液基细胞检测

在液体活检的研究中，基于表面上皮标志物（EpCAM和CK）的循环肿瘤细胞（CTC）检测策略应用较为广泛，但存在局限性。研究表明，CTC中的肿瘤相关miRNA与癌症的发生和发展具有高度相关性，具有成为肿瘤表征和鉴定标志物的潜力。目前，高通量地针对单个CTC在活细胞水平开展原位分析，并进一步实现多个miRNA的同步分析，是颇具挑战性的工作。然而，新型的二维纳米材料——金属有机框架（MOF）因结构可控、功能多样的特性，为研究人员提供了活细胞探针载体的新思路。 　　近日，中国科学院深圳先进技术研究院陈艳团队联合清华大学深圳国际研究生院谭英团队、香港理工大学杨莫团队，提出了新型的2D MOF纳米传感器集成的液滴微流控流式细胞仪（Nano-DMFC），可应用于CTC单细胞miRNA的原位多重检测。相关研究成果以2D MOF Nanosensor-Integrated Digital Droplet Microfluidic Flow Cytometry for In Situ Detection of Multiple miRNAs in Single CTC Cells为题，发表在Small上。 　　本研究开发了一种新型的2D MOF纳米传感器集成的液滴微流控流式细胞仪（Nano-DMFC），突破了活细胞中核酸原位分析的技术瓶颈，高通量地实现了样本中单个CTC活细胞miRNA的原位、多重、定量分析。该纳米传感方案以金属有机框架MOF为猝灭剂，双色荧光染料标记DNA探针为供体，首次合成了用于双重miRNAs检测的生物功能化MOF荧光共振能量转移（FRET）纳米探针。该2D MOF纳米传感器修饰了两种乳腺癌靶向多肽序列，以增加肿瘤细胞靶向和内体逃逸能力。集成2D MOF纳米传感器的数字液滴微流控流式细胞仪，可实现单个乳腺癌细胞中双重miRNA标志物（miRNA-21和miRNA-10a）的原位检测。 　　纳米传感器集成的液滴微流控流式细胞仪由三部分组成——单细胞液滴发生器、纳米探针微注射单元和液滴荧光检测单元。Nano-DMFC系统首先产生单细胞液滴，然后2D MOF纳米传感器被精确地微注射到每个单细胞液滴中，在活细胞水平实现单个肿瘤细胞中的双重miRNA表征。在单个肿瘤细胞内存在目标miRNA时，MOF纳米片上的染料标记的ssDNA与其靶标形成杂交双链DNA（dsDNA），dsDNA和MOF之间的相互作用减弱，使dsDNA从MOF表面分离，最终触发荧光的恢复。不同类型的miRNA在单个细胞中产生不同的荧光信号。最后，研究使用光纤集成的液滴流式检测装置，在纳米探针孵育后对液滴中的信号进行检测和分析，从而实现对单细胞中双重miRNA的检测。实验结果表明，Nano-DMFC平台能够以双重miRNA为靶标在仿生样本（含有10,000个阴性上皮细胞）中检测出10个阳性CTC细胞，同时在加标血液样本的回收实验中表现出良好的重复性。该平台验证了以miRNA为标志物的CTC检测新策略。Nano-DMFC系统作为小型化、高度集成、操作简易的活细胞miRNA分析平台，为探究肿瘤细胞异质性和鉴定细胞亚型提供了新思路，并在临床研究中具有癌症早期诊断和术后监测的潜力。 　　研究工作得到国家自然科学基金、广东省粤港联合创新领域项目、深圳市科技创新委员会和香港研究资助局等的支持。 　　论文链接 　　A、同时检测miR-21和miR-10a的MOF-PEG-peps纳米复合材料传感器的制备方案；B、Nano-DMFC系统中的样品处理单元和miRNA检测单元，可实现单细胞液滴包裹、纳米传感器微注射、单个CTC细胞多重miRNA荧光检测。 在液体活检的研究中，基于表面上皮标志物（EpCAM和CK）的循环肿瘤细胞（CTC）检测策略应用较为广泛，但存在局限性。研究表明，CTC中的肿瘤相关miRNA与癌症的发生和发展具有高度相关性，具有成为肿瘤表征和鉴定标志物的潜力。目前，高通量地针对单个CTC在活细胞水平开展原位分析，并进一步实现多个miRNA的同步分析，是颇具挑战性的工作。然而，新型的二维纳米材料——金属有机框架（MOF）因结构可控、功能多样的特性，为研究人员提供了活细胞探针载体的新思路。

时间：2018年9月27日 19:30 - 20:30内容简介：临床疑难病例越来越多，传统的细胞学已经不能满足我们对体液检测的要求，流式细胞术运用于体液检测，不仅提高了白血病、淋巴瘤的检出率，而且可以检测体液的免疫细胞，判断体液类型，从而辅助判断病情。主讲人简介：詹茜 重庆医科大学附属第一医院 流式平台组长重庆医科大学血液肿瘤硕士，肿瘤学博士，现任重庆医科大学分子医学检测中心流式平台组长，血液肿瘤组组长，对多色流式分析白血病、淋巴瘤有着丰富的经验。

1947年，Mandel和Metais首次报道了外周血中存在游离DNA（Cell-free DNA, cfDNA）。正常生理状态下，血液中的cfDNA主要来源于白细胞的坏死和凋亡；在某些疾病和特殊状态下，如组织损伤、癌症和炎症反应等，细胞内的DNA片段也会被释放到各种体液中（血浆、脑脊液、尿液等）成为cfDNA。在癌症早期，当患者还未表现出明显的临床症状时，细胞内DNA状态就已经发生变化，这些DNA被释放到体液中，使得体液cfDNA中包含了与癌症相关的重要信息。通过对这些信息进行提取和处理，可对癌症进行非侵入式诊断，实现癌症的早期诊疗，因此，cfDNA检测是目前市场上最常见的液体活检形式。髓母细胞瘤（Medulloblastoma，MB）是一种恶性的儿童胚胎中枢神经系统肿瘤，具有沿软脑膜转移的倾向。根据基因组特征可分为4个亚群：WNT、SHH、 Group 3和Group 4。手术切除结合放化疗是目前治疗MB的首选治疗方案（可治疗约70%的病人），术后的标本则作为诊断和肿瘤特征分析的证据。MB能够随着时间的推移而发展，约1/3患有MB的儿童最终都是死于该疾病，存活下来的患者也需要长期忍受由于治疗而产生的毒性。目前，除了磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）和脑脊液（Cerebrospinal fluid, CSF）细胞学检测，还没有可靠的分子生物标志物来反应MB的进展情况。因此，通过纵向样本开发强大的、微创的、临床可操作的生物标志物是非常必要的。研究显示，在 CNS 恶性肿瘤患者中，CSF来源的cfDNA比从血浆中分离出来的cfDNA具有更大的效用【1-2】。MB基因组几乎没有热点驱动突变，而是以普遍的染色体拷贝数变异（Copy number variations, CNVs）为特征，因此限制了cfDNA 突变分析在MB中的通用性【2-3】。近日，来自美国St. Jude儿童研究医院的Paul A. Northcott团队在Cancer Cell杂志在线发表了题为Serial assessment of measurable residual disease in medulloblastoma liquid biopsies的文章。研究人员利用MB中染色体不稳定性的特点，通过低深度全基因组测序（Low-coverage whole-genome sequencing, Lc-WGS）对来自123名MB患者的476例CSF来源的cfDNA样本进行分析，鉴定了可作为可测量残留病变（Measurable Residual Disease, MRD）标志物的CNVs，阐释了cfDNA检测的疾病预测价值和诊断价值。本研究共收集了来自123名MB患者的共476例CSF样本，提取cfDNA进行低深度全基因组测序（lcWGS），并进行后续分析（图1）。首先，作者评估了cfDNA来源的CNVs作为MRD标志物的效用。数据显示，在67例样本（67/105）中检测到了MRD；相反，7例非肿瘤CSF样本中都没有检测到cfDNA来源的CNVs，即MRD阴性。MRD阳性CSF样本与相应的原发性肿瘤之间的CNVs检测谱高度一致。MRD检测与疾病的转移状态、分子亚群和肿瘤位置显著相关，与年龄、性别、切除范围、细胞学检查结果以及切除和脑脊液取样之间的时间无关。值得注意的是，无论相应的脑脊液细胞学结果如何，MRD在高危疾病患者中的阳性率相似：91例脑脊液细胞学阴性的样本中有56例样本的MRD呈阳性。图1. 样品收集及检测流程图随后，作者探究了连续MRD检测与疾病复发之间的关系。在30/77（39%）例放疗后、21/75（28%）例化疗中及20/68（34%）例治疗结束的患者中检测到MRD。出现疾病复发的患者在治疗期间的MRD持续率明显高于没有复发的患者。在MRI显示病情完全缓解的32例病人中，有16例病人在复发前3个月时就检测到了MRD，此时影像学或细胞学异常还不能检测到。在所有持续接受放化疗或细胞学有差异的12例病人的CSF样本（n=27）中均检测到了MRD。24/25例患者在病情发展的3个月内采集的脑脊液标本中MRD呈阳性；在病情没有进展的患者中，193/209（92%）例CSF样本都是MRD阴性。那么，连续检测MRD在临床上有何价值？作者发现，那些放化疗后、治疗期间或已经结束治疗的病人中，MRD阳性病人的无进展生存期（progression-free survival, PFS）比MRD阴性的病人差很多。与治疗结束时MRI和脑脊液细胞学检查的标准评价进行比较，同时进行的MRD检测对于病人分类更有效，其对残留病变的灵敏度也更高（64% vs. 24%）。在治疗结束的病人中，12/20（60%）MRD-阳性的病人的MRI/细胞学检查正常，但后期其中的10位病人的病情都有所进展；其余两例病人MRI正常其MRD也呈阳性。在高风险患者中，治疗结束时的MRD与PFS有显著关系。作为一个随时间变化的变量，随访期间MRD检测与PFS显著相关。接下来，作者对疾病复发中的肿瘤相关分子图谱进行了分析。为了同时在早期和疾病进展期检测渐进性疾病（Progressive disease, PD）和MRD阳性患者的CSF，作者比较了从患者匹配的CSF样本中提取的CNVs谱，发现了染色体非整倍性，提示12/15（80%）例患者存在克隆选择或进化。cfDNA 分析可以更早地检测出那些在疾病复发时占主导地位的肿瘤克隆。在研究过程中，作者也注意到了原位肿瘤与cfDNA中检测到的CNVs不一致的情况。例如，患者sj024被诊断为Group4髓母细胞瘤，随后又出现转移性骨骼复发。然而与相应的原位肿瘤CNV检测结果相比，患者的cfDNA来源的CNVs谱更符合复发肿瘤特性，提示患者的CSF样本中包含了具有侵略性的亚克隆，可以驱动疾病的进展。最后，作者进一步评估了基于 lcWGS 的 cfDNA 分析在其他儿童脑肿瘤中的适用性。通过对17名非髓母细胞瘤患者进行分析，发现所有患者在其相应的原发肿瘤中都存在染色体和/或局灶性CNVs。基于lcWGS分析CSF来源cfDNA显示，13例（76%）样本呈MRD阳性，包括3例转移样本。此外，作者还观察了与临床过程相呼应的cfDNA样本的分子反应，其与MB中的发现类似。综上所述，该研究利用从MB和其他CNS肿瘤患者收集的脑脊液样本的大型纵向队列，首次有效地、系统地论证了CSF来源的cfDNA谱在儿童CNS癌症中检测MRD的临床效用（图2）。虽然液体活检的种类和方式非常丰富，但作者认为使用lcWGS检测CSF来源的cfDNA中的肿瘤相关CNVs非常适合于MB：（1）MB切除后患者脑脊液或血浆中cfDNA的含量明显低于其他脑肿瘤患者【4-5】，这种低于毫微克的产物，若采用其他检测方法（如表观遗传组和突变分析）是极具挑战的，但对lcWGS已经足够；（2）染色体CNVs在儿童MB中几乎无处不在，捕获CNVs无需使用定制探针来靶向不同的突变驱动基因，适用于缺乏已知驱动基因突变的MB样本。该研究支持将前瞻性cfDNA评估纳入MB临床试验，以进行进一步的研究和技术改进，最终实现根据MRD反应进行个性化治疗。图2. cfDNA检测流程及临床效用原文链接:https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.09.012

