电转染仪原理

6、电转染试剂的选择电击会对细胞造成一定程度的伤害，在转染试剂的选择上要注意，应选择具有细胞膜修复成分的电转染试剂，如Entranster-E，将电击对细胞的损伤降到最低。

1、 电场参数电场是电转染的重要因素，细胞在电场的作用下，膜通透性增加或是形成小孔，以完成转染过程。因此电场强度是应该被优化的主要参数。电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。因此，一个适宜的电场强度至关重要。不同细胞系具有不同的最佳场强值，其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外，还可以采取较为简便的间接法。文献显示存活率在50%左右的电场参数为理想参数，故可间接测定存活率来确定最佳场强值。

2、脉冲过程1）脉冲波形脉冲波形主要分为两种：1、方波脉冲；2、指数递减波脉冲。方波脉冲是指：电压瞬间升至预设电压，保持电压放电，然后瞬间终止放电。一般哺乳动物细胞电转染时选择方波脉冲，有较高的转染效率和细胞存活率。指数递减波脉冲是指：先对电容充电，然后让电容完全放电，其电压变化呈指数递减。一般这种波形的脉冲电转染适用于细菌、酵母菌、昆虫细胞。2）脉冲时间脉冲时间的选定主要取决与脉冲波形。在方波脉冲中，脉冲时间可直接设定。在指数递减波脉冲中，脉冲时间是指电压衰减至初始电压1/3时所用的时间，等于电容（C）与电阻（R）的乘积，单位是ms。在参数优化中，增加电压应当降低脉冲时间，而减小电压则应当增大脉冲时间。3）脉冲次数一般而言，对于大多数细胞类型都选择单次脉冲。而在有些情况下可能会用到多次脉冲，因为低电压、短脉冲时间、多次脉冲可有效避免细胞损伤。多次脉冲建议中间间隔1min。

4、 质粒因素从质粒浓度看，细胞密度为1*106/ml，DNA用量在2-5ug/ml转染效率最高。转染率在一定一定范围内随质粒浓度的上升呈线性增高，但是到达一个峰值后，随DNA用量增加而转染率逐渐下降，其原因可能为细胞吸纳DNA有一个饱和度，过量便会产生毒性，使存活率降低，不利于转染率提高。进行小分子量的分子转染时（siRNA/miRNA），应使用高电压、短脉冲时间。大分子量分子转染时（DNA），应使用低电压，长脉冲时间。从质粒的纯度看，用高纯度的DNA才 能提高电转的效率，且应注意以下几点：首先DNA／RNA应该超纯(A260／A2801．8)，其次应不含内毒 素，同时质粒应溶于双蒸水而不是TE缓冲溶液。

3、细胞因素用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2d）。因为处于对数生长期的细胞分裂旺盛，表面结构致密比稳定期的细胞差，电转后，细胞膜的恢复能力强，而且处于有丝分裂期的细胞更容易接受外源DNA.细胞悬液浓度一般为1*106/ml，当细胞生长密度大于3*106/ml，转染效率会下降。原因除了细胞老化外，细胞过密会使相邻细胞相互作用增大，甚至使细胞相互融合，从而导致电场的局部微扰，使电场环境无法均一化，细胞体积越大对电击越敏感，所需电场强度也越小。

5、 温度 一般情况下，电转的过程是在室温下进行，但在 电击前后可对细胞进行冰浴处理。电击前冰浴的时间对转染率影响不大，但低温环境能够防止DNA被外源性DNA酶降解，并限制在电击中因Joule作用而产生的不良反应，因此，实验一般选择电击前冰浴5min。电击后冰浴，会影响DNA摄入，因为电击后冰浴可增强细胞收缩，细胞膜上的 电穿孔封闭较慢，延长外源性DNA摄入时间，从而提高其摄入量。在室温环境下，虽然细胞膜上的孔 封闭速度快，但在随后2h，质粒还可通过电内化进入细胞，因此摄人量不一定比4℃环境下低。而且，室温下细胞在5 min内即闭孔，在4℃的环境下穿孔状态可保持4h，穿孔封闭缓慢降低了存活率，同时细胞在低温下更容易受到损伤。因此，综合考虑摄人量和存活率，大部分文献倾向于电击后细胞仍在室温或37℃下保存。

[font=宋体]哺乳动物细胞表达系统具有促使蛋白正确折叠和实现复杂修饰的功能，表达的蛋白更近天然状态，能够运用于制药等活性要求高的领域。利用哺乳动物细胞表达系统生产蛋白通常有两种方式：瞬时转染与稳定转染（构建稳定细胞系），这两种方式在原理、操作流程、应用场景上均有所区别，本文主要就瞬时转染与稳定转染之间的区别做一介绍。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]瞬时转染与稳定转染实验原理的异同：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]瞬时转染与稳定转染都是将目的基因转染至特定哺乳动物细胞内，进而表达得到目的蛋白。不同的是瞬时转染的方式外源基因并没有转染到细胞的染色体上而是存在于游离的载体上，这样可以在短时间内获得基因的表达产物，但是随着细胞的不断分裂增殖外源基因最终会丢失，无法继续进行重组蛋白的生产；而利用细胞稳定转染则会将外源基因转染至细胞染色体上，目的基因不会随着细胞传代而消失，稳定转染的细胞株能够长期稳定的生产目的蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]实验操作的差别：[/b][/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]瞬时转染与稳定转染所用的质粒是不同的，瞬转的质粒不需要带有抗性，而用于稳定转染的质粒一定要带有特定的抗性以便于后续的克隆株筛选。另外，两者所用的培养基及实验试剂也有所区别。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]瞬时转染的操作比构建稳定细胞系的操作简单，构建好质粒后，经过细胞复苏、转染、细胞培养、蛋白纯化等步骤即可得到目的蛋白；而构建稳定细胞系需要先将构建好的质粒线性化，再导入培养好的哺乳动物细胞内，通过一定的转染方式实现质粒与细胞的融合，接着经过细胞池筛选、单克隆筛选、细胞传代培养等步骤才能得到稳定转染的细胞系。对稳定细胞系进行培养能够长期稳定的生产目的蛋白。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]瞬时转染与稳定转染优缺点对比[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]瞬时转染：[/font][font=宋体]优点：[/font][font=宋体]①能够快速生产得到微量至中量的重组蛋白[/font][font=宋体]②实验成本低[/font][font=宋体]③一个宿主可以带有多个拷贝，表达效率高[/font][font=宋体]缺点：无法长期生产得到重组蛋白[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]稳定细胞系构建：[/font][font=宋体]优点：能够长期稳定生产目的蛋白[/font][font=宋体]得到稳转株之后后续生产蛋白的成本大大降低[/font][font=宋体]能够对基因进行基因插入、基因敲除等编辑操作[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service][b]稳定细胞系构建服务[/b][/url]，包含过表达细胞系构建服务和[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]稳定细胞株开发服务，详情可以参看[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service[/font][/font]

