测序仪原理

编者按 NGS技术，到底是下一代测序，还是二代测序？NGS到底包含了哪些技术？关于NGS的定义，一直困扰着业内外人士。曾参与“国际人类基因组单体型图计划中国卷”项目 、“炎黄一号” 等多个重大科研项目的基因测序专家王威博士，近期发表了文章《浅议基因测序技术的代际》，文中清晰地解释了测序技术代际问题。小编特将该文转载，欢迎各位交流探讨。 正文： 相对于较早出现的Sanger双脱氧核苷酸测序技术（简称Sanger测序），2005年后出现的NGS测序技术，使得基因组研究进入高通量时代，促进了基因组学科学研究及技术转化应用。 在基因组学领域，NGS通常是next-generation sequencing的缩写，意为下一代或者新一代测序技术，亦有人称之高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS)、二代测序技术（second-generation sequencing）。至于到底哪些测序技术属于NGS，并无明确统一的界定，目前主要有两种观点，存在些许差别。 01 对NGS的最初种理解 自动化的Sanger测序技术，以Sanger技术为起点，新出现的技术被称为下一代测序技术（简称NGS）1。 这些新技术涉原理，依赖不同的模板制备方法(例如乳液PCR、DNA纳米球、桥式扩增 、单分子模板)、序列测定方法（焦磷酸测序、基于可逆终止化学测序、基于连接反应的测序、磷酸连接荧光核苷酸或实时测序）、基因组比对与组装方法等。 这种观点认为目前的大规模并行测序技术都属于NGS，包括Roche/454测序、Illumina/Solexa测序、Life的SOLiD与ION系列以及华大基因的BGISEQ/MGISEQ系列等；此外，持这种观点的学者还将Helicos BioScience、Pacific BioSciences以及Oxford Nanopore的单分子及纳米孔测序技术均纳入NGS技术，并未单独将其定义为第三代测序技术1～3。 02 对NGS第二种理解 另一种理解认为 NGS主要是指基于大规模并行测序（massively parallel sequencing，简写MPS）的测序技术4。 大规模并行测序的关键技术诞生于上世纪90年代，于2005年商业化进入市场。这一技术同时对成百上千万的待检测DNA模板分子进行测序，加大了测序反应的效率与通量，使得一次测序实验便能够完成一个或更多的人类基因组序列的测定。尽管不同的大规模并行测序技术原理各不相同，但有一些共同特点，杨焕明老师有非常简洁的总结5：（1）“裸”、“密”并行，每一个分子簇为一个裸露的测序反应，使得测序通量提高了几个数量级；（2）测序通量 的提高，损失了下机的读长（初期只有约20个碱基，现在已有显著提升）。 尽管MPS的标本制备和测序原理不同于Sanger测序，但它与Sanger 测序一样,仍需要对测序分子进行扩增，因而也不可避免的增加引入序列误差的概率和GC偏差，也不能直接分析不同修饰的核苷酸5。 按照这一观点，单分子测序不属于NGS，而是更加新的技术。 03 NGS：Next-generation 还是 Now-generation? 随着MPS成熟稳定，在2008～2010年左右，NGS有了一个新的含义，即Now-generation sequencing6、7，直译为“当代”或者“现代“测序技术。 也就是说，“下一代”测序技术变成了“现代”测序技术。不过，Now-generation sequencing这一说提法并未被广泛使用。因此在多数情况下，NGS主要是指Next-generation sequencing。 在高通量测序技术刚刚问世时，人们并没有预料到测序技术的后续发展如此迅猛。因此，无论是Next-generation 还是Now-generation，其实都是一个比较笼统的提法，本身也意味着变化和发展。这也就不难理解为什么目前对于哪些技术属于NGS会存在不同观点了。 04 关于测序技术的代际 上述话题牵涉出所谓的测序技术代际的问题。然而目前来看似乎并没有统一的认定。 如果按照上文对NGS的理解，目前的代际划分似乎更多的用来区分Sanger 测序与非Sanger 测序。这两类技术在原理和测序通量上都有存在较大差异，但也有相通之处。例如，无论是Sanger双脱氧核苷酸测序,还是高通量测序中的边合成边测序技术，或者是基于连接反应的测序，其原理都依赖核苷酸的聚合反应。 目前测序仪代际划分的分歧点主要围绕“二代测序”和“三代测序”技术。“三代测序”这种提法出现于2008～2009年，当时主要是指有别于NGS的新型测序技术。一些学者认为单分子测序、实时测序以及核心方法有别于已有技术的方法，应是三代测序技术的定义性特征。目前，三代测序通常是指无需DNA扩增的单分子测序技术4。这种技术从原理与特点来看，有其自身优势（比如测序能够获得较长的读长，有望解决单倍体基因组组装和结构变异识别），是测序技术发展的重要思路。 有学者指出，目前测序技术代际划分，也许更多的是出于商业上的考虑，因为人们通常习惯性的认为技术代际升级代表了技术的演化。例如，Pacific BioSciences 公司在其发表的论文中，将单分子实时测序技术与NGS进行了区分，被归入三代测序技术8，其用意是不言而喻的。 单分子测序技术早在2003年就有概念性的论文发表9。2008年，Helicos BioSciences推出了单分子测序仪，随后Pacific BioSciences与Oxford Nanopore也推出了各自商业化的测序仪。不过，也许是由于单分子测序对技术体系要求更高，这项技术的发展远不如当初人们预想得那般迅猛，直至今日尚未达到NGS这样的市场规模。这期间，Helicos BioScience已于2012年破产，尽管其技术符合目前对三代测序技术的界定。 随着更多的应用，单分子技术也陆续暴露出一些技术问题。例如，在近期的一篇论文中，研究人员对利用长读长测序技术组装的人类基因组进行分析，发现与短读长组装相比，长读长组装的蛋白编码区域含有更多的错误10。尽管有学者指出，新的生物信息学工具已经能够改善纳米孔测序的组装结果，有望从Oxford Nanopore和PacBio的测序数据中获得高质量的序列11。但是，真正的长读长技术，只有达到或超越现有技术的性能和准确度时，才有实用意义。 从测序技术应用角度来看，某些应用也许并不需要长读长的单分子测序技术。例如，基于外周血游离DNA测序的无创产前检测，因目标DNA本身就是一百多个碱基的短片段，采用NGS就能够比较好的进行检测与分析，且成本也在逐渐下降。此外，通过一些间接技术手段，比如华大智造近期推出的stLFR测序12，也能够在全基因组范围内提供基因组长片段信息，包括分型、突变及基因组结构变异。 单分子测序技术从原理上具备潜力与优势，值得进一步研发完善。但是未来能否达到预期的市场规模，甚至成为主流测序技术，还需要经过实践检验。技术发展代际内的升级相对比较频繁，而代际间的升级则相对缓慢，只有核心原理有创新并且跨越式超越前一代的技术，也许才更适合被定义为新一代技术。 总之，目前测序技术代际划分较为模糊，且测序技术目前仍处于快速发展中。其中，SANGER与 NGS均引领了基因组技术，推动了基因组学科技进步。前者为人类基因计划（HGP）做出了主要贡献，目前仍在是很多生物学与医学实验室的常规技术；后者则是当前基因组研究与应用的主流技术，直接为基因组测序的广泛应用扫清了经济上的障碍，使其不仅能更好的服务于科研，也正在成为医学界以及其他应用领域的重要工具。单分子技术则是测序技术发展的重要方向，开始崭露头角，但成熟与完善尚需时日。以上这些测序技术，均有各自的特点，也有其适合的应用范围与应用场景。 附笔： 写这篇小文的初衷，是近期因为有朋友提出过此类问题，也有人常将测序技术类比IT技术的发展。因此在这里分享自己的观点，也期望与持不同意见的朋友交流探讨。 特别感谢两位曾经参与过水稻基因组计划等早期基因组大项目的同事张建国博士与李胜霆博士，在春节假期期间分享了各自的观点，并协助完善本文。 目前测序技术的代际划分并没有统一的认定。即使一个人，其观点也会随时间与认知的改变而发生某些变化。在2008年前后，我们单位的NGS平台刚刚进入规模化稳定运行阶段。也正是那个时候，出现了“三代技术”。业内不少人都认为这类单分子技术很快将取代NGS。但事实并非如此。我曾经的观点认为单分子测序技术属于三代技术，而目前则倾向于将其归入NGS。 关于测序技术的代际，可以看看IT的代际。百度上是这样划分的：初代计算机被称为电子管计算机，第二代计算机被称为晶体管计算机，第三代计算机成为中小规模集成电路计算机，第四代计算机成为大规模和超大规模集成电路计算机，第五代计算机，指具有人工智能的新一代计算机。IT的代际划分主要源自技术原理的革新（第五代感觉主要是软件上的革新），是认识计算机发展史和技术原理的需要，具有客观存在的价值。新一代在性能上全面超越前一代。 从认识论的角度来讲，大家习惯于根据技术划分代际，代际升级代表了技术的演化。只有核心原理新并且跨越式超越前一代的技术才能被称为新一代。新一代的出现首先是从技术原理上提出，有希望和潜力超越现有技术，然后从商业角度宣传，有一些最终行不通的被淘汰，能发展成熟超越前一代的才会真正成为新一代。也有可能方向是对的，但是技术暂时跟不上，会经历曲折的发展。这种代际认识在回顾历史的时候最清楚。 王威 博士 华大智造副总裁，医学遗传学研究员，科学技术委员会成员。 先后参与、负责完成“国际人类基因组单体型图计划中国卷”项目 (简称 HapMap 计划) 北京区域的基因分型任务、初个中国人基因组图谱的绘制工作 (简称“炎黄一号”) 等多个重大科研项目。主要从事基因组医学新技术开发、推广与应用。

p 　　“这一个项目我做了7年，这辈子能做几个这样的项目?它就像我的孩子一样，对于自己的孩子，哪怕再难、再苦我都要坚持。” /p p 　　“做科研就不能怕走弯路，我跌跌撞撞地走了这么多年，只是为了基因测序技术的国产化，哪怕没有资金和支持，我也要坚持做下去，因为这是我的‘孩子’。” /p p 　　说这话的人是中国科学院北京基因组研究所技术研发中心常务副主任、副研究员任鲁风。多年来，他不断地调整着研究方向，不断地学习不同学科的知识，为的就是研制出中国人自己的基因测序仪。 /p p style=" text-align: center " img title=" 2015810545267550.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201508/insimg/14b6e2f4-ff1d-4525-b4b3-9fa5b7c70aab.jpg" / /p p style=" text-align: center " 任鲁风 /p p 　 strong 　初试牛刀 /strong /p p 　　22岁，毕业于南开大学生物系的任鲁风进入天津市某医院从事遗传性耳聋基因方面的基础研究，一个偶然的机会，他与基因结下了不解之缘。 /p p 　　在那里，他第一次接触到了“基因芯片”，这种在当时还很“时髦”的检测技术，就像给他“注射了一针兴奋剂”。当他得知北京一家公司正在建立基因芯片技术团队时，便毫不犹豫地放弃了在医院刚刚得到的晋升职位和稳定的工作，来到北京寻找他的梦想。 /p p 　　他的梦想与努力没有被辜负，经过多年心血与集体攻关，2003年由任鲁风主要完成的全球第一款SARS病毒全基因组芯片问世，并荣获了首都“抗击SARS集体一等功”。 /p p 　　“当时的基因芯片应用涉及了人类、动物、植物及病毒等方面，主要偏重于在基础研究中的应用，其中针对病毒进行鉴别检测的基因芯片是应用研究中主要的方向。”任鲁风向记者介绍说。 /p p 　　在他看来，在此之前，没有其他分子检测技术能够实现检测靶标的通量概念，基因芯片是第一种可以大规模并行化进行基因靶点检测的实用技术，“如果能够根据其特点应用于恰当的实践领域，将有其广阔的市场前景”。 /p p 　　可是好景不长，SARS过后，和国内众多新兴产业的轨迹一样，基因芯片产业进入了一个波谷期，公司内部业务调整，使得他不得不再次转行，寻找突破口。 /p p 　　2004年，他所在的部门裁撤，开始转岗从事基因治疗新药的研发和临床前实验研究工作。“不安分”的他总觉得还是没有找到自己的“归宿”，他始终坚信，没有应用前景的研究只能锁在象牙塔中，直到他进入中科院基因组所。 /p p 　　碰撞出的基因测序仪 /p p 　　2008年，中科院北京基因组所时任副所长于军研究员，也是任鲁风的博士生导师，针对生命科学仪器的发展提出了模块化DNA分析系统的概念，即对于DNA进行不同层次的分析时，可以是少数几种分子生物学核心技术的一种或多种的集成。此后，在与中科院半导体所的科研交流中，双方一拍即合，提出了研发当时技术复杂度最高，同时也是未来预期应用最广泛的第二代高通量基因测序仪的思路。 /p p 　　这个多学科碰撞出的火花，让当时刚刚进入测序技术研究领域的任鲁风激动不已。“进入研究组后，我才发现，原来我对基因组学、基因测序的了解是那么的浅显。”任鲁风说。 /p p 　　研究小组提出用不同学科领域的技术解决生命科学领域应用的问题。经过生物学和物理学两个看似完全不相干的团队历时半年的相互交流学习，任鲁风和同事们了解了半导体材料和相关的光电技术，也向他们普及了基因检测的相关知识。最终，联合研究组确定了研发基因测序仪所采取的技术路线。 /p p strong 　　再难也要做下去 /strong /p p 　　“2008年的时候，当时买一台类似的测序仪要花400万元，中科院给我们两年半时间，用406万元经费开发出一台测序仪，说实话当时我也觉得挺难的。”回忆起当年情景，任鲁风感慨万千。 /p p 　　“第一年走的弯路非常多，在摸索技术路线时，我们发现了很多问题。到2009年9月，项目要进行中期汇报时，我们才刚刚在仪器研发和技术开发方面入了门。当时非常焦虑，但是再难也要走下去。”任鲁风说。 /p p 　　从2009年9月到2011年4月验收结题，实际上他们只花了一年半时间便完成了这台基因测序仪原理样机的研发。个中曲折，已不能尽数。 /p p 　　功夫不负有心人。2011年3月，第一台基因测序仪原理样机搭建完成并功能实现，同年4月通过了中科院专家组的现场验收。 /p p 　　基因测序仪原理样机的研发成功不仅仅给了研究组信心，同样也为基因组所的学术方向结构完整性提供了有力的支持。在基因组所的“一三五”发展规划中，测序技术研发占据了非常重要的地位。任鲁风在当年博士毕业留所，自信满满地带领新成立的DNA测序技术研究开发中心团队进入下一个攻坚阶段——工程样机的开发工作，但却遇到了极大的困难，差点导致夭折。 /p p 　　工程样机的开发工作涉及到对仪器系统的全面重新设计，对各个部件都需要从工程化角度评估和测试，需要远远高于原理样机研发时所需要的经费。因为种种原因，这个项目虽然得到了研究所最大程度的支持，但一两百万元的经费对于这项工程来说实在是杯水车薪，争取国家项目资助又因为种种原因未获成功，开发工作一度陷入断粮状况。“最少的时候直接参与开发工作的只剩两三个人，我不得不争取一些小的项目咬牙支撑这个项目走下去。”任鲁风回忆起工程样机开发阶段的艰难也会有些唏嘘。 /p p 　　峰回路转，2013年10月，项目组与紫鑫药业达成协议，共建中科紫鑫公司实现基因测序仪项目产业化。科研项目的产业化转化所带来的资金和发展契机让任鲁风看到了希望。 /p p 　　“直到2015年1月，中科紫鑫已经完成了20多台机器，准备投放到遴选出的试用用户手里，让他们做免费的试用，我需要业内的评价。”任鲁风说。 /p p 　　国产自主知识产权的基因测序技术对国家的意义、国家在国际上的战略地位以及对精准医学的发展意义重大。任鲁风告诉记者，“我们的机器上市之后，国外的垄断企业一定会大幅度降价，对我国整体基因产业发展也会有更多的推进作用。” /p p 　　“这一个项目我做了7年，这辈子能做几个这样的项目?它就像我的孩子一样，对于自己的孩子，哪怕再难、再苦我都要坚持。”任鲁风说。 /p

p 　　测序技术的每一次变革，都是对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发等领域的巨大推动作用。从1977年第一代DNA测序技术(Sanger法)，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。 /p p 　　根据原理的不同，人们将测序技术发展分为三个阶段，第一代，sanger测序。第二代，高通量测序(NGS)。第三代，单分子/纳米孔测序。由于三代测序技术各有优缺点，应用的领域也不尽相同，第一代测序技术仍未被淘汰，目前的测序市场是三代测序技术并存的局面。 /p p style=" text-align: center " strong 第一代：sanger测序 /strong /p p 　　第一代测序技术，主要基于 Sanger双脱氧终止法的测序原理，结合荧光标记和毛细管阵列电泳技术来实现测序的自动化，基本方法是链终止或降解法，人类基因组计划就是基于一代测序技术。第一代的Sanger测序技术的优点是，测序读长长，能达到800-1K bp，且测序用时短，只需要几十分钟即可完成一次测序，测序准确度高准确性高达99.999%，目前仍是测序的金标准 缺点是通量低、成本高，影响了其真正大规模的应用。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/c42dc54f-dd66-44ff-b704-d7ae009f055b.jpg" title=" 1.jpeg" / /p p 　　因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。 /p p style=" text-align: center " strong 第二代：高通量测序(NGS) /strong /p p 　　高通量测序技术(又称为下一代测序，Next Generation Sequencing，NGS)自2005年454公司推出第一台基于焦磷酸测序二代测序仪开始，到2017年Illumina推出NovaSeqTM系列，高通量测序技术经历了十几年的技术发展过程，NGS测序平台也经历了一系列的收购和合并，最终形成主要三家测序平台，包括：Illumina的Solexa平台、Life Technologies的 Ion Torrent平台和华大基因的Complete Genomics平台。 /p p 　 span style=" color: rgb(0, 176, 240) " strong 　1.Illumina平台 /strong /span /p p 　　由于其技术成熟，平台之间高度互补性与交叉性，使得其在短读长测序上大占优势，是目前应用最广泛的NGS平台。目前其占据了测序仪市场约70%的市场份额。 /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 176, 240) " strong 2.Life Technologie平台 /strong /span /p p 　　Life公司Ion Torrent测序平台采用的为半导体测序原理，其在非碱基多聚体(non-homopolymer)的测序上正确率与其它NGS平台相差无几，而对于连续碱基的检测还不够完善，在检测同一碱基连续出现时的数量可能会有所误差。相对于其他平台，测序通量较小，平台数量也较少。 /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 176, 240) " strong 3.Complete Genomics平台 /strong /span /p p 　　Complete Genomics平台采用了高密度DNA纳米芯片技术，在芯片上嵌入DNA纳米球，然后用复合探针-锚定分子连接(cPAL)技术来读取碱基序列。虽然这些技术非常准确，但该技术在应用上最大的限制可能就是其过短的读长。 /p p 　　高通量测序技术经历了十几年的飞速发展，人类基因组测序成本已经从人类基因组计划的约30亿美元降到了1000美元左右。目前二代测序设备在通量、准确度上都有了较大的提高，同时测序成本也随之大幅度下降，成为商用测序的主流。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/179d5f56-cfcc-48c2-a654-d53e05adb76b.jpg" title=" 2.jpeg" / /p p style=" text-align: center " strong 第三代：单分子/纳米孔测序 /strong /p p 　　测序技术在近两年中又有新的里程碑，Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术，被认为是第三代测序技术。与前两代技术相比，他们最大的特点是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，其中，Heliscope技术和SMRT技术利用荧光信号进行测序，而纳米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序。 /p p 　　由于第二代技术存在短读长和耗时长的缺陷，人们希望第三代测序技术能解决这些缺陷，第三代测序技术通过现代光学、高分子、纳米技术等手段来区分碱基信号差异的原理，以达到直接读取序列信息的目的，三代测序设备在DNA 序列片段读长上优于二代设备，但在准确度上较二代设备差，目前尚未完全成熟，市场应用面还不算广，未来随着技术的改善，三代测序设备将更为稳定和成熟。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201807/insimg/cc5887e2-9c01-4a0b-8a42-128f991dee7d.jpg" title=" 3.jpeg" / /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 176, 240) " strong 第三代测序优势： /strong /span /p p 　　1)第三代基因测序读长较长，如Pacific Biosciences 公司的 PACBIO RS II 的平均读长达到 10kb，可以减少生物信息学中的拼接成本，也节省了内存和计算时间。 /p p 　　2)直接对原始DNA样本进行测序，从作用原理上避免了 PCR 扩增带来的出错。 /p p 　　3)拓展了测序技术的应用领域，二代测序技术大部分应用基于DNA，三代测序还有两个应用是二代测序所不具备的：第一个是直接测RNA的序列，RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同，根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。 /p p 　　4)三代测序在ctDNA，单细胞测序中具有很大的优势：ctDNA含量非常低，三代测序技术灵敏度高，能够对于1ng以下做到监测 在单细胞级别：二代测序要把DNA提取出来打碎测序，三代测序直接对原始DNA测序，细胞裂解原位测序，是三代测序的杀手应用。 /p p 　 span style=" color: rgb(0, 176, 240) " strong 　第三代测序缺陷： /strong /span /p p 　　1)总体上单读长的错误率依然偏高，成为限制其商业应用开展的重要原因 第三代基因测序技术目前的错误率在15%-40%，极大地高于二代测序技术NGS的错误率(低于1%)。不过好在三代的错误是完全随机发生的，可以靠覆盖度来纠错(但这要增加测序成本)。 /p p 　　2)三代测序技术依赖DNA聚合酶的活性。 /p p 　　3)成本较高，二代Illumina的测序成本是每100万个碱基0.05-0.15美元，三代测序成本是每100万个碱基0.33-1.00美元。 /p p 　　4)生信分析软件也不够丰富。 /p p 　　三代测序和二代测序相比较，第二代测序技术的优点是成本较之一代大大下降，通量大大提升，但缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统偏向性，同时读长也比较短。第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的，它的根本特点是单分子测序，不需要任何PCR的过程，这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误，三代读长超长，准确低，费用高，但因读长长，利于组装和发现unique reads潜在优势明显，但是劣势也限制了三代测序的商业应用。 /p p 　　 strong 未来前景 /strong /p p 　　目前，第二代的基因测序技术高通量测序(NGS)是市场商用主流。第三代的单分子/纳米孔测序将是未来的大势所趋，但是预计在将来5-10年内二、三代基因测序会共存，但二代测序仍将是测序市场商业应用主流。 /p

