细胞毒性检测

p strong 仪器信息网讯 /strong 2018年新年伊始，力康Heal Force生命科学仪器事业部隆重推出全新产品——细胞毒素安全柜。 /p p 　　细胞毒素（Cytotoxicity）药物是高危险性化合物，与微生物污染不同的是，这些药物粉尘污染无法被福尔马林或过氧化氢等普通的消毒方式中和。必须充分保护涉及到药物分析制备的操作人员和维护安全柜的工作人员，例如更换过滤器等。细胞毒素安全柜就是专门为这种高毒性的细胞毒素类药物实验和维护所设计的。 br/ /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/1b6bb2bf-9afa-4c16-b0a6-a55a190d120b.jpg" title=" 1.jpg" style=" width: 600px height: 678px " width=" 600" vspace=" 0" hspace=" 0" height=" 678" border=" 0" / /p p br/ /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong & nbsp HFsafe CY系列细胞毒素安全柜 /strong /span /p p & nbsp /p p br/ /p p strong 一、工作原理 /strong /p p 　　室内空气做为补偿进气由工作台面前部的栅格进入，经由工作台面下方的底部回风腔,同污染区的污染空气一起，在风机作用下进入前置过滤器过滤后，经过过滤的洁净空气进入背部回风腔。随后约70%的洁净空气经过下降过滤器二次过滤后，形成超洁净的下降气流保护工作台面上的样品。其余约30%的洁净空气，经过排风过滤器二次过滤后排出安全柜。二次过滤设计使外排气流和下降气流的过滤效率、安全性都得到了大幅提高。 br/ /p p br/ /p p strong 二、HealForce细胞毒素安全柜特点 /strong /p p br/ /p p strong 1、全分隔型台面 /strong /p p 　　采用新型分割型台面板设计，单块台面板更小、更轻、更高强度，使拆卸、安装更为轻松。采用了独特的导流槽设计，保证实验中泼洒的液体准确流入底部集液槽，保护前置过滤器不受液体侵袭。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/905bcafc-155e-4a0c-b383-f4c911be16d5.jpg" title=" 2.jpg" / /p p strong 2、前置过滤器 /strong /p p 　　相比普通的生物安全柜，增加了前置过滤器，前置过滤器可对内部风道、负压区和风机加以保护，避免被污染，极大延长排风过滤器及下降气流过滤器的寿命。 /p p 　　前置过滤器采用了模块化的设计，可逐个拆卸安装。 /p p 　　独特的结构设计，使前置过滤器模块可以在安全柜运行的状态下，进行拆卸、回收及替换，使全过程都处于安全柜的保护下，有效地保护操作员及环境安全。防止操作人员对细胞毒素类药物的摄入。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/f7e92fea-e002-4f0a-a54f-f9e807e1524a.jpg" title=" 3.jpg" / /p p strong 3、稳定的气流模式 /strong /p p 　　在工作区和外排出风口配备了专利技术的双探头热膜式微风速传感器，多点测量风速，并带有温度测量功能。保证安全柜的正常运作。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/3ffce0b5-deca-47e7-a6fb-fd1c2961ea78.jpg" title=" 4.jpg" / /p p br/ /p p strong 4、采用进口品牌具有变频技术的高性能静音风机 /strong /p p 　　该风机具有风速稳定性高、噪音低、使用寿命长的特点。可根据风速传感器传递的信号，自主调节功率。保证下降气流和流入气流的稳定。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/be7b204d-5c19-4dcd-9cf4-d623f4ea4245.jpg" title=" 5.jpg" / /p p strong 5、具有紫外灯预约功能 /strong /p p br/ /p p strong 三、适用标准 /strong /p p 　　目前国内尚无细胞毒素安全柜的标准，标准主要有德国的DIN12980标准和澳大利亚AS 2567。从各国的细胞毒素安全柜标准看，都可作为高端生物安全柜使用。 /p p br/ /p p strong 四、严格的出厂检验 /strong /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/d25cd258-374b-4e88-9eab-e509bdd99931.jpg" title=" 6.jpg" / /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201801/insimg/8187858a-1a1b-4f78-a48f-306186b686bb.jpg" title=" 7.jpg" / /p p br/ /p p br/ /p p br/ /p

随着纳米技术的快速发展，越来越多的新型纳米材料不断出现并迅速应用在实际生活中。因此，发展快速、高通量的生物检测手段对纳米毒性的快速安全评估极为重要。流式细胞术是毒理学检测的常用技术，具有高通量、快速、准确的特点。但由于团聚的纳米材料在尺寸上同细菌相近，严重干扰检测结果，使得流式细胞术难以运用于纳米材料对细菌的毒性评估。　　近期，中国科学院合肥物质科学研究院技术生物与农业工程研究所吴李君、陈少鹏课题组建立了基于PI-GFP双荧光标记的纳米材料细菌毒性检测方法：GFP绿色荧光表征细菌的生长，碘化丙啶PI红色荧光标记区分死、活细胞，在流式细胞仪上准确区分细菌与纳米材料，通过绿色荧光和红色荧光细胞的相对比例，反应纳米材料的毒性。对比单荧光标记，双荧光标记可以更准确地检测纳米材料的毒性。运用上述建立的双荧光报告系统，他们研究了水环境中金属离子及表面活性剂对纳米银毒性的影响，揭示了不同环境因子对纳米银细菌毒性的影响和机制。结果表明，双荧光报告检测系统可以较准确地反应纳米材料的毒性，适用于环境纳米材料生物学效应的评估。该研究成果已被国际毒理学期刊Cheomsphere (DOI: 10.1016/j.chemosphere.2016.04.074)接收。　　该研究受到国家重大研究计划、中科院先导专项B、国家自然科学基金以及研究院院长基金资助。　　双荧光报告基因系统检测纳米银生物毒性

直接测定DNA合成是细胞增殖检测的最准确方法之一，是测定物质毒性、评估药物安全评价、细胞健康的基本方法，其中以前常用的方式是利用胸腺嘧啶核苷酸类似物&mdash &mdash BrdU进行检测。因为在细胞周期的S期，和细胞一起孵育的BrdU能掺入DNA分子中，再结合BrdU抗体与渗入DNA的BrdU特异性结合，就能够检测到DNA复制活跃的细胞。 但BrdU有一大缺点，就是需要变性DNA后才能与抗体结合，但这就破坏了DNA双链结构，影响了其他染料的结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问题。哈佛大学医学院细胞生物学家Adrian Salic就认为：&ldquo 为了能够暴露BrdU的抗原表位，必须用高浓度的盐酸，乙酸或酶解，但经历了如此严重的处理后，细胞原本精巧细致的结构在显微镜下就变得惨不忍睹了。&rdquo 事实上，现在有一种新的检测方法能避免这种情况的发生&mdash &mdash EdU检测。EdU （5-乙炔基-2&rsquo 脱氧尿嘧啶核苷）也是一种胸腺嘧啶核苷类似物，但其连有的炔羟基团在天然化合物中很少见，在细胞增殖时能够插入正在复制的DNA分子中，基于EdU与染料的共轭反应可以进行高效快速的细胞增殖检测分析，可以有效地检测处于S期的细胞百分数。与传统的免疫荧光染色（BrdU）检测方法相比，更简单，更快速，更准确。EdU只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内更容易扩散，不需要严格的样品变性（酸解、热解、酶解）处理，有效地避免了样品损伤，有助于在组织、器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况，具有更高的灵敏度和更快的检测速度。Adrian Salic特别强调：&ldquo 与传统的免疫荧光染色不同，EdU反应能在几分钟内完成，且不需要进行严格的样品变性处理，使得组织成像更简单易行。&rdquo 细胞增殖检测方法基于EdU与Apollo？荧光染料的完美结合准确检测新合成的DNA，简单，快速，准确。这种检测方法非常快速，且只需简单的几个步骤，因此也适用于高通量筛选试验，如在药物筛选中检测加药后细胞的活力。 图1 BrdU 与EdU 检测原理示意图 表1 BrdU 与EdU 检测优缺点比较 图2 BrdU 需要DNA 变性后才能与抗体结合，导致BrdU、Hoechst 染色弥散，边缘模糊不清； 而EdU 边缘清晰完整，检测更灵敏、更准确EdU可以检测新合成的DNA，而EU则可以检测新合成的RNA。EU是一种尿嘧啶核苷类似物，能够在RNA转录时期代替尿嘧啶（ U ）渗入正在合成的RNA分子，基于EU与Apollo？荧光染料的特异性反应进行RNA检测。EU能够在体内和体外水平检测时间和空间上RNA合成的变化，能够更方便地研究RNA转录位点，结合相关抗体标记能够检测与RNA有相互作用的蛋白。结合EdU和EU进行检测新合成的DNA和新合成的RNA，可以深入开展细胞增殖、细胞周期、细胞毒性、DNA复制及修复、信号通路等方面的研究。

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Innovations in Pharmaceutical Technology (IPT) 最近对话安捷伦公司的王小波博士，其中谈到了推动流式细胞术发展的需求，以及该技术未来可能的发展方向。 IPT：在过去十年中，流式细胞仪的应用是如何发展的？流式细胞术是一种强大的技术，用于定量检测悬浮液中单个细胞和其他颗粒的物理和化学特征，速度可达每秒数千个细胞。细胞通常被不同靶蛋白的荧光标记抗体标记，从而能够同时对单个细胞的多种胞外或胞内蛋白质进行多重给检测与分析。由于细胞正在被应用于如免疫疗法、细胞和基因疗法等疾病治疗的研究，因此流式细胞术提供的数据就变得越来越重要。当然，它也可用于分子生物学、细菌学、病毒学、癌症研究和传染病的监测。在过去的十年里，使用流式细胞仪的人变得越来越多，而如今，许多生物学实验室都在使用流式细胞仪。重要的是，该技术的革新使其变得更易于使用且更具性价比。因此，流式细胞仪逐渐成为许多公司的最大收入来源。IPT：哪些应用领域目前正处于增长阶段？流式细胞仪传统上应用于免疫学—也即是我们通常所说的对免疫细胞如淋巴细胞的研究。例如，它已被用于免疫表型分析：根据细胞表面的抗原或标记物使用对应抗体来识别细胞的过程，以分类和了解不同类型的免疫细胞。如今，流式细胞仪的应用在涉及药物开发的细胞功能检测中也很常见，如细胞增殖、细胞活化、细胞信号、细胞凋亡和细胞毒性等。例如，流式细胞仪可用于检测共培养实验中免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。目前，流式细胞术在生物研究所涵盖的广泛领域有着丰富的应用。IPT：流式细胞术的使用是否还存在障碍？随着实验室拥有比以往更多的分析仪器，情况正在改善。设计实验、准备样品和运行流式细胞仪检测需要时间，特别是当科学家想要运行不同类型的检测时。此外，实验室想开展多色实验设计也很常见，其中20或30个荧光标记是正常的。因此，需要大量的时间和资源来进行数据分析，以获得实验结果中的生物学见解。好消息是，随着流式细胞仪的自动化程度越来越高，分析能力越来越好，这将帮助时间有限的实验室进一步优化工作流程。IPT：流式细胞仪性能方面有哪些最新的突破？除了使用更多的多色搭配方案，还有正在开发的新试剂，对靶抗原有更高的特异性和亲和力，改善了信噪比，以提高分辨率和更好的进行细胞分群，这使得实验室能够开展更加复杂的实验。我们现在能够在单次流式实验中检测数百万个单个细胞中40、50，甚至100多个分析物--这就是我们所看到大数据和人工智能发挥作用的地方。还有光谱流式细胞仪的面世，它可以检测荧光基团发出的整个光谱。与传统流式细胞仪中对一种荧光基团的单一波长范围检测相比，该技术在灵敏度方面有了进一步提高。IPT：流式细胞仪的未来是什么？流式细胞仪不仅需要继续发展紧跟细胞分析的需求，而且还需要让我们世界上的优秀科学家更容易使用它。在我从事这个行业期间，我看到了这个领域的积极变化；许多实验室现在都拥有流式细胞仪，使生物学家--无论他们是在大学还是在生物制药公司--都能使用这些强大的仪器进行前沿研究。流式细胞仪所涉及的仪器、试剂和软件的开发人员需要共同努力，继续保持这一发展趋势，以便在生命科学研究、疗法开发和临床诊断的背景下，在分析和理解复杂的细胞环境和过程方面实现全球性突破。我们终将见证，流式细胞仪作为世界上所有生物学家都可以使用的工具，将在推动生命科学研究、疗法开发和生产，以及临床诊断和预后方面发挥更重要的作用，最终促进医疗健康的进步。安捷伦流式细胞仪和实时细胞分析PLXA业务部总经理王小波王小波博士是细胞传感器、细胞处理和细胞分析技术相关生命科学工具领域的全球知名的专家和领导者。自2018年通过艾森生物被收购加入安捷伦以来，王博士一直在领导创新实时细胞分析平台和下一代流式细胞仪系统的开发和商业化。通过专注于满足细胞基因治疗和免疫肿瘤市场的客户需求，王博士带领团队实现了技术和解决方案在这些新兴和快速增长的市场中的渗透和应用。在加入安捷伦之前，王博士是艾森生物的联合创始人和首席技术官，他带领艾森团队开发了用于无标记、实时细胞分析的电子传感器平台以及NovoCyte流式细胞仪技术并实现了商业化。在创建艾森之前，王博士曾在AVIVIA生物科学公司担任过三年左右的研发高级总监。在此之前，王博士就职于美国德克萨斯大学MD安德森癌症中心。多年来，王博士发表了60多篇科学论文，在细胞处理、细胞分析和生物传感器技术等各个领域拥有50多项美国专利。

背景介绍 药物性肝损伤（DILI）会影响肝脏代谢和解毒能力，但其根本机制仍有很多未知。为了准确和可再现地预测人的DILI，非常需要体外肝脏模型来替代昂贵和低通量的2D细胞培养系统、动物研究和芯片实验室模型。我们提出了一种新的“droplet in droplet”（DID）生物打印方法，该方法可以产生用于肝毒性研究的生理相关肝脏模型。这些模型，或称微型肝脏，是用BIO X微滴打印包裹在ⅰ型胶原中的肝(HepG2和LX2 肝星状细胞)和非肝(HUVEC 人脐静脉血管内皮细胞)细胞制成的。培养7天后，将微型肝脏暴露于急性和高剂量的对乙酰氨基酚或氟他胺，然后评估细胞活力、白蛋白分泌、丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性和脂质积累的变化。微型肝脏ALT活性增加，白蛋白和脂质生成减少，表面这两种药物均有细胞毒性反应。这项研究的结果进一步验证了3D生物打印是一种可行的、可用于模拟肝组织和筛选特异性药物反应的中到高通量的解决方案。 材料和方法 细胞准备根据建议的方案培养两种肝细胞（HepG2和LX2）和一种非肝细胞（HUVEC）细胞系，并每3-4天传代一次。HepG2在含有谷氨酰胺的MEMα中生长，并补充1%丙酮酸钠(Gibco，Cat#11360070)和1%MEM非必需氨基酸溶液(Gibco，Cat-#11140050)。LX2细胞在IMDM(Gibco，Cat#12440053)中生长，HUVEC在EGM-2生长培养基(Lonza，Cat#CC-3156)中培养，并添加单体补充剂(Lonza，Cat#CC-4176)。所有培养基均添加10%的FBS(Gibco，16000044类)和1%的青霉素链霉素(Gibco，参考文献1509-70-063)。.生物墨水的制备和DID生物打印中和并制备3mg/mL浓度的Coll I bioink(CELLINK，SKU#IK4000002001)用于生物打印。以1:1:2（LX2:HUVEC:HepG2）的比例将5x106个细胞/毫升装入冷冻墨盒。在未经处理的96孔板(Thermo Fisher Scientific)中，使用BIO X(CELLINK，SKU#0000000 2222)上的液滴打印功能对微型肝脏进行生物打印。使用设置为8°C的温控打印头(TCPH，SKU#0000000 20346)将胶原液滴分配到设置为8°C–10°C的冷却打印床上。在第一轮液滴打印后，样品在37°C下培养3分钟，然后返回BIO X，使用相同参数进行第二轮液滴打印。在37°C条件下，将得到的封装液滴热交联20分钟，并为每个孔提供200微升混合培养基（25%IMDM+25%DMEM+50%MEM）。培养液每2-3天更新一次。药物处理和分析培养7天后，用不同浓度的APAP[0.1,0.5,1,5,10,25,50 mM]（Abcam）或FLU[10,25,50,75,100,150,200µM]（Selleckchem）处理微型肝脏72小时。采用比色溴甲酚绿（BCG）测定法（Sigma-Aldrich）、ALT活性测定法（BioVision）和活/死染色试剂盒（Invitrogen）分别检测白蛋白产生、肝损伤和细胞活力。所有分析均按照制造商的说明进行。 结论 胶原I中的细胞生长和球体形成胶原I中的细胞生长和球体形成在这项研究中，我们评估了Coll I bioink中的细胞生长、球体形成和迁移模式。到第2天，HepG2和LX2已紧密组装成小簇，HUVEC已拉长，形成同心网络（图1）。使用胶原蛋白作为支架可以在整个培养过程中进行细胞重组、球体极化和细胞增殖（数据未显示）。此外，根据图1，很明显，细胞在整个培养过程中渗透DILI模型，并可能在内部和外部液滴层之间迁移。生物打印微型肝脏的药物治疗和细胞毒性第10天的毒性评估结果表明，生物打印微型肝脏对APAP（图2A）和FLU（图2B）具有细胞毒性和剂量依赖性反应。这种肝功能下降表现为白蛋白分泌和脂质生成减少，ALT活性上调。同样明显的是，基于ALT活性的增加，两种药物的毒性剂量都会对细胞活力产生破坏性影响。后者在图3中尤为明显，其中活/死图像表明，在较高浓度的APAP或流感病毒下，细胞活力显著降低。药物治疗的动态细胞内反应研究了APAP和FLU如何调节细胞内脂肪含量。肝组织的ORO染色通常用于识别脂肪酸或药物引起的不同阶段纤维化或脂肪变性（Pingitore，2019）。在我们的研究中，经处理的微型肝脏的ORO染色显示，在高剂量药物处理的样本中，脂肪积累最小，而在未经处理或低剂量药物治疗的样本中，脂肪积累显著（图4A）。一种解释是APAP和FLU与脂质过氧化有关，其中毒性药物水平引起的氧化应激可能引发脂质降解和膜损伤（Behrends，2019）。图4B中未处理样品的详细观察提供了液滴模型中液滴的横截面图。这张图片显示了大量细胞向液滴外壳迁移并产生脂肪，可能表明存在营养和氧气梯度，并验证了细胞重组模式和胶原内的球体极化。▶ 作为2D细胞培养系统、动物研究和芯片实验室原型的可靠替代品，BIO X可作为中高通量工具，用于制作功能性3D生物打印肝脏模型，实现药物筛选和分析，并减轻药物消耗的成本。▶ CELLINK Coll I作为DID模型的支架，为模型提供了一个稳定、可调和高度相容的环境，且具有丰富的肝细胞重排和球体形成的结合位点。▶ 基于脂质过氧化、白蛋白分泌减少和ALT活性上调的证据，我们的研究结果表明，DID微型肝脏具有功能性，并且对APAP和FLU具有剂量依赖性和细胞毒性反应。▶ DID模型允许组织层之间的细胞间相互作用，并为研究不同硬度层之间的迁移模式提供了独特的机会。未来的毒性研究可以采用该模型复制纤维化的各个阶段，或研究药物治疗后肝脏组织的再生能力。参考文献：1.Behrends, V., Giskeødegård, G. F., Bravo-Santano, N., Letek, M., & Keun, H. C. Acetaminophen cytotoxicity in HepG2 cells isassociated with a decoupling of glycolysis from the TCA cycle, loss of NADPH production, and suppression of anabolism. Archivesof Toxicology. 2019 93(2): 341–353. DOI: 10.1007/s00204-018-2371-0.2.Chen, M., Suzuki, A., Borlak, J., Andrade, R. J., & Lucena, M. I. Drug-induced liver injury: Interactions between drug properties andhost factors. Journal of Hepatology. 2015 63: 503–514. DOI: 10.1016/j.jhep.2015.04.016.3.Pingitore, P., Sasidharan, K., Ekstrand, M., Prill, S., Lindén, D., & Romeo, S. Human multilineage 3D spheroids as a model of liversteatosis and fibrosis. International Journal of Molecular Sciences. 2019 20(7): 1629.