常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞需要一定的载体和导入方法，基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内，并在细胞内表达。转染方法有多种，根据不同的细胞，贴壁或悬浮细所可选用不同的方法，其目的是要达到设置转染效率，影响转染产率的因素有多种，包括转染方法、操作技术、质粒DNA的纯度、靶细胞的生长状态等，下面重点介绍向几种常用的转染技术：被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需应用胰酶处理成单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的60%为宜，转染当日，在转染前4小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞，也需在转染前4小时换一次新鲜培养液。用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其了化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准，目前大多采用进口的术提取纯化试剂盒。具体的基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电击基因转导尘等。靶基因被导入细胞后，一般在转染后48小时，靶基因即在细胞内表达。根据不同的实验目的，48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。如若建立稳定的细胞系，则可对靶细胞进行筛选，根据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物，最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。

7、电转后培养液的选择细胞在电击后十分脆弱，其 培养液的选择应注重提高细胞的存活率，一般选择 低渗的RPMI 1640+10％FCS。除此之外，可参考 加入50 mmol／L海藻糖+1.25％DMSO，因为海藻 糖具有稳定DNA、蛋白质以及细胞膜的作用，并提高电转后细胞特别是淋巴细胞的存活率。此外， 有文献显示凋亡是细胞电击后死亡的主要原因，电 击后的培养液还可加入Caspase抑制剂和SCFGM-CSF等细胞因子。

荧光显微镜下H526细胞的慢病毒转染结果

[color=#1a1a1a]1. 脂质体法[/color][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a]2. 电穿孔法[/color][/color][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a]3. 病毒介导的感染[/color][/color][/color][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a]4.非脂质体转染[/color][/color][/color][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a][color=#1a1a1a].........请大家补充[/color][/color][/color]

慢病毒转染过后的细胞荧光照片明场[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/06/202306302120455921_65_5389809_3.jpeg[/img]低浓度[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/06/202306302120459963_6495_5389809_3.jpeg[/img]高浓度[img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/06/202306302120461778_5983_5389809_3.jpeg[/img]

报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其 它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因主要有以下几种： 胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎 叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)　nptⅡ、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作 用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。氯霉素乙酰 转移酶基因测时可通过放射自显影观察。荧光素酶基因（luciferase Gene）1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中出来的，该酶在有ATP、Mg2＋、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用植物整株或部分直接用X-光片 或专门仪器进行检测。具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的采用。β-D-葡萄糖苷酶基因该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱 、荧光等进行检测。除此之外还有庆大霉素转移酶基因等。在动物基因表达调控的研究中，已使用的报告基因主要有以下几种： 绿色荧光蛋白（gfp）基因等。绿色荧光蛋白来源于海洋生物水母，其基因可在异源组织中表达并产生荧光，GFP Cdnad 开放阅读框架长度约740bp，编码238个氨基酸残基，其肽链内部第65-67位丝氨酸－脱氢酪氨酸－甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基因，在长 紫外波长或蓝光照射下发出绿色荧光。转染后的细胞可在荧光显微镜或流式细胞仪(FACS)中直接观察基因的表达。此外还有β-半乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)等。

不同的慢病毒转染浓度，荧光显微镜荧光场亮度可以作为简单的定量分析数据吗

[font=宋体]随着生物技术的快速发展，稳定转染细胞株的构建在基础研究和应用研究中变得越来越重要。这一技术涉及到将外源基因稳定整合到宿主细胞基因组中，从而实现基因的长期表达。然而，这一过程也伴随着一系列的挑战和常见问题。本文将深入探讨稳转细胞株构建的方法，以及在实践过程中可能遇到的问题，旨在为研究者提供实用的指导和建议。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]稳定转染细胞株构建方法：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一、慢病毒感染细胞[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]慢病毒因为可以感染大多数的分裂细胞和非分裂细胞，包装技术成熟，[/font][font=Calibri]II[/font][font=宋体]代和[/font][font=Calibri]III[/font][font=宋体]代慢病毒包装系统均能包装高滴度的慢病毒，是稳转细胞系构建的首选系统。但是因为慢病毒有包装容量限制，不适合转录本区域比较长的基因，对较大的基因有局限性。另外由于慢病毒是逆转录病毒，病毒表达载体中，是由[/font][font=Calibri]WPRE[/font][font=宋体]元件代替[/font][font=Calibri]PolyA[/font][font=宋体]稳定以达到稳定[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]的作用，对部分基因的翻译有一定影响。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二、转座子介导的稳转细胞系构建[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]转座子是存在于各种生命细胞内的可移动遗传信息元件，能实现[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]片段在染色体内部[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]之间的转移。工程化的转座子由[/font][font=Calibri]ITR[/font][font=宋体]和转座酶编码基因组成，通过转座酶与[/font][font=Calibri]ITR[/font][font=宋体]结合实现基因转移。将转座子的两个元件分别构建在两个独立载体上，并将目的基因序列替换转座酶序列，与另一个载体共转染目的细胞，实现目的基因在宿主基因组上的整合。与其他技术不同，目的基因在整合酶存在下会持续处于切割—整合状态，实现连续跳跃。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]三、[/font][font=Calibri]CRISPR/Cas9 [/font][font=宋体]基因敲入[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]利用[/font][font=Calibri]CRISPR/Cas9[/font][font=宋体]系统，通过[/font][font=Calibri]NHEJ[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]HDR[/font][font=宋体]修复机制，可将目的基因（如抗性基因和荧光标志）定点敲入细胞基因组。在哺乳动物细胞中，[/font][font=Calibri]NHEJ[/font][font=宋体]的效率高于[/font][font=Calibri]HDR[/font][font=宋体]。设计特定[/font][font=Calibri]sgRNA[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]donor[/font][font=宋体]载体，可在[/font][font=Calibri]AAVS1[/font][font=宋体]位点（人基因组安全港）实现基因定点敲入。此方法稳定、安全，但敲入概率在不同细胞和位点中有所差异，需筛选单克隆以获得稳定细胞系。随着编辑效率提高，此方法将更省时省力。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]四、[/font][font=Calibri]CRISPR SAM[/font][font=宋体]系统，通过融合[/font][font=Calibri]VP64[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]MS2-P65-HSF1[/font][font=宋体]系统对基因进行过表达和干扰[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]CRISPR SAM[/font][font=宋体]通过[/font][font=Calibri]dCas9-VP64[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]MS2-P65-HSF1[/font][font=宋体]激活蛋白实现了多数细胞内源基因的特异性激活，不受基因大小限制。主要优势是应用广泛，但需要三种不同抗性病毒逐次或同时感染细胞。[/font][font=Calibri]CRISPR SAM[/font][font=宋体]将[/font][font=Calibri]sgRNA[/font][font=宋体]序列构建在[/font][font=Calibri]lenti[/font][font=宋体]载体中，配合其他两种慢病毒可激活任何基因。主要缺点是筛选细胞时需要三种不同抗性的病毒，部分细胞筛选后表型变化明显。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]稳转细胞系构建中常见问题解析：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]是否需要进行密码子优化？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]由于氨基酸密码子的简并性和[/font][font=Calibri]tRNA[/font][font=宋体]的种类多样性、数量的差异，密码子优化对长基因稳转细胞系的构建有很强的必要性，可以大幅提高目标蛋白的表达量。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. Kozak[/font][font=宋体]序列是必须要添加的吗？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Kozak[/font][font=宋体]序列（通常是[/font][font=Calibri]GCCACCatgG[/font][font=宋体]），真核生物[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]真正的起始密码子位于[/font][font=Calibri]Kozak[/font][font=宋体]序列的保守序列中，其共有序列是[/font][font=Calibri]CCRCCAUGG[/font][font=宋体]，几乎所有[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]的翻译起始都依赖于[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]’帽子结构募集小亚基，少数通过内部核糖体进入位点[/font][font=Calibri](IRES)[/font][font=宋体]募集小亚基。[/font][font=Calibri]Kozak[/font][font=宋体]序列通过与翻译起始因子[/font][font=Calibri]eIF[/font][font=宋体]形成翻译起始复合物，起始蛋白的翻译。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]启动子应如何选择？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]CMV[/font][font=宋体]（巨细胞病毒）启动子除了在干细胞外，其他大多数细胞类型中均可以获得高表达活性。悬浮细胞中[/font][font=Calibri]SFFV[/font][font=宋体]启动子表达活性相对较高。而[/font][font=Calibri]EF1a[/font][font=宋体]（延伸因子[/font][font=Calibri]-1[/font][font=宋体]α）启动子更适用于表达长片段的基因。[/font][font=Calibri]CMV[/font][font=宋体]；[/font][font=Calibri]EF1A[/font][font=宋体]；[/font][font=Calibri]CAG[/font][font=宋体]；[/font][font=Calibri]CBh[/font][font=宋体]；[/font][font=Calibri]SFFV[/font][font=宋体]，等均属于强启动子，都可作为稳转细胞系构建可选启动子。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]稳转细胞系培养体系[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]稳转细胞系一般建议用半抗性筛选浓度维持细胞生长，如[/font][font=Calibri]hepG2[/font][font=宋体]细胞[/font][font=Calibri]puro[/font][font=宋体]抗性筛选浓度为[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g/ml[/font][font=宋体]，则建议用[/font][font=Calibri]1ug/mL+[/font][font=宋体]完全培养基维持生长；部分基因过表达后会影响细胞代谢，尤其肿瘤细胞，糖酵解代谢速率受影响，细胞生长缓慢，可相应添加葡萄糖或者[/font][font=Calibri]HEPES[/font][font=宋体]调节细胞细胞代谢水平，维持细胞增殖。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5. [/font][font=宋体]标签放在[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端还是[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端好？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]如果[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端有信号肽，建议放在[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端；蛋白如果较小，建议放在[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端，减少蛋白降解；如果下游有[/font][font=Calibri]P2A[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]T2A[/font][font=宋体]等自剪切肽，建议放在[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]端。如果为了添加[/font][font=Calibri]Kozak[/font][font=宋体]序列，建议加在[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端。如果纯化中需要酶切标签，建议放在[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]端。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6. [/font][font=宋体]是否可以构建稳转敲除的细胞系？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一般不建议，因为敲除元件稳定持续的表达在细胞中，累积脱靶效应明显，影响细胞状态。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service][b]稳定细胞系构建服务[/b][/url]，包含过表达细胞系构建服务和[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]稳定细胞株开发服务，其服务内容详情可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service[/font][/font]

