冷冻制样原理

应用电子显微镜高分辨本领和高放大倍率，对物体组织形貌和结构特征进行分析和研究的近代材料物理测试方法。但样品的制作直接影响着结果的准确性，所以制作满足要求的样品就成了整个试验的重点。现将一些常见电镜制样方法简介如下。透射电镜（TEM）TEM放大倍数可达近百万，可以看到在光学显微镜下无法看清的0.1~0.2nm的细微结构。它的样品制备工作量非常大，约占全部测试工作的半数以上或90%以上，是十分关键的。图 透射电镜样品台常用样品台分为两种：顶入式样品台和侧插式样品台顶入式样品台要求样品室空间大，一次可放入多个（常见为6个）样品网，样品网盛载杯呈环状排列，使用时可以依靠机械手装置进行依次交换。优点：每观察完多个样品后，才在更换样品时破坏一次样品室的真空，比较方便、省时间。缺点：但是需要的空间过大，使样品远离下方物镜，不宜减小物镜焦距而影响电镜分辨力。侧插式样品台样品台制成杆状，样品网载放在前端，只能盛放1～2个铜网。优点：样品台体积较小且占用空间较少，可布置于物镜内上部，利于提高电镜分辨率。缺点：不可能一次投入多个样品网中，每换一个样品都要打破一次样品室内真空，稍有不方便。支撑网的选择：支撑网有多种材质如Cu、Ni、Be、尼龙等，选择时要与待分析样品的成分分开。图 筛网尺寸制备原则• 简单• 不破坏样品表面• 获得尽量大的可观测薄区主要制备方法• 支持膜法：• 复型法：• 超薄切片法：• 薄膜试样（电解双喷减薄，离子减薄，FIB等）1. 支持膜法适用范围：纳米颗粒（防止样品从铜网缝隙中漏出）支持膜种类：• 微栅膜• FIB微栅膜• 纯碳微栅膜• 多孔碳膜• Quantifoil规则多孔膜• C-flat纯碳多孔支持膜等图 筛网尺寸制备过程：• 制备支持膜：在铜网上覆盖一层有机膜后喷碳• 选择分散剂：根据样品性质选择，常用无水乙醇• 分散：使用超声波或搅拌将粉末分散成悬浮液液滴上支持膜（两种方法）：（a）滴样：用镊子将覆盖支持膜的铜网夹住，并用滴管向支持膜上滴入数滴悬浮液，使其保持夹持状态直至干燥为止（推荐）（b）捞取：用镊子夹持载网浸入溶液捞取液滴（缺点：双面挂样制备关键和注意事项：• 样品粉末能否在支持膜上均匀分布• 确保实验过程中未带入污染物2.复型法基本原理：利用电子束透明膜（碳、塑料、氧化物薄膜）复制材料表面或者断口形态的间接试样制备方法。适用范围：在电镜中易起变化的样品和难以制成薄膜的试样。样品要求：非晶态、分子尺寸小、导电性、导热性良好，耐轰击，有足够的强度和刚度。复型法分类：塑料一级复型、碳一级复型、塑料-碳二级复型、萃取复型。（1）塑料一级复型样品上滴特定溶液，溶液在样表面展平，多余的用滤纸吸掉，溶剂蒸发后样品表面留下一层100nm左右的塑料薄膜。图 塑料一级复型（2）碳一级复型利用真空镀膜装置将碳膜蒸镀于试样表面，将试样置于真空镀膜装置内，将试样置于所配的分离液内经电解或者化学分离得到分离碳膜便可应用于分析。图 碳一级复型（3）萃取复型图 萃取复型（4）塑料-碳二级复型通俗地说，塑料的一级复型中又制造出碳复型即为二级复型。分辨率相当于塑料的一级复型，对试样无损害，耐电子束辐照，复型带重金属投影。图 碳二级复型3. 超薄切片法适用范围：生物组织、较软的无机材料等。1.取材 2.固定 3.漂洗 4.乙醇或丙酮系列脱水 5.渗透 6.包埋 7.聚合 8.修块 9.切片 10.捞片染色 11.电镜观察注意事项：• 迅速：最短时间内取样,投入固定液• 体积小：所取样品体积不超过1mm3• 轻：轻轻操作，使用锋利器械，避免拉、锯、压• 准确：所取部位有代表性• 低温：在0～4℃内操作4.离子剪薄法适用范围：用于非金属材料或非均匀金属制备过程：• 预处理：按预定取向切割成薄片，机械抛光减薄到几十μm，把边长/直径切割至3mm。• 装入离子轰击装置：• 抛光：获得平坦而宽大的薄区。图 离子剪薄法5.电解双喷减薄法适用范围：只能制备金属试样，首选大块金属。样品准备：• 磨抛厚度均匀，避免穿孔偏• 样品保证清洁• 多准备一些试样，试合适的条件制备步骤：• 样品接正极、电解液接负极，电解液从两侧喷向样品• 样品穿孔后，自动停机• 获得中间薄，边缘厚，呈面窝状的TEM薄膜样品电解液选择：根据样品；不损伤仪器优点：条件易控制，快速，重复性好，成功率较高。图 电解双喷减薄法原理图6. 聚焦离子束法（FIB）适用范围：适用于半导体器件的高精度切割与线路修复。原理：采用从液态金属镓中提取离子束，并通过调节束流强度对指定区域进行快速精细处理。方法：铣削阶梯法，削薄法（H-bar）铣削阶梯法：• 预处理：铣削出两个反向的阶梯槽，中间留出极薄的TEM试样• 标记：刻蚀出定位标记• 定位：用离子束扫描定位标记，确定铣削区域• 铣削：自动或手动完成铣削加工图 铣削阶梯法制备的样品TEM照片削薄法（H-bar）：• 使用机械切割和研磨等方法将试样做到50-100μm厚• 使用FIB沉积一层Pt保护层• 使用FIB铣削掉两侧的材料图 削薄法工作示意图扫描电镜（SEM）扫描电镜样品制备比透射电镜样品制备简单，无需包埋和切片。样品要求：样品须为固体；达到无毒、无放射性、无污染、无磁性、无水分、组分稳定。