毒性蛋白质病(Proteinopathy)通常由细胞内或细胞外沉积大量折叠变异的蛋白质(Misfolded protein)所致。在蛋白合成和成熟过程中的任何一个环节出现问题，如蛋白突变、折叠以及翻译后修饰出现异常都有可能会导致蛋白质病的发生。虽然蛋白质病这个术语对很多人来说还比较陌生，但现已证明其和多种严重的神经性疾病，如阿尔兹海默症、帕金森病和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的发生密切相关。靶向蛋白质病的研究也为屡屡受挫的神经退行性疾病治疗提供了新的曙光[1,2]。高内涵整体解决方案的优异体现在七月的Cell主刊中，研究将目光转至由MUC1基因移码突变导致的肾病(MUC1 kidney disease ,MKD)[3]。与神经性退行性疾病类似，MKD目前尚无有效治疗手段。结合细胞系、小鼠模型、病人组织和日益火热的类器官来源样本，研究证实MUC1突变蛋白(MUC1-fs)会大量聚集在细胞内，并最终激活未折叠蛋白应答(Unfolded protein response UPR)，诱发细胞损伤和毒性。因此，MKD也属于蛋白质病的一种。针对该发病机制，研究实施基于高内涵平台的高通量筛选，并成功获得能特异清除突变MUC1蛋白的小分子药物BRD4780。该研究不仅深入我们对蛋白转运异常发生机制的了解，也为多种毒性蛋白质病提供了新的治疗策略和切入点。在七月的研究热点版块中，Nature Review Drug Discovery专门针对发现进行了解析[4]。该研究也体现了珀金埃尔默高内涵整体解决方案的高效应用。成像平台Opera Phenix配合CellCarrier Ultra系列微孔板主导高内涵筛选的同时，并通过水镜优势参与了基于上述四种样本的所有荧光拍摄和动态追踪分析细胞凋亡进程。针对类器官样本的拍摄，PreciScan功能被用于提速拍摄进程和排除不需要的图像采集和分析。所有的荧光分析由Harmony软件完成，尤其是‘spot’分析功能的应用。a疾病解析通过MKD病人和体外模型等样本，研究使用抗体染色方式分析野生型MUC1和对应突变产物的组织和细胞分布。在不同来源的样本中，值得一提的是基于病人诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells , iPS cells)建立的类器官(Organoid)样本。基于干细胞技术的类器官模型建立和分析也是近年来高内涵的优势应用方向之一[5]。与病人的切片结果一致，野生型MUC1主要分布在类器官的顶膜部位，而突变蛋白则分布在细胞内。进一步研究证明聚集在细胞内的突变MUC1会诱发细胞应激，活化ATF6-UPR通路并最终导致细胞损伤，表明MKD是蛋白质病。基于MKD病人的肾类器官模型染色，图片由Opera Phenix拍摄。红色指示野生型MUC1蛋白；绿色指示突变体MUC1蛋白；蓝色为E-cadherin；黄色为Na/K ATPase标记基底外侧膜。b高内涵筛选为了发现能有效清除突变蛋白的药物，研究针对病人样本建立永生化细胞系，并利用Opera Phenix开展大规模、多指标高内涵筛选。在初筛中，研究关注能清除突变蛋白并无显著细胞毒性的药物，并在此基础上细化筛选药物浓度开展二轮筛选。通过两轮筛选后，研究通过特异性、mRNA水平调控和是否能抑制ER应激药物thapsigargin的细胞毒性三个指标来进一步分析候选药物。高内涵筛选流程图最终，从3713种化合物中，研究成功发现BRD4780满足上述的指标，能有效特异清除突变蛋白的同时不影响MUC1转录水平，并能保护病人模型细胞系不受thapsigargin的应激压力。进一步的实验证明BRD4780能工作于类器官模型和小鼠模型，是非常有潜力的MKD治疗药物。左图：基于细胞系的染色结果，黄色指示野生型MUC1蛋白；绿色指示突变体MUC1蛋白；灰色指示细胞核。右图：对应的统计分析和细胞数变化分析。c机制研究为了解析MUC1突变体亚细胞聚集原理和BRD4780工作机制，研究利用成像技术进行大量共定位研究，并发现病人来源细胞系中MUC1突变体滞留在内质网和高尔基体之间的早期分泌通路中，并与运货受体TMED9有显著的共定位趋势，且这个现象能进一步在多种模型和病人组织中重现。通过动态成像追踪，研究证明BRD4780能将滞留的突变蛋白从早期分泌途径中释放出来，并促进其进入溶酶体降解途径。基于细胞系的亚细胞共定位研究，分析基于Harmony软件的‘spot’分析功能。基于细胞系、小鼠模型、病人组织和类器官来源样本的荧光染色分析，红色指示TMED9；绿色指示突变体MUC1蛋白；灰色指示细胞核。* 荧光图片均由Opera phenix 拍摄。非常有意思的是，在病人样本中研究同时也发现TMED9蛋白水平的上升，而BRD4780处理同样能降低TMED9蛋白水平。此外，通过CRISPR技术敲除TMED9能表型模拟BRD4780的处理效果，清除突变蛋白。因此，TMED9参与了MUC1突变体在早期分泌途径的滞留和积累，并可能是BRD4780的直接作用靶点。针对此，研究采取细胞热移位测定法(Cellular thermal shift assay，CETSA)证实细胞内BRD4708和TMED9存在直接相互作用。凭借其能在生理条件下进行细胞水平分析的优势，CETSA成为了内源蛋白-药物相互作用分析技术的生力军，是表性筛选下游药物解析的利器。基于CETSA方法在细胞水平确认BRD4708能直接结合TMED9综合上述的发现，研究向我们阐释了MKD的发病以及BRD4780的作用机制。通过直接结合TMED9，BRD4780将突变的MUC1蛋白从内质网和高尔基体之间的早期分泌通路中释放出来，加速溶酶体对其的清除。令人兴奋的是，在具有很好的药理性质的同时，BRD4780不仅能作用于MKD，还能作用于其他多种膜相关蛋白导致的毒性蛋白质病，如UMOD突变相关的慢性肾病和色素性视网膜炎等，是非常有潜力的候选药物。MKD的发病机制和BRD4780的作用机制图同时，该研究也是高内涵两大应用领域的精华案例。首先是亚细胞水平成像应用，研究中涉及到的大量定位、共定位研究和动态追踪蛋白转运过程都是高内涵的优势应用场景。其次，更为关键的是，该研究也是成像筛选主导的药物发现案例。从疾病模型表型的建立到靶向逆转疾病相关表型的筛选，和最后下游的药物机制研究，都离不开珀金埃尔默高内涵解决方案。高内涵解决方案，伴随着机器学习的逐渐成熟，将成为创新药物研发行业的新鲜血液[6]。参考文献1. Ganguly G, et al.Proteinopathy, oxidative stress and mitochondrial dysfunction: cross talk in Alzheimer' s disease and Parkinson' s disease. Drug Des Devel Ther. 2017 Mar 16 11:797-810.2. Scotter EL, et al.TDP-43 Proteinopathy and ALS: Insights into Disease Mechanisms and Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 2015 Apr 12(2):352-63. doi: 10.1007/s13311-015-0338-x.3. Dvela-Levitt M, et al.Small Molecule Targets TMED9 and Promotes Lysosomal Degradation to Reverse Proteinopathy. Cell. 2019 Jul 25 178(3):521-535.e23.4. A novel approach to reverse proteinopathies https://www.nature.com/articles/d41573-019-00133-55. Czerniecki SM, et al.High-Throughput ScreeningEnhancesKidneyOrganoid Differentiation from HumanPluripotent Stem Cells and Enables Automated Multidimensional Phenotyping. Cell Stem Cell. 2018 Jun 1 22(6):929-940.e4.6. Machine learning brings cell imaging promises into focus https://www.nature.com/articles/d41573-019-00144-2关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn。

仪器信息网讯 今日，瑞明生物官宣新品MoniCyte微型活细胞监测系统发布上线。MoniCyte微型活细胞监测系统可整机放入细胞培养箱中进行定时图像采集，并将细胞图像实时传送到云端，实现实时细胞计数，汇合度分析及划痕实验等功能，并可在异地通过PC、手机、平板即时登录查看，是细胞培养监测的智能管家。产品应用细胞监测：跟踪细胞随时间的增殖，以监测细胞生长和分布情况； 细胞增殖：无标记活细胞成像工具观察细胞随时间的增殖； 细胞毒性：评估药物/化合物/有毒物对细胞活力影响；细胞迁移：使用划痕分析研究细胞迁移的特定治疗效果；集落监测：跟踪细胞集落随时间推移的数量和大小的变化； 3D微组织：用于临床前药物开发和基础研究中的微组织形态学观察。图像采集参数设置人工智能细胞识别细胞生长曲线分析产品优势传统观察细胞的方式需要频繁将细胞从培养箱中取出，之后在普通生物显微镜下进行观察，环境干扰大，费时费力。微型活细胞监测系统采用集成化结构设计，小巧便捷，可放置于细胞培养箱、超净台、实验台等地方实时对细胞进行观察。 微型化：体型小巧，移动方便，多台设备可放置于一个培养箱，提高效率；智能化采用AI技术进行实时计数及汇合度分析； 远程查看：支持远程通过平板、手机、PC等终端随时随地查看细胞数据；无干扰：电动物镜对焦和荧光切换，免除开箱干扰，稳定性好。规格型号型号MC-B100MC-F100明场照明LEDLED荧光通道——双通道荧光：470nm蓝光LED；530nm绿光LED放大倍数10×固定物镜10×固定物镜传感器6MP CMOS5MP CMOS物镜对焦电动电动培养容器培养皿、培养瓶、玻片、多孔板培养皿、培养瓶、玻片、多孔板尺寸150×170×180mm220×200×220mm重量2kg4kg工作环境温度：5℃-40℃；湿度：20%-95%温度：5℃-40℃；湿度：20%-95%

近几十年来，纳米材料或纳米产品在能源、航空航天、农业、工业、生物医药等诸多领域得到了蓬勃发展和广泛应用。然而近些年报道的纳米材料对人类健康和环境安全造成的潜在负面影响引起了各界的担忧，这催生了“纳米毒理学”领域的诞生。该领域主要研究纳米材料或纳米产品在生命周期内对生物的不良健康影响，并进行安全性评估和风险管理，最终实现纳米材料的安全生产、使用和废弃。大量的基础毒理学研究和国际纳米技术标准表明纳米材料的物理化学性质包括化学组分、尺寸、形状、表面化学、结晶度、溶解度、氧化还原电位等会广泛地影响纳米材料与生物体在器官/组织、细胞和分子层次上的相互作用。因此，深入了解纳米材料的理化性质在介导不同水平纳米–生物相互作用中所扮演的角色具有重要意义，这不仅利于实现进行可靠的纳米毒性评估，也有助于设计更加安全的纳米产品。为此，赵宇亮/陈春英/谷战军团队在Particuology上发表综述文章，深入探讨了人造纳米材料的关键物理化学性质对诱发潜在生物毒性的影响。该文章首先概述了纳米材料如何在器官/组织、细胞和分子水平上与生物体发生相互作用，并在此基础上深入讨论了尺寸、形状、化学性质、表面化学，以及上述理化性质所介导的纳米材料的团聚/聚集、生物冠形成和降解等行为对其毒理学特征的影响。另外，该文章还介绍了研究纳米–生物相互作用的主要分析方法、不同地区和/或国家目前对含纳米材料产品的监管和立法框架，提出了纳米毒理学领域面临的挑战和可能的解决方案，以期为纳米材料的安全性评价提供参考。图1. 纳米材料的毒性相关特性及研究纳米–生物相互作用的分析方法器官、细胞、分子层面上的纳米-生物相互作用根据所处的生命周期阶段的不同，人造纳米材料对人类的主要暴露方式包括肺部吸入、口服摄取、皮肤接触和静脉注射等。大多数经肺、胃肠和皮肤暴露的纳米产品会被滞留在暴露器官中并可能在被机体逐渐清除之前诱发毒性；只有少数局部暴露的纳米材料可能被吸收到血液和/或淋巴循环。由于缓慢的剂量率、独特的吸收途径和特殊生物冠的生成/演变，非静脉注射的纳米材料在体内分布更广泛、更均匀。相比之下，静脉注射纳米材料则更快地从血流中清除，并主要聚集在富含单核-吞噬系统(MPS)的器官，如肝脏和脾脏。此外，无论暴露途径如何，进入体循环的纳米材料可能通过血脑屏障、血睾丸屏障和胎盘屏障，并对这些器官造成影响。基于纳米材料的性质，其代谢和排泄方式多种多样，主要发生在肝脏和肾脏。综上，根据纳米材料的毒物动力学过程，可以推断肺、肠、肝、脾和肾是纳米材料的主要毒性靶点。 图2. 器官、细胞和分子水平上的纳米生物相互作用。(a) 毒物动力学(即纳米材料在体内的吸收、分布、代谢和排泄) (b) 纳米材料的潜在毒性机制在细胞、亚细胞和分子水平上，纳米材料可能粘附、切割、嵌入细胞膜而造成膜损伤，或被细胞内化而进入细胞。包括网格蛋白依赖、小窝蛋白依赖、非网格蛋白和非小窝蛋白依赖的内吞、微胞饮和吞噬在内的多种胞吞途径是纳米材料进入细胞的主要方式。不同的内化途径将进一步影响其在细胞内的定位、命运和下游的细胞毒性。纳米材料通过多种毒性机制发挥细胞毒性，本质上可归因于其对细胞组分和结构的氧化损伤和物理损伤。一方面，纳米材料可以通过促进活性氧(ROS)的生成、消耗细胞内抗氧化系统和/或干扰线粒体的功能而引起氧化应激，造成脂质、蛋白质和核酸分子的氧化损伤。另一方面，纳米材料可能会改变生物大分子的构像和功能，通过直接的生物物理相互作用干扰或破坏细胞。二者可能引起的下游事件包括：细胞膜渗漏、线粒体功能障碍、溶酶体膜通透性(LMP)、内质网应激、刺激或阻断涉及细胞增殖和死亡、细胞骨架破坏、基因毒性等信号通路，最终导致炎症反应、细胞周期阻滞和细胞死亡（凋亡、坏死、自噬、铁死亡和焦亡等）。影响纳米材料毒性的关键特性 本节作者重点讨论了经合组织成立人造纳米材料工作组提出的11种典型纳米材料（包括纳米氧化铈、纳米氧化锌、纳米二氧化钛、金纳米材料、银纳米材料、富勒烯、多壁碳纳米管、单壁碳纳米管、纳米粘土、二氧化硅、树状聚合物）的关键理化性质以及其所介导的团聚/聚集、形成生物冠和降解行为对不同水平纳米–生物相互作用的影响。化学组成纳米材料核心的化学本质决定了纳米材料的溶解性、催化活性、氧化还原能力、电离特性、与生物大分子的亲和性，从而决定了纳米材料的毒性及其机理。除了核心纳米材料的化学性质，表面涂层/接枝和元素掺杂等材料设计也会影响纳米材料的毒理学特征。元素掺杂通过改变纳米材料的催化性能和溶解特性而影响其毒性。另外，纳米材料制备过程中的金属和杂质残留、内毒素污染等也是其生物毒性的潜在来源。粒径经肺、胃肠、皮肤暴露的纳米材料，其吸收行为表现出不同的尺寸依赖性。体循环中的纳米材料因其尺寸不同可能发生：快速经肾脏清除、被肝脾吞噬而积聚、经胆汁排泄或实现相对长的血液循环而遍布全身，可见其分布和排泄行为也受尺寸的影响。在细胞水平，尺寸是影响纳米材料内吞途径的重要因素。另外，尺寸直接影响纳米材料造成氧化应激和物理破坏的能力。形状纳米材料可以制成多种形状，如纳米球、纳米管、纳米棒、纳米线、纳米立方体、纳米片等。不同形状的纳米材料可能表现出不同的毒代动力学行为、细胞摄取和毒性效应。这可能与形状影响纳米材料晶面暴露、催化性能、生物冠形成等有关。表面特性由于纳米生物相互作用通常发生在纳米–生物界面上，故而纳米材料的表面性质（特别是表面电荷、表面疏水性和表面原子/基团）对其吸收、分布、排泄、细胞摄取及毒性潜力等至关重要。这些表面特性通过综合影响纳米材料在生物介质中的分散性、所形成的生物冠、与细胞表面配体的亲和力、核心纳米材料的ROS生成能力和有毒离子释放程度等方面而发挥作用。影响纳米材料毒性的生物转化行为纳米材料由于其超高的表面能而极不稳定，倾向于发生系列转变以降低其表面活性。形成团聚体、表面吸附生物分子而形成生物冠、发生降解是其常见的降低表面能的方式。聚集状态本质上，团聚对纳米材料的毒物动力学、细胞摄取和毒性的影响可归因于纳米材料表观尺寸的增强。在人体暴露前形成聚集体可极大地减小经肺、肠、皮肤的吸收而降低系统暴露风险和毒性。然而，纳米材料一旦进入或在机体中形成聚集体，似乎具有很高的毒性潜力。在细胞水平，团聚状态可以改变原始纳米材料的细胞内化途径和摄取程度而产生复杂的影响。总之，团聚状态对最终纳米毒性的影响仍存在争议，需进一步讨论。生物冠的形成及演化生物冠的形成及演化高度依赖于初级纳米材料的理化性质(如尺寸、表面化学、形状等)及其周围生物环境。它会改变原始纳米材料的合成特性并赋予其全新的生物特性。生物冠在介导纳米生物的吸收、血液循环、分布、代谢、细胞摄取和毒性机制等多种相互作用中发挥着主导作用。在大多数情况下，纳米材料表面生物冠的形成可缓解其非特异性的毒害作用，这可能与生物冠抑制细胞摄取、减少ROS生成、降低团聚率、减轻有毒表面活性剂诱导的细胞毒性，减缓纳米材料溶解及释放有毒金属离子等有关；然而生物冠可能具有激活免疫而诱发炎症、改变基因表达、诱发内质网应激、细胞凋亡等负面影响。生物降解纳米材料暴露可能会经历恶劣的胃肠道环境、肝细胞微粒体酶、MPS系统的酸性富含氧化性物质和离子的溶酶体环境，这都将挑战纳米材料的完整性并促进其降解。根据降解程度和速率、完整纳米材料和降解产物的毒性潜力，生物降解对纳米材料的毒理学特征具有深远的影响。例如，银纳米材料降解释放银离子已经被认为是其毒性作用的重要机制之一。而二硫化钼纳米片降解产生的钼酸盐可以参与肝细胞的钼酶合成并提高其活性。吸入不可降解的碳纳米管会长时间聚集在肺部而诱发肉芽肿、肺泡炎和纤维化反应。纳米毒理学研究的分析方法 本小节作者首先从分子层面探讨了用于原位分析蛋白冠结构、组成、形成动力学的先进技术，接着在细胞层面介绍了用于可视化纳米材料摄取、转位、毒性作用的高分辨显微镜成像和质谱成像技术、以及基于流式的单细胞技术和多组学技术；最后，在器官层面概述了纳米材料的体内定量方法和活体成像技术用以研究纳米材料的吸收、分布、代谢、排泄。图3. 针对不同水平纳米-生物相互作用的分析方法纳米产品的监管 现阶段，世界各国对含纳米材料产品的监管由现有的一般和特定行业的监管和立法体系覆盖。例如，不同领域纳米产品在欧盟的流通均须遵守the Registration, Evaluation, Authorization, and Restriction of Chemicals regulations和the Classification, Labelling and Packaging Regulation regulations。此外，欧洲食品安全局、欧洲医药局、健康和消费者保护联合研究中心以及欧洲工作安全与健康机构等细分机构还出台了针对本领域纳米产品的监管办法和指导。另外，各国普遍认为纳米材料的风险评估应在个案基础之上，可能的风险与特定的纳米材料和特定的用途有关。比如，美国的食品药品监督管理局(FDA)以特定纳米产品作为重心，通过上市前审查和/或上市后监管系对其进行监管。FDA针对纳米材料的详细监管参见“FDA’s Approach to Regulation of Nanotechnology Products”。美国的环境保护署还出台了一系列法规包括Toxic Substances Control Act, Federal Insecticide, Fungicide and Rodenticide Act, CleanAir Act, and Clean Water Act等对纳米材料整个生命周期进行监管。虽然目前纳米材料与普通化学品有着相似的监管和立法框架，但几乎所有的监管机构都对纳米材料安全性评价的几乎每个阶段都给予了特别的关注，并推出了指南或标准化。还有一些倡导者呼吁建立专门针对纳米材料的立法和监管框架。相信随着纳米材料风险评估的发展，对纳米材料的监管和立法将进一步完善。总结与展望 尽管纳米毒理学领域取得了巨大的进展，但纳米材料的安全性评价仍面临着严峻的挑战。第一，确定纳米材料毒性与其理化特性之间的因果关系非常困难。为此，通过精细的材料设计和制造提供一个可在单变量水平控制的覆盖广泛毒理学相关性质的纳米材料库尤为紧迫。第二，有相当一部分的毒理学研究忽略了诱导纳米毒性的现实情况。在这方面，有必要避免内毒素污染、未纯化或分离的有毒催化剂/表面活性剂和剂量过大而造成的毒性。第三，针对纳米材料在生物环境中的动态转化，特别是非静脉注射给药的纳米材料所形成的生物冠，对其毒性的影响仍然十分匮乏。第四，基于多组学技术的系统毒理学手段对微小的生物分子改变的解读具有挑战性，很难获得纳米材料毒性机制的整体图像。幸运的是，上述问题已经引起了广泛的关注，并有望通过精细的实验设计、先进的原位分析技术和生物信息学方法的发展来解决。这些努力将在纳米材料理化性质和纳米生物相互作用之间的因果关系方面带来重大突破，从而促进人造纳米材料的风险评估和管理，以及更好地设计生物兼容的新型纳米产品。