[font=宋体]慢病毒构建稳转细胞系的原理主要是利用慢病毒载体将外源基因导入宿主细胞，并实现外源基因的稳定表达。具体来说，构建稳转细胞系的核心是将慢病毒矢量载体导入宿主细胞中，慢病毒载体通常包含病毒的复制和包装组件，以及外源基因的表达调控序列。当慢病毒载体被导入宿主细胞后，它可以利用细胞的复制和转录机制将外源基因插入宿主细胞的染色体中，从而实现外源基因的稳定表达。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]构建稳定的慢病毒转染细胞系是在细胞中稳定表达外源基因的一种有效方法。下面是一般慢病毒构建稳定转染细胞系的步骤：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、选择慢病毒载体： 选择适当的慢病毒载体，通常是一个包含[/font][font=Calibri]LTR[/font][font=宋体]、包装信号、引导[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]序列和多功能质粒载体的质粒。这个载体应该包含要表达的外源基因。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、转染慢病毒包装细胞： 使用慢病毒包装细胞系，例如[/font][font=Calibri]293T[/font][font=宋体]或其他适合的细胞系。这些细胞通常被选择因为它们能够支持慢病毒复制和包装。将慢病毒载体与包装蛋白的表达质粒一同转染进这些细胞中。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、病毒产生和收集： 慢病毒包装细胞会开始产生慢病毒颗粒，这些颗粒包含了慢病毒载体和外源基因。培养一定时间后，收集细胞培养上清液，这是富含病毒的液体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、测定病毒滴度： 对采集的上清液进行病毒滴度的测定，通常可以通过转染一定数量的目标细胞，然后测定这些细胞的感染率来确定病毒的滴度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、转染目标细胞： 将上一步获得的病毒用于转染目标细胞。这些目标细胞可以是要建立稳定转染细胞系的细胞。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、筛选稳定细胞系： 添加适当的筛选物质，例如抗生素，以选择表达了外源基因的细胞。这可以通过在培养基中添加抗生素，使得只有表达了外源基因的细胞能够存活下来。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]7[/font][font=宋体]、单克隆分离： 对稳定表达细胞群进行单克隆分离，以确保每个克隆都来自单一细胞。这有助于保持表达的一致性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]8[/font][font=宋体]、验证表达： 对所得的单克隆细胞系进行验证，确认外源基因的表达水平和稳定性。这可以通过[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Western blotting[/font][font=宋体]等分子生物学技术来实现。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]通过这些步骤，可以建立一个稳定表达外源基因的慢病毒转染细胞系，为后续的实验和研究提供了有力的工具。这种方法常用于基因功能研究、药物筛选和基因治疗等领域。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]慢病毒构建稳转细胞系的优点：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]与常用的转染方法相比，慢病毒构建稳转细胞系有以下几个优点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①高效性：慢病毒能够将外源基因整合到宿主细胞基因组中，实现稳定的外源基因表达。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②特异性：由于慢病毒的感染和复制比较特异，只会影响一定类型的细胞，因此可以实现对具体细胞的选择性转染。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③安全性：慢病毒的基因转移速度较缓慢，对宿主细胞和人体的损伤较小，因此具有较高的安全性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service][b]稳转细胞株构建服务[/b][/url]，包含过表达细胞系构建服务和[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]稳定细胞株开发服务，详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service[/font][/font]