血液肿瘤是起源于造血系统的恶性肿瘤，其发病机制复杂，环境因素、遗传因素、免疫因素等都被认为与疾病的发生、进展密切相关。淋巴细胞亚群中的T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤淋巴细胞及淋巴细胞功能亚群调节性T细胞是细胞免疫检测的常用指标，广泛用于血液肿瘤患者的免疫状态评估、疾病复发或转移风险预测及治疗指导等。为了更加深刻认识淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中的作用，加强其检测过程的质量管理，促进其规范地应用于临床，由中国医药质量管理协会医学检验质量管理专业委员会牵头组织国内血液肿瘤和临床检验领域多位专家，制定了该专家共识。该共识介绍了淋巴细胞亚群的检测方法，归纳总结了其对血液肿瘤筛查、复发转移预警及预后评估、合并感染风险预警、造血干细胞移植后免疫重建监测与移植物抗宿主病预防、嵌合抗原受体T细胞免疫治疗后监测、用药指导与疗效监测等方面的应用，并对血液肿瘤患者的监测方案与随访时机选择做出了推荐。淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中应用的专家共识中国医药质量管理协会医学检验质量管理专业委员会通信作者：杨再林，E-mail:804728092@qq.com武坤, E-mail:wukun@ydyy.cn 刘耀, E-mail:liuyao77@cqu.edu.cn本文已被本刊录用并于5月9日在中国知网发表，转载、引用请注明出处。知网首发网址：https://kns.cnki.net/kcms/detail/50.1176.R.20230508.1716.002.html原文阅读：淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中应用的专家共识血液肿瘤是起源于造血系统的恶性肿瘤，具有高度异质性。2022版《造血与淋巴组织肿瘤WHO分类》根据肿瘤细胞的来源，将血液肿瘤主要分为髓系增殖和肿瘤、髓系/淋系肿瘤和其他谱系未定白血病、组织细胞/树突状细胞肿瘤、B淋巴细胞增殖性疾病和肿瘤、T淋巴细胞增殖性疾病和肿瘤、NK细胞肿瘤、淋巴组织间质源性肿瘤、遗传性肿瘤综合征8个大类。血液肿瘤的发生、发展和转归与其患者机体的免疫功能，尤其是细胞免疫功能密切相关[1-2]。随着疾病的发生发展，免疫微环境也随之发生相应变化，进而引起外周血中各种免疫细胞亚群的改变。淋巴细胞是构成人体免疫系统的主要细胞，根据淋巴细胞表面的标记物和功能，淋巴细胞可以分为许多不同的群体。临床上常用流式细胞术（FCM）对外周血中的不同群体的淋巴细胞进行鉴别和计数，包括CD3+T淋巴细胞，CD3+CD4+辅助/诱导T淋巴细胞，CD3+CD8+抑制/杀伤T淋巴细胞，CD3-CD19+B淋巴细胞，CD3-（CD16+CD56）+NK淋巴细胞，简称为TBNK，及CD3+CD4+CD25+CD127low/-调节性T细胞（Treg）[3]等。本共识中将TBNK和Treg统称为淋巴细胞亚群。血液肿瘤作为造血干细胞异常的恶性肿瘤，疾病的多种因素会影响免疫细胞的产生、增殖及分化，使外周血的淋巴细胞数量与功能产生异常[4]，导致免疫功能失调[5-6]，因此对血液肿瘤患者进行规范的淋巴细胞亚群检测十分必要。为了规范淋巴细胞亚群检测中的实验方案、技术操作，使更多相关领域的临床、科研和实验室技术人员认识到淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤患者诊断、预后评估、治疗指导中的作用及注意事项，进一步促进其在血液肿瘤中的应用，中国医药质量管理协会医学检验质量管理专委会结合文献学习和多家医疗机构的临床工作实践制定了本专家共识。 1淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中的意义 1.1 血液肿瘤的发生、进展、预后与免疫功能的关系正常情况下，免疫系统对肿瘤细胞有监视和清除作用，维持机体内环境的稳定。免疫功能异常可能会导致细胞免疫和体液免疫失调，从而为肿瘤的发生和发展提供条件[7-9]；在病原体感染时免疫系统也会受到影响，当免疫功能下降时，肿瘤发生的风险增加[10-11]。文献报道急性白血病、B细胞淋巴瘤等患者常见外周血T细胞数量及CD4+/CD8+比值下降，并伴免疫功能紊乱[12-13]。Treg的主要功能是抑制自身免疫应答，维持免疫平衡，避免过度的炎症反应和自身免疫性疾病的发生，在免疫系统中发挥重要的负向调控作用。在血液肿瘤中，Treg一方面可以通过抑制对肿瘤细胞的免疫反应来促进肿瘤生长；另一方面也可通过抑制炎症和防止可能导致肿瘤发展的自身免疫反应而发挥保护作用。研究发现，多种类型的血液肿瘤患者Treg数量呈现上升趋势，可能会导致肿瘤免疫逃逸的发生[14-15]。此外，一些淋巴细胞产生的细胞因子，如白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等，在血液肿瘤患者中异常表达，进一步说明了机体免疫功能异常和血液肿瘤之间关系密切[16-18]。近年来，一些新型的免疫治疗策略也在血液肿瘤的诊疗中发挥日益重要的作用，例如采用免疫检查点抑制剂、嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗、双重特异性抗体治疗等[19-22]，这些治疗手段主要是通过增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，来达到治疗目的。1.2 淋巴细胞亚群在血液肿瘤中的临床意义淋巴细胞亚群在血液肿瘤中的临床应用主要包括以下方面。（1）部分血液肿瘤的筛查。血液肿瘤包括多种类型，其中一些类型可表现为特定淋巴细胞亚群的增殖和分化异常，通过淋巴细胞亚群检测可以对这些类型的血液肿瘤进行初筛。如急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞增殖性疾病（CLPD）等[23]。（2）肿瘤复发及转移预警及预后评估。Treg在多种血液肿瘤中比例增加，可以通过抑制免疫细胞杀伤作用来帮助肿瘤细胞逃脱免疫监视，并且与恶性程度、转移倾向、复发率等预后指标密切相关[24-26]。（3）合并感染风险预警。（4）造血干细胞移植治疗患者的免疫重建评估与移植物抗宿主病（GVHD）预防。Treg可以作为急性和慢性GVHD的生物标志物[27-29]。（5）CAR-T治疗患者的规范化管理和评估。（6）靶向药物、免疫抑制剂和化疗药物的疗效监测，治疗指导[30-31]。 2 淋巴细胞亚群检测的主要方法和结果报告 2.1 外周血淋巴细胞亚群检测的主要方法淋巴细胞亚群主要通过FCM进行检测。根据中华人民共和国卫生行业标准（WS/T 360-2011）《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》[32]，FCM检测淋巴细胞亚群时，可以采用双平台法或单平台法。首选乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝真空管进行外周静脉血标本采集，并在24 h内进行检测。送检时间超过30 h应该采用肝素钠或枸橼酸钠抗凝，可在室温下稳定保存至48 h，若用双平台法，应采用同一标本进行白细胞计数和分类，则应该选择EDTA-K2作为抗凝剂。若送检时间超过48 h，应该使用流式细胞检测专用的样本保存液或样本保存管，可稳定保存至14 d。TBNK检测推荐的单抗为CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56，Treg检测的单抗为CD4、CD25、CD3、CD127。CD3+T细胞标记为CD3+，CD4+T细胞标记为CD3+CD4+，CD8+T细胞标记为 CD3+CD8+，B细胞标记为CD3-CD19+，NK细胞标记为CD3-（CD16+CD56）+，Treg细胞的标记为CD3+CD4+CD25+FoxP3+或CD3+CD4+CD25+CD127low/-。T细胞表面CD127的低表达与T细胞质内FoxP3的高表达具有良好的相关性[33-35]，且以CD127为标志进行检测方法明显优于以细胞质内FoxP3为标志的检测方法[36-38]，因此也可以使用CD127替代FoxP3进行Treg细胞的分析。上机检测前应采用配套的标准微球对仪器进行全程质控。推荐每管获取淋巴细胞数应不小于10 000个，得到的检测数据可通过调整荧光补偿、圈门等将各种不同表型的淋巴细胞亚群区分开[39-41]，进而得到各群细胞的相对比例及计算绝对数。推荐同时报告淋巴细胞亚群的百分比和绝对计数结果。2.2 外周血淋巴细胞亚群检测的结果报告通常应报告以下内容：CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞和NK细胞的相对计数（百分比）和绝对计数（绝对值）、CD4+/CD8+比值、Treg细胞占CD4+T细胞的百分比。2.2.1 外周血淋巴细胞亚群检测的参考区间近年来已有多篇文献发布了我国不同地区、年龄、民族健康人群的TBNK、Treg细胞参考区间[42-46]。在2023年2月中华医学会健康管理学分会发表的《TBNK淋巴细胞检测在健康管理中的应用专家共识》中公布了一项对我国九省（湖北、河南、广东、吉林、山东、山西、江苏、浙江、四川）20~60岁健康成人TBNK淋巴细胞参考区间的研究结果[45- 47]，可供参考，见表1。在2017年一项研究中发布了健康成年人外周血Treg细胞参考区间[48]，可供参考，见表2。由于Treg在多种疾病的临床治疗与疗效观察方面具有重要探讨价值，近年来许多国内实验室均报告了疾病观察组与健康对照组中外周血Treg细胞占CD4+T细胞的参考区间，如张宁等[49]报道了健康对照组参考区间为（4.52 ± 0.50）%，陈赛英等[50]报道了健康对照组参考区间为（6.85 ± 1.86）%，XU等[51]报道了健康成人的参考区间为（5.52 ~ 7.70）%，QIU等[52]报道了健康对照组参考区间为（5.70 ± 1.43）%。淋巴细胞亚群参考区间的建立受年龄、性别、种族、地域及仪器试剂等众多因素影响[47]，建议有条件的实验室可以针对本地区、本实验室检测体系等建立自己的参考区间及评价体系。调查健康人群淋巴细胞亚群的参考范围，建立95%可信区间的参考值区间，应满足每组至少120例健康样本数量[53]。此外，鉴于人员、仪器、试剂、方法、环境等诸多变化因素，实验室应对已建立的参考区间定期进行验证，每次验证应不少于20例健康样本，分布在参考区间外的测定值应不超过10%[32, 53]。若分布在参考区间外的测定值超过10%，则需要重新验证或考虑实验室分析程序、人群差异等其他因素。2.2.2 外周血淋巴细胞亚群检测报告的审核和发布进行淋巴细胞亚群检测的实验室都应该参加国家卫生健康委员会或省市级临检中心组织的室间质评，从而保证本室检测结果的准确性。在检测患者样品前，实验室人员应确认仪器状态正常和室内质控在控。在报告结果时，实验室人员要审核数据采集阈值的设置、抗体的组合方案、与实验结果相关的所有设门等，以排除样本异常和实验操作导致的检测结果异常。实验室人员还应根据检测结果的内部关系初步判断结果的可靠性。例如，数据应满足：CD3+% + CD19+% + （CD16+CD56）+% ≈（100 ± 5）%；CD4+% +CD8+% ≈ CD3+% （变化范围为5%~10%）[32]。若不满足，则需充分检查，必要时重复实验，在排除仪器、样品、操作等问题后如实报告检测结果，并需要重点分析该样本中是否存在异常表型的淋巴细胞，并用该样本制作血涂片镜检及进一步进行免疫分型对异常细胞进行鉴定，并及时与临床进行沟通。目前，由于国内没有针对Treg细胞检测项目的室间质评，因此应进行实验室间比对。 3 淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤患者中的应用 3.1 血液肿瘤的筛查当出现以下情况：（1）B或NK淋巴细胞显著增高；（2）CD3+CD4+CD8+T淋巴细胞或CD3+CD4-CD8-T淋巴细胞明显增高；（3）CD4/CD8比值大于10:1或小于1:10；（4）CD3+%+CD19+% +（CD16+CD56）+%明显大于或小于（100 ± 5）%、CD4+%+CD8+%明显大于或小于CD3+%（变化范围为5%~10%），在排除标本、仪器、设门、试剂及反应性改变等因素后，需要考虑标本中存在异常淋巴细胞，并结合临床进行血液肿瘤的筛查。血液肿瘤常见的淋巴细胞亚群改变见图1，血液肿瘤淋巴细胞亚群筛查与随访路径见图2。注：A表示T淋巴细胞群比例增高；B表示B淋巴细胞群比例增高；C表示NK细胞群比例增高；D、E表示同一患者T、B、NK三群淋巴细胞比例之和小于95%，存在不表达CD3、CD19、CD16和CD56的淋巴细胞；F表示CD4+T、CD8+T淋巴细胞群比例大致正常；G表示CD4+T淋巴细胞群比例降低，CD8+T淋巴细胞群比例增高；H表示CD4+T淋巴细胞群比例增高，CD8+T淋巴细胞群比例降低；I表示中CD4+CD8+T淋巴细胞群比例增高；J表示CD4-CD8-T淋巴细胞群比例增高。图1 血液肿瘤常见的淋巴细胞亚群改变注：A表示T淋巴细胞群比例增高；B表示B淋巴细胞群比例增高；C表示NK细胞群比例增高；D、E表示同一患者T、B、NK三群淋巴细胞比例之和小于95%，存在不表达CD3、CD19、CD16和CD56的淋巴细胞；F表示CD4+T、CD8+T淋巴细胞群比例大致正常；G表示CD4+T淋巴细胞群比例降低，CD8+T淋巴细胞群比例增高；H表示CD4+T淋巴细胞群比例增高，CD8+T淋巴细胞群比例降低；I表示中CD4+CD8+T淋巴细胞群比例增高；J表示CD4-CD8-T淋巴细胞群比例增高。注：MICM表示形态学、免疫学、细胞遗传学及分子生物学分型。图2 血液肿瘤淋巴细胞亚群筛查与随访路径3.2 血液肿瘤的复发、转移风险预警及预后评估当血液肿瘤患者外周血中出现CD4+和CD8T细胞减少，CD4+/CD8+比值降低，而Treg细胞明显增加时，提示肿瘤复发和转移的风险增加；CD3+、CD4+、CD8+T细胞的数量和比例与患者的完全缓解（CR）率、无复发生存期（RFS）和总生存期（OS）呈正相关，而Treg的数量和比例与CR率、RFS和OS呈负相关[54-58]。在急性髓系白血病（AML）患者中，NK细胞数量和比例与CR率、RFS、OS呈正相关[59]，NK细胞数量减少的AML和多发性骨髓瘤（MM）可能有更差的预后[60-61]3.3 血液肿瘤合并感染风险预警感染是血液肿瘤患者的常见并发症[62]，CD4+T淋巴细胞在免疫防御中发挥关键作用。当CD4+T淋巴细胞绝对计数＜500个/μL时，血液肿瘤患者机会性感染风险会大幅升高[63]。CD4＋T、CD8＋T淋巴细胞数量低下的淋巴瘤患者，化疗后感染风险明显升高[64]。初诊时Treg细胞比例升高的血液肿瘤患者，其住院期间感染率明显增加[65]。3.4 造血干细胞移植后免疫重建监测及GVHD预防3.4.1 移植患者免疫重建监测造血干细胞移植（HSCT）后造血能力持久恢复与免疫系统功能调节密切相关，主要表现为免疫细胞数量的增加和细胞功能状态的恢复[66-67]。免疫重建受移植物来源、移植物数量与组分、预处理方案、胸腺功能等众多因素影响，但自体造血干细胞移植和异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）患者外周血中TBNK、Treg细胞的重建规律基本相似。NK细胞恢复较快，一般移植后2~3周可恢复。CD3+CD8+T淋巴细胞一般移植后1~3月逐渐恢复，CD3+CD4+T淋巴细胞恢复通常需1年以上。CD3-CD19+B淋巴细胞移植后恢复时间不定，短至3个月，长至1年半以上。Treg细胞在移植早期通常比例非常低，移植晚期逐渐增多。3.4.2 移植患者GVHD预防GVHD是allo-HSCT患者需要面临的重要挑战。发生GVHD的患者，其疾病及移植相关死亡率大幅上升，尽早判断是否发生排异反应及抢先治疗是决定移植成败的关键。高炎症状态是GVHD的主要特点[68-69]。具有负调控炎症反应功能的Treg细胞随GVHD等级的增加呈下降趋势，有望成为预测急性GVHD（发生于移植后100 d内）和慢性GVHD（发生于移植100 d后）的特异性指标[70-71]。同时，植移后NK细胞迅速增加会促使炎症因子的大量分泌，从而促进急性GVHD发生[72-73]。因此allo-HSCT患者在早期植入阶段（输注后2~4周）、移植后早期阶段（输注后1~3月）、移植后晚期阶段（输注后3月以后）都建议行淋巴细胞亚群检测。3.5 CAR-T治疗患者的规范化管理和评估3.5.1 CAR-T细胞增殖监测CAR-T细胞免疫治疗目前已被用于治疗复发/难治性的血液肿瘤。定期监测CAR-T治疗患者体内的CAR-T细胞水平、肿瘤负荷、免疫功能（主要包括淋巴细胞亚群的比例和数量）和相关不良反应（细胞因子释放综合征、神经毒性等），是治疗后病情评估的重要手段[74-75]。患者回输CAR-T细胞后，可通过FCM监测外周血中CAR-T细胞的比例和数量，结果报告中一般包括总CAR-T细胞（占淋巴细胞）、CD4+CAR-T细胞（占T淋巴细胞）和CD8+CAR-T细胞（占T淋巴细胞）的比例和数量。有条件的实验室还可开展荧光定量聚合酶链反应法（qRT-PCR）监测CAR-T细胞增殖水平。多项临床试验数据显示，体内CAR‑T细胞增殖水平与疗效显著正相关[76-78]。3.5.2 淋巴细胞亚群监测淋巴亚群检测也被推荐与CAR-T细胞监测同时进行[75]。有研究通过检测患者CAR‑T细胞回输后第15天的外周血淋巴细胞水平，发现低水平的淋巴细胞数（血液肿瘤患者常伴有免疫功能失衡，细胞免疫功能往往处于免疫抑制状态，对突变细胞的识别和杀伤能力下降[94-95]。检测初诊时患者的淋巴细胞亚群，能有效判断患者免疫功能的初始状态。3.7.3 放化疗、免疫治疗及靶向治疗患者的淋巴细胞亚群监测与随访放化疗、免疫治疗及靶向治疗期间患者可呈周期性改变[96]，可通过检测患者每个周期治疗前后的淋巴细胞亚群变化，来评估患者治疗期间免疫功能恢复情况及肿瘤复发和转移的风险。建议有条件的情况下，可在治疗结束后半年内每3个月跟踪检测，半年后每6个月进行随访。3.7.4 造血干细胞移植患者的淋巴细胞亚群监测与随访建议造血干细胞移植后患者的淋巴细胞亚群检测时间可在移植后第14天、第21天、1个月、2个月、3个月、6个月、1年、2年随访[97-101]。3.7.5 CAR-T治疗患者的淋巴细胞亚群监测与随访建议连续监测患者CAR-T细胞回输前1天、回输后第4天、第7天、第14天、第28天外周血淋巴细胞亚群变化情况，及治疗后2个月、3个月、6个月随访。见图3。图3 血液肿瘤淋巴细胞亚群检测与随访路径图 4 结语随着流式细胞术的广泛应用，用于免疫功能评价的淋巴细胞亚群检测在临床已广泛开展，通过TBNK、Treg这些指标，可以评估血液肿瘤患者免疫状况，为疾病诊断、分型，治疗方案的选择、化疗后感染预防，疾病转归等提供实验室依据，以及为血液肿瘤患者的个性化治疗提供参考。机体免疫功能是动态变化的，由于受年龄、药物、感染、营养、生理等众多因素的影响，存在较大的个体差异。不同疾病状态下淋巴细胞亚群检测结果也可能呈现出较大的差异，因此在参考范围的建立、报告结果解读等方面依然存在挑战。针对血液肿瘤患者，临床工作中需要建立患者个体化的淋巴细胞亚群基线水平，动态监测淋巴细胞亚群结果的变化趋势，并结合多种免疫功能检测指标，综合分析患者的免疫状态，为临床决策提供更加全面的参考。淋巴细胞亚群检测在血液肿瘤中具有重要的临床意义和广泛的应用前景，本共识的发布将有助于推动淋巴细胞亚群检测临床实践中的应用，促进血液肿瘤的诊断、治疗和预后评估水平的提高，期望能够为我国血液肿瘤的精准诊疗做出贡献。专家组组长：杨再林（重庆大学附属肿瘤医院）、武坤（昆明医科大学第一附属医院）、刘耀（重庆大学附属肿瘤医院）执笔人（按姓氏汉语拼音排列）：陈双（重庆大学附属肿瘤医院）、程沈菊（昆明医科大学第一附属医院）、蒋亭亭（重庆大学附属肿瘤医院）、李轶勋（昆明医科大学第一附属医院）、刘耀（重庆大学附属肿瘤医院）、彭余（重庆大学附属肿瘤医院）、武坤（昆明医科大学第一附属医院）、杨再林（重庆大学附属肿瘤医院）专家组成员（按姓氏汉语拼音排列）：陈曼（北京陆道培医院）、陈朴（复旦大学附属中山医院）、池沛冬（中山大学肿瘤防治中心）、蒋能刚（四川大学华西医院）、李力（南部战区总医院）、李珍（南方医科大学南方医院）、李国盛（山东大学齐鲁医院）、李智伟（新疆维吾尔自治区人民医院）、刘耀（重庆大学附属肿瘤医院）、刘艳荣（北京大学人民医院）、马骁（苏州大学附属第一医院）、毛霞（华中科技大学同济医学院附属同济医院）、倪万茂（浙江省人民医院）、冉隆荣（重庆大学附属肿瘤医院）、任方刚（山西医科大学第二医院）、王卉（河北燕达陆道培医院）、王慧君（中国医学科学院血液病医院）、王剑飚（上海交通大学附属瑞金医院）、翁香琴（上海交通大学附属瑞金医院）、吴丽娟（西部战区总医院）、吴雨洁（江苏省人民医院）、武坤（昆明医科大学第一附属医院）、徐翀（上海市临床检验中心）、杨军军（温州医科大学检验医学院）、杨顺娥（新疆医科大学附属肿瘤医院）、杨再林（重庆大学附属肿瘤医院）、岳保红（郑州大学第一附属医院）、张爱梅（中国科学技术大学附属第一医院/安徽省立医院）、张会来（天津医科大学肿瘤医院）、赵明宇（重庆大学附属肿瘤医院）、朱杰（大连医科大学附属第二医院）、朱莉（华中科技大学同济医学院附属同济医院）、朱明清（苏州大学附属第一医院）、朱明霞（北京大学第三医院）、郑金娥（华中科技大学同济医学院附属协和医院）、周辉（湖南省肿瘤医院）利益冲突声明所有作者声明无利益冲突