制备原则：• 表面受到污染的试样，要在不破坏试样表面结构的前提下进行适当清洗，然后烘干；• 新断开的断口或断面，一般不需要进行处理，以免破坏断口或表面的结构状态；• 要侵蚀的试样表面或断口应清洗干净并烘干；• 磁性样品预先去磁；• 试样大小要适合仪器专用样品座尺寸。常用方法：块状样品块状导电材料：无需制样，用导电胶把试样粘结在样品座上，直接观察。块状非导电（或导电性能差）材料：先使用镀膜法处理样品，以避免电荷累积，影响图像质量。图 块状样品制备示意图粉末样品直接分散法：• 双面胶粘于铜片表面，借助棉球使被测样品颗粒直接撒布于其上，并用洗耳球对样品进行轻吹以去除粘附的、没有被牢固地固定的粒子。• 将装有颗粒的玻璃片翻起，对着已准备好的试样台用小镊子或者玻璃棒轻敲，使细颗粒能够均匀地落入试样台上。超声分散法：将少量颗粒放入烧杯内，加乙醇适量，超声震荡5分钟，然后用滴管加入铜片内，使其自然干燥。镀膜法真空镀膜真空蒸发镀膜法（简称真空蒸镀）就是将蒸发容器内需要成膜的原材料在真空室内进行加热，将蒸发容器内的原子或分子气化并从表面逸出，一种形成蒸气流并将其射入固体（称为衬底或基片）的表面以冷凝成固态薄膜的工艺。离子溅射镀膜原理：离子溅射镀膜在局部真空溅射室内辉光放电生成正向气体离子；在阴极（靶）与阳极（试样）之间电压加速时，荷正电离子轰击阴极表面并原子化阴极表面材料；生成的中性原子，向四面八方飞溅，射落在样品表面，从而在样品表面生成了均匀的薄膜。特点：• 对任何待镀材料来说，溅射都是可能的，只要它能够制成靶材即可（适用于难蒸发材料和不容易获得高纯度化合物的相应薄膜材料的制备）；• 溅射所获得的薄膜和基片结合较好；• 消耗贵金属少，每次仅约几毫克；• 溅射工艺具有良好的可重复性，膜厚可控，同时能在大范围基片表面得到厚度均一的膜。• 溅射方法：直流溅射、射频溅射、磁控溅射、反应溅射。1．直流溅射图 直流溅射沉积装置示意图已经很少使用了，由于沉积速率过低~0.1μm/min、基片加热、靶材导电、直流电压和气压都必须很高。优点：装置简单，容易控制，支模重复性好。缺点：工作气压高（10-2Torr）,高真空泵不起作用；沉积速率低，基片升温高，只能用金属靶（绝缘靶导致正离子累积）2．射频溅射图 射频溅射工作示意图射频频率：13.56MHz特点：• 电子作振荡运动，延长了路径，不再需要高压。• 射频溅射可制备绝缘介质薄膜• 射频溅射的负偏压作用，使之类似直流溅射。3．磁控溅射原理：用磁场使电子移动方向发生变化，电子移动轨迹被束缚与拉长，工作气体中电子电离几率增加，电子能量得到高效利用。由此使得正离子轰击靶材产生的靶材溅射变得更高效，可以在更低气压下溅射，而被正交电磁场捆绑的电子则会被束缚于靶材周围，仅能在它们能量消耗殆尽后沉积下来的基片中溅射。图 磁控溅射原理示意图特点：低温，高速，有效解决了直流溅射中基片温升高和溅射速率低两大难题。缺点：• 靶材利用率低（10%-30%），靶表面不均匀溅射；• 反应性磁控溅射中的电弧问题；• 薄膜不够均匀• 溅射装置比较复杂反应溅射溅射气体添加氮气、氧气、烷类等少量反应气体，反应气体和靶材原子共同沉积于衬底上，对于某些不容易发现块材而制造靶材的物质，或者溅射时薄膜成分易偏离靶材原成分，均可用此法进行。反应气体：O2，N2，NH3，CH4，H2S等镀膜操作将制备完成的样品台放置在样品托上，放入离子溅射仪，加盖，旋紧螺丝并开启电源抽真空。当真空趋于稳定时，在5 X10-1mmHg左右，按下“启动”键，用调节针阀把电流调节到6~8mA,开始镀金，镀金1分钟后即自动停止镀金，关好电源、打开顶盖螺丝、放掉气体、取下试样即成。图 Cressington 108Auto高性能离子溅射仪冷冻电镜制样冷冻电镜是扫描电镜超低温冷冻制样传输技术（Cryo-SEM）可以实现液体，半液体和电子束敏感样品的直接观测，例如生物和高分子材料。样品经超低温冷冻，断裂和镀膜制样（喷金/喷碳）后可由冷冻传输系统置于电镜中的冷台上（温度可至-185°C）观察。适用范围：塑料，橡胶及高分子材料，组织化学，细胞化学等样品制备要求：能够保持本身的结构，又能抗脱水和电子辐射方法：（a）通过快速冷冻使含水样品中的水处于玻璃态，也就是在亲水的支持膜上将含水样品包埋在一层较样品略高的薄冰内。图 液氮冷冻（b）采用喷雾冷冻装置（spray-freezing equipment），结合基质混合冷冻技术（spray-freezing），可在极短时间内将两种溶液（如受体和配体）混合（ms量级），然后快速冷冻。图 喷雾冷冻装置金相制样金相分析是材料研究领域中非常重要的一个环节，也是材料内部组织研究的一种主要方法。利用定量金相学原理通过对二维金相试样磨面或者薄膜进行金相显微组织测量与计算，确定合金组织在三维空间中的形态，进而建立合金成分，组织与性能之间定量关系。制样过程：样品切割、镶嵌样品、机械制样、检验样品样品切割方法：金相最适合的切割方法是湿式切割轮切割法。优点：所造成的损伤与所用的时间相比是最小的切割片的选择：主要依据材料的硬度和韧性进行选择。图 砂轮片的选择• 陶瓷和烧结碳化物：金刚石切割片• 钢铁材料：氧化铝（Al2O3）切割片和CBN切割片• 有色金属：碳化硅（SiC）切割片镶嵌样品金相样品镶嵌技术（以下简称镶样）是将试样尺寸小或形状不规则造成研磨抛光痛苦时镶嵌或夹持，以便于试样抛磨，提高工作效率和实验精度的一种工艺方法。镶样一般分为冷镶和热镶。