在论坛上看到了强人提供的《土壤农化分析》，小弟“得寸进尺”，请问有没有人可以提供《污染土壤修复原理与方法》？著 译 者：周启星 宋玉芳出 版 社：科学出版社

[align=center][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]慢病毒载体感染技术[/color][/size][/font][/align][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]慢病毒载体感染技术已经被广泛应用于[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]干扰技术中。使用慢病毒载体，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]shRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]被导入宿主细胞的细胞核内，根据启动子不同，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]shRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]可被[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]聚合酶[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]II[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]或者[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]III[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]催化转录[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，这些前体结构被[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]加工形成[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]pre-shRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]随后被[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Dicer[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]和[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]TRBP/PACT[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]酶切，去除发卡结构，产生在两个[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]’[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]末端带有两个游离碱基的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]20-25[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]nt[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的双链[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]siRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。这一有活性的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]siRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]随后[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]与[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Argonaute[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] (Ago) [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]等蛋白质因子结合，形成[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]诱导的沉默复合体[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000](RNA-induced silencing complex, RISC)[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]作为[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RISC[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的一部分，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]siRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通过碱基互补配对以序列特异性的方式结合到靶[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]mRNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]在镁离子和[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ATP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的参与下，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Ago[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]切割靶标[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，产生的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]片段被快速降解，从而在转录后水平沉默靶基因的表达[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][63-65][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]凋亡是多[/color][/size][/font][url=https://baike.baidu.com/item/%E5%9F%BA%E5%9B%A0][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]基因[/color][/size][/font][/url][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]严格控制的过程。这些基因在种属之间非常保守，如[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Bcl-2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]家族、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]家族[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。内源性细胞凋亡途径始于线粒体，细胞色素[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]C[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]从线粒体内释放是关键的一步。在细胞凋亡信号的刺激下，细胞色素[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]C[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]从线粒体释放到胞浆，并与凋亡细胞蛋白酶激活因子[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Apaf-1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]结合，在[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]dATP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]存在下，募集并激活[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase-9[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，形成[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Cyto-3-Apaf-1-caspase-9[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]凋亡体，激活下游的效应蛋白酶，如[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase-2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]6[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]7[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]8[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]9[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，启动[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的级联反应，引起细胞凋亡。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]被认为是凋亡的中心实施者，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase9[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]是调控[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，参与打靶与激活调控，激活[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]处于凋亡级联反应的核心位置，是效应[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，是参与凋亡的效应物。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的主要底物是聚合酶[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PARP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，在细胞凋亡启动时，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PARP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]通过[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的裂解剪切参与凋亡的发生。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]cappase-3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]对[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PARP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的蛋白水解作用是凋亡实施的早期事件或前提条件。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Bcl-2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]是一种具有抑制细胞凋亡作用的蛋白，能够抑制[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]激活，结合[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Apf-1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]及[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-9[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，并维持其非活化状态，抑制[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]caspase[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]级联反应，并且抑制线粒体释放细胞色素[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]C[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，防止细胞凋亡[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000][78, 79][/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。实验中，我们通过[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]western blot[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]检测相关蛋白发现，与对照组相比，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]cleaved-caspase3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]cleaved caspase-9[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]、[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]cleaved PARP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的表达量增加，而[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Bcl-2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]抗凋亡蛋白表达量减少，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PARP[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]表达量明显下降，表明，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MSI1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]低表达促进了凋亡的产生。[/color][/size][/font]

[font=宋体][font=宋体]多重荧光免疫组化技术[/font] [font=Calibri](Multiplex immunohistochemical[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]mIHC) [/font][font=宋体]也称作酪氨酸信号放大 [/font][font=Calibri](Tyramide dignal amplification[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]TSA) [/font][font=宋体]技术，是一类利用辣根过氧化酶 [/font][font=Calibri](Horseradish Peroxidase, HRP) [/font][font=宋体]对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]这一技术基于酪胺信号的放大效应，实现对单个细胞或组织样本上多个目标靶点的同时检测。这为全面研究细胞组成、细胞功能以及细胞间的相互作用提供了强大的工具。通过多重荧光免疫组化技术，科学家们可以更深入地了解细胞的奥秘，揭示生命现象的复杂性。[/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]mIHC [/font][font=宋体]实验原理及流程[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]TSA [/font][font=宋体]技术采用 [/font][font=Calibri]HRP [/font][font=宋体]标记的二抗，[/font][font=Calibri]HRP [/font][font=宋体]催化加入体系的 [/font][font=Calibri]TSA [/font][font=宋体]衍生荧光染料，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，将信号共价结合到抗原上。之后用热修复洗去非共价结合的抗体，再换下一种一抗来第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]原理：[/font][/b][font=宋体][font=宋体]带有染料标记的底物酪胺[/font] [font=Calibri](T) [/font][font=宋体]分子在过氧化氢氧化环境下，被抗体或探针固定的 [/font][font=Calibri]HRP [/font][font=宋体]转化为具有短暂活性的中间状态 [/font][font=Calibri](T*)[/font][font=宋体]，然后被激活的中间态分子 [/font][font=Calibri](T*) [/font][font=宋体]迅速与相接蛋白分子的富含电子区域 [/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]酪氨酸残基[/font][font=Calibri]) [/font][font=宋体]进行稳定的共价结合，未被标记的酪胺分子将被洗脱，借此实现对抗原的特异性染色。由于相接的蛋白 [/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]包括 [/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]，抗体，目标抗原[/font][font=Calibri]) [/font][font=宋体]都含有大量的酪氨酸结合位点，所以目标抗原处会富集大量标记分子，使信号被有效放大 。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]多重免疫荧光染色的步骤包括样品制备、抗原诱导、抗原解露等。[/font][/b][font=宋体]具体如下：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①样品制备：根据细胞或组织的不同，选择不同的处理方式。对于细胞样品，需要固定和渗透化处理以保持其形状和蛋白质结构。对于组织样品，需要切片并进行染色前的去脂处理。[/font][font=宋体]②抗原诱导：如果目标标记物是蛋白质，那么需要选择适当的抗体来识别目标蛋白质。抗体可以人工合成或从动物体内提取。[/font][font=宋体]③抗原解露：对于细胞样品，可以利用活液解离细胞，并将细胞固定在载玻片上。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]IHC [/font][font=宋体]与 [/font][font=Calibri]mIHC[/font][font=宋体]区别与联系[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service][b]免疫组化[/b][/url]，是应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性的研究。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]简单来说，[/font][font=Calibri]mIHC [/font][font=宋体]属于 [/font][font=Calibri]IHC [/font][font=宋体]的升级版本！[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Tips[/font][font=宋体]：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]相同点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]能够完整显现组织原位形态信息。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]不同点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]常规免疫组化的分析属于定性分析，其判断大多依赖于经验，其分析结果会有差异。而多重荧光免疫组化属于定量分析，其利用软件可对组织中的细胞进行精准的结果分析。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]常规免疫组化受传统染色成像的限制，靶标少于 [/font][font=Calibri]3 [/font][font=宋体]个，无法完整分析组分信息。而多重荧光免疫组化可实现多因子共定位，可以获取更多的生物信息，且样本需求量较少。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供的[/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/fluorescent-multiplex-ihc-services][b]TSA[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/fluorescent-multiplex-ihc-services][b]法多重荧光免疫组化服务[/b][/url]，有一系列屏蔽自发荧光干扰的手段，配合激光共聚焦显微镜的拍摄条件，提供更优质的图像质量，收获更特异的染色结果。[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/fluorescent-multiplex-ihc-services[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b][font=Calibri] [/font]