澳大利亚研究人员开发出一种新设备，可以检测和分析血液样本中的癌症细胞，使医生能够避免采用侵入性手术检测癌症并监测治疗进展。相关研究发表于1日出版的《生物传感器和生物电子学》杂志。20世纪20年代，奥托沃伯格发现癌症细胞消耗大量葡萄糖，从而产生更多乳酸。此次新设备通过检测细胞周围酸性化的pH敏感荧光染料，来监测单个细胞的乳酸增加情况。一毫升血液中的数十亿个血细胞内可能存在一个肿瘤细胞，原本很难找到。但新检测技术有38400个小室，能够分离活性肿瘤细胞的数量。一旦识别出肿瘤细胞，科学家们就可以进行基因和分子分析，这有助于癌症的诊断和分类，并为个性化治疗计划提供信息。此外，循环中的肿瘤细胞也是转移的前兆，转移是90%癌症相关死亡的原因。研究这些细胞可以深入了解癌症转移的生物学原理，为新疗法提供信息。研究人员表示，准确的癌症诊断对有效治疗至关重要，但活检会给患者带来不适，也会增加手术并发症的风险和成本，通过评估血液样本中的肿瘤细胞来管理癌症，比组织活检的侵入性小得多。医生可以重复开展测试，并监测患者对治疗的反应。此外，最新技术不依赖高端设备和操作员，这将使医生能以经济高效的方式诊断和监测癌症患者。团队已为最新装置申请了临时专利，并计划将其商业化。

细胞培养基是人工模拟细胞在体内生长的营养环境，是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。培养液或培养基的含义几乎相同，英文都是medium。当它是粉剂时，倾向性地称为培养基，而将粉剂配成液体后，多称为培养液。培养液中常常补加血清、抗生素等成分。培养基主要包括天然细胞培养基、合成细胞培养基和无血清细胞培养基等。细胞培养基的质量标准和检测方法澄清度水是细胞培养基的溶剂。细胞培养基中的营养成分只有完全溶解于水才能被细胞吸收摄取，细胞才能生长增殖，因此细胞培养基是否溶解以及培养液是否透明澄清直接影响培养基使用。该项目是通过对水溶解后的细胞培养基的澄清度检查，判断细胞培养基的澄清度。 按中华人民共和国药典2005年版二部附录Ⅸ B进行。pH 值哺乳类动物细胞生长需要合适的酸碱度，pH过高或者过低都会导致细胞死亡。pH值的测定也可以检查细胞培养基的批间差。清大天一标准规定取规定量供试品，用注射用水（水温20℃-30℃）溶解至1L，加入规定量碳酸氢钠到上述溶液中，用与细胞培养基溶液pH值相近的两点标准缓冲液校准后的酸度计进行测定。按中华人民共和国药典2005年版二部附录Ⅵ H进行；加入规定量的碳酸氢钠到上述溶液中，按中华人民共和国药典2005年版二部附录Ⅵ H进行干燥减量的质量分数细胞培养基具有吸湿性，在空气中放置水分会很快升高，干燥减量的质量分数表示产品中含湿量。细胞培养基是有菌制剂，其丰富的营养成分有利于微生物生长，控制细胞培养基中的水分可以防止微生物的繁殖，保持细胞培养基的养分。按中华人民共和国药典2005 年版二部附录Ⅷ L 干燥失重测定法进行。渗透压溶剂通过半透膜由低浓度向高浓度溶液扩散的现象称为渗透，阻止渗透所需施加的压力，称为渗透压。细胞必须生活在等渗环境中，动物细胞借助K＋、Na＋维持渗透平衡。大多数细胞对渗透压有一定的耐受性。但是培养液渗透压过高容易使细胞脱水wei缩，培养液渗透压过低容易使细胞膨胀破裂，因此要控制培养基的渗透压范围。按中华人民共和国药典2005 年版二部附录Ⅸ G 渗透压摩尔浓度测定法进行。细菌内毒素细菌内毒素是许多病原性细菌所产生的毒素。它的特殊性在于不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有生物活性的物质。培养基细菌内毒素过高，对生物制品疫苗（如狂犬、乙肝疫苗）、基因工程药品等注射用的药品都需要检查细菌内毒素。 因此本项目的检验符合生物制品质量控制要求。常规细胞培养基的细菌内毒素标准定为＜10 EU/ml。称取本品规定量（见表4-12）的1/100，加入细菌内毒素检查用水10 mL溶解，吸取该溶液0.1 mL加细菌内毒素检查用水3.9 mL，混匀即得试样。按中华人民共和国药典2005 年版二部附录Ⅺ E 细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。微生物限度细胞培养基不是无菌产品，其中的微生物在一定条件下会吸收细胞培养基中的营养物质滋生繁殖，导致细胞培养基变质失效。控制细胞培养基中细菌和霉菌，是延长细胞培养基有效期的方法之一。清大天一在参考《中华人民共和国药典》2005版二部附录第100页的口服给药制剂的微生物限度标准，并严于该标准，规定细胞培养基产品的细菌数每1g不得超过200个，霉菌数每1g不得超过50个。称取样品1 g，加入无菌纯化水10 mL溶解，混匀即得试样。按中华人民共和国药典2005年版二部附录Ⅺ J 微生物限度检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数。检查法采用平皿法。细胞生长试验这是一个性能特性表述的要求。细胞培养基的功能就是培养哺乳类动物细胞，因此经过细胞培养效果的检验是产品质量优劣的直观表述，这也是很多生物制药用户要求的一项指标。目前国内尚无细胞培养和计数的法定方法，可参考《体外培养的原理与技术》中细胞计数fa论述的内容给出。按产品说明书配制培养液进行细胞培养，前四天用含10％小牛血清的培养液培养，观察细胞形态并计数，检查细胞培养基是否有促生长的能力。后三天用不含小牛血清的培养液维持培养，观察细胞形态并计数，检查细胞培养基中是否有不利细胞生长的毒素。本试验用细胞为VERO细胞。细胞培养液的储存，细胞培养液的储存条件一般为2－8℃、密闭、避光保存，但要注意如下几点：1） 过滤后的完全培养液，即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培养液要尽快使用，一般在2－3周内使用完。培养液中的L-谷氨酰胺是不稳定的，不同温度L－谷氨酰胺的降解。2） 灭菌后的未加L-谷氨酰胺等添加剂的培养基溶液，一般可在4℃保存6～9个月，也可冷冻保存，用时解冻3） 高压除菌后的培养基应置4℃保存，不能因为其可耐受高温而忽略储存温度。4） 添加某些生长因子、激素等添加物，可能会改变培养液的储存条件，比如温度、时间等方面的要求

