核苷酸检测

想要成功分离脱三苯甲基、去保护的寡核苷酸，您需要具有高分离能力并且可以耐受严苛条件的色谱柱。如果色谱柱不具备足够高的分离能力，则不能保证结果的准确性。如果色谱柱不够稳定，则需要频繁地进行更换，这样便会扰乱工作流程，从而增加成本。Agilent AdvanceBio 寡核苷酸色谱柱拥有高效的 2.7 µm 表面多孔 Poroshell 颗粒填料。采用安捷伦独有的技术对颗粒填料进行化学修饰，使其可耐受高 pH 的流动相。我们还将这些填料与封端 C18 固定相键合，从而为寡核苷酸的分析提供出色的选择性。此外，我们还采用分离度标准品对每一批 AdvanceBio 寡核苷酸填料进行了测试，确保其具有一致的性能。AdvanceBio 系列产品旨在为蛋白质、抗体、偶联物、新生物实体和生物药物的完整表征提供一致、卓越的性能。

AdvanceBio 寡核苷酸色谱柱提供了高质量、高分离度的离子对反相 (IP-RP) 色谱柱化学填料平台，通过纯化为分析表征提供支持并支持无缝方法放大。想要成功分离脱三苯甲基、去保护的寡核苷酸，HPLC 色谱柱需要具有高分离能力并且可以耐受高 pH 和温度，这样可以提供更好的分离和变性条件，从而实现理想的分离度和寡核苷酸分离。AdvanceBio 寡核苷酸色谱柱拥有高效的 2.7 µ m 和 4 µ m 表面多孔 Poroshell 颗粒填料。采用安捷伦独特的技术对颗粒填料进行化学修饰，使其可耐受高 pH 的流动相。我们还将这些填料与封端 C18 固定相键合，从而为寡核苷酸的分析提供出色的选择性。此外，我们还采用分离度标准品对每一批 AdvanceBio 寡核苷酸填料进行了测试，确保其具有一致的性能。AdvanceBio 产品专门为蛋白质、抗体、偶合物、新生物体和生物药物的完整表征和生物分析提供一致、出色的性能。特性：在高 pH 和高温下化学填料颗粒保持稳定 — 可在理想变性条件下提高分离度，提供出色的峰形和分离效果可全面扩展的化学填料平台拥有 2.7 µ m 和 4 µ m Poroshell 颗粒填料 — 简化了方法放大，避免放大至纯化时的化学填料重新验证过程21.2 mm 内径制备柱中装填 4 µ m Poroshell 化学填料 — 具有更高的效率和分离度，可提高目标产物的收率和纯度更高的灵活性 — 2.7 µ m Poroshell 填料可兼容 HPLC 和 UHPLC 仪器更可靠的结果 — 高效 Poroshell 颗粒形态实现高分离度分离更低的成本 — 稳定、耐高 pH 的化学改性硅胶可确保色谱柱的长使用寿命工作原理：了解离子对反相 (IP-RP) 色谱离子对反相 (IP-RP) 色谱是一种分析技术，可保留和分离通常不被反相色谱柱保留的带电分子。对于具有阴离子骨架的极性寡核苷酸来说，引入烷基胺离子对试剂有助于其与 C18 固定相的相互作用。带正电的氮基团与寡核苷酸的阴离子骨架形成了“离子对”。胺的烷基链被疏水性 C18 固定相保留，促成寡核苷酸的保留与分离。寡核苷酸分析虚拟实验室近年来，合成寡核苷酸（包括小干扰 RNA、反义寡核苷酸和适配体）已成为快速发展的药物形式。随着这些合成寡核苷酸的发展，越来越需要可靠的分析方法和易于使用的数据分析工作流程来表征它们。通常表征的寡核苷酸属性包括：质量纯度（以及杂质的相对含量）序列