水环境中药物与个人护理用品(PPCPs)的残留问题是当前环境领域的研究热点。未被完全吸收、利用的抗生素类药物通过尿液、粪便排泄等途径进入城市污水或医院污水，而污水处理厂现有处理技术不能对其进行有效去除。我国是抗生素生产和使用大国，头孢抗生素的生产和使用量增长势头明显，长期的、大量的、持续性的排放会造成水环境抗生素&ldquo 假性持久性&rdquo 污染，对生态环境以及人类健康造成危害。 　　本研究对头孢类抗生素的水环境检测分析方法进行完善，建立可广泛应用的，同时检测多种头孢类抗生素的固相萃取-高效液相色谱分析方法。通过优化梯度淋洗条件，检测波长和参照波长分别为254 和270 nm， 7 种头孢抗生素在20 min 内完全分离。通过固相萃取条件的选择与优化，水样预处理使用HLB 柱进行SPE，调pH 值至3，NaCl 加入量为6.0 g/L，进行HPLC 测定。7 种头孢抗生素的回归方程决定系数r 均大于0.99，检出限(LOD)在0.05～0.39&mu g/L。该方法超纯水和自来水平均回收率分别为87～105%和68～105%。方法回收率和重复性好，准确性和灵敏度较高，适用于同时测定水中7 种头孢抗生素。 　　利用level III 模型初步预测头孢类抗生素在环境中的分配归趋，为头孢类抗生素在大环境中的生态风险评价提供依据。模型模拟结果和实验结果有可对比性，十种头孢类抗生素主要富集在水和土壤中，这两相中的分配比例总共占到90%以上。 　　本文研究了环境中含量较高的两种头孢类抗生素(头孢氨苄，头孢拉定)和该类抗生素的两种主要降解产物(7-ACA，7-ADCA)对羊角月牙藻和大型溞的生态毒性，并将其与四环素类药物(四环素，金霉素和土霉素)产生的生态毒性进行了比较。研究了不同药物在不同浓度下对羊角月牙藻72h 生长抑制作用以及对单位藻细胞叶绿素含量的影响。实验结果表明头孢抗生素对藻细胞的生长抑制作用比四环素类抗生素要弱，但头孢类抗生素降解产物有时表现出比抗生素原体更强的毒性。 　　联合毒性实验结果显示除四环素和7-ACA 的二元混合物为拮抗作用外，其余二- II -元混合物均为简单相加作用。另外，初步研究了不同药物在不同浓度下对大型溞24h活动性抑制作用。结果提示头孢类抗生素长期大量排放及其降解产物所造成的潜在生态风险不容忽视。本文为头孢类抗生素进一步的环境生态风险评价及治理措施研究提供了重要参考数据。 参考文献：水环境中典型抗生素类药物的检测分析和生态毒性研究.pdf

近年来“问题奶粉”事件频繁爆发，乳制品尤其是婴幼儿配方奶粉的质量安全问题受到全社会的关注。2019年12月1日，被称为史上最严的《中华人民共和国食品安全法实施条例》（以下简称《条例》）修订版正式施行，加强了对婴幼儿食品等特殊食品的监管。目前乳制品的质量安全根据国家食品安全标准主要针对重金属，农兽药残留，真菌毒素，违禁添加物，致病性细菌等指标。珀金埃尔默的高内涵细胞成像技术是从细胞层面对乳制品的安全性风险进行监控。一、乳制品检测安全方案针对重金属检测，珀金埃尔默可以提供从单元素到多元素、元素形态的检测方案。针对化学污染物，农兽药残留真菌毒素，珀金埃尔默提供从提取净化到报告输出全流程的液质联用检测方案。牛奶掺假珀金埃尔默可以提供指纹图谱的技术体系应对牛奶掺假。二、细胞成像目前乳制品包括婴幼儿配方乳粉所检测的物质大部分基于行业经验或重大安全事件发生以后的总结而列入标准，基本都是在原子分子层面，而且检测覆盖的物质具有局限性，许多未知的风险物质无法检测，并不能完全反映乳制品样品真实安全性。珀金埃尔默的高内涵细胞成像分析技术从分子水平、细胞水平、模式生物水平提拱评价标准和解决方案，帮助更好更快的完成产品研发、建立乳制品尤其是婴幼儿配方乳粉的全产业链的安全性风险管控，也帮助为消费者提供更科学更安全的乳品。高内涵细胞成像分析技术是在保持细胞结构和功能完整性的前提下，对细胞和亚细胞、微组织、小型模式生物个体等层次进行多通道、多靶点的荧光成像，对其状态、变化、总体趋势进行分析，得到高内涵、高可靠性的统计结果，能够检测细胞形态、生长、分化、迁移、活性、凋亡、代谢及信号转导等各个环节，在单一实验中获取大量相关信息，在细胞毒性、遗传毒性、个体毒性、表型研究、蛋白相互作用、等许多方面都有很好的应用。这套解决方案将结合传统检测方案，从细胞和生物个体的角度更加真实全面的评估乳制品和婴幼儿配方乳粉的安全性，帮助企业向市场提供更安全、更绿色、更健康的乳制品。更多内容信息，欢迎参与“鲜乳、乳制品及婴幼儿乳粉质量与安全检测”主题网络研讨会。6月3号15:00-15:30高内涵成像与分析系统助力乳制品质量控制与安全监测李想(珀金埃尔默) 了解更多应用资料和产品信息，扫描下方二维码，下载高内涵成像分析系统助力乳制品质控与安全监测相关资料。

前言人类严重急性呼吸窘迫综合征冠状病毒(SARS-CoV-2) 感染会导致多种临床表现，从无症状疾病到急性呼吸窘迫综合征 (ARDS) 和多器官衰竭。除了病毒对呼吸系统和其他器官的直接损伤外，越来越多的证据表明，由 SARS-CoV-2 感染引起的免疫反应有助于冠状病毒病 (COVID-19) 的病理生理学，尤其是在严重的疾病过程中。CD4+ T 辅助细胞和 CD8+细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 都有助于控制呼吸道病毒感染。T 细胞免疫反应与 COVID-19 期间疾病结果之间存在复杂的关系。微环境中存在的其他因素可能会影响 T 细胞反应的质量，从而影响病理学。因此，重要的是确定哪些 T 细胞亚群具有致病作用？2022年02月，德国柏林夏里特医学院研究团队在 Cell期刊（IF：66.850）发表了题为 &ldquo Complement activation induces excessive T cell cytotoxicity in severe COVID-19&rdquo 的研究成果，采用单细胞蛋白质组学(CyTOF)和单细胞转录组学研究方法，评估COVID-19重度过程中致病T细胞的功能和诱导信号，发现了患者体内的补体激活可使其T细胞过度毒性。表明T细胞毒性加剧和补体激活使得COVID-19患者患重度疾病或死亡的风险增大。研究背景本篇作者将单细胞蛋白质组学和转录组学与机制研究相结合，揭示 T 细胞区室的改变及它们的上游信号和功能相关性，解释了在严重 COVID-19 中观察到的重要免疫病理学特征。大规模细胞术（飞行时间细胞术 [CyTOF]）和单细胞 RNA-seq(scRNA-seq) 结合基于 VDJ 测序 (VDJ-seq) 的 T 细胞克隆型鉴定用于确定 COVID-19 和严重程度-T细胞区室的特异性改变。作者描述了 C3a 驱动对COVID-19 重症患者的活化 CD16 表达细胞的诱导。这些 T 细胞表现出增加的免疫复合物介导的、不依赖于 TCR 的细胞毒性，导致肺内皮细胞激活和释放趋化因子。这种机制可能导致 COVID-19 患者出现严重的肺损伤和内皮炎。研究思路研究结果1.严重的 COVID-19 中表达CD4 +、CD8 + TCRab +和 TCRgd + T 细胞作者对急性和恢复期的轻度和重度 COVID-19 患者、患有其他急性呼吸道感染（流感样疾病）的患者以及慢性感染人类免疫缺陷病毒 (HIV) 或乙型肝炎 (HBV) 和对照组（图1A）。为了进一步探究 T 细胞空间，将获得的 T 细胞（CD45 + CD3 +CD19 - CD15 -）预先门控到 CD4+T 辅助细胞（CD3 +，CD8 - TCRgd -），CD8 +CTLs（CD3 +，CD8 + TCRgd - ) 和 TCRgd + (CD3 - , CD8 - TCRgd + ) 细胞使用 29 种表面抗原标记。对来自对照、FLI、HIV、HBV 和急性 COVID-19 的样本进行无监督聚类分析，对预先门控的 T 辅助细胞、CTL 和 TCRgd 进行分区T 细胞分别分为 19、15 和 14 个单独的细胞簇（图 1 B-1D）。来自轻度或重度 COVID-19 患者的大部分细胞在统一流形逼近和降维投影 (UMAP) 空间中与其他患者组或对照组的细胞明显分离（图 1B）。与其他组相比，轻度和重度 COVID-19 患者的簇 25 T 细胞（CD8 + CD38 hi HLA-DR +Ki67 +）的比例增加（图1D 和 1E）。重症 COVID-19 的进一步特征是簇 26 T 细胞（CD8 +，高度活化的 NKT 样细胞）的丰度增加，也表达高水平的 CCR6 和 CD16。图1 | HLA-DR hi CD38 hi高度活化但也表达 CD16 的 CD4 +和 CD8 + T 细胞在重症 COVID-19 中的积累2.单细胞转录组学揭示重症 COVID-19 中 T 细胞向高细胞毒性和脱粒潜力转变为了获得有关 COVID-19 和严重程度特异性 T 细胞簇的功能信息，作者对来自急性感染和恢复期轻度和重度 COVID 的外周血单核细胞 (PBMC) 样本以及纯化的表达 CD38 的 T 细胞进行了单细胞转录组scRNA-seq 分析，并对齐 CyTOF 和 scRNA-seq T 细胞簇，得到了 17 个簇（图 2A和2B)。与 FLI 或 HBV 患者以及对照组相比，COVID-19 患者中属于第 7、8 和 10 组的 T 细胞比例更高（图 2D 和 2E)。作者观察到其他具有FCGR3A表达的 T 细胞簇（簇 9、11、12 和 13）。接下来，作者对集群 7、8、9 和 10 进行了基因本体论 (GO) 富集分析，比较了轻度和重度 COVID-19 T 细胞（图 2F）。作者观察到重症 COVID-19 T 细胞脱粒相关基因的特定富集，接着对选择性富集通过基因集富集分析进行基因验证。最后，对来自队列的样本进行的单细胞转录组学scRNA-seq 分析支持了作者在重症 COVID-19 的主要 T 细胞区室中发现了一部分活化的 CD16+T 细胞，并确定了与细胞毒性相关的转录程序的增加。图2 | 急性轻度和重度 COVID-19 期间 T 细胞的单细胞转录组学来自对照组 (n = 6)、FLI (n = 8)、HBV (n = 4)、轻度 COVID-19 (n = 9) 和重度 COVID-19 (n = 10) 的 T 细胞簇的 UMAP患者。3.CD16 介导的 CD8+T 细胞脱粒导致内皮细胞释放趋化因子CyTOF 和 scRNA-seq 分析确定了两个主要的 T 细胞活化特征：(1) 形成高度活化、增殖的 TFH 样 CD4 +细胞和表达 CXCR3 的 CTL，与疾病严重程度无关；(2) 活化的 CD16 + T 细胞特异性。作者测试了 SARS-CoV-2 特异性抗体反应在这些患者中是否更明显？SARS-CoV-2 特异性 IgA 的血清浓度，结果显示，特定 IgG 水平在重症 COVID-19 中更高（图 3A）。接下来，作者研究了与 CD16+CD4+和 CD8+簇相关的功能特性。如 scRNA-seq 所示，与对照组相比，来自重症 COVID-19 患者的样本含有明显更多的表达粒酶 B 的 CD8+T 细胞（图 3C）。CD16 参与重症 COVID-19 最可能的影响之一是在与内皮细胞相互作用期间 T 细胞脱粒增强。事实上，根据对重症 COVID-19 的尸检结果，已经观察到 T 细胞浸润和内皮细胞损伤，即淋巴细胞性内皮炎。可以想象，免疫复合物介导的 CD16+T 细胞脱粒会导致内皮损伤。为了验证这一假设，作者在抗 CD16 抗体存在的情况下，将原代肺微血管内皮细胞与从轻度/重度 COVID-19 患者/对照中分离的富集的非初始 CD8 + T 细胞共同培养。随后，作者分析了炎症介质的释放（图3G）。抗 CD16 触发的严重 COVID-19 T 细胞通过共培养的内皮细胞引起增强的 CXCL8 (IL-8) 和 CCL2 (MCP-1) 释放。与对照 T 细胞相比，来自 COVID-19 患者的 T 细胞放大了伴刀豆球蛋白 A 诱导的跨内皮电阻损失，表明内皮屏障破坏，但这种效应仅对来自重症 COVID-19 患者的 T 细胞显著（图 3 H ）。为了补充作者在外周血中的发现，作者研究了COVID-19 患者肺部CD16 + T 细胞的组织定位。作者发现与来自不同对照尸检组的肺组织相比，CD3 + CD16 + T 淋巴细胞的数量增加（图 3 I 和 3J）。并在死亡的晚期时间点下降（图 3 J）。这些发现支持作者的假设，即在重症 COVID-19 患者中 CD16 +高细胞毒性 T 细胞的生成和局部积累增强，可诱导肺内皮细胞的活化和损伤。T 细胞诱导的化学引诱剂 CXCL8 和 CCL2 的释放可导致 COVID-19 肺炎中中性粒细胞和单核细胞的浸润增加。图3 | 重症 COVID-19 的 T 细胞的脱粒和细胞毒性潜力增加4. 在急性重症 COVID-19 期间诱导的表达FCGR3A的 T 细胞克隆持续存在并保持其增加的细胞毒性潜力来自重症 COVID-19 患者的 CD16 + T 细胞表现出增强的细胞毒性特性，可能导致器官损伤，作者分析了它们在清除急性感染后的持久性。症状发作后 3-8 个月恢复期（图 4A -4E），作者分析了单个 COVID-19 T 细胞簇的克隆富集是否不同。进一步揭示这些克隆的高细胞毒性潜力。随后探索富含反应性缺氧特征的区域。结果显示，重症 COVID-19 患者的 CD16 + CD8 + T 细胞在恢复期持续存在，采用更分化的 CD62L -表型，但仍保持其高细胞毒性潜力。图4 | 在急性 COVID-19 期间扩增的 T 细胞克隆的时间依赖性进化和表型5. C3a 促进表达 CD16 的高细胞毒性 T 细胞的分化因为 COVID-19 的死亡率和严重发病率会不同程度地影响老年人，作者研究了总 CD16 + T 细胞的形成是否与年龄增加有关。作者利用已发表的流式细胞术数据揭示了来自老年人的样本中检测到显著更高比例的 CD16 +细胞，这支持了作者的年龄依赖性增加的假设（图 5 A）。重症 COVID-19 的一个关键特征是补体生成和激活增加，作者分析了补体成分补体因子 D (CFD) 与年龄的相关性。接下来，作者在重组 IL-2 和来自轻度或重度 COVID-19 患者的血清或对照血清的存在下，用板结合的抗 CD3/CD28 抗体刺激来自健康未暴露对照的富集 CD3 +细胞。最后，作者测试了 C3a 是否是导致重症 COVID-19 患者血清 T 细胞分化潜能改变的原因。总之，在重症 COVID-19 中高水平产生的补体分裂产物（如 C3a）会产生炎症环境，促进 CD16+高细胞毒性 T 细胞的分化。图5 | C3a促进表达CD16的高细胞毒性T细胞分化6.活化的 CD16 + T 细胞在严重 COVID-19 期间的病理作用作者比较了死于 COVID-19 的患者和幸存者中活化 CD16 +T 细胞的比例。与幸存者（幸存者）相比，死亡的重症 COVID-19 患者（非幸存者）样本中所有 CD4 +和 CD8 + T 细胞中活化的 CD16 + TCRab +细胞的百分比显著更高（图 6 A）。接下来，作者在更大的队列中测试了 C3a 生成上游补体蛋白的血浆水平是否与患者的病程和结果相关。与轻度 COVID-19 相比，重症患者血浆样本中经典和替代途径的正调节因子水平较高（图6B ）。作者还分析了与疾病轨迹相关的补体蛋白水平，特别是随后疾病严重程度的恶化。临床恶化的患者样本中 C1R 和 CFD 升高，而随后疾病进展的患者样本中抑制经典和凝集素依赖性补体途径的补体因子 I (CFI) 的丰度较低（图 6C）。最后，C1QA、C1QB、C1QC 和 CFD 的数量不仅在重症 COVID-19 中较高，而且与致命结果相关（图 6 D）。总之，这些数据进一步支持了补体系统和活化的 CD16 + T 细胞在严重 COVID-19 期间的病理作用。图6 | 活化 CD16 + T 细胞的比例和血浆补体蛋白水平与 COVID-19 的结果相关相关讨论过度的 T 细胞活化和改变的表型可能导致感染相关的器官损伤。在重症 COVID-19 患者中，作者检测到活化的 CD16 +T 细胞的分化，这显示出免疫复合物介导的细胞毒性潜力和激活肺微血管内皮细胞的潜力。CD16 中的扩展克隆+ T 细胞区室持续存在并保持其高细胞毒性潜力。作者将 C3a 鉴定为分化改变的活化 T 细胞表型的上游信号。活化 CD16 +T 细胞的比例和血浆补体蛋白丰度水平与重症 COVID-19 患者的不良预后相关。因此，SARS-CoV-2 触发的补体激活创造了一种炎症环境，驱动具有高免疫致病潜力的 T 细胞分化。在这里，作者显示重症 COVID-19 患者中 C3a 生成的增加促进了 CD16 +、高细胞毒性 CD4 +和 CD8 + T 细胞的分化。总结全文，研究发现新冠重症患者体内出现高度活化、高细胞毒性的CD16 +T细胞亚群。新冠重症患者体内免疫复合物介导的CD16 + T细胞可以与内皮细胞相互作用促进微血管内皮细胞的损伤、释放炎性趋化因子以及中性粒细胞和单核细胞浸润肺组织。而CD16 + T细胞克隆在急性疾病后仍能保持其细胞毒性表型。补体成分C3a作为其上游信号可以促进高毒性CD16 +T细胞的分化。活化CD16 +T细胞的比例和血浆补体蛋白水平与新冠患者的死亡风险有关，表明T细胞的高毒性和补体激活使得新冠患者死亡风险增加。总之，特别严重的 COVID-19 导致活化的 CD16 + T 细胞数量增加，这些细胞通过不依赖 TCR 的细胞毒性 T 细胞功能触发补体级联反应与内皮损伤和患者存活相关。这在功能上将先天和适应性免疫系统与内皮损伤联系起来，这可能构成一个重要的分子轴，解释了在 COVID-19 中观察到的广泛的器官损伤。

