病原菌检测

求助：血清免疫学做病原菌检测会用到哪些仪器设备？有清单最好。跪求各位大神仗义出手相助。

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长期以来，人们对于病原菌耐药的认识基本上停留在特定病原菌对特定抗生素的耐药机制，以及特定抗生素对病原菌的抑菌机理上。然而相关研究表明，在抗生素使用与病原菌耐药水平之间存在着一种宏观的量化关系，即一定范围内的抗生素使用可以导致病原菌整体耐药水平以及耐药菌感染率的变化，这种关系就是抗生素与病原菌之间的量化关系。 有关抗生素与病原菌之间量化关系研究的历史不长，而对其集中、深入的研究也只是近几年才展开的。在发达国家，特别是对抗生素使用严格控制的北欧国家此类研究开展较多，而在发展中国家则基本为空白。造成这一领域研究起步晚，发展不均衡主要有两方面因素。 首先，相关研究需要通过一定范围内大样本的调查，收集、处理各种病原菌和抗生素使用的相关数据。在发达国家，有关病原菌耐药和抗生素使用的监测机构健全，可以方便地获取和处理大量的相关数据，加之有流行病学、统计学、药理学、微生物学以及临床医学等多学科的协作，可以深入、细致、及时地研究抗生素使用与病原菌耐药之间的量化关系。 而在发展中国家，相关的监测机构不健全。以国内为例，目前各级医疗机构有关病原菌耐药的数据和抗生素使用的数据，由不同的职能科室、部门管理，信息交流困难，导致了我们在这一领域中的研究远远落后于发达国家。 第二，不同抗生素剂量单位以及常用剂量差别很大，在大范围研究中无法比较和叠加。早期相关研究只能以抗生素的使用率和抗生素的费用消耗为指标，不能准确反映抗生素的实际使用情况。为解决这一难题，人们用成人每日常用剂量作为标准剂量，将不同抗生素的消耗量换算为统一标准单位，并命名为每日约定剂量（defined daily doses，DDD），以使用的DDD数表示抗生素的消耗量。每一种抗生素消耗量换算成DDD后可以比较和叠加。WHO于1996年推荐采用此方法来研究、监测抗生素的使用情况。正是在这一标准建立后，相关研究在短时间内取得了很大进展。这一领域的研究大致分为以下二类： 1、针对社区居民的大范围研究 此类研究的对象多为一个地区、一个国家，甚至可以是对多个国家的超大规模研究。研究结果对于指导相关国家和地区制定、修改控制抗生素使用的法规，检验相关控制措施的有效性具有重要指导意义。通过不同国家的对比研究还可以探讨自然条件、环境因素、社会因素、经济发展水平对抗生素使用与病原菌耐药水平之间量化关系的影响。 瑞典在1994年设立专门机构，率先启动了一项针对抗生素使用与病原菌耐药的全国性系统工程STRAMA，采取有针对性的措施消除抗生素不合理的使用，若干年后，瑞典抗生素的消耗量减少了22%，病原菌耐药水平也明显降低。 2、针对医疗机构的小范围研究 此类研究主要关注不同医院、不同病区、不同基础疾病条件下抗生素使用与病原菌耐药之间的量化关系，发现并证实了多种抗生素的消耗量与常见病原菌的感染率和耐药率之间存在密切的关系。 此类研究的重点通常是临床常见、对患者威胁最大的病原菌，如金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎球菌和肠球菌，以及临床重点关注的抗生素，如万古霉素、大环内酯类抗生素和第三代头孢菌素等。其研究结果对于指导临床抗感染治疗即控制病原菌耐药水平的上升具有重要实用价值。 一项研究采用多元回归的方法，分析了以色列一家医院6个内科病区抗生素使用与病原菌耐药的数据，结果表明，这些病区阿米卡星和第3代头孢菌素的消耗量与临床耐药菌感染率密切相关。 目前只有为数不多的研究通过改变临床抗生素的使用，降低病原菌的耐药水平和耐药菌的感染率，可以说是这一领域研究的前沿，也是这一领域探索者的希望所在和最终目的。 Landman等通过减少医院中头孢菌素、亚胺培南、克林霉素和万古霉素的使用，增加含β-内酰胺酶抑制剂抗生素的使用，成功地降低了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐头孢他啶肺炎克雷伯菌的感染率。 近期研究还发现，临床增加氨苄西林/舒巴坦的使用量可以明显降低奇异变形杆菌和阴沟肠杆菌的耐药水平；而增加头孢吡肟的使用量可以降低MRSA的感染率。 有研究者曾对其所在医院烧伤病区抗生素使用和病原菌耐药的相关数据进行了统计分析，发现含β内酰胺酶抑制剂类抗生素的使用量与金黄色葡萄球菌耐药水平呈负相关。此外，他们目前已累积了该院烧伤病区8年来临床抗生素使用和病原菌耐药的全部数据，并建成了查询方便的数据库，为进一步进深入研究奠定了基础。 总之，抗生素使用与病原菌结构和耐药水平之间量化关系的研究对于指导临床抗感染治疗、合理使用抗生素，以及制定控制抗生素使用的相关法规具有重要意义，但目前在这一领域有许多方面有待进一步探索。目前国内有关抗生素和病原菌的相关信息的交流存在诸多障碍，这需要包括医疗机构管理者、相关专家以及临床医师共同努力，加强信息交流，通过深入研究抗生素使用与病原菌耐药之间的量化关系，为指导临床抗感染治疗，降低病原菌的耐药水平提供具有实际应用价值的信息。

据美国农业部官方网站消息，美国农业部食品安全与检验局（FSIS）于近日出台了一套有关减少即食食品中的病原菌的指导方案，以帮助小型肉类与禽类产品制造商生产出更高质量的产品。 鉴于2010年的多起与疾病相关的召回事件，FSIS改善了即食肉禽类产品指南，着重强调了造成召回的原因。某些召回事件发生的原因是，产品加工后有病原菌进入其中。该套方案的出台有助于减少这些情况下的污染，例如烹调或调制完后加入酱油或者香料的过程。 该套法规并非针对肉禽类产品生产厂家的强制要求，而是为了帮助小型制造商更好的遵守FSIS现行法规。FSIS将在重要指南文件中公布此套指导方案。

植物病原菌毒素的种类、作用机理和应用前景

2011年4月25日，据美国农业部官方网站消息，美国农业部食品安全与检验局（FSIS）出台一套有关减少即食食品中的病原菌的指导方案，以帮助小型肉类与禽类产品制造商生产出更高质量的产品。鉴于2010年的多起与疾病相关的召回事件，FSIS改善了即食肉禽类产品指南，着重强调了造成召回的原因。某些召回事件发生的原因是，产品加工后有病原菌进入其中。这套方案的出台有助于减少这些情况下的污染，例如烹调或调制完后加入酱油或者香料的过程。这套法规并非针对肉禽类产品生产厂家的强制要求，而是为了帮助小型制造商更好的遵守FSIS现行法规。FSIS将在重要指南文件中公布这套指导方案。更多内容请见：http://www.fsis.usda.gov/News_&_Events/NR_042511_01/index.asp。

国家“863计划”现代农业技术领域研制了一批海水鱼重要病原菌高效疫苗，4种疫苗进行了安全性初步评价，2种基因重组疫苗已获得农业部批准进入安全性评价阶段，有望成为我国海水鱼病害的新型治疗药物。　　构建了包括迟钝爱德华氏菌基因缺失减毒活疫苗、拟态弧菌基因缺失减毒活疫苗、嗜水气单胞菌溶血素ISCOMs疫苗等6种具有良好免疫保护效果的高效疫苗；建立了3种疫苗的中试生产技术工艺；对鳗弧菌基因缺失减毒活疫苗、创伤弧菌及嗜水气单胞菌ISCOMs疫苗、海水鱼哈维氏弧菌病重组外膜蛋白疫苗等4种疫苗进行了安全性评价，初步结果显示四种疫苗具有良好的安全性、稳定性；鳗弧菌基因缺失减毒活疫苗、海水鱼哈维氏弧菌病重组外膜蛋白疫苗的转基因生物安全评价中间试验已获得农业部批准，有望成为我国海水鱼病害的新型治疗药物。