冷镶应用：对于温度和压力极为敏感材料、和微裂纹试样要进行冷镶，会使试样组织不发生改变。图 冷镶示意图冷镶材料：一般包括环氧树脂、丙烯酸树脂、聚脂树脂。• 环氧树脂：收缩率低，固化时间长；边缘保护好，用于真空浸渍，适用于多孔性材料；• 丙烯酸树脂：黄或白，固化时间较短，适合批量大、形状不规整样品镶样；对于含裂纹或者孔隙的试件渗透性更好；尤其是对印刷电路板的封装；• 聚酯树脂：黄色、透明、固化时间较长；适用于大批量无孔隙的试样制样，适用期长；真空浸渍：多孔材料（如陶瓷或热喷涂层）需真空浸渍。树脂能增强这些脆弱材料并能尽量减少制备缺陷（例如抽出，开裂或未开孔等）。只有环氧树脂由于其低粘度、低蒸汽压的性质，才能在真空浸渍中使用。荧光染料和环氧树脂可以被混合以方便地发现荧光灯中所有被充填的孔隙。图 冷镶制样 图片来源：司特尔公司热镶应用：适用于低温及压力不大的情况下不发生变形的样品。图 热镶示意图镶材料：目前，通常多用塑料做镶嵌材料。镶嵌材料包括热凝性塑料（如胶木粉），热塑性塑料（如聚氯乙烯），冷凝性塑料（环氧树脂加固化剂）和医用牙托粉与牙托水。胶木粉不透光、色泽多样、且较坚硬、样品不易倒角、但抗强酸、强碱耐腐蚀性较差。聚氯乙烯呈半透明或透明状，抗酸碱耐腐蚀性能良好，但柔软。热镶试样图片来源：司特尔公司机械制样机械制样可分两种操作：研磨和抛光1.研磨研磨的终极目标就是要得到损伤最小的平表面。这些小损伤会在后续抛光中短时间内被去除。研磨分为粗磨和细磨两个过程。• 粗磨粗磨过程就是把全部试样表面变成一个类似的面，用比较粗的固定研磨颗粒就能快速磨去材料。• 精磨 精磨会使样品有些微变形，但这些变形在抛光过程中就会消除掉。2.抛光抛光就像研磨，还得除去前道工序造成的伤害。它可以分为金刚石抛光与氧化物抛光两大工序。• 金刚石抛光唯有把金刚石当作研磨料来抛光才有可能在最快的时间内得到最佳研磨平面。其原因是金刚石非常坚硬，几乎能切割所有的物质和相态。• 氧化物抛光 对于特别软、韧性的样品，须采用氧化物抛光法。抛光在抛光布上完成。金刚石抛光时还须用到润滑剂。研磨和抛光设备检验样品打磨后的检测部位变的发亮，在观察组织的时候需要先将试样的检测部位腐蚀掉，做好之后使用酒精冲淋，使用吹风机吹扫。

p 　 strong 　仪器信息网讯 /strong 2015年5月29日-6月2日，“2015全国生物医学农林 a href=" http://www.instrument.com.cn/zc/1139.html" 电镜 /a 技术研讨会暨生物电镜前沿技术培训班”在浙江大学举行。本次会议特别邀请了国内外知名专家教授和电镜工作者讲授生物电子显微镜技术的最新发展，交流生物样品制备和应用方面的技术经验，并安排部分学员参加实验操作及演示。 /p p 　　台湾中央研究院植物暨微生物学研究所简万能博士作了题为“Ultrastructure of plant cells using high pressure freezing and freeze substitution”的报告。 /p p style=" text-align: center" img alt=" " src=" http://img1.17img.cn/17img/old/NewsImags/images/201565105212.jpg" style=" width: 500px height: 333px" / /p p style=" text-align: center" strong 简万能博士 /strong /p p 　　据介绍，由于早年看到所有的教科书都说想要获得更好的电镜观察结果，就要用冷冻制样技术，简万能便开始了这方面的研究，然而不做不知道，一做才知道有多难。冷冻制样对于动物来说比较简单，而对于植物来说由于细胞壁的影响却非常难。20年来，在研究当中，他碰到的失败的次数永远比成功多。“但是当你成功后，你会发现你的眼界比以前做化学固定大得多。”简万能这样说道。 /p p 　　“电镜是生物学研究非常有用的工具。由于生物细胞的含水量可以达到80%-90%，所以制样能否成功主要是解决水的问题。传统的透射电镜制样技术，对样品损伤最大的步骤是脱水，往往使得细胞结构发生很大的变化。而利用冷冻制样最大的优点就是可以保持细胞原来的结构，并保持一些可溶性的物质。如果要做溶在细胞质里的元素分析，一定要采用冷冻制样技术。” /p p 　　由于水在冷冻的过程中会形成冰晶影响观察，所以在如何避免形成冰晶是冷冻制样的一个关键点。简万能表示：“在制样中一定要注意一些关键的温度节点。如-137℃是水的重结晶点，如果能迅速降低到这一温度，样品中的水就会形成玻璃态的冰。如果超过-70℃，玻璃态的冰就会形成二次冰晶。” /p p 　　在报告中，简万能介绍了目前常用的冷冻方法，如投入式冷冻、冷金属块撞击式冷冻、丙烷喷射冷冻、高压冷冻等。并指出高压冷冻的优点是可以做活的生物样品，可以做超过200& amp #956 m厚的样品。 /p p 　　此外，简万能还介绍了在冷冻固定之后，如何更好的实现冷冻置换。他表示，如果要做超薄切片，高压冷冻和冷冻置换是最好的选择，可以获得非常好的样品形态，会有更多的信息被保留。 /p p 　　在研讨会之后，简万能博士亲自指导参加培训的学员，进行了投入冷冻、高压冷冻、冷冻置换等实验操作。 /p p style=" text-align: right " 撰稿：秦丽娟 /p p style=" text-align: left " & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp 第一届电镜网络会议： a href=" http://www.instrument.com.cn/webinar/icem2015/" _src=" http://www.instrument.com.cn/webinar/icem2015/" http://www.instrument.com.cn/webinar/icem2015/ /a /p