空气污染特别是PM2.5是当前人类面临的重要的环境问题之一。北京大学课题组研究人员近期在此问题上取得跨学科进展,首次以荧光标记的酵母菌取代现有方法中的半导体传感器,实现了对PM2.5多方面毒性的实时在线监测。　　据了解,目前对于大气颗粒物的毒性研究,大多采用离线的方式,不能及时知晓其毒性 而细胞染毒或动物暴露实验灵敏度偏低,一些健康效应不易检测到。在颗粒物致病机理方面,目前也存在类似“盲人摸象”的现象,不能够全方面地了解PM2.5的毒性机理。　　受酵母菌相关研究的启发,由北大环境科学与工程学院研究员要茂盛、物理学院副教授罗春雄领导的研究团队,集成利用空气采样、微流控、荧光蛋白标记的酵母菌以及单酵母菌蛋白荧光自动检测平台,用活体酵母菌替代传统半导体传感器,创建了大气PM2.5毒性实时在线监测系统。　　要茂盛介绍,课题组先将PM2.5颗粒物采集到液体中,再将样品实时输送至放有酵母菌的芯片里。由于酵母菌会对来自颗粒物的刺激发生反应,通过用不同荧光蛋白标记酵母菌的所有基因,就可实时看到酵母菌的哪些基因对颗粒物的刺激发生了响应,就好像可“实时监测不同地区车辆行驶状况”。　　目前,此项研究成果已申请国家发明专利。课题组正在利用该体系对不同国家、地区颗粒物的毒性进行研究,同时也在筛查更多有响应的酵母菌蛋白,并研究其灵敏度、响应的毒性标定,以进一步揭示PM2.5对人体的具体致病毒性机制。

2020年伊始，由新型冠状病毒（2019-nCoV）所引发的肺炎疫情牵动着每一个人的心。随着各个医疗及隔离场所疫情防治工作的逐步展开，在此过程中产生的各种废水及废弃物对环境生态所产生的影响也逐渐受到关注。为了避免污染物对水源地、地表水、地下水和土壤等产生的污染和破坏，1月31日生态环境部印发了《应对新型冠状病毒感染肺炎疫情应急监测方案》，研究部署应对新型冠状病毒感染肺炎疫情应急监测工作，防止疫情次生灾害对生态环境和人民群众造成不良影响。在该应急监测方案中，明确提出加强饮用水水源地水质预警监测，方案中表明在疫情防控期间，在饮用水水源地常规监测的基础上，增加余氯和生物毒性等疫情防控特征指标的监测，控制风险，切实保障人民群众饮水安全。Modern Water 作为先进水质生物毒性监测设备的所有者，所有用的Microtox® 生物毒性检测技术起源于20世纪60年代，是生物毒性检测行业内的“黄金标准”。这项技术应用生物传感原理（发光细菌法），可对水中广谱污染物质进行快速测定。产品Microtox® 系列检测产品包括：Microtox® LX/Microtox® M500 台式毒性仪，适用于实验室；Microtox® FX/Delatox 便携式毒性仪，适用于应急监测和小型水厂化验室；Microtox® CTM 在线毒性仪，适用于水源地监测，大型水厂进/出水口监测。应用Microtox® 系列生物毒性分析仪自2007年进入中国以来，广泛应用于水源地、净水构筑物出水、出厂水的应急监测，在环境监测、供水、疾控和公共卫生管理等领域中发挥了重要作用。2008年北京奥运会，2010年广州亚运会，2010年上海世博会均采用了Microtox毒性检测仪；2008年汶川地震期间，国家环监总站、震区及国内多家检测机构应急小组均配备了Microtox便携毒性仪对震区进行了全面全程的水质毒性监控；美国911事件以后，美国各水司、水厂将Microtox® 毒性仪大量应用于公共场所、饮用水源、出厂水等的检测。Microtox® 生物毒性检测技术通过了工业界、研究单位和政府的验证，截至05年已有超过500篇的关于Microtox系统应用和评价的论文。

近日，中国检科院张峰首席专家团队在毒性快速评价研究领域取得科研新进展，构建了一种基于脂质组学和离子淌度质谱的真菌毒素侵染细胞评价模型。真菌毒素及其次级代谢产物种类繁多，分布广，毒性强，并可通过食物链累积和传递，严重威胁着人类健康。目前，真菌毒素的毒性评价主要采用体内模型和体外模型开展，体内模型评价准确性高，但存在成本高、周期长、基质效应强等问题，且低剂量的真菌毒素往往无法满足动物实验毒性评价的用量要求。体外模型具有条件可控、周期性短等优点，但是开展基于真菌毒素侵染细胞毒性模型评价也有一定的局限性，在低剂量真菌毒素侵染时细胞状态变化不显著，难以进行毒性评价。研究团队将脂质组学技术引入体外毒性评价领域，融合离子淌度质谱技术，筛选出真菌毒素侵染人源细胞的生物标志物，并研究了真菌毒素侵染导致的人源细胞脂质变化规律。经统计学差异分析发现，受伏马毒素B1侵染的HepG2细胞模型生物标记物为神经鞘脂类和甘油磷脂类，受黄曲霉毒素B1侵染的细胞模型生物标记物为甘油糖脂类，受赭曲霉毒素A侵染的细胞模型生物标记物以甘油磷脂类为代表类。检测标志物的含量可以用于评价新型真菌毒素的毒性大小。该方法相比于细胞模型毒性评价实验，具有两大优点：一是方法灵敏度高；二是可通过标志物的定性定量分析，精准评价复合毒素的毒性。相关研究由在读研究生陈兰在导师张峰研究员的指导下完成，得到了陈凤明博士等老师的指导帮助，研究成果发表在分析化学领域国际顶级期刊《Analytical Chemistry》（影响因子6.986）2022, 94, 18, 6719–6727，该工作得到了国家重点研发计划项目，国家高层次人才项目的支持。图1 不同真菌毒素侵染细胞脂质组学生物标记物筛查表1 不同毒素侵染细胞的代表性生物标志物FormulaDescriptionAFB1C41H76O5DG(18:2(9Z,12Z)/20:0/0:0)C51H98O6TG(14:0/16:0/18:0)C59H110O6TG(18:0/18:1(9Z)/20:1(11Z))C61H112O6TG(18:1(9Z)/20:1(11Z)/20:1(11Z))C63H116O6TG(18:1(9Z)/20:1(11Z)/22:1(13Z))FB1C32H65NO3Cer(d18:0/14:0)C34H69NO3Cer(d18:0/16:0)C45H76NO6PPE dO-40:9C45H91N2O6PSM(d18:1/22:0)C47H93N2O6PSM(d18:1/24:1(15Z))DONC37H72O4DG(O-16:0/18:1(9Z))C36H69O8PPA(13:0/20:1(11Z))C39H78NO8PPC(10:0/21:0)C35H30O17Thonningianin BC46H82NO8PPC(16:0/22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))OTAC37H68O4phenolic phthiocerolC36H69O8PPA(13:0/20:1(11Z))C45H76NO6PPE dO-40:9C45H88NO9PPS(O-20:0/19:1(9Z))

研究背景T-LGLL是一种罕见的慢性淋巴细胞增生性疾病（Chronic Lymphoproliferative Disorder, CLPD），其特征是血液或组织中的成熟细胞毒性T细胞，如大颗粒T淋巴细胞（T- Large Granular Lymphocytes, T-LGL）的克隆性增生。由于缺乏特异性基因标志物，其表现（绝对计数变化、形态、免疫表型特征等）又常常与反应性扩增相似，因此，在T-大颗粒淋巴细胞白血病（T-Large Granular Lymphocytic Leukemia, T-LGLL）的诊断检测中，证明扩增的 T-LGL 的克隆性仍然是一个挑战，特别是在没有淋巴细胞增多（lymphocytosis）的情况下。利用流式细胞术（Flow cytometry, FCM）分析T细胞受体β链恒定区1（Constant region 1 of T-cell receptor β chain, TRBC1）的表达（后续用TRBC1-FCM表示），已被证明是评估Tαβ细胞克隆性的一种有效、简单、快速和特异的方法。然而，由于更为成熟的Tαβ细胞相较于总Tαβ细胞，往往显示出更为宽泛的TRBC1+/TRBC1 -比值，TRBC1-FCM方法对于诊断T-LGLL 克隆性的实用价值，还有待进一步证实。研究目的研究者希望通过直接比较正常 Tαβ-LGL 与T-LGLL中 TRBC1+ 和 TRBC1-Tαβ 细胞的相对分布和绝对计数，验证TRBC1-FCM方法在诊断T-LGLL中特异性T细胞克隆的实用性。研究方法研究纳入了54例样本（EDTA抗凝的全血），样本分别来自17例正常对照（HD），8例反应性 Tαβ 淋巴细胞增多症，5例HDc（有T-LGL克隆的HD），及24例Tαβ-LGLL 患者（18 名 TαβCD8-LGLL、5 名 TαβCD4-LGLL和 1 名 Tαβ 双阴性 LGLL）。利用Cytek® Aurora全光谱流式细胞仪，研究者设计了两组免疫分型方案（Panel I 和Panel II）对样本进行检测分析，整个过程严格遵循EuroFlow SOP进行。Panel I ，主要为TRBC1+细胞成熟标记（如CD27, CD28, CD45RA and CD62L等） Panel II，包括12个骨架抗体（TRBC1、成熟标记、LGL常见异常表型标记），4个主要系别标记（CD3, CD4, CD8 和 TCRγδ），TCRVβ和CD45。两组光谱流式免疫分型方案详细信息如下图1：图1-基于光谱流式的免疫分型方案结论利用Panel I，研究者比较了含有多克隆（n = 25）和单克隆（n = 29） LGL的血液中TRBC1+和TRBC1−的Tαβ-LGL的分布和绝对计数。总体而言，多克隆性TRBC1+或TRBC1− 的Tαβ-LGL细胞数量（百分比）在0.36 ~ 571细胞/μL之间（3.2 ~ 91% TRBC1+细胞），而单克隆性LGL的细胞数量（百分比）在51 ~ 11,678细胞/μL之间（96% TRBC1+细胞）。因此可以认为，通过总Tαβ细胞群体中TRBC1表达谱鉴定的病理性T-LGL的绝对计数不能作为检测Tαβ克隆性的通用（单一）标准，特别是在没有淋巴细胞增多和/或血液中携带相对较少（图2-TRBC1+和TRBC1−细胞的绝对计数和相对分布（多克隆vs.单克隆）接下来，研究者将TRBC1-FCM方案结合TCRVβ库和异常表型检测（Panel II），以进一步验证 TRBC1-FCM 方法在临床环境中对 T-LGLL 中 T 细胞克隆性进行高灵敏度评估的实用性，并提高其检测（小）LGL 克隆的特异性。一共有12个例的样本被纳入此步研究（6 个 HD、2 个 TαβCD8-HDc 和 4 个 TαβCD8-LGLL）。结果发现，T-LGLL 和 HDc 例中克隆性 TRBC1+ 或 TRBC1-的 Tαβ 和 TαβCD8 细胞的绝对计数（32-5,515 个细胞/μL） ，显著高于来自正常/反应性例的多克隆 TRBC1+ 和 TRBC1- 的总 Tαβ（0-25 个细胞/μL）和 TαβCD8（0-21 个细胞/μL）细胞（图 3A&C）。但对TRBC1+ 细胞百分比的分析却并未观察到显著差异。提示，基于表达单个 TCRVβ 家族的细胞中 TRBC1 的表达模式识别 Tαβ-LGL 的克隆性，应该基于（表达单个TCRVβ 家族的克隆性 TRBC1+ 或 TRBC1- Tαβ 和 TαβCD8 细胞）绝对细胞计数和/或异常表型表达的综合评估。关于Cytek