1 沙门氏菌基本概况及食品污染状况沙门氏菌（Salmonella）是一种无芽孢、无荚膜的革兰氏阴性杆菌。除雏鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外，其余都有鞭毛，能运动。多数具有菌毛，能吸附于细胞表面，发酵葡萄糖、麦芽糖和甘露糖产酸产气，不发酵乳糖和蔗糖，不产生吲哚，不分解尿素，多数产硫化氢，不液化明胶，MR、VP 实验阴性（王辉等 2008）。沙门氏菌是肠杆菌科中最重要的病原菌属，目前全世界已发现约 2500 种血清型，这些血清型均可引起食源性疾病（Humphrey 2000）。与人类疾病有关的血清型主要包括伤寒沙门氏菌，甲、乙和丙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸭沙门氏菌和新港沙门氏菌等，其中以鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及猪霍乱沙门氏菌最为常见。在国际上公认的沙门氏菌中有三个血清型以中国地名命名，分别是上海沙门氏菌（Salmonella Shanghai）、自贡沙门氏菌（Salmonella Zigong）和广州沙门氏菌（SalmonellaGuangzhou）（王辉等 2008）。进食被沙门氏菌污染的食品后，沙门氏菌可通过肠道上皮细胞经毛细血管和淋巴管进入血液，导致菌血症和全身感染。同时，沙门氏菌被巨噬细胞胞饮并内化时产生极强的内毒素，从而引起腹泻、发热及肠道炎症反应。沙门氏菌源于家畜、家禽、人类及鼠类的粪便之中，常污染的食品为鸡肉、猪肉、牛肉、鱼肉、香肠、火腿、熏肉制品和鸡蛋等（藤仁明 2007；Schroeter et al. 1994）。孙晓林等（2008）对兰州市肉与肉制品微生物污染状况研究结果表明，生猪胴体和肉样沙门氏菌检出率分别为 7.5%和 14%。洪文展（2005）发现深圳市售肉品沙门氏菌污染率为 26.2%。Capita 等（2003）对西班牙的鸡肉感染沙门氏菌情况做了调查，结果显示 49%的鸡肉含有沙门氏菌。Uyttendaele 等（1997）对比利时禽肉及其制品中沙门氏菌的流行状况研究表明，1993 年沙门氏菌的平均污染率为 19.4%，1994 年为 24.1%，1995 年为21.9%，1996 年为 36.7%。此外，Bosilevac 等（2009）对美国零售牛肉的研究结果、Berends等（1997）对猪胴体及猪肉的研究结果和 Jorgensen 等（2002）对市售生鸡肉沙门氏菌的污染状况研究均表明沙门氏菌广泛存在于食品性动物、动物胴体、零售肉及肉制品食品之中。

细菌的实验室检测方法进展——金黄色葡萄球菌的鉴定方法摘要：金黄色葡萄球菌广泛分布于自然界，多存在于人和动物的鼻腔、咽喉、皮肤及与外界相通的腔道。能引起人和动物机体局部、脏器的化脓性感染，重者可引起败血症、脓毒血症等全身感染。金黄色葡萄球菌也是国内外最常见的细菌性食物中毒病原菌之一，在我国由金黄色葡萄球肠毒素引起的食物中毒占细菌性食物中毒事件的前几位。典型的金黄色葡萄球菌为球型，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌肠毒素被分为7 个血清型，A、B、C（C1、C2、C3）、D、E。目前实验室对金黄色葡萄球菌的检验有传统培养法，金黄色葡萄球菌肠毒素的检测方法，脉冲场凝胶电泳检测分型方法和聚合酶链式反应（PCR）技术对金黄色葡萄球菌的检测方法。

为探讨一起食物中毒的病原菌，按照GB/T4789-2003及WS/T9-1996中食源性致病菌的检验方法，应用mini-VIDAS全自动荧光免疫分析仪等对所采集的食物中毒标本进行检验。结果 25件标本中检出的5株菌均为都柏林沙门氏菌，说明本次食物中毒的病原菌为都柏林沙门氏菌。

[size=4]实验室分为室内质量控制和室间质量评价两个组成部分[color=#ec0078]一、室内质量控制[/color]（一）检验人员的培养1.定期进行新理论、新技术和新方法的业务学习。2.定期进行理论考核和操作技能考核。3.编写作业指导书。（二）仪器设备的功能监测、维修及 保养1.恒温孵箱、水浴箱和冰箱：了解其性能，每天记录温度，定期清理消毒，冰箱定期化霜。恒温孵箱、水浴箱定期检定。2.灭菌器械的效果检测：化学指示剂胶带 嗜热脂肪芽胞杆菌指示菌片 枯草杆菌芽胞3.二氧化碳培养箱：注意CO2含量的监控。4.厌氧箱或厌氧罐：进行厌氧环境监控。美兰指示条，刃天青指示剂5.微生物鉴定仪：a.及时更新系统操作软件。b.定期对仪器的探测部位进行清洁。c.对每批号的鉴定卡、条和板用标准菌株进行测定，并核对每个反应结果。[/size]

目的:建立抗菌中药对临床常见病原性细菌抑菌作用的检测方法。方法:选择6种常用抗菌中药（黄连、苦参、连翘、大黄、生地、知母)，分别采用水提法制备至质量浓度1mg/L。应用液体稀释法测定上述中药对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)。结果:建立了中药抑菌作用的检测方法。黄连、大黄与连翘抑制细菌的作用较强，MIC值均≤0.05mg/L，其中黄连对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强（MIC值为0.00625mg/L）。结论:应用本方法可以进行中药抑菌作用的检测。抗菌中药对所试验菌种表现不同的抑菌作用。【关键词】中草药；微生物敏感性试验；抗菌药；细菌 Study on Antibacteral Effects of Six Chinese Herbs Against Pathogenic Bacteria XUE Jianjiang1,QIAO Haixia2,LIU Jinjun2,et al 1.Clinicial Lab,The First Affilited Hospitial,Hebei North University,Zhangjiakou,075000,Hebei,China 2.Department of Microbiology,Hebei North University,Zhangjiakou,075000,Hebei,China 【ABSTRACT】Objective:To establish a method to detect the antibacterialactivity of traditional chinese medicine against pathegenicbacteria.Methods:Six varieties of traditional chinese medicine(Coptisetc)were selected and extracted with pure water to make concentratedwith 1mg/L.Three different common pathogenic bacteria were used todetermine the minimal inhibitory concentration(MIC)in vitro with liquiddilution method to the selected medicine.Results:The methods wereestablished to detect the antibacterial activity of traditional chinesemedicine.Three herbs had inhibition effects on the strains oftest,among which Coptis Chinesis had the strongest effect and MIC was0.00625g/mL to Staphylococcus aureus.Conclusion:The methods can serveas a reference for the antibacterial activity of traditional chinesemedicine.The degree of inhibition effect for different traditionalchinese medicine on different bacteria were different. 【KEY WORDS】Chinese Herb,Microbial Sensitivity Tests,AntiBacterial Agents,Bacteria 中药几千年来为中国人民的健康做出了重大贡献，在现代预防和控制细菌性感染疾病中也发挥了积极作用。应用中药进行抗感染治疗具有副作用小，药物来源广泛，价格低廉等优势。在清热解毒抗菌类中药中开发抗菌药物具有良好的应用前景。长期以来，对于抗菌中药作用机理的较少认识限制了其在临床中的应用。目前，尚无统一规范的中药抗菌作用评价方法。为此，本研究拟应用抗生素最小抑菌浓度检测方法，检测6种常用抗菌中药（大黄、苦参、连翘、黄连、生地、知母）对三种常见病原性细菌（金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌）的抑菌作用，建立一种可以规范的中药抗菌作用检测方法。