光域生物医学完成数千万天使轮融资——自主知识产权的在体流式细胞检测技术（点击查看此前报道）光域生物医学宣布已经完成天使轮融资，由专业医疗投资机构苇渡创投独家投资。本轮融资资金主要用于研发投入和临床技术创新。公开资料显示，光域生物医学科技（苏州）有限公司成立于2022年4月，其核心技术是国际首创并具有自主知识产权的在体流式细胞检测技术，基于该技术可实现免抽血、实时、动态、连续、无创、定量检测/监测人体或动物循环系统中的细胞、分子、纳米颗粒等目标物质，获取多维度的科研或临床数据，直接反映人或实验动物体内环境真实的分子、生理、代谢、药物等方面的参数和状态，区别于传统离体检测方式。光域生物医学即将上市发布的IVFC-1000系列科研仪器将成为国际上首台基于IVFC技术的商用仪器，开创一项全新的活体细胞学检测方法，并具有完全自主知识产权。魏勋斌教授开发“体内流式细胞术”(IVFC)癌症是人类生命的巨大威胁，癌症转移是癌症患者死亡的主要原因。循环肿瘤细胞(ctc)是肿瘤转移的临床生物标志物之一。目前检测血液样本中ctc的体外方法都是基于ctc在外周血中的分布不随时间发生显著变化的假设 然而，最近的研究对这种方法的正确性提出了挑战。由于连续抽取患者或实验动物的血液，研究CTC计数的每日振荡是不现实的，理想的方法是在体内长时间监测CTC。在发表于《光科学与应用》(Light Science & Application)杂志上的一篇新论文中，以上海交通大学医学- x研究所和生物医学工程学院、北京大学生物医学工程系魏勋斌教授为首的一组科学家，和同事开发了一种非侵入性光学方法来监测异种移植瘤模型中的ctc。他们开发的光学系统被命名为“体内流式细胞术”(IVFC)，这与传统的“体外”流式细胞术不同，后者只能在体外检测荧光标记的细胞。在IVFC中，调整激光聚焦于实验小鼠耳的微动脉。当荧光标记的CTC通过光片时，荧光被激发并被光电倍增管(PMT)检测。为了说明这种光学结构的意义，血液循环中的ctc可以无创、反复、连续检测。“我们的IVFC技术不同于目前用于CTC检测的实验室或临床方法。操作系统不需要抽血。由于反复采血不会破坏生物环境，因此我们可以长期定期、无创地监测ctc。”他们说。通过这项技术，他们在前列腺癌原位小鼠模型中监测了24小时内不同癌症进展阶段的gfp表达ctc。在CTC计数方面，他们观察到，在夜间开始时，也就是啮齿动物的活跃阶段，每天都有惊人的振荡。在第6天、第12天、第18天和第24天用IVFC实时检测ctc，结果显示在转移性循环早期出现了明显的爆发活性。结果表明，前期爆发的概率高于后期。“这些发现可能会扩展我们对ctc和时间框架之间关系的理解。ctc并非全天均匀分布于血液中。他们在白天和晚上是不同的。提示昼夜节律可能调节CTC释放。临床检测ctc时应考虑到这一因素。”“ctc似乎比人们预期的更复杂。本研究为我们提供了一个影响临床CTC检测的潜在因素。了解CTC是否昼夜变化和爆发，从而加深对其分布规律的认识，是非常重要的。IVFC技术不需要在不同的时间点采血，重复的采血过程可能会改变生物环境。毫无疑问，我们越来越了解ctc和癌症转移。ctc的检测比以往任何时候都更加精确。”生物学家和临床医生说。用血管代替流动室，IVFC和FCM相似在使用这种类型的IVFC检测CTC之前，需要对感兴趣的细胞进行标记。 基于荧光的IVFC的基本原理与传统的FCM相似，只是使用生物体内的天然血管代替常规流式细胞仪中的流动室。 当荧光标记的细胞通过聚焦在血管上的激光束的狭缝时，可以激发它发射荧光。 然后可以通过PMT检测该信号（结构详见下图）。 因此，可以长时间获得生物信息而无需抽血。参考文献Wei Xunbin,Zhou Jian,Zhu Xi et al. A Noninvasive and Real-Time Method for Circulating Tumor Cell Detection by In Vivo Flow Cytometry.[J] .Methods Mol. Biol., 2017, 1634: 247-262DOI:10.1038/s41377-021-00542-5文献作者：魏勋斌，博士，博士生导师，博雅特聘教授，国家杰出青年科学基金获得者，SPIE（国际光学工程组织）Fellow（会士）。1993 年于中国科技大学物理系光电子技术专业获学士，1999 年获美国加州大学 Irvine 分校生物物理学博士，1999-2001 年在哈佛大学从事博士后研究。2001-2006 年任哈佛大学生物医学光学中心研究助理教授。2006 年回国，国内工作期间获得国家杰出青年科学基金、教育部新世纪优秀人才、科技部 973 国家重大基础研究计划、国家传染病重大专项、国家自然科学基金仪器专项、上海市领军人才、上海市优秀学科带头人、上海市曙光学者、上海市浦江人才计划等项目资助。共发表 NATURE、PNAS、NATURECOMMUNICATIONS 等 100 余篇，总影响因子400，他引 3600 余次。获得国家三类医疗注册证一项，国内外专利20 余项。1）可用于肿瘤光学早期检测的“在体流式图像细胞仪”； 2）在体肿瘤光学分子影像技术及近红外纳米光学探针技术； 3）活体光学细胞操纵技术研究； 4）激光医学与老年痴呆症的光治疗技术。

微流体装置中这些由碳纳米管做成的微型柱头，能够捕捉任何流经装置的癌细胞或其他细小物质。每个柱头直径为30微米。 　　一个由哈佛大学和麻省理工学院(MIT)组成的研究小组近日设计出一种小型装置，可检测出血液样本中的癌细胞，这项成果有望帮助医生快速判断癌症是否存在扩散迹象。研究报告发表在近期的Small期刊上。 　　这种微流体装置只有一枚硬币大小，但可以检测到包括艾滋病病毒在内的多种病毒。据领导该项研究的哈佛大学医学院生物医学工程教授梅米特托纳(Mehmet Toner)表示，这种装置的早期版本诞生于四年前，当时研究小组用硅制成一种微型柱头，将抗体涂在其表面，当病人血液流经这种硅柱，任何接触到柱头的癌细胞便能被抗体捕获。不过在当时，仍有一些细胞完全没有触碰到硅柱。 　　通过与MIT副教授Brian Wardle的合作，托纳的研究小组用碳纳米管代替硅，在这种装置中置入不同几何形状的碳纳米管簇(nanotube forest)，并且每根纳米管的表面都涂满可识别癌细胞的多种抗体，由于碳纳米管的优良吸附性能，使得含有癌细胞的血液样本能充分流经该装置，最终，这种经过改良的装置捕获癌细胞的能力相比之前提高了8倍。 　　使用碳纳米管的另一个好处还在于，研究人员可以通过改变纳米管的几何结构使这种装置能够捕捉不同大小的物质——大到癌细胞，小至病毒。 　　在因癌症死亡的人中，有90%是由于癌症扩散最终导致死亡的，而扩散中的癌细胞通常很难被检测到，这种微流体装置或有望改变这种现状。 　　目前，托纳的小组正在致力于对该装置进行设计调整，以期能检测出艾滋病病毒。(科学网 张笑/编译) 　　相关仪器：共焦显微镜 荧光显微镜 　　完成人：梅米特托纳课题组 　　实验室：美国麻省总医院生物微机电系统资源中心 麻省理工学院航空航天系

Innovations in Pharmaceutical Technology (IPT) 最近对话安捷伦公司的王小波博士，其中谈到了推动流式细胞术发展的需求，以及该技术未来可能的发展方向。 IPT：在过去十年中，流式细胞仪的应用是如何发展的？流式细胞术是一种强大的技术，用于定量检测悬浮液中单个细胞和其他颗粒的物理和化学特征，速度可达每秒数千个细胞。细胞通常被不同靶蛋白的荧光标记抗体标记，从而能够同时对单个细胞的多种胞外或胞内蛋白质进行多重给检测与分析。由于细胞正在被应用于如免疫疗法、细胞和基因疗法等疾病治疗的研究，因此流式细胞术提供的数据就变得越来越重要。当然，它也可用于分子生物学、细菌学、病毒学、癌症研究和传染病的监测。在过去的十年里，使用流式细胞仪的人变得越来越多，而如今，许多生物学实验室都在使用流式细胞仪。重要的是，该技术的革新使其变得更易于使用且更具性价比。因此，流式细胞仪逐渐成为许多公司的最大收入来源。IPT：哪些应用领域目前正处于增长阶段？流式细胞仪传统上应用于免疫学—也即是我们通常所说的对免疫细胞如淋巴细胞的研究。例如，它已被用于免疫表型分析：根据细胞表面的抗原或标记物使用对应抗体来识别细胞的过程，以分类和了解不同类型的免疫细胞。如今，流式细胞仪的应用在涉及药物开发的细胞功能检测中也很常见，如细胞增殖、细胞活化、细胞信号、细胞凋亡和细胞毒性等。例如，流式细胞仪可用于检测共培养实验中免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤。目前，流式细胞术在生物研究所涵盖的广泛领域有着丰富的应用。IPT：流式细胞术的使用是否还存在障碍？随着实验室拥有比以往更多的分析仪器，情况正在改善。设计实验、准备样品和运行流式细胞仪检测需要时间，特别是当科学家想要运行不同类型的检测时。此外，实验室想开展多色实验设计也很常见，其中20或30个荧光标记是正常的。因此，需要大量的时间和资源来进行数据分析，以获得实验结果中的生物学见解。好消息是，随着流式细胞仪的自动化程度越来越高，分析能力越来越好，这将帮助时间有限的实验室进一步优化工作流程。IPT：流式细胞仪性能方面有哪些最新的突破？除了使用更多的多色搭配方案，还有正在开发的新试剂，对靶抗原有更高的特异性和亲和力，改善了信噪比，以提高分辨率和更好的进行细胞分群，这使得实验室能够开展更加复杂的实验。我们现在能够在单次流式实验中检测数百万个单个细胞中40、50，甚至100多个分析物--这就是我们所看到大数据和人工智能发挥作用的地方。还有光谱流式细胞仪的面世，它可以检测荧光基团发出的整个光谱。与传统流式细胞仪中对一种荧光基团的单一波长范围检测相比，该技术在灵敏度方面有了进一步提高。IPT：流式细胞仪的未来是什么？流式细胞仪不仅需要继续发展紧跟细胞分析的需求，而且还需要让我们世界上的优秀科学家更容易使用它。在我从事这个行业期间，我看到了这个领域的积极变化；许多实验室现在都拥有流式细胞仪，使生物学家--无论他们是在大学还是在生物制药公司--都能使用这些强大的仪器进行前沿研究。流式细胞仪所涉及的仪器、试剂和软件的开发人员需要共同努力，继续保持这一发展趋势，以便在生命科学研究、疗法开发和临床诊断的背景下，在分析和理解复杂的细胞环境和过程方面实现全球性突破。我们终将见证，流式细胞仪作为世界上所有生物学家都可以使用的工具，将在推动生命科学研究、疗法开发和生产，以及临床诊断和预后方面发挥更重要的作用，最终促进医疗健康的进步。安捷伦流式细胞仪和实时细胞分析PLXA业务部总经理王小波王小波博士是细胞传感器、细胞处理和细胞分析技术相关生命科学工具领域的全球知名的专家和领导者。自2018年通过艾森生物被收购加入安捷伦以来，王博士一直在领导创新实时细胞分析平台和下一代流式细胞仪系统的开发和商业化。通过专注于满足细胞基因治疗和免疫肿瘤市场的客户需求，王博士带领团队实现了技术和解决方案在这些新兴和快速增长的市场中的渗透和应用。在加入安捷伦之前，王博士是艾森生物的联合创始人和首席技术官，他带领艾森团队开发了用于无标记、实时细胞分析的电子传感器平台以及NovoCyte流式细胞仪技术并实现了商业化。在创建艾森之前，王博士曾在AVIVIA生物科学公司担任过三年左右的研发高级总监。在此之前，王博士就职于美国德克萨斯大学MD安德森癌症中心。多年来，王博士发表了60多篇科学论文，在细胞处理、细胞分析和生物传感器技术等各个领域拥有50多项美国专利。

时间：2018年5月31日 19:30 - 20:30内容简介：骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes, MDS)是起源于造血干细胞的一组异质性髓系克隆性疾病，特点是髓系细胞分化及发育异常，表现为无效造血、难治性血细胞减少、造血功能衰竭，高风险向急性髓系白血病（AML）转化。在临床上，MDS与其他的髓系增殖性疾病的诊断与鉴别诊断是一个普遍的难点。随着各种检测技术在临床上应用不断深入，流式细胞术在MDS及相关疾病中的重要性日益突出。来自道培血液病医院的流式细胞术主任王卉老师，专业从事流式检测工作多年，在流式细胞术检测方面有着很深的造诣。主讲人简介：王卉陆道培医疗集团病理和检验医学科副主任，流式细胞室主任中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会第一届青年委员会委员，中国血液免疫学会流式细胞学组委员，中国医师协会检验医师分会造血与淋巴组织肿瘤检验医学专家委员会特聘专家，北京医学检验学会体液和血液学检验分会副主任委员，北京医学会医学细胞生物学分会委员。 从事临床流式细胞术检测和细胞分选16年，参与编写专业书籍8本（2本待出版）。擅长流式细胞术检测白血病、淋巴瘤、非造血系统肿瘤、微小残留病变等临床诊断。独立签发临床流式诊断报告十余万份，其中50%为来自全国各大医院会诊的疑难病例。