一、生物毒性与环境监测预警体系　　常规的水质监测给出的结果一般是各项检测指标的浓度，比如《生活饮用水检测方法》中列出的109项检测指标及其限值。但是水体中可能存在的有毒物质远不止这109种，尤其是许多有毒有害的微污染物，如有机氯农药(OCPs)、多环芳烃(PAHs)、全氟辛烷磺酸(PFOS)和全氟辛酸铵(PFOA)以及消毒副产物等新型污染物，对人体具有致癌、致畸、致突变等严重危害。常规的理化监测虽然可以对污染物做定性定量的检测，但对水环境质量整体评价和生态影响评估来说，理化监测存在着局限性。此外，当突发性污染事件发生时，在找到污染物前需要快速地评判污染危害性，以尽量减少可能造成的人员危害和经济损失。　　所以，为了快速直观地反映水污染状况、可以直接利用水中的活体生物来判定有毒物质的质量浓度。在污染物指标明确之前，用一种综合的毒性效应指标快速报告毒性的存在及大小，这就是水质生物毒性监测。它也是一种能够及时快速对水体毒性进行预警的方法。　　2020年，新冠疫情突然爆发，生态环境部在1月30日印发《关于做好应对新型冠状病毒感染肺炎疫情生态环境应急监测工作通知》，明确了将饮用水水源地环境质量作为重点进行监控，在原来常规监测指标的基础上，增加余氯和生物毒性等疫情特征指标。　　生物毒性的检测原理为利用有毒物质污染应激下生物体的死亡、行为响应和生理生化改变，通过人工观察存活生物数量，或使用仪器自动测量指示生物的发光强度、呼吸作用、氧含量、酶活性、微生物产电量等指标，来判断水中毒性大小。这种方法使用“毒性”代替“毒物”来反映水质情况，确认对生态和健康的影响，也称为综合毒性。　　总之，采用常规的化学监测，难以对多种化学污染物进行实时监测，预警迟滞，从发生水环境污染事故，到采取有效的处理措施需要耗费大量时间。生物毒性监测和常规化学指标监测相比，优势在于能够对复合污染和未知污染物快速响应，常用于突发性污染事故监测，饮用水安全监测或者在线预警装置中。　二、技术路线及代表仪器　　生物毒性监测使用的指示生物有动物、植物和微生物等。目前我国用于水质毒性监测的指示生物主要有四种：菌类、藻类、蚤类和鱼类。　　路线一：菌指发光菌，是一类在正常生理条件下能发出荧光的微生物。在实际应用中常选用费氏弧菌、鳆发光杆菌和明亮发光杆菌。我国于1995年8月1日实施的《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB/T 15441-1995)中，使用的是明亮发光杆菌T3小种，以氯化汞作为参比毒物，通过生物发光光度计来测量水体的相对发光度，从而表示其急性毒性水平。这种方法简单、快速，可用于多种水环境的监测，是目前生物毒性分析仪中应用最为广泛的方法。但同时，发光细菌法也存在测试稳定性和重复性稍差，进口仪器使用的发光细菌冻干粉价格昂贵等缺点。使用发光细菌法测量生物毒性的监测仪器有聚光科技生产的TOX-2000、美国赛默飞生产的AQ4700水质毒性分析仪、清华大学研制的JQ TOX-online、杭州绿洁生产的GR-8800、英国现代水务生产的Microtox LX、哈希生产的Eclox、山东东润生产的DR-2090 、深圳朗石生产的LumiFOX系列等。　　路线二：藻类是水生生态系统的主要初级生产者，生存状态与水环境的质量密切相关，因此藻类用于水质监测评价也得到广泛的应用。但是藻类作为受试生物存在不少缺陷，例如由于藻类本身有较强的适应性及变异性，对外部环境有较强的忍耐力，因此灵敏性较其他方法偏低。使用藻类作为受试生物测量生物毒性的监测仪器有德国BBE生产的Algae Toximeter 11等。　　路线三：蚤类监测中使用大型蚤(Daphnia magna straus)作为受试生物。大型蚤(也有称 “大型溞”)是一种常见的浮游动物，隶属甲壳纲，枝角亚目。在《水质 物质对蚤类(大型蚤)急性毒性测定方法》(GB/T 13266-1991)中，通过测定物质或废水对蚤的半数抑制浓度或半数致死浓度，来判断物质或废水的毒性程度。以这种原理研发生产的仪器有德国BBE的Daphnia Toximeter 11等。　　路线四：国内用于水质毒性监测的鱼类较多，常见的有鲢鱼、鳙鱼、草鱼、斑马鱼等。我国于1992年8月1日实施的《水质　物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》(GB/T 13267-91)中规定，推荐采用斑马鱼并不排除使用其他鱼种，比如还可以选用青鳉鱼等，但对试验条件需做相应的改变，例如稀释水性质及温度。此标准适用于单一化学物质的毒性测定，或者工业废水的毒性测试。在2019年生态环境部发布的《水质　急性毒性的测定　斑马鱼卵法》(HJ 1069-2019)中，使用斑马鱼卵代替了活鱼，灵敏度更高，可用于地表水、地下水、生活污水和工业废水的急性毒性测定。中国科学院生态环境研究中心以鱼为指示生物研制出BEWs生物毒性监测仪器已在北京密云水库和山东某市水源地安装使用。此外，选用鱼作为受试生物的还有德国BBE生产的Fish Toximeter、新加坡叡克公司研发的鱼类毒性仪等。　　由于各个方法的灵敏度、响应时间、预警范围、适用水体有所差异，因此在实际应用中需根据污染情况来选用合适的单一方法，或者多种方法结合以实现及时、全面、有效的毒性预警监测系统。　三、生物毒性分析仪市场简述　　目前国内市场上的生物毒性监测仪有十几家品牌，同总磷、COD、氨氮检测仪等常规污染物检测仪器相比，生物毒性分析仪属于相对小众的水质监测仪。从市场量占比角度看，其中70%为进口品牌，如赛默飞、BBE、哈希、现代水务等。国产品牌仅占30%，如聚光科技、朗石、绿洁等。　　根据应用场景，水质毒性分析仪可以分为在线式、便携式和实验室型。其中在线式和便携式约各占40%的市场份额，实验室仪器使用的相对较少，约为20%。在污水厂进水监测和饮用水水源地的监测点位多使用在线式水质毒性分析仪，而便携式仪器多用于突发性污染事件时的应急监测，或者定期的水质监测。进口品牌在线式仪器单台价格在50-60万左右，国产价格约为30-50万左右。进口品牌便携式仪器单台价格约30万元，国产约10万元。　　从仪器原理来看，以发光细菌为指示生物研制的生物毒性仪市场占有量最大，约占70%以上。在水库、饮用水水源地等环境水的监测中常选用发光细菌法，而湖泊、河流等水域常使用鱼类作为指示生物。　　由于目前水质毒性数据不属于环境监测考核指标，因此存在认可度不高的问题，这也是该类仪器推广过程中的一大难点。因此，使用该类仪器的单位多用于辅助性、预警性的判断水质质量状况，比如在连云港、重庆、汕头、苏州环境监测中心站等长三角和珠三角地区已投入使用。当涉及环境污染定性定量结论时，仍需出具理化检测结果来判定污染程度和污染类型。　四、未来展望　　突发性环境污染事故不同于一般的环境污染，它具有事发突然、难以预测、危害严重等特点，常规的理化指标监测已经难以满足当前污染物的监控预警要求。应对突发性环境污染事件需要构建好环境安全预警系统，生物毒性预警就是其中关键而有效的一种。　　我国正处于生态环境监测工作转型的阶段，从传统环境监测向现代生态环境监测转变，目标是建成科学、独立、权威、高效的生态环境监测体系。国家近期发布的有关计划中对环境预警系统建设、突发性污染事故防范的重视程度越来越高，生物毒性监测以及环境预警体系建设的重要性已在多个文件中提及。　　比如2020年6月21日生态环境部发布的《生态环境监测规划纲要(2020-2035年)》中指出， 2020-2035年，生态环境监测将在全面深化环境质量和污染源监测的基础上，逐步向生态状况监测和环境风险预警拓展，构建生态环境状况综合评估体系。监测指标也从常规理化指标向有毒有害物质和生物、生态指标拓展，从浓度监测、通量监测向成因机理解析拓展。　　在2020年7月中国仪器仪表行业协会发布的9项团体标准立项中，《水质生物毒性监测仪(电化学分析法)》即为其中之一。生物毒性监测仪的优势在于能够实现已知有毒污染物的低成本快速监测，和在位、在线和实时监测与预警。随着相关政策和标准的推出，可以预见，在接下来的环境监测工作中，生物毒性监测或许会成为重点手段之一。利用生物毒性预警与化学参数监测的优势互补，联合生物-化学监测，可提升扩展在线监测预警功能，形成更为完善的生态环境整体质量监测体系。　　参考文献　　[1]王英才,王树磊,胡文,等.生物综合毒性监测技术与多源生物预警体系[J].人民长江,2017,48(11):21-26.　　[2]生态环境部.生态环境监测规划纲要(2020-2035年)[Z].2020-06-21.　　[3]郑洪领,邹丽.生物监测及其在水环境污染防治中的应用进展研究[J].环境科学与管理,2017,42(4):116-118.　扫二维码加绿仪社为好友 及时了解科学仪器市场深度分析!

日前，水利部科技推广中心为着力推进水利重要领域和关键环节技术水平的提升，组织开展了《2016年水利先进实用技术重点推广指导目录》的评审工作，北京雪迪龙科技股份有限公司的“水质综合毒性在线监测仪”作为唯一一项毒性预警技术位列其中。 MODEL 9880 水质综合毒性在线监测仪是以微生物燃料电池为原理的毒性物质检测装置。当有毒物质流入时，微生物的活性受到抑制，细胞色素产生的电荷减少，传感器电流发生变化，根据电流峰值的降低幅度，确定毒性物质是否流入。 该设备抗干扰能力强，适用于国家水质监测站（水源地、江河湖泊）、自来水厂流入口、工业污水等各类水体水质的监测；响应毒性物质可达5000多种，且灵敏度高；日常管理简单，运行成本极低。 点击查看产品详细信息：MODEL 9880 生物综合毒性监测仪

6月2日，《自然-实验手册》（Nature Protocols）在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心周斌研究组与西湖大学何灵娟研究组合作完成的研究成果（Genetic recording of in vivo cell proliferation by ProTracer）。该研究阐释了细胞增殖示踪技术——ProTracer的构建及应用，并以肝细胞增殖的示踪为例，论述了如何利用ProTracer技术示踪成体哺乳动物在器官稳态与修复再生过程中的细胞增殖。细胞增殖是多种组织器官发育、稳态维持及修复再生过程中细胞来源的基础。体内细胞增殖由于细胞类型以及所处的时期不同存在较大差异。此前，领域内较为常用的检测细胞增殖的方法主要分为细胞增殖标志物染色、核苷酸类似物掺入及同位素掺入。上述方法对于检测体内细胞增殖均有一定的局限性：细胞增殖标志物染色方法只能检测某个瞬间的细胞增殖状态，核苷酸类似物可以进行长时程的掺入却有一定的细胞毒性，同位素掺入的检测方法比较复杂且不便捷。此外，上述检测方法均无法做到细胞类型特异性的细胞增殖检测。当目的细胞的增殖速率较为缓慢时，利用上述检测方法易出现目的细胞的增殖信号被其他增殖速率较快的细胞增殖信号干扰或淹没的问题。为了解决上述问题，周斌研究组最近建立了能够示踪体内细胞增殖的遗传示踪技术——Proliferation Tracer（ProTracer）。该技术实现了在体内长时间不间断地示踪细胞增殖、细胞类型特异性的细胞增殖检测以及活体检测细胞增殖等多方面的突破。该工作剖析了使用ProTracer技术进行细胞增殖示踪的技术细节，包括小鼠品系的构建、鉴定、交配策略以及细胞增殖示踪的最终检测方法。为了实现体内无缝隙捕捉细胞增殖，研究构建了一个可被诱导变成Cre的CreER小鼠品系——Ki67-Cre-rox-ER-rox（Ki67-CrexER），其中rox是Dre同源重组酶的识别位点。当将Ki67-CrexER小鼠与特定的DreER小鼠结合后，DreER能够在Tamoxifen诱导后入核并识别Ki67-CrexER中的rox位点，同时发生Dre-rox同源重组反应将位于两个rox位点之间的ER序列切割掉，从而在DreER表达的细胞中将诱导性表达的Ki67-CrexER转变为持续性表达的Ki67-Cre，实现时空可控以及细胞特异性的细胞增殖的不间断捕捉。此外，结合荧光素酶报告基因，ProTracer技术也可以实现终身无创检测活体动物内特定细胞类型的增殖，无需处死动物。该工作以成体小鼠肝脏作为示例，探究了对成年小鼠组织中细胞增殖的示踪，包括小鼠交配策略、tamoxifen诱导策略、小鼠损伤模型与组织样本分析等。科研人员利用ProTracer技术探讨了肝脏在成体组织稳态及损伤再生中的肝细胞增殖，并量化了肝脏稳态以及损伤状态下的新生肝细胞数量，发现了肝细胞增殖的区域性富集现象，揭示了成体肝脏中新生肝细胞的主要来源。该工作的发表为领域内使用ProTracer技术研究特定细胞类型的体内增殖示踪提供了便利。研究工作得到中国科学院、国家自然科学基金、科学技术部、上海市科学技术委员会，以及分子细胞卓越中心动物平台和细胞平台等的支持。红色：GS+肝细胞；紫色：E-Cad+肝细胞；绿色：GFP+肝细胞

型号推荐：水质综合毒性测定仪-一款便携式发光菌毒性检测仪器2024实时更新，水质综合毒性测定仪，作为现代水质监测技术的重要组成部分，以其独特的检测方式和广泛的应用领域，为水质分析提供了强有力的支持。本文将从四个方面阐述其对水质分析的帮助。 一、快速准确检测多种污染物 水质综合毒性测定仪能够快速、准确地检测水样中的多种污染物，包括重金属、有机污染物等。通过发光细菌法的应用，该仪器能够实时反映水样中的毒性水平，为水质分析提供及时、可靠的数据支持。 二、评估水质对水生生物的影响 除了检测污染物外，水质综合毒性测定仪还能评估水质对水生生物的影响。通过模拟水生生物在自然环境中的反应，该仪器能够预测水质变化对水生生物种群结构和生态平衡的影响，为水质管理和生态保护提供科学依据。 三、辅助决策与预警 水质综合毒性测定仪的检测结果能够为管理部门提供决策支持。当水质出现异常时，该仪器能够迅速发出预警信号，提醒相关部门及时采取措施，防止水质进一步恶化。同时，通过长期监测和数据分析，该仪器还能为水质改善方案的制定提供重要参考。 四、促进水资源可持续利用 水质综合毒性测定仪的应用有助于实现水资源的可持续利用。通过科学评估水质状况，该仪器能够指导水资源的合理开发和利用，减少污染排放，保护水资源生态环境。同时，它还能为公众提供水质信息，提高公众对水资源保护的意识。 五、仪器特点 1、符合国家标准（GB/T154411995）及国际标准（ISO11348-3）； 2、对超过近3000种以上毒性化合物敏感的生物早期预警系统； 3、样品制备后15分钟内得到结果，快速、可靠、可再现； 4、检测结果和其他传统毒性分析方法高度相关，可应用于应急水体污染检测，帮助用户实时监控排水是否符合当地法规和排放标准； 5、Android智能操作系统，更智能，更具人性化； 6、具有自主研发的生物毒性暗室自动升降检测装置，解决行业内开盖测试受强光影响的难题；同样的菌量，用我们仪器可以节省5倍的耗材成本； 7、便携性PVC工程箱设计，可外出携带现场检测； 8、7英寸超大显示触控屏幕，省去按键繁琐操作，更方便； 9、使用硅光电倍增管，大幅提升检测灵敏度； 10、具有RJ45、WIFI、4G和蓝牙连接传输功能，可实现无线传输至相关监控、监管平台，实现数据的实时性，更符合监管部门的场景需求； 11、仪器内置6000mAH锂电池组，在外部断电或无供电情况下，可支撑连续工作8个小时以上； 12、一条曲线可做20个曲线浓度点，可随意选择曲线点是否参与整条曲线计算，无需手动记录，保证曲线值更精准；（曲线浓度点可定制增加） 综上所述，水质综合毒性测定仪在水质分析中发挥着重要作用。它不仅能够快速准确检测多种污染物，评估水质对水生生物的影响，还能为管理部门提供决策支持和预警服务，促进水资源的可持续利用。随着技术的不断进步和应用领域的不断拓展，相信水质综合毒性测定仪将在未来发挥更加重要的作用。

仪器信息网讯 近日宣布其xCELLigence RTCA HT（实时细胞分析高通量）平台现已与 BioTek BioSpa 8 全自动培养箱集成。为了响应市场需求，安捷伦将二者组合，实现了更高水平的自动化工作流程，为免疫肿瘤学领域的无标记高通量效价分析和疫苗市场的高通量病毒介导的细胞病变效应 (CPE) 检测提供了全新功能。制药研究人员要完成免疫肿瘤治疗的使命，面临着激烈的竞争，因此正在不断开发使临床研究加速成功的方法。同样，由于存在不断变化的公共卫生威胁，疫苗开发人员也面临着前所未有的压力。自动化工作流程可以提升候选药物筛选能力，是一种更快、更有效将研究转化为发现的手段。然而，许多现有的自动化工作流程解决方案仍然依赖大量的手动干预步骤，从而阻碍了通量并限制了方案开发的范围。xCELLigence RTCA HT - BioSpa 8 的集成可为细胞增殖和细胞毒性提供无标记的非侵入性动力学结果，使研究人员能够分析多达八个 384 孔 板，从而提高通量并减少样品量。BioSpa 8 培养箱提供实时温度和 CO2/O2 控制，以及湿度监测功能。xCELLigence RTCA HT（实时细胞分析高通量）平台xCELLigence仪器配备加热支架，因此可以保护细胞在从培养箱自动转移期间，免受不必要的扰动和培养条件的波动。用户友好的软件便于进行自动化检测和数据分析，使其成为真正无人值守的系统，此系统可用于鉴别对抗疾病的治疗方法，并为这一技术组合提供一定的自动化支持。安捷伦副总裁兼细胞分析事业部总经理 Todd Christian 说道：“这是免疫肿瘤治疗和疫苗开发的创新解决方案，表明安捷伦一直致力于抗击癌症和传染病。将我们的非侵入式实时细胞分析检测功能与生理条件的孵育培养结合，可提供简单的自动化工作流程，以提高生理条件下的通量和筛选灵活性。”范德堡大学医学中心范德堡疫苗中心副主任 Robert Carnahan 博士谈道：“xCELLigence RTCA HT 技术一直是促进高通量、快速和定量细胞病变效应 (CPE) 监测的关键，它是一种评估中和活性和效价的工具。我们能够绕过空斑或病灶形成实验中所需的众多动手、多步骤过程来测量病毒活性。”安捷伦提供包括用于实时细胞和代谢分析的工具，以及流式细胞仪、孔板和成像/显微镜平台，这些产品和服务有助于利用广泛的学科和方法进行药物发现。此次推出的这一全新集成解决方案展现安捷伦应对解决现实挑战的能力，兑现作为药物开发领域合作伙伴的承诺。关于安捷伦安捷伦科技有限公司（纽约证交所：A）是生命科学、诊断和应用化学市场领域的全球领导者，致力于为提升人类生活品质提供敏锐洞察和创新经验。安捷伦的仪器、软件、服务、解决方案和专家能够为客户最具挑战性的难题提供更可靠的答案。2022 财年，安捷伦营业收入为 68.5 亿美元，全球员工数约为 18,000 人。