[font=宋体]随着生物技术的飞速发展，生物安全问题日益凸显。为了确保人类健康与环境安全，生物安全检测服务应运而生，成为一道重要的防线。本文将介绍生物安全检测服务的背景、意义、技术方法和应用领域，并探讨其发展趋势和前景。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]一、背景与意义[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]生物安全检测服务旨在预防、检测和监控生物危害，保护人类健康和环境安全。随着生物技术的广泛应用，新型病原菌、转基因生物等不断涌现，给人类带来潜在风险。因此，生物安全检测服务对于防范和控制生物风险具有重要意义。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]二、技术方法[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]分子生物学技术：利用分子生物学技术对病原菌进行基因水平检测，包括基因芯片、[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]等。这些技术可快速、准确地检测出病原菌，为防控措施提供科学依据。[/font][/font][font=宋体]免疫学技术：通过抗体检测和抗原检测，对病原菌进行特异性识别，具有灵敏度高、操作简便等优点。[/font][font=宋体]生物传感器技术：利用生物传感器对生物危害进行实时监测，具有快速、便捷的优点，可实现连续监测和自动化分析。[/font][font=宋体]数据分析技术：通过对大量数据的收集和分析，发现病原菌的传播规律和预测未来趋势，为防控决策提供数据支持。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]三、应用领域[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]食品工业：在食品生产过程中，对病原菌进行严格检测，确保食品安全。[/font][font=宋体]医学领域：在医疗过程中，对病原菌进行监测和防控，保障医护人员和患者的健康。[/font][font=宋体]环境监测：对自然环境和养殖场等重点区域进行病原菌监测，防止病原菌扩散。[/font][font=宋体]进出口检验检疫：对进出口货物进行病原菌检测，防止外来病原菌入侵。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]四、发展趋势和前景[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]随着科技的不断进步，生物安全检测服务将朝着更加快速、准确、自动化的方向发展。未来，人工智能和大数据技术的应用将进一步优化生物安全检测服务体系，提高监测预警能力。同时，随着全球气候变化和生态系统的改变，新型病原菌的出现和传播将更加频繁，因此生物安全检测服务还需不断加强和完善，以应对未来挑战。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州建立了经[/font][font=Calibri]CNAS[/font][font=宋体]认证的实验室，并且拥有生物安全二级实验室，已在北京市备案，该实验室严格按照[/font][font=Calibri]CNAS[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]GLP[/font][font=宋体]规范进行设计及管理。团队成员具备扎实的生物医学、药学等相关专业背景，对中国[/font][font=Calibri]NMPA[/font][font=宋体]、美国[/font][font=Calibri]FDA[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]ICH[/font][font=宋体]等的当今要求和未来趋势具有深刻的理解，可根据客户产品提供最佳的病毒清除验证和细胞库检测的方案。详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/biosafety-testing-services[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]总之，[url=https://cn.sinobiological.com/services/biosafety-testing-services][b]生物安全检测服务[/b][/url]是保障人类健康与环境安全的重要防线。通过采用先进的科学技术和方法，我们能够更加有效地预防、检测和监控生物危害。随着科技的进步和社会的发展，我们相信生物安全检测服务将会在保障人类健康和环境安全方面发挥更加重要的作用。[/font]

1 水中大肠菌群（Coliform group）细菌的检测 1 .1目的和原理 如果水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染而引起肠道传染病。由于肠道病原菌在水中数量较少，故从水中特别是自来水中分离病原菌常常非常困难。大肠菌群细菌是肠道好氧菌中最普遍和数量最多的一类细菌，所以常常将其作为粪便污染的指示菌。即根据水中大肠菌群细菌的数目来判断水源是否受粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。一般规定每1000ml自来水中大肠菌群细菌不得超过3个。 大肠菌群细菌是指一类好氧或兼性厌氧，能发酵乳糖，在乳糖培养基中经37℃ 24小时培养，能产酸产气，革兰氏阴性，无芽孢的杆菌。本试验采用多管发酵法，以最近似数的方式来记载，此一数字是根据概率公式来估算，有大于实际数字的倾向，在增加每种稀释度的试管重复数后，可减少偏差。本法除了用于检测水样（淡水或海水）外，尚可用于泥浆、沉积物、污泥等的检测。测定时先将这类固体或半固体样品预先称重，再加水稀释，可取50克样品，置于盛有450ml灭菌磷酸盐缓冲液并装有玻璃珠、石英砂的锥形瓶中，振荡1—2分钟，便成10-1稀释，以用于检验。 1.2 材料与器皿 （1）培养基二倍浓度的乳糖胆汁液体培养基一倍浓度的乳糖胆汁液体培养基伊红——美蓝琼脂（E．M．B．）培养基亮绿乳糖胆汁（B．G．B）液体培养基营养琼脂培养基（2）灭菌移液管、灭菌稀释水、试管、杜汉氏小管、革兰氏染液、灭菌培养皿 1.3 方法与步骤 （1）假定试验①用10ml水样，接种到二倍浓度的乳精胆汁管中去，重复接三支 。②用lml水样，接种到一倍浓度的乳精胆汁管中去，重复接种三支。③制备水样 10-1和 10-2的稀释液。④分别接种lml10-1和 10-2稀释液到一倍浓度的乳糖胆汁管中，每个稀释液接种三支。⑤在35℃中培养48小时，观察有无气体和酸产生。⑥在48小时以内，培养管内倒置的杜汉氏管中有任何量的气体积累，便可断定为阳性假定试验。若培养管内液体清晰而杜氏管中有气泡时，可能为放置不当而残存的空气泡，不可与产气的阳性反应相混同。无气泡着为阴性。产酸者呈黄色。(2) 确信试验①取呈阳性和阳性可疑的初步发酵试管，轻轻振荡或转动，然后以无菌的金属接种环，转移1环培养物至亮绿乳糖胆汁管中，于35C℃培养48小时。如在倒置的杜汉氏管中产气，不论其量多寡，皆为阳性确信试验。②凡初步发酵试验管在24小时之前就显示活跃的发酵（产气量占杜汉氏管10％以上）的试管，应及时转移至确信试验的培养基。（3）完成试验①取上述阳性确信试验管，在伊红一美蓝平板上划线分离，为了确保获得分离的单菌落，须注意以下事项：a．划线间距至少相隔0.5厘米 b．接种针尖端要稍弯曲 c．先对发酵管轻击，并使之倾斜，以免接种针挑取到任何膜状物或浮渣，d.划线时要用针尖的弯曲部分接触琼脂培养基平面，以免刮伤或戳破培养基。划线后培养皿倒置，于35C培养24小时。② 24小时后，观察在EMB平板上出现的单个菌落，具核心及深绿色金属光泽者为较典型的大肠菌群菌落。尽可能挑取典型的或接近典型的大肠菌群菌落，在营养琼脂斜面上划线，置37 ℃培养24小时。挑取斜面培养物制成涂片，进行革兰氏染色，凡属革兰氏阴性杆菌，即确认了大肠菌群细菌的存在。③ 在EMB平板上呈较典型的大肠菌群细菌还可再次转接至乳糖胆汁发酵管中，在37℃下培养48小时，产生气体者即确认了大肠菌群细菌的存在。④ 根据证实有大肠菌群细菌存在的阳性管数查表5－10，以确定大肠菌群数。整个试验的步骤见图5－7所示。 图5－7 大肠菌群细菌的检测 1.4 结果及分析 将上述各个试验阶段的结果列表记录，并最后算出水中所含大肠菌群的最大可能值（表5－10）。 表5－10 最近似数（MPN）指数和95%置信度检索表 出现阳性反应的试管数每100ml中的MPN指数95% 置信度 在3支10ml 试管中在3支1ml 试管中在3支0.1ml 试管中下限 上限 0013 0.59 0103 0.5 13 10040.520 1017121 1107123 11111336 12011336 2009136 20114337 21015344 21120789 22021447 2212810150 300234120 301397130 3026415380 310437210 3117514230 31212030380 3209315380 32115030440 32221035470 330240361300 331460712400 33211001504800 本试验所用的培养基系选择培养基，许多细菌都不能利用培养基中的乳糖来发酵产气产酸，而大肠菌群细菌及少数其它种类的细菌可发酵乳糖产气产酸。培养基中的胆汁（牛、羊或猪的胆酸盐）是表面活性剂，它不会抑制大肠菌群细菌的生长，但能抑制其它革兰氏阳性细菌，如芽孢形成菌的生长。在胆汁缺乏时可用0.1克的十二烷基磺酸钠替代。溴甲酚紫（或亮绿）是pH的指示剂，大肠菌群在发酵乳糖产气外还同时产酸，该指示剂有助于我们判断发酵的进程。在假定试验的初步发酵管中，可能有极少数能发酵乳糖产气的非大肠菌群细菌混在阳性可疑反应管中，通过确信试验和完成试验，对初步发酵中的阳性可疑管进行复发酵试验，并进行革兰氏染色和细菌形态观察，即可将那些少量的非大肠菌群细菌（“假阳性管”）删除去，放在记录时须把三步试验都呈阳性的试管数计入阳性反应管。 1.5 培养基配制 （1）乳糖胆汁液体培养基： 蛋白胨 20.0克 乳糖 5.0克 胆酸钠 5.0克 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液 1毫升 蒸馏水 1000毫升. 将蛋白胨、乳糖、胆盐加热溶解于1000毫升蒸馏水中，调pH至7.2～7.4，加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1毫升，充分混匀，分装于有倒置杜汉氏小管的试管中，注意小管中不得有气泡，115℃灭菌20分钟。（2）伊红－美蓝琼脂（E．M．B）培养基①蛋白胨琼脂培养基（其成分为蛋白胨10.0克；琼脂18.0克；蒸馏水1000毫升；pH7.6） ②20％乳糖 2毫升 ③2％伊红溶液 2毫升 ④0.5％美蓝溶液 1毫升 将已灭菌的蛋白胨琼脂培养基加热溶化，冷却至60 ℃左右时，将已灭菌的乳糖溶液、伊红溶液及美蓝溶液按上述量以无菌操作加入，摇匀后即倒平板。乳糖在高温灭菌易被破坏，故必须严格控制灭菌温度，一般为115℃，20分钟。（3）亮绿乳糖胆汁（B.G.B.）液体培养基蛋白胨 10.0克 乳糖 10.0克 胆酸钠 20.0克 亮绿 0.0133克 蒸馏水 1000毫升 pH 7.4 分装试管后，加入杜汉氏小管，115℃灭菌20分钟。