[font=宋体][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/special-staining-services][b]HE[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/special-staining-services][b]染色[/b][/url]，全称为苏木精[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]伊红染色法 [/font][font=Calibri](hematoxylin-eosin staining)[/font][font=宋体]，是最基本的病理学染色技术，能够对正常组织和病理组织进行形态结构的观察。特殊染色是常规[/font][font=Calibri]HE[/font][font=宋体]染色的必要补充，能够有针对性地对组织成分进行染色，使组织病理学评价更加完善精确，在临床病理学诊断和病理组织学研究具有重要的应用价值。除常规的[/font][font=Calibri]HE[/font][font=宋体]染色外，义翘神州还提供[/font][font=Calibri]9[/font][font=宋体]种特殊染色服务，包括[/font][font=Calibri]masson[/font][font=宋体]三色染色、 [/font][font=Calibri]PAS[/font][font=宋体]染色、尼氏染色、[/font][font=Calibri]VG[/font][font=宋体]染色、苏丹黑染色、普鲁士蓝染色、油红[/font][font=Calibri]O[/font][font=宋体]染色和β[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]半乳糖苷酶衰老染色等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]为了显示与确定组织或细胞中的正常结构或病理过程中出现的异常物质、病变及病原体等，需要分别选用相应的显示这些成分的染色方法进行染色。包括[/font][font=Calibri]: [/font][font=宋体]胶原纤维 染色[/font][font=Calibri](Masson[/font][font=宋体]等[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]、网状纤维染色、弹力纤维染色、肌肉组织染色[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]磷钨酸 苏木素 [/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]、脂肪染色[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]苏丹[/font][font=Calibri]III)[/font][font=宋体]、糖原染色[/font][font=Calibri](PAS)[/font][font=宋体]、粘液染色[/font][font=Calibri](PAS)[/font][font=宋体]等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特殊染色：[/font][font=宋体]病理组织切片染色技术作为病理实验室基本方法之一，具有较高的使用价值，也是目前临床外科病理最基本、最常见的形态学检验技术。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]实验原理：[/font][font=宋体][font=宋体]组织切片染色就是利用染料在组织切片上给予不同颜色，使其与组织或者细胞内的某种成分发生作用，经过透明后通过光谱吸收和折射，使其各种微细结构能显现不同颜色，这样在显微镜下就可显示出组织细胞的各种成分。最常见的组织染色是[/font][font=Calibri]HE[/font][font=宋体]染色，另外巴菲尔生物还可开展其他特殊染色项目，如[/font][font=Calibri]masson[/font][font=宋体]染色、[/font][font=Calibri]PAS[/font][font=宋体]染色、[/font][font=Calibri]AB-PAS[/font][font=宋体]染色、[/font][font=Calibri]EVG[/font][font=宋体]染色、[/font][font=Calibri]VG[/font][font=宋体]染色、维多利亚蓝染色、番红[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]固绿染色、甲苯胺蓝染色、油红[/font][font=Calibri]O[/font][font=宋体]染色、阿利新蓝染色、碱性磷酸酶染色、瑞氏姬姆萨染色、普鲁士蓝染色、[/font][font=Calibri]TTC[/font][font=宋体]染色及髓鞘染色等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特殊染色的应用价值[/font][font=宋体]现代病理学中免疫组织化学技术、电子显微镜技术以及其它细胞及分子生物学技术应用日益广泛，但由于这些技术要求一定的实验条件以及所需的试剂价格较为昂贵，对于一部分病人以及某一些基层医院是比较难以接受的。而组织化学技术则具有无需复杂的实验条件以及较为昂贵的试剂操作又比较简单的优势，在临床病理学诊断中具有重要的应用价值。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]比如，当细胞中出现色素，是黑色素还是含铁血黄素以及当组织中出现均一化学物质是否为淀粉样变性等，用组织化学技术区别起来很简单，所以组织化学技术，虽然已有几十年到几百年的历史，仍是一个很有实用价值的技术。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]常见的特殊染色方法及应用：[/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Mallory[/font][font=宋体]磷钨酸苏木素染色[/font][/font][font=宋体]原理：成熟的苏木素通过钨的结合成蓝色色淀，这种色淀与所选择的组织成份能牢固地结合而呈蓝色，显示棕红色的成份是由于磷钨酸而着色。[/font][font=宋体]方法应用：[/font][font=宋体][font=宋体]临床上应用该方法对横纹肌肉瘤进行诊断，横纹肌肉瘤的组织学形态变化多样，与未分化的间胚叶肿瘤很难鉴别，采用磷钨酸苏木素染色，在瘤细胞质内发现蓝色横纹，则可以证明该肿瘤是呈横纹肌分化。该染色液也可以对炎症渗出的纤维素，[/font][font=Calibri]DIC[/font][font=宋体]的毛细血管中的纤维素、以及神经病理等方面进行染色[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]PAS[/font][font=宋体]染色 [/font][/font][font=宋体]原理：高碘酸是一种氧化剂，它能破坏多糖结构的碳键。组织切片首先用高碘酸溶液氧化，使存在于组织多糖分子的乙二醇基或氨羟基的碳键打开，生成醛基化合物。暴露出来的游离醛基与无色品红溶液作用，生成新的红至紫红色复合物而得到定位。[/font][font=宋体]应用：[/font][font=宋体][font=宋体]在组织学上，主要用来检测组织中的糖类。随着医学实验技术的发展，糖原染色应用的范围更加广泛，如用以证明与鉴别细胞内空泡状的性质，心肌病变及其他心血管疾病的诊断，糖原累积病诊断和研究[/font] [font=宋体]，糖尿病的诊断和研究，用于某些肿瘤的诊断等。除用于糖原的鉴定和黏液的显示外，还可以观察肾小球基底膜、结肠杯状细胞中性黏液物质、阿米巴滋养体和霉菌的着色。为临床诊断、分类和治疗提供了重要的依据。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多关于特殊染色服务详情可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/special-staining-services[/font][/font][font=Calibri] [/font]