2023年3月2日，北京——安捷伦科技公司(纽约证交所:A)近日宣布其 xCELLigence RTCA HT（实时细胞分析高通量）平台现已与 BioTek BioSpa 8全自动培养箱集成。为了响应市场需求，安捷伦将二者组合，实现了更高水平的自动化工作流程，为免疫肿瘤学领域的无标记高通量效价分析和疫苗市场的高通量病毒介导的细胞病变效应 (CPE) 检测提供了全新功能。制药研究人员要完成免疫肿瘤治疗的使命，面临着激烈的竞争，因此正在不断开发使临床研究加速成功的方法。同样，由于存在不断变化的公共卫生威胁，疫苗开发人员也面临着前所未有的压力。自动化工作流程可以提升候选药物筛选能力，是一种更快、更有效将研究转化为发现的手段。然而，许多现有的自动化工作流程解决方案仍然依赖大量的手动干预步骤，从而阻碍了通量并限制了方案开发的范围。配备 BioTek BioSpa 8 全自动培养箱的 xCELLigence 实时细胞分析高通量 (RTCA HT) 平台xCELLigence RTCA HT - BioSpa 8 的集成可为细胞增殖和细胞毒性提供无标记的非侵入性动力学结果，使研究人员能够分析多达八个 384 孔 板，从而提高通量并减少样品量。BioSpa 8 培养箱提供实时温度和 CO2/O2 控制，以及湿度监测功能。xCELLigence 仪器配备加热支架，因此可以保护细胞在从培养箱自动转移期间，免受不必要的扰动和培养条件的波动。用户友好的软件便于进行自动化检测和数据分析，使其成为真正无人值守的系统，此系统可用于鉴别对抗疾病的治疗方法，并为这一技术组合提供一定的自动化支持。安捷伦副总裁兼细胞分析事业部总经理 Todd Christian 说道：“这是免疫肿瘤治疗和疫苗开发的创新解决方案，表明安捷伦一直致力于抗击癌症和传染病。将我们的非侵入式实时细胞分析检测功能与生理条件的孵育培养结合，可提供简单的自动化工作流程，以提高生理条件下的通量和筛选灵活性。”范德堡大学医学中心范德堡疫苗中心副主任 Robert Carnahan 博士谈道：“xCELLigence RTCA HT 技术一直是促进高通量、快速和定量细胞病变效应 (CPE) 监测的关键，它是一种评估中和活性和效价的工具。我们能够绕过空斑或病灶形成实验中所需的众多动手、多步骤过程来测量病毒活性。”安捷伦提供包括用于实时细胞和代谢分析的工具，以及流式细胞仪、孔板和成像/显微镜平台，这些产品和服务有助于利用广泛的学科和方法进行药物发现。此次推出的这一全新集成解决方案展现安捷伦应对解决现实挑战的能力，兑现作为药物开发领域合作伙伴的承诺。关于安捷伦科技安捷伦科技有限公司（纽约证交所:A）是生命科学、诊断和应用化学市场领域的全球领导者，致力于为提高生活质量提供敏锐洞察和创新经验。安捷伦的仪器、软件、服务、解决方案和专家能够为客户最具挑战性的难题提供更可靠的答案。2022财年，安捷伦的营业收入为68.5亿美元，全球员工数为18,000人。如需了解安捷伦公司的详细信息，请访问 www.agilent.com。

DispenCell专为快速、简单、温和地分离单细胞而开发，可应用于细胞株开发、CRISPR编辑的细胞筛选、稀有细胞分离、单克隆抗体筛选和单细胞基因组学等多种单细胞分离场景。基于阻抗技术的分离方式可以更加温和的处理细胞样品，小于0.1psi的分离压力让自动分离也能拥有高细胞活率。DispenSoft软件可提供即时可追溯的克隆性证明图谱，搭配CloneSelect Imager FL高通量单克隆验证系统，在第0天即可准确检测到单细胞并验证单克隆性。DispenCell主机紧凑小巧，可放置在生物安全柜等无菌环境中，软件操作界面简单直观，易于学习和使用。1. 温和高效DispenCell可实现对细胞样品更加轻柔的处理，小于0.1psi的分离压力与手动移液相当，但效率更高(~5min/96孔板)。分离过程无激光照射，保证细胞的完整性，因此，细胞活性和生长得以保持。2. 克隆性证明DispenSoft单细胞分析软件可提供即时和可追溯的克隆性证明图谱，允许用户在细胞分配后立即检查克隆性。3. 基于阻抗的分离吸头DispenCell 配有一个检测细胞通过的感应吸头，随着每个细胞的通过将触发一个独特的信号并被软件记录。无菌一次性分离吸头可确保清洁的单细胞分离，且无交叉污染，经认证不含动物源产品和细胞毒性材料。4. 小巧、简单、易用DispenCell体积小巧，可放置在生物安全柜等无菌环境中工作。仪器和软件操作简单，易于设置，无需清洁和校准，样品制备简单，易于学习和快速上手使用。简化工作流程的组合解决方案单细胞分离和单克隆验证在很多应用中都至关重要！例如细胞株开发过程，不仅需要分离和处理大量的单细胞，还需要验证单克隆性并形成证据来用于最终申报。CloneSelect Imager FL 和 DispenCell 的组合，能够提供高效的过程以及可信的证据，在第 0 天即可自信地验证单克隆性。CloneSelect Imager FL 单克隆验证系统全新的 CloneSelect Imager FL，在标准白光成像基础上，增加了高对比度多通道荧光技术，可在第 0 天准确的检测到单细胞并验证单克隆性。通过比较汇合度分析来识别和验证基因编辑。• 数字化记录单细胞证据，以便提交给监管机构• 在多个时间点对细胞进行非侵入式成像，以监测克隆形成• 使用高分辨率白光成像进行筛选• 通过动态分析提供实时结果• 可进行自动化整合

在细胞治疗过程中，评价免疫细胞的增殖能力，以其对靶细胞的杀伤能力是细胞治疗过程中非常关键的环节。其中DELFIA® EuTDA细胞毒法和DELFIA® BrdU细胞增殖方法，凭借其高灵敏度、易操作性性等诸多优势，已逐渐成为主流的检测技术。在此，通过以下一系列的应用案例，我们将向大家展示DELFIA® EuTDA、DELFIA® BrdU、活体影像及放射性检测等方法如何助力免疫细胞杀伤研究。 一，CAR-T细胞杀伤毫无疑问，CAR-T疗法已成为当下最火的肿瘤细胞疗法之一。同样作为CAR-T大国，中国多数CAR-T疗法已进入临床研究，并且产业化发展迅速，而美国则还集中在临床前研发[1]。安全性是CAR-T疗法的一大挑战。除了细胞因子风暴外，CAR-T疗法还会诱发移植物抗宿主反应 （graft versus host disease GVHD）等安全隐患。鉴于选择性去除CD45RA阳性细胞能有效抑制GVHD发生[2]，研究利用CD45RA阴性T细胞群体开展靶向CD19的 CAR-T疗法，来提高治疗安全性。结合DELFIA的细胞杀伤检测法和基于Calcein-AM标记的流式法，研究证明CD45RA阴性 CAR-T细胞能有效杀伤CD19阳性肿瘤细胞系，并能作用于原代NK细胞杀伤耐受的MLL重排白血病原始细胞SJ4-11（K562为敏感细胞对照，RS4 11为耐受细胞对照）[3]。由于CD45RA-细胞主要为CD3+CD45O+记忆T细胞，因此针对常见的病原体和疫苗应有更好的回忆应答（Recall response）。通过使用DELFIA Cell Proliferation Assay 检测掺入的BrdU，研究确认CD45RA- T细胞对人CMV、Epstein–Barr 病毒、 herpes simplex 病毒和tetanustoxoid有更为显著的免疫反应（下图a，增殖指标）。基于同样的增殖检测平台，研究利用PBMC开展Mixed lymphocyte reaction (MLR)，对比不同细胞亚群的同种异体反应。相较于CDRA-效应细胞群体，CD45RA+细胞在MLR实验中具有更高的增殖能力（下图b）和IFN-γ分泌能力（下图c）[3]。 进一步的体内实验研究继续利用了PerkinElmer IVIS活体成像平台，在白血病小鼠模型的基础上，研究证明CD45RA-的 CAR-T疗法在不诱导GVHD的同时，发挥强效的抗癌效果[3]。借助活体成像的优势，研究追踪CD19+ SEM细胞在小鼠体内的扩增情况，确认在接种18天后肿瘤的信号强度足以模拟顽固性白血病小鼠模型。在此模型的基础上CD45RA-的 CAR-T疗法同样能迅速发挥作用，两周内强力抑制生物发光信号至检测限以下。最后，基于同样的检测平台结合重复接种肿瘤细胞，研究证明CD45RA-的 CAR-T疗法还能作用于复发白血病小鼠模型。 二，CAR-NK细胞杀伤CAR-T细胞疗法的成功和兴起也推动了其他类型的CAR研究，其中就包括针对实体瘤的CAR-NK疗法。相较于T细胞，NK细胞可以在没有抗体和MHC的帮助下靶向疾病细胞，因此能发动更为快速的免疫反应并能有效针对无MHC I表达的肿瘤细胞。同时, NK细胞更为安全，支持“Off-the-Shelf”的大规模生产和直接异体治疗。目前在国内已有多家医疗企业推动CAR-NK治疗，如博生吉的CD7 CAR-NK。在6月份的Molecular Therapy期刊上，广州医科大学附属第三医院的研究向我们展示了最新的CAR-NK临床应用。为了特异靶向肿瘤细胞表面抗原NKG2DLs，研究在NKG2D受体的胞外结构域基础上融合参与NK细胞活化的核心分子DAP12，并进一步通过RNA转染途径提升CAR-NK安全性。基于DELFIA的细胞杀伤检测法，研究证明NKG2D-DAP12 (NKG2Dp)能有效的裂解多种肿瘤细胞系，优于对照NK和NKG2D-CD3z(NKG2Dz)[4]。借助Perkinelmer提供的HCT116-luc报告细胞系，研究通过活体成像方法，在体内水平证明CAR-NK能有效控制肿瘤发展。进一步的临床研究证明CAR-NK的引入能迅速引起肿瘤退缩和肿瘤细胞减少，强调NKG2D CAR是一种很有前景的细胞治疗方案[4]。 三，T细胞杀伤T细胞不仅是免疫系统的核心成员，也是适应性免疫反应的基石。因此，T细胞功能的全面评价在肿瘤免疫疗法的开发过程中至关重要，其中就包括肿瘤疫苗的研发。早期基于经典肿瘤相关抗原gp100的研究证明细胞因子RANTES的引入能显著提升小鼠脾脏细胞的杀伤能力。同时，RANTES表达的时间点非常关键。疫苗引入前12和24小时表达RANTES能有效提升T细胞的杀伤能力，而48小时则没有这个现象。基于动物实验，研究推测多种细胞参与杀伤，包括CD8+，NK细胞和CD4+细胞群体。进一步基于DELFIA细胞毒法研究证明TRAIL和FasL参与了杀伤过程[5]。 除了传统T细胞杀伤外，DELFIA细胞毒法还可以被用于检测靶向T细胞的新型免疫治疗分子，如双特异抗体(BiTE)等的细胞杀伤功能[6]。 四，NK细胞杀伤鉴于NK细胞在天然免疫系统的重要性，其活力检测也是免疫检查点抑制剂研发过程中的核心项目。此外，NK细胞活力检测还可以用于衡量用于免疫疗法开发的新型小鼠模型。在2016年发表的一份研究中，基于DELFIA的细胞杀伤检测法证明PD-1抗体可以显著提升NOG-MHC Double Knockout小鼠脾中NK细胞靶向K562的杀伤活力。靶向免疫治疗的新小鼠模型不仅能加速新型免疫检查点药物（组合）研发，同时可以协助发现新的标志物预测疗效[7]。 除了直接杀伤靶细胞外，抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）也是评价NK细胞功能的一个关键指标。在今年的一份研究中，DELFIA细胞毒法被用于衡量静脉注射免疫球蛋白( intravenous immunoglobulin, IVIG)对NK细胞功能的影响。从结果可以看出，除了阻断NK细胞的直接杀伤能力外，IVIG几乎完全抑制ADCC活力（下图上）[8]。在该研究中，除了ADCC检测外，Perkinelmer的放射检测解决方案（3 [H]-Thymidine和MicroBeta 2）也被用于衡量IVIG和免疫抑制药物对NK细胞增殖的影响。H3-掺入法证明相较于IVIG，免疫抑制药物能有效抑制NK细胞增殖（下图下），而IVIG则特异作用于T细胞活力。鉴于ADCC是单抗药物发挥临床效果的核心机制之一，其活力检测也成为大分子药物研发的必须环节[9]。 欢迎扫码登录珀金埃尔默生命科学试剂耗材平台，点击进入car-t细胞治疗应用专题关注二维码：进入试剂耗材平台：参考资料：[1] Jia Xin Yu, et al. The global pipeline of cell therapies for cancer. https://www.nature.com/articles/d41573-019-00090-z[2] Triplett BM, et al. Rapid Memory T-cell Reconstitution Recapitulating CD45RA-depleted Haploidentical Transplant Graft Content in Patients with Hematologic Malignancies. Bone Marrow Transplant. 2015 Jul 50(7): 968–977.[3] Chan WK, et al. Chimeric antigen receptor-redirected CD45RA-negative T cells have potent antileukemia and pathogen memory responsewithout graft-versus-host activity. Leukemia. 2015 Feb 29(2):387-95.[4] Xiao L, et al. Adoptive Transfer of NKG2D CAR mRNA-Engineered Natural Killer Cells in Colorectal Cancer Patients. Mol Ther. 2019 Jun 5 27(6):1114-1125.[5] Aravindaram K, et al. Transgenic expression of human gp100 and RANTES at specific time points for suppression of melanoma. Gene Ther. 2009 Nov 16(11):1329-39.[6] Lewis SM, et al. Generation of bispecific igG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat Biotechnol. 2014 Feb 32(2):191-8.[7] Ashizawa T, et al. Antitumor Effect of Programmed Death-1 (PD-1) Blockade in Humanized the NOG-MHC Double Knockout Mouse. Clin Cancer Res. 2017 Jan 1 23(1):149-158.[8] Pradier A, et al. Small-Molecule Immunosuppressive Drugs and Therapeutic Immunoglobulins Differentially Inhibit NK Cell Effector Functions in vitro. Front Immunol. 2019 Mar 27 10:556. [9] DELFIA经典技术应用于单抗研发及细胞治疗——AD0116细胞杀伤专题之ADCC https://mp.weixin.qq.com/s/0lkBdDHL5MFIyoeoFV4wWQ关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn

基因毒性杂质检测ICH M7笔者查询ICH官网，发现从2023年4月3日起ICH M7(R2)指导原则进入了“Step 5”，即实施阶段（Implementation）。基因毒性杂质，简称基毒杂质，即遗传毒性杂质。自从ARB类降压药缬沙坦中发现基毒杂质NDMA以来，N亚硝胺杂质引发了各国药品监管机构、制药企业、药物研发机构、CXO等的重点关注。NDMA结构ICH M7全称“Assessment and control of DNA reactive(mutagenic) impurities in pharmaceuticals to limit potential carcinogenic risk”，其关注的对象：在较低水平时也有可能直接引起DNA 损伤，导致DNA 突变，可能引发癌症的DNA 反应性物质，即致突变杂质。M7指导原则为基毒杂质的鉴别（Identification）、分类（Categorization）、界定（Qualification）和控制（Control）提供了实用框架。这次是M7指导原则的第二次修订，即M7（R2），整体框架和主要内容没有变化，仅在以下方面有所调整：&bull 本次修订将M7分为两个相关联的文件，第一份文件是指导原则主体，第二份文件是关联的附件。&bull 在指导原则附录3，新增了7个化合物的可接受摄入量（AI）或每日允许暴露量（PDE），并在附件（Addendum）中增加了这7个化合物的各论。&bull 调整了致突变杂质的危害性评估和控制策略的部分要求和问题回答。比如：“潜在致突变性”等同“潜在遗传毒性”么？答：不等同，潜在遗传毒性是指潜在的致突变性、潜在的致染色体断裂性或潜在的致多倍体性。明确M7指导原则关注致突变性。更多问答，请见M7(R2) Q&As文件。&bull 由于临床治疗技术的进步，M7（R2）中将HIV患者的生存期从1-10年修改为＞10年。&bull 其他，如语法编辑和格式化等。药品中常见的基毒杂质有：N亚硝胺类、磺酸酯类、叠氮类等。不同于普通杂质检测，基毒杂质的检测面临更多的挑战：1、基毒杂质杂质种类，差异大，需要多种分析手段和方法；2、基毒杂质含量低，需要高灵敏度仪器（包括预处理方法）；3、对仪器的定性定量准确性和重现性要求高；4、要求仪器维护方便和交叉污染低。药品中基毒杂质，可能来源于原料药本身（如雷尼替丁等），辅料（如二甲双胍缓释制剂），原料药和制剂生产过程使用的溶剂（如缬沙坦等），以及包材（如橡胶材料可能引入亚硝胺杂质）、生产工艺、存储过程等。基于以上的认识，岛津参考权威机构要求，如国家药监局相关文件要求、EP 2.5.42、USP 等，为制药和药检客户提供先进的分析仪器和解决方案，分享检测经验。并为此精心制作了《亚硝胺分析UFMS解决方案》等检测方案，涵盖沙坦类药物、雷尼替丁、“神药”二甲双胍和生产使用的溶剂等，供客户参考使用。除了亚硝胺之外，磺酸酯类、叠氮类也是关注对象，岛津推荐HS+GC-MS检测磺酸酯类，LC-MS/MS检测叠氮类。岛津可提供覆盖法规要求的各类分析仪器，供药品CMC和检验检测的客户使用。本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)导致的新冠肺炎（COVID-19）自2019年至今仍然在全球蔓延，其变异株Omicron由于高传播率目前已取代其它毒株成为全球新冠的主要流行毒株。各国已采取大规模疫苗接种，通过其产生的中和抗体和抗病毒T细胞来缓解和对抗新冠肺炎。有研究报道，病毒特异性T细胞在病毒清除（即SARS-CoV-1感染后17年）和在抗体滴度减弱的COVID-19患者中检测到SARS-CoV-2特异性T细胞会持续很长时间。因此需要充分了解新冠肺炎中T细胞免疫过程，对疫苗开发和免疫治疗具有重要意义。COVID-19患者中的T细胞免疫反应T细胞免疫反应是高度特异性的，在引发有效的抗病毒反应方面具有不可或缺的作用。在SARS-CoV-2感染的早期阶段，树突状细胞(DC)和巨噬细胞可以吞噬病毒感染的细胞，通过抗原呈递启动T细胞反应。随后，CD4+T细胞刺激B细胞产生病毒特异性抗体，细胞毒性CD8+T细胞靶向病毒感染的细胞。有研究报道，SARS-CoV-2特异性CD4+和CD8+T细胞在COVID-19症状发作后的前2周内的外周血中很明显。大多数SARS-CoV-2特异性CD4+T细胞表现出中枢记忆表型，主要产生Th1细胞因子，而CD8+T细胞具有更高水平的穿孔素表达的效应表型。另外有研究报道COVID-19患者T细胞活化的异质性，并提供证据表明CD4+和CD8+T细胞都能够产生有效的免疫反应，并出现受损或过度的T细胞反应。轻度COVID-19患者的T细胞升高，产生强大的抗病毒免疫反应。特别是CD8+T细胞表达更高水平的细胞毒性分子，例如颗粒酶A和FAS配体，它们有利于消除病毒感染的细胞。然而，在严重疾病病例中，CTL（Cytotoxic T cells，细胞毒性T细胞）比例减少，同时幼稚和中枢记忆CD8+T细胞的百分比也均较低。此外，与健康对照组相比，COVID-19患者的终末分化效应CD4+和CD8+T细胞的百分比更高。且重症COVID-19患者的调节性T细胞(Tregs)水平低于轻症患者。总之，T细胞亚群（包括Treg、Th1、幼稚和记忆T细胞）平衡中的这些失调可能导致严重的炎症状况，并可能导致COVID-19复发。尽管由CD4+和CD8+T细胞介导的早期抗病毒反应最有可能具有保护作用，但SARS-CoV-2有效的先天免疫逃避能力使T细胞难以通过限制I型和III型干扰素反应来产生有效的抗病毒反应。COVID-19恢复期患者和健康人中的T细胞免疫反应恢复康复患者的T细胞计数可以为T细胞在抗病毒反应中的作用提供重要参考。有研究报道，超过70%的COVID-19恢复期患者存在SARS-CoV-2特异性T细胞。100% CD4+T细胞和70% CD8+T细胞在康复患者中具有SARS-CoV-2 Spike特异性反应。功能测定证实CD4+T细胞表现为Th1表型并产生大量IFN-γ，和针对S蛋白较低水平的IL-4、IL-13、IL-5或IL-17A。同样，大多数SARS-CoV-2刺突特异性CD8+T细胞产生IFN-γ，绝大多数IFN-γ+CD8+T细胞也共表达颗粒酶B和肿瘤坏死因子α (TNFα)。这些数据表明，康复患者中的大多数CD4+和CD8+T细胞产生了针对S蛋白的大量抗病毒免疫反应，说明功能性T细胞在病毒清除和恢复中的重要性。此外，这些数据也说明利用SARS-CoV-2的S蛋白作为疫苗生产关键候选者的重要性。T细胞反应在无症状和未接触过的个体中观察到的T细胞反应最低。但是即使没有并发的体液反应，无症状/轻度恢复期的COVID-19患者也可以产生强大而持久的记忆T细胞反应来预防复发性感染。有研究报道，与有症状的个体相比，无症状患者的免疫反应较弱，并且相当一部分有症状的患者在恢复期早期表现出中和抗体量减少。COVID-19恢复期患者在出院后2周内也显示出与针对人ACE2的中和抗体滴度和病毒特异性T细胞计数的强相关性。细胞因子风暴细胞因子风暴是指在各种病理条件下检测到的大量促炎细胞因子和趋化因子，是在SARS-CoV-2感染患者中观察到的关键病理特征之一。在重症COVID-19患者中记录到高细胞因子水平。各种免疫细胞类型，包括巨噬细胞、中性粒细胞、DC，以及NK、B和T细胞，可导致COVID-19患者的细胞因子风暴和炎症反应的过度激活状态。由先天免疫细胞释放的TNFα、IL-6和IL-1β可能是SARS-CoV-2感染晚期患者发生细胞因子释放综合征和严重全身炎症反应的主要驱动力之一，其中一些可能是导致这些患者淋巴细胞减少或Th1反应不足的潜在机制之一。另据报道，在COVID-19重症病例中，血清TNFα和IL-6水平升高与总T细胞计数呈负相关，表明这些细胞因子可能参与淋巴细胞减少和T细胞丢失。相反，处于恢复期的患者上述细胞因子的血清水平显著降低，并显示T细胞计数恢复。鉴于这些发现，有人提出IL-6阻滞剂，如sarilumab、siltuximab和tocilizumab，以及IL-1β受体阻滞剂用于治疗重症COVID-19患者以解决过度炎症和控制炎症的传播。趋化因子和细胞因子水平升高，例如CCL2/3/5、CXCL8/9/10和IFN-γ、TNFα、IL-1β、IL-1RA、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12 、IL-33、粒细胞/粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（G-CSF和GM-CSF）、血管内皮生长因子A（VEGFA）和血小板衍生生长因子亚基B（PDGFB），促进其它白细胞向组织的募集，导致组织损伤。基于T细胞反应的疫苗研究SARS-CoV-2完整基因组的快速可用性可用于开发多种疫苗，使其在刺激幼稚T细胞后产生效应和记忆T细胞，发挥免疫保护。成功的SARS-CoV-2疫苗应该产生对有效免疫反应具有高度特异性的SARS-CoV-2反应性T细胞，而不会产生炎症或疾病开始的不良影响。SARS-CoV-2的蛋白被确定为最适合疫苗开发的靶标，以触发病毒特异性T细胞反应和体液免疫反应。表达S蛋白的腺病毒病毒载体疫苗，即5型腺病毒(Ad5-nCoV)，在健康个体(NCT04313127)中检测其疫苗的安全性和耐受性，观察到2周后成功产生特异性抗病毒T细胞和体液免疫反应。Moderna开发了基于mRNA的疫苗，编码SARS-CoV-2抗原（S蛋白），通过脂质体递送系统给药。因mRNA疫苗可以模拟天然病毒感染，并仅编码抗原蛋白并且不能整合到宿主染色体中。因此，基于mRNA的疫苗更能发挥细胞免疫和体液免疫。T细胞免疫检测---细胞因子释放检测（CRA）疫苗中的抗体测试是常规进行的，但因为特异性病原体的T细胞在血液中存在的总T细胞（通常小于1-3%）中只占很小的一部分，需要在从全血中纯化的细胞中进行。而这些检测都需要复杂的设备和高度专业化的人员，这可能不是每个常规实验室都可以使用的。杜克-新加坡国立大学Antonio Bertoletti教授团队采用了一种快速和简单的替代方法，即基于Ella微流控ELISA技术的全血细胞因子释放测定(Cytokine release assay, CRA)实验：直接将刺激性抗原或肽添加到全血中，导致血浆中细胞因子（通常是IFN-γ）的分泌，然后进行定量。该检测方法通过简单地将Spike肽库添加到全血中，可以轻松快速地检测和相对定量接种疫苗个体中的Spike特异性T细胞反应。此方法检测时间比常规方法缩减了7个小时，总时间缩短了12个小时。总结因T细胞免疫反应在疾病的早期阶段表现出保护作用，也可能导致致命症的发生，因此COVID-19的治疗和预防中需要深入地了解疾病过程中的免疫反应。特别是在症状轻微的患者中阻断促炎细胞因子的早期治疗干预可能会产生有害影响，并导致免疫反应不足和病毒清除受损。在危重COVID-19患者中恢复T细胞耗竭和改善过度炎症反应的晚期治疗干预可能具有更好的临床结果。在疫苗开发中，也要充分考虑其是否可以增强抗病毒免疫和特定T细胞反应从而加强疫苗保护的持久性。参考文献Robust T Cell Immunity in ConvalescentIndividuals with Asymptomatic or Mild COVID‐19.Highly functional virus‐specific cellular immune response in asymptomatic SARS-CoV‐2 infection.T‐cell responses and therapies against SARS‐CoV‐2 infection.Rapid determination of the wide dynamicrange of SARS‐CoV‐2 Spike T cell responses in whole blood of vaccinated andnaturally infected.T cell immunity to SARS-CoV-2 followingnatural infection and vaccination.关于我们ProteinSimple是美国纳斯达克上市公司Bio-Techne集团（NASDAQ:TECH）旗下行业领先的蛋白质分析品牌。我们致力于研发和生产更精准、更快速、更灵敏的创新性蛋白质分析工具，包括蛋白质电荷表征、蛋白质纯度分析、蛋白质翻译后修饰定量检测、蛋白质免疫实验如Western和ELISA定量检测蛋白质表达等技术，帮助疫苗研发、生物制药、细胞治疗、基因治疗、生物医学和生命科学等领域科学家解决蛋白质分析问题，深度解析蛋白质和疾病相互关系。联系我们地址：上海市长宁路1193号来福士广场3幢1901室 电话：021-60276091热线：4000-863-973邮箱：PS-Marketing.CN@bio-techne.com网址：www.bio-techne.com

? 导 读2020版《中国药典》已于今年6月正式发布，并将于12月30日起开始实施。2020版与此前版本的药典相比，有多处重要的增删与修改，四部新增《9306 遗传毒性杂质控制指导原则》为其中之一。该指导原则的出现，为遗传毒性杂质的控制提供了理论依据。据此，药典二部又在十种药物项下规定了对磺酸烷基酯类和N-亚硝胺类遗传毒性杂质的监控要求。如何建立遗传毒性杂质的监控能力成为一些制药企业与检测机构必须完成的挑战，需尽早做好相应准备。 什么是遗传毒性杂质，新版药典为什么要加入这些内容，具体都有哪些规定呢？让小编为你一一解读。 新版药典遗传毒性杂质内容的解读 根据新版药典的定义，遗传毒性杂质（genotoxic impurities）是指能引起遗传毒性的杂质，包括致突变性杂质和其他类型的无致突变性杂质。其主要来源于原料药或制剂的生产过程，如起始原料、反应物、催化剂、试剂、溶剂、中间体、副产物、降解产物等。 新版药典之所以要增加遗传毒性杂质的内容是为了加强国际标准协调，参考了人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）相关指导原则。 药典四部新增《9306 遗传毒性杂质控制指导原则》，用于指导药物遗传毒性杂质的危害评估、分类和限制规定，以控制药物中遗传毒性杂质潜在的致癌风险，为药品标准制修订，上市药品安全性再评估提供参考。 药典二部有10种药物明确指出在必要时，应采用适宜的分析方法对产品进行分析，以确认相关遗传毒性杂质的含量符合我国药品监管部门相关指导原则或ICH M7指导原则的要求。这10种药物关于遗传毒性杂质的规定列表如下： 为了更好的推进磺酸烷基酯及N-亚硝胺的检测方法，岛津根据相关标准开发了多种检测方案。 岛津解决方案之磺酸烷基酯篇 磺酸烷基酯磺酸烷基酯一般是在磺酸盐类药物生产过程中产生的，2007年6月国际制药巨头罗氏制药公司在欧盟国家销售的一种抗HIV药物甲磺酸奈非那韦某些批次检出了甲磺酸乙酯，该事件导致此种药物在欧盟市场一度停售，直到罗氏修正了工艺并增加对甲磺酸乙酯的控制，此后多个国家及国际组织均加强了对磺酸烷基酯的监控。 磺酸烷基酯结构，R1为甲基、苯基或甲苯基，R2为烷基 磺酸烷基酯的分类不同的磺酸盐药物中需要检测的磺酸烷基酯的种类是不同的，下表罗列了各种磺酸盐原料药需要检测的磺酸烷基酯的种类。方案1 顶空+色相色谱质谱岛津HS-20+ GC-MS分析系统 岛津顶空自动进样器特点主要有：• 均一稳定的恒温控制技术，卓越的重现性• 加热炉可以位重叠加热，提高分析效率• 混合振荡功能，可使样品快速达到平衡，缩短分析时间 各磺酸烷基酯衍生物SIM色谱图 方法原理：在顶空条件下使用碘化钠将磺酸烷基酯衍生为的碘代烷烃，然后使用气质检测。方法特点：前处理简单，对仪器污染小，但不能同时检测不同类的磺酸烷基酯。 方案2 气相色谱质谱岛津GC-MS分析系统 岛津气质特点主要有：• 高灵敏度抗污染型离子源，良好的稳定性• 强劲大容量真空系统，大幅度缩短质谱开机后的稳定(抽真空)时间• OD Lens双偏转透镜，聚焦目标离子，减低噪音 八种磺酸酯标准品TIC色谱图 方法原理：药品溶于乙酸乙酯后有机滤膜过滤，直接采用气质检测。方法特点：可以同时检测不同类的磺酸烷基酯，基质复杂样品检测效果可能欠佳。 方案3 三重四极杆气相色谱质谱岛津GCMSMS分析系统 GCMSMS NX系列气质还具有以下特点：• ClickTek技术仪器维护更方便• 新一代AFC全惰性流路，提供更高的检测精度• 智能钟、Smart EI/CI 复合源提高实验效率 八种磺酸酯标准品MRM色谱图 方法原理：药品溶于乙酸乙酯，，有机滤膜过滤后使用三重四极杆气质检测。方法特点：可以同时检测不同类的磺酸烷基酯，三重四极杆气相色谱质谱抗干扰能力强可用于复杂基质样品的检测 岛津解决方案之N-亚硝胺篇 N-亚硝胺N-亚硝胺类化合物是一类强致癌有机化合物，它由前体物质硝酸盐、亚硝酸盐和胺类通过化学或生物学途径合成。典型代表化合物有N，N-二甲基亚硝胺（NDMA）、N，N-二乙基亚硝胺（NDEA）。2018年被爆出沙坦类药物中含有遗传毒性杂质NDMA，尤其是缬沙坦和氯沙坦尤为严重。 N-亚硝胺化合物结构 方案1 液相色谱最高130Mpa的高耐压，完美应对各种分析• 高通量自动进样器，实现样品的连续分析• 可配备流动相精灵，诊断精灵以及修复精灵• 最新设计的三维中文色谱软件，符合GMP标准 NDMA和NDEA 均在10min以内出峰，分离度良好，5 ng/mL标准品溶液灵敏度轻松满足ANSM French OMSL法规要求。 方案2 三重四极杆气相色谱质谱下图为6种N-亚硝胺定量限MRM图，峰型完美。应对欧洲药典质量控制要求so easy。 方案3 液相色谱质谱 • UF-Swiching技术:真正意义上实现了正、负离子同时采集；• UF-Scaning技术:扫描速度可达30000u/sec；• UF- Sweeper Ⅲ技术：离子碰撞过程的超低串扰；• UF- Senstivity技术：三重脱溶剂系统，实现超高灵敏度 轻松再现FDA和EDQM法规中规定的NDMA和NDEA检测方法，并使用LabSolutions软件实现了内标法和外标法同时定量。 5.0 ng/mL标准样品MRM色谱图 岛津自1875年创业以来，始终秉承创始人岛津源藏的创业宗旨“以科学技术向社会做贡献”，不仅视自己为仪器供应商，而且努力向各个行业的用户分享岛津丰富的专业资源和强大的应用支持。为应对制药行业相关用户对遗传毒性杂质的检测需求，岛津公司开发了基于LC、GCMS、HS-GCMS、GC-MS/MS以及LC-MS/MS等平台的相关药物中遗传毒性杂质的检测方法。岛津分析中心也精心推出《沙坦类药物中遗传毒性杂质检测方案》和《药品中遗传毒性杂质检测整体解决方案》，希望我们的工作对您有所帮助。