由于传播途径多样、影响范围广泛，症状发展迅速，传染病仍然是世界范围内引起人类大量死亡的重要原因。21世纪以来多次严重疫情给我们留下深刻印象：一是2003年的“非典”（SARS），二是2009年的甲型H1N1流感（人感染猪流感），再有就是现在席卷全球的新型冠状病毒肺炎疫情。因此，传染病的防控一直是医学科学工作者面临的巨大挑战。其中，对病原体进行快速准确的鉴定是传染病精准防控的基础。中国医学科学院病原生物学研究所彭俊平研员自2000年起即深耕于病原体检测技术方法及基因组学、耐药机制相关的研究工作。近日，仪器信息网特别采访了彭俊平研究员，与他就核酸质谱技术在病原体检测领域的应用现状及前景进行了深入交谈。[align=center][img=彭俊平个人.JPG,600,337]https://img1.17img.cn/17img/images/202204/uepic/3407a132-360a-4424-b8f8-73b9d8028642.jpg[/img][/align][align=center]中国医学科学院病原生物学研究所 彭俊平研究员[/align][color=#ff0000]“国内最早开展核酸质谱病原体检测研究的团队之一”[/color]随着各项科学技术的进步，病原体检测技术也在不断发展，由病原分离、电镜观察、免疫学检测等传统生物学方法发展到[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]技术、芯片技术、测序技术、质谱技术等分子生物学方法。“因为引起疾病的病原体种类繁多，单一的平台技术不能解决所有问题，所以，我们的主要工作是利用各种平台技术对病原体进行筛查。”彭俊平介绍到，“多年来我们课题组一直致力于搭建一个病原体组合筛查技术体系，这也是我国在传染病防控领域的一个重要工作。另外，我们利用多重[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]反应结合飞行时间质谱技术（以下简称：核酸质谱）在病原体检测领域开展了10多年的工作，这也是我们多年来的一个重点发展方向。”核酸质谱是什么？彭俊平为笔者解答到，核酸质谱其实是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）在核酸水平的应用，是一种将多重[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]反应与质谱结合的复合技术。此前，MALDI-TOF主要应用于蛋白质水平的微生物鉴定研究，应用发展不过30多年，而MALDI-TOF在核酸水平的相关应用则是近些年提出的概念，应用发展时间就更短。最初，MALDI-TOF在核酸研究领域开展的应用是SNP基因分型，其首先通过[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]扩增含有SNP的基因组片段，再通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而检测出SNP位点信息。因为MALDI-TOF本身的高灵敏度和高通量等特点，使其非常适合应用于SNP多位点的筛查。而MALDI-TOF在病原体检测领域的研究则鲜少有报道。彭俊平课题组是国内最早开展核酸质谱病原体检测研究的团队之一。“我们是在2009年引进的这个技术平台，正好是H1N1全球大流行的时候，当时核酸质谱的技术水平还不足以帮助我们开展相关工作，因此我们就开始自己开发方法。”核酸质谱病原体检测的原理是利用MALDI-TOF检测多重[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]反应的产物，即单碱基延伸的产物质量大小，来判定检测靶基因的有无，从而进一步判定样本中目标病原体的有无。与传统的病原体检测技术相比，核酸质谱在灵敏度、检测通量以及操作简便性等方面均有一定优势。此外，核酸质谱检测的核酸序列均来源于公共数据库，不需要依赖其他的数据库。[color=#ff0000] “开发了7种人冠状病毒的检测方法，成功申请专利”[/color]经过多年的技术摸索，彭俊平团队利用核酸质谱在病原体检测领域做出了很多成果。最近其团队开发了7种人冠状病毒的检测方法，并申请了发明专利。目前，已知可以感染人的冠状病毒共有7种，其中包括2003年的“非典”SARS冠状病毒、2012年在中东地区出现的MERS冠状病毒以及2019年12月爆发的严重性呼吸系统综合征冠状病毒SARS-Cov-2。彭俊平介绍到，课题组是从2012年开始开展人冠状病毒的检测技术研究，其中一部分工作内容就是利用核酸质谱进行检测应用。该部分成果是与岛津公司合作开发的，利用一步法多重反应[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]与MALDI-TOF质谱联用鉴定7种人冠状病毒与新型冠状病毒的重要突变位点。“本次合作中我们将多重[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]反应从两步法改进为一步法，既缩短了实验时间，又减少了人为操作的工作。而且我们改进的方法适用于所有的RNA病毒，可以说是摸索出了一种通用的解决方案。”彭俊平介绍到，“和岛津合作成果的应用价值很明确，我非常期待未来该方法的推广。接下来我们也将继续和岛津合作在MALDI-TOF平台上开发出更多病原体检测解决方案，并合力推动核酸质谱在临床领域的应用。”笔者追问到目前国际上核酸质谱在病原体检测领域的应用现状如何？彭俊平坦言道，国际上相关的成果并不多，而团队于2009年就开展了相关研究，可以说是走在了国际前列。不过，目前核酸质谱病原体检测的应用还以科研阶段为主，临床应用正处于拓展阶段。此外，彭俊平也谈到他认为核酸质谱走向临床所面临的瓶颈，一是MALDI-TOF本身的硬件设备比较贵；其次，基于MALDI-TOF平台提供给临床应用的成熟方法不多。因此，核酸质谱这样的技术平台想要真正推广到临床，首先需要提供“一揽子”的解决方案，这样应用场景就会被打开。不过，彭俊平也观察到，无论国内还是国外，越来越多的团队和厂商开始关注这一领域，相信核酸质谱的临床应用情况将在短短几年之内得到很大的改变。最后彭俊平表示，未来核酸质谱病原体检测值得重点关注的方向有呼吸道感染疾病、腹泻性疾病和性传播疾病等，其涉及的病原体种类繁多，是核酸质谱可以“大展身手”的方向。后记：采访中彭俊平反复提到“病原体的组合筛查技术体系”，他也为笔者解释到，为了获取更全面的生物信息，往往需要多种技术平台共同解决问题，而不是希望用一个技术平台去解决所有的问题。回到MALDI-TOF这一技术来说，总有人拿质谱与NGS测序相比较，其实它们的应用场景和目标都不一样，发展核酸质谱也并不是为了替代测序技术。事实上，核酸质谱只需要在中高通量的检测中建立并巩固其“王者地位”，在此基础上能够再提升灵敏度和分辨率等性能，就为自身的发展开辟了新天地。