——2022上半年生命科学仪器新品盘点系列基因测序是指利用血液、组织、细胞等生物样品，对DNA进行检测的技术，迄今为止已历经四代发展，是实现精准医疗的重要手段之一。齐碳科技在今年6月份发布了纳米孔基因测序仪家族新成员QNome-3841hex，作为一款桌面式测序仪，其最大的特点在于更为灵活的通量，支持最多6个测序任务独立运行；铭毅智造在5月推出了自主研发的单色荧光高通量基因测序仪UniSeq2000TM，采用微流控芯片技术，能够实现对不同类型的科研和临床样品进行基因测序；赛默飞基于成熟的Applied Biosystems技术推出了新型SeqStudio Flex系列基因分析仪，可进行Sanger测序和多重荧光片段分析；赛纳生物在今年1月线上发布了S100测序仪。为了方便大家熟悉了解基因测序仪新品的看点与亮点，小编特别进行了一期简评，供大家学习了解。齐碳科技:换新升级 纳米孔基因测序仪家族再添新成员2022年6月6月28，齐碳科技发布国产自研量产纳米孔基因测序仪升级版QNome-3841hex，作为一款桌面式测序仪，其最大的特点在于更为灵活的通量，支持最多6个测序任务独立运行，测序过程中可自由组合测序芯片，灵活可控，无需凑样，最大程度上降低开机成本。升级版测序仪QNome-3841hex还搭载全新升级测序芯片QCell-384，单张芯片可产出3G数据量，在6张芯片同时运行的环境下，一次测序可获取18G数据，满足了更高通量的测序需求。齐碳科技 QNome-3841hex基因测序仪小编点评：作为齐碳QNome家族的新成员，QNome-3841hex的成功发布，标志着国产纳米孔基因测序仪开始矩阵化发展，将满足市场更多元的测序需求，为各领域的研究及应用提供核心支持。铭毅智造:新品UniSeq2000TM 微流控与单色荧光发光测序结合2022年5月5月9日，铭毅智造科技有限公司发布了自主研发的单色荧光高通量基因测序仪UniSeq2000TM。根据产品介绍，UniSeq2000TM采用微流控芯片技术，结合单色荧光发光测序化学技术，可以实现对不同类型的科研和临床样品进行基因测序，目前设计最大芯片数量为2张，每张芯片通量为160-320M Reads，可提供SE50/75/100/150，PE75/100/150等多种读长模式，测序数据质量Q3080%，测序周期为12-24小时，具有测序精度高、效率快、成本低、操作简单等优势。铭毅智造 UniSeq2000TM高通量基因测序仪小编点评：铭毅智造发布的新品UniSeq2000TM是一款针对临床应用的测序设备，操作简单，无需值守，适合医院本地化检测使用。高通量测序技术这个关键技术过去一直被国外公司垄断，国产单色荧光高通量基因测序仪UniSeq2000TM的发布，代表着国产基因测序仪新势力的崛起，期待越来越多的国产高端科学仪器的诞生。赛默飞:推出新品SeqStudio Flex基因分析仪 兼备测序和片段分析2022年4月2022年4月，赛默飞世尔科技推出了新型Applied Biosystem SeqStudio Flex系列基因分析仪，基于成熟的Applied Biosystems技术，通过改进优化设计和技术，使其高效灵活、简单易用且智能连接。该新品也是市面上第一款具备远程服务功能的毛细管电泳基因分析仪，打破了物理距离的限制并简化了数据传输、分析和科研协作过程，帮助科研工作者把更多的时间集中在重要工作上。SeqStudio Flex基因分析仪可进行高水平的Sanger测序和多重荧光片段分析，应用广泛，从简单的靶向测序到识别最新SARS-CoV-2病毒变异株，为科研人员提供所需的高质量数据和可靠性能。赛默飞 SeqStudio Flex基因分析仪小编简评：赛默飞推出的新一代中通量SeqStudio Flex基因分析仪，进一步扩展了Applied Biosystems产品组合，凭借成熟的Applied Biosystems的技术和智能化设计将继续引领Sanger测序和多重荧光片段分析未来的发展方向。赛纳生物: S100测序仪 采用荧光发生和纠错编码测序技术2022年1月2022年1月12日，赛纳生物线上发布S100测序仪，它是一款高通量测序平台，具有检测速度快、灵活部署、无需凑样的特点。赛纳生物测序仪采用了独创的基于荧光发生原理的边合成边测序（Fluorogenic SBS）技术。处于暗态的Fluorogenic核苷酸分子无荧光发出，当被DNA聚合酶识别并结合进入待测DNA模板时放出荧光，通过依次参与反应的核苷酸种类及荧光强度可判断DNA序列信息。该技术将发光集团修饰在磷酸键上，使用天然碱基和简单常用的聚合酶及磷酸酶，没有分子疤痕和测序偏差，降低测序过程的复杂度，可在短时间内完成天然状态DNA合成并获得精确的荧光信号，测序过程快速、结果准确，易于获得长读长。赛纳生物 S100测序仪小编简评：赛纳生物发布的S100测序仪，体型小，操作简单，具有通量灵活、准确度高、多场景适用的特点。该新品于6月获得欧盟CE-IVDR认证，在一定程度上证明了赛纳生物的研发能力和产品质量得到国际机构的认可与肯定。后记：国产企业在生命科学上游高端仪器设备持续发力，4款新品基因测序仪中，国产品牌占据3席。今年国家发改委印发的《“十四五”生物经济发展规划》提出，加快发展高通量基因测序技术，推动以单分子测序为标志的新一代测序技术创新，不断提高基因测序效率、降低测序成本。可以说，测序技术的创新已上升至国家战略层面，希望国产厂商能够乘势而上，奋勇向前。

6月8日，齐碳科技正式对外宣布完成超4亿人民币B轮融资，由高瓴创投和鼎晖VGC（创新与成长基金）联合领投，博远资本、华盖资本及阳光融汇资本跟投，老股东高榕资本、中关村协同创新基金、银杏谷资本、雅惠投资及BV百度风投持续加码。齐碳科技专注于纳米孔单分子基因测序仪及配套试剂、芯片的自主研发、制造及应用开发。据了解，本轮融资完成后，齐碳将进一步加大科研投入，加速产业化进程，计划于今年内完成定型产品量产并推向市场。单分子纳米孔测序技术备受青睐纳米孔技术因其不需要复杂的酶扩增以及荧光标记，且其具有低成本高通量的特点而受到广大研究者们的青睐。纳米孔DNA测序的基本原理图与传统Sanger测序技术相比，纳米孔单分子测序技术的核心优势在于它的便携性、低成本和高通量。总体而言，相较于主流二代测序仪，纳米孔测序仪具有长读长、小巧便携、实时输出结果等优势，特别适合病原微生物快速检测、基因组结构变异以及重复序列变异检测。美国国家卫生研究院（NIH）提出了“1000美元测序”的概念，而基于纳米孔的DNA测序技术是最有潜力实现这一目标的方法之一，众多实验研究也进一步验证了纳米孔DNA测序技术的可行性。齐碳科技为国内唯一实现纳米孔测序仪产品化的企业齐碳科技创立于2016年，致力于纳米孔基因测序仪及配套试剂耗材的自主研发、制造与应用，是目前全球唯二、国内唯一通过自主研发实现纳米孔基因测序仪产品化的高科技企业。2020年9月，齐碳科技成功发布我国第一台纳米孔单分子基因测序仪QNome-9604，填补了国内新一代基因测序技术领域的空白。该款测序仪可直接检测过孔核酸，无需PCR扩增，读长可达150Kbp以上，8小时可稳定产出500Mbp数据，单次准确率达90%，设备小巧便携，可突破中心实验室使用限制，应用场景更为灵活。目前该产品已通过TÜV莱茵第三方检测，认定QNome-9604在基因测序通路数量、准确率、读长等方面的检测数据全部达标。投资人观点齐碳科技联合创始人&董事长胡庚博士表示，非常感谢齐碳科技的新老股东们对我们的长期关注与支持。齐碳科技成立至今不到五年，高效的完成了首款国产纳米孔基因测序仪的技术研发和产品定型，并将于今年实现产品量产，这一切都离不开团队的努力、股东的支持和市场的关注。本轮融资完成后，齐碳科技将投入更多的资源到团队扩充、产品升级、产能提升及商业拓展中，努力将更快更好的基因测序技术推广到更广阔的应用场景中。高瓴联席首席投资官、高瓴创投生物医药与医疗器械负责人易诺青表示：“齐碳科技研发了国内首台纳米孔基因测序仪，成功打破了基因测序设备、配套芯片及试剂研发领域的高壁垒和海外垄断，攻克了国内基因测序‘卡脖子’的技术难题。在市场应用空间中，微生物病原检测、癌症检测等细分领域适合成为纳米孔基因测序仪的首选应用方向。我们将长期支持国家重点领域科技研发，推动高水平科技自立自强。”鼎晖创始合伙人、鼎晖投资创始合伙人王霖表示：“基因测序行业增长迅速，传统二代测序技术在应用中存在一定的局限。作为下一代长读长测序技术中壁垒最高的产业链上游，齐碳科技具有强大的研发实力，产品迭代升级、性能提升速度快，公司目前在纳米孔基因测序仪方面的技术已达到全球领先水平。我们很高兴可以和齐碳科技这类硬科技公司携手同行，并期待公司产品早日实现在科研端和临床端的大规模应用。”博远资本创始合伙人陈鹏辉表示：纳米孔测序技术近年来快速发展，准确度、通量、成本等各方面都有了极大提升，科研和临床的应用场景持续拓宽，照亮了过去从未看到的基因组的黑暗角落。齐碳科技在具有强大战斗力的创始人团队带领下，成功突破纳米孔测序仪的超高技术门槛，产品顺利进入商业化阶段，公司也成为了国内该领域毫无疑问的龙头企业。博远资本非常高兴能够参与本轮融资，将持续赋能公司未来发展，在生命科学和精准医疗领域贡献更大价值。华盖资本医疗基金执行总经理孟楠认为，基因检测技术开发与应用在全球范围内已经进入高速发展期，齐碳科技创始团队具有全球视野及高效的研发能力，其拥有纳米孔基因测序方面的技术已达到全球领先水平。“我们高度认可齐碳科技团队的产品研发能力和开拓能力，相信在白净卫博士的带领下，公司将获得长足发展。华盖未来将助力公司成为测序领域的领导者，持续为社会创造价值。”阳光融汇资本合伙人石晟昊表示：第四代基因测序技术在读长，测序时间等方面有天然优势，齐碳科技团队的技术扎实、完整。作为这一技术路线国内产品化和商业化最快的公司，齐碳科技具有显著的投资价值。阳光融汇非常荣幸参与本轮融资，相信公司未来将在创始团队的带领下持续拓展第四代基因测序的技术和应用边界，成为基因测序行业龙头企业。

一. 测序仪对比测序技术代表仪器读长通量准确度成本Sanger法ABI 3730xl DNA Analyzer500-800bp0.096Gbp/天99.99%0.24美分/bpIlluminaHiSeq X Ten System150bp1800Gbp/运行99.9%0.01美分/bp华大智造MGISEQ-2000200bp（单端）或2×150bp（双端） 60Gbp/运行 99.9% 0.015美元/bpRoche 454GS FLX+ System700bp0.7Gbp/运行99.9%0.02美元/bpABI SOLiDSOLiD System 5500xl75bp120Gbp/运行99.94%0.13美分/bpPacBioSequel II System10kb60Gbp/运行99%0.15美元/bpNanoporeMinION Device100kb30Gbp/运行90%0.02美元/bpHelicosHeliScope Single Molecule Sequencer25-50bp28Gbp/运行未知　　1. ABI 3730xl DNA Analyzer图源自thermofisher官网　　1.1. 相关原理　　 DNA测序：基于Sanger法的原理，利用DNA聚合酶在体外DNA复制过程中随机掺入带有荧光标记和终止子的双脱氧核苷酸(ddNTPs)，从而得到不同长度的DNA片段。这些片段经过电泳分离后，通过激光激发和CCD检测，得到每个碱基发出的荧光信号，从而确定DNA的碱基序列。　　 片段分析：基于荧光检测的原理，利用不同颜色的荧光染料标记不同长度或类型的DNA片段，如微卫星、SNP、AFLP等。这些片段经过电泳分离后，通过激光激发和CCD检测，得到每个片段发出的荧光信号，从而确定片段的大小或等位基因。　　1.2. 主要组成　　ABI 3730xl DNA Analyzer仪器是一种高通量的DNA测序和片段分析的平台，它可以同时使用48或96根毛细管进行电泳分离和荧光检测。　　 测序仪主机：包含电泳系统、自动进样系统、激光系统、光学系统、温控系统、聚合物输送系统等多个模块，用于控制仪器的运行和数据的采集。　　 计算机工作站：预装用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件，如Data Collection Software、Sequencing Analysis Software、SeqScape Software、GeneMapper Software等。　　 毛细管阵列：提供预组装的48根或96根毛细管阵列，它们与业界标准的96孔和384孔板配合使用。毛细管为内部无涂层毛细管，可提供300次的运行质保。　　 DNA测序试剂和耗材：包括BigDye Terminator循环测序试剂盒、GeneScan分子量标准品、片段分析标准品、POP-7聚合物分离胶等。　　1.3. 主机模块　　 电泳系统：负责将DNA片段在毛细管中进行电泳分离，根据不同长度的DNA片段在电场中的迁移速度不同，将它们按照从小到大的顺序排列。电泳系统由高压电源、电泳缓冲液、毛细管阵列等组成。　　o 高压电源：提供高达30kV的电压，使DNA片段在电场中迁移。　　o 电泳缓冲液：提供电导性和pH稳定性，使DNA片段在毛细管中顺利运行。　　o 毛细管阵列：提供预组装的48根或96根毛细管，它们与业界标准的96孔和384孔板配合使用。毛细管为内部无涂层毛细管，可提供300次的运行质保。　　 自动进样系统：负责将样品从96孔或384孔板中自动吸取，并注入到毛细管阵列中。自动进样系统由进样针、进样泵、进样阀等组成。　　o 进样针：用于从样品板中吸取样品，并通过进样阀将样品注入到毛细管中。　　o 进样泵：用于控制进样针的吸取和释放动作，以及进样量的大小。　　o 进样阀：用于控制进样针与毛细管之间的连接和断开，以及进样时间的长短。　　 激光系统：负责将激光光束照射到毛细管阵列的出口处，激发荧光信号。激光系统由激光器、光纤、光学开关等组成。　　o 激光器：提供单波长、505nm、固态、长寿命的激光光源，用于激发荧光染料。　　o 光纤：用于将激光光束从激光器传输到毛细管阵列上。　　o 光学开关：用于控制激光光束的开启和关闭，以及激光功率的大小。　　 光学系统：负责将荧光信号收集并转换为电信号。光学系统由滤光片、透镜、CCD相机等组成。　　o 滤光片：用于选择不同颜色的荧光信号，并过滤掉背景噪声。　　o 透镜：用于聚焦和放大荧光信号，并将其投射到CCD相机上。　　o CCD相机：用于将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机工作站进行数据采集和分析。　　 温控系统：负责控制仪器的温度，保证测序的稳定性和可靠性。温控系统由温度传感器、风扇、加热器等组成。　　o 温度传感器：用于监测仪器内部和外部的温度，并反馈给温控器进行调节。　　o 风扇：用于散热和通风，维持仪器的适宜温度。　　o 加热器：用于加热和保温，防止仪器的过冷。　　 聚合物输送系统：负责将聚合物分离胶从储存瓶输送到毛细管阵列中，作为电泳介质。聚合物输送系统由压力罐、气压调节器、流量计等组成。　　o 压力罐：用于储存聚合物分离胶，并提供一定的压力，使聚合物分离胶能够流动。　　o 气压调节器：用于控制压力罐的气压，以及聚合物分离胶的流速。　　o 流量计：用于测量聚合物分离胶的流量，以及毛细管中的胶量。　　2. HiSeq X Ten System图源自Illumina官网　　HiSeq X Ten System是Illumina公司的产品。Illumina是一家生物技术公司，它的测序仪是基于桥式PCR和荧光检测的技术，也是目前最流行的二代测序平台之一。它的测序仪有多个系列，如NovaSeq、HiSeq、MiSeq、MiniSeq等，它们的核心技术原理是相同的，但在通量、读长、准确度、成本等方面有所不同。　　2.1. 相关原理　　 文库构建：将待测DNA打断成小片段，并在两端加上特殊的接头(Adaptor)，这些接头包含与流通池表面探针互补的序列(P5/P7)、用于区分不同文库的索引(Index)、以及用于测序引物结合的序列(Rd1 SP/Rd2 SP)。文库构建后需要进行质量检测和定量。　　 聚集体生成：将文库DNA片段注入到流通池中，并与表面探针杂交结合。然后进行桥式PCR扩增，使每个DNA片段形成一个聚集体。聚集体生成后需要进行温度变化和化学处理，使其单链化并去除P5端的DNA链，只留下P7端的DNA单链。　　 边合成边测序：将带有荧光染料和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到流通池中，并利用DNA聚合酶将它们连接到聚集体的DNA链上。每次只能加入一个碱基，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号，从而确定碱基序列。然后用化学剂去除荧光染料和可逆终止子，使下一个碱基可以继续加入。重复这个过程，直到完成所有的测序循环。　　 数据分析：将CCD相机收集到的荧光信号转换为原始数据(BCL文件)，并进行质量控制和过滤，去除低质量的聚集体和信号。然后根据索引将不同文库的数据分离，并进行碱基识别(Base calling)，将荧光信号转换为碱基序列(FASTQ文件)。最后根据不同的测序目的，进行后续的数据分析，如比对、变异检测、表达量计算等。　　2.2. 主要组成　　 流通池(Flow cell)：是一个微型的玻璃芯片，它的表面覆盖了数亿个固定在不同位置的寡核苷酸探针，这些探针与文库DNA片段的接头互补，可以通过杂交结合。流通池内部有多个通道，每个通道可以进行不同的测序反应。　　 聚集体(Cluster)：是指通过桥式PCR在流通池表面扩增形成的由相同DNA片段组成的簇，每个聚集体可以发出荧光信号，从而被检测为一个读长(Read)。聚集体的密度和质量会影响测序的效率和准确度。　　 荧光染料(Fluorescent dye)：是指用于标记不同碱基的四种荧光分子，它们分别对应A、T、C、G四种碱基，并发出不同颜色的光。荧光染料还带有可逆终止子，可以控制每次只加入一个碱基。　　 激光器(Laser)：是指用于激发荧光染料发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。　　 CCD相机(CCD camera)：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机进行数据分析。　　 计算机系统(Computer system)：是指用于控制测序仪运行和处理数据的设备，它预装了用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件，如BaseSpace Sequence Hub、Sequencing Analysis Software等。　　3. MGISEQ-2000图源自华大智造官网　　MGISEQ-2000测序仪是一种基于荧光检测的第二代测序技术，可以实现高通量、高精度、低成本的基因组测序。　　3.1. 相关原理　　o DNA测序：基于双端测序的原理，利用DNA聚合酶在体外DNA复制过程中随机掺入带有荧光标记和终止子的双脱氧核苷酸(ddNTPs)，从而得到不同长度的DNA片段。这些片段经过桥式扩增后，形成单分子簇，然后通过四色荧光检测，得到每个碱基发出的荧光信号，从而确定DNA的碱基序列。　　o 片段分析：基于荧光检测的原理，利用不同颜色的荧光染料标记不同长度或类型的DNA片段，如微卫星、SNP、AFLP等。这些片段经过桥式扩增后，形成单分子簇，然后通过四色荧光检测，得到每个片段发出的荧光信号，从而确定片段的大小或等位基因。　　3.2. 主要组成　　o 测序仪主机：包含流体控制系统、温控系统、激光系统、光学系统、信号采集系统等多个模块，用于控制仪器的运行和数据的采集。　　§ 流体控制系统：负责控制样品和试剂的输送，以及测序反应的进行。流体控制系统由进样针、进样泵、进样阀等组成。　　§ 进样针：用于从样品板中吸取样品，并通过进样阀将样品注入到芯片上。　　§ 进样泵：用于控制进样针的吸取和释放动作，以及进样量的大小。　　§ 进样阀：用于控制进样针与芯片之间的连接和断开，以及进样时间的长短。　　§ 温控系统：负责控制仪器和芯片的温度，保证测序的稳定性和可靠性。温控系统由温度传感器、风扇、加热器等组成。　　§ 温度传感器：用于监测仪器和芯片内部和外部的温度，并反馈给温控器进行调节。　　§ 风扇：用于散热和通风，维持仪器和芯片的适宜温度。　　§ 加热器：用于加热和保温，防止仪器和芯片的过冷。　　§ 激光系统：负责将激光光束照射到芯片上，激发荧光信号。激光系统由激光器、光纤、光学开关等组成。　　§ 激光器：提供单波长、532nm、固态、长寿命的激光光源，用于激发荧光染料。　　§ 光纤：用于将激光光束从激光器传输到芯片上。　　§ 光学开关：用于控制激光光束的开启和关闭，以及激光功率的大小。　　§ 光学系统：负责将荧光信号收集并转换为电信号。光学系统由滤光片、透镜、CCD相机等组成。　　§ 滤光片：用于选择不同颜色的荧光信号，并过滤掉背景噪声。　　§ 透镜：用于聚焦和放大荧光信号，并将其投射到CCD相机上。　　§ CCD相机：用于将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机工作站进行数据采集和分析。　　§ 信号采集系统：负责对数字化的电信号进行滤波、校准、分段、碱基识别等处理，最终生成测序结果。信号采集系统由数据采集卡、数据处理软件等组成。　　§ 数据采集卡：用于将CCD相机传输的电信号接收并转换为数字信号，以及进行一定的滤波和校准处理。　　§ 数据处理软件：用于对数字信号进行进一步的分段、碱基识别、质量评估等处理，以及生成测序结果文件。　　o 计算机工作站：预装用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件。　　o 芯片：芯片是MGISEQ-2000测序仪的核心部件，它是一种微流控芯片，上面有数百万个微孔，每个微孔都可以进行单分子簇测序，实现高通量的数据产出。芯片有不同的规格和类型，如单端测序芯片、双端测序芯片、片段分析芯片等，可以根据不同的需求选择合适的芯片。　　4. GS FLX+ System图源自罗氏官网　　GS FLX+ System测序仪是一种基于焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术的二代测序平台，它可以提供高通量、高准确度和超长读长的DNA测序服务。　　4.1. 相关原理　　 文库构建：将待测DNA打断成小片段，并在两端加上特殊的接头(Adaptor)，这些接头包含与DNA捕获珠表面探针互补的序列(A/B)、以及用于测序引物结合的序列(P1/P2)。文库构建后需要进行质量检测和定量。　　 乳液PCR：将文库DNA片段与DNA捕获珠混合，并加入油相形成乳液滴。每个乳液滴中只包含一个DNA捕获珠和一个文库DNA片段。然后进行PCR扩增，使每个DNA捕获珠上形成一个单分子聚集体。乳液PCR后需要进行破乳液和洗涤处理，去除多余的油相和PCR试剂。　　 PTP装载：将经过乳液PCR处理后的DNA捕获珠注入到PTP中，并使每个微孔中只有一个DNA捕获珠。然后进行温度变化和化学处理，使聚集体单链化并去除A端的DNA链，只留下B端的DNA单链。　　 边合成边测序：将带有荧光染料和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到PTP中，并利用DNA聚合酶将它们连接到聚集体的DNA链上。每次只能加入一个碱基，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号，从而确定碱基序列。然后用化学剂去除荧光染料和可逆终止子，使下一个碱基可以继续加入。重复这个过程，直到完成所有的测序循环。　　 数据分析：将CCD相机收集到的荧光信号转换为原始数据(SFF文件)，并进行质量控制和过滤，去除低质量的聚集体和信号。然后进行碱基识别(Base calling)，将荧光信号转换为碱基序列(FASTA/FASTQ文件)。最后根据不同的测序目的，进行后续的数据分析，如比对、变异检测、表达量计算等。　　4.2. 主要组成　　 测序仪主机：包含电泳系统、自动进样系统、激光系统、光学系统、温控系统、聚合物输送系统等多个模块，用于控制仪器的运行和数据的采集。　　 计算机工作站：预装用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件，如Data Collection Software、Sequencing Analysis Software等。　　 PicoTiterPlate(PTP)：是一个微型的塑料板，它的表面覆盖了数百万个微孔，每个微孔可以容纳一个DNA捕获珠(DNA Capture Bead)，并进行单分子测序反应。　　 DNA捕获珠(DNA Capture Bead)：是一种直径约28微米的磁性珠子，它的表面覆盖了数千个固定在不同位置的寡核苷酸探针，这些探针与文库DNA片段的接头互补，可以通过乳液PCR(Emulsion PCR)扩增形成单分子聚集体(Single Molecule Cluster)。　　 荧光染料(Fluorescent dye)：是指用于标记不同碱基的四种荧光分子，它们分别对应A、T、C、G四种碱基，并发出不同颜色的光。荧光染料还带有可逆终止子，可以控制每次只加入一个碱基。　　 激光器(Laser)：是指用于激发荧光染料发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。　　 CCD相机(CCD camera)：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机进行数据分析。　　4.3. 主机组成　　 电泳系统：是指用于将带有荧光染料和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到PTP中，并利用DNA聚合酶将它们连接到聚集体的DNA链上的系统。每次只能加入一个碱基，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号，从而确定碱基序列。　　 自动进样系统：是指用于将经过乳液PCR处理后的DNA捕获珠注入到PTP中，并使每个微孔中只有一个DNA捕获珠的系统。然后进行温度变化和化学处理，使聚集体单链化并去除A端的DNA链，只留下B端的DNA单链。　　 激光系统：是指用于激发荧光染料发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。　　 光学系统：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机进行数据分析。　　 温控系统：是指用于控制PTP板和反应液的温度，以保证测序反应的稳定性和效率的系统。　　 聚合物输送系统：是指用于将不同类型和浓度的聚合物溶液输送到PTP板中，以提供不同阶段所需的反应条件和试剂的系统。　　5. SOLiD System 5500xl图源自thermofisher官网　　SOLiD System 5500xl测序仪是一种基于连接法测序(Sequencing by Ligation)技术的二代测序平台，它可以提供高通量、高准确度和中等读长的DNA测序服务。　　5.1. 相关原理　　 文库构建：将待测DNA打断成小片段，并在两端加上特殊的接头(Adaptor)，这些接头包含与DNA捕获珠表面探针互补的序列(P1/P2)、以及用于测序引物结合的序列(Rd1 SP/Rd2 SP)。文库构建后需要进行质量检测和定量。　　 乳液PCR：将文库DNA片段与DNA捕获珠混合，并加入油相形成乳液滴。每个乳液滴中只包含一个DNA捕获珠和一个文库DNA片段。然后进行PCR扩增，使每个DNA捕获珠上形成一个单分子聚集体。乳液PCR后需要进行破乳液和洗涤处理，去除多余的油相和PCR试剂。　　 FlowChip装载：将经过乳液PCR处理后的DNA捕获珠注入到FlowChip中，并使每个微孔中只有一个DNA捕获珠。然后进行温度变化和化学处理，使聚集体单链化并去除P1端的DNA链，只留下P2端的DNA单链。　　 边连接边测序：将带有荧光探针和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到FlowChip中，并利用DNA连接酶将它们连接到聚集体的DNA链上。每次只能加入一个碱基对，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号，从而确定碱基对序列。然后用化学剂去除荧光探针和可逆终止子，使下一个碱基对可以继续加入。重复这个过程，直到完成所有的测序循环。　　 数据分析：将CCD相机收集到的荧光信号转换为原始数据(BCL文件)，并进行质量控制和过滤，去除低质量的聚集体和信号。然后进行碱基识别(Base calling)，将荧光信号转换为碱基对序列(FASTQ文件)。最后根据不同的测序目的，进行后续的数据分析，如比对、变异检测、表达量计算等。　　5.2. 主要组成　　 测序仪主机：包含电泳系统、自动进样系统、激光系统、光学系统、温控系统、聚合物输送系统等多个模块，用于控制仪器的运行和数据的采集。　　 计算机工作站：预装用于仪器控制、数据收集和样品文件自动分析的软件，如Data Collection Software、Sequencing Analysis Software等。　　 FlowChip：是一个微型的玻璃芯片，它的表面覆盖了数百万个微孔，每个微孔可以容纳一个DNA捕获珠(DNA Capture Bead)，并进行单分子测序反应。　　 DNA捕获珠(DNA Capture Bead)：是一种直径约28微米的磁性珠子，它的表面覆盖了数千个固定在不同位置的寡核苷酸探针，这些探针与文库DNA片段的接头互补，可以通过乳液PCR(Emulsion PCR)扩增形成单分子聚集体(Single Molecule Cluster)。　　 荧光探针(Fluorescent probe)：是指用于标记不同碱基对的四种荧光分子，它们分别对应A/T、T/A、C/G、G/C四种碱基对，并发出不同颜色的光。荧光探针还带有可逆终止子，可以控制每次只加入一个碱基对。　　 激光器(Laser)：是指用于激发荧光探针发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。　　 CCD相机(CCD camera)：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机进行数据分析。　　5.3. 主机组成　　 电泳系统：是指用于将带有荧光探针和可逆终止子的四种dNTPs逐一加入到FlowChip中，并利用DNA连接酶将它们连接到聚集体的DNA链上的系统。每次只能加入一个碱基对，然后用激光激发荧光信号，并用CCD相机记录每个聚集体发出的荧光信号，从而确定碱基对序列。　　 自动进样系统：是指用于将经过乳液PCR处理后的DNA捕获珠注入到FlowChip中，并使每个微孔中只有一个DNA捕获珠的系统。然后进行温度变化和化学处理，使聚集体单链化并去除P1端的DNA链，只留下P2端的DNA单链。　　 激光系统：是指用于激发荧光探针发光的光源，它可以提供单波长、固态、长寿命的激光光束。　　 光学系统：是指用于捕捉和记录荧光信号的设备，它可以将荧光信号转换为数字化的电信号，并传输给计算机进行数据分析。　　 温控系统：是指用于控制FlowChip板和反应液的温度，以保证测序反应的稳定性和效率的系统。　　 聚合物输送系统：是指用于将不同类型和浓度的聚合物溶液输送到F