应用专家 肖丽国 期待已久的华东电镜会于10月24日在美丽的宜兴东氿湖畔落下帷幕，徕卡显微系统分别在材料分会与生命科学分会两个分会场进行专题报道，为大家介绍Leica在不同研究领域中的电镜制样解决方案。 生命科学专场中UM应用专家肖丽国在大家的心头种了一把草，通过介绍Leica在Cryo TEM与Cryo SEM方向的解决方案和多个应用实例，为大家安利了一套全新的电镜制样设备。图1 生命科学分会场专题报道自2017年的诺贝尔化学奖颁布，冷冻电镜技术就以不可阻挡的态势走进大家的视野。Leica作为专业的电镜制样设备专家，在冷冻电镜制样上有着全流程的解决方案。 Cryo TEM在Cryo TEM方向，想要实现在黑白成像的冷冻透射电镜中快速找到目标小样品，以前是非常困难的，耗时又费力。Leica结合自身的光学成像优势，推出了一套冷冻光电联用系统Thunder Imager EM Cryo CLEM，能够实现低温光学荧光成像。通过与各类电镜进行软件和硬件上的联用，利用荧光与电镜位置叠加，实现在电镜下快速寻找和成像，极大地提高了工作效率。图2 Thunder Imager EM Cryo CLEM 图3 样品展示Cryo SEM在Cryo SEM方向，Leica拥有真正的真空冷冻传输系统EM VCT500，在对低温样品进行安全传输和转移的同时，可以将常温SEM升级为冷冻SEM，实现冷冻扫描观察。当然，扫描不仅可以观察表面，Leica冷冻断裂镀膜系统EM ACE600可以实现冷冻断裂，将低温样品敲断后镀膜，通过EM VCT500即可转移至Cryo SEM中进行冷冻断面观察，实现立体断裂成像，极大扩宽了应用范围。图4 Cryo VCT500制样技术解决方案 图5 样品展示如需了解更多内容，请返回点击右下角联系我们吧！

近期，QRB discovery在线发表了中国科学院生物物理研究所研究员章新政课题组题为Low-cooling-rate freezing in biomolecular cryo-electron microscopy for recovery of initial frames的研究论文。研究发现了在冷冻电镜成像过程中导致电子束诱导蛋白质样品快速漂移的新机制，并提出通过降低冷却速率制备无快速漂移的冷冻电镜样品的新方法。该方法可以有效恢复辐照损伤最少，含最多高分辨信号的成像数据质量，提升重构分辨率，实现辐照损伤敏感氨基酸的高分辨重构，高分辨信号的恢复也为冷冻电镜达到原子分辨率奠定了基础。　　1980年代，有科学家把含水样品快速投入到-183℃的液态乙烷中，制备包埋在玻璃态冰中的低温样品来减少生物样品受高能电子束照射产生的损伤。一般认为，降温速率越快越容易产生玻璃态冰，但是玻璃态冰中的蛋白质在电子束照射初期会产生快速漂移，无法矫正，使冷冻电镜前几帧成像模糊而无法有效应用于三维重构。电子束曝光初期的冷冻电镜数据具有最小的辐照损伤，含有最主要的高分辨信号，所以电子束诱导的快速漂移是实现原子分辨率结构解析以及易辐照损伤氨基酸高分辨重构所需要克服的壁垒，有科学家称其为冷冻电镜中的“Key outstanding problem”。　　经过近5年的攻关，研究人员发现快速漂移源自玻璃态冰在急速冻结时产生的应力，该应力和过高的降温速率相关，可以通过降低冷却速率来减少。通过优化冷冻制样技术，降低冷冻过程中样品的降温速率，研究实现了蛋白质快速漂移的消除（如图）。在降低冷却速率制备得到的冷冻样品中，数据分析展示出冷冻电镜前几帧数据被有效恢复，从恢复的电子密度图中可以清晰看到在普通冷冻样品结构中无法得到的辐照损伤敏感的氨基酸侧链信息。　　研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金委员会重点项目、中科院战略性先导科技专项（B类）、中科院基础前沿科学研究计划项目的支持。　　论文链接 降低样品冷却速率消除快速漂移示意图。a.通过降低样品冷却速率，冷冻电镜前几帧数据明显恢复。b-c.增加载网与镊子的传热在载网形成的冷却速率梯度和在不同冷却速率下GDH样品前几帧的恢复情况。d-e.提高液态乙烷温度至-110℃时制备的铁蛋白样品，以及在不同温度下铁蛋白前几帧的恢复情况。f.冷冻电镜前几帧恢复后，易受辐照损伤的氨基酸侧链密度图对比