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p style=" text-indent: 2em " 在过去的一年中，循环肿瘤细胞(CTC)捕获和检测市场飞速增长，多个公司将此类技术推向临床并应用于癌症的诊断，与此同时，一大批新兴公司凭借其独有技术从科研机构中脱颖而出，开启了循环肿瘤细胞捕获和检测的商业化之路。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/80851a5e-ad37-4e21-86db-fe75c5d75d14.jpg" title=" 细胞.jpeg" alt=" 细胞.jpeg" width=" 419" height=" 279" style=" width: 419px height: 279px " / /p p 　　传统上，临床医生采用组织活检进行癌症诊断。但这种方法对患者具有侵入性，不仅耗时且价格高昂。在过去的十年中，液态活检技术的发展为这些问题带来了突破性的解决方案，并有望为不同患者的疾病提供了更加精准的个体化信息。 /p p 　　加拿大多伦多大学生物化学教授Shana Kelley一直致力于CTC捕获和检测技术的研究，她认为，“ strong 液体活检将有望带来一次彻底的模式转变，因为患者可以在接受治疗的同时以一种非侵入式的方式进行持续监测 /strong 。这样可以监测肿瘤的动态特征，帮助医生们制定更多治疗方案，而组织活检由于技术的风险和侵入性无法做到这些。”她还表示：“ strong 我们发现越来越多的技术能够在单细胞水平分析CTCs的基因型和表型特征 /strong 。考虑到这些细胞的异质性以及追踪患者样本中目标亚群微量水平的重要性，这一点极其重要。” /p p 　　一般而言，研究人员可以通过CTC的生物或物理特征(如基因表达、大小、密度、变形性或电荷)进行正向富集或负向富集，然后利用免疫、分子或功能性实验对这些细胞进行检测。虽然CTC富集和捕获技术前景广阔，但与利用ctDNA的液体活检技术相比，研究人员却遇到了挑战。 /p p 　　2017年发表在Cancer Discovery期刊的一项研究中，来自德国汉堡大学医学中心的Klaus Pantel及其研究团队对CTCs在液体活检领域的临床应用进行了研究，并指出了 strong CTCs应用的局限性 /strong ： strong 建立癌细胞系或异种移植需要成百上千个CTCs，这使该方法适用于极少数疾病的晚期患者身上 /strong 。作者还指出，对基于CTC生物学发现的新技术研发的关注，常常会延缓CTC检测进入临床诊断的进程。但研究人员也表示，有关CTC生物学的新研究已经开始衍生出“集CTCs富集、检测和定性于一体”的平台。 /p p 　　美国医疗和生命科学咨询公司Health Advances副总裁Kristen Amanti认为，CTCs临床应用的问题和障碍主要取决于如何使用这些细胞。“ strong 如果公司试图利用CTCs来进行癌症筛查，而不是监测已经被诊断出患有某种特定癌症患者的治疗，那么公司将面临更大的困难 /strong 。”Kristen Amanti说到，“如果没有针对特定类型癌症的筛查机制，那么在证明临床证据有效方面会很困难。如果你提前了解已有一个筛查机制，那你可能还要去证明你比这种筛查更好，或者能够提供某种经济优势。” /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(192, 0, 0) " 商业化进程加速 /span /strong /p p style=" text-indent: 2em " 虽然在临床开展上面临着不少障碍，但是CTC富集和检测的商业前景仍然十分强劲。2018年，多家公司都在CTC捕获和检测技术的临床转化方面取得了重大进步。 br/ /p p 　　美国Epic Sciences公司的CTC技术在2018年取得了一系列积极进展。2018年6月，Epic Sciences公司及合作伙伴发布了一项多机构队列研究，验证了基于CTC的AR-V7检测方法的有效性。根据该公司的信息， strong 这项研究是首个证实液体活检能够预测治疗效果并显示对患者具有生存受益的研究之一 /strong 。此外，Epic Sciences在2018年初时曾获得5200万美元E轮融资，目前该公司正在将其技术用于研究血液中肿瘤细胞和人类免疫细胞的综合分析，进而用于免疫治疗药物的研发和伴随诊断中。2018年11月，该公司还与加拿大四家乳腺癌治疗中心合作进行了一项临床试验，以检测其技术是否能预测转移性乳腺癌患者的复发风险。 /p p 　　与此同时，美国液体活检公司Celsee Diagnostics在CTC富集工具商业化方面取得了进展。在与单细胞诊断公司IncellDx达成一项可行性研究合作后，Celsee Diagnostics在2018年1月份签订了一系列产品的 strong 联合商业化协议，包括基于CTC的乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌和其他癌种的筛查产品 /strong 。 /p p 　　2018年5月，CellMax Life公司启动了一项美国临床试验，用于验证其基于CTC的结直肠癌筛查产品。该公司CMx平台目前只在亚洲销售，采用于一种“混合微流体芯片”，能够从10亿个正常细胞背景中分离出1~10个CTCs。CellMax Life还在2018年4月份与IncellDx达成合作，共同开发和和销售几种实体瘤的CTC检测产品，用于个性化治疗方案选择和监测。近日，CellMax Life还宣布，作为公司细胞疗法临床试验的一部分，公司已经与台湾Medigen Biotech公司达成合作。Medigen将结合Cellmax Life的CMx平台及其液体活检panel，用于患者的的治疗决策及疗效监测。 /p p 　　另一家计划进军CTC液体活检领域的公司是Precision for Medicine。2018年9月，Precision for Medicine收购了ApoCell公司及其ApoStream CTC富集技术。 strong 该技术可利用介电电荷差分离肿瘤细胞和正常细胞 /strong 。根据Precision for Medicine公司高级副总裁Darren Davis的说法，公司收购ApoCell主要在于其开发的一款基于免疫组织化学和免疫荧光成像的新型液体活检技术。 /p p 　　Vortex Biosciences也在推广基于CTC的VTX-1液体活检平台方面取得了进展。该公司在2018年3月份与BioView合作开发一种整合流程，以识别CTCs的临床生物标志物。2017年11月份，该公司和Stratec Consumables签订了一项供货协议，计划开发一款适用于Vortex平台的微流体芯片。该芯片最初由加州大学洛杉矶分校(UCLA)开发，新版芯片将帮助该平台适用于商业生产规模。此外，在2018年早些时候，Menarini Silicon Biosystems公司宣布已经将最近收购的技术整合到一款细胞型液体活检流程中，其中包含CellSearch CTC纯化工具。该公司表示，CellSearch strong 利用细胞外抗原表位和免疫磁珠，以一种自动化方法从血液样本中提取肿瘤细胞 /strong 。 /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(192, 0, 0) " 初创公司潜力巨大 /span /strong /p p style=" text-indent: 2em " 位于美国密歇根州的初创公司Akadeum计划通过公司的微气泡平台进入液体活检市场。公司称微气泡平台可以识别和分离CTCs和其他分子分离。目前Akadeum的这款工具只限于研究使用，与微流控芯片不同的是，该平台使用的是低密度的玻璃板和空气泡，气泡表面带有特定抗体，能够与靶细胞结合，然后“浮到表面”。Akadeum公司CEO Brandon McNaughton表示，该公司计划在未来两到三年内在全美国推广产品甚至销往国外。 br/ /p p 　　来自威斯康星大学的 Capio BioSciences公司也开发了一种类似的技术，名为CapioCyte。该技术整合了细胞滚动和多价结合功能。Capio BioSciences创始人Seungpyo Hong解释道，CapioCyte与其他CTC捕获技术不同之处在于，该技术结合了仿生学和纳米技术。癌症筛查和早期诊断是一个极大的市场，但Hong指出，每个患者的CTCs所呈现的高度变异数量和表型表明，CTCs的预后价值将在未来得到进一步探索。 /p p 　　除此之外，美国堪萨斯大学还在2018年5月公布了一项关于 strong 微流体平台的研究 /strong ， strong 该平台可以对包括多发性骨髓瘤在内的克隆性浆细胞疾病患者的循环浆细胞进行检测 /strong 。在堪萨斯大学大学化学与机械工程专业教授Stephen Soper主导下，研究团队在2016年创建了Biofuidica公司，进一步开发一款使用正弦微流控技术的诊断工具。 /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(192, 0, 0) " 学术成果不断涌现 /span /strong /p p style=" text-indent: 2em " 商业进程之外，关于CTC的学术成果在去年同样不断涌现。例如，来自加拿大英属哥伦比亚大学的研究人员便开发了一款 strong CTC富集系统 /strong 。研究团队认为，通过结合生物物理富集和激光捕获显微切割(LCM)，该系统在一定程度上克服目前液体活检技的局限性。在本研究中，课题组通过溶解红细胞从前列腺癌血样中富集CTCs，使用一种特殊的微流体细胞分类方法分离白细胞和CTCs。为了提取单个CTC用于激光捕获显微切割，研究小组通过免固定染色选择肿瘤细胞，将细胞样本嵌入水凝胶基质中，使细胞固定。随后，研究小组然后使用一款短距离散焦UV激光提取包埋的细胞。 br/ /p p 　　此外，在去年4月份，来自加拿大多伦多大学的一个研究小组发布了一项关于 strong mRNA细胞计数法的检测方法 /strong ，将CTC分离和基因表达分析结合起来。研究人员使用两种磁性颗粒，选择性杂交肿瘤细胞中mRNA的不同区域，帮助分离细胞并评估每个细胞中RNA的含量。研究小组利用免疫荧光法以及mRNA方法或EpCAM捕获法检测到CTCs。研究人员发现mRNA细胞计数方法能够同时提供CTC数量和临床相关mRNA的缺失或存在的准确情况。但研究小组表示，他们还将需要在CTCs含量较少的早期癌症患者中测试这种方法。 /p p style=" text-align: center " strong span style=" color: rgb(192, 0, 0) " 结语 /span /strong /p p style=" text-indent: 2em " 肿瘤液态活检的概念起源于CTC，相比ctDNA，发现较早却浮沉多年的CTC在几番打磨后逐渐发挥出自己的优势。借着二代测序技术的东风，ctDNA后来者居上占尽风头，但是CTC也完全没有落后。CTC分离和鉴定技术的发展使得相关研究再次成为肿瘤领域的焦点。如今，越来越多新的检测产品正在被使用，未来可能还会出现更多。随着更多数据的积累与临床证据的支持，液体活检的使用或将变得更加常规化。 br/ /p

高等植物和微藻能够利用光能将水和二氧化碳转化成淀粉等高能化合物，从而生产粮食和生物燃料。因此，高产淀粉细胞工厂的选育具有重要意义。目前，定量测定细胞中淀粉含量的方法通常包括破坏性的细胞处理过程、酶(或酸)介导的水解、水解产物的定量等多个环节，不仅需要大量细胞，且操作步骤繁琐、耗时耗力、成本较高，极大地限制了淀粉含量的高通量筛选。此外，传统方法通常无法检测自然界中大量存在的难培养微生物中的淀粉含量。 　　近日，中国科学院青岛生物能源与过程研究所单细胞研究中心助理研究员籍月彤、硕士研究生何曰辉等利用该中心研制的活体单细胞拉曼分选仪原型机(Raman-activated Cell Sorter，RACS)，通过单细胞拉曼光谱的快速采集和分析，发明了一种快速、非侵入性、不须标记、以单个活体细胞为单位的淀粉定量检测方法，为富含淀粉的种质资源选育提供了一种崭新手段。该工作发表在新一期的Biotechnology Journal上。 利用单细胞拉曼光谱技术在单个细胞精度定量监测微藻产淀粉过程 　　研究人员以478 cm-1拉曼峰强度作为细胞淀粉含量的定量标记对莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)以及工业常用藻株小球藻(Chlorella pyrenoidosa)进行了淀粉含量检测，证明该方法与传统试剂盒法测定结果相关系数(R2)达0.99。该方法无需破壁等繁琐预处理，信号测量时间仅需两秒，基本无耗材消耗，仅需个别细胞或纳升级样品。同时，该方法不需经过细胞纯化与培养环节，能将微藻种质淀粉含量筛选时间从几天缩短至几分钟。此外，该方法还能对难培养微生物资源进行检测并基于淀粉含量进行单细胞分选，从而极大地拓展了应用空间。 　　上述研究得到了科技部合成生物学&ldquo 863&rdquo 项目和中科院&ldquo 能源微藻生物炼制&rdquo 创新团队国际合作伙伴计划等支持，由徐健研究员和黄巍研究员共同主持完成，华东理工大学李元广教授团队也参与了该研究。

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到2020年，全球细胞检测市场有望从2015年的大约108亿美元增长到183亿美元，其中，2015年到2020年之间的复合年增长率为11.16%。细胞检测市场增长因素包括研发支出的增加，细胞检测越来越多的用于药物筛选，同时自动化和高通量技术的进展也有助于该市场的增长。　　研发支出的增加将有助于细胞检测市场的增长。生物技术和制药公司数目的增加也将有助于细胞检测市场在市场上主要份额的生长。全球生物制药行业，也是增长最快的领域，2014年的收入被估计为1630亿美元，占药品市场约20%。　　据医疗信息的IMS研究所估计，在预测期内(2014年至2019年)全球制药行业的复合增长率有望在7%和12%之间。制药和生物技术公司在药物研发方向投入的加大，预计将带动细胞检测市场。　　新兴市场的增长率预计将高达11%至14%，亚太地区有望见证这个行业最高的年复合增长率。随着新药研发项目支出的规模增大，较高的增长速度将成为细胞检测市场的重要驱动力。　　报告中的产品包括耗材、仪器、服务和相关软件。耗材细分为基础试剂、测定试剂盒、细胞系和微孔板。试剂和测定试剂盒进一步划分包括：报告基因检测、第二信使检测、细胞增殖检测、细胞死亡检测和其它检测。细胞系进一步分类为永生化细胞系、原代细胞系和干细胞系。在应用的基础上，报告分为基础研究、药物发现、预测毒理学、ADME研究和其他应用。　　2015年，药物研究占细胞检测市场的最大份额。预测毒理学被预计是2015年到2020年间增长最快的应用之一。　　报告中的地域包括北美洲、欧洲、亚洲和世界其余区域。在2015年，北美占有这个市场的最大份额，而亚洲被预计会以最快的速度增长。亚洲细胞检测市场的增长主要来自该地区日益增加的医疗支出和不断增长的人口两个因素。　　细胞检测市场的公司主要包括：BD(美国)，默克(美国)，丹纳赫(美国)，赛默飞世尔(美国)，珀金埃尔默(美国)，CST(美国)，CISBIO(法国)，DiscoveRx(美国)，GE(美国)和Promega(美国)。

直接测定DNA合成是细胞增殖检测的最准确方法之一，是测定物质毒性、评估药物安全评价、细胞健康的基本方法，其中以前常用的方式是利用胸腺嘧啶核苷酸类似物&mdash &mdash BrdU进行检测。因为在细胞周期的S期，和细胞一起孵育的BrdU能掺入DNA分子中，再结合BrdU抗体与渗入DNA的BrdU特异性结合，就能够检测到DNA复制活跃的细胞。 但BrdU有一大缺点，就是需要变性DNA后才能与抗体结合，但这就破坏了DNA双链结构，影响了其他染料的结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问题。哈佛大学医学院细胞生物学家Adrian Salic就认为：&ldquo 为了能够暴露BrdU的抗原表位，必须用高浓度的盐酸，乙酸或酶解，但经历了如此严重的处理后，细胞原本精巧细致的结构在显微镜下就变得惨不忍睹了。&rdquo 事实上，现在有一种新的检测方法能避免这种情况的发生&mdash &mdash EdU检测。EdU （5-乙炔基-2&rsquo 脱氧尿嘧啶核苷）也是一种胸腺嘧啶核苷类似物，但其连有的炔羟基团在天然化合物中很少见，在细胞增殖时能够插入正在复制的DNA分子中，基于EdU与染料的共轭反应可以进行高效快速的细胞增殖检测分析，可以有效地检测处于S期的细胞百分数。与传统的免疫荧光染色（BrdU）检测方法相比，更简单，更快速，更准确。EdU只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内更容易扩散，不需要严格的样品变性（酸解、热解、酶解）处理，有效地避免了样品损伤，有助于在组织、器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况，具有更高的灵敏度和更快的检测速度。Adrian Salic特别强调：&ldquo 与传统的免疫荧光染色不同，EdU反应能在几分钟内完成，且不需要进行严格的样品变性处理，使得组织成像更简单易行。&rdquo 细胞增殖检测方法基于EdU与Apollo？荧光染料的完美结合准确检测新合成的DNA，简单，快速，准确。这种检测方法非常快速，且只需简单的几个步骤，因此也适用于高通量筛选试验，如在药物筛选中检测加药后细胞的活力。 图1 BrdU 与EdU 检测原理示意图 表1 BrdU 与EdU 检测优缺点比较 图2 BrdU 需要DNA 变性后才能与抗体结合，导致BrdU、Hoechst 染色弥散，边缘模糊不清； 而EdU 边缘清晰完整，检测更灵敏、更准确EdU可以检测新合成的DNA，而EU则可以检测新合成的RNA。EU是一种尿嘧啶核苷类似物，能够在RNA转录时期代替尿嘧啶（ U ）渗入正在合成的RNA分子，基于EU与Apollo？荧光染料的特异性反应进行RNA检测。EU能够在体内和体外水平检测时间和空间上RNA合成的变化，能够更方便地研究RNA转录位点，结合相关抗体标记能够检测与RNA有相互作用的蛋白。结合EdU和EU进行检测新合成的DNA和新合成的RNA，可以深入开展细胞增殖、细胞周期、细胞毒性、DNA复制及修复、信号通路等方面的研究。