p 　　北京大学生物动态光学成像中心/北京未来基因诊断高精尖创新中心/生命科学联合中心/工学院黄岩谊教授课题组日前在DNA测序方法的研究上取得重要突破。该团队在此前谢晓亮教授首创的荧光发生测序技术基础上发展了一种全新概念的测序方法——纠错编码(简称ECC)测序法。ECC测序法采取一种独特的边合成边测序(SBS)策略，利用多轮测序过程中产生的简并序列间的信息冗余，大幅度增加了测序精度。该进展于2017年11月6日以“Highly accurate fluorogenic DNA sequencing with information theory-based error correction”为题在线发表于《自然 生物技术》(Nature Biotechnology)期刊上。 /p p 　　ECC测序法的化学反应采用了荧光发生测序技术，该技术由谢晓亮课题组于2011年首次报道(Nature Methods (2011) 8, 575.)，原理巧妙之处在于在DNA互补链合成时可以释放同所延伸核苷酸数目相等的荧光分子，利用这一反应可以实现低错误率的SBS。黄岩谊课题组在此基础上，过去几年对该方法进行了拓展(ChemBioChem (2015) 16, 1153.)，为本次技术突破奠定了基础。该团队首先从化学原理上对荧光发生测序技术中的荧光标记分子进行了结构优化，设计合成了具有不同波长、更优性能的测序底物分子，并对聚合酶参与的各阶段反应动力学进行了细致的测量和建模 在深入理解荧光发生测序化学反应速度、完成度、副反应等关键技术细节的基础上，完善了ECC测序原理样机的搭建，不断迭代优化测序反应条件和信号采集流程 从数据入手，构建了精确的测序信号失相模型并提出了次级延伸理论，并据此开发出算法软件对测序反应失相过程做出了合理简化使其具备了实用性。 /p p 　　在ECC测序法中，序列信息的冗余来自黄岩谊课题组新发展的“对偶碱基荧光发生”SBS测序流程，该流程通过对测序试剂按对偶碱基分为两两匹配的三组，并对待测DNA序列进行三轮独立测序，继而产生三条互相正交的简并序列编码。这三条编码可互为校验，后续不但能够通过解码推导出真实碱基序列信息，而且具备对单轮测序错误位点的校正能力。ECC编码和解码策略已被广泛应用在信息通讯和存储等其它领域中，并被证实可以有效检测和纠正数据传输或存储时发生的错误。此次黄岩谊团队在测序技术中首次引入冗余编码概念，通过和低错误率的荧光发生测序技术巧妙结合，在实验室搭建的原理样机上获得了单端测序超过200碱基读长无错误的实验结果。 /p p 　　该论文作者包括北京大学博士后陈子天，博士研究生周文雄、乔朔、康力，段海峰副研究员，谢晓亮教授和黄岩谊教授 黄岩谊是这篇文章的通讯作者。该工作先后得到了北京市科委、国家科技部863计划、国家自然科学基金、北大-清华生命科学联合中心以及北京未来基因诊断高精尖创新中心的资助。 /p

一家由Facebook亿万富豪尤里&bull 米尔纳(Yuri Milner)支持的小型企业正在寻求进入DNA测序的热门领域，其所研发的产品是一款和笔记本电脑相同尺寸和重量&mdash &mdash 可能也会是相同价格&mdash &mdash 的设备。 　　&ldquo 我们所谈论的DNA测序工具是一款类似于iPad的设备，使用起来非常简便，成本也相当低廉，&rdquo GenapSys公司31岁的联合创始人兼首席执行官何塞姆&bull 艾斯方迪亚普尔(Hesaam Esfandyarpour)表示，&ldquo 我们的目标是将它带到普罗大众的手中。&rdquo 　　这一观点和Illumina截然不同：Illumina是一家出售面向研究人员的DNA测序工具、化学品和其他工具的企业，去年的销售额高达14.2亿美元。今年早些时候，Illumina宣布，其成功到达了生物学上期盼已久的一个里程碑：以1,000美元的价格解密人类的全套DNA序列。 　　然而相关设备的成本价高达100万美元，且必须十个一组进行购买，明年仅有几十个可供出售。这是DNA测序工厂的中心 大型实验室，如位于剑桥的哈佛-麻省理工布罗德研究所(The Harvard-MIT Broad Institute)，以及澳大利亚的嘉万医学研究所(Garvan Institute of Medical Research)立刻进行了订购。 　　艾斯方迪亚普尔表示，他的机器每台售价仅为几千美元，用户可能需要为使机器运作起来的原料和化学品支付更多资金。但他尚未定下官方价格。GenasSys即将上市的原因是想要让科学家们更早地使用到这些机器。商业性质的产品上市将在一年多以后实现。艾斯方迪亚普尔在佛罗里达州马可岛的年度基因组生物学及技术进步研讨会(Advances in Genome Biology & Technology Meeting，以下简称&ldquo AGBT会议&rdquo )上首次谈论了该项技术。 　　DNA测序背后的概念类似于生命科技公司(Life Technologies)出售的Ion Torrent设备的原理 后者正使用一种半导体芯片试图和Thermo Fisher的产品进行融合。(艾斯方迪亚普尔曾经致力于该设备的授权专利的研究。)但两款设备的原理有所不同：Ion Torrent设备测量的是DNA反应时释放的离子，而GenapSys设备测量的则是DNA分子在进行复制、释放其编码时的电信号。 　　艾斯方迪亚普尔表示，Ion Torrent的设备需要多块芯片，每次运作可能需要几百美元的代价。第一次运作将测量1 个gigabase的DNA，第二次测量20个gigabase，第三次则测量100个gigabase&mdash &mdash 这是精确分析人类基因组所需要的DNA编码数量。 　　&ldquo 这可能是一块利基市场，一种真正小型的设备，价格仅相当于一台笔记本电脑，大小也与笔记本差不多，&rdquo GenasSys顾问委员会受雇顾问、哈佛大学的乔治&bull 彻奇(George Church)表示，&ldquo 价格绝对低廉，甚至都不能称其为设备。它填补了(Illumina)MiSeq或(Ion Torrent)或Nanopores公司尚未涉足的一块利基市场。&rdquo 此外，他还希望，GenasSys的DNA测序设备的价格能在该产品正式推出后进一步下降。彻奇表示，他在GenasSys总部亲眼见证过这些机器的运作。 　　GenapSys科学顾问委员会的另一名成员、斯克瑞普斯研究所(Scripps Institute)的埃里克&bull 拓普尔(Eric Topol)也同样表达了乐观情绪。他表示，这款设备的重量仅有几磅重，在另一种重要的DNA测序方法上表现良好：读数长度(read length)，即设备一次所能读取的DNA数量。(所有测序设备都只能解码部分基因编码，然后采用超级计算机进行重新组合。) 　　&ldquo 我们正开始一个针对患有糖尿病儿童的抗体测序的研究项目，如果不能进行长读数，这个项目甚至无法开展，&rdquo 拓普尔说，&ldquo 随着时间的推移，这将被证明是有用的、重要的，但显然现在还处于非常早期的阶段。&rdquo 　　阿拉巴马州亨茨维尔的哈德孙阿尔法研究所(HudsonAlpha Institute)所长兼主任里克&bull 迈尔斯(Rick Myers)为一家风险投资基金对GenapSys进行了审查。&ldquo 我对此感到激动，因为我认为这家公司真的有潜力，&rdquo 迈尔斯说，&ldquo 他们一定要这么做，把产品带到科学家手中，而他们有潜力成为这个领域的真正玩家。&rdquo 　　基因组学研究人员此前一直都是广告宣传的受害者。几年前，采用激光技术来对DNA单个分子进行测序的太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)发誓要赶超Illumina 它从未成功，但成为了超长DNA读数领域的利基玩家。两年前，一家名为Oxford Nanopore的公司展示了一款指状存储器大小的DNA测序仪，并表示将很快有售&mdash &mdash 但目前为止市场上仍不见其踪影，不过14日上午，布罗德研究所的一名研究员大卫&bull 杰夫(David Jaffe)在AGBT会议上展示了源自于该设备的数据。研究人员对此表示激动，但也警告说，这款设备可能&ldquo 易于出错&rdquo 。高盛分析师艾萨克&bull 罗(Isaac Ro)称，这一演示对Illumina公司来说&ldquo 完全是积极的&rdquo ，因为这使得竞争变得更为不可能了。 　　艾斯方迪亚普尔表示，他从未想过单个DNA分子测序&mdash &mdash 正如Oxford Nanopore和太平洋生物科学公司所做的那样&mdash &mdash 会有高准确率 物理学原理使得这非常困难。他认为，他的方法既便宜又更好。他利用400万美元的奖励金和来自Facebook亿万富豪尤里&bull 米尔纳、德诚资本、盈富泰克创业投资公司(IPV Capital)的不到5,000万美元资金打造了自己的仪器。现在，他必须证明这款仪器可以实现他的愿望。

如果说二代测序的使命是使成本降低到1000美元/基因组的话，那么三代测序的使命就是使成本降低到100美元/基因组，进一步促进测序发展为临床的常规检测技术，在临床诊疗上发挥更大的作用。在年初的J.P.Morgan健康医疗大会上，美国基因测序公司Illumina宣布将创建一个新公司——Grail，致力于开发一种不超过1000美元的血液检测，用于多类型癌症的早期筛查。这种肿瘤DNA测序的主要目的是在无症状的个体中诊断各种各样的癌症，从而实现提前预防或治疗。　　随着技术的不断进步，基因测序的成本正变得越来越“亲民”。不过，人们认为1000美元仍然不能使基因测序成为一个“飞入寻常百姓家”的临床诊断价格，人们的下一个目标是100美元。　　“如果说二代测序的使命是使成本降低到1000美元/基因组的话，那么三代测序的使命就是使成本降低到100美元/基因组，进一步促进测序发展为临床的常规检测技术，在临床诊疗上发挥更大的作用。”南方科技大学副教授、深圳市瀚海基因生物科技有限公司(以下简称“瀚海基因”)创始人兼CEO贺建奎告诉《中国科学报》记者，随着第三代测序技术(即“单分子测序技术”)的发展，人们距离这个目标正越来越近。　　第三代测序更易临床推广　　在世界范围内，基因测序仪一度被几家主要的公司所垄断，著名的测序公司有Illumina、Life Tech、罗氏(Roche)、太平洋生物等，我国99%以上的测序仪和试剂都依赖于进口。而在单分子测序方面，此前也仅有美国和英国推出了第三代测序仪。　　“业界对第三代测序仪非常关注。太平洋生物于2014年推出一款小型化的单分子测序仪Sequel，在短短一个月的时间内，他们公司股价就上涨了一倍。”瀚海基因化学部总监高雁介绍说，在临床应用方面，第三代测序仪有着比二代测序仪更大的优势。　　“二代测序需要一个比较复杂的样品制备过程，同时为了建库，还需要匹配十余台设备，光这些设备就需要一百多万元。”高雁告诉《中国科学报》记者，二代测序技术很难在医院推广——医生并不愿意进行烦琐的、需要相对专业水平的样品制备等操作，他们更期待一键式、自动化的操作仪器：待测样品放进去，自动运行，隔天之后就得到一个非常直接的报告，而不是将测序结果交由第三方的生物信息学的专业人员进行分析，再给医生反馈。　　贺建奎认为，相比二代测序，第三代测序技术在临床上的应用有明显优势：第三代测序技术不需要PCR扩增，可直接对单个分子进行测序 样品制备简单，测序成本进一步降低 可直接读取RNA的序列和包括甲基化在内的DNA修饰。这些优势可以大大改善临床基因测序的成本、速度和质量。　　瀚海基因2014年5月份立项，致力于开发一款面向临床应用、可供医生直接使用的第三代基因测序仪。2015年10月底，瀚海基因率先在国内研发出第三代测序仪的原理样机“GenoCare”，引起了国内外的广泛关注。贺建奎预计，工程样机将于2016年下半年制成。　　精准医疗的入口　　基因测序作为精准医疗的重要一环，随着技术的进步以及成本的下降，近年来发展迅速。　　精准医疗主要包括精准诊断和精准治疗两部分。作为精准诊断的关键，基因测序已成为当仁不让的精准医疗的入口。如今，医疗部门通过基因测序及分析技术对病人分子层面信息进行收集，再利用生物信息学分析工具对所有信息进行整合并分析，医生可以早期预测疾病的发生、可能的发展方向和疾病可能的结局，以帮助作出诊断。　　贺建奎介绍说，目前，单分子测序平台可以广泛应用于无创产前诊断、肿瘤早期无创诊断、胚胎植入前遗传学筛查、病原体检测和遗传病基因变异检测等。　　“已有文献报道证明，对唐氏综合征的筛查，单分子测序技术比Illumina测序技术对检测21号染色体异常更为灵敏。”高雁告诉记者，他们的实验设计还显示，单分子测序能够检测到3%的低频突变。　　对于病患而言，如果切除癌症的肿瘤组织，其中大概只有40%是真正的癌症组织，其余60%则是正常的血管等组织。而在40%的癌症组织中，大约只有50%发生了癌细胞突变，另外一半正常。这样算下来，需要真正检测的有突变的癌症细胞只占所要切除的癌症组织的20%左右。　　“我们研究团队将靶向基因捕获和测序融合在一步完成，实现了单分子靶向测序。经过实验设计，证实了可以检测到3%低频突变。所以我们认为，这个原理将来有可能用到癌症的早期检测。”高雁说。　　此外，贺建奎告诉记者，对于诸如埃博拉等重大暴发性传染病的应用领域，第三代或第四代(纳米孔分子测序)测序技术的应用，更是能够第一时间让病毒现出原形，从而为重大传染病防控提供科学依据。　　“测序技术不能仅仅用于科研，更要用于临床，这样才拥有更广阔的市场和更长久的生命力。”高雁说。　　并非取代二代测序　　尽管第三代测序技术优势多多，但并不意味着单分子测序无所不能，也并非毫无瑕疵。贺建奎告诉记者，目前第三代测序并不能取代二代测序，而是作为对其的一种补充共同发展。　　“单分子测序有通量限制，普遍不如二代测序仪高。这限定了其在全基因组测序方面‘拼’不过二代测序仪。”贺建奎说，单分子测序仪并不适合独立做全基因组测序，更适于针对有限的、个性化的、目标性的应用。　　此外，第三代测序仪尽管节省了人力和物料成本，但它的硬件成本还相对较高。贺建奎举例说，太平洋生物公司一款单分子测序仪的成本约为150万美元，其最新版本尽管降低了1/3的成本，其“身价”仍令人咋舌。　　“总体来讲，第三代测序仪还处于起步的发展阶段，仍有未知的空间等待进一步探索。比如三代测序仪提供了一个强大功能，它或能发现潜在遗传信息。”贺建奎说，基因测序技术作为生物大产业的金字塔顶尖的技术，需要国家大力支持。　　“三代测序技术的发展需要国家像支持国产CPU、国产大飞机那样的力度去支持。”贺建奎认为，基因测序技术涉及多学科领域的交叉，这一行业的快速发展，势必带来光学、表面化学等工业品质的提升，这些方面的共同进步最终将推动“中国制造”走向“中国创造”。