p 　　5月29日，清华大学生命科学院博士生张森森的蛋白样品9时准时在液氮环境下进入冷冻电镜。几天后，埃(10-10)级精度的蛋白质“高清3D彩照”将出炉。研究人员可以“直视”单个蛋白质的分子结构，并解出生命运转机理。 /p p 　　这期间，冷冻电镜中的电子枪将持续发射电子，每次看一个小单元。为了解释这个“小单元”，张森森为科技日报记者示意了一个“镊子尖”大小的小金片，“金片上约有200个左右的均匀小孔，每个小孔中再分150个小孔，电子束一次只‘看’其中一个小孔。”金片类似蛋白质的“载玻片”，与光学显微镜不同的是，载玻片透光，小金片要透电子，容许电子束透过样品时受到散射。散射信号被捕捉记录下来，计算后可呈现分子结构。 /p p 　　透射式电镜的生产能力是冷冻电镜制造能力的基础之一。“国内没有一家企业生产透射式电镜。”赛默飞公司技术支持陈宝庆说得不假思索，他毕业于北京大学地球物理专业，对行业非常了解，他介绍，“之前还有几个企业制造，比如原江南光学仪器厂现在就不造了。” /p p style=" text-align: center" img style=" width: 450px height: 324px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201806/insimg/5bbc5225-5cff-4593-b15c-7a70f246a589.jpg" title=" 03.jpg" height=" 324" hspace=" 0" border=" 0" vspace=" 0" width=" 450" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 透射式电镜 /span /p p 　　 strong 能做到单电子束控制的灯丝，只有进口 /strong /p p 　　“理论上说，只要施加足够强的电场，电子就会从材料中‘游’出来。”陈宝庆说。但“游”的状态与可以使用的电子状态相距甚远。 /p p 　　什么样的电子才能为蛋白质拍摄高清3D彩照呢?东南大学材料科学与工程学院万克树教授描述了理想的状态：速度完全一样的电子，从“源头”的一个点上、非常多地发射出来。 /p p 　　“这些要求是相互矛盾的。”万克树解释，电子从材料表面溢出，要发射电子多，面积就要大，但是面积大了就难以满足一致性要求。 /p p 　　如果把电子枪想象成一把枪，它必须以“狙击”的精度完成机枪的扫射，“子弹”的角度、速度完全一致。 /p p 　　“电子的能量要做到高度一致，虽还达不到激光的程度，但也必须是很窄的分布。”陈宝庆解释，电子“子弹”一致性是提高图像分辨率的前提。 /p p 　　为此，电子枪的核心构造其实是一根极细的“陀螺针”，形似陀螺，尖端却比针还细。电子从尖端出发，在真空的环境下，前去与大分子“相撞”，进而反映出分子构象。 /p p 　　“之前的技术路线是通过加热让电子枪发射电子，发射源(俗称“灯丝”)用钨丝或六硼化镧，需要2500℃左右，高温促使电子发射，但也使电子异常活跃、难以控制，因此热发射电子枪的电镜精度低。”万克树说。 /p p 　　“场发射是通过高压电场，把电子从‘灯丝’里拉出来，室温下可完成。”万克树说，“所用灯丝国内没有生产，全部依赖进口，每根上万美元左右。” /p p 　　他提到的常温场发射枪(肖特基电子枪)是将氧化锆沉积在单晶钨的晶体的特定面上。FEI公司后来在电子枪生产上又有了新的突破，将热和场结合起来，稳定性进一步提升。在清华大学冷冻电镜实验室的仪器介绍中可以看到，一台2013年购买、2015年到货的最新型号电镜在电子枪一栏标明“X-FEG”，有中文翻译为超稳定高亮度电子枪。“所用灯丝在材质上与之前的一致，工艺不同能够使亮度更强。”陈宝庆介绍。 /p p 　 strong 　上了邮票的科研成就，被中断 /strong /p p 　　场发射的另一个关键部分是牵拉出电子的外加电场，电场电压高达300千伏。“在这样的高压下保持电压稳定，才能‘拉’出稳定一致的电子，专业上称为‘单色性好’。”万克树说。 /p p 　　据题为《中国透射式电子显微镜发展的历程》的文章记载，1963年，我国就开始了高压100kV电子枪稳定因素探讨的实验，1965年完成样机，中国自主研制透射式电镜于1979年达到当时的国际先进水平，还专门为国产的电子显微镜发行过纪念邮票。 /p p 　　该领域的研发却由于种种原因一度中断。“直到几年前，中国也试图重启这方面的公司，也曾立项想要完成场发射透射电镜的自主研发。”陈宝庆回忆，曾经有相关的科研人员，辗转找到他询问，为什么FEI公司没有相关专利。 /p p 　　“他们想到的捷径之一是把生产厂商的专利拿来参考，但是其中很多生产工艺是秘方级别的，根本不会外传。”陈宝庆说。 /p p 　　 strong 从“看人影”到“辨雀斑”，中国研发没使上劲 /strong /p p 　　“如今，中国只有一家企业生产扫描电镜，透射电镜完全不生产了。”陈宝庆说，德国蔡司公司也停止了透射电镜的生产，目前世界上生产透射电镜的厂商只有3家，分别是日本电子、日立、FEI(2016年被赛默飞公司以42亿美元收购。) /p p 　　没有市场是设备巨头纷纷放弃透射电镜的原因。“透射电镜之前的清晰度，使得冷冻电镜在科学研发上基本没有实际作用。”陈宝庆说。可以理解为，以前只能看清楚个人影，现在却能辨认清楚脸上的雀斑。 /p p 　　除了电子枪的原理变化，冷冻电镜上其他的技术精进，例如三维重建算法的实现、样品制作机器人的研发成功等，使得冷冻电镜的分辨率大规模提升，成为生命科学研究的利器。 /p p 　　在冷冻电镜从“看人影”到“辨雀斑”的发展历程中，中国没有使上劲。在冷冻电镜实验室中，从耗材到配件都必须进口。“加样台10万元一个、小金片50元一个、外托150元一个??”张森森说，所有匹配冷冻电镜使用的工具都需要原装，根本不存在“山寨版”。零件坏了找不到人修理，只能等待零件邮寄到货后进行更换。对于中国的冷冻电镜使用者们来说，这样的体验可能还要持续不短的时间。 /p

