库尔特原理

前文回顾：发明人库尔特的传奇人生——颗粒表征电阻法（上）一、经典库尔特原理在经典电阻法测量中，壁上带有一个小孔的玻璃管被放置在含有低浓度颗粒的弱电解质悬浮液中，该小孔使得管内外的液体相通，并通过一个在孔内另一个在孔外的两个电极建立一个电场。通常是在一片红宝石圆片上打上直径精确控制的小孔，然后将此圆片通过粘结或烧结贴在小孔管壁上有孔的位置。由于悬浮液中的电解质，在两电极加了一定电压后（或通了一定电流后）， 小孔内会有一定的电流流过（或两端有一定的电压），并在那小孔附近产生一个所谓的“感应区”。含颗粒的液体从小孔管外被真空或其他方法抽取而穿过小孔进入小孔管。当颗粒通过感应区时，颗粒的浸入体积取代了等同体积的电解液从而使感应区的电阻发生短暂的变化。这种电阻变化导致产生相应的电流脉冲或电压脉冲。图1 颗粒通过小孔时由于电阻变化而产生脉冲在测量血球细胞等生物颗粒时所用的电解质为生理盐水（0.9%氯化钠溶液），这也是人体内液体的渗透压浓度，红细胞可以在这个渗透压浓度中正常生存，浓度过低会发生红细胞的破裂，浓度过高会发生细胞的皱缩改变。在测量工业颗粒时，通常也用同样的电解质溶液，对粒度在小孔管测量下限附近的颗粒，用 4%的氯化钠溶液以增加测量灵敏度。当颗粒必须悬浮在有机溶剂内时，也可以加入适用于该有机溶液的电解质后，再用此有机 溶液内进行测量。通过测量电脉冲的数量及其振幅，可以获取有关颗粒数量和每个颗粒体积的信息。测量过程中检测到的脉冲数是测量到的颗粒数，脉冲的振幅与颗粒的体积成正比，从而可以获得颗粒粒度及其分布。由于每秒钟可测量多达 1 万个颗粒，整个测量通常在数分钟内可以完成。在使用已知粒度的标准物质进行校准后，颗粒体积测量的准确度通常在 1-2%以内。通过小孔的液体体积可以通过精确的计量装置来测量，这样就能从测量体积内的颗粒计数得到很准确的颗粒数量浓度。 为了能单独测量每个颗粒，悬浮液浓度必须能保证当含颗粒液体通过小孔时，颗粒是一个一个通过小孔，否则就会将两个颗粒计为一个，体积测量也会发生错误。由于浓度太高出现的重合效应会带来两种后果：1）两个颗粒被计为一个大颗粒；2）两个本来处于单个颗粒探测阈值之下而测不到的颗粒被计为一个大颗粒。颗粒通过小孔时可有不同的途径，可以径直地通过小孔，但也可能通过非轴向的途径通过。非轴向通过时不但速度会较慢，所受的电流密度也较大，结果会产生表观较大体积的后果，也有可能将一个颗粒计成两个[1]。现代商业仪器通过脉冲图形分析可以矫正由于非轴向流动对颗粒粒度测量或计数的影响。图2 颗粒的轴向流动与非轴向流动以及产生的脉冲经典库尔特原理的粒度测量下限由区分通过小孔的颗粒产生的信号与各种背景噪声的能力所决定。测量上限由在样品烧杯中均匀悬浮颗粒的能力决定。每个小孔可用于测量直径等于 2%至 80%小孔直径范围内的颗粒，即 40:1 的动态范围。实用中的小孔直径通常为 15 µm 至 2000 µm，所测颗粒粒度的范围为 0.3 µm 至 1600 µm。如果要测量的样品粒度分布范围比任何单个小孔所能测量的范围更宽，则可以使用两个或两个以上不同小孔直径的小孔管，将样品根据小孔的直径用湿法筛分或其他分离方法分级，以免大颗粒堵住小孔，然后将用不同小孔管分别测试得到的分布重叠起来，以提供完整的颗粒分布。譬如一个粒径分布为从 0.6 µm 至 240 µm 的样品，便可以用 30 µm、140 µm、400 µm 三根小孔管来进行测量。 库尔特原理的优点在于颗粒的体积与计数是每个颗粒单独测量的，所以有极高的分辨率，可以测量极稀或极少个数颗粒的样品。由于体积是直接测量而不是如激光衍射等技术的结果是通过某个模型计算出来的，所以不受模型与实际颗粒差别的影响，结果一般也不会因颗粒形状而产生偏差。该方法的最大局限是只能测量能悬浮在水相或非水相电解质溶液中的颗粒。使用当代微电子技术，测量中的每个脉冲过程都可以打上时间标记后详细记录下来用于回放或进行详细的脉冲图形分析。