盘点一下市场常见国产测序仪研发公司，这个赛道的公司主要集中在深圳和成都，北京和上海分别有一家企业。企业地区产品今是科技成都Gseq500万众一芯成都ATGC-MICRO NGS基因测序仪齐碳科技成都QNome-9604、QNome-3841、QNome-3841hex瀚辰光翼成都高通量基因分型系统华大智造深圳DNBSEQ-T20×2、DNBSEQ-T10×4、DNBSEQ-T7、MGISEQ-2000、MGISEQ-200、DNBSEQ-G99、DNBSEQ-E25真迈深圳SURFSeq 5000系列、FASTASeq 300系列、GenoLab M系列、GenoCare 1600系列赛陆医疗深圳Salus Pro芯像生物上海Starseq 100赛纳生物北京S100铭毅智造深圳UniSeq2000测序仪安序源生物深圳AXP100-RS纳米孔基因测序仪　　测序仪是生物科技领域的重要工具，它可以读取生命的密码——DNA，为疾病诊断、药物研发、基因编辑等提供数据支持。目前，测序仪的技术发展主要经历了三代，分别是基于化学合成的第一代(Sanger法)、基于荧光信号的第二代(高通量测序)和基于电信号的第三代(单分子测序)。随着测序需求的增加和成本的降低，第四代测序技术——纳米孔测序正在崭露头角，它可以实现快速、廉价、准确和长读长的测序。　　在这一领域，成都作为中国西部的科技中心，拥有多家创新型企业，正努力扛起测序仪的大旗。其中，齐碳科技、今是科技、万众一芯和瀚辰光翼是四家代表性的企业，它们分别从不同的角度和方向，开发出具有自主知识产权和国际竞争力的测序仪产品。图源自齐碳科技官网　　齐碳科技是中国第一家成功研发出纳米孔基因测序仪原理样机、工程样机、产品样机并推出产品的企业。它的产品——齐碳纳米孔基因测序仪QNome-9604，填补了我国新一代基因测序技术领域的空白。该产品已经在多个领域得到应用，如微生物、人类、动植物研究，肿瘤早期筛查、罕见病诊断等临床研究。图源自今是科技官网　　今是科技是一家专注于纳米孔测序技术的企业，其愿景是“让基因测序成为精准医疗的常规手段，提升人类健康水平”。它开发并商用了第四代(纳米孔)基因测序仪和试剂——Gseq500是一款中通量基因测序仪。该测序仪配合专用芯片MK，可实现DNA和RNA测序。可在10小时内输出高达15Gb的优质长读长测序数据，可实时识别碱基，灵活测序，无需累积样本，它能满足靶向重测序、小型基因组测序、甲基化测序等重点运用。其技术核心是基于蛋白纳米孔和核酸碱基相互作用所产生的特征电流信号，通过高度集成的芯片系统在单分子水平实现对核酸的高通量测序。以诺奖工作参与者、世界顶级的纳米孔测序专家为核心，今是科技组建了包括生化、集成电路、材料、MEMS、有机合成、算法等方向中美两地资深专家在内的研发团队，已基本覆盖了第四代基因测序仪研发所需要的专业领域。图源自万众一芯官网　　万众一芯是一家专注于半导体生化检测领域的企业，其目标是成为半导体生化检测领域的独角兽。它开发了一种基于半导体芯片的新型基因测序仪——ATGC-MICRO NGS基因测序仪。该产品搭载自主研发的高灵敏度 ISFET 测序芯片(包括26万门或400万门2种传感器)，采用无磁珠测序法，仪器自动完成测序模板富集和测序，利用电信号代替传统光学信号，实现高速电子测序，获得高质量的Fsatq 格式数据，官网称是业内最快、最小的基因测序仪。图源自瀚辰光翼官网　　瀚辰光翼是一家专注于高通量基因分型系统的企业，其愿景是成为全球生命科技客户最信赖的伙伴。它开发了一种基于荧光信号的高通量基因分型系统——瀚辰光翼高通量基因分型系统GeneMatrix。该产品单次实验最大通量可达7680个数据点，实现大规模的基因分型和遗传分析。该产品具有高效率、高准确度、高稳定性、高可重复性等特点，应用于子辅助育种、前景标记筛查、种质资源基因型鉴定、品系鉴定、健康风险、营养代谢、遗传特征等领域。　　综上，成都作为中国西部的科技中心，现已孵化出这四家企业，正努力扛起测序仪的大旗。这些企业从不同的角度和方向，开发出具有自主知识产权和国际竞争力的测序仪产品，为生物科技领域的发展和人类健康的提升做出了贡献。我们期待这些企业能够继续创新和突破，为测序技术的进步和普及做出更大的贡献。但也面临着一些挑战和问题。要想成为未来基因测序新高地还需要从以下几个方面进行努力：　　一是加大对基因测序仪器设备的量产投入和支持，提升产业链上游的核心竞争力。　　二是拓展基因测序技术的终端应用领域，推动基因测序技术与其他产业的融合发展，创造更多的社会价值和经济效益。　　三是加强对基因测序行业的市场开拓和品牌建设，提升成都基因测序企业在国内外的知名度和影响力，争取更多的合作机会和市场份额。　　四是加强对基因测序行业的人才培养和引进，打造一支高素质、高水平、高效率的创新团队，为基因测序行业的发展提供人才保障。　　五是加强对基因测序行业的监管和服务，建立健全相关的法律法规和标准规范，保障基因测序技术的安全、合规、质量和效果。　　总之，成都在基因测序行业方面有着不可忽视的优势和潜力，也面临着一些挑战和机遇。抓住时代发展的契机，充分发挥自身优势，积极解决存在的问题，期待成都成为未来基因测序新高地。　　本文作者：Lambyang

在“二代测序”(NGS)尚未迎来投资热潮的情况下，技术突破捷报连连的“三代测序”(3GS)又进入到了投资人的视野中。1986年，第一台商用基因测序设备正式出现，到第二代测序设备出现，期间间隔了19年时间。而第二代设备问世，到第三代设备的诞生，仅仅用了5年，基因测序设备的更新换代速度正在不断加快。这就好比“2G”手机跳过“3G”，直接跨越到了“4G”时代。　　报告通过四个方面对第三代基因测试技术进行分析：　　1、第三代基因测试技术的发展现状 　　2、第三代基因测试方法原理 　　3、第三代极影测试技术优势和劣势 　　4、国内外布局第三代基因测试技术的公司情况。　　1、第三代基因测试技术的发展现状　　以Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术为代表的三代测序技术在经过了多年发展后，已经逐步趋于成熟。　　尽管当下该技术还有成本偏高、错误率较高、生物信息学分析软件不够丰富的问题，但其在读长、测序速度等方面都具有明显优势。　　三代测序设备已实现稳定性、小型化，未来随着准确度提升、平行测序能力和酶活性等问题的解决，第三代测序技术将成为未来发展的重要技术趋势，实现大规模商业化将是大势所趋。　　2、第三代基因测序方法原理　　Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技术，被认为是第三代测序技术。　　与前两代技术相比，他们最大的特点是单分子测序，其中，Heliscope技术和SMRT技术利用荧光信号进行测序，而纳米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序。　　PacBio SMRT技术应用了边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体，芯片上有很多小孔，每个孔中均有DNA聚合酶。　　测序基本原理是：DNA聚合酶和模板结合,4色荧光标记4种碱基(即是dNTP),在碱基配对阶段,不同碱基的加入,会发出不同光,根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。DNA聚合酶是实现超长读长的关键之一,读长主要跟酶的活性保持有关,它主要受激光对其造成的损伤所影响。　　另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间的距离增大，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。SMRT技术的测序速度很快，每秒约数个dNTP。　　但是，同时其测序错误率比较高(这几乎是目前单分子测序技术的通病)，达到15%。但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错(代价是重复测序，也就是成本会增加)。SMRT技术原理图　　Oxford Nanopore Technologies公司所开发的纳米单分子测序技术与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号的测序技术。　　该技术的关键之一是，设计了一种特殊的纳米孔(只能容纳单分子通过)，孔内共价结合有分子接头。当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度(每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的)，灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。Nanopore技术原理图　　3、第三代基因测序技术的优势和劣势　　相比于二代测序，三代测序具有如下优势：　　1、第三代基因测序读长较长。如Pacific Biosciences公司的PACBIO RS II 的平均读长达到10kb，可以减少生物信息学中的拼接成本，也节省了内存和计算时间。　　2、直接对原始DNA样本进行测序，从作用原理上避免了PCR扩增带来的出错。　　3、拓展了测序技术的应用领域。二代测序技术大部分应用基于DNA，三代测序还有两个应用是二代测序所不具备的：第一个是直接测RNA的序列，RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误差。第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同，根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。　　4、三代测序在ctDNA，单细胞测序中具有很大的优势：ctDNA含量非常低，三代测序技术灵敏度高，能够对于1ng以下做到监测 在单细胞级别：二代测序要把DNA提取出来打碎测序，三代测序直接对原始DNA测序，细胞裂解原位测序，是三代测序的杀手应用。　　同时，第三代基因测序也存在一定的缺陷：　　1、总体上单读长的错误率依然偏高，成为限制其商业应用开展的重要原因 第三代基因测序技术目前的错误率在15%-40%，极大地高于二代测序技术NGS的错误率(低于1%)。不过好在三代的错误是完全随机发生的，可以靠覆盖度来纠错(但这要增加测序成本)。　　2、三代测序技术依赖DNA聚合酶的活性。　　3、成本较高，二代Illumina的测序成本是每100万个碱基0.05-0.15美元，三代测序成本是每100万个碱基0.33-1.00美元。　　4、生信分析软件也不够丰富(如图所示)：一、二、三代基因测序技术对比图　　4、国内外布局三代测序的公司情况　　国外布局三代测序的主要有Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technologies等公司，2015年10月27日，国内公司瀚海基因(Direct Genomics)公布了基于Helicos技术研发的专门用于临床的第三代单分子测序仪GenoCare 原理样机。　　中科院北京基因组研究所与浪潮基因组科学也在共同研制国产第三代基因测序仪。在测序仪价格方面，PACBIO 2011年的第一台三代测序仪PacBioRS在美国价格80万美金，2015年生产的sequel测序仪价格35万美金，大幅下降。在测序成本方面，预计未来5年内三代测序能达到100美元全基因组测序的价格。国内外布局三代测序的公司　　第三代测序技术是大势所趋　　从兴证医药健康这份报告中可以看到：目前，第三代测序在技术上相对于二代在读长和测序速度等方面有明显优势，但在成本和准确率等方面还有待提升。目前国内只有瀚海基因在三代测序上有临床成果，而国外已经初步实现技术商业化。总体而言，第三代测序技术是未来发展趋势，实现大规模商业化将是大势所趋。　　本篇报告内容由动脉网整理自兴证医药健康投资报告

国家药品监督管理局发布通知，公开征求基因测序仪临床评价注册审查指导原则。该指导原则为对基因测序仪的一般要求，意见稿规定临床申报产品需明确基本原理、产品类型、核心部件等结构组成、性能参数要求及软件核心功能算法、适用范围及预期用途、安全性评价等产品评价方面。以下是通知详情：各有关单位：　　根据国家药品监督管理局2021年度医疗器械注册技术指导原则制修订计划的有关要求，我中心组织起草了《基因测序仪临床评价注册审查指导原则（征求意见稿）》。经文献汇集、企业调研、专题研讨和专家讨论，形成了征求意见稿。　　为使该指导原则更具有科学合理性及实际可操作性，即日起在网上公开征求意见，衷心希望相关领域的专家、学者、管理者及从业人员提出意见或建议，推动指导原则的丰富和完善。　　请将意见或建议以电子邮件的形式于2021年10月27日前反馈我中心。　　联系人：郑生伟、方丽　　电话: 010-86452541；010-86452538　　电子邮箱：zhengsw@cmde.org.cn；　　　　　　　fangli@cmde.org.cn　　附件：1.基因测序仪临床评价注册审查指导原则（征求意见稿）（下载）　　　　　2.《基因测序仪临床评价注册审查指导原则（征求意见稿）》意见反馈表（下载）国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心2021年10月13日

p style=" text-align: center " /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/noimg/b9badc3b-2ddc-463d-94cc-6895afc62199.jpg" title=" 黄岩谊.jpg" width=" 627" height=" 195" style=" width: 627px height: 195px " / /p p style=" text-align: center " 图. 全新设计的核苷酸底物通过聚合酶的延伸反应产生荧光产物用于测序 br/ /p p 　　在国家自然科学基金项目(项目编号：21327808，21525521)等资助下，北京大学黄岩谊课题组日前在DNA测序方法与技术上取得重要进展，发展一种全新概念的测序方法—纠错编码测序法(简称ECC)，该方法采取一种独特的边合成边测序(SBS)策略，利用多轮测序过程中产生的简并序列间的信息冗余，大幅度增加了测序精度。研究成果于2017年11月6日发表在Nature Biotechnology(《自然-生物技术》)期刊上。论文链接：http://www.nature.com/articles/nbt.3982。 /p p 　　序列信息的冗余来自黄岩谊团队新发展的“对偶碱基荧光发生”SBS测序流程，该流程通过全新设计的特殊测序反应底物，对待测DNA序列进行三轮独立的SBS测序，继而产生三条互相正交的简并序列编码。这三条编码可互为校验，后续不但能够通过解码推导出真实碱基序列信息，而且具备对单轮测序错误位点的校正能力。这种编码和解码策略已被广泛应用在其它科学领域中，用于有效检测和纠正错误。此次黄岩谊团队在测序技术中首次引入冗余编码概念，通过和低错误率的荧光发生测序技术相结合，在实验室搭建的原理样机上获得了单端测序超过200碱基读长无错误的实验结果。在ECC测序中，黄岩谊团队首先从化学原理上对荧光发生测序技术中的荧光标记分子进行了结构优化，设计合成了具有不同波长、更优性能的测序底物分子，并对聚合酶参与的各阶段反应动力学进行了细致的测量和建模。在深入理解荧光发生测序化学反应速度、完成度、副反应等关键技术细节的基础上，构建了精确的测序信号失相模型并提出了次级延伸理论，并据此开发出算法软件对测序反应失相过程做出了合理简化使其具备实用性。 /p p style=" text-align: right " 【原标题：我国学者在DNA测序方法与技术上取得重要进展】 /p p br/ /p

在10月27日南方科技大学举行的“基因组测序技术进展国际研讨会”上，深圳市瀚海基因生物科技有限公司发布了其自主研发的单分子基因测序仪“GenoCare”原理样机。据瀚海基因创始人兼CEO、南方科技大学副教授贺建奎介绍，这是亚洲首个具有自主知识产权、中国第一台制成样机的第三代测序仪。　　与已应用于临床的(第二代)基因测序设备相比，该测序仪能够直接读取患者最原始的DNA或RNA分子序列，可大大改善临床基因测序的成本、速度和质量。　　早期参与到该项目的医院有深圳妇幼保健院、深圳人民医院以及南方医科大学南方医院，这些医院通过该仪器评估，在患者血液中发现了病毒DNA以及循环的肿瘤DNA分子，指导病人个性化选择乙肝抗病毒药物和癌症的治疗办法。　　“对于中国数以百万计的乙肝患者来说，耐药性是个棘手问题，而一种经济实惠的方式是通过检测该病毒与耐药相关的基因序列，从而帮助医生指导病人选择正确核苷酸类似物治疗。”南方医科大学南方医院疾病感染中心教授王战会说，“第三代测序技术有潜力发展成为医院广泛使用的临床基因突变检测工具。”　　“单分子测序方法提供了一个适合于临床的置信水平。同时也提供了技术优势，如降低样本处理错误的风险，并允许对许多疾病重要的基因表达或拷贝数变异绝对定量。”贺建奎说，他们预计在2016年下半年完成试用机的研制。