我国海洋领域首个冷冻电镜中心建成，目前已全面对外开放共享，为用户提供样品制备、数据解析等服务。冷冻电镜也称低温电子显微镜，是一种能够对生物样品实现高分辨三维结构解析的高精尖设备。“如果说天文望远镜观测的是极宏观的天体，那么冷冻电镜则是针对极微观的生物大分子，观测水平达到十分之一纳米（百亿分之一米）级别。” 海洋试点国家实验室冷冻电镜中心主任沈庆涛教授说，冷冻电镜技术目前还非常新颖，但已经在生物学领域产生了极大影响，被诺贝尔奖官方称为“使得生物化学进入一个新时代”的技术。自2013年开始，冷冻电镜成为诸多诺奖级论文成果的得力助手。海洋试点国家实验室建设的冷冻电镜中心，是山东省首个冷冻电镜中心，也是我国乃至全球首个聚焦海洋生命科学的冷冻电镜中心。“生命来源于海洋，但目前国内外对陆地生物的研究比海洋生物更全面更系统，冷冻电镜的工作也多集中在陆地模式生物上。” 沈庆涛介绍，针对生命科学回归海洋的趋势，充分发挥海洋试点国家实验室的“向海”特长，他们建立了海洋领域首个冷冻电镜中心，以海洋生物为研究目标，推动海洋生物学从宏观走向微观，从生态、细胞水平走向分子水平。为了保证冷冻电镜的高分辨率解析能力，海洋试点国家实验室同时配备了冷冻电镜中心环境适配系统。“冷冻电镜设施昂贵精密，对于每个样品通常需要花费2-3天拍摄成千上万张照片，提取近百万生物大分子颗粒进行后续的图像处理。” 沈庆涛表示，在此过程中，环境适配系统能够对温度、湿度、磁场、震动等因素进行控制并适配，从而保证冷冻电镜自始至终状态稳定。

前言细胞中的RNA质量控制，如RNA的降解及RNA总量稳定的调控，被细胞内的多种蛋白质机器精确调控，比如被称为细胞监视器的RNA外切体（exosome)，RNA外切体激活子NEXT复合物（Nuclear exosome targeting complex），从而维持机体的正常生理功能。NEXT在剪切体上游行使功能，招募RNA外切体对新转录出来的RNA进行降解。很长一段时间里，结构生物学手段利用晶体学手段尝试解析NEXT的结构，以期了解NEXT调控RNA质量稳定的作用机制，但由于复杂的结构组成和高度动态的特征结构解析一直未果。近日，冷冻电镜让NEXT复合物的结构得以呈现，RNA质量稳定背后的详细机制得以窥见。在生物学中，清理机体产生的“废物”与制造物质同等重要。生物体产生的不再需要的细胞、蛋白质或其他分子的聚集，如不及时处理，会导致机体产生一些问题。不过，生物已经进化了出多种方法来完成清理多余物质的清理。一个典型的例子是RNA外切体。RNA分子在细胞中扮演许多角色。其中一些被翻译成蛋白质，一些则与细胞的蛋白质一起形成蛋白质-RNA机器。RNA外切体是一种细胞机器，可以降解有缺陷、有害或不再需要的RNA分子。如果不依靠外切体进行修剪，我们的细胞就会变成功能失调的囤积者，进而无法正常行驶功能。“RNA的监测和降解途径存在于所有形式的生命中，”斯隆凯特林研究所结构生物学项目主席Christopher Lima解释说。“从细菌到人类，所有生物都有监测RNA的状态并靶向降解RNA的机制。Lima博士说，在很长一段时间里，这些降解通路被认为像家务一样，是重复且枯燥的。但事实证明，这些降解通路受到高度调控，并控制着从胚胎发育到细胞周期的许多过程。更重要的是，通路一旦发生失调，从癌症到神经系统退化的许多类型疾病便会产生。在2022年6月9日发表在Cell上的一篇新论文中，Lima博士和实验室的博士后研究员Puno提出了有助于解释RNA外切体如何定位需要降解的RNA的研究结果。在冷冻电镜的帮助下，科学家们解析了一种RNA降解机制的关键部分，名为细胞核外切体靶向复合物（ Nuclear Exosome Targeting ，NEXT）的蛋白质组装体的结构。“我们知道NEXT将RNA靶向递送到RNA外切体，但在生物化学和结构上，我们不知道它是什么样子，也不知道它是如何工作的。”—Puno 结构生物学家现在，通过冷冻电镜，科学家们首次获得了获得了NEXT与RNA结合的第一张清晰图片。这些图片及相关的生化和生物实验揭示了RNA分子被传递到RNA外切体并进行降解的过程。逐渐了解结构几年前，Puno博士开始使用当时的金标准X射线晶体学方法研究NEXT的结构。在这种方法中，蛋白质首先首先进行晶体生长，它们以相同的方式排列并形成晶体。然后，X射线穿过晶体并击中探测器，所形成的图案被用来确定蛋白质的结构。虽然Puno博士能够结晶NEXT蛋白，但由此产生的X射线衍射图像不足以看到结构的细节。“不过，随后出现了冷冻电镜革命，”他说。“冷冻电镜帮助我们可视化这种蛋白质的样子以及它如何结合其RNA底物。动态蛋白质的可视化冷冻电镜的工作原理是捕获冷冻但非结晶的蛋白质样品的许多不同图像，然后使用计算方法将它们校准成最终的清晰图像。