时间：2017年8月10日 19:30 - 20:30内容简介：细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从40nm到1000nm不等。细胞外囊泡广泛存在于各种体液中，由于其携带多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等物质，会参与到细胞通讯、迁移、免疫调节、组织再生等多种生理过程中，而成为目前的研究热点。对细胞外囊泡进行准确的定性、定量、分离及后续研究是目前主要的研究手段。目前关于细胞外囊泡研究的方法众多。而流式细胞术以其高速、高灵敏、高通量、多参数、可定量的特点，成为目前对细胞外囊泡的非常出色的检测方法。同时，带分选功能的流式也可以让您达到很好的分离效果。本次在线讲座，我们邀请了贝克曼库尔特生命科学部中国区流式产品经理周昱曦博士为大家介绍流式细胞术在微小颗粒检测方面的发展，以及使用流式细胞术对细胞外囊泡进行检测的流程介绍、优化以及相关的注意事项。主讲人简介：周昱曦 博士产品经理 贝克曼库尔特生命科学部贝克曼库尔特生命科学部中国区流式产品经理，负责非临床流式的产品管理工作。毕业于中山大学中山医学院。具有10年以上流式细胞分析、分选仪操作经验，从事流式应用支持、应用开发、市场推广超过5年。对科研流式应用及开发、仪器原理及特性拥有丰富经验。点击此处轻松报名。

Rzdeb / Istockphoto.红细胞（RBCS）是世界上输血服务所需的重要血液产品。遗憾的是，初始捐赠的血液，由于储存和输血袋限制了红细胞的寿命和降解，因此，其质量只能通过采样来确定。加拿大不列颠哥伦比亚大学的达纳迪瓦恩（Dana Devine）和同事推出了一种光学方法，采用拉曼光谱仪作为最佳的作业工具，可以对红细胞进行非侵入性检查。自20世纪80年代以来，在艾滋病毒/艾滋病发生严重问题之后，输血产品的安全标准有了很大的改进，但质量仍然可能是一个问题。因此，需要一种适当的分析工具，可以快速且容易地对红细胞和其他输血产品进行质量控制分析。主要问题是存储空间的劣化，称为“存储病变”的问题。这可能导致转发患者中的严重健康问题，如果他们首先需要输血，那么将面临多次问题。红细胞浓缩物通常可以在加拿大、英国和美国的血库中储存长达42天。在这些区域外，存储限制可能不同。来自一批单位的随机样品，通常在到期日期前检测溶血、血细胞比容、血红蛋白和残留白细胞（WBC）。然而，由于样品之间的个体和性别差异，某些单位的血液样品可能会在到期日之前长期退化。随着装置老化，造成葡萄糖浓度下降和乳酸浓度升高。因此，对这两种成分的分析可充当退化的代理。通过专注于三个特定的拉曼带 - 对于乳酸（857cm-1），葡萄糖（787 cm-1），溶血（1003 cm-1），团队发现，他们可以将这些分析结果与红细胞在储存和退化水平达到的时间匹配。该团队指出，允许空间偏移拉曼光谱（SORS）通过输血袋深入进入样品进行检测。虽然此前已经展示了这样的分析，但该团队现在再次验证了具有并行生物扫描所获取的光谱，允许它们揭示关注的适当频段。该团队写道，拉曼技术可有效地用于集中使用红细胞的单位、患者安全和库存管理的血液质量控制。他们专注的因素可能不会广泛代表需要输血的一般患者的问题，但对于需要输血的婴儿等一些非常关键的患者来说，它们却具有更为重要的意义。团队认为，“这种方法可以为更可靠地确定储存的血质保质期，为溶血和代谢物浓度的计算提供数据，并将为血液供应商提供质量控制和库存管理的互补手段，”。原始出版物：Vardaki, MZ, Schulze, HG, Serrano, K, Blades, MW, Devine, DV, Turner, RFB. Non-invasive monitoring of red blood cells during cold storage using handheld Raman spectroscopy. Transfusion. 2021 61: 2159– 2168. https://doi.org/10.1111/trf.16417符斌 供稿

密理博（Millipore）公司作为全球生命科学领域的策略性供应商，为生物科学研究和生物制药工业提供先进的技术、优化的工具和完善的服务。2007年12月4日，密理博率先发布“干细胞检测”产品。大量的密理博过滤类产品将通过验证而可用于干细胞研究，其中带Express PLUS膜的Stericup产品第一个通过该项验证。用上述产品过滤干细胞培养液，干细胞传代五次之后仍保持多能性而无不良影响。 Stericup过滤杯包括接收瓶和盖子，便于处理和储存。Stericup已经无菌处理为即用型，提供高速高通量过滤和低蛋白吸附，从而保证关键性生长因子不被吸收。若与Express PLUS膜和培养液同时使用，Stericup产品排除了过滤完全培养液时会去除重要因子或带入其他有毒成分的风险，从而为干细胞培养提供优化和经济的解决方案。Express PLUS膜孔径大小为0.22 μm，其不对称的孔状设计使得其过滤速度优于其他滤膜。 密理博成立于1954年，已经从一家卓越的过滤产品和服务的供应商成功转型为生命科学领域的策略性供应商。公司收购了Chemicon、Upstate、Linco和NovaSpetic AB等著名品牌。整合后的密理博为您提供创新的技术和更强的应用支持，使您的研发过程更加顺畅，实验结果更可靠。我们的科学家们深切了解生命科学研究的复杂性，能够帮助顾客解决他们在细胞生物、干细胞、蛋白质研究和细胞信号转导等领域所面临的巨大挑战。 了解更多产品信息请浏览密理博官方网站：www.millipore.com.cn；了解更多市场活动信息请浏览密理博中国主页：www.millipore.com/cn。或拨打密理博客户服务热线：400-889-1988。

在癌症诊断与治疗中，医生通常是利用活组织检查来进行确诊并跟踪治疗效果。这种方法不仅会给患者带来创伤，而且价格昂贵。循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell, CTC)检测打破了这一僵局。CTC是存在于癌症患者血液循环系统中的游离癌细胞，被认为是癌症生长、转移的一个重要因素。近年来，CTCs引发越来越多的研究者及商业公司的兴趣。 　　10月23日，在第三届&ldquo 千人计划&rdquo 创业大赛决赛上，美国泰勒影像生物技术有限公司创始人洪斌博士带来了关于CTCs的新项目&mdash &mdash 基于循环肿瘤细胞检测的快速、低成本癌症普查技术。生物探索记者对此进行了专访。 洪斌博士在千人计划大赛上展示自己带来的CTCs检测项目 　　循环肿瘤细胞，癌症无创检测新工具 　　对于科研及临床来说，CTC的概念并不陌生，早在1896年，澳大利亚学者Ashworth就首次提出CTC的概念。CTCs目前定义为自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。 　　大量实验已经证实CTCs检测有助于肿瘤的早期诊断、判断患者预后、评估抗肿瘤药物的疗效及制定个体化治疗方案。与其他组织学标本如骨髓等相比，外周血标本容易获得，且创伤性小，是临床上常规检测较为理想的标本来源。 　　但是，CTC在外周血中的数量非常稀少，仅占外周血白细胞的1/106-1/107，并且它是连续产生的，在血液中呈动态分布，会出现滞后现象，具有很强的异质性，因此CTCs的检测一直受到挑战。 　　新技术实现CTCs快速检测 　　洪斌博士带来的技术可以解决这一问题。洪博士曾在美国豁达斯派克生物技术公司及美国艾卫迪医学检测公司工作，主导过政府支持的循环肿瘤细胞检测项目。他说，CTCs的少是相对的概念，并不是所有样品中都会少，这是一个误解。以前是因为产品、设备不够好，检测不到，所以才叫&ldquo 少&rdquo 。现在已经证明了，很多样品检测水平是以前平台的30倍到100倍，这样就不能称作&ldquo 少&rdquo 了。 　　不同于常规的细胞学检测手段，洪博士使用的是专利技术，肿瘤细胞无需分离、无需洗脱特异性染色和高清成像，不会对细胞产生物理损伤，没有样品损失。同时，他们开发了非抗体染色剂，无论染色时间长短对正常细胞都不会产生非特异性染色，不会产生染色背景。整个检测过程只需10分钟，保证了癌症检测的准确度、灵敏度、特异性和方便使用。 　　既往研究表明，外周血CTCs存在于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、膀肌癌和卵巢癌等多种恶性肿瘤中，因此洪博士的这项技术几乎可以检测所有癌症&mdash &mdash 只要能产生CTCs。医院、体检中心、诊所、中心实验室进行癌症筛查、诊断和治疗评价时均可使用这项技术。 　　一年左右进入临床 　　对一项医学技术来说，大家最为关注的永远都是何时能够进入临床，真正应用到患者身上，尤其是与癌症相关的技术。洪博士表示，这项技术预计一年左右在中国进入临床，经过临床试验、注册证审批等程序，再过一年半到两年时间即可推向市场。 　　洪博士提醒，虽然这项技术很先进，但是它不能完全取代现有的癌症检测技术。放射、影像、病理检查等每项技术都有自己的优势，在某些情况下，CTCs快速检测技术能够取代传统检测手段，更多情况下，CTCs快速检测技术希望做到与传统检测手段优势互补，最终实现癌症的准确检测&mdash &mdash 这也是癌症检测的最终目的。 　　在查看介绍资料时，记者注意到该技术有&ldquo 床边&rdquo 、&ldquo 快捷&rdquo 字样，因此产生疑问，该检测方法有可能给患者在家里使用吗?洪博士说，该检测使用形式多样，可以在专业实验室使用，也可以在病人床边使用，但是建议医生在专业实验室使用，以方便结果确认。 　　洪博士计划首先将产品推向全国各体检中心。被问及在中国推广这项技术可能会遇到哪些挑战，他说，挑战肯定会有，毕竟这是一个新产品，但它并不是市场上第一个这种类型的产品。经过多年发展，市场已经认可CTCs检测相关产品，他们只要努力证明这项技术好在哪里就行了。 　　CTCs检测不是一件易事，中国十年前就有公司介入CTCs检测领域，因为难度太大，到现在鲜有成功者。或许接下来十年，这种情况会得到改观。随着检测技术的不断改进，检测手段敏感性与特异性的提高，CTCs检测必将在临床肿瘤诊治中得到更广泛的推广应用，CTCs检测也将在人类战胜肿瘤的征途上写下新的篇章。 　　美国泰勒影像生物技术有限公司创始人洪斌 　　洪斌毕业于南京大学、北京化工大学、美国路易维尔大学。曾在美国豁达斯派克生物技术公司担任高级研究员、项目主管，在美国艾卫迪医学检测公司担任研发主管。洪博士获得了美国普渡大学药政管理与质量监督职业资格认证，美国药监局药政管理培训资格认证，多项中美创新创业大赛大奖，并入选美国大学名人录。他发表第一作者SCI核心期刊文章十余篇，发明专利四篇、知识产权一篇，是生物传感器和医学检测领域著名期刊 Biosensor & Bioelectronics的特邀审稿人。

有了政府主导建立的检测平台，细胞治疗产品在安全性和质量上就能得到更好保障。最近，国内首个细胞制剂第三方检测平台在张江药谷建成，首个用户也已诞生——上海优卡迪生物医药科技有限公司与建设平台的上海市生物医药科技发展中心签约。这家企业有28条治疗肿瘤的CAR-T等免疫细胞产品研发管线，部分管线的质量检测业务和临床试验中第三方检测业务将交给平台完成。“CAR-T细胞、干细胞等细胞治疗技术在我国发展很快，但存在‘一抓就死，一放就乱’的问题。”优卡迪首席执行官俞磊博士说，“有了政府主导建立的第三方检测平台，企业研发的细胞产品在安全性和质量上就能得到更好保障，也让医院与企业合作开展临床试验时，多了一道保障，最终受益的是患者。”上海市生物医药科技发展中心还与上海医药行业协会、市药检院、市药审中心联合制定了团体标准《细胞和基因治疗产品快速无菌检查法的验证技术要求》，科济、优卡迪、药明巨诺等5家企业成为首批标准执行单位。其他一系列检测标准也在制定中。建平台规范细胞治疗产业细胞制剂检测平台是上海市生物医药产业技术功能型平台的一个模块。功能型平台属于新型研发机构，全名为“研发与转化功能型平台”，具有技术研发和科技成果转化两大功能。“十三五”以来，市科委会同市发改委、市经信委和市财政局，以完善产业链和创新链、强化创新策源功能为目标，推进建设了15个功能型平台。生物医药功能型平台位于张江郭守敬路，旨在适应创新药物的研发需求，对标国际顶尖技术团队，战略性布局并逐步完善生物医药全产业链“一站式”研发服务。近日建成的细胞制剂检测平台，就是为了满足创新药物的研发需求。“近年来，以CAR-T细胞、干细胞为代表的细胞治疗技术在全球快速发展。在上海，已涌现出一大批研发细胞制剂的创新型企业。”上海市生物医药科技发展中心主任李积宗说，这类技术在给肿瘤、免疫系统疾病、感染性疾病等患者带来希望的同时，也产生了一些安全隐患。与传统药物不同，细胞制剂是“活药物”，大多是为患者定制的，所以每份药的质量可能有差别，这就需要相应的标准来规范。细胞制剂检测平台工作人员在操作层析系统纯化仪器。如何进一步规范上海的细胞治疗产业？在市科委、市发改委、浦东新区和张江科学城的支持下，上海市生物医药科技发展中心将细胞制剂检测纳入生物医药功能型平台。这个子平台包含5个洁净标准的细胞房以及完善的微生物检测室、流式细胞检测室、内毒素检测室等单元，能满足细胞制剂质量评估的全套检测需求。国企联手民企组建专业团队建好功能型平台，除了一流的硬件设备，还要有运营平台的一流技术团队。为此，生物医药功能型平台采用“国有企业联手民营企业”模式，让运营整个平台的国企上海生物医药公共技术服务有限公司作为主要投资方，联手民企世翱（上海）生物医药科技有限公司，组建上海精检检测有限公司，由这家新公司运营细胞制剂检测平台。“我们的技术团队现有十多人，主要来自世翱。”精检检测总经理顾莉萍介绍，世翱从2014年起开展高端生物样品和生物材料检测，是国内最早从事干细胞和CAR-T细胞制剂检测的团队之一。CAR-T的中文名为“嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞”。T淋巴细胞具有免疫活性，好似人体内的军队，专门杀灭外来入侵者。CAR是一种分子修饰物，包含识别肿瘤抗原的抗体序列。它像卫星导航系统，使T淋巴细胞能准确识别并消灭肿瘤细胞。细胞制剂检测平台工作人员在检测CAR-T细胞体外杀伤功能。CAR-T细胞制剂中的T细胞取自患者体内，在体外完成修饰、扩增等工序后，再回输到患者体内。在这一“制药”过程中，确保细胞制剂的质量和安全非常重要。世翱建立了先进检测检验技术和规范体系，所以被功能型平台选中成为合作方。“我们要做上海细胞治疗的守门员，对上海企业研发或进入上海医院临床研究的细胞治疗产品进行质量检验，特别是产品安全性的检测和评估，以确保患者的安全。”顾莉萍说。把生物制药公司留在上海“20多年前，张江为生物制药公司落地提供了‘拎包入住’的早期创业环境。现在，张江开始提供产品中后期开发的平台服务，这样既能提高新药开发的质量和效率，又能把更多生物制药公司留在上海。”作为细胞制剂检测平台的首家用户企业创始人，俞磊感慨道。2015年，俞磊在张江药谷创立了优卡迪。2020年，优卡迪研发的“ssCART-19注射液”获批进入临床试验，目前处于Ⅱ期临床试验阶段。不同于已获批上市的同类进口药，这款治疗复发、难治型B淋巴细胞白血病的新药是第四代CAR-T产品，可突破性地用于CAR-T禁忌征——中枢神经系统白血病。与细胞制剂检测平台签约后，优卡迪将把部分产品管线的检测业务交给平台完成。这样可获得更具公信力的第三方检测报告，有利于通过药监部门的药品审评，也能降低患者在临床试验中面临的风险。上海泰槿生物技术有限公司也是功能型平台的重要合作伙伴，与细胞制剂检测平台在同一幢楼里，可谓“近水楼台先得月”。泰槿首席执行官李建良博士介绍，公司利用自建的全人源化转基因小鼠平台，专注于全人源单克隆抗体新药开发服务。“抗体类药物是生物药的一个主流类型，它们的适应征包括肿瘤、免疫系统疾病和感染性疾病。”李建良解释，“小鼠、兔子体内产生的抗体在用于治疗前，或组装成嵌合抗原受体前，要进行人源化蛋白质工程改造。而我们公司全人源化转基因小鼠平台产生的抗体，不需要进行改造。”生物医药功能型平台的流式细胞仪等仪器，泰槿都可使用。“买一台流式细胞仪要花几百万元，通过平台提供技术服务这种方式，能为我们节省很多研发成本。”李建良告诉记者，“而且研发抗体药物、细胞治疗药物的重点企业集聚在张江，我们依托功能型平台工作，与这些企业的合作就很便捷。”据了解，生物医药功能型平台已为一大批企业提供研发服务，除了细胞制剂检测，还包括细胞治疗产品制备、生物药中试工艺开发、创新药物制剂研发等模块，成为推动上海生物医药产业发展的重要力量。

