型有特异性的二抗。亲和纯化和交叉吸附由于在Ig结构域具有高度的结构保守性，建议对抗体进行亲和纯化并进行交叉血清吸附的，以减少交叉反应的可能性。免疫亲和层析可用于分离亲和纯化的抗体。我们可以选择已进行物种交叉吸附的抗体，交叉吸附相关信息会在对应产品说明括号中提供，表示为“ min X”，“X”为相关物种的缩写。偶联标记二抗通常与分子偶联，例如酶，荧光探针或有色颗粒。免疫测定的检测系统将确定标记物的种类。抗人二抗可以与多种标记物偶联，包括生物素，AP，HRP，荧光基团和胶体金纳米颗粒。

有机磷农药中毒的死亡率很高,其重要原因之一是诊断不及时。日本学者Inoue等人研究验证了一种简单快速的新方法——液相色谱法-大气压电离子化-质谱测定法(LC-APCI-MS法),结果证实此方法可以有效测定进入人体血清中的10种有机磷酸盐浓度(J Phar Biomedl Anal 2007, 44: 258)。 　　“液液提取”或“固体萃取”方法是目前临床最常用的有机磷酸盐提取方法,但是对某些特殊成分的化合物如乙酰甲胺磷则无效。 　　Inoue等人采用即液相色谱-质谱联用测定法(LC-MS)研究出一种简单快速的方法用来测定急性中毒患者血清中的10种有机磷农药浓度[乙酰甲胺磷、杀扑磷、敌敌畏、倍硫磷、苯硫磷、敌匹硫磷、甲基乙酯磷(稻丰散)、马拉硫磷、杀螟硫磷、杀螟腈]。这10种有机磷农药在日本使用广泛。 　　具体操作程序如下:使用乙腈脱蛋白后,将每种需检测的生物标本注入一个XTerra MS C18不锈钢试剂盒中,采用10 mmol/L的甲酸铵-甲醇组成的溶剂进行梯度洗脱。 　　结果显示,回收提取率令人满意,绝对回收率为血清标本的82.2%~107.2%,相对回收率为60.0%~108.1%。血清的测定范围(LODs)为0.125~1.000　μg/ml,检测上限为0.25~1.25 μg/ml。从这种检测上限浓度逐渐增加到8 μg/ml时,可以观察到很好的直线相关性。在所有实验标本中,均值在期望浓度的20%范围内,而且相关系数(r2)0.9838。 　　大部分有机磷农药的分析结果显示样本内部和批间分析的精确度、准确度都是令人满意的。从对温度的稳定性角度,对所有有机磷酸盐分析可以发现,敌敌畏和马拉硫磷在室温下就可以最快溶解。杀扑磷和敌匹硫磷在整个为期4周的测定期内对所有温度都相对稳定。 　　该研究证实,将沉淀蛋白法作为样本的提纯程序,这种LC-MS方法快速可行,可以测定人体血清中的有机磷农药,并且在测定血清标本中有机磷农药时具备较高的选择性、敏感性、精确度、准确度、直线性、回归性和稳定性。因此这种简单准确的检测方法,可以成功地应用于临床急性有机磷农药中毒事件中。 　　 用于血清有机磷检测的液相色谱-质谱联用设备