“这几乎就像捕捉一堆飞行中的鸟的照片，”Lima博士说：“鸟在飞行过程中又多种动作，导致鸟的翅膀看起来很模糊。但是，如果我们能在所有这些不同的图片中找到翅膀的部分，那么我们就可以通过对齐这些图片来重建鸟的翅膀的样子，并确定它们是如何工作的。”从冷冻电镜图片中，科学家们能够看到NEXT蛋白形成了一个非常灵活的二聚体：这意味着NEXT蛋白的两个单体在一起形成一个功能单元。Puno博士说：“这真的非常非常令人费解”，并指出这些类型的蛋白质以前没有可视化过二聚体的形成。“这几乎就像捕捉一堆飞行中的鸟的照片”—Lima 结构生物学家“从我们进行的生化实验中，我们知道二聚化对降解很重要，”他继续说道。“但对我们来说，尚不清楚二聚体在引导RNA到RNA外切体的过程中起了什么作用。为了解开这个谜团，研究小组希望在降解的不同步骤中捕获相互作用的NEXT复合物，然后用冷冻电镜将这些构象可视化。RNA的降解与疾病RNA降解的重要性不言而喻：有缺陷或失控的降解会引起许多疾病。最著名的例子是便是囊性纤维化，在这种情况下，一些负责编码离子通道或者转运体蛋白的信使RNA被RNA降解通路降，这使得肺粘膜中的一些关键蛋白质无法正常表达，从而造成粘液的堆积并导致呼吸严重受损。“这是RNA质量控制失调的一个典型例子，”Lima博士说。RNA降解途径的缺陷也在几种类型的癌症中发挥作用。事实上，MSK的基因检测平台MSK-IMPACT检测的与RNA外切体途径相关的两个突变基因，其中一个突变在NEXT蛋白上。“不仅信使RNA需要适当的质量控制，”Lima博士解释说。“现实情况是，如果你的RNA质量控制通路出现了问题，你的核糖体将不起作用，你的转移RNA将不起作用，你的剪接体也将不起作用的话，引起一系列连锁反应，会有很多种疾病找上门来”RNA所起的作用之广解释了为什么有缺陷的RNA降解途径会产生严重的致病作用。要理解这些效应，不仅需要对RNA外切体本身有更深入、更广泛的了解，还需要对NEXT等“上游”蛋白质有更深入、更广泛的了解，这些蛋白质有助于监测RNA并确定RNA何时存在缺陷或不再需要。“我们希望能在体外进行RNA降解反应，将样品放入冷冻电镜中，并捕捉到它们在工作时所有可能动态构象。”Lima博士说。“作为结构生物学家，我们希望能够看到动态的过程，重现其工作过程。相关文献摘要RNA质量控制依赖于辅助因子和链接物来识别和准备底物，以便由核糖核酸酶（如3′到5′核糖核酸外显子）进行降解。我们解析了人源细胞核外切体靶向蛋白（nuclear exosome targeting ，NEXT）结合RNA的复合物的冷冻电镜结构，为底物识别以及RNA移交给RNA外切体之前作用机制提供了见解。结构揭示了ZCCHC8作为一个支架蛋白，形成同源二聚体，和MTR4螺旋酶相互作用并介导将柔性较大的RBM7结合到解旋酶的核心位置。三个亚基协同作用以结合RNA：RBM7和ZCCHC8检查3′端上游的序列，促进MTR4捕获RNA。ZCCHC8覆盖了MTR4的表面，这对RNA的结合和释放以及MPP6依赖性的招募和对接到RNA外切体核心很重要。这些相互作用，通过协调RNA的捕获、移位和从螺旋酶中释放到外切体中，完成RNA的降解和调控。总结 RNA的质量控制是细胞生命的重要组成部分。 RNA外切体会降解有缺陷、有害或不再需要的RNA。 科学家们已经使用冷冻电镜来确定降解机制关键部分的结构，称为NEXT。 NEXT蛋白的突变可导致包括癌症在内的疾病。相关文献Structural basis for RNA surveillance by the human nuclear exosome targeting (NEXT) complex

原位硅油冷冻干燥机：精确控制与高效保护的结合一、用途：　　原位硅油冷冻干燥机是一种广泛应用于食品、医药、化工等行业的先进设备。它以其出色的性能和高效能力，成为实现物料低温干燥、保持原有品质和延长储存周期的理想选择。　　二、原理：　　该产品利用了“减压降温”技术来进行低温干燥。首先，将待处理物料置于真空环境中，在减压条件下蒸发水分。然后，通过对硅油进行循环加热和降温，使得润湿在待处理物料表面的水分迅速被固化并转化为固态水。最后，在真空状态下通过恢复常压给予样品光辐射或微波加热使定向剂从乳液中释放出来, 以达到快速脱溕目标。　　三、性能特点：　　1. 精确控制：该设备配备了智能控制系统，可实时监测和调整各项参数如温度、压力和时间。操作人员可以根据需求进行精确设置，以实现最佳的干燥效果。　　2. 高效保护：该产品在干燥过程中能有效减少对物料的损伤。通过低温处理，能够很好地保留物料的营养成分、香气和口感，在同时降低细菌滋生的风险的情况下延长其储存周期。　　3. 广泛适用：该设备可用于各种食品、药品等材料的干燥处理。不同类型和状态（固体、液体或胶体）的样品均可以使用该产品进行高质量的干燥处理。　　4. 结构稳定耐用：设备采用优质材料制造，并经过严格测试，确保工作稳定并提供长期可靠使用。　　四、结论：　　原位硅油冷冻干燥机是一款功能强大且高效可靠的工业设备，在多个行业中都担当着关键角色。通过其精确控制和高效保护性能，它为企业提供了更好地保存产品质量和延长储存期的保障。无论是食品加工、医药生产还是化工领域，该产品都展示出了其重要性和价值。