如果在测量过程中，颗粒有变化（如凝聚或溶解过程，细胞的生长或死亡过程等），则可以根据不同时间的脉冲对颗粒粒度进行动态跟踪。 对于球状或长短比很接近的非球状颗粒，脉冲类似于正弦波，波峰的两侧是对称的。对很长的棒状颗粒，如果是径直地通过小孔，则有可能当大部分进入感应区后，此颗粒还有部分在感应区外，这样产生的脉冲就是平台型的，从平台的宽度可以估计出棒的长度。对所有颗粒的脉冲图形进行分析，可以分辨出样品中的不同形状的颗粒。 大部分生物与工业颗粒是非导电与非多孔性的。对于含贯通孔或盲孔的颗粒，由于孔隙中填满了电解质溶液，在颗粒通过小孔时，这些体积并没有被非导电的颗粒物质所替代而对电脉冲有所贡献，所以电感应区法测量这些颗粒时，所测到的是颗粒的固体体积，其等效球直径将小于颗粒的包络等效球直径。对于孔隙率极高的如海绵状颗粒，测出的等效球直径可以比如用激光粒度仪测出的包络等效球小好几倍。 只要所加电场的电压不是太高，通常为 10 V 至 15 V，导电颗粒譬如金属颗粒也可以用电阻法进行测量，还可以添加 0.5%的溴棕三甲铵溶液阻止表面层的形成。当在一定电流获得结果后，可以使用一半的电流和两倍的增益重复进行分析，应该得到同样的结果。否则应使用更小的电流重复该过程，直到进一步降低电流时结果不变。 在各种制造过程中，例如在制造和使用化学机械抛光浆料、食品乳液、药品、油漆和印刷碳粉时，往往在产品的大量小颗粒中混有少量的聚合物或杂质大颗粒，这些大颗粒会严重影响产品质量，需要进行对其进行粒度与数量的表征。使用库尔特原理时，如果选择检测阈值远超过小颗粒粒度的小孔管（小孔直径比小颗粒大 50 倍以上），则可以含大量小颗粒的悬浮液作为基础液体，选择适当的仪器设置与直径在大颗粒平均直径的 1.2 倍至 50 倍左右的小孔，来检测那些平均直径比小颗粒至少大 5 倍的大颗粒 [2]。 二、库尔特原理的新发展 可调电阻脉冲感应法可调电阻脉冲感应法（TRPS）是在 21 世纪初发明的，用库尔特原理测量纳米颗粒的粒度与计数。在这一方法中，一个封闭的容器中间有一片弹性热塑性聚氨酯膜，膜上面有个小孔，小孔的大小（从 300 nm 至 15 m）可根据撑着膜的装置的拉伸而变来达到测量不同粒度的样品。与经典的电阻法仪器一样，在小孔两边各有一个电极，测量由于颗粒通过小孔而产生的电流（电压） 变化。它的主要应用是测量生物纳米颗粒如病毒，这类仪器不用真空抽取液体，而是用压力将携带颗粒的液体压过小孔。压力与电压都可调节以适用于不同的样 品。由于弹性膜的特性，此小孔很难做到均匀的圆形，大小也很难控制，每次测得的在一定压力、一定小孔直径下电脉冲高度与粒度的关系，需要通过测量标准颗粒来进行标定而确定。图3 可调电阻脉冲感应法示意图当小孔上有足够的压力差时，对流是主要的液体传输机制。 由于流体流速与施加的压力下降成正比，颗粒浓度可以从脉冲频率与施加压力之间线性关系的斜率求出。但是需要用已知浓度的标准颗粒在不同压力下进行标定以得到比例系数[3]。 这个技术在给定小孔直径的检测范围下限为能导致相对电流变化 0.05%的颗粒直径。检测范围的上限为小孔孔径的一半，这样能保持较低程度的小孔阻塞。典型的圆锥形小孔的动态范围 为 5:1 至 15:1，可测量的粒径范围通常从 40 nm 至 10 µm。 此技术也可在测量颗粒度的同时测量颗粒的 zeta 电位，但是测量的准确度与精确度都还有待提高，如何排除布朗运动对电泳迁移率测量的影响也是一个难题[4]。微型化的库尔特计数仪随着库尔特原理在生物领域与纳米材料领域不断扩展的应用，出现了好几类小型化（手提式）、微型化的库尔特计数仪。这些装置主要用于生物颗粒的检测与计数，粒度不是这些应用主要关心的参数，小孔的直径都在数百微米以内。与上述使用宏观压力的方法不同的是很多这些设计使用的是微流控技术，整个装置的核心部分就是一个微芯片，携带颗粒的液体在微通道中流动，小孔是微通道中的关卡。