[font='times new roman'][size=18px]生物实验中的基础操作[/size][/font][font='times new roman'][size=18px]—[/size][/font][font='times new roman'][size=18px]病毒转染及[/size][/font][font='times new roman'][size=18px]Q-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/size][/font][font='times new roman'][size=18px]低表达细胞模型的构建[/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1. [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]从[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-80[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]°C[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]冰箱取出慢病毒载体冰上融化，将慢病毒用空白培养基稀释为滴度[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]×[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000]8[/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，充分混匀，准备好病毒感染增强液。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2. [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]将悬浮细胞移入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]15 mL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]离心管中，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]900 rpm[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，离心[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]8 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，弃去上清，用空白培养基重悬细胞沉淀，并用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url]充分吹打混匀。取其中[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]500 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]放入细胞计数仪中计数，取出[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1.5[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]×[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10[/color][/size][/font][font='times new roman'][sup][size=16px][color=#000000]6[/color][/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]个细胞置入新的离心管中。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3. 12[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]孔板中以[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]MOI=15[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的病毒滴度进行感染，培养[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]16 h[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]4. 16 h[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]后，在原培养基中加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2 ml [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]新鲜完全培养基继续培养，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]72 h[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]后观察荧光。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]5. [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]细胞生长至状态良好，加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]g/mL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]嘌呤霉素筛选至[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]90%[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]以上细胞产生荧光。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=18px]荧光实时定量[/size][/font][font='times new roman'][size=18px] [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/size][/font][font='times new roman'][size=18px]（[/size][/font][font='times new roman'][size=18px]q-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/size][/font][font='times new roman'][size=18px]）[/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]. [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]总[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的提取：分别将细胞离心，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]PBS[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]缓冲液清洗[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]次，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]900 r/min [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]离心[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]8 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，得到细胞沉淀。分别加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1 mL Trizol[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url]吸打至细胞完全破裂，加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]200 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]氯仿，震荡[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]30 s[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，室温静置[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，以有效分离无机相和有机相，随后[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]4[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]°C[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]12000 g/min [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]离心[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]15 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。将上清移至高压过的[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]1.5 mL[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，轻柔颠倒震荡数次，室温静置[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，随后[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]4 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]°C[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]12000 g/min [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]离心[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。弃去上清，加入[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]75%[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]无水乙醇，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]4 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]°C[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]12000 g/min [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]离心[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]5 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。弃去上清，沉淀置于冰上自然干燥，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]但不可完全干燥。用[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] 30 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]μ[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]L DEPC[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]水溶解总[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]RNA[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。用[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]NanoDrop One[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]超微量分光光度计进行定量和纯度检测。[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]. [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]cDNA [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的合成：将混合液轻柔吹打混匀，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]42[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] °C[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]，[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]2 min[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]。[/color][/size][/font][align=center][font='times new roman'][color=#000000]表[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000] [/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]逆转录体系[/color][/font][/align][table][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]试剂名称[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]使用量[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]RNase-free ddH[/color][/font][font='times new roman'][sub][size=13px][color=#000000]2[/color][/size][/sub][/font][font='times new roman'][color=#000000]O[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]to 16 μL[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]4*gDNA wiper Mix[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]4 μL[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]模板[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] RNA[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]Total RNA[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]：[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]1pg-1 [/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]μ[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]g[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]5*HiScript III qRT SuperMix[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]4 μL[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='宋体'][color=#000000]第一步的反应液[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]16 μL[/color][/font][/align][/td][/tr][/table][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]. [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]q-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]检测[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000] mRNA [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]的表达[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]GAPDH [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]引物序列：[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Forward primer:5’-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3’[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Reverse primer:5’-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ODC1 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]引物序列：[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Forward primer: [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]5[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]′[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-ATTAAAGGAACAGACGGGCTC-3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]′[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Reverse primer:[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]5[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]′[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]-ATGTGCGTGGTCATAGAGTATG-3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]′[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]q-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]反应体系：[/color][/size][/font][align=center][font='times new roman'][color=#000000]表[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]q-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]反应体系[/color][/font][/align][table][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]试剂名称[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]使用量[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]2*ChamQ Universal SYBR q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] Master Mix[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]1[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]0[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000] μL[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]Primer1[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]（[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]10μM[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]）[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]0.[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]4 μL[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Primer2[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]（[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]10μM[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]）[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]0.4 μL[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Template DNA/cDNA[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]X μL[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]ddH[/color][/size][/font][font='times new roman'][sub][size=16px][color=#000000]2[/color][/size][/sub][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]O[/color][/size][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]To[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000] 20 μL[/color][/font][/align][/td][/tr][/table][font='times new roman'][size=16px]将混合液轻柔吹打混匀，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]37 °C, 15 min[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]85 [/size][/font][font='times new roman'][size=16px]°C[/size][/font][font='times new roman'][size=16px], 5 s[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]，得到[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]cDNA[/size][/font][align=center][font='times new roman'][color=#000000]表[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]q-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]反应程序[/color][/font][/align][table][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]反应步骤[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]反应温度[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]反应时间[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]循环次数[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]预变性[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]95[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000] °C[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]10[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000] [/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]min[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]1[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]变性[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]95[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000] °C[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]10[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000] s[/color][/font][/align][/td][td][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]退火[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]55-65 °C[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]1[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]0 s[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]3[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]0[/color][/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]延伸[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]72 °C[/color][/font][/align][/td][td][align=center][font='times new roman'][color=#000000]3[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]0 s[/color][/font][/align][/td][td][/td][/tr][/table][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]用[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]Graphpad prism5 [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]计算[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]mRNA [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]水平的表达量。[/color][/size][/font]

GBT 25916.1-2010 洁净室及相关受控环境 生物污染控制 第1部分：一般原理和方法

污染源SO2监测，应用电化学传感器现场可以直读，比较快捷，但也有很多问题，交叉干扰、容易老化等。看到有厂家开发了应用碘量法原理现场直读设备，比较感兴趣，请专家介绍一下，谢谢！说明一下，本人从事监测管理，只为选择好的设备，拒绝厂商广告。

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[font=宋体][font=宋体]膜联蛋白（[/font][font=Calibri]Annexin[/font][font=宋体]）是一类分布广泛的钙依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸（[/font][font=Calibri]PS[/font][font=宋体]）能特异性结合，参与一系列[/font][font=Calibri]Ca2+[/font][font=宋体]依赖型的膜相关的过程，包括细胞的胞吐和内吞作用、囊泡运输、调节血液凝固以及炎症反应等多种生物学事件，在许多人类疾病的发病机制或进展中起着非常重要的作用。膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]Annexin V[/font][font=宋体]）染色是检测细胞凋亡的常用方法。[/font][/font][b][font=宋体][font=宋体]膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]染色原理及应用[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]一、膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]染色原理[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]染色，也称为[/font][font=Calibri]Annexin V[/font][font=宋体]染色，是一种用于检测细胞凋亡的方法。其核心原理基于细胞凋亡过程中的一种生物化学变化。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（[/font][font=Calibri]PS[/font][font=宋体]）只分布在细胞膜脂质双层的内侧。然而，当细胞开始凋亡时，这一分布会发生改变，磷脂酰丝氨酸会从细胞膜内侧翻到外侧。膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]是一种能够与这种外翻的磷脂酰丝氨酸特异性结合的蛋白。通过结合荧光物质，这种结合可以被检测和观察，从而确定哪些细胞正在经历凋亡。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]二、膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]染色的应用[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①流式细胞术：膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]染色常用于流式细胞术中，以检测和分类正常细胞和凋亡细胞。通过流式细胞仪，可以快速分析大量细胞，并准确地识别出凋亡细胞。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②光学显微镜成像：膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]染色也可用于光学显微镜成像技术，这使得研究者能够在显微镜下直接观察细胞的形态变化，从而对凋亡过程有更深入的理解。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③与其他染色方法的结合：膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]染色可以与其他染色方法如碘化丙啶[/font][font=Calibri](PI)[/font][font=宋体]染色结合使用。[/font][font=Calibri]PI[/font][font=宋体]是一种能够进入凋亡晚期细胞核的染料，因此可以用于区分凋亡早期和晚期细胞。这种联合使用的方法能提供更全面的细胞凋亡信息。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]④临床应用：膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]染色在许多临床领域中都有应用，例如肿瘤学、血液学和药理学等。它可以帮助研究者深入理解疾病的发展过程，评估新药物对细胞凋亡的影响，以及监测疾病的进展和治疗的效果。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]总的来说，膜联蛋白[/font][font=Calibri]V[/font][font=宋体]染色是一种强大的工具，可以帮助科学家们更好地理解细胞凋亡的过程，从而为疾病的治疗和药物研发提供有价值的信息。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]更多关于膜联蛋白详情可以关注[url=https://cn.sinobiological.com/][b]义翘神州[/b][/url]！[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