p 　　对很多人来说，基因测序仪都是一个很陌生的名词。然而，如果你感受过独步世界的中国高铁技术，见证过中国发射的量子卫星，还听说过独占世界超算排行榜长达五年的中国超级计算机，那么处于全球领先地位的中国基因测序仪也绝对值得一探究竟。 /p p 　　人们常说，19世纪是蒸汽机的世纪，20世纪是汽车和计算机的世纪，而21世纪则是生命科学的世纪。生命科学研究将在医疗健康、体育运动、农业养殖、司法刑侦、太空探索等众多方面广泛而深远地改造人类生活。作为生命科学研究最核心的基础性工具，基因测序仪已经成为当前中美全面科技竞争的重要领域。 /p p 　　 strong span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 什么是基因测序 /span /strong /p p 　　基因测序技术是基因组学研究的核心技术，是现代生命科学研究中最广泛应用的重要技术。你可能还不知道，地球上几乎所有你能看见和看不见的生命形式都是由基因编码而成的。塞满商场的人类、卖萌为生的熊猫，爬过阳台的甲虫、各类叫不上名字的树木花草以及数万亿和我们亲密接触的细菌、微生物，都是由DNA编码的生命体。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201908/uepic/a458d63e-538a-4d26-b3cd-50c2933870ba.jpg" title=" 1.jpg" alt=" 1.jpg" / /p p 　　每一个生命都像是执行一段代码的程序，而DNA正是生命的源代码。相应地，破解生命源代码的技术，就是DNA测序。 /p p 　　 strong span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 发现双螺旋——让测序成为可能 /span /strong /p p 　　如果说测序技术的进步是发掘矿藏的过程，那么还需要先行者告诉我们矿藏的方向和位置。完成这项任务的，正是科学界的两位顶尖人物——沃森和克里克。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201908/uepic/d812d00c-25b0-471a-91bf-31490093244a.jpg" title=" 2.jpg" alt=" 2.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 双螺旋结构的发现者James Watson和Francis Crick /span /p p 　　1953年，沃森和克里克发现了DNA双分子螺旋结构，人类对生命的认识有了重大的突破，即：“生命是序列的，生命是数据的。”生命体的全基因组包含了其全部遗传信息，这些信息是A-T、C-G四种碱基两两配对后排列成的长链。这些碱基的排列信息可以被读取出来，以1010001的二进制形式存储在计算机中 可见，生命的密码是一组可以被数据化的碱基排布序列。因此，测定DNA序列就成为解读遗传信息的先决条件和整个生命科学研究的重要基础。 /p p 　　可以说，正是DNA双螺旋结构的发现，带动了DNA测序技术的大发展，开启了人类历史上方向明确而历时长久、道路曲折、投入巨大、进展惊人的探索。 /p p 　　 strong span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 测序技术发展的四个阶段 /span /strong /p p 　　DNA双螺旋的发现，让破解生命源代码的DNA测序在原理上成为可能，现在我们就来回顾测序技术的具体发展，其主要经历了四个阶段。因篇幅所限，这篇文章将为你展示前两个阶段。 /p p 　　 strong 阶段1：从“前直读”到“直读” /strong /p p 　　1964年，即DNA螺旋被发现11年后，康奈尔大学的研究者第一次分析了酵母的核苷酸序列。这次研究标志着一个新时代的开始。不过，正如承载生命信息的大分子经历了从RNA到DNA的历程，最开始的测序方法是用来测定RNA序列的，实验用不同的RNA酶对RNA模板进行“消化”(digestion)，并根据反应后产物中可能重叠的序列间接推导可能的完整序列。这种测序技术流程繁琐，推导复杂，很难重复，验证还更为困难。不仅如此，在试图测定双链且更加稳定的DNA时，这种方法没能获得成功。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 305px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201908/uepic/f6459ef0-726f-4dab-805d-2c1b3ea314e1.jpg" title=" 3.jpg" alt=" 3.jpg" width=" 600" height=" 305" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 直读法示例 /span /p p 　　在技术的发展史上，新技术的出现就像制作一个木桶，每一块木板都代表一种必须具备的基础条件，任意一块板的缺失都不构成一个木桶，同时，木板之间还需要彼此适应和融合。直接读取DNA序列的测序技术(即“直读法”)，正是这样一个木桶。它是在分子克隆技术、凝胶电泳技术、放射自显影三种技术全部成熟之后才出现的。在这三种技术的基础之上，直接读取DNA序列的SBC和SBS测序法问世。“直读法”的最大突破在于不再需要间接推导，而是可以直接在凝胶上按顺序直观读出测序模板，判断DNA分子每个碱基位置上为T-C还是A-G。 /p p 　　SBC与SBS这两种方法在原理上相似，但具体操作有诸多不同。SBC法使用化学试剂，有较强的毒性，且技术复杂较难掌握，成功率不高。相比之下，SBS法使用酶试剂，具有操作简便、结果稳定、准确性高且重复性好等特点。更有意思的是，运用SBS法的设备相对简单，可以实验室自制或采用通用设备，还有使用方便的标准化试剂盒，因此很快风靡全球相关实验室。SBS法由英国科学家桑格(Frederick Sanger)于1975年率先发明，因此也被称为Sanger法。这种直读法的发明也为DNA测序的数字化和自动化奠定了基础 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201908/uepic/dc28748a-368f-4144-8805-8b14db973ec8.jpg" title=" 4.jpg" alt=" 4.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " Sanger电泳法跑胶结果示例图 /span br/ /p p 　　 strong 阶段2：从手工到自动化 /strong /p p 　　上世纪80年代以前，分子生物学这门学科一直都被戏称为“现代技术、手工操作”，直到DNA测序技术出现，分子生物学才有了第一种实现自动化和信息化的技术。此后测序技术在几十年发展历程中不断吸收其他领域新技术(如物理领域的纳米技术及激光技术、化学领域的荧光标记核苷酸技术、生化领域的毛细管电泳分析、信息领域高密度芯片等技术)并将它们融为一体的成果，形成了现代科学研究技术中的强力工具。 /p p 　　1986年，加州理工学院的胡德(Leroy Hood)发明了以四种荧光物质标记测序反应产物的“四色荧光法”，这些荧光物质在不同波长的激光下呈现不同颜色。这项技术成为广受欢迎的SBS测序法(Sanger测序法)走向自动化的关键突破。　　 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201908/uepic/c56d19b1-381e-4039-89b4-c54f701e45ec.jpg" title=" 5.jpg" alt=" 5.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" font-family: 楷体, 楷体_GB2312, SimKai " 四色荧光法原理示意图和自动测序仪的四色荧光“峰图” /span br/ /p p 　　这种方法将测序效率提高了数倍，读长达到500nt(nt：nucleotide 核苷酸，是衡量单链核酸的长度单位)，分辨率大为提高 而且，这是测序技术发展史上首次真正彻底抛弃了放射性物质的使用。测序效率也称为“通量“，是指单台设备一次反应所获取的序列数据量。 /p p 　　另外，还有一个与通量同样重要的概念——“读长”：测序仪的测序原理是将目标DNA大量复制，然后用酶将这些DNA长链切断，并分别对每一小段测序，最后将这些片段拼接还原成完整的长链。读长就是指测序仪能读出的每一个DNA片段的长度。这两个概念很重要，后面还会经常提到。 /p p 　　据此，美国ABI公司在1986年推出了第一台商品化的平板电泳全自动测序仪——ABI 370A。此后，该公司又推出了多种改进型，在读长、通量、准确性方面都有很大提高，这种自动化测序仪成为划时代的国际“人类基因组计划(HGP)”得以启动的重要技术依据。 /p p 　　尽管这一代测序仪为“人类基因组计划”做出了突出贡献，但只实现了测序过程的自动化，在自动测序之前的细菌克隆、手工制胶、手工加样等操作都需要消耗大量的人力。一组数据可以说明问题：在“人类基因组计划”冲刺阶段，华大在6个月的时间里完成了50万次成功的测序反应，共消耗了1500万个形状大小与医用“针头”类似的移液器吸头。 /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 0, 0) " 未完待续，详见下期： /span strong span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 爆发式的进步 /span /strong /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 小贴士 /strong /span /p p 　　 strong 1.人类基因组计划(Human Genome Project, HGP) /strong /p p 　　人类基因组计划是一项规模宏大，跨国跨学科的科学探索工程。其宗旨在于测定组成人类染色体(指单倍体)中所包含的30亿个碱基对组成的核苷酸序列，从而绘制人类基因组图谱，并且辨识其载有的基因及其序列，达到破译人类遗传信息的最终目的。基因组计划是人类为了探索自身的奥秘所迈出的重要一步，是继曼哈顿计划和阿波罗登月计划之后，人类科学史上的又一个伟大工程。 /p p 　　这一计划于1990年正式启动。美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。2001年，人类基因组工作草图发表。2003年4月14日，六国首脑共同宣布人类基因组测序胜利完成。 /p p 　　 strong 2.测序效率与读长 /strong /p p 　　测序效率也称为“通量”，是指单台设备一次反应所获取的序列数据量。测序仪的测序原理是将目标DNA大量复制，然后用酶将这些DNA长链切断，分别对每一小段测序，最后根据片段首尾重合的部分，拼接还原成完整的长链。读长就是指测序仪能读出的每一个DNA片段的长度。 /p p 　　 strong 3.SBC与SBS /strong /p p 　　这两种方法的原理相似，但具体操作有诸多不同。SBC法使用化学试剂，有较强的毒性，且技术复杂较难掌握，成功率不高。相比之下，SBS法使用酶试剂，具有操作简便、结果稳定、准确性高且重复性好等特点。且运用SBS法的设备相对简单，可以实验室自制或采用通用设备，还有使用方便的标准化试剂盒，因此很快风靡全球相关实验室。 /p

今年年初illumina公司的CEOJay Flatley在摩根大通健康会议上信心满满地发布了两款测序仪，尽管在基因测序的通量和速度方面，新仪器Hiseq X Ten比其以往的测序仪更具优势，但是昂贵的价格却让很多大公司囊中羞涩、望洋兴叹。而一款仅售900美元的测序仪很可能让illumina公司感到坐立难安，同样感到紧张的还有CG测序仪的拥有者们，因为他们的测序仪重达数吨，而且平均读长仅有36bp。 　　由英国公司Oxford Nanopore开发设计MinION测序仪则拥有很长的读长，而且只有普通U盘大小，可随身携带，理论上可实现想测就测。日前该测序仪已投入市场使用，或许未来它将基因测序仪变得如同手机一样普通、便捷、廉价。 　　MinION测序仪的测序原理 　　MinION测序仪只有4英寸长，普通U盘大小，由一个传感器芯片，专用集成电路和一个完整的单分子感应测试所需的流控系统构成。MinION采用新型纳米孔测序法(nanopore sequencing)，拥有很长的读长，平均读长为80K bp，并且具备很高的测序速度。 　　然而，目前纳米孔测序法较低的测序准确率65%-80%仍是大家关心的问题，但是该设备目前仍在不断更新，仍有很多研究者非常看好这一技术，&ldquo 数年后，它会主导基因测序市场&rdquo 。同样该技术被MIT Technology Review杂志评为&ldquo 2012年10大年度科技突破之一&rdquo 。制药巨头Roche公司同样看好这一技术，2012年Roche公司宣布基因测序仪454从测序市场退出，但它们并没有放弃测序市场，随后它们耗费1.25亿美元收购了纳米测序技术公司Genia Technologies，以及投资了Stratos Genomics公司。 　　MinION测序仪售价仅为900美元，相比那些5 万美元到 75 万美元的基因测序设备，这种基因测序仪未来将会赢得更多的市场。你完全可以将其揣在口袋里，随时随地的测序自己的基因，但基因测序的数据分析则需要运营能力强大的电脑以及专业人士来解读。 　　尽管如此，但是它的出现将会改变目前基因测序领域的游戏规则。大型基因测序仪器设备商以及基因测序服务公司的日子将会变得窘迫起来，因为人们将不再需要他们的设备、仪器和服务，另外基因测序解读公司可能会火起来，因为庞大的基因测序数据需要更多的公司来完成基因解读的任务。

近期，我国首部生物经济五年规划——《“十四五”生物经济发展规划》发布，这标志着生物经济成为了一种全新的经济形态。《规划》指出，要开展前沿生物技术创新，加快发展高通量基因测序技术，推动以单分子测序为标志的新一代测序技术创新，明确鼓励探索第三代测序技术，将其作为有效补充，为二代测序范围外的复杂基因突变类型寻求新的解决方案。事实上，三代测序近年来热度颇高，已引发了整个行业的关注，不少企业正积极布局。在二代测序已成红海的当下，大家开始向三代测序寻求答案。那么，这条探索之路应该如何走？6月8日晚，贝瑞基因董事长、总经理高扬博士，PacBio太平洋生物科技总经理吴应光，兴业证券大健康研究中心总经理、医药行业首席研究员孙媛媛，易凯资本合伙人李钢做客华夏大健康会客厅，共同探讨了如何在生物经济时代抢滩三代测序等前沿话题。此次会客厅由华夏时报社总编辑助理、大健康新闻部主任陈岩鹏主持。三代测序具有高成长性陈岩鹏：三代测序是贝瑞基因布局的重点，在这个领域贝瑞基因非常有前瞻性，早在2019年就宣布与美国知名三代测序企业PacBio太平洋生物科技就第三代测序仪的开发及临床推广达成长期合作，双方联合开发第三代测序平台。那么高董您认为，贝瑞基因是因循怎样的思路和规划在布局三代测序，未来临床转化的发力点又是什么？高扬：我们布局三代基因测序领域，实际上经过了长期调研。我想说明的是，一代、二代、三代测序技术，不像其他领域是向下兼容，而是各有技术特点，互为补充。贝瑞基因长期从事罕见病和基因病的诊断，在这个过程中我们发现，有些基因病用一代、二代测序得不到有效解决，更别说性价比。因此我们下定决心，希望用这个世界上最成熟、最稳定的三代测序技术为临床带来更多的诊断方法。我们在三代测序的布局实际上是科研先行、硬件提速、产品落地的状态。三代测序在科研领域经过了很长时间的发展，有大量科研文献，在相关领域形成了技术层面的论证。贝瑞基因和PacBio研发的硬件平台，目前进入医疗器械注册临床试验阶段。在硬件基础上，我们开发了地中海贫血基因检测试剂盒，现在也进入了临床试验阶段。我们观察到，中国临床市场对三代测序产品的接受程度非常高。未来我们不仅要研发优质的产品，也要为中国人带来性价比更适宜的产品，我们有信心做好相当体量的基因病患者的筛查和诊断。陈岩鹏：PacBio太平洋生物科技是高质量测序的先进供应商。高保真长读长的三代测序，技术层面有其独特优势，那么生物经济时代，对于技术创新有了高维度要求，吴总您认为三代测序技术层面将面临的最大难题是什么？吴应光：三代基因测序非常独特，它读的很长，读的很准，它不仅能够解决诊断的问题，将来还会参与解决治疗问题（如基因治疗）。2003年，科学家公布了当时被称为完整的人类基因组序列，但其中有大约8%空白区域没有序列数据，这主要包括高度重复DNA片段的区域以及着丝粒等高GC含量的区域。直到近20年后的2022年年4月，《科学》杂志连续发布6篇论文报告，公布了首个完整无间隙人类基因组序列，填补了近20年来缺失的“拼图”碎片，主要归功于三代测序技术的大幅发展。三代测序技术也大幅提升了基因检测技术解决临床问题的能力，以罕见病诊断为例，常规的二代测序技术基本上只能够解释约33%的罕见病病例的致病机理，而PacBio与美国Children’s Hospital Mercy的合作揭示，PacBio的HiFi测序因为其SNV，Indel，SV，以及甲基化的出色表现，有望将这一百分比提升至67%。陈岩鹏：都说拥抱趋势才能赶上风口，作为二级市场的研究人士，孙总您如何看待三代测序整体市场在生物经济时代的发展趋势和特点？孙媛媛：我们投资领域确实非常关注三代基因测序，未来也会有更多的资本涌入这个赛道。从二级市场维度来看，我认为测序板块具有很强的成长性，是一个长坡厚雪的赛道。这个赛道的成长性主要来自两点，首先它具有宽广的边界，这决定了其有一个长期较大的发展空间；第二它属于密集创新，决定了它有较高的成长性和丰富的业态。未来一级市场也会有一大批测序项目涌进来，那时这个赛道会获得更高的关注度和资金支持。目前，人类已经把测序的能力边界从核酸领域拓展到了蛋白质领域。从技术创新角度来看，作为测序中的新兴细分领域，单分子测序的技术创新性更强，技术迭代速度更快，这个领域下游的关注度也非常高，未来在测序这个成长赛道中，大有可为。从全球来看，三代测序市场规模已达到200亿美金。而且目前三代测序仪的渗透率还仅在10%左右，我们认为未来渗透率还会进一步提高。未来若干年，全球测序行业还将保持年均20%的增长速度。此次贝瑞基因和PacBio太平洋生物科技合作的三代基因测序产品，是一个很好的临床转化的案例。陈岩鹏：目前三代基因测序炙手可热，未来市场上关于三代测序的投资并购也会越来越多，从专业的角度，李总，作为投资人的您觉得应该如何判断一个优质的三代测序企业标的？李钢：我接触基因测序的时间还是蛮长的，我认为，一代、二代、三代测序，不像是笔记本的芯片，新一代出来就会把上一代完全迭代掉。其实一代测序在临床应用上仍然很多。比如一代测序过程细致，质控环节多，不容易污染，测序结果也很直观。如果对二代测序结果有疑问，很多时候还会跟一代测序结果去比对。一代测序在某一些场景下还是金标准。但是一代测序，有一个非常大的问题，就是耗时长、成本高，所以，后来二代测序慢慢崛起。第二代基因测序技术逐步走入大众视野，第二代基因测序技术以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa、Hiseq技术和ABI公司的SOLiD技术为代表。第二代测序法首先要将DNA随机切割成小片段，然后在这些小片段分子的两端连接上接头（adapter）制成DNA测序文库。与第一代测序仪的区别在于，第二代测序仪采用的是合成测序法，即边合成边测序，在通过聚合酶或连接酶不断地延伸引物获得模板序列的同时，对每一轮反应的结果进行荧光图像采集、分析，最后获得全序列的测序结果。测试速度快，成本低，并且保持了高准确性。当然二代测序仪也有其缺点，由于其将DNA切割成小片段后扩增读取的技术路线，测序的读长较短，而且在扩增过程中也会给测序带来各种误差。第三代测序技术是指单分子测序技术。DNA测序时，不需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。第三代测序技术也叫从头测序技术，即单分子实时DNA测序。第三代测序技术原理主要分为两大技术阵营：第一大阵营是单分子荧光测序，代表性的技术为美国螺旋生物（Helicos）的SMS技术和美国太平洋生物（Pacific Bioscience）的SMRT技术。第二大阵营为纳米孔测序，代表性的公司为英国牛津纳米孔公司。三代测序的研发需要大量的资金支持。我做了统计，从2019年到今天，三年多的时间，规模以上的融资大概发生了24起，总额在120亿人民币上下，因此不管是从金额还是数量上，这三年里，三代基因测序领域的增长非常快。测序仪国产化提速陈岩鹏：我们看到贝瑞基因正在和PacBio联合开发三代桌面测序仪，当下测序仪国产化的话题关注度很高，高董您觉得如何在生物经济时代进一步为测序仪的国产化提速？高扬：既然提到国产化，我认为前提是必须充分了解中国市场。今年1月，我们与PacBio开始联合研发三代桌面测序仪。为什么要做这件事？因为中国的临床市场是多层次的，要用硬件、用适宜的试剂盒来满足多层次需求。我们经过调研得到一个结论：广大临床市场只需测序仪满足某几个固定方面的应用。比如，三代测序仪在临床主要是针对结构复杂的变异等，对测序量要求不大，但对测序质量、数据解读的直观性要求较高。另外，中国广大医院对于基因病的诊断能力依然在提高中，对桌面型测序仪有比较大的需求。等到三代桌面测序仪研发成功，会率先在中国市场以国产化的形式上市。提升国产化进程，从贝瑞基因的策略来说，这个领域相对很新，临床转化上就全世界而言，我们都走在前列。我们选择最好的技术合作伙伴，定位研发适宜中国市场的硬件平台和试剂盒。只有满足中国临床需求，提升国产化的努力才会有回报。一旦满足了需求，三代基因测序市场，临床级别的增速将远远超过科研级别。希望未来在三代测序领域，我们能成为技术的开拓者、市场的推广者、硬件国产化的中坚力量、临床与患者之间的桥梁。陈岩鹏：从技术和应用的角度，吴总您认为三代测序仪未来的方向将是怎样，比如小而美是否会成为大潮流？吴应光：临床实践表明，三代测序可以提供一个更高的卫生经济学结果。就以贝瑞基因正在推进的第三代地中海贫血病基因检测为例，这是国内首个基于三代测序技术在临床应用的检测产品，到目前为止，我们的临床测试显示，检出率几乎是100%，有很多一代或者二代都无法检测到的变异，都是三代测序检测出来的。二代三代并不是完全迭代或者替代的过程，我认为三代的技术不会停留在小而美的阶段，因为它确实可以提供更多的回答，提供更高的卫生经济价值，它势必会到主流的应用上。陈岩鹏：三代测序因其特点，被视为打开大门的新钥匙，那么在孙总您看来，三代测序会为整个行业带来怎样的“鲶鱼效应”？孙媛媛：目前已经能够看到“鲶鱼效应”。就全球测序将近200亿美金的市场里，下游发展的速度高于上游，按照最新的数据测算，下游在市场里大概占到了七成。在下游市场中，临床端的市场增速高于科研端，测序下游的应用场景非常多元，临床端除了大家比较熟悉生殖健康，还有肿瘤、罕见病、代谢免疫等。而三代测序的一个能力特点就是和很多细分领域都有比较好的匹配度。未来，三代测序在下游细分领域的渗透值得期待。陈岩鹏：近年来，三代测序的市场热度越来越高，行业也需要快速健康有序发展，李总您对政策层面有些怎样的建议？李钢：就监管政策而言，我觉得应该给这些科技属性的创新企业更宽松的环境。在对企业临床试验标准严格的基础上，给予企业在技术上、政策上甚至资金、上市等方面一定支持。让技术更快地应用到临床陈岩鹏 ：随着三代测序的飞速发展和市场规模的不断扩大，大家认为自己的企业在这个过程中都分别扮演什么样的角色？高扬：三代基因测序领域，目前来说，从科研到临床转化是趋势。贝瑞基因是长期在这个基因测序领域的临床应用方面转化和布局的企业，我们非常希望能够抓住甚至是引领三代基因测序。在临床转化的这个浪潮中，我们希望能够成为三代测序技术的开拓者、市场的推广者和硬件国产化的中坚力量。我们非常希望能够利用三代基因测序这个技术平台开发出大量的适宜中国市场的基因诊断和基因筛查的产品，贝瑞基因要做好临床和患者之间技术桥梁的这个角色。吴应光：PacBio从2019年推出高保真测序技术之后，我们的业务中心逐渐从传统的纯科研，特别是动植物领域转向人类医学健康领域。我认为，PacBio还有很多非常有价值的事情可以做。第一，现在人类基因组的相当多的参考基组或者各种数据、模型，基本上都还是建立在ngs二代测序的基础上的，随着完整人类参考基因组的建立，现在有很多类似于叫泛基因组，就是我们称作为疾病相关数据库的更新，会让我们下游的临床应用更加精准。第二，我觉得可以更多的参与到人类基因临床科研以及健康诊断行业中来，与贝瑞基因深度合作，能够让技术更快地应用到临床中。孙媛媛：从二级市场投研的角度，我们的使命是发掘优质的企业，跟优秀的企业一同成长，让企业的市场估值和企业价值匹配。目前我们也拥有非常强大的团队，我们团队现在有20个人，团队里的博士也是在美国攻读相关测序专业。三代测序，是我们团队长期重点关注的方向，未来也希望可以承担企业和市场之间桥梁的作用，让更多的二级投资人去了解三代测序的潜力和价值。李钢：我们投行作为资本和实业企业中间的桥梁，拥有国内最大的医疗健康团队，有70多人，都是专注在医疗健康领域。大部分人有生物学、医学等专业背景。所以，我们希望借助我们对资本、对行业、对技术的熟悉，能够让资金、资本有效的实现配置，然后让这些有前景的技术、有发展潜力的公司得到尽快的发展壮大，为中国甚至全球的病患提供更多的新医疗技术和救治手段。孙媛媛：我们比较关注三代测序，下游的应用场景假设做一个排序，您觉得下一个场景会是哪些？高扬：三代测序首先是拿出来解决下游相对比较明确的一些基因病的筛查和诊断。未来的临床场景，我们是非常希望做到一个全基因病的筛查和未明确疾病的诊断。吴应光：除了讨论过的诊断外，我认为三代测序，在接下来的治疗，特别是基因治疗领域，还有相当大的前景。陈岩鹏：能否用一句话描述一下您心中三代测序技术的未来？您对它的最大的期待是什么？高扬：三代基因测序为我们基因行业打开一扇全新的大门，我非常期待三代基因测序为全行业的从业者带来一些新的思路、新的方法和新的答案。吴应光：因为三代测序是典型的单分子实时测序，所以它的速度其实非常之快，我们希望在这个领域能够进一步有所突破。孙媛媛：希望三代测序，未来能够做到二代做不到的事，开拓出纯增量市场。李钢：我期待三代测序的技术也好，平台也好，能够更准、更快、更便宜。