除了需要考虑液体微流对测量带来的影响，以及可以小至 10 nm 的微纳米级电极的生产及埋入，其余的测量原理和计算与经典的库尔特计数器并无两致。这些微芯片可以使用平版印刷、玻璃蚀刻、 防蚀层清除、面板覆盖等步骤用玻璃片制作[5]， 也可以使用三维打印的方式制作[6]。一些这类微流控电阻法装置已商业化。图4 微流计数仪示意图利用库尔特原理高精度快速的进行 DNA 测序近年来库尔特原理还被用于进行高精度、快速、检测误差极小的 DNA 或肽链测序。这个技术利用不同类型的纳米孔，如石墨烯形成的纳米孔或生物蛋白质分子的纳米孔，例如耻垢分枝杆菌孔蛋白 A（MspA）。当线性化的 DNA-肽复合物缓慢通过纳米孔时，由于不同碱基对所加电场中电流电压的响应不同，通过精确地测量电流的变化就可对肽链测序。由于此过程不影响肽链的完整性，如果将实验设计成由于电极极性的变化而肽链可以来 回反复地通过同一小孔，就可以反复地读取肽链中的碱基，在单氨基酸变异鉴定中的检测误差率可小于 10-6[7,8]。图5 纳米孔 DNA 测序库尔特原理的标准化 早在 2000 年，国际标准化组织就已成文了电感应区法测量颗粒分布的国际标准（ISO 13319），并得到了广泛引用。在 2007 年与 2021 年国际标准化组织又前后两次对此标准进行了修订。中国国家标委会也在 2013 年对此标准进行了采标，成为中国国家标准（GB/T 29025-2012）。参考文献【1】Berge, L.I., Jossang, T., Feder, J., Off-axis Response for Particles Passing through Long Apertures in Coulter-type Counters, Meas Sci Technol, 1990, 1(6), 471-474. 【2】Xu, R., Yang, Y., Method of Characterizing Particles, US Patent 8,395,398, 2013. 【3】Pei, Y., Vogel, R., Minelli, C., Tunable Resistive Pulse Sensing (TRPS), In Characterization of Nanoparticles, Measurement Processes for Nanoparticles, Eds. Hodoroaba, V., Unger, W.E.S., Shard, A.G., Elsevier, Amsterdam, 2020, Chpt.3.1.4, pp117-136.【4】Blundell, E.L.C.J, Vogel, R., Platt, M., Particle-by-Particle Charge Analysis of DNA-Modified Nanoparticles Using Tunable Resistive Pulse Sensing, Langmuir, 2016, 32(4), 1082–1090. 【5】Zhang, W., Hu, Y., Choi, G., Liang, S., Liu, M., Guan, W., Microfluidic Multiple Cross-Correlated Coulter Counter for Improved Particle Size Analysis, Sensor Actuat B: Chem, 2019, 296, 126615. 【6】Pollard, M., Hunsicker, E., Platt, M., A Tunable Three-Dimensional Printed Microfluidic Resistive Pulse Sensor for the Characterization of Algae and Microplastics, ACS Sens, 2020, 5(8), 2578–2586. 