[font=宋体]在现代生命科学研究中，[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-production][b]重组蛋白表达技术[/b][/url]扮演着至关重要的角色。通过将外源基因导入宿主细胞，并使其表达特定蛋白，我们能够获取大量高纯度的重组蛋白，为疾病治疗、药物研发和生物工程等领域提供了强有力的支持。本文将介绍重组蛋白表达的原理、表达系统、生产步骤以及应用前景。[/font][font=宋体][b]一、重组蛋白表达的原理[/b][/font][font=宋体][font=宋体]重组蛋白表达是利用[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]重组技术，将目标基因（外源基因）导入宿主细胞中，并通过宿主细胞的生物机制使其表达出特定蛋白。其主要步骤包括：[/font][/font][font=宋体][font=宋体]基因克隆：将目标基因经过[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]扩增后，与表达载体连接，形成重组质粒。[/font][/font][font=宋体]转染或转化：将重组质粒导入宿主细胞中，可以使用化学方法、电穿孔或者嗜热菌等方式进行转染或转化。[/font][font=宋体]表达蛋白：重组质粒进入宿主细胞后，融合到宿主细胞的染色体中，随后遵循细胞的转录和翻译机制，表达出目标蛋白。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]二、常见的重组蛋白表达系统[/font][/b][font=宋体]大肠杆菌表达系统：大肠杆菌是常用的重组蛋白表达宿主细胞之一。其优点在于生长快速、易于培养，并且能够产生大量的蛋白。此外，大肠杆菌的遗传工具和代谢途径也被广泛研究，提供了便利。[/font][font=宋体]酵母表达系统：酵母表达系统包括酿酒酵母和毕赤酵母。这些酵母细胞具有真核细胞的特点，能够进行正确的蛋白折叠和修饰。同时，酵母细胞也可以进行大规模培养和高表达，适用于一些复杂蛋白的表达。[/font][font=宋体]昆虫细胞表达系统：昆虫细胞表达系统常用于大规模蛋白表达。昆虫细胞具有真核细胞的优势，能够对蛋白进行正确的折叠和修饰，适合于表达大量需求复杂结构的重组蛋白。[/font][font=宋体]哺乳动物细胞表达系统：哺乳动物细胞的表达系统可用于高效表达复杂蛋白和进行蛋白质研究。哺乳动物细胞具有真核细胞特点，能够进行正确的蛋白质修饰和折叠，并且在一些特殊情况下需要考虑到人类蛋白的免疫原性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]三、重组蛋白生产步骤[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]细胞中有两个蛋白生产阶段：转录和翻译，被称为分子生物学的中心法则。换言之，转录和翻译步骤属于重组蛋白表达步骤。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]为了生产重组蛋白，基因被分离并克隆到表达载体中。重组蛋白的生产需要蛋白表达系统、蛋白纯化系统和蛋白识别系统。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]获取重组蛋白的基本步骤：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1.[/font][font=宋体]目标基因的扩增。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2.[/font][font=宋体]插入克隆载体。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3.[/font][font=宋体]亚克隆到表达载体中。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4.[/font][font=宋体]转化到蛋白表达宿主中[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]细菌[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]大肠杆菌[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]、酵母细胞、哺乳动物细胞或杆状病毒[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]昆虫细胞系统[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]5.[/font][font=宋体]重组蛋白鉴定试验[/font][font=Calibri](Western blot[/font][font=宋体]或荧光[/font][font=Calibri])[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]6.[/font][font=宋体]大规模生产。[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]大规模发酵[/font][font=Calibri])[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]7.[/font][font=宋体]分离和纯化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]需要考虑多种因素：[/font][font=宋体][font=Calibri]1.[/font][font=宋体]选择哪个宿主系统？[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2.[/font][font=宋体]如何分离和纯化重组蛋白？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]选择适当的表达宿主或使用正确的纯化方法并不容易，应考虑目标重组蛋白的性质。下面列出了一些重要因素：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]? 膜结合[/font][font=宋体]? 溶解度[/font][font=宋体]? 单或多结构域[/font][font=宋体][font=宋体]? 大小[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]分子量[/font][font=Calibri])[/font][/font][font=宋体]? 表达位置[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]对于大多数没有足够经验来表达和分离重组蛋白的人来说，重组蛋白的生产是非常耗时的。许多生物公司为各种不同规模的重组蛋白表达提供良好的服务：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service[/font][font=宋体]，例如义翘神州[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]四、重组蛋白表达技术的应用前景[/b][/font][font=宋体]药物研发：重组蛋白表达技术被广泛应用于药物研发领域，用于生产重组蛋白药物。这些药物包括多肽类、蛋白类和抗体类药物，如生长因子、抗体药物和血液制剂等。通过重组蛋白表达技术，我们可以获得高效纯度的药物，满足临床上的需求。[/font][font=宋体]生物工程：重组蛋白表达技术被广泛应用于生物工程领域，用于生产特定的蛋白产品。这些产品可以应用于食品、化妆品、工业发酵等领域，如酶制剂、生物染料和生物材料等。[/font][font=宋体]疾病治疗：通过重组蛋白表达技术，我们能够合成特定的蛋白，用于疾病的治疗和诊断。例如，利用重组抗体技术，可以开发出用于癌症治疗和免疫治疗的抗体药物。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-production[/font][/font]