深圳共进电子股份有限公司6日正式宣布与上海小海龟科技有限公司签署战略合作协议，强势进军大健康领域，双方将共同打造国内首款自主研发的基因测序新产品——半导体高通量基因测序仪，为精准医疗发展注入强力，成为基因测序领域迅速崛起的新兴力量。 共进股份作为全球领先、中国最大的高端通信电子产品生产巨擘，于2015年2月在上交所成功上市，产品涵盖各类网络通信终端设备、智慧家庭、可穿戴产品。小海龟科技是一家从事创新生物芯片及高端医疗器械研发、生产和服务的高科技公司，已自主研发成功半导体高通量基因测序仪和测序芯片，并启动预研更下一代的基因测序技术。 去年上市以来，共进股份就已确定转型升级目标领域，包括实施智能化工厂解决方案，拓展智慧家庭领域、大数据个性化服务领域及智能生物传感器领域。去年6月的16亿元定增计划进一步锚定“互联网+医疗健康”、“互联网+智慧家居”两大领域，此次联姻小海龟科技是其转型大健康医疗领域的第一步。 据1月5日晚间共进股份刊登的公告，此次向小海龟科技共注资人民币3000万元，所占股份达10%。另据发布会介绍，共进股份此前已间接持有小海龟科技5%的股份。因此，共进股份目前共持有小海龟科技15%的股份。 在发布会上，共进股份和小海龟科技联合推出一款新产品——半导体高通量基因测序仪。据小海龟科技首席科学家吴东平介绍，该产品的核心原理是利用半导体芯片中高度集成的传感单元测量离子变化并转换为电信号读出，具有通量高、速度快、精度高的优点。据悉，该产品是国内首款自主研发的半导体基因测序仪，拥有全自主知识产权，技术先进。更吸引市场的是，该仪器价格和测序费用都将大大低于目前的市场行情，将有力推动基因测序技术的普遍使用。 共进股份董事长汪大维告诉记者，“对于进军基因测序行业，我们和小海龟的合作可谓是珠联璧合，除资本合作以外，共进股份将与小海龟科技在半导体高通量基因测序仪新产品的生产、产业化、市场营销等方面达成深度合作。” 共进股份总经理唐佛南说，“共进股份与小海龟之间的战略合作，是共进股份布局大健康产业链的第一步，这也是共进股份在拓展智慧家庭领域、大数据个性化服务领域及智能生物传感器领域以外又一次重大的新的尝试。” 早在去年6月，共进股份就推出了募集资金约16亿元非公开发行预案，募投项目中包括了“宽带通讯终端产品升级和智能制造技术改造项目”、“基于人工智能云平台的智慧家庭系统产业化项目”、“可大规模集成智能生物传感器研发项目”、“生物大数据开发利用关键技术研发项目” 等五大项目。 中国是生物和基因测序技术大国，基因测序技术的发展在众多领域都有着极其重要的意义。作为传统治疗与健康管理方式的革新，基因测序广泛应用于个体化医疗，遗传病检测、传染病监控、体检，食品安全检测、育种，药物开发，医疗保险系统、公安安全系统，生命科学研究等领域。 近年来，基因测序产业得到迅猛发展，全球基因测序市场总量从2007年的794.1万美元增长至2013年的45亿美元。预计未来几年，全球市场仍将继续保持快速增长，而Markets and markets预测，中国的基因测序产业2012-2017年间复合年均增长率达到20%-25%。

在基因测序领域，谁控制仪器，谁就会赢得天下，从ABI的3730测序仪到后来的illumina的测序仪，都可以证明这点，这个行业目前是由上游技术驱动的，对技术的依赖度很强。测序公司、诊断公司都加大对测序技术领域的投资，以期能在未来基因测序爆发时期，获得可观的市场份额。根据安永的最近一份报告显示，未来5年内，基因测序的仪器市场规模同基因测序服务基本相当。 　　罗氏、illumina公司都加大对新技术的投资。2012年，Roche公司宣布基因测序仪454从测序市场退出时，就加紧在纳米测序技术领域的布局，先后投资了Genia Technologies公司和Stratos Genomics公司。illumina公司也早就盯上了纳米孔测序技术，是牛津Nanopore公司的主要股东之一。然而令illumina公司恼火的是，2013年10月，牛津Nanopore公司回购了illumina公司持有的13.5%股份，从而保持该公司更加独立运营，此次回购价值共超过5640万美元。 　　纳米孔测序原理 　　在A，T，G，C四种不同的脱氧核苷酸通过纳米孔进入的时候，其所引起的电流变化也是不一样的，随即可通过电流来检测DNA序列。双链DNA直径为2nm，单链DNA直径为1nm，所以采用的纳米孔尺寸有着近乎苛刻的要求。纳米孔：分为生物纳米孔和固体纳米孔，生物纳米孔：a溶血素(一般嵌入在双层脂膜当中)，最窄直径尺寸为1.5nm，可允许单链DNA分子通过。但是生物纳米孔对稳定性、电流、噪声等方面有很高的要求。固态纳米孔：由硅及其衍生物制造，通过电子束和离子束在硅或其他材料薄膜上钻出纳米尺度的孔洞。固态纳米孔在稳定性、电流噪声、工艺集成方面有着显著的优势，但是目前有技术瓶颈，以及造价高昂。 　　固态纳米孔工艺 　　固态纳米孔的制作与半导体工艺的结合使得DNA测序芯片的大规模生产成为可能. 2001年，Li等人使用聚焦离子束在 Si3N4 薄膜上制作出了直径61 nm 的孔，随后又采用 Ar将孔径缩小到了1.8nm。2003年， Storm等人用高能电子束在SiO2薄膜上制作出了直径2 nm的孔. 如今， 人们已经可以在很多材料上制作出亚 10 纳米尺度的固态纳米孔，例如，SiNx，SiO2，SiC，Al2O3等. 此外， 石墨烯因其本身超薄的结构和特殊的电子特性也作为薄膜材料的一种新选择，它的超薄的单原子层结构十分适合隧道电流的测量。 　　纳米电极制作 　　纳米电极的制作在测序用纳米孔制造工艺中也是一项重要的挑战。前文提到， 纳米电极的形状、与纳米孔重合度的好坏直接影响到电流信号的好坏， 因此要在纳米尺度制作出形状规则、 电学特性良好的电极并不容易。 　　目前研究者们所做的工作都是在实验室中对单个纳米孔进行研究， 而无法将其运用到商业中. 到目前为止， 还没有办法能够快速制作出直径大小均一且都在5 nm以下的纳米孔阵列， 在DNA测序芯片向商业化转变的道路上， 这是必须解决的一个问题. 但是， 相信随着半导体制造工艺和纳米电子学的不断发展， 人们一定会制作出高质量的纳米孔芯片。 　　产品：Minion 　　由英国公司Oxford Nanopore开发设计MinION测序仪则拥有很长的读长，而且只有普通U盘大小，由一个传感器芯片，专用集成电路和一个完整的单分子感应测试所需的流控系统构成，可随身携带，理论上可实现想测就测。日前该测序仪已投入市场使用，或许未来它将基因测序仪变得如同手机一样普通、便捷、廉价。该技术被MIT Technology Review杂志评为&ldquo 2012年10大年度科技突破之一&rdquo 。但是其错误率很高，据称有35%的错误率，平均10个碱基，就有3.5个测序错误。这也意味着基因突变检测成为纳米孔测序的禁区，也成为纳米孔测序的致命弱点，并让其长读长的优势黯淡无光。 　　面临挑战 　　虽然纳米孔测序的优点十分明显，与前几代技术相比在成本、速度方面有着很大优势，但是目前还处在起步阶段，从测序原理到制造工艺都存在有许多问题，许多技术也都只停留在理论阶段。其面临的挑战主要是如下几个部分： 　　电流检测系统：电流识别最短距离为3nm，而且目前的材料几乎很难寻找到孔径这么小的材料。 　　纳米膜系统：限制目前的纳米孔大小，目前有关纳米孔制作方面仍有很大的阻力 　　数据分析系统：即使很多人获取这些数据，但是对于数据的运行和分析仍旧存在很大障碍。 　　主要纳米孔技术公司 　　Base4, UK 　　Fullgen, Argentina 　　Genia, USA, California 　　INanoBio, USA, Arizona 　　Ionera, Germany 　　Izon Science, New Zealand 　　Nabsys, USA, Providence 　　Nanion, Germany 　　Nanopore, USA, New Mexico 　　Noblegen Biosciences, USA, Massachusetts 　　Oxford Nanopore Technologies, UK 　　Quantapore, USA, California 　　Quantum Biosystems, Japan 　　中国从事相关技术研究学者 　　龙亿涛 　　华东理工大学，上海市曙光学者，&ldquo 东方学者&rdquo 特聘教授，研究方向纳米光谱电化学，纳米通道单分子分析，仿生界面等。 　　赵清 　　北京大学凝聚态所副教授，主要从事ZnO、AlN纳米线的制备、掺杂，表征，电学，光学，场致电子发射性能方面的研究。 　　注：部分内容来自生物通和贺建奎博客

p 　　如今，基因组测序的新闻已变得司空见惯，不像几年前，基因组草图甚至能登上杂志的封面。随着测序仪的价格不断下探，你也考虑购入一台。挑来选去，不知哪一台更好。在这一期的《BioTechniques》上，Jeffrey Perkel告诉你，一台也许并不够。 /p p 　　新一代测序仪在上市之初，价格高昂，仅限“土豪”实验室购买。如今，选择多了，价格也便宜了。比如Illumina新近推出的MiniSeq测序仪，售价仅为49,500美元(美国售价)，每次运行有望产生7.5 Gb，足以应对靶向测序的应用。在爱丁堡大学，本科生甚至可以选修一门课程，用Illumina的NGS技术来破译细菌基因组。 /p p 　　然而，在第一台NGS仪器上市十年后，序列组装仍然是个挑战。即使是5.2 Mb的脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)基因组，也给爱丁堡大学的本科生带来不少麻烦，这归因于重复和移动的调控元件。不过，研究人员正在学习通过不同的测序技术，来理清这些区域。 /p p 　　Evan Eichler是华盛顿大学医学院的一名教授，他研究的是传统基因组测序项目往往忽视的基因组区域，比如不稳定的区域。这些区域的两端伴随着长片段重复，在减数分裂的过程中可能没对准，导致插入/缺失，或重复。Eichler表示，目前有证据表明这些区域是基因进化的摇篮，它们甚至在某种程度上解释了人何以为人。同时，这些复杂的区域也与疾病相关。 /p p 　　当今，研究人员在测序人类基因组时，大多采用短读长的Illumina测序技术。这种策略将基因组剪切成数百万个小片段，平行读取，然后在数据分析环节将每个片段与基因组的独特序列比对，并鉴定出相对于人类参考基因组的变化。这些算法目前还不能实现基因组的从头(de novo)组装，因此，无法捕获大规模的结构变异。 /p p 　　不过，其他方法可以做到。Pacific Biosciences和Oxford Nanopore的仪器在原理、速度和价格上有所不同，但它们都带来了比Illumina、Ion Torrent长得多的读取片段。PacBio的平均读长达10 kb，有些甚至超过60 kb Oxford Nanopore的MinION读长要短一些，但也在kb级别。 /p p 　　就每个碱基而言，这些技术比Illumina要贵，“原始”错误率更高，并产生了更少的序列。因此，使用这些技术的研究人员需要开展更多的测序运行。不过，如果他们将长读取和短读取技术相结合，就能解决那些之前无法搞定的区域。 /p p 　　再回到Eichler研究的第17号染色体。17q21.31含有一段900 kb的倒位和许多重复基因，它们往往会在测序过程中丢失或错误组装。不过，Eichler的团队如今结合使用Illumina和PacBio的技术，不仅大大提高了测序质量，也明显降低了测序成本。Eichler认为，这种策略有助于增加我们对人类遗传变异的认识。 /p p 　　最近几个月，PacBio和Illumina都推出了新的测序仪。PacBio的Sequel在去年9月推出，比RS II更小巧、更便宜，但通量大大提高。Illumina的MiniSeq也在1月份上市，有望真正降低新一代测序的门槛。如今的你们，有了更多的选择。 /p

p 　　从1977年Sanger发明了双脱氧链终止法一代测序技术开始，测序技术发展至今已有四十多年时间，先后经历了以GS FLX、Solexa、SOLID为基础的二代测序技术，以及基于单分子实时测序（SMRT）和纳米孔测序技术的三代测序技术。虽然三代测序在蓬勃发展，并在基因组和转录组测序等领域展现出前所未有的优势，但限于成本问题，其应用范围尚不及二代测序。 br/ /p p br/ /p p 　　二代测序技术以其短读长、高通量、准确性高的特点，仍在测序市场上占优势地位。以Illumina Solexa为例，首先利用超声波将DNA打断成200-500bp小片段文库，加接头后DNA片段随机附着于flowcell表面，经过桥式PCR扩增形成“DNA簇”，实现碱基信号强度放大，采用边合成边测序的方法，进行全基因组全面，准确的测序。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/insimg/55d34bab-6612-47a8-873c-49b4c5dcb0eb.jpg" title=" 1.jpg" style=" width: 600px height: 276px " width=" 600" vspace=" 0" hspace=" 0" height=" 276" border=" 0" / /p p br/ /p p style=" text-align: center " strong 图1 Hiseq Xten (左) 与 NovaSeq 6000（右） /strong /p p br/ /p p 　　2014年Illumina推出HiSeq X Ten测序仪，它利用数十亿个纳米孔的流动槽，较大缩短了测序周期。2017年它又推出了新一代测序仪NovaSeq系列，我们以相同文库分别进行Hiseq Xten系列和NovaSeq系列测序，DNA重测序产出数据指标如下： /p p br/ /p p strong 表1 DNA重测序结果比较 /strong /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/insimg/5454c24d-abf7-4aef-b3d4-a4cfe7b68c24.jpg" title=" 2.jpg" / /p p br/ /p p br/ /p p 看完重测序，再看看转录组文库测序比较： /p p br/ /p p strong 表2 转录组测序结果比较 /strong /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201802/insimg/9429bf33-74ea-4c0a-b71e-150a0478b58e.jpg" title=" 3.png" / /p p 基于以上结果，图谱君总结了以下几点： /p p br/ /p p strong 1.测序原理 /strong ：X-ten与Nova6000测序原理均是基于solexa的边合成边测序的原理；Nova6000采用Illumina的EX-AMP簇生成技术，以及新一代的Patterned Flow Cell。 /p p strong 2.Q30质量值 /strong ：在实际测序中Nova6000的Q30相对于X-ten更稳定且测序时长更短，试剂衰减对质量影响更小，整体的Q30 Nova6000要优于X-ten。 /p p strong 3.测序方式 /strong ：受限于X-ten的控制软件以及试剂等因素，X-ten只能进行单Index的测序识别；而Nova6000可以进行I7 I5双端Index的测序，理论上可以做到更精准的识别。 /p p strong 4.DNA文库冗余度 /strong ：Nova6000明确优于X-ten平台。 /p p br/ /p p 　　有没有发现随着二代测序仪器的发展，测序结果真是又快又好，目前二代测序较多的应用于基因组重测序，转录组分析，小分子RNA研究等领域。基于二代测序技术进行遗传图谱构建，基因定位的研究也越来越多。 /p

p 　　 strong 仪器信息网讯： /strong 10月21日上午，仪器信息网举办了“基因测序前沿技术”网络主题研讨会，本会议邀请到基因测序方面的两位重量级专家，包括北京大学生物动态光学成像中心研究员黄岩谊和中国科学院半导体研究所研究员周晓光，研讨会共有一百多人报名参加，反响热烈。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" t019a8623b690f4163b.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201510/noimg/323ddb0e-e388-4130-b6e2-dcf2f987e842.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" strong 北京大学生物动态光学成像中心黄岩谊研究员 /strong & nbsp /p p 　　黄岩谊报告的主题是“单细胞测序的技术挑战”。黄岩谊认为，从分析化学的角度出发，单细胞测序是非常有意思的，测序结果可以提供海量数据，并且这些数据平均下来的价格相对便宜得多，通过这些大量的数据可以做很多有意思的研究。 /p p 　　目前，通过单细胞测序技术可以获得的信息包括：所有RNA分子测序的定量分析，全基因组的定量信息，表观遗传学的信息。黄岩谊认为单细胞测序成功的重要指标是所有片段要等倍扩增以及扩增过程不能出错。 /p p 　　最后，黄岩谊通过相关实验结果形象对比了以下几种测序技术的优缺点：简并寡核苷酸引物PCR（DOP-PCR）、多次退火环状循环扩增（MALBAC）、多重置换扩增(MDA)以及eMDA，而针对不同的问题，应选择不同的测序方法。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img style=" WIDTH: 200px HEIGHT: 225px" title=" gt.jpg" border=" 0" hspace=" 0" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201510/insimg/6d2a0f68-7783-4aba-a63d-785a203835f4.jpg" width=" 200" height=" 225" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" strong 中科院半导体所周晓光研究员 /strong /p p 　　周晓光的报告题目是“基因测序技术发展及原理”，从科普的角度带领听众回顾了基因测序技术的发展历程及现阶段几代测序技术的原理。 /p p 　　基因测序技术的发展阶段如下：第零代测序（1975～1985）使用手工Sanger测序法；第一代测序（1986～2006)使用自动化荧光标记链终止测序法；第二代测序（2006～现在）为DNA链合成测序法；第三代测序（现在)是实时、单分子合成测序法；三代后使用的是直接测序法，而直接测序法也是测序技术的发展趋势。其中，第二、三代测序技术的主要区别是：第三代测序流程中没有DNA片段的单分子扩增过程。 /p p 　　从提供工具的角度来说，周晓光赞同世界著名物理学家、数学家Freeman Dyson的看法——工具革命引导着科学方向：新工具的革命远比新概念更多地推出新的科学方向；概念驱动革命的影响是用新概念去阐明旧事物；而由工具驱动革命的影响是去发现需要阐明的新事物。 /p p style=" TEXT-ALIGN: right" 撰稿：史秀明 /p

当前，基因测序仪的主要生产企业有Illumina、Life technologies、Pacific Biosciences等。近日，仪器信息网编辑随机采访了基因测序仪用户，所采访用户涉及高校、科研院所、测序公司的实验室等，共计3名用户，其中A用户使用Life technologies 公司产品ABI 3730XL，主要应用于PCR产物测序，质粒和细菌人工染色体的末端测序 B用户使用Illumina公司推出的 hiseq-2000，主要应用基因组组装、重测序、外显子测序、转录组测序以及小RNA测序的研究 C用户使用Pacific Biosciences公司研发生产的PacBio RSI，主要应用于基因组从头测序，检测DNA修饰。仪器信息网所采访的产品涵盖了第一、第二和第三代基因测序仪。 ABI 3730XL测序仪 Illumina hiseq-2000测序仪 PacBio RSI 测序仪 　　仪器价格：一代更比一代高 　　在采访中了解到，用户A所使用的ABI 3730XL测序仪购于2010年，当时购买的价格是100万元人民币左右，这是一款第一代测序仪，其基于毛细管电泳和荧光标记技术进行测序。 　　用户B使用的第二代测序仪Illumina hiseq-2000于2011年购买，价格约为75万美元，其采用可逆终止法的边合成边测序技术。 　　用户C使用的PacBio RS I测序仪是一款第三代测序仪，其利用DNA单分子的直接测序的原理进行测序。该仪器于2012年购进，当时购买价格约为100万美元。 　　用户开机率：普遍较高 　　A用户来自测序公司，每天都收到来自其他单位的测序样本，因此使用频率非常高，几乎每天都开机， 　　B用户来自科研机构，该仪器作为平台仪器，为单位所在的整个科研系统服务，两年中都是满负荷使用。 　　C用户来自高校，仪器主要为高校内部系统提供服务，1年中使用频率较高。 　　测序速率，读长，通量都可以满足需求 　　相比之下，ABI 3730XL测序仪的测序速度在第一代基因测序仪中是最高的。但是，由于其依赖于电泳分离技术，所以速率方面难以进一步升级，96样本的测序运行时间约为1小时40分钟。每天的数据通量可以达到600000bp，主要适合于基因测序和基因分型研究。 　　Illumina hiseq-2000测序仪作为第二代测序仪，测序速率大大提升，每天最高可以产生75Gb的数据。可以实现De Novo从头测序，DNA重测序等各种测序目标。 　　PacBio RSI的测序速度可以达到每分钟60个碱基，从样品制备到获得碱基序列的全部流程可在1天内完成。每天可获得的数据是200Mb mappable data。能够完成各种测序目标。 　　读长方面，ABI 3730XL的准确读长可以达到800bp。Illumina hiseq-2000测序仪读长可以达到2× 100bp。PacBio RSI目前可以获得1300bp的平均读长。 　　前处理环节：第三代测序仪优势明显 　　用户表示，ABI 3730XL和Illumina hiseq-2000虽然与同类仪器相比建库准备实验相对方便，但仍需花费较长时间和大量人力。但作为第三代测序平台的PacBio RSI测序仪，利用DNA单分子的直接测序的原理，无需进行文库制备，可直接从DNA片段获得测序数据，从样本制备到获得测序结果，所需的时间还不到一天。并且与传统标准方法相比，所需的DNA量也相当少，用量可低至不到500ng。 　　收费售后服务：用户满意度高 　　Illumina、Life technologies的售后服务获得了用户的一致认可，用户认为，其服务&ldquo 响应速度快，专业性高，解决问题十分彻底&rdquo 。 　　基因测序仪的产品生产商相对较少，过了免费的质保服务期之后，用户需要承担高额的售后服务费用，但几名用户对此并未产生不满，ABI 3730XL的用户表示，&ldquo 我们认为一年10万元的售后费用物有所值。&rdquo 　　改进意见：配套试剂耗材应降价 　　尽管ABI 3730XL在速度和成本方面都已达到了极限，但与二三代测序仪相比，其通量较低，成本较高，并且由于其对电泳分离技术的依赖，速度成本难以进一步提升。尽管如此，ABI 3730XL用户认为，ABI 3730XL方法可靠，并且已形成规模化，将继续发挥重要作用。 　　使用Illumina hiseq-2000的用户认为，该仪器的配套试剂价格过高，另外读长还有待增加，并且希望建库准备实验可以实现自动化。 　　PacBio，RSI的用户表示，这台仪器的不足之处主要在于试剂耗材价格过高，通量还有待提高。另外，PacBio RSI系统可购买升级包，将原有系统转化成最新的PacBio RSII，但是，升级耗资巨大也是令用户头痛的问题。 　　附：基因测序仪简介 　　DNA测序技术是现代生物学研究中重要的研究手段之一。成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期。1977年，Maxam和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法。同一时期，Sanger发明了双脱氧链终止法。20世纪90年代，荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序时代。目前，基因测序仪已发展到第三代，Illumina、Life technologies(ABI)等公司共同占据着全球基因测序仪市场。 撰稿编辑：乔峰