【7】Derrington, I.M., Butler, T.Z., Collins, M.D., Manrao, E., Pavlenok, M., Niederweis, M., Gundlach, J.H., Nanopore DNA sequencing with MspA, P Natl Acad Sci, 107(37), 16060-16065, 2010. 【8】Brinkerhoff, H., Kang, A.S.W., Liu, J., Aksimentiev, A., Dekker, C., Multiple Rereads of Single Proteins at Single– Amino Acid Resolution Using Nanopores, Science, 374(6574), 1509-1513, 2021. 作者简介许人良，国际标委会颗粒表征专家。1980年代前往美国就学，受教于20世纪物理化学大师彼得德拜的关门弟子、光散射巨擘朱鹏年和国际荧光物理化学权威魏尼克的门下，获博士及MBA学位。曾在多家跨国企业内任研发与管理等职位，包括美国贝克曼库尔特仪器公司颗粒部全球技术总监，英国马尔文仪器公司亚太区技术总监，美国麦克仪器公司中国区总经理，资深首席科学家。也曾任中国数所大学的兼职教授。 国际标准化组织资深专家与召集人，执笔与主持过多个颗粒表征国际标准 美国标准测试材料学会与化学学会的获奖者 中国颗粒学会高级理事，颗粒测试专业委员会常务理事 中国3个全国专业标准化技术委员会的委员 与中国颗粒学会共同主持设立了《麦克仪器-中国颗粒学报最佳论文奖》浸淫颗粒表征近半个世纪，除去70多篇专业学术论文、SCI援引近5000、数个美国专利之外，著有400页业内经典英文专著《Particle Characterization： Light Scattering Methods》，以及即将由化学工业出版社出版的《颗粒表征的光学技术及其应用》。点击图片查看更多表征技术

生物、药物等许多的研究均需要通过观察细胞体积的变化或细胞数目增减的来判断和评估实验的效果。由于细胞所处环境的改变可促使其自身体积做出相应的变化，以便适应改变后的环境大致新的平衡。由于并不能清晰地知道该种细胞体积变化规律，因此必须检测其体积或细胞数目随条件、时间的变化。 　　细胞的发育与细胞分裂周期级数递增均需要连续不断的细胞增殖。 　　在培养液中正在增殖的细胞在其分裂前其体积将增大至原体积的两倍。然而对细胞发育与分裂的速度作如何调整才能保证细胞体积的不变并不明确。因此，测量细胞的体积的变化对了解与控制细胞的发育和周期非常重要。 　　细胞的死亡 　　细胞的增殖与细胞的死亡之间需要一个精细的平衡以保持足够的细胞数量。该种平衡容许细胞作最佳的状态调节以适应各样机能变化的需求。细胞死亡有两种清晰的机制，坏死与凋亡。坏死是一个病理生理的机制，包括细胞膨胀以及细胞膜破裂而释出内容物。凋亡则是一个程序式死亡的机制。凋亡的特征之一就是细胞收缩。细胞有缺陷的凋亡与过度凋亡，两者同样会导致严重疾病。 　　渗透压的补偿 　　任何种类的细胞都有可能因处于不利环境而死亡。细胞犹如多孔的网筛极易因渗入已溶解于周围环境的化学物而使渗透压受影响。细胞内外环境中该些溶解物颗粒数目的不平衡，将会导致水份透进细胞而使其体积涨大，或者是水份从细胞渗出使其体积收缩。 　　当细胞或微生物遭遇环境的变化，它们都会尝试通过自身调节来适应新的环境。 　　细胞平均体积(MCV)的变化 　　当细胞或微生物遭受环境变化时，它们将通过自身调整以图适应新的环境。一些例子中细胞需要改变自身体积以便达到适合的目标。 　　由贝克曼库尔特公司出品的Multisizer 3 库尔特细胞特性分析仪是目前最权威的细胞体积、细胞计数的分析仪器，应用文献多不胜数。无可逾越的领先技术更使Multisizer 3 成为分辨率最高的仪器。