空[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/bp][color=#3333ff]气质[/color][/url]量测试仪原理，空[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/bp][color=#3333ff]气质[/color][/url]量测试仪是一款能实时检测甲醛，PM2.5，TVOC和温湿度的产品，小巧精致，方便携带。采用32位高精度CPU处理计算，然后转化为污染物浓度值，并在液晶屏上加以显示。空[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/bp][color=#3333ff]气质[/color][/url]量测试仪可同时检测仪装修污染所产生的有害气体，被很多家庭所采用。那么你了解空[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/bp][color=#3333ff]气质[/color][/url]量测试仪的原理吗？接下来，就让小编给大家介绍空[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/bp][color=#3333ff]气质[/color][/url]量测试仪原理。[b]空[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/bp][color=#3333ff]气质[/color][/url]量测试仪原理[/b]空[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/bp][color=#3333ff]气质[/color][/url]量测试仪是一款能实时检测甲醛，PM2.5，TVOC和温湿度的产品，小巧精致，方便携带。通过其内部的原装进口传感器，能准确测量出污染物浓度，并计算出空[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/bp][color=#3333ff]气质[/color][/url]量指数AQI，当浓度超标时报警。空[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/bp][color=#3333ff]气质[/color][/url]量检测仪原理为检测前端甲醛传感器，PM2.5传感器，TVOC传感器以及温湿度传感器的信号，通过运算放大器将传感器的微弱信号放大，并通过滤波电路去除噪声干扰，然后通过AD采集，并采用32位高精度CPU处理计算，然后转化为污染物浓度值，并在液晶屏上加以显示。空[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/bp][color=#3333ff]气质[/color][/url]量检测仪配套的传感器空[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/bp][color=#3333ff]气质[/color][/url]量检测仪内部配备了多种气体传感器，分别有甲醛传感器，PM2.5传感器，TVOC传感器以及温湿度传感器。[b]甲醛传感器原理和技术指标[/b]采用英国DART达特两电极电化学传感器，通过扩散原理，不需要气泵抽取，是一款能真正实现连续测量的甲醛传感器，通过国际甲醛检测领域权威部门认可。有甲醛存在时，会产生很小的直流电流，结合高精度放大电路和AD采样，测量甲醛浓度。空[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/bp][color=#3333ff]气质[/color][/url]量测试仪原理，空[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/bp][color=#3333ff]气质[/color][/url]量测试仪是一款能实时检测甲醛，PM2.5，TVOC和温湿度的产品，小巧精致，方便携带。采用32位高精度CPU处理计算，然后转化为污染物浓度值，并在液晶屏上加以显示。技术指标：测量范围：0.00-5.00mg/m3分辨率：0.01mg/m3测量精度：±5%测量原理：电化学[b]PM2.5传感器原理和技术指标[/b]PM2.5传感器使用韩国进口传感器，采用光散射原理，其内部对角安放着红外线发光二极管和光电晶体管，他们的光轴相交，当带灰尘的气流通过光轴相交的交叉区域，粉尘对红外光反射，反射的光强与灰尘浓度成正比。技术指标：测量范围：0-999ug/m3分辨率：1ug/m3测量精度：±5%测量原理：光散射[b]TVOC传感器原理和技术指标[/b]TVOC是总有机挥发物的总称，TVOC可有嗅味，有刺激性，能引起机体免疫水平失调，影响中枢神经系统功能，出现头晕、头痛、嗜睡、无力、胸闷等自觉症状；还可能影响消化系统，出现食欲不振、恶心等，严重时可损伤肝脏和造血系统，出现变态反应等。测量传感器采用韩国进口传感器。技术指标：测量范围：0.00-9.99mg/m3分辨率：0.01mg/m3测量精度：±10%测量原理：半导体工作湿度：15-90%RH输入规格：5V/1A电池容量：1000mAh充电接口：micro usb设计了恒流控制器， 确保采样流量恒定，切割曲线的正确。 具有特别的保护气幕，避免了粉尘对仪器核心部件—光学系统的污染，确保仪器高可靠性 通过计算机软件实现仪器零点自动调节，提高了仪器测量精度，方便了用户使用。

题目：人骨保护素质粒转染抑制大鼠实验性牙周炎骨吸收的研究作者：唐华期刊：博士论文全文链接：http://so.med.wanfangdata.com.cn/ViewHTML/DegreePaper_Y1194727.aspx

密析尔冷镜露点仪原理及工作方式关键词：冷镜法，露点仪，原理，工作方式基础技术 把露点的光学冷凝原理作为测定气体中水分含量的方法，已经有几百年历史。露点温度（即气体被冷却时，水蒸气开始冷凝成水或冰这一时刻的温度）精确地描述了气体的湿度。测量的主要不确定度及误差在于确定冷凝检测的时间，以及被测冷凝表面温度的精度。早期的手动露点仪常有工作上的错误，是因为它们的冷却循环方法是由外部冷冻剂（如二氧化碳或溶剂蒸发）进行的，加之可以看见的冷凝层所需要的时间滞后性，常常会导致对水分含量的低估。现代的自动冷镜传感器清除了这些缺陷， 提供的仪表是可以满足工业过程控制测量应用的要求，也可以工作在实验室条件下。冷镜露点仪工作原理 密析尔冷镜露点传感器有一个微型的抛光金属镜面，使用固态珀耳帖电加热泵将其冷却至被测气体露点温度。当温度降低到该露点时，镜面会形成冷凝。一个由红色发光二极管高增益光电探测器组成的电光回路检测冷凝的形成。镜面反射光强度减少量，作为仪表控制电路调整施加于珀耳帖的冷却功率的反馈输入，这样镜面就被控制在平衡状态中。蒸发速度与冷凝速度以相同的速率发生。此时（由铂阻温度计）测量的镜面温度就等于被测气体的露点温度。 提高性能第一步：双光路检测；两路反馈信号无疑比单路要可靠许多。[img]http://1862.img.pp.sohu.com.cn/images/2009/11/10/0/25/1258944290bg215.jpg[/img] 提高性能第二步：透镜聚焦；光路聚焦更精确，以显著增强测量敏感度。从下图可清楚看出其前后的改善。[img]http://1812.img.pp.sohu.com.cn/images/2009/11/10/0/25/12589438dc1g214.jpg[/img] 提高性能第三步：分光反馈；入射光通过分光镜到检测探头，形成反馈回路，以保持入射光强的恒定。[img]http://1862.img.pp.sohu.com.cn/images/2009/11/10/0/25/1258933aef9g213.jpg[/img] 另外，所有密析尔仪表冷镜产品均有自动补偿系统。定期对传感器光强度进行再平衡，补偿由于可能的污染引起的光强度减少。污染补偿 任何光学系统均会受到染影响。冷镜露点湿度仪也不例外。特别是清洁镜面后会减少光反射，虽然对仪表性能影响微乎其微，但是日益积累超过一定程度，系统将无法准确地运作。因此，所有密析尔冷镜仪表均植入了一个自动补偿系统自动平衡补偿（ABC）定期地重新平衡传感光学元件，补偿任何由于污染而引起的光强度地减少。Optidew和S4000型拥有各种周期和持续时间的ABC系统，使用户能根据特工业过程情况选择合适的时间。仪表还有可配置的数据保持系统，在ABC阶段中保持显示和输出数据，允许完全的连续的工业过程控制。密析尔最新的仪表Optidew具有动态污染纠正（即 DCC）。DCC是智能化的微处理器控制的系统，工作原理与ABC相同，但是检测和补偿污染更为先进，并能自动地纠正饱和条件，如当传感器处于气体凝露的[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=156245]冷镜露点仪原理[/url][img]http://1862.img.pp.sohu.com.cn/images/2009/11/10/0/25/1258944290bg215.jpg[/img]