环境监测是了解环境现状的重要手段，它包括环境化学分析、物理测定和生物监测三个部分。生物监测是一个利用生物对环境污染所发出的各种信息来判断环境污染状况的过程。生物长期生活于自然环境中，不仅能够对多种污染作出综合反映，也能对污染的历史状况作出反映。因此，生物监测取得的结果具有重要的参考价值。微生物监测是生物监测重要组成部分具有其独特的作用。 一、水体污染的微生物监测 （一）、粪便污染指示菌 人畜粪便中携带有大量致病性微生物。如果将这类污染物排人水体，就可能引起各种肠道疾病和某些传染病的暴发流行。因此，对水体的粪便污染状况进行监测具有重要意义。直接检测各种病原菌十分烦琐和耗时耗费。此外，由于水中的致病菌少，直接检测也很困难，即使检测结果阴性，也不能保证水中不含致病微生物。因此，在水质卫生学检查中，通常采用易检出的肠道细菌作为指示菌，取代对病原菌的直接检测。若水样中检出这类指示菌，即认为水体曾受粪便污染，有可能存在致病菌。检测到的指示菌越多，污染越严重。肠道细菌中的大肠菌群是普遍采用的粪便指示菌。在水质卫生学检查的结果中，常用“大肠菌群指数”和“大肠菌群值”作指标。大肠菌群指数是指每 L 水中所含的大肠菌群细菌的个数。大肠菌群值则是指检出一个大肠菌群细菌的最少水样量（ ml 数）。两者间的关系可表示为：大肠菌群值 =1000 ／大肠菌群指数我国饮用水的质量标准规定，大肠菌群指数不得大于 3 ，大肠菌群值不得小于 333ml 。

我发个东西给大家看看食源性致病菌检测技术卫生部文件 卫法监发[2004]30号卫生部关于2003年全国重大食物中毒事件情况的通报各省、自治区、直辖市卫生厅局、新疆生产建设兵团卫生局，卫生部卫生监督中心，中国疾病预防控制中心：2003年，我部共收到全国重大食物中毒事件报告379起，17876人中毒，323人死亡。与2002年比较，重大食物中毒的报告起数、中毒人数、死亡人数分别增加了196.1%,80.7%,134.1%。现将有关情况通报如下：一、全年重大食物中毒情况（一）食物中毒报告情况第三季度仍是我国重大食物中毒报告起数、中毒人数、死亡人数最多的季度，分别占总数的41.2%,38.4%,44.9%。 （二）按致病原因分类2003年各地上报的重大食物中毒中，微生物性食物中毒发病人数最多，占总中毒人数的43.8%；化学性食物中毒的报告起数和死亡人数均为最多，分别占总数的45.2%和55.7%。（三）按进食场所分类从发生食物中毒的进食场所可以看出，集体食堂发病人数最多，占总发病人数的55.7%，其中，报告学校集体食堂食物中毒131起，6611人中毒，2人死亡。家庭食物中毒的死亡人数最多，占总死亡人数的85.1%。二、中毒原因分析从食物中毒报告数量来看，2003年报告数量与过去几年几年相比明显增多，主要有以下几方面的原因：一是2003年国家出台了《突发公共卫生事件应急条例》，各级卫生行政部门对食物中毒的报告管理明显加强，食物中毒的漏报、瞒报情况有所减少；二是新闻媒体的舆论监督力度明显加大；三是我部进一步加强了食物中毒报告制度建度，对瞒报或报告不及时的部门和单位进行了通报。总体上看，广东、四川、云南、湖北、贵州、福建、重庆、河北、陕西等省市对重大食物中毒报告制度执行得较好。经分析，2003年食物中毒的主要原因有：（一）食品加工和保存不当。不正确的食品加工或保存方式导致食物被蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌等致病性微生物污染，包括食品未加热到一定的温度和时间，某些食物中的致病因素未被彻底灭活等是导致食物中毒的常见原因，如江苏南京市燕子矾中学11月4日发生41名师生四季豆食物中毒事件、辽宁海城市3月19日发生292名学生豆奶中毒事件等。（二）消费者缺乏预防食物中毒的基本知识和鉴别有毒动植物的能力。自我保护意识较弱。2003年，因误食或食用毒蕈、河豚鱼、蟾蜍等有毒动植引起的中毒与2002年相比增长幅度明显，特别是毒蕈引起的中毒，全年共报告毒蕈32起，315人中毒，63人死亡，为中毒致死原因的第二位，如湖南省耒阳市一家庭6月发生误食毒蕈中毒事件，11人中毒，4人死亡；报告蟾蜍中毒4起，18人中毒，7人死亡，如广东台山市8月31日发生误食蟾蜍中毒事件，4名儿童中毒，4人死亡。（三）投毒或误食化学性有毒物质。2003年因投毒导致的中毒事件起数与往年相比明显增多，是引起中毒死亡的最主要原因。投毒的物质主要是剧毒急性鼠药（大多数为毒鼠强），高居中毒致死的第一位。2003年全国共报告重大剧毒鼠药中毒75起，1316人中毒，121人死亡，病死率为9.2%，与2002年相比，报告起数与死亡人数分别增加102.7%、40.7%。剧毒鼠药中毒的发生场所以家庭为主，共报告中毒47起，317人中毒，90人死亡，病死率为28.4%，如湖北省利川市2003年10月21日发生毒鼠强投毒事件，33人中毒，10人死亡；发生在集体食堂的剧毒鼠药中毒13起，689人中毒，3人死亡。此外，误食被农药、亚硝酸盐污染的食物也是导致化学性食物中毒的另一主要方面，如吉林延边州2月一家庭发生误食被农药污染的豆油导致23人中毒，5人死亡。食源性致病菌检测技术食源性疾病是食品安全的主要问题，世界卫生组织将食源性疾病定义为：“凡是通过摄食进入人体的，使人体患感染性或中毒性的疾病。”这里包括了由食品微生物污染和化学性物质引起的食源性疾病。而微生物引起的食源性疾病是食品安全的主要问题。世界卫生组织2002年3月公布，全球每年因食源性笥生物污染引起的腹泻病例达到数十亿，死亡的0-15岁儿童约170万。在发达国家至少有1/3的人患食源性疾病，在食源性疾病上花费达数十亿美元。近年来，在国外食源性疾病事件也频频发生，如英国的疯牛病，日本的出血性大肠埃希氏菌O157：H7和雪印牛奶的葡萄球菌肠毒素中毒暴发，法国的李斯特氏菌中毒等。1998年上海出现甲肝大流行，发病率高达507/10万。1999年苏皖等地引起的O157：H7大规模暴发流行，急性肾功能衰竭患者195人，死亡人数177人，病死率为90.8%。我省1992-2000年共发生食物中毒794起，发病人数20717。死亡人数71人。WHO估计各国食源性疾病的漏报率在90%以上，也就是说，每年公布细菌性食源性疾病事件对于实际发生率来说冰山一角。食源性致病菌检测技术对食源性疾病的预防与控制已引起了世界各国关注。食源性疾病病原的检测技术是食源性疾病的预防与控制的关健的技术环节。目前我们国家虽然制定相关的食物中毒病原菌检验方法，由于检测方法均采用经典、耗时较长，且存在国内试剂供应不配套等问题，很难适应公共卫生事件应急处理快速反应的需要，随着时代的进步，检测方法的先进性、灵敏度、特异性要求都更高。特别是一些新的病原菌及病毒性食源性疾病的发生，都对检测技术提出更高的要求。随着分子生物学检测技术的发展，为微生物食物中毒快速检测提供了良好的技术平台。现结合标准的食源性病原菌的检测方法，对与食源性疾病密切相关的病毒、细菌和生物毒素的最新检测技术及其研究进展进行介绍。食源性致病菌检测技术 食 源 性 病 毒 病（简单的说说）引起食源性疾病的病毒主要有甲型病毒性肝炎、戊型病毒性肝炎、轮状病毒腹泻、诺瓦克样病毒胃肠炎和朊病毒病等。 甲型病毒性肝炎甲型病毒性肝炎是由甲型肝炎病毒HAV通过粪-口途径传播的急性传染病，呈世界性分布，发病率高，传染性强。在不发达国家，HAV的感染率高，常常发生甲肝的暴发流行。HAV是直径27-32nm的20面体立体对称的圆球颗粒，无囊膜。HAV的核酸为单股正链RNA，有感染性。HAV病毒是一种独特的小核糖核酸病毒，遗传学性质稳定，有7个基因型，只有1个血清型。 戊型病毒性肝炎戊肝即戊型病毒性肝炎是一种严重的新发胃肠道传染病，在发展中国家有暴发流行，发达国家主要由旅游途径输入。本病流行绝大多数是水型流行，有明显的季节性。HEV为正20面体，无包膜的球形颗粒，形态学上分类属杯状病毒。HAV基因组为单股正链RNA，约7.6Kb。 轮状病毒轮状病毒是引起婴儿非细菌性腹泻的主要病原。该病毒属呼吸病毒科，病毒颗 粒直径68-70mm，分11个片段双股RNA。将轮状病毒分为A、B、C、D、E、F、G组。与人有关的为A、B、C组。在同一组又将病毒分为不同的血清型。现在已发现有7组不同的血清型，与人类腹泻有关的血清型主要属于轮状病毒A、B、C组。A组轮状病毒是幼儿严重水样腹泻的主要原因。B组轮状病毒是引起成人腹泻的主要原因。C组轮状病毒则是主要引起世界各地散发的儿童腹泻。 诺瓦克样病毒胃肠炎诺瓦克病毒（NV）和诺瓦克样病毒（NLV）是一组世界范围内引起的急性无菌性胃肠炎的重要病原，它们有许多共同特征：①直径26～35nm的小圆结构病毒，无包膜；②分离自急性胃肠炎病人的粪便；③不能在细胞或组织中培养；④基因组为单股正链RNA；⑤在Cscl密度梯度中的浮力密度为（1.36～1.41）g/cm3；⑥电镜下缺乏显著的形态学特征。此病毒的主要经粪-口传播，生吃贝类食物是导致诺瓦克样病毒胃肠炎暴发流行的最常见原因。 朊病毒病朊病毒病即海绵状脑病是由朊病毒（Prion）引起的人和动物中枢神经系统病变性致死疾病。疯牛病（BCD）是最著名的朊病菌毒病。除了上述朊病毒外，人患的还有克-雅氏病（CID）、新型克-雅氏病（v CID）、致死性家族性失眠症（FFI）、格-斯综合征（GSS）和库鲁病（Kuru）等，动物性的朊病毒病还包括羊瘙痒病（Scrapie）、鹿和麋的慢性消瘦病（CWD）、传染性水貂脑病TME和猫海绵状脑病（FSE）。朊病毒是美国科学家Prusiner提出的超出经典病毒学的概念，是不被大多数修饰核酸的方法灭活的蛋白传染性颗粒，称为抗蛋白酶蛋白PrP。PrP可分为正常型（PrPC）和致病型（PrPSC）。编码PrP基因存在于正常哺乳动物基因组内，编码33-35KD的神经元细胞表面糖蛋白，是一种蛋白酶敏感的可溶性蛋白质，二级结构中α-螺旋占40%，β-折叠占30%，半衰期短。PrPSC是PrPC的构象异构体，是抗蛋白酶的不溶性蛋白，存在于细胞内。其二级结构与PrPSC有显著差异，α-螺旋38%，而β-折叠高达43%，半衰期较长。这导致PrPSC与PrPC理化性质完全不同。PrPSC高度热稳定，紫外线离子辐射及羟胺均不能丧失其侵染能力。人朊病毒除了遗传性、医源性、散发性外，还有食源性。Kuru病就是由于吃了Kuru病死者的脑组织而传染的。许多研究认为，vDJD是由于疯牛病病毒传染给人引起的，主要是由于人吃了疯牛的肉、内脏、脑等而传播的，也有关于人吃食痒