国外的用户统计表明，Multisizer 3 已成为细胞实验室必备的研究工具。 　　自华莱士• 库尔特先生发明 库尔特原理 以来，该原理已广泛应用于材料、生物、医学、制药等众多的领域。目前生物领域的细胞计数标准就是库尔特原理。美国材料实验协会ASTM将库尔特原理定为生物细胞计数的标准(ASTM-F2194)。国际血液学标准化委员会亦指定库尔特原理为计算红细胞与白细胞的标准实验室方法 (Clin. lab. Haemat. 1988. 10, 203-212.)。 　　作为库尔特原理及技术应用的鼻祖，美国贝克曼库尔特公司始终保持着技术领先的优势。† 库尔特计数仪(Coulter Counter)无论在研究还是在质量控制的应用均具有深远的影响力。在权威的研究机构及其发表的学术文献当中，库尔特计数仪均担当着不可或缺的角色。 　　多年来贝克曼库尔特公司在市场上推出了一系列的库尔特计数仪(Coulter Counter)，如：ZM、TA II、Multisizer II等系列型号，为科研与产品控制的实验室颗粒/细胞的检测提供最可靠的分析手段。Multisizer 3 型库尔特颗粒/细胞计数及粒度分析仪为当今所有计数仪、粒度分析仪当中分辨率最高的仪器。 　　库尔特原理(Coulter Principle) 　　又称为电感应区技术。 　　悬浮于弱电解液中的细胞被抽吸而经过一个小孔，因产生外加电压而形成“感应区”。细胞经过小孔时，细胞的体积替代了电解液的相应体积。因相应体积的电解液被替代，小孔感应区产生电压脉冲而导致电阻的改变。脉冲的强度与细胞的体积成比例的关系 。 　　Multisizer 3 先进的DPP 数码脉冲处理器，使测量过程中的数以百万计的脉冲信号无须经压缩而保存。数据因无损失而能实现再分析功能。DPP的功能使得Multisizer 3 能够实时监测样品在分析过程中的原始变化。 　　DPP同样可用于检测细胞体积的改变。在许多的生化过程中细胞体积是一个重要的参考因素。如细胞发育、细胞周期、细胞死亡、渗透压的补偿、致病机理和吞噬作用等。Multisizer 3 可以观测细胞粒径与体积从几秒到几小时内的变化。 　　DPP技术在低温生物学中的应用 　　这是在冷冻过程中受渗透压影响的细胞，其平均体积(MCV)的分布曲线和20秒内连续的脉冲峰值平均值的变化。 　　择任意的脉冲群可以将一个粒度分布“分割”成多重的分布。因此，可获得在分析全程中的某一时段的粒度分布。如图示，可获得细胞的平均直径随时间的变化。 　　使用Beckman Coulter 的Multisizer™ 3 库尔特体积粒度分析仪将能方便而精确地测量细胞平均体积(MCV)的各种变化。

仪器信息网讯 2013年4月9日，贝克曼库尔特在北京翠宫饭店举办了“新技术新产品交流展示会”，并宣布贝克曼库尔特在Pittcon 2013上推出的DelsaMax系列纳米及Zeta电位分析仪正式登陆中国市场，70多位来自科研院所、质检机构、石油化工等单位的颗粒特性表征工作者参会并见证了这一时刻，仪器信息网作为特邀媒体亦出席了会议。 会议现场 　　作为颗粒特性分析仪器产品的领先供应商，贝克曼库尔特此次重点推介的DelsaMax系列是DelsaNano系列的升级款，最大的创新点是DelsaMax系列拥有一个光源和两个独立检测系统，可以实现并行测量，即一次加样可同步进行纳米粒径测量与Zeta电位分析，能够在纳米生物技术、纳米粒结合等领域“大显身手”，这当属世界首创! 　　同时，贝克曼库尔特会上还特别展出了Multisizer4库尔特颗粒计数及粒度分析仪。这款产品是贝克曼库尔特经典产品Multisizer3的升级版，继续沿用了闻名半个多世纪的库尔特原理，但却加进了时代进步的元素——数码脉冲处理器(DPP)技术，这使得Multisizer4灵敏度大为提高，可广泛应用在生物技术、细胞生物学、石油化工等行业。 　　