ADCC简介IgG抗体要发挥功能，除了需要Fab区域（Fragment of antigen binding）识别并特异性结合抗原， 还需要其可结晶区域（Fragment crystallizable,Fc）来发挥IgG的效应功能（二级功能），如靶向细胞的杀伤等。Fc区域主要介导以下三类活动：通过结合表达在Natural killer (NK)等免疫细胞表面上的FcγR（Fcγ receptors）激活抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）通过结合血清补体C1q激活补体依赖的细胞毒性作用（Complement-dependent?cytotoxicity，CDC）通过结合新生儿Fc受体（Neonatal Fc receptor ，FcRn）延长抗体半衰期。今天我们主要关注ADCC，其不仅是机体通过抗体清除被病毒或其他病原物感染细胞的主要途径，也是目前治疗性抗体发挥临床效果的（Mechanism of Action ，MOA）核心机制之一[1]。因此，对于抗体新药研发和改造，仿制药开发和研发过程中抗体质量及功能的分析，都离不开ADCC的检测。同时，在生物药和免疫调节药物的临床试验中，ADCC活力也是必须的ex vivo指标之一。在此，我们以ADCC检测为切入点，向大家展示珀金埃尔默的DELFIA技术平台是如何助力抗体制药的。图片引用自参考资料[1]基于DELFIA技术的ADCC检测从细胞水平来说，ADCC本质上属于免疫细胞介导的杀伤。因此，常见的针对细胞杀伤（注意不是细胞活力）的检测方式，如经典的51Cr释放法，LDH检测，和Calcein 释放法等都可以用于ADCC检测。从原理上，这些方法可分为直接的检测靶细胞在效应免疫细胞作用下的裂解程度，如51Cr释放法；和间接的检测效应细胞的活化，如NFAT-RE-luc报告基因法和监测剩余的细胞活力来评估细胞杀伤，如化学发光法等。间接法的缺点是不能直接模拟体内ADCC过程。利用DELFIA技术的DELFIA® EuTDA（货号AD0116）细胞毒法属于直接检测法，更能反映ADCC的MOA。与51Cr释放法形式类似，DELFIA® EuTDA细胞毒法利用荧光放大配体BATDA特异的标记靶细胞。BATDA能迅速进入细胞，并在水解作用下形成亲水的TDA留在细胞内，并在靶细胞裂解下释放，和DELIFA Eu试剂相结合形成强荧光、稳定的螯合物EuTDA用于检测。更详细的原理介绍可参考我们的微信端公众号[2]和应用材料[3]。图片引用自参考资料[3]作为放射性检测的替代方法，更为安全的DELFIA® EuTDA细胞毒法在ADCC活力检测中具有众多优势。相较于无法区分非特异死亡的LDH检测，EuTDA法不受效应细胞死亡和裂解的影响，降低背景的同时提升了检测的窗口和稳定性。相较于Calcein，BATDA能有效标记脆弱细胞，迅速被细胞摄取和在细胞裂解下完成高效的释放，为ADCC检测提供了稳定的检测窗口和易于标准化等优势。同时，EuTDA细胞毒法不受效应细胞限制，灵活支持利用多种原代免疫细胞（如PBMC和NK细胞）和更为稳定的改造细胞系的ADCC检测。从检测模式上EuTDA方法为时间分辨荧光（Time-Resolved Fluorescence，TRF），因此拥有TRF本身的众多优势，包括不受来源于培养基和血清等的背景荧光干扰，高稳定性和重复性等。此外，靶向红外区的检测能有效避免检测样本来带的干扰，并为多重检测打下基础。最后，对自动化和小型化的支持已让EuTDA法逐渐成为大分子药物研发中ADCC检测的标准方法[4]。在此，我们通过几个经典案例向大家介绍基于DELFIA技术的ADCC检测是如何助力大分子药物研发的。单抗研发领域之Fc区域改造在谈到Fc区域改造之前我们先得进一步了解ADCC通路的关键成员。单克隆抗体通过其Fc区域募集表达IgG受体FcγR的NK细胞等的多种免疫细胞。人的FcγR包括FcγRI(CD64，高亲和力)，FcγRII(CD32，低亲和力)和FcγRIII(CD16，低亲和力)。Fc和FcγR的相互作用会引发一系列的免疫活动和多种免疫细胞的活化，达到靶细胞杀伤的效果。同时，也不是所有的FcγR都会激活免疫反应，例如FcγRIIb就是一个抑制性IgG受体。早期基于小鼠的研究证明FcγR参与了Rituximab and Trastuzumab的药效。反过来，FcγRIIIa的多态性（高亲和力(V158)活低亲和力(F158)）和单抗药物的临床效果之间存在相关性。因此，Fc/FcγR之间的相互作用是抗体药效的关键调控者。而通过改造Fc区域调节其和FcγR之间的亲和力也成为抗体研发的一个有力切入点。在此，我们向大家介绍抗体改造的先河研究[5]。在结构解析的基础上，该研究引入AlphaScreen高通量筛选平台，通过竞争法鉴定出FcγRIIIa高亲和力的Fc区域变体。AlphaScreen的亲和力结果进一步由Biacore SPR 确认。除了检测变体和FcγRIIIa之间的亲和力，AlphaScreen还用于确认变体和抑制性IgG受体FcγRIIb之间的亲和力，从而获得变体和RIIIa/RIIb的相对亲和力比值。结果显示A330L 突变和S239D/I332E相结合能提高对激活性FcγRIIIa的亲和力的同时降低和抑制性受体FcγRIIb之间的亲和力，显著提升RIIIa/RIIb的相对亲和力比值（4-9, 针对Trastuzumab）。在亲和力筛选的基础上，研究利用DELFIA EuTDA-based cytotoxicity assay（货号AD0116）在细胞水水平探究变体对ADCC的提升。以不同FcγRIIIa基因型的PBMCs为效应细胞，Her2+ SkBr3为靶细胞，研究证明改造的变体能有效提升ADCC（2-3个数量级），与亲和力数据趋势一致（下图左）。进一步的研究证明变体能有效引发针对HER-2不同表达水平的细胞株的ADCC。针对几乎没有抗原表达的MCF7细胞系，变体依然具有客观的ADCC活力（下图右）。除了基因水平多态性外，Fc区域的糖基化也影响其和FcγR的亲和力。尤其是岩藻糖的缺失会提升IgG1和FcγRIIIa之间的亲和力。因此，除了突变外，改造Fc区域的糖基化修饰也是提升治疗性抗体ADCC活力的一个途径。以由罗氏研发的Lumretuzumab单抗（RG7116）为例[6]。RG7116一方面阻断HER3的激活并下调HER3的表达。进一步通过罗氏去岩藻糖修饰的GlycoMab技术改造，RG7116和FcγRIIIa之间的结合亲和力提高50倍。基于DELFIA技术的ADCC检测证明，糖基化改造显著提升RG7116的ADCC活力（下图左）。同时，对比不同HER3表达量的细胞系，研究清晰地表明HER3受体表达丰度和RG7116介导的ADCC活力之间的正相关联系（下图右）。在动物模型上，基于多种低免疫细胞浸润的小鼠皮下瘤模型，研究发现RG7116仅通过靶向HER3就能发挥抗癌作用。进一步利用高免疫细胞浸润的异种原位移植A549肺癌小鼠模型，研究证明糖基化改造有效提升小鼠的生存周期。临床一期试验进一步证明RG7116的临床疗效。一方面，RG7116有效抑制了肿瘤细胞膜HER3的表达。同时，相较于未糖基化改造的抗体，RG7116升高外周NK免疫细胞的活化程度[7]。免疫治疗领域之首个PD-1抗体： Nivolumab著名的O药Nivolumab（英文商品名: Opdivo），于2014年底获得FDA批准用于治疗晚期黑色素瘤，成为第一个获批的PD-1抑制剂，标志着免疫治疗时代的开启。四年后，Nivolumab也成为中国首个获批的PD-1单抗针对晚期非小细胞肺癌，商品名“欧狄沃”。虽然同是单抗药物，PD-1抑制剂与常见的靶向药物作用机制不同。PD-1抗体主要用于阻断PD-1和其配体PD-L1的相互作用，而不是杀伤PD-1阳性细胞，也就是抗肿瘤效应细胞。在Nivolumab的体外表征分析研究中，DELFIA Cell Cytotoxicity Kit（货号AD0116）被用于确认Nivolumab是否会诱导ADCC产生。以活化的PBMCs为效应细胞，高表达PD-1的CD4阳性细胞为靶细胞，研究人员确认IgG4亚型的nivolumab不会诱发ADCC效应[8]。后续的实验进一步证明nivolumab不能介导CDC，因此nivolumab的引入不会清除PD-1阳性细胞群体。除了nivolumab外，其他的PD-1单抗，包括默沙东的Keytruda、百济神州的BGB-A317及恒瑞的SHR-1210,都为弱ADCC活性设计。然而，同样是免疫检查点抑制剂，CTLA-4单抗Ipilimumab则需要其ADCC活性来杀伤Treg细胞发挥作用，强调了不同作用机制对抗体ADCC活性的要求也有区别[9]。结语ADCC活力的检测不仅能协助解析单抗药物的MOA，也推动对于NK细胞功能的研究及开辟新的抗肿瘤策略。作为成熟的细胞杀伤检测工具，DELFIA® EuTDA（货号AD0116）细胞毒法不仅可用于评估抗体的ADCC和CDC活力，还能用于检测ACT，CAR-T和CAR-NK等疗法中免疫细胞的杀伤能力。为了助力免疫治疗的开发，我们近期推出“珀金埃尔默生命科学试剂耗材平台”，加速您的研究和药物开发进程。针对ADCC和CDC等细胞杀伤检测，珀金埃尔默提供涵盖试剂-耗材-仪器-应用的完善解决方案。除了DELIFIA平台，我们提供金标准放射性检测方案及强大的多模式检测平台，胜任常见LDH检测、Calcien 释放和化学发光法等多种方法。试剂耗材查询与购买欢迎登录珀金埃尔默生命科学试剂耗材平台，搜索货号AD0116，在线下单。登入路径：参考资料参考资料[1] Deyev SM, Lebedenko EN. Modern Technologies for Creating Synthetic Antibodies for Clinical Application.Acta Naturae. 2009 Apr 1(1):32-50.[2] 科研干货|免疫细胞如何杀伤肿瘤细胞. https://mp.weixin.qq.com/s/-jW77oFnXusb9h6e-AKQBg[3] A Simplified, Gentle Cell-Labelling Method for Non-Radioactive Cytotoxicity Assays. PerkinElmer application note[4] An Automated DELFIA ADCC Assay Method using a CD16.NK-92 Cell Line. Biotek application note[5] Lazar GA, et al.Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14 103(11):4005-10.[6] Mirschberger C, et al. RG7116, a TherapeuticAntibody That Binds the Inactive HER3 Receptor and Is Optimized for Immune Effector Activation. Cancer Res. 2013 Aug 15 73(16):5183-94.[7] Meulendijks D, et al. First-in-Human Phase I Study of Lumretuzumab, a Glycoengineered Humanized Anti-HER3 Monoclonal Antibody, in Patients with Metastatic or Advanced HER3-Positive Solid Tumors.Clin Cancer Res. 2016 Feb 15 22(4):877-85.[8] Wang C, et al. In Vitro Characterization of the Anti-PD-1 Antibody Nivolumab, BMS-936558, and In Vivo Toxicology in Non-Human Primates. Cancer Immunol Res. 2014 Sep 2(9):846-56.[9] Romano E, et al. Ipilimumab-dependent cell-mediated cytotoxicity of regulatory T cells ex vivo by nonclassical monocytes in melanoma patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 May 12 112(19):6140-5.关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn

目前医院及一些工业企业的员工已经能够采用佩戴辐射指示徽章的方法来实时快速地显示佩戴者所处的辐射等级，不过在检测有毒化学品污染方面，却一直没有出现类似的便携指示装置。为此科学家们最近开发出了一种暴露在有毒化学物质环境下就会自动变色的色素产品，并将这种产品称为“石蕊试纸扩展版”。 　　负责研制这种设备的Suslick教授表示：“我们开发的设备只不过是石蕊试纸的数字化多维码扩展版。我们采用了几种不同的纳米级多孔色素材料，并把这些材料排列成6x6的阵列。只要把阵列的颜色排列状况与标准表进行对比，就可以很快知道某环境中的化学品毒性程度。“ 　　科学家们在玻璃，纸片或塑料片上使用色素打印出6x6的色素阵列，然后再用特制的平板扫描仪或数码相机对这些阵列进行拍照，并将阵列的初始图像与放入有毒环境后的图像进行对比，便可测出该环境是否具有化学毒性。而且这种色素不会受到环境湿度的影响。这项开发工程是由国家健康部赞助的。 　　另外，加州一家名为iSense的公司还制造了一台可用于检测的廉价扫描仪原型机，这种扫描仪使用造价便宜的白色LED灯管作为光源，并可配合普通数码相机一起使用，能加快扫描处理的操作方便性，速度，整套系统的价格也有所下降。并且已经进入了商业化生产阶段。 　　CNBeta编译 　　原文：dailytech

流式细胞仪在生命科学领域尤其医学中应用非常广泛，是一种能够对细胞进行相关处理的仪器，并且能够对细胞进行必要的分析。小编为大家介绍一下流式细胞仪的概念、发展历史、特点、分类、基本原理以及应用。　　流式细胞术与流式细胞仪的概念　　流式细胞术(flow cytometry , FCM)：是一种定量分析技术，是指利用流式细胞仪检测细胞特异性标记荧光信号而测定细胞的多种生物物理性质的方法，同时也是一项可以把具有某相同荧光信号特性的某些细胞亚群从多细胞群体中分离和富集出来的细胞分析技术。点击查看更多细胞流式仪　　流式细胞仪(flow cytometer)：是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术和抗原抗体检测技术为一体的新型高科技仪器 是以激光为光源、检测生物学颗粒理化性质的仪器。　　流式细胞仪的发展历史　　1、1934年，Moldavan使悬浮的红细胞从一个毛细玻璃管中流过，每个通过的细胞可被一个光电装置记录下来。这就是流式细胞仪的雏形。　　2、1965年，Kamentsky用紫外吸收和可见光散射两个参数同时测量未染色细胞，给出细胞中核酸的含量和细胞大小。奠定了多参数流式细胞测量的基础。　　3、1967年，Van Dilla和Los Alamos采用了层流流动室和氩激光器，开发出了液流束、照明光轴、检测系统三者相互垂直的流式细胞仪。这成为目前各种流式细胞仪的基础。　　4、1969年，Fulwyler利用静电墨水喷射液滴偏转技术，建立了流式细胞分选术。Ehrlich和Wheeless利用飞点扫描技术和缝扫描技术使零分辨率的流式细胞仪变成了低分辨率的流式细胞仪。　　5、20世纪70年代，随着Kohler和Milstein成功提出了单克隆抗体技术和荧光标记技术，为特异研究和分析细胞奠定了良好的基础。　　6、1973年，美国BD公司和美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界上第一台商用流式细胞仪FACS I。　　7、20世纪80年代，流式细胞仪的数据采集、存储、显示、分析日趋完善，随着样品制备方法的增加，新的荧光染料和细胞标记物的出现，使流式细胞仪的应用范围逐渐扩大。　　8、20世纪90年代，与之配套的标本制备仪和自动进样器的问世，以及适合临床应用的单克隆抗体的增加，使流式细胞仪逐渐从科研单位进入医院的中心实验室和检验科，成为现代化的临床检验仪器的一部分。　　流式细胞仪的特点　　1、高速度：每秒可检测1 000-5 000个细胞。　　2、高灵敏度：每个细胞只要带有1 000-3 000个荧光分子就能检出，两个细胞之间有5%的差别就可区分出来，光散射的灵敏度为0.3um。　　3、高精度：在细胞悬液中测量细胞，比其他分析技术的变异系数更小，分辨率高。　　4、高纯度：分选细胞的纯度可大于99%以上。　　5、多参数：可同时定量检测单个细胞的DNA等多个参数。　　流式细胞仪的分类　　1、根据功能不同，可分为临床型和综合型(科研型)。　　2、根据有无细胞分选功能，可分为流式细胞分析分选仪和流式细胞分析仪。　　3、根据结构不同，可分为一般流式细胞仪(零分辨率流式细胞仪)和狭缝扫描流式细胞仪(高分辨率流式细胞仪)。前者的激光光斑为椭圆形，光斑直径大于被检细胞体积。后者激光光束为一条线状扁平光斑，直径在3-5um。　　流式细胞仪的基本原理　　1、将悬浮分散的单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后，放入样品管。　　2、在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，流动室充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排列成单列由流动室的喷嘴喷出，成为细胞液柱。　　3、液柱与水平方向的入射激光束垂直相交，相交点称为测量区。通过测量区的细胞受激光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被成90℃角方向放置的光电倍增荧光检测器和前向角放置的光电二极管检测器接收，经过转换器转换为电子信号。　　4、电子信号经模/数转换输入计算机。计算机通过相应的软件储存、计算、分析，就可以得到细胞的大小和活性、核酸含量等理化指标。　　流式细胞仪的应用　　1、DNA倍体分析　　DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用最广检测项目。由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同，存在异倍体细胞，所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息，这在细胞生物学中运用很广泛。特别地，它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行，这样在细胞混合培养中，可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光，常用的染料为PI，DAPI。　　在该领域Partec公司的 CyFlow PA是一枝独秀。　　2、细胞生存能力实验　　使用Heochest 33342染料与DNA特异性结合，后因细胞活力不同染料的结合程度也各异，故可评估细胞的活性度。　　3、计数外周血中检测网织红细胞　　使用TO染料能够特异性地与RNA结合，结合系数高达3000，故具有很好的性价比。　　4、外周血、骨髓采集物中CD34阳性干细胞计数，临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定。使用标准ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE标记CD34抗体，PE-CY5标记CD45抗体。　　5、交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验　　检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有着重要临床意义，因为这种反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症。流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结合的人免疫球蛋白。FITC标记人免疫球蛋白抗体、PE标记粒细胞表面标志物、PE-CY5标记HLA抗体。　　6、血小板自身抗体检测　　血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关症状，如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别血小板抗体。　　7、移植交叉配型　　原细胞毒实验，主要用于避免移植物超急性排拆反应。流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击，作为HLA配型前的预实验。流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别T细胞CD3或B细胞CD29抗体。　　8、检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺激后活化效应淋巴细胞早期活化指标CD69可用来检测免疫治疗效果。流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化情况：FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD8抗体、PE-CY5标记的CD69抗体。　　9、细胞增殖状态检测　　核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量细胞增殖分裂状况，在评估肿瘤预后有重要意义。为些标志物的检测一般同细胞表面标志物同时检测。FITC标记PCNA或Ki67或BrdUrd，PE或(并)PE-CY5标记细胞表面标志物。　　10、染色体分析　　流式细胞仪染色分析运用两种特异性染料：Hoechest33258与核苷酸AT结合 Chromomycin A3与GC相结合。从而在双参数坐标上根据染色体ATCG含量的不同识别各种染色体。平时进行的染色体分析耗时且需要操作者极具经验，而用流式细胞仪时可快速地识别出异常染色体，如加配分选系统可将这些异常染色体分选出来作进一步分析。　　以上，就是小编为您介绍的流式细胞仪的概念、发展历史、特点、分类、基本原理以及应用。如今医疗的进步离不开医疗设备的发展与进步，流式细胞仪就是集中于测量发育异常的细胞遗传物质的数量变化，该设备的鉴定对种质资源、物种进化、物种分类、生态学研究、倍体育种等方面具有重要意义。