水产养殖病原微生物的分子检测注：全文见附件。有用到的鼓掌不要都做伸手党

哪位有食品中重要人兽共患疾病病原体检测技术方面的资料，麻烦帮传一下，谢谢！haijun.yunfeng@yahoo.com.cn

(二)泌尿系统感染病原菌的快速检测　　因泌尿系统感染的中段尿样本中的细菌量相对很高, 中段尿样本也是MALDI-TOF MS直接检测的理想选择[30], 并且常常是单一菌种感染, 避免了MALDI-TOF MS在鉴定混合菌样本的不足[31]。泌尿系统感染是人类常见的感染性疾病, 临床泌尿系统感染最常见的病原菌为大肠埃希菌(70%~95%)、腐生葡萄球菌(5%~10%)以及其它肠杆菌科细菌, 如奇异变形杆菌和肺炎克雷伯菌。有研究表明MALDI-TOF MS对尿液样本中这些细菌的鉴定效率和准确率要优于传统鉴定方法和其他鉴定系统[7, 32, 33]。1.鉴定效能 FERREIRA等[7]选取尿液中细菌大于1× 105 cfu/mL的样本进行直接的MALDI-TOF MS鉴定, 结果显示尿液样本经过差速离心法处理后, 可将91.8%的菌株鉴定到种、92.7%的菌株鉴定到属的水平。　　杨溪等[33]使用MALDI-TOF MS技术对临床收集到的1 040份尿液样本进行直接快速检测, 共鉴定出含细菌的样本526份, 其中尿细菌培养菌落数≥ 1× 105 cfu/mL, 培养出1种/2种菌的尿液样本MALDI-TOF MS的直接鉴定率分别为92.7%(430/464)和75%(96/128)。MALDI-TOF MS直接检测法的鉴定结果与尿细菌培养法鉴定出的细菌菌种一致, 符合率为100%。2.与流式细胞术联用 怀疑泌尿系统感染的尿液样本一般经离心后取沉淀直接进行检测, 但考虑到临床上有60%~80%的尿液样本是阴性的, 为了减少分析的时间和人工的工作量, 有学者将MALDI-TOF MS与流式细胞术联用检测, 用流式细胞术筛除细菌数量不足的尿液样本, 而MALDI-TOF MS用来检测筛选结果为阳性的尿液样本, 取得了良好的鉴定效果[34, 35]。MARCH ROSSELLó 等[34]建立了这样一种微生物鉴定程序:先用流式细胞仪进行菌落计数筛查出单一细菌阳性的尿液样本, 然后再进行MALDI-TOF MS检测, 发现细菌数在1× 107 cfu/mL时是足够的细菌浓度, 有87.5%的敏感性, 而细菌数在(1× 105)~(1× 107)cfu/mL之间的样本经过4 h的预增菌, 得到用于分析的足够的细菌数量后, 可以达到91.7%的敏感性。3.细菌含量对鉴定结果的影响 由于中段尿中病原菌数 2.0), 而随着样本中细菌数的降低, 鉴定成功的比例和鉴定分数也在下降, 当菌落数 1× 104 cfu/mL的中段尿样本, 应用MALDI-TOF MS直接检测即可取得满意的鉴定效果。4.中段尿样本直接检测的新方法 DEMARCO等[31]近期描述了一种透析过滤的方法, 通过脱盐、分馏、富集等步骤对100例阳性尿液样本在MALDI-TOF MS分析前进行了预处理, 实验结果表明这种预处理方法能够正确地鉴定阳性尿液样本, 并且正确分类了所有临床相关菌尿症的阴性尿液样本, 包括一组污染的尿液样本和一组临床上无关紧要的定植菌。敏感性和特异性分别是67%和100%。5.中段尿样本直接检测的不足之处 与直接检测培养阳性的血样本一样, 对于含有2种或2种以上细菌感染的中段尿样本, MALDI-TOF MS常常表现为鉴定能力不足[33, 35] 尿液蛋白质如α -防御素[8]会造成鉴定结果不能正确匹配数据库 对酵母菌的鉴定能力也有待于进一步提高 对于核糖体蛋白序列差异很小的菌种也常常不能区分。(三)其它无菌体液　　MALDI-TOF MS直接检测和鉴定其它无菌体液样本如脑脊液、胸腹水和关节液等中细菌的报道尚不多。NYVANG HARTMEYER等[37]首次报道了通过直接将脑脊液样本离心取上清直接进行MALDI-TOF MS分析, 肺炎链球菌性脑膜炎可以在30 min内做出诊断, 为后续治疗方案的选择和结果的解释提供了重要的参考依据。SEGAWA等[38]也用同样的方法对一例肺炎克雷伯菌引起的脑膜炎做出了诊断, 但同时也指出在实际应用中能获得的样本量少, 细菌数少可能会限制它的应用。另外, 还可将无菌体液样本转移到血培养瓶中进行孵育, 待报阳后进行检测也是可行的。有研究应用MALDI-TOF MS检测了46份液体, 包括移植养护液、关节液、深部脓疱样本、骨小孔样本用血培养基孵育, 发现44/46(96%)能鉴定到种的水平, 余下的2份被鉴定到属的水平[18]。四、总结与展望　　MALDI-TOF MS是一种简单、快速、高通量和高效的微生物鉴定手段, 在临床样本直接检测方面较传统的鉴定方法具有更大的优势, 能显著降低样本检测的周转时间和成本, 但尚存在着一些不足之处, 主要表现在:(1)MALDI-TOF MS在检测和鉴定细菌方面的敏感性还不高, 不能直接鉴定患者血样本中的病原菌(细菌数量太少) (2)对于一些核糖体蛋白差异较小的细菌用其辨别有较大的困难 (3)目前的研究都有各自不同的操作过程, 在样本处理、质谱图采集和分析等方面没有统一的标准, 可能会影响分析结果在实验室内和实验室间的可重复性 (4)标准的鉴定参考图谱数据库尚不够完善, 需要进一步拓展 (5)对一些细胞壁难以破坏的细菌(如革兰阳性菌、酵母菌)和混合菌等的鉴定能力还不够高。但是相信随着更加有效的样本预处理方法、更加严格的检测过程控制和更高分辨率的图像处理技术的实现, MALDI-TOF MS用于直接检测临床样本中的微生物会有更广阔的前景。