DelsaMax系列的三宗“最” 贝克曼库尔特公司颗粒表征全球产品经理Matthew N Rhyner博士 　　会上，贝克曼库尔特技术应用专家Matthew N Rhyner博士介绍，DelsaMax系列利用电泳光散射及动态光散射原理，拥有31个检测器，测量过程仅需短短1秒钟，是一款纳米颗粒特性表征的“利器”，能够轻松应付生物制品成分表征、化学制品和材料两大市场的复杂要求。 　　据了解，DelsaMax系列当前共推出了DelsaMax Pro及DelsaMax Core两个型号。其中，DelsaMax Pro仅需45微升样品在短短1秒钟内便可获得纳米粒径与Zeta电位的结果，凭借“最小的样品量，最快捷的分析，成就最极致的结果”这一赞誉亮相Pittcon 2013。而DelsaMax Core则拥有独立的动态和真正的静态光散射检测器，样品容量低至1微升，能够测量从0.4纳米至10,000 纳米的颗粒大小与分子量。 　　Multisizer系列再出“重拳” 会场展出了Multisizer4库尔特颗粒计数及粒度分析仪 　　Matthew N Rhyner博士说到，1947年，库尔特先生发明了以电阻变化法测量颗粒和细胞粒度及数目的库尔特原理(COULTER PRINCIPLE)，而Multisizer系列产品正是采用这一原理，并在各行各业建立了雄厚的用户基础。现如今，随着科学技术的进步，库尔特原理也迈进了数码时代。 　　最新推出的Multisizer4创新引入了数码脉冲处理器(DPP)专利技术，分辨率、灵敏度都有了大幅提升，不但可精确分析粒径分布，还能分析微量颗粒的绝对体积、绝对数量。配合精确的体积测量泵，Multisizer4还可提供颗粒的个数与浓度。Matthew N Rhyner博士还举例到，Multisizer4在细胞生物学领域能够“大显神通”，如Multisizer4可以对生物细胞体积的改变作持续地跟踪、监测和分析。 贝克曼库尔特公司技术工程师现场操作演示Multisizer4 　　除Matthew N Rhyner博士莅临现场作技术应用培训外，贝克曼库尔特中国及东南亚区颗粒特性分析部市场营运经理马作楠先生、颗粒分析产品部北区经理麻晓良先生等纷纷到场参会。 贝克曼库尔特中国及东南亚区颗粒特性分析部市场营运经理马作楠先生 　　马作楠先生首先对各位用户能在百忙之中出席会议表示感谢，并对大家的到来表示欢迎。同时还说到，DelsaMax系列可谓是世界上第一台可以同时并实时测量纳米粒径与Zeta电位的粒度仪，曾在Pittcon 2013上亮相展出。而Multisizer4则是迄今为止功能最全、分辨率最高的颗粒计数及粒度分析仪，今天我们的工程师会亲自操作Multisizer4，测量矿泉水、眼药水以及洗眼液中的颗粒分布情况，让大家现场体验一下Multisizer4的优良性能。 贝克曼库尔特颗粒分析产品部北区经理麻晓良先生 　　麻晓良先生说到，贝克曼库尔特公司于1997年由Beckman公司与Coulter公司合并而成，其创始人是世界科学仪器界传奇式人物阿诺贝克曼先生与沃勒斯库尔特先生。发展至今，贝克曼库尔特公司已成为世界上最大的颗粒分析仪器制造公司之一。 　　贝克曼库尔特公司业务主要分为专业测试、生命科学与临床测试3部分，其中，颗粒特性分析业务属于专业测试部，主要颗粒表征仪器产品则包括库尔特颗粒计数/粒度分析仪Multisizer系列、激光粒度仪LS系列与Delsa系列、比表面及孔隙分析仪SA3100。 抽奖活动现场 　　此外，贝克曼库尔特公司的代理商——北京博力飞科技发展有限公司现场还安排了抽奖活动，以此回馈贝克曼库尔特颗粒特性分析仪器新老用户的支持。(撰稿：刘玉兰) 　　附录：http://www.coultercounter.com/ 　　　　　http://www.beckmancoulter.com.cn/ 　　　　　http://www.instrument.com.cn/netshow/SH100336/index.asp