当地时间10月7日，瑞典卡罗琳医学院宣布，授予威廉凯林(William G. Kaelin Jr)、彼得拉特克利夫(Sir Peter J. Ratcliffe)及格雷格塞门扎(Gregg L. Semenza)诺贝尔生理学或医学奖，以表彰他们在“发现细胞如何感知和适应氧气供应”领域的卓越贡献。我们都知道，这次诺奖的核心发现就是围绕HIF-1（低氧诱导因子）这条信号通路，小编在这里不再赘述这条通路伟大而精妙的丰富内核，而要强调的是，人类的多种疾病都和常氧/低氧的调节有关，比如恶性肿瘤，肾性贫血，损伤修复，循环障碍疾病等，这次的三位诺奖得主已经为我们发现并阐明了生物体启动氧感知的重要钥匙，而仍然有太多未知的关键节点等待同道中人去探索发现。常用的方法包括体外化学模拟和体外物理模拟，说白了就是给细胞加工具药物（例如CoCl2）或者是低氧环境培养。对于有些细胞模型或研究方向来说，低氧环境培养是必不可少的，然而往往很多实验室的低氧培养设备和其他检测设备是分家的，或者甚至缺少低氧培养的相关设备，给许多实验设计造成了不大不小的困扰。点点点点一下嘛解决方案靠谱的隆重介绍所以Cytation & Lionheart氧浓度可调节活细胞检测系统上图便是能够便捷控制CO2和O2的气体控制装置，在面板上可以方便设定CO2和O2的浓度范围，比如上图，O2的浓度已经从常规的20%降低到5%。是不是惊讶于她的轻盈体型？咱们就是这么节约空间资源有木有！当然，作为控制器，是需要和咱们的核心检测设备Cytation或Lionheart搭载使用的，这样就能够完美实现低氧环境控制和灵活多样的活细胞检测同步进行（传送门）。新鲜小案例：研究一下3D细胞球的缺氧变化此前我们已经介绍过非常多的3D细胞的应用案例，由于3D细胞能够更好地模拟体内细胞的微环境，因此针对3D细胞培养的缺氧水平下的研究需求也是非常多的。11个小时内，人源肝细胞球内的低氧水平逐渐增加（Cyto-ID Hypoxia 染料用于标记细胞内缺氧水平，红色荧光信号增加，表示细胞低氧状态加剧） 请向后滑动_____通过Gen5软件的细胞圈选识别，可以对Cyto-ID标记的细胞缺氧信号定量分析。_____这个图展示了不同的分析方式下的信号倍比变化，数据说明一切，咱们还是需要选择对合适的分析方法__________使用低亲和力球形96板 ，能够快速的构建3D细胞模型（相关案例传送门），接入CO2和N2后，通过气体控制装置设定CO2条件5%，氧气条件8%，放入细胞培养板，即可在长时间内实时监测细胞球的形态或其他需要检测的指标。来自霍普金斯医学院的案例首先，Dr. Gilkes团队在分子水平，研究了多种乳腺癌细胞系在低氧（1%）培养条件下的HIF-1和RohB的mRNA水平及蛋白水平的表达变化，在发现显著差异后，当然是要研究一下这个关键的RohB在活细胞水平，特别是3D细胞培养模型中， 如何影响肿瘤细胞的表型变化，于是，Cytation和Lionheart就发挥了重，要，作，用啦。__

近日，生物检测领域的新前沿技术——XCELLigence高峰论坛透露，作为生物检测技术领域的一项创新有望给中药检测提供可量化依据。 　　据了解，罗氏应用科学部最新的这一实时细胞分析系统为药物研发、毒理学、肿瘤学、医学微生物和病毒学研究分析应用，提供了一个无需标记、同时又可对细胞进行实时监测的新型细胞分析平台。尤其在现代中药的开发和药理机制分析的应用上，这一突破性的技术给中草药的发展带来了里程碑式的意义。 　　在高峰论坛上，浙江大学医学部柯越海教授还介绍说，中国传统医药与西方现代科学有了一个共通的、可量化的检验途径，也为传统天然药材的药效检测提供了新的依据。艾森生物科学公司总裁徐晓博士指出：“XCELLigence新技术使得研究者对癌症的了解更透彻，有利于最优化的药物研发，使癌症得到更好的治疗。”罗氏诊断应用科学部及分子诊断部总监郭伟立先生表示：“罗氏希望通过XCELLigence系统平台的不断完善，对无标记的动态细胞检测技术的发展起到更好的推动作用，从而为生物检测领域做出贡献。”

作为液体活检的重要标志物之一,循环肿瘤细胞(CTCs)在外周血中的含量可以用来辅助判断患者的癌症病发状况。除此以外,CTCs对于肿瘤细胞转移行为等基础研究也具有非常重要的意义。然而人体血液中的CTCs含量极其稀少,通常仅有0~10个/mL,与之相对,红细胞、白细胞和血小板的含量则分别达到5×109 个/mL、4×106 个/mL和3×108 个/mL,而且肿瘤细胞在转移过程中可以通过上皮-间质转化(EMT)和间质-上皮转化(MET)来不断地改变自身的特征。正是由于其稀缺性和异质性,以及血液中复杂基质的干扰,CTCs的精准检测成为巨大的难题。 由于常规的光学分析手段在检出限和灵敏度上均难以达到直接检测的要求,因此通常在进行外周血中CTCs的检测之前,要通过一些样品前处理方法来实现其分离和富集。常采用的样品前处理方法可以分为物理法和化学法,物理法主要根据细胞在物理特征上的差异来进行分离,例如膜过滤分离和密度梯度离心,就是分别依据细胞的大小和密度来完成筛选。化学法则主要依靠生物大分子的特异性识别作用,例如抗原抗体相互作用,核酸适配体与靶标的选择性结合。　　上述样品前处理方法虽然能够在不同程度上实现CTCs的分离富集,但也存在着一定的缺陷。由于这些方法都是非连续性的,在吸附、洗脱和转移的过程中难免会造成细胞的丢失,加之CTCs本身的稀缺性,很容易导致假阴性结果的产生。利用微流控芯片功能集成的特点则可以很好地解决这一问题,CTCs的捕获、释放、计数及检测等操作均可在芯片上完成,连续的自动化处理可以有效减少人为误差的干扰。此外,微流控芯片所需要的进样量非常小,可以大大减少珍贵样品和试剂的消耗,降低检测成本。并且在微尺度下表面力的作用会明显放大,可以有效提高物质混合和反应的效率,实现快速高效的分离分析。因此,近年来多项研究尝试利用微流控芯片平台开展CTCs分离检测工作,取得了良好的效果。本文对微流控芯片技术用于CTCs分离检测的相关研究进展进行了综述,将采用的分离方法主要分为物理筛选和生物亲和两大类,同时囊括正向富集和反向富集两种策略。此外,对于近期发展的芯片原位检测CTCs新方法也进行了介绍。　　1、CTCs分离芯片研究进展　　作为商品化较为成功的CTCs分离检测系统,强生公司的CellSearch产品采用的是基于上皮细胞黏附分子(EpCAM)抗体特异性识别肿瘤细胞的方法,类似的方法在CTCs分离芯片中也被广泛使用,可以视作利用生物亲和作用进行CTCs分离富集的代表。　　另一方面,依据细胞在物理性质方面的差异,无须生物标志物的条件下即可实现CTCs的筛选,其中有无外力介入的被动分离方法,例如利用微尺度下流体力学中的惯性效应和黏弹性效应来进行筛分。　　也有外加物理场的主动分离方法,诸如介电泳、表面声波和光镊技术等。除了直接对CTCs进行特异性识别实现正向富集外,也可以通过选择性结合诸如白细胞等干扰,再将其排除,从而达到反向富集的效果。　　2、、芯片原位CTCs检测　　对于CTCs的检测,通常采取先进行细胞染色,再用荧光显微镜观察的方法,但该方法在灵敏度上有待提高,且重现性较差,需要手动操作和人工计数。　　此外,以荧光光谱为代表,一些常见的光谱检测手段也被广泛应用在芯片上CTCs的检测中。　　除了光学分析方法外,研究人员通过使用传感元件实现了CTCs芯片检测结果的数字化直读或可视化分析。　　3、总结与展望　　本文对CTCs分离微流控芯片的技术原理、分离策略和研究进展进行了综述。其技术原理主要分为物理筛选和生物亲和两大类,分离策略分为正向富集和反向富集两个方向。同时,介绍了CTCs芯片原位检测的主要技术方法和优化策略。随着微流控芯片技术的快速发展,其微尺度流体操控、微结构加工和集成传感检测能力得到极大提升,进一步推动了CTCs分离微流控芯片技术的发展。多项研究显示,以微流控芯片为平台来分离检测外周血中的CTCs,可以充分发挥芯片本身微量、高效、易于自动化和集成化的优势,最终实现对临床血液中CTCs的快速精准分析,在肿瘤早期诊断、复发与转移监测以及抗肿瘤药物评价等多个领域具有重要的应用空间。　　现阶段,CTCs芯片在筛选精度和筛选效率方面仍存在较大的提升空间。针对这一挑战,由于精准与高效二者难以兼得,未来的芯片设计应该更专注于单个目标的实现。一方面,针对基础研究,应当注重于提高CTCs筛选的细胞纯度及细胞活性。可以先利用惯性效应对血液进行粗分离,筛分出尺寸较大的白细胞和CTCs。再采用液滴分选的方法,通过免疫磁性分离实现CTCs的精确筛选。液滴分选技术能够达到单细胞分析的精度,利用液滴分选进行肿瘤细胞筛选也已有文献报道。另一方面,针对临床检测领域,研究重点则在于实现临床样本的高通量分析。可以采用电分析方法,依据不同种类细胞的比膜电容和细胞质电导率差异来设置恰当的阈值,对流经检测窗口的CTCs实现快速分析。此外,微流控芯片技术属于多学科交叉领域,CTCs芯片的发展同时也受益于微机电系统(MEMS)、材料学、流体力学和生物医学等研究领域的技术突破。随着相关领域研究技术的发展,CTCs芯片未来有望成为肿瘤基础研究和癌症早期临床诊断的重要平台。