基因测序技术已成为在生物医学领域影响最大，竞争最激烈的高新技术研究领域之一。根据通量、读长及技术出现时间等不同，基因测序仪可划分为一代基因测序仪（Sanger测序）、二代基因测序仪（MPS，大规模并行测序）、三代基因测序仪（单分子测序）等。由于基因测序仪研发难度大、市场准入门槛极高，研发出测序仪器的企业不多，而能够批量生产基因测序仪的企业更是屈指可数。目前国内基因测序仪市场有小20家测序设备智造企业，其中多家为贴牌生产单位，测序仪自主研发企业仅不到10家。尽管当前基因测序仪市场仍然以二代测序技术为主流（约占到整体市场份额的八成），但作为测序“黄金标准”的一代测序仪在市场仍有较大影响力和部分受众用户，而以纳米孔技术为典型的第三代测序仪市场开始崛起。近一年来，笔者观察到国内外市场共有5款新型基因测序仪宣发上市。从技术路径上看，其中4款为二代基因测序仪，1款为纳米孔测序仪。仪器机型整体向更高通量、更小体积、更快速度、测序流程更简单方向发展。2021年以来基因测序仪新品国产企业在生命科学上游高端仪器设备持续发力，5款新品基因测序仪中，国产品牌占据三席，进口品牌占到两席。以下是上文出现的基因测序仪新品详细信息：赛默飞2021年10月，赛默飞发布Ion Torrent Genexus高通量测序系统 。赛默飞 Ion Torrent Genexus 高通量测序系统Ion Torrent Genexus系统是行业内第一个真正落地实现 “All in One，One for All” 理念的高通量二代测序（NGS）系统，由纯化系统、一体化测序仪和软件组成，极具创新性地将NGS全部湿实验和干实验，及全流程硬件系统和软件系统实现一体化。只需2步、15分钟的手动操作和设置，1~32个样本通量，最快一天完成NGS全流程。华大智造2021年华大智造没有推出新型测序机型，但华大智造在10月份启动了DNBSEQ-T7和MGISEQ-2000的产品性能全新升级。在日通量超高的测序仪DNBSEQ-T7上，主要升级包括：全新版本的测序试剂（V2.0）、仪器控制软件和算法更新、配套MGIDL-T7（DNB自动化加载仪器）软硬件升级，推出高通量测序试剂套装V2.0，数据产出更高、更稳定。华大智造 MGISEQ-2000 基因测序仪在中高通量测序仪MGISEQ-2000上，目前已经支持6种读长模式的MGISEQ-2000又一次完成“自我突破”—，在读长方面实现了从PE200到PE300的飞跃。在此之前，市面在售能首次实现PE300或SE600的只有两个系列的机型：一个是Illumina的MiSeq系列，另一个是Thermo Fisher的Ion GeneStudio S5系列，如今华大智造MGISEQ-2000终于跻身此列。Singular Genomics12月16日，Singular Genomics Systems, Inc.（纳斯达克股票代码：OMIC），一家利用新型下一代测序(NGS) 和多组学技术为研究人员和临床医生赋能的公司，宣布推出台式测序仪G4。Singular Genomics G4台式测序仪通量：每次运行 15-400 GB 数据TAT：6-19 小时的运行时间准确度：所有套件的准确度为 99.6-99.9%NGS平台具有新颖的高性能化学和先进的工程技术，可为包括肿瘤学和免疫学研究在内的一系列应用提供准确性、灵活性、速度和功能。据悉，G4 仪器和耗材套件的订单现已开始接受，预计将于 2022 年第二季度开始发货。齐碳科技2021年12月底，齐碳科技发布QNome-3841纳米孔基因测序仪。齐碳科技纳米孔基因测序仪 QNome-3841相比起去年发布的QNome-9604，这款测序仪新品最大的提升在于电路的设计，将原来的板级电路升级为集成电路——将原本分离的元器件集成到齐碳科技自主研发的ASIC芯片上，可以进一步缩小仪器尺寸、提高通量，为下一步中、高通量机型的研发打下基础。同时，仪器的小型化并不以牺牲性能为代价，纳米孔测序的技术原理决定了纳米孔基因测序仪具有小型化的潜力。经过模型迭代，目前K1孔的单次准确率已经提升至94%，而最新研发的K2孔的单次准确率最高已达97.6%。塞纳生物2022年1月12日，赛纳生物线上发布S100测序仪。塞纳生物S100测序仪赛纳生物S100测序仪是一款高通量测序平台，具有检测速度快、灵活部署、无需凑样的特点。赛纳生物测序仪采用了独创的基于荧光发生原理的边合成边测序（Fluorogenic SBS）技术。处于暗态的Fluorogenic核苷酸分子无荧光发出，当被DNA聚合酶识别并结合进入待测DNA模板时放出荧光，通过依次参与反应的核苷酸种类及荧光强度可判断DNA序列信息。该技术将发光集团修饰在磷酸键上，使用天然碱基和简单常用的聚合酶及磷酸酶，没有分子疤痕和测序偏差，降低测序过程的复杂度，可在短时间内完成天然状态DNA合成并获得精确的荧光信号，测序过程快速、结果准确，易于获得长读长。附“基因测序专场”

DNA 测序是一种确定 DNA 分子中碱基(A、T、C 和 G)顺序的技术，在生物学、医学、法医学和其他领域有着广泛的应用，例如基因组学、遗传学、分子生物学、疾病诊断和个性化医疗。 DNA 测序技术自 1970 年代以来经历了多次革命性的发展，从第一代测序到第二代测序，再到第三代测序。这些测序技术在原理、方法、优势和局限性方面有着显著的差异。本文将对基于这三代测序技术的相关仪器工艺创新进行概述，并比较其特点和应用。　　一、第一代测序仪　　基于桑格测序方法，该方法使用链终止双脱氧核苷酸(ddNTP)生成不同长度的DNA片段，通过电泳分离并通过荧光检测。 代表性仪器是 Applied Biosystems 及其 3730xl DNA 分析仪。 工艺创新主要有自动毛细管电泳、荧光标记和碱基识别算法的开发 。　　a. 自动毛细管电泳：通过向填充有凝胶或聚合物基质的细毛细管施加电场来分离不同长度的 DNA 片段的过程。 DNA 片段根据其大小和电荷在毛细管中迁移，较小的片段比较大的片段移动得更快。 毛细管电泳系统可以自动并行加载、进样、分离和检测多个样品，从而提高 DNA 测序的通量和效率 。　　b. 荧光标记：将荧光染料附着到链终止核苷酸 (ddNTP) 上的过程，用于在测序反应中生成 DNA 片段。 荧光染料根据 ddNTP 的碱基类型(A、T、C 或 G)发出不同颜色或波长的光。 荧光信号由毛细管电泳末端的激光和相机或扫描仪检测 。　　c. 碱基识别算法：分析毛细管电泳产生的荧光信号并确定 DNA 片段中碱基序列的过程。 碱基检出算法使用各种方法来校正信号中的噪声、伪影和错误，例如峰检测、峰对齐、峰归一化、峰反卷积和质量评分。 碱基检出算法以各种格式输出序列数据，例如色谱图、跟踪文件或 FASTA 文件 。　　二、第二代测序仪　　基于大规模并行边合成边测序 (SBS)，它使用修饰的核苷酸或探针，在每个循环后终止 DNA 合成(或允许可逆终止终止子、可切割探针)。 DNA 分子通过聚合酶链式反应 (PCR) 或桥式 PCR 在固体表面或乳液液滴中进行扩增，并通过光学或化学检测进行测序。 代表性仪器主要有Illumina的基因组分析仪、HiSeq和MiSeq平台 罗氏及其 454 平台 以及 Ion Torrent 及其个人基因组机器和 Proton 平台。 工艺创新主要有测序反应的小型化、光学/化学检测方法和核苷酸化学方法。　　a. 测序反应小型化：减少第二代测序仪中 DNA 样本和测序反应的大小和体积的过程，涉及使用微流体装置或显微孔阵列来限制 DNA 分子，并通过聚合酶链式反应 (PCR) 或桥式 PCR 对其进行扩增，减少了所需的 DNA 量并增加了测序反应的密度。　　b. 光学/化学检测方法：测量第二代测序仪中 DNA 合成过程中碱基掺入所产生的光或化学信号的过程，涉及使用荧光标记的核苷酸或探针，根据碱基类型发出不同的颜色或强度。 光学/化学检测方法根据测序平台和化学成分而有所不同，通常遵循以下步骤：　　i. 在测序反应中，DNA 模板与引物和 DNA 聚合酶杂交。　　ii. 测序反应提供标记的核苷酸或探针，它们在每个循环后终止 DNA 合成或允许可逆终止(例如可逆终止子、可切割探针)。　　iii. 根据碱基配对规则将标记的核苷酸或探针添加到DNA模板的互补链上。　　iv. 荧光信号或化学信号(例如 pH 值变化)由高分辨率相机或扫描仪捕获并转换为数字数据。　　v. 通过计算分析信号以确定碱基身份和序列。　　c. 核苷酸化学方法：涉及使用修饰核苷酸或探针影响第二代测序仪中 DNA 合成的过程。 它基于互补碱基配对的原理，其中A与T配对，C与DNA中的G配对。 核苷酸化学方法根据测序平台和化学方法的不同而有所不同，通常遵循以下步骤：　　i. 在测序反应中，DNA 模板与引物和 DNA 聚合酶杂交。　　ii. 测序反应提供经过修饰的核苷酸或探针，它们在每个循环后终止 DNA 合成或允许可逆终止(例如可逆终止子或可裂解探针)。　　iii. 根据碱基配对规则将修饰的核苷酸或探针添加到DNA模板的互补链上。　　通过光学/化学方法检测修饰的核苷酸或探针，然后通过化学或酶促步骤去除或灭活，从而允许下一个循环进行。　　三、第三代测序仪　　基于单分子实时(SMRT)测序，不需要扩增或终止DNA分子。 通过监测将荧光标记的核苷酸或探针掺入互补链的 DNA 聚合酶的活性，对 DNA 分子进行测序。 代表性仪器主要有 Pacific Biosciences 及其 PacBio RS II 和 Sequel 平台 Oxford Nanopore Technologies 及其 MinION、GridION 和 PromethION 平台 以及 Ultima Genomics 及其 Ultima 平台。 工艺创新主要有使用零模波导(ZMW)、纳米孔或纳米通道来限制和观察单个 DNA 分子 使用磷酸化核苷酸或纳米孔接头来实现连续测序 以及使用人工智能来提高碱基识别准确性。　　a. 零模波导 (ZMW)、纳米孔和纳米通道是三种类型的纳米结构，可以限制和观察单个 DNA 分子以进行第三代测序。　　i. ZMW 是金属薄膜中的纳米级孔径，可产生高度受限的光学观察空间。 当激光照射在金属薄膜上时，只有少量的光可以进入ZMW并激发内部的荧光分子。 这样可以检测通过 DNA 聚合酶掺入 DNA 链的单个荧光标记核苷酸或探针。 Pacific Biosciences 在其 SMRT 测序技术中使用 ZMW。　　ii. 纳米孔是膜上的纳米级孔，可在膜上产生电势差。 当 DNA 分子穿过纳米孔时，它会破坏离子电流并产生反映 DNA 碱基序列的特征信号。 纳米孔可以是生物的(例如蛋白质孔)或合成的(例如固态孔)。 Oxford Nanopore Technologies 在其 MinION、GridION 和 PromethION 测序平台中使用了纳米孔 。　　iii. 纳米通道是表面上的纳米级凹槽，为 DNA 分子拉伸和排列创造了一个有限的空间。 当荧光染料应用于 DNA 分子时，可以通过显微镜对它们进行成像，并且可以通过将荧光图案映射到参考基因组来确定它们的序列。 纳米通道可以通过多种方法制造，例如蚀刻、光刻或模制。 Ultima Genomics 在其 Ultima 测序平台中使用了纳米通道。　　b. 磷酸化核苷酸和纳米孔接头是两种类型的修饰核苷酸或探针，可对单个 DNA 分子进行连续测序。　　i. 磷酸化核苷酸是荧光标记的核苷酸，其磷酸基团上连接有可移除的接头。 连接体可防止焦磷酸盐的释放，否则会终止 DNA 合成。 连接子还允许在每个掺入循环后裂解荧光染料，从而可以在多个循环中重复使用相同的 ZMW。 Pacific Biosciences 在其 SMRT 测序技术中使用了磷酸化核苷酸 。　　ii. 纳米孔接头是具有发夹结构和条形码序列的合成寡核苷酸。 这些接头连接到 DNA 分子的两端，形成可以多次通过纳米孔的环状 DNA 分子。 条形码序列允许对同一 DNA 分子的重复读取进行识别和比对，从而提高准确性和共识质量。 Oxford Nanopore Technologies 在其 MinION、GridION 和 PromethION 测序平台中使用 Nanopore 适配器 。　　c. 人工智能是计算机科学的一个分支，它使用机器学习、深度学习、神经网络和其他方法来执行需要人类智能的任务，例如自然语言处理、图像识别、语音识别和决策。 人工智能通过以下方式提高第三代测序中的碱基检出准确性：　　i. 使用来自不同测序平台和化学物质的原始信号和相应序列的大型数据集来训练神经网络。　　ii. 开发可以纠正原始信号中的噪声、伪影和错误的算法，例如信号漂移、同聚物错误、插入/删除错误和碱基修饰。　　iii. 实施可以利用多个来源信息的方法，例如参考基因组、共识序列、质量评分和元数据。　　iv. 优化方法，适应不同的测序条件，例如读长、覆盖深度、测序速度和样品质量。　　d. 用于第三代测序中碱基检出的人工智能方法的一些示例：　　i. DeepNano：一种深度循环神经网络，使用原始电流信号执行碱基识别。　　ii. Guppy：一种基于神经网络的软件工具，使用原始电流信号执行 Oxford Nanopore MinION 读取的碱基识别。　　iii. DeepMod：一种双向循环神经网络，使用原始电流信号进行碱基识别和碱基修饰检测。　　iv. NanoMod：一种卷积神经网络，使用原始电流信号进行碱基修饰检测。　　v. Megalodon：一种软件工具，可使用原始电流信号读取执行碱基识别、碱基修饰检测和选择性剪接检测。　　vi. DeepSimulator：一种深度卷积生成对抗网络，模拟 Oxford Nanopore MinION 从参考基因组中读取的内容。　　vii. Clairvoyante：一种多任务卷积神经网络，使用原始信号强度值对 Pacific Biosciences SMRT 读取执行变体识别。　　viii. IsoPhase：一种深度卷积神经网络，使用原始信号强度值读取执行单倍型感知亚型重建。　　ix. DeepIso：一种深度卷积神经网络，使用原始信号强度值读取进行异构体量化。　　总之，第一代、第二代和第三代测序是DNA的三种不同读取方法，在原理、方法、优势和局限性方面有着显著的差异。第一代测序是基于桑格测序方法，使用链终止双脱氧核苷酸(ddNTP)生成不同长度的 DNA 片段，并通过电泳分离和荧光检测，工艺创新主要有自动毛细管电泳、荧光标记和碱基识别算法的开发。第二代测序是基于大规模并行边合成边测序 (SBS)，使用修饰的核苷酸或探针，在每个循环后终止或可逆终止 DNA 合成，并通过光学或化学检测进行测序，工艺创新主要有测序反应的小型化、光学/化学检测方法和核苷酸化学方法。第三代测序是基于单分子实时(SMRT)测序，不需要扩增或终止 DNA 分子，而是通过监测将荧光标记的核苷酸或探针掺入互补链的 DNA 聚合酶的活性进行测序，工艺创新主要有使用零模波导(ZMW)、纳米孔或纳米通道来限制和观察单个 DNA 分子；使用磷酸化核苷酸或纳米孔接头来实现连续测序；以及使用人工智能来提高碱基识别准确性。这三代测序技术各有优缺点，适用于不同的目标和场景。选择合适的测序技术需要考虑多种因素，例如读长、准确性、速度、成本和样品质量。随着科技的进步，DNA 测序技术仍在不断发展和改进，为生命科学领域带来新的机遇和挑战。

基因测序技术是一种基因检测技术，也被称为DNA测序技术，是进行分子生物学研究和基因改造的基础，也是解锁人类生命奥秘的重要方式之一。基因测序技术发展了40余年，已在众多领域被广泛应用，包括生物的基因组图谱绘制、物种进化演替过程、表观遗传学、疾病相关基因的确定和诊断等等。近年来，基因测序相关产品和技术由实验室研究演变到临床使用，为我们理解人类生物学特征和疾病，评估遗传疾病提供了关键性信息，所以说基因测序技术是下一个改变世界的技术毫不为过。 在新冠疫情期间，这项技术得到了更多人的关注。疫情爆发初期，在不到一个月的时间内，通过基因测序技术，新冠病毒(COVID-19)的基因组序列被公布，为分析武汉新型冠状病毒的进化来源、致病机制提供了第一手资料。不少国家也发起了COVID-19患者基因测序计划，以了解个人基因对病毒感染反应的影响，这项研究的数据将为患者护理及药物处方提供信息，未来还可以帮助疫苗设计，从而拯救更多生命。 整个测序环节中，从样品收集到上机测序，水贯穿了包括测序仪的日常清洗维护和试剂配制在内的每一个环节。作为一个必不可少的基础试剂，水的品质对最终测序结果会产生显著影响。水中的杂质，如无机盐、有机物、核酸酶、颗粒物等，不仅会污染设备，缩短测序仪毛细管的使用寿命，而且还会降低DNA聚合酶的活性，最终干扰测序结果的准确性。下面这些基因测序经常遇到的问题很有可能是使用的水有问题，快来看看你有没有中招̷Q1：DNA测序样品用什么溶剂溶解比较好？溶解DNA测序样品，使用超纯水溶解最好。原因： DNA的测序反应的原理其实就是Taq酶的聚合反应，需要一个最佳的酶反应条件。如果溶解DNA样品的溶液含有过多的盐，会影响测序反应体系，造成Taq酶的聚合性能下降，干扰测序反应甚至无法产生信号。纯水应用Tips: 超纯水机采用基因测序专用超纯化柱，RephiLe独创配方填料的低镁型纯化柱，可以特异性去除水中的镁离子，降低空白本底对测序反应体系的影响。Q2：测序结果怎么没有峰图呢？原因：模板被降解，罪魁祸首可能是测序使用的水中含有核酸酶。纯水应用Tips: 制备超纯水的超纯水机需要带有终端滤器，如乐枫生物的RephiBio终端滤器，可以去除DNA酶和RNA酶。Q3：为什么测序峰图出现了“瀑布效应”？“瀑布效应”是基线突然从高处下降的现象。原因：样品被有机物污染，有机物会被激发产生荧光，抬高基线。纯水应用Tips: 使用带有TOC检测系统的超纯水机,如乐枫Genie系列智能超纯水系统，有机物含量低于5 ppb，采用全氧化法设计的TOC在线监测系统，在线监测TOC含量，符合ISPE制药工程指南 / 美国药典USP等标准对于TOC检测的要求。Q4：“钉子峰”如何避免？“钉子峰”是A、T、C、G四个颜色的峰都被突然拔起，形成的尖锐峰形。原因： 溶液中可能存在气泡或者颗粒，气泡和颗粒对激光全反射，形成“钉子峰”。纯水应用Tips: 纯水机取水口配备0.22μm的终端滤器，测序之前使用超声波对超纯水进行脱气可以有效地防止“钉子峰”。 乐枫生物Genie系列智能纯水系统以稳定的水质、智能的操作系统充分满足基因测序用水需求，在诸多应用到测序仪的实验室常常会看到乐枫生物Genie系列智能超纯水系统的身影。华大基因海外“火眼实验室”采用的超纯水机是Genie 系列的超纯水系统。关于乐枫生物 乐枫生物(Rephile Bioscience，Ltd.) 是一家专业从事高端水纯化和实验室分离纯化产品研发、设计和制造的企业，为高科技生物技术和生命科学领域的用户服务。乐枫公司着眼于全球发展，在中国、美国、法国、印度、南非等近20个国家建立了销售机构，同时也为国际大型公司提供OEM和ODM，产品销往包括欧美的近100个国家。成立十余年，乐枫持续投入研发，创立出了自己的产品品牌RephiLe（瑞枫），推出了多个新概念产品- 无线连接的Genie系列纯水系统和智能型大流量纯水工作站Super-Genie等。目前乐枫纯化柱填料配方齐全，也提供多款密理博纯水系统的兼容耗材。关键词：纯水，超纯水，实验室，Genie纯水机，基因测序，测序峰图，乐枫关注RephiLe 企业微信：乐枫纯水，关注乐枫动态！