寡核苷酸分离技术合成寡核苷酸和DNA片段被应用于迅速发展的应用领域，包括作为主体或杂交探针用于治疗性制剂。沃特世寡核苷酸分离技术(OST：Oligonucleotide Separation Technology)基于BEH杂化颗粒的反相色谱柱，以及Gen-Pak离子交换柱，应对各种高分辨分析与实验室规模分离挑战所需，包括涉及各种DNA和RNA品种。沃特世OST色谱柱装有键合了C 18 的第二代杂化技术BEH颗粒。对去三苯甲基(detritylated，或称脱保护)的合成寡核苷酸样品的分离，基于成熟的离子对反相色谱法。沃特世提供1.7 μm UPLC颗粒或2.5 μm HPLC颗粒，装填以各种不同色谱柱规格，从而灵活满足各种实验室规模分离或分析的不同需求，并能实现异乎寻常的样品分辨率和卓越的色谱柱使用寿命。此外，沃特世的制造和质控测试程序，有助于确保批次之间与柱之间的性能的一致性，而无论应用的难度有多高。1、分离效率相当于或优于PAGE、CGE、或离子交换HPLC方法2、可从去三苯甲基(脱保护)的全长产物中分辨出失败序列3、可放大的柱规格，满足实验室规模的分离需求4、超长的色谱柱使用寿命，降低单次分析或分离成本5、经MassPREP OST标准品质控测试，帮助确保性能稳定对寡核苷酸混合物具有异乎寻常的高分辨率ACQUITY UPLC OST C 18 ，1.7 μm色谱柱(设计专用于ACQUITY UPLC系统)和XBridge OST C 18 ，2.5 μm色谱柱，能完全适用于离子对反相色谱法分析和纯化去三苯甲基寡核苷酸的需求。如图所示(右图)，使用沃特世UPLC技术所进行的分离，具有与毛细管凝胶电泳(CGE)相媲美的组分分辨率，而且分析时间显著缩短。由于使用亚2 μm BEH技术颗粒提高了分辨力，因而有可能对大寡核苷酸序列进行分离(如将N与N-1分开)。此外，使用沃特世OST色谱柱配合质谱联用技术以及对质谱兼容的洗脱剂，有可能对与失败序列的色谱分离开的目标寡核苷酸产物的分子量特征进行定量分析。分离15-60mer去三苯甲基寡脱氧胸苷序列组(Detritylated Oligodeoxythymidine Ladder)分离去三苯甲基寡脱氧胸苷序列组，比较毛细管凝胶电泳(CGE)与离子对反相色谱方法的分离效果纯化单链RNA干扰RNA寡核苷酸的UPLC/MS分析RNA干扰(RNAi)机制的发现现在被广泛用于静默目标基因表达，这推动了对小分子干扰RNA(siRNA)分析的需求。为满足对20-25个核苷酸的小分子干扰RNA(siRNA)进行耐用的、快速的、灵敏的分析的需求，沃特世开发了一个UPLC/MS方法，运用了UPLC OST色谱柱和Synapt HDMS质谱仪。采集准确质量可对5’-截断寡聚体(寡核苷酸合成过程所产生的失败序列)以及其它一些杂质峰进行分配。质谱图中的质量的每个峰均使用MaxEnt 1软件进行去卷积化。图2给出了推测性的5’-端失败产物。对寡核苷酸母体的几乎完整序列均进行了解释。质谱分析还显示除了目标21-mer RNAi序列以外，还存在一个额外的尿苷单核苷酸。对一个21mer的RNA进行LC/MS分析不同离子对试剂对不同寡核苷酸序列分离的影响杰出的柱寿命在这些苛刻的分离条件下，填充以BEH技术颗粒的沃特世OST色谱柱显示出引人注目的柱寿命，同时还具有并保持卓越的分离性能。而在相同的苛刻分离条件下，传统硅胶基质色谱柱的使用寿命显著缩短。分离5-25mer去三甲苯基(脱保护)寡脱氧胸苷序列——进样1000针柱分辨率没有任何变化寡核苷酸分离技术(OST)柱产品一览表产品描述 粒径 孔径 柱规格 部件号ACQUITY UPLC OST C 18 * 1.7 μm 135 2.1 x 50 mm 186003949ACQUITY UPLC OST C 18 * 1.7 μm 135 2.1 x 100 mm 186003950ACQUITY UPLC OST C 18 * 1.7 μm 135 2.1 x 150 mm 186005516ACQUITY UPLC OST C 18 方法验证包** 1.7 μm 135 2.1x 100 mm 186004898ACQUITY UPLC OST C 18 定制柱* 1.7 μm 135 定制 186003951XBridge OST C 18 2.5 μm 135 2.1 x 50 mm 186003952XBridge OST C 18 2.5 μm 135 4.6 x 50 mm 186003953XBridge OST C 18 2.5 μm 135 10 x 50 mm 186003954XBridge OST C 18 方法验证包** 2.5 μm 135 4.6 x 50 mm 186004906XBridge OST C 18 定制柱 2.5 μm 135 定制 186003955* 用于配合沃特世UPLC系统使用**来自于不同批次填料所装填的三根色谱柱可放大的DNA与RNAi分离，良好的产品回收率研究基因静默、或用于基因敲除时，需要高纯度寡核苷酸。XBridge OST C 18 色谱柱，具有极高分辨率，其柱规格设计用于满足实验室规模的分离需求，是纯化去三苯甲基(脱保护)寡核苷酸的首选色谱柱。如下表所示，XBridge OST C 18 色谱柱规格和操作流速的选择，主要取决于合成反应混合物的规模大小。我们建议根据寡核苷酸样品的载量选择适当的色谱柱规格，这样可使组分分辨率最大化，使目标产物与不要的失败序列分离开得到最大回收率。柱规格 大概样品载量** mg*** 流速2.1 x 50 mm 0.04 μmoles 0.2 mg 0.2 mL/min4.6 x 50 mm 0.20 μmoles 1.0 mg 1.0 mL/min10 x 50 mm 1.00 μmoles 4.5 mg 4.5 mL/min19 x 50 mm* 4.00 μmoles 16.0 mg 16.0 mL/min30 x 50 mm* 9.00 μmoles 40.0 mg 40.0 mL/min50 x 50 mm* 25.00 μmoles 110.0 mg 110.0 mL/min* OST订制柱** 所列数值仅为约值，且取决于寡核苷酸的长度、碱基组成、以及所采用的“切取中心”的馏分收集方法。*** 按平均寡核苷酸分子量及合成产率估算将siRNA Duplex与其相关杂质分离开