坊间指狗狗能透过嗅觉来侦测癌细胞，于是研究人员将灵敏的化学物质与光学探测器结合、制造出一种“电子鼻”，号称不只能让各种癌症现形，还可辨别该癌细胞是否具侵略性。 　　该仍在实验室阶段的电子鼻侦测系统，是由来自美国麻州大学(University of Massachusetts)的化学家，以及与乔治亚理工学院(Georgia Tech)的生物学家、材料学家的共同研究成果，他们希望能进一步开发出各种癌症通用的血液测试仪器。 　　“狗狗或许能侦测到癌症，不过牠们不会告诉你那是哪种癌症以及其危险程度 ”麻州大学的化学家Vincent Rotello表示 他正与研究教授、也是一位专长癌症检测的兽医Joseph Jerry一起工作。而为了要复制狗狗的能力并使其精确化，他们与乔治亚理工学院教授Uwe Bunz合作，打造了一种以金纳米粒子为基础的材料。 　　研 究人员发现，就像红、蓝、绿三原色可混合出各种色彩，不同种类的奈米粒子能混合在一起以覆盖整个癌细胞谱(spectrum) 而这种“类三原色 (RGB-like)」的发光奈米粒子，能与血液或组织样本混合在一起，然后包覆住可疑的细胞。根据那些被照亮的粒子结合状况，就能辨别那些癌细胞是否具 转移性。 　　Rotello表示，现在虽有针对特定癌抗原的血液检测方法，因而能发现前列腺癌等症状 不过这种测试无法辨别癌细胞是否具侵略性、以决定该如何处理：“我们的方案是第一次就能检测出各种癌症，以及其危险程度。” 　　下 一步，研究人员将把此检测方案，由动物实验(现在是用老鼠)阶段进展至人类血液的测试 “在人类的血液里有各种不同的、由各种器官蜕化(slough off)的细胞，能被分离与分析出来。”Rotello表示：“而我们就能利用我们的电子鼻来进行简易的血液测试，并检测出各种癌症。” 　　研究团队所开发出的聚合物涂层，又称做PPE (para-phenyleneethynylene)，当把纳米粒子表层的金取代时，就有发光的能力 当细胞附着在其上，就能用其产生的光谱来检测出细胞的种类。用激光就能使该种纳米粒子发光。坊间指狗狗能透过嗅觉来侦测癌细胞，于是研究人员将灵敏的化学物质与光学探测器结合、制造出一种“电子鼻”，号称不只能让各种癌症现形，还可辨别该癌细胞是否具侵略性。 　　该仍在实验室阶段的电子鼻侦测系统，是由来自美国麻州大学(University of Massachusetts)的化学家，以及与乔治亚理工学院(Georgia Tech)的生物学家、材料学家的共同研究成果，他们希望能进一步开发出各种癌症通用的血液测试仪器。 　　“狗狗或许能侦测到癌症，不过牠们不会告诉你那是哪种癌症以及其危险程度 ”麻州大学的化学家Vincent Rotello表示 他正与研究教授、也是一位专长癌症检测的兽医Joseph Jerry一起工作。而为了要复制狗狗的能力并使其精确化，他们与乔治亚理工学院教授Uwe Bunz合作，打造了一种以金纳米粒子为基础的材料。 　　研 究人员发现，就像红、蓝、绿三原色可混合出各种色彩，不同种类的奈米粒子能混合在一起以覆盖整个癌细胞谱(spectrum) 而这种“类三原色 (RGB-like)」的发光奈米粒子，能与血液或组织样本混合在一起，然后包覆住可疑的细胞。根据那些被照亮的粒子结合状况，就能辨别那些癌细胞是否具 转移性。 　　Rotello表示，现在虽有针对特定癌抗原的血液检测方法，因而能发现前列腺癌等症状 不过这种测试无法辨别癌细胞是否具侵略性、以决定该如何处理：“我们的方案是第一次就能检测出各种癌症，以及其危险程度。” 　　下 一步，研究人员将把此检测方案，由动物实验(现在是用老鼠)阶段进展至人类血液的测试 “在人类的血液里有各种不同的、由各种器官蜕化(slough off)的细胞，能被分离与分析出来。”Rotello表示：“而我们就能利用我们的电子鼻来进行简易的血液测试，并检测出各种癌症。” 　　研究团队所开发出的聚合物涂层，又称做PPE (para-phenyleneethynylene)，当把纳米粒子表层的金取代时，就有发光的能力 当细胞附着在其上，就能用其产生的光谱来检测出细胞的种类。用激光就能使该种纳米粒子发光。坊间指狗狗能透过嗅觉来侦测癌细胞，于是研究人员将灵敏的化学物质与光学探测器结合、制造出一种“电子鼻”，号称不只能让各种癌症现形，还可辨别该癌细胞是否具侵略性。 　　该仍在实验室阶段的电子鼻侦测系统，是由来自美国麻州大学(University of Massachusetts)的化学家，以及与乔治亚理工学院(Georgia Tech)的生物学家、材料学家的共同研究成果，他们希望能进一步开发出各种癌症通用的血液测试仪器。 　　“狗狗或许能侦测到癌症，不过牠们不会告诉你那是哪种癌症以及其危险程度 ”麻州大学的化学家Vincent Rotello表示 他正与研究教授、也是一位专长癌症检测的兽医Joseph Jerry一起工作。而为了要复制狗狗的能力并使其精确化，他们与乔治亚理工学院教授Uwe Bunz合作，打造了一种以金纳米粒子为基础的材料。 　　研 究人员发现，就像红、蓝、绿三原色可混合出各种色彩，不同种类的奈米粒子能混合在一起以覆盖整个癌细胞谱(spectrum) 而这种“类三原色 (RGB-like)」的发光奈米粒子，能与血液或组织样本混合在一起，然后包覆住可疑的细胞。根据那些被照亮的粒子结合状况，就能辨别那些癌细胞是否具 转移性。 　　Rotello表示，现在虽有针对特定癌抗原的血液检测方法，因而能发现前列腺癌等症状 不过这种测试无法辨别癌细胞是否具侵略性、以决定该如何处理：“我们的方案是第一次就能检测出各种癌症，以及其危险程度。” 　　下 一步，研究人员将把此检测方案，由动物实验(现在是用老鼠)阶段进展至人类血液的测试 “在人类的血液里有各种不同的、由各种器官蜕化(slough off)的细胞，能被分离与分析出来。”Rotello表示：“而我们就能利用我们的电子鼻来进行简易的血液测试，并检测出各种癌症。” 　　研究团队所开发出的聚合物涂层，又称做PPE (para-phenyleneethynylene)，当把纳米粒子表层的金取代时，就有发光的能力 当细胞附着在其上，就能用其产生的光谱来检测出细胞的种类。用激光就能使该种纳米粒子发光。

当前，在细胞或亚细胞水平的分子分析，即无论是被选择的分子分析或是细胞代谢物的分析，对于相关研究人员而言依然是一项挑战。而为了更好地了解复杂的生物现象（例如：生物体系的差异性可能导致在不同的细胞之间，甚至是不同的亚细胞区室之间产生一个代谢物梯度），科学家们需要开发可以在细胞水平检测代谢物的方法。现有的一些方法虽然有其各自突出的优势，但也依然存在一些局限。例如：荧光显微镜的检测能力依赖于所使用的分子探针，这可能会导致一个较低的方法特异性。此外，对一个给定分子进行荧光标记，很可能对它的位置和生物功能产生影响。近些年，基于质谱技术的单细胞分析方法也开始逐渐发展起来（包括：MALDI-TOF和二次离子质谱 SIMS），它们无需荧光标记，尤其适于未知分子的检测。但是这两种方法通常需要真空条件，从而很难进行活细胞检测。此外，科学家们也在尝试使用激光剥蚀电喷雾离子化质谱进行单细胞分析工作。 最近，清华大学张新荣研究组开发了一种基于探针电喷雾质谱技术（PESI-MS）的单细胞检测方法，成功实现了在细胞和亚细胞水平的代谢物检测。他们将一种针尖直径约为1微米的钨探针插入活细胞以富集代谢物。而被富集的代谢物从该探针的针尖上可以被直接解吸附/离子化，从而极大地改善了检测灵敏度。较之其他需要预先洗脱被富集分析物的方法，该方法的灵敏度提升了约30倍。这一方法目前已被初步应用于单个洋葱细胞代谢产物的检测。

时间：2018年11月1日 19:30 - 21:00内容简介：淋巴瘤是发生于淋巴结和/或结外淋巴组织的一组造血系统恶性肿瘤，不同类型的淋巴瘤在临床病程、治疗方案及总体预后方面具有很大的差异性，因此准确的诊断及分型至关重要。但淋巴瘤的确诊和分型则必须依赖免疫表型的检测分析。那流式细胞学是如何检测免疫表型的？在淋巴瘤诊断中具体有何应用？结果如何判读？检测过程又是怎样的呢？此次讲座，我们非常荣幸的邀请到了上海瑞金医院血液学研究所流式细胞室负责人翁香琴老师，主要围绕《流式细胞学在非霍奇金淋巴瘤诊断中的专家共识》，给我们分享一下流式细胞学在淋巴瘤检测中的应用。主讲人简介：翁香琴 上海瑞金医院血液学研究所流式细胞技术平台 助理研究员遗传学专业，助理研究员，2003年开始负责上海瑞金医院血液学研究所流式细胞技术平台。 主要研究方向：多参数流式细胞术在血液系统肿瘤诊断及MRD监测中的应用，并以第一作者身份发表相关SCI论文数篇。参与执笔撰写《流式细胞学在非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用专家共识》和《多参数流式细胞术检测急性白血病及浆细胞肿瘤微量残留病专家共识》。 担任中华医学会免疫学分会流式细胞学组全国委员。

五月的天气多了些燥热，空气里弥漫着太阳爆裂的味道，贝克曼库尔特的细胞外囊泡研讨班活动正在武汉、成都和深圳如火如荼的展开。具有双层膜结构囊泡状异质性群体的细胞外囊泡，参与多种生理和病理过程，细胞外囊泡研究显示出巨大的临床应用前景，来自美国哈佛干细胞研究所的Vasilis Toxavidis和美国哈佛医学院贝斯以色列女执事医学中心的John Tigges，两位有着丰富的流式细胞术和外泌体研究经验的学者辗转三地，和当地优秀的科研工作者们面对面的交流，迎来了一场场流式细胞术与细胞外囊泡研究的学术盛宴。5月24日 武汉站 武汉是细胞外囊泡检测研讨班第一站，九点的江城正为繁忙的道路拥堵而苦恼，前来听课的老师络绎不绝，早早赶到会场等待。在酷炫的武汉生物技术研究院的报告厅里，Vasilis和Toxavidis分别作了检测囊泡流式性能分析和流式检测细胞外囊泡的经验分享，贝克曼库尔特公司的全国离心机产品经理霍德华和流式应用专家刘飞分别介绍了超速离心技术及流式细胞术在外泌体研究中的经典应用。一张张投射在液晶屏上的PPT画面， 让听课老师们都表现出极大的热忱，流式与囊泡研究的碰撞，激发出思想的火花。下午的实验部分，各位老师利用CytoFLEX流式细胞仪，直接体验了一把将理论转化为实验结果的惊喜。5月26日 成都站天府之国的成都是研讨会的第二站，原本容纳一百多人的香格里拉酒店演播厅却提前出现“人满为患”的状况，后来不得不在走廊上额外添加座位。上午四场讲座，两位美国专家Vasilis Toxavidis和John Tigges的演讲引来台下老师阵阵掌声，大家踊跃提问解除心中疑惑；华西医院莫显明主任和张文庚副主任结合自己实验室优势分别作了标准化流式细胞术和肺单细胞图谱研究现状与发展的报告，将活动推向了高潮，在座的老师们深深体验到流式的博大精深。而下午的圆桌讨论，老师们根据自己的研究领域，参加不同的讨论小组，交流了解流式细胞术在不同领域的应用，老师们在热烈讨论中收获了满满的流式干货。5月28日 深圳站“长风逐细浪，大鹏入九天”，活动的最后一站来到了珠江三角洲的经济与科技前沿阵地深圳，世界瞬息万变，科学研究日新月异，促进了当地老师们对新技术的渴望。在深圳麒麟山庄报告厅，Vasilis Toxavidis和John Tigges介绍分享了利用流式手段检测100 nm的外泌体，让大家对流式技术又有了深入的认知，为大家打开了流式检测外泌体的大门。来自南方科技大学的黄巍副教授从es细胞转移研究的角度介绍了相关流式应用，南方医科大学的郑义教授则从干细胞研究角度介绍了流式的应用，贝克曼库尔特CytoFLEX系列流式细胞仪以其高灵敏度高分辨率成为广大研究者的不二之选。三场细胞外囊泡学术活动场场爆满，座无虚席，大家在轻松愉快的环境里领略了流式技术不同的风景，了解了贝克曼库尔特流式细胞仪在微颗粒检测中的独秀之美。此次活动的圆满结束，更加激励贝克曼库尔特坚定根植于广大客户的科研需求，不断发展创新，来年我们再约！* CytoFLEX流式细胞仪仅用于科学研究，不用于临床诊断。

p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201708/insimg/8285de06-fab1-432b-acd4-3147494e96d5.jpg" title=" tpxw2017-08-10-03_副本.jpg" / /p p 　　在国家自然科学基金重大研究计划、国家杰出青年科学基金项目和面上项目的资助下，华东理工大学杨弋教授团队开发了一系列特异性检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的高性能遗传编码荧光探针iNap，相关研究成果以“Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism”(遗传编码的荧光探针揭示NADPH代谢的动态调节)为题于2017年6月5日以“研究长文”的形式在线发表在Nature Methods，2017年7月28日正式刊出。陶荣坤博士、赵玉政研究员和初环宇博士为共同第一作者。华东理工大学杨弋教授和中国科学技术大学刘海燕教授为文章的共同通讯作者。 /p p 　　烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH/NAD+)及其磷酸化形式(NADPH/NADP+)，作为生物体内两对最重要的辅酶和核心代谢物，常被用作评价细胞代谢状态的关键指标，与衰老及相关疾病如癌症、糖尿病、肥胖症、心脑血管疾病、神经性退行性疾病等的发生发展密切相关。长久以来，细胞代谢的检测主要依赖酶学、色谱、质谱等，这些方法不仅破坏了细胞或生物体的完整性，更难以应用于高通量筛选。为了解决这一重要科学难题，2011年，杨弋教授团队利用合成生物学方法开发了一系列遗传编码的NADH荧光探针，实现了在活细胞及各种亚细胞结构中对NADH分子的实时动态、特异性的检测与成像(Cell Metabolism, 2011, 14, 555)。2015年，该团队又报道了可同时检测NAD+，NADH及其比率的第二代细胞代谢荧光探针NADH氧化还原比率探针(SoNar)，像火眼金睛一样，可察觉到癌细胞与正常细胞的微细代谢差异(Cell Metabolism, 2015, 21, 777)。并进一步建立了细胞代谢荧光探针在单细胞、活体动物成像及高通量药物筛选方面的系统研究方法(Nature Protocols, 2016, 11, 1345)。 /p p 　　NADH和NADPH的荧光光谱相似，但是二者的生理功能却显著不同。NADH主要参与物质能量代谢，而NADPH主要参与合成代谢以及抗氧化，传统的自发荧光分析方法很难区分这两种小分子。该研究团队在第二代NADH荧光探针SoNar的基础上，通过对底物结合蛋白的理性设计和改造，开发了一系列高性能遗传编码荧光探针iNap，特异性检测NADPH，实现了在活体、活细胞及各种亚细胞结构中对NADPH代谢的高时空分辨检测与成像。该研究首次报道了癌细胞内不同亚细胞结构中游离的NADPH水平，发现了氧化应激时癌细胞内NADPH代谢受葡萄糖水平动态调节。研究团队也进一步发现人体内源性类固醇激素DHEA通过抑制G6PD活性和激活AMPK活性，对NADPH代谢实现双向调节作用。鉴于AMPK信号通路在衰老、糖尿病、肥胖症以及癌症中的重要角色，这一研究结果有望破解DHEA作为一种药物和膳食补充剂在这些疾病方面发挥出的有益作用。NADPH作为细胞内的还原力，在生理或病理条件下发挥重要角色。该研究报道的细胞代谢荧光探针iNap，不仅可应用于抗氧化、AMPK、脂肪酸合成等代谢途径与通路分析，也可用于衰老及相关疾病创新药物的发现。 /p