近日，由中国科学院科研装备研制项目资助，中科院北京基因组研究所与中科院半导体研究所共同研发的，具有自主知识产权的国产化高通量DNA测序仪BIGIS-4系统日前投入试运行。 　　基因组所的科研人员应用该系统完成了海洋中温菌(Glaciecola mesophila)的基因组测序工作，相关研究论文分别在《中国科学：生命科学》杂志中文版第7期和英文版第9期发表。这是应用国产化测序仪开展科研工作并取得成果的首次报道，标志着我国正式进入核酸测序技术研发这一国际热点领域。 　　BIGIS-4系统是一个高度集成的可扩展型高通量测序仪，技术采用焦磷酸测序原理，其中，反应模块分割成4个独立的反应仓，共用一套液路系统。根据不同的测序样本量和通量需求，1至4个反应模块可独立或整体运行，一次测序反应可以得到600-800Mb的数据产量，平均序列读长可达到600-700碱基，相较于国际市场同类设备具有一定的技术性能提升和设备成本优势。 　　目前，项目组正在继续开展研发工作，进行配套试剂、芯片和测序分析软件的研发和完善，预期不久将可以实现该系统的全面国产化进程。 BIGIS-4单反应模块测序读长分布

p 　　中国首个应用于临床的第三代测序仪投产，有望把一个人的全基因测序成本从1000美元降至100美元，但仍需进一步完善相关技术。 /p p 　　7月31日，南方科技大学生物系80后教授、瀚海基因创始人贺建奎宣布，自主研发的第三代基因测序仪GenoCare正式投产，首笔订单达到700台测序仪。 /p p 　　21世纪经济报道记者独家获悉，该笔订单合同期三年，购买方包括国内外研究机构和医疗机构。目前测序仪已在科研市场应用，但投入临床市场所需的批文还在申报中。 /p p 　　贺建奎表示：“我们使用单分子测序，不需要扩增，并可大幅降低试剂消耗量，同时，所有试剂、仪器都在国内生产、集成和组装，成本因此降低，一个人的全基因组测序价格可降到100美元。” /p p 　 strong 　截至目前，全球自主研发三代测序仪的企业只有三家，另外两家分别是美国Pacific Biosciences和英国Oxford Nanopore Technologies。 /strong /p p 　　过去的十余年里，三代测序主要在科研市场崭露头角，但因错误率高、成本高等原因始终未能进入临床市场，更谈不上产业化。 /p p 　　目前，基因测序市场的主流是二代测序，三代测序的样本量、数据量需要积累，中下游应用开发也刚起步。即便是应用相对广泛的二代测序，在各病种的覆盖率也不算高，三代测序的普及之路更为漫长。 /p p strong 　　研发破壁 估值15亿 /strong /p p 　　瀚海基因已开始在罗湖莲塘工业园建设1万平米的第三代测序仪生产线，建成之后产能将达到每年1000台，产生50亿元价值。 /p p 　　“除团体订单外，我们的测序仪没有公开发售，价格还不能透露，”贺建奎表示，“目前已进入小批量试产阶段，年底生产线建好后可以大批量生产，年终可接受国内外医院、科研机构订单，到明年年初，群众就能用到三代测序服务了。” /p p 　　深圳一名熟悉瀚海基因的投资机构合伙人告诉21世纪经济报道记者：“瀚海基因的技术是吸收后创新。” /p p 　　记者了解，贺建奎在斯坦福大学的导师斯蒂芬· 奎克教授是一位拥有12家公司的企业家，也是世界上首个第三代单分子测序仪Helicos的发明人。资料显示，Helicos公司于2004年创办，并于2012年破产。 /p p 　　也是在2012年，贺建奎完成斯坦福大学博士后研究员的工作，回国入职南方科技大学，成为该校生物系第一位教师。同年，他创办了瀚海基因，启动国产三代测序仪研发。 /p p 　　起初行业内外对这一项目并不看好，瀚海基因前4年也一直没有销售收入，研发遭遇资金危机，两次险些关门倒闭。贺建奎直言：“一开始见了20多位风险投资人，无一例外都被拒绝，理由之一是当时还没有在职教授创业的例子。” /p p 　　另外，测序仪研发难度非常大，国产三代测序仪更是首次尝试。贺建奎指出：“基因测序的样品前处理非常复杂，耗费时间、人力，还需要有后续的生物信息及专业人才。三代测序仪要把这些集成在一起，改变二代测序的半自动场景，测完自动完成生物信息学分析，难度不小。” /p p 　　测序仪研发对人才要求很高，其涉及光学、流体、化学、分子生物学、生物信息学和精密机械等，需要多学科交叉知识和人才。 /p p 　　即便到了今天，瀚海对人才的渴求依旧跃然纸上。记者获悉，与生产线同时启动的是瀚海研究院计划，预计未来5年引入至少50名遗传解读分析专家以及50名医学专家(包括生殖、肿瘤、传染病等各学科)。 /p p 　　2015年，瀚海基因终于拿到第一笔大额融资——南京中正科技投资1700万元，同年，瀚海基因发布了GenoCare原理样机。此后，公司身价一路水涨船高，目前共获得5轮、2亿元风险投资，测序仪虽未真正走向市场，但估值已达15亿元。 /p p 　　深圳一名中小企业投资机构负责人告诉21世纪经济报道记者：“去年11月我们去看的时候，估值已经10亿元了，项目还很早期，对我们来说太贵，投不起。” /p p 　　 strong 产业化起步 大幅降低成本 /strong /p p 　　采访过程中，贺建奎多次提到，降低临床基因测序成本，这也是二代测序仪的发力方向。 /p p 　　原中国科学院北京基因组研究所副所长于军指出：“第一代测序仪测一个人的基因组测序接近30亿美元，第二代降到1000美元，第三代使用单分子测序，不需要扩增，价格有望降到100美元。”业内将其称为摩尔定律，以说明价格急剧下降趋势。 /p p 　　翻看基因测序成长史，第一代测序技术主要基于Sanger双脱氧终止法的测序原理，结合荧光标记和毛细管阵列电泳技术来实现测序自动化，基本方法是链终止或降解法，人类基因组计划就是基于一代测序技术。 /p p 　　第二代测序技术设备供应商主要是Illumina，业内普遍认为，其市场占有率达到70%。今年年初，Illumina公司宣布推出NovaSeq系列测序仪，据称，其简捷操作、低成本及灵活性有望将基因组测序成本降至100美元。 /p p 　　根据Illumina2017年第一季度财报，Illumina共收到135个NovaSeq测序仪订单。不过，中国科学院院士陈润生指出：“NovaSeq系列测序仪的使用窗口目前没有开放。” /p p 　　国内基因企业也在通过技术合作、收购等方式破壁测序仪国产化。如Illumina和贝瑞和康、安诺优达开发了一款适用于无创产前检测的二代测序仪NextSeq CN500和NextSeq 550AR，并已获得CFDA批准。 /p p 　　华大基因通过收购的方式布局，先后推出三款国产二代测序仪。华大基因CEO尹烨此前向21世纪经济报道记者透露：“算上临床机构、科研机构和友商，国内应该已经超过两百多台我们的测序仪在‘服役’了。” /p p 　　第三代测序技术原理最早发表于2003年，后来，Pacific Biosciences和Oxford Nanopore相继入局，Pacific Biosciences于2015年10月推出小型单分子测序仪Sequel。一名基因测序公司技术总监告诉记者：“中国市场目前唯一的三代测序仪就是这家公司提供，也是针对科研市场。” /p p 　　英美测序仪的研发起步虽早，但进展一直缓慢，临床应用更谈不上。瀚海基因化学部副总监赵陆洋告诉21世纪经济报道记者：“三代测序仪很受科研市场欢迎，因其提供了RNA直接测序的可能性，这是二代测序做不到的。” /p p 　　上述投资机构合伙人表示：“科研型测序仪对易用性、可靠性要求低一些，对可调节因素要求高一些，也不需要申请注册证。相比之下，临床市场的门槛高很多，空间也比较大。” /p p 　　虽然瀚海基因对自己的测序仪信心满满，但在评价一款基因测序仪的三大核心指标：通量、读长、准确度方面，瀚海基因却三缄其口。 /p p 　　据贺建奎介绍，GenoCare第三代基因测序仪的核心技术为单分子荧光测序，此项技术使用全内反射荧光成像方法，能够检测单个荧光分子，无需PCR扩增。 /p p 　　资料显示，二代基因测序技术在上机测序前需要对样本进行PCR扩增，可以在试管里、在很短的时间内，将待测基因扩增50万倍乃至上百万倍，这能提高基因诊断的灵敏度，但带来问题是实验要求比较高，成本也居高不下。 /p p 　　同时，贺建奎团队联合中美两国科学家协作使用Genocare对大肠杆菌测序。数据结果显示，Genocare与测序行业龙头Illumina生产的MiSeq二代基因测序仪的一致性达到99.7%。 /p p 　　“预计明年年初会公开发售价格。临床实验也已经启动了，在走试验、申报流程。其他领域如科研市场不需要医疗器械证就可以使用，这些领域已经有我们的测序仪在应用了。”贺建奎说。 /p p 　　 strong 应用存短板核心部件依赖进口 /strong /p p 　　研发出三代测序仪后，瀚海基因一面要推动大批量生产，一面要开拓中下游。 /p p 　　目前，基因测序已形成了明确的产业链分工：上游为设备和耗材供应商 中游为第三方测序服务供应商，需依赖设备投入、运营管理与终端维护开发 下游为生物信息分析服务商。 /p p 　　贺建奎阐述了瀚海基因的商业模式：“中游的应用开发比如肿瘤基因检测、遗传基因检测、传染病检测，通过合作伙伴来完成。希望越来越多的测序服务公司和相关的机构在我们测序仪上开发各类疾病检测，形成生态圈，并且通过他们或者其他人把测序仪销售到医院。” /p p strong 　　上下游企业的互相“成全”，也是Illumina和华大基因成长的路子。 /strong /p p 　　前述投资机构合伙人指出：“华大基因向Illumina购买了100多台测序仪才成为第一，华大基因也通过这些测序仪开发出了很多服务。测序仪未来的销售量如何，可能要依靠整个行业，包括合作伙伴、临床以及科研机构有没有充分地把临床意义和科研意义发挥出来。” /p p 　　记者在瀚海基因测序仪上市发布现场注意到，华大基因、北科生物、从事体外诊断的安图生物等都有相关负责人到场，这些都是瀚海的潜在合作伙伴。 /p p 　　不过，是否牵手瀚海基因还需要考量。一家生物技术公司产品部负责人告诉21世纪经济报道记者：“瀚海的测序仪一次只能测一个人的全基因组，Illumina的人数会多一点。另外，现在体外诊断主要还是对已知疾病的检测，瀚海基因主要是早期筛查，这虽然是趋势，但目前市场有限，二代测序也很早就在做了，样本和数据更多。” /p p strong 　　而更多的挑战还是来自老问题：错误率高。 /strong /p p 　　兴证医药研报指出，第三代基因测序单读长错误率依然偏高，在15%-40%，二代测序的错误率低于1%。前述中小企业投资机构负责人告诉记者：“单分子测序不需要切断DNA和RNA序列，看重对碱基对一下子读下去能读多长，而影响读长的一个是机器，一个是生物合成酶。” /p p 　　广发证券也指出，单分子测序可收集到的信号非常弱，这对光电元件提出很高要求，虽然目前部分仪器已经实现商业化，但离理想状态还有较大距离。另外，还有测序通量不高、插入缺失错误等不足之处，这都影响了三代测序的推广。 /p p 　　值得一提的是，与其他国产测序仪一样，瀚海基因测序仪核心零部件依旧需要进口，例如光学系统中的部分核心器件来自日本、德国，测序芯片和微流控系统需来自新加坡、美国。 /p p & nbsp /p

NASA宇航员凯特鲁宾斯首次在太空利用MinION测序仪进行DNA测序。　　凯特鲁宾斯，2005年毕业于斯坦福大学医学院生物化学系及微生物学与免疫学系，获得癌症生物学博士学位，2009年进入NASA培训，成为一名合格的宇航员。英国牛津纳米孔公司提供的MinION测序仪，只有手掌大小。　　美国国家航空航天局(NASA)官网30日宣布，刚过去的周末，NASA宇航员凯特鲁宾斯在国际空间站内成功完成微重力条件下的DNA测序，这标志着人类已迎来“能对太空活体生物进行基因测序”的全新时代。　　刚完成测序任务的鲁宾斯表示，她与地面同事一起见证了基因和系统生物学研究来到了太空。“我们现在开启了一个全新的科学领域——太空基因组和系统生物学。”　　这次太空测序是“生物分子测序研究项目”的一部分。测序使用的是英国牛津纳米孔公司提供的MinION测序仪，只有手掌大小，既方便又快捷。测序原理是通过纳米孔施加电流，同时让含有检测样本的液体流经检测仪，不同的DNA分子会引起不一样的电流变化，通过电流变化就能识别出这种基因序列的生物。　　项目组将事先准备好的老鼠、病毒和细菌的DNA样本带到空间站，由鲁宾斯在太空进行检测，而地面团队成员同步对类似样本进行测序。比较后发现，太空和地球上的两种测序结果能完美匹配。　　项目主管、NASA微生物学家萨拉卡斯特罗-华莱士说：“下一步我们将把整个测序过程搬到太空，不再带样本到太空，而是直接在太空准备样本，然后进行基因测序。宇航员将不仅能对已知的生物测序，还能在太空完成取样、准备样本和测序整个过程，最终识别出未知的外星生命。”　　有了在太空中测序DNA的方法，就能识别出国际空间站内的微生物是否威胁宇航员的健康，帮助地面科学家随时了解宇航员们的生活环境，及时告知他们是否要做清洁或服用抗生素。太空DNA测序仪对未来造访火星等需要长时间待在空间站的宇航员来说，是保护他们健康的重要工具。　　另外，测序仪还会成为空间站其他科研的重要工具，比如直接检测绕轨飞行中遗传物质或基因表达的变异，而不用再像以前一样等几个月返回地球后才知道结果。

1996年，Kasianowicz等人首次发现单链DNA和RNA电泳穿过α溶血素（α-HL）纳米孔的时候会产生对应的阻塞电流信号。此后，众多科研学者在这一研究基础上开始了更为广泛的研究。经过二十余年发展，生物纳米孔技术现已开始商业化，且市面已有成型的基于生物纳米孔单分子测序技术的基因测序仪产品。纳米孔最具前景的应用之一是其可以用于第三代DNA测序技术，因其不需要复杂的酶扩增以及荧光标记，且其具有低成本高通量的特点而受到广大研究者们的青睐。纳米孔是单分子测序仪最核心部件图1 纳米孔DNA测序的基本原理图。（a）基于纳米孔的DNA测序传感器搭建示意图，图中显示一条单链DNA正在电泳穿过石墨烯纳米孔。（b）单链DNA过孔时产生的阻塞离子电流信号细节示意图，每个碱基的体积及其与纳米孔之间的相互作用强度不同导致对应的阻塞电流幅值存在差异，从而可以用来区分不同的DNA碱基。【Si Wei, et al. Chin. Sci. Bull., 2014, 59(35): 4929-4941.】纳米孔单分子DNA测序传感器基于库特计数器原理，如图1所示在固态薄膜的顺式端（cis）和反式端（trans）都注满了离子溶液，两端的溶液仅通过纳米孔进行连接，当带电的DNA分子被置入到液池的顺式端后，在纳米孔的两侧施加电压，DNA分子会在电场力的作用下电泳穿过纳米孔，由于DNA碱基自身在孔内的物理占位以及其与纳米孔间较强的相互作用使得通过纳米孔的电流会被阻塞。一条单链DNA（ssDNA）由腺嘌呤（A），鸟嘌呤（G），胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）组成。因为四种碱基的尺寸及特征各异，当单链DNA穿过跟自身尺寸相当的纳米孔时，不同的碱基会产生对应幅值的阻塞电流，通过研究这些电流之间的差异就可以实现对DNA四种碱基的辨识，如图1所示。通过分析这些阻塞电流信号（如阻塞电流幅值和过孔时间等），DNA链上所含的碱基很有可能被检测和区分开来。纳米孔作为单分子测序仪器设计与制造的核心检测部件，因此如何保证纳米孔单分子传感器的检测灵敏度、时间空间分辨率、稳定性和寿命等是影响纳米孔单分子测序仪器工作效率和稳定性的关键技术问题。三大技术突破成就了如今的纳米孔单分子测序仪自1996年纳米孔被Kasianowicz等人发现以来，众多科学家投入大量精力深入研究，在研究过程中也遇到很多难题。例如，尽管研究者们都相继报道了纳米孔离子电流可以用于四种碱基的区分，然而他们得到的结论却大相径庭，使得阻塞电流的幅值和相应碱基之间的对应关系至今仍然含糊不清。研究者们对单链DNA均聚物在过孔时产生的阻塞电流幅值跟碱基体积大小的相关性进行了研究，组成DNA四种碱基的体积大小顺序为GATC，理论上DNA碱基的尺寸对离子电流信号的影响较大，然而其与纳米孔的强相互作用在阻塞电流幅值检测方面也会起到主导作用，且在不同的纳米孔材料或者实验条件下获得的实验结果差异较大，这也制约了基于纳米孔DNA测序的发展。经历了20余年的发展，三大技术突破与革新也成就了现今的纳米孔单分子测序仪的研制。首先是纳米孔检测DNA或RNA全新技术方案的提出，其次是采用酶对DNA分子的剪切或复制用于纳米单分子测序技术中，最后是单碱基信号的测序精度精准调控。之后数年的时间，Oxford Nanopore 公司于2013年11月启动了MinION测序仪的早期试用计划，这时首款纳米孔单分子测序仪也正式开始步入人类的视野。便携、低成本和高通量 纳米孔单分子测序成为最具潜力的DNA测序技术人类基因组计划人类基因组计划在2003 年完成人体全序列的基因测定，历时12 年，耗资数十亿美元，人类基因序列图已成为全人类共同的财富。但是，第一代的 Sanger测序方法也给基因组测序贴上了数亿美元的价格标签，让人望而生畏。近两年发展迅猛的第二代测序仪让人类基因组重测序的费用降低到10 万美元以下，测序时间也缩短到6 个月。但是，这样的价格和时间，相对于个人用户仍然太高，极大地限制了其临床应用和基础理论研究。与传统Sanger测序技术相比，纳米孔单分子测序技术的核心优势在于它的便携性、低成本和高通量。强大的市场需求和探索生命科学未知领域的渴望，有力地推动着DNA 检测水平的提高。2004 年，美国国家人类基因组研究所（NHGRI）启动了“千元基因组测序研究项目”, 目的是让人类基因组的测序费用降至1000 美元以下。基于纳米孔的单分子DNA 测序方法是第三代测序技术中成本最低，最具有竞争力的技术。同年，美国国家卫生研究院（NIH）提出了“1000美元测序”的概念，而基于纳米孔的DNA测序技术是最有潜力实现这一目标的方法之一，众多实验研究也进一步验证了纳米孔DNA测序技术的可行性。该方法的优势在于它简化了对DNA 的化学修饰、扩增和表面吸附等工艺，具有结构简洁、速度快、操作简便等特点，同时省去了昂贵的荧光试剂和CCD照相机的费用。最为重要的是它的效率高，单个核苷酸分子通过纳米孔的时间仅在微秒级，如果考虑单个芯片上集成成百上千个纳米孔阵列，有望在24 小时内完成对个体的基因测序，而目前的二代基因测序仪则需要6 个月时间。 商业化进展慢 提高纳米孔稳定性迫在眉睫纳米孔单分子测序技术现有市场的典型产品是Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司的MinION纳米孔测序仪，它具有低成本、高通量、读速快、读长长（约150kb）和高便携等特点，因此纳米孔单分子传感器目前已被广泛应用于物理学、生物学和化学等学科涉及单分子应用的科学研究，助力人类科技的发展，造福人类。基于上述纳米孔单分子测序技术的特点，相比传统测序仪器而言，它的典型应用场景之一是极端环境中病毒或细菌的高精度检测。例如，在偏远贫困地区，在疫情爆发或在没有足够的设备资源的情况下，便携的纳米孔单分子测序仪可以快速的协助病毒检测和疾病诊断。数年前西非爆发埃博拉病毒时，单分子测序仪便在病毒检测过程中起到的重要作用。再例如，存放在外太空空间站的土壤和水等是否已经出现微生物依然成谜，要将样品带至地球进行采样分析方能揭晓，而轻便的纳米孔单分子测序仪仅有u盘大小，可以方便的携带至外太空，在其他辅助条件下协助检测。虽然基于纳米孔的单分子测序仪具备很多优势，而且已经进入商业化进程，但是它的市场占有率相比传统测序技术而言依然偏低。其原因主要是目前市场已有的纳米孔测序仪采用的仍然是生物纳米孔和磷脂膜，这样的生物体系不可避免的面临着寿命短和稳定性不持久的缺陷。因此要推进纳米孔单分子测序技术的发展，这些问题必须得到解决。而固体纳米孔（例如氮化硅，二硫化钼）目前的报道也可以辨识单碱基，因此固体纳米孔有望在未来代替生物纳米孔实现稳定、可重复利用的高精度DNA测序。然而固体纳米孔在信噪比方面不如生物纳米孔，而且DNA在相同条件下通过固体纳米孔的速度偏快，因此如何提高固体纳米孔的信噪比和实现有效的DNA控速也是亟需解决的关键科学问题。作者简介：司伟，博士，东南大学硕导/讲师，2020年度东南大学“至善青年学者”，江苏省2019年度优秀博士学位论文和东南大学2019年度优秀博士学位论文获得者，入选2019年、2020年东南大学机械工程学院“优才培育计划”，担任《MaterialsInternational》(ISSN: 2668-5728)期刊助理编辑和《Bioengineering International》(ISSN 2668-7119)期刊编委，获得2019年Nanotechnology期刊杰出审稿人奖。主要研究方向：（1）机械操控及机器人技术、（2）工程流体动力学及传感器、（3）结构工艺设计及加工制造、（4）程序语言算法和三维建模与仿真。