引言 通常细菌的分类工作是根据细菌的形态学和生物化学反应来进行的。然而，这些测试工作比较耗费时间，而且需要专业知识及专门的培训才能完成。通过检测细菌的红外光谱然后进行化学计量学分析显示出了很大的优越性( 包括在测试速度及结果的一致性方面 )。20 世纪 50 年代末首次尝试了这种方法，并取得了一些成果，但是在仪器以及数据后处理工具方面也暴露出一些局限性。 傅立叶变换红外光谱 (FT-IR) 的出现使细菌的红外光谱分析工作在上个世纪 80 年代又复兴了起来。FT-IR 光谱的高信噪比，良好性能，加上计算能力的大大进步，使其在细菌分析方面的应用非常可行。Hopinson 和 Naumann 小组是应用 FT-IR 进行微生物鉴定和鉴别的先驱。最新研究表明这种方法对病原菌和非病原菌的分析也非常有效。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是20世纪80年代发展起来的一种新型软电离有机质谱, 作为一种新兴的蛋白质组学检测技术, 现已广泛应用于生命科学及相关领域。同时作为一项新兴的微生物鉴定技术, 受到了国内外的广泛关注。与传统的生化表型鉴定方法和分子生物学方法相比, MALDI-TOF MS具有操作简单、快速、准确和经济的特点。早在1975年, ANHALT等[1]利用质谱仪结合高温裂解技术第1次完成了细菌的鉴定, 从此拉开了质谱鉴定细菌的“ 序幕” 。随着质谱检测技术的不断完善和发展, 近年来, MALDI-TOF MS已经成功应用于微生物的鉴定, 显示了其在细菌、酵母菌等鉴定方面均具有良好的应用价值。众多的研究表明, MALDI-TOF MS技术对培养出的纯菌落进行菌种鉴定具有很高的稳定性及准确性, 对常见细菌和酵母菌的属的鉴定率能达到97%~99%, 种的鉴定率也能达到85%~97% 另外, MALDI-TOF MS大大缩短了细菌鉴定的时间, 而且其成本也较常规鉴定方法低[2, 3]。除此之外, MALDI-TOF MS已经能够成功地用于部分微生物亚种水平的鉴定和细菌耐药性的检测, 但这种方法在大多数情况下是应用于培养出的纯菌落的鉴定[3]。　　如果能够从临床样本中直接检测细菌/真菌, 突破细菌/真菌培养阳性率低、培养时间长的瓶颈, 为细菌/真菌感染性疾病的诊疗提供更快、更准确的病原学依据, 将对临床及时控制细菌/真菌感染性疾病起到更大的作用。国内外学者已尝试将质谱技术应用于临床样本的直接检测, 并取得了显著的进展。本文就MALDI-TOF MS技术在临床样本的直接检测应用作一综述。一、MALDI-TOF MS检测原理　　MALDI-TOF MS技术用于微生物鉴定的实质就是检测具有属、种或亚型特异性的生物标志的质量信号, 主要是微生物菌体内高丰度、表达稳定和进化保守的核糖体蛋白。MALDI-TOF MS 仪器主要由基质辅助激光解吸离子源(MALDI)和飞行时间质量检测器(TOF)两部分组成。MALDI的原理是用一定强度的激光照射样本与基质形成的共结晶薄膜, 基质从激光中吸收能量而汽化, 并迅速降解, 使样本分解吸附, 基质和样本之间发生电荷转移从而使样本分子发生电离 TOF的原理是带有电荷的样本分子在电场作用下加速飞过飞行管道, 因为离子的质荷比与离子的飞行时间呈正比, 所以不同质量的离子因达到检测器的飞行时间不同而被检测, 以离子峰为纵坐标、离子质荷比为横坐标形成特征性的质量图谱。将不同种属微生物经MALDI-TOF分析所形成的质量图谱与数据库中的参考图谱进行比较, 从而实现对目标微生物种或菌株的区分和鉴定[2]。二、MALDI-TOF MS直接检测临床样本的流程　　临床样本直接检测的流程主要包括3个部分:临床样本的预处理、样本上机检测和对比蛋白质指纹图谱数据库得出鉴定结果。由于目前报道最多的临床样本是阳性血培养瓶和中段尿样本, 下面将以这二者为例介绍其直接检测的流程, 其它临床样本的检测流程与之类似。(一)临床样本预处理　　MALDI-TOF MS直接用于临床样本的检测有2个基本的要求:(1)临床样本中细菌的量。为了得到准确的鉴定图谱, MALDI-TOF MS技术对置于靶板上的细菌的最低检测限约为(1× 104)~(1× 106)cfu/mL。若要直接检测拟似血流感染的血液样本以及拟似泌尿系统感染的中段尿等临床样本中的病原菌, 首先必须富集细菌 (2)临床样本的质。由于血液和血培养瓶中的大分子成分如血红蛋白和其它蛋白成分、尿液中的白细胞等有机成分会干扰细菌的谱峰, 所以直接检测前需要采取预处理措施去除这些干扰因素。1.阳性血培养瓶直接检测 直接检测阳性血培养瓶的细菌浓度常常需要1× 107 cfu/mL[2, 4]。由于在血流感染患者血液中的细菌量常常很低(最低可 1~10 cfu/mL), 因此对血样本的直接检测需要一个增菌的过程, 即采用血培养瓶增菌。目前已报道的阳性血培养病原菌预处理程序各不相同, 但预处理过程主要包含了以下2个步骤:(1)将细菌从血细胞中分离出来。先应用温和去污剂(如吐温-80、十二磺基硫酸钠、皂素等)将血液中的血细胞溶解, 然后通过不同的流程(离心、洗涤)去除其它的干扰因素, 纯化要鉴定的细菌样本 (2)将菌体中的蛋白质抽提出来。最常用的是混合溶剂处理法, 使用甲酸/乙腈溶液对样本进行处理来抽提蛋白, 利用2种溶剂的混合作用将菌体表面的蛋白和存在于细胞内的低相对分子质量的高丰度蛋白提取出来, 实现对菌株的鉴定。虽然至今尚没有规范化的处理程序, 不过目前市场上已有商品化的阳性血培养瓶预处理试剂盒Sepsityper kit(Bruker)可以提高鉴定分数和鉴定准确率, 但是花费比较高, 处理程序也费时较长[5]。另外, HAMMARSTR? M等[6]建立了一种基于声学捕捉和集成选择性富集目标(integrated selective enrichment target, ISET)的新方法用于富集样本中的细菌, 快速、准确并且简化了人工操作, 有望替代传统的以离心为基础的分离方法。2.中段尿样本 要取得一个较高的鉴定成功率, 直接检测中段尿样本中病原菌至少需要的细菌数量是1× 105 cfu/mL[7, 8]。对尿样本的预处理程序较为简单, 主要有下面几个步骤:低速离心去除白细胞, 高速离心收集细菌, 沉淀, 经过洗涤、离心之后进行蛋白质的提取(常用的是甲酸、乙腈), 经高速离心后取1 μ L上清涂布到MALDI的靶板上, 在室温下干燥后即可进行检测。

自2004年以来，加拿大首个新的即食食品李斯特菌政策将于2011年4月1日生效。该政策是加拿大政府应对韦瑟里尔报告所采取的又一措施，该报告是对加拿大2008年李斯特菌感染事件的独立调查。2008年，加拿大共发生57起李斯特菌感染，造成23人死亡，死者大部分为老年人。 国际上公认的李斯特菌共有7个菌株：其中单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李斯特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。单核细胞增生李斯特菌广泛存在于自然界中，肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特菌，并制定了相应的标准。 此次的新政策主要有6处重大修改：制定了与国际标准类似的、新的最终产品符合性标准；针对能否造成李斯特菌生长，对即食食品的定义作了修改或制定，更新了李斯特菌暴发涉及的食品列表；鼓励使用后灭活处理和/或李斯特菌生长抑制剂；规定了从环境到最终产品检测的具体抽样；要求所有即食食品厂实施环境监督；加强对高风险人群的调查。 新政策将适用于在加拿大销售的所有即食食品，包括国内产品和进口产品。因此，检验检疫部门提醒出口食品加工企业：密切关注国外信息，及时调整产品结构，确保出口产品的安全卫生。

根据土壤环境质量GB 15618-1995；有机物 GB/T 5750-2006等，酶标仪可以应用如下：无机污染物：1）硝酸盐NO3(-)和亚硝酸盐NO2(-)的含量；光吸收2）硫酸盐；光吸收3）氯化物；光吸收4）氰化物；光吸收5）重金属离子（铬、砷）； 光吸收有机污染物:1）苯并芘；光吸收2）苯胺类化合物；光吸收3）有机磷农药残留；光吸收动力学 法（乙酰胆碱酯酶）4）其他农药；ELISA5) 兽药残留(①抗生素类;②驱肠虫药类;③生长促进剂类;④抗原虫药类;⑤灭锥虫药类;⑥镇静剂类;⑦β-肾上腺素能受体阻断剂) ELISA微生物病原菌:1)TRF法检测大肠杆菌O157:H7（环境和食品）；TRF1） 内毒素检测重要性：细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁上的一种脂多糖（LPS）和蛋白的复合物，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。内毒素大量进入血液就会引起发热反应—“热原反应”。 因此，快速检测血液、脏器内毒素含量可以为临床相关疾病的诊断预后提供参考。2） 内毒素检测方法（鲎试剂法）： 动态浊度法；光吸收 终点显色法；光吸收 动态显色法；光吸收

【金秋计划】+如果病原微生物泼溅在检测人员身上应该如何处置 https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/09/202409181047227788_3745_1502196_3.jpg!w690x457.jpg 在实验室工作，难免会出现操作不当导致液体溅入或洒落吸入，为保障检测工作人员的健康生命安全和国家财产安全，防止和杜绝食盐污染对周围环境造成严重污染，确保一旦发生食盐污染事件及安全事故时，能及时规范，科学，迅速，有效的控制，应做好以下处理： https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/09/202409181048538740_7234_1502196_3.jpg!w412x320.jpg 1.如果病原微生物泼溅在检测人员皮肤上，立即用75%的酒精或碘伏进行消毒，然后用清水冲洗。 2.如果病原微生物泼溅在检测人员眼内，立即用生理盐水或洗眼液冲洗，然后用清水冲洗。 3.如果病原微生物泼溅在检测人员的衣服、鞋帽上或桌面、地面，立即选用75%的酒精、碘伏，0.2-0.5%的过氧乙酸、500-10000mg/L有效氯消毒液等进行消毒。 4.如果工作人员通过意外吸入、意外损伤或接触暴露，应立即紧急处理，并及时报告实验室污染预防应急处置专业小组。如工作人员操作过程中被污染的注射器针刺伤、金属锐器操作应立即实施急救。首先用肥皂和清水冲洗伤口，然后挤伤口的血液，再用消毒液（如75%的酒精、2000mg/L次氯酸钠、0.2%-0.5%过氧乙酸、0.5%的碘伏）浸泡或涂抹消毒，并包扎伤口（厌氧微生物感染不包扎伤口）。 https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/09/202409181046574296_653_1502196_3.jpg!w328x212.jpg 总之，实验室安全不可忽视，在做试验前一定要戴好手套、口罩、帽子、防护鞋、防护衣等，一但不小心弄到身上要第一时间采取有效的处理方法，做好应急处置。

到菜市场买菜，大多数市民都选购浇灌农家肥的蔬菜。殊不知，施农家肥的蔬菜会被病原微生物污染，7天内污染最严重。 这项由南京农业大学、江苏省农科院专家对南京城东麒麟镇、百水桥等郊区农田及孝陵卫农贸市场出售的小白菜、萝卜、生菜等蔬菜样品检测结果表明，距离施肥时间越近,蔬菜表面大肠菌群数量越多。以小白菜为例，人粪尿自然放置7天再浇灌，7天后,每克小白菜表面大肠菌群数为5200个；15天后，每克小白菜表面大肠菌群数为1500个。秋冬季，菠菜和红萝卜污染最严重,其次是小白菜；春夏季，白萝卜污染最严重。 那么，蔬菜烹饪前怎样处理比较卫生呢？ 研究人员经检测后发现，市民常用的自来水浸泡、冲洗等方法对去除蔬菜表面大肠菌群有一定的效果，其中以冲洗效果最佳。白萝卜未经冲洗，每克菜表面有1250个大肠菌群，冲洗后为18个，浸泡处理后有196个。但浸泡、冲洗无法明显杀灭蔬菜内部的大肠菌群。 专家介绍，最好的杀灭蔬菜病原菌的方法是沸水浸泡。沸水处理15秒就可以使蔬菜表面的大肠菌群数量明显下降,叶菜类蔬菜内部的大肠菌群经沸水浸泡30~45秒可以基本杀灭,萝卜类蔬菜内部大肠菌群经沸水浸泡60秒以上也可以彻底杀灭。