冷冻干燥是利用升华的原理进行干燥的一种技术，是将被干燥的物质在低温下快速冻结,然后在适当的真空环境下,使冻结的水分子直接升华成为水蒸气逸出的过程. 冷冻干燥得到的产物称作冻干物，该过程称作冻干。 物质在干燥前始终处于低温(冻结状态),同时冰晶均匀分布于物质中,升华过程不会因脱水而发生浓缩现象,避免了由水蒸气产生泡沫、氧化等副作用。干燥物质呈干海绵多孔状，体积基本不变，极易溶于水而恢复原状。在最大程度上防止干燥物质的理化和生物学方面的变性。 冷冻干燥机原理简单易懂，但是在应用在具体行业里时，却也有着很多的区别。 近代干燥机开始使用的是间歇操作的固定床式干燥机。19世纪中叶，洞道式干燥机的使用，标志着干燥机由间歇操作向连续操作方向的发展。回转圆筒干燥机则较好地实现了颗粒物料的搅动，干燥能力和强度得以提高。一些行业则分别发展了适应本行业要求的连续操作干燥机，如纺织、造纸行业的滚筒干燥机。 20世纪初期，乳品生产开始应用喷雾干燥机，为大规模干燥液态物料提供了有力的工具。40年代开始，随着流化技术的发展，高强度、高生产率的沸腾床和气流式干燥机相继出现。而冷冻升华、辐射和介电式干燥机则为满足特殊要求提供了新的手段。60年代开始发展了远红外和微波干燥机。 用于进行干燥操作的机械设备类型很多，根据操作压力可分为常压和减压（减压干燥机也称真空干燥机）。根据操作方法可分为间歇式和连续式。根据干燥介质可分为空气、烟道气或其他干燥介质。根据运动（物料移动和干燥介质流动）方式可分为并流，逆流和错流。 按操作压力，干燥机分为常压干燥机和真空干燥机两类，在真空下操作可降低空间的湿分蒸汽分压而加速干燥过程，且可降低湿分沸点和物料干燥温度，蒸汽不易外泄，所以，真空干燥机适用于干燥热敏性、易氧化、易爆和有毒物料以及湿分蒸汽需要回收的场合。 在具体应用中，如：海参冻干，机械冻干，药物冻干，食品冻干，都是应用着不同的类型的冻干设备。 简单的说，就是冻干所需要技术条件，科技条件。难度越大，要求越高，产品的成本自然也更高，价格也更高。 产品的捕水量，最低温度也是有区别的。具体的需求量，还是要看产品的要求。

在适当的时候结束初级和次级干燥步骤是提高冷冻干燥过程效率的一个关键方面。使用压力作为终点判定标准是确定这两个冻干步骤终点的一个很好的方法。下文中会描述原理和相关的工具来进行压差测量。文中的实验数据对建立最合适的终点标准时会起到作用。上周末我和一群朋友去山里徒步旅行。我们走了几个小时，午饭时间到了一间小屋。此时，我们已经完全没有体力活动和呼吸新鲜的空气了。我们坐下来，点了很多好吃的东西，然后开始把自己弄得傻乎乎的。当我发现肚子里有压力和疼痛时，我才停下来。我的胃不舒服地扩大了我徒步旅行短裤的腰围，并成为这个午餐时间暴食的一个明显的终点标准。当我坐在那里，试图消化和准备继续前行时，我陷入了沉思。老实说，每当我陷入思考的时候，我通常都在想着实验室。当我感觉到胃里的压力逐渐减轻时，我回想起的不仅是一顿丰盛的饭菜，还意识到压力对于判定终点非常有帮助。我在之前已经讨论了冷冻干燥后使用温度来确定次级干燥步骤的终点。在这里，我想给您介绍一个基于压力差的替代方法。冷冻干燥事实上，压力差测试是一种非常好的无损终点检测方法，用于确定初级或次级干燥阶段的结束。该技术使用两种不同的压力计，一个皮拉尼传感器和一个电容压力计。皮拉尼传感器的工作原理是气体的热导率随压力变化。压力计用一根细导线悬挂在气体中，用电流加热来测量压力。在高压下，由于周围气体分子与金属丝的高碰撞率，金属丝将热能损失给气体。这一原理如下图所示。当真空降低时，气体分子的数量和周围介质的导电性一起减少。然后，媒介开始慢慢失去热量。由于这一过程依赖于气体分子的热导率和气体成分，皮拉尼传感器只能在其校准条件下显示正确的压力，而校准条件通常设置在纯氮或空气环境中。除了皮拉尼传感器外，电容式压力计还用于独立于气体成分测量压力。对于这种类型的压力计，电容信号的差异是由压力计内部的物理变化产生的，而不是气体性质的变化。因此，用电容式压力计测量压力与气体成分无关。如果您像我一样，您可能会想知道这两种工具在这种终点确定中是如何协同工作的。在冷冻干燥过程中，由于冰的升华，干燥室内的气体几乎完全由水蒸气组成。样品干得越多，气体成分的变化就越大。水蒸气被氮气或空气代替，直到干燥过程结束时，室内气体只含有纯氮气或空气。由于水蒸气的热导率比氮气的热导率高约 1.6 倍，皮拉尼压力计在纯水环境中的测量偏差约为 60%。皮拉尼压力计和电容式压力计只能在样品干燥后测量相似的压力，并且室内气体的成分主要是纯氮或空气。因此，当到达终点时，两个工具显示的压力相同。下图以图形方式描述了该过程。重要的是，压力波动阻止了这两种测量工具之间的差异达到零。一个合适的终点标准应高于压力波动引起的差值。该值还应足够低，以确保在切换到下一个冻干步骤之前，两个显示压力之间的差异在给定的时间内最小。听起来很简单。但是如何真正建立一个合适的终点标准呢？为了找到合适的压差，我们使用测试方案进行多次测试：我用甘氨酸溶液（去离子水中 5%W/V）作为试验溶液。将溶液在 -40°C 下冷冻 24 小时以上，并在冷冻干燥机上以 0.3mbar 的压力进行干燥。重要的是，在每次冻干循环之前，应进行真空试验，以校准皮拉尼压力计。此步骤是强制性的，以确保皮拉尼压力计在干燥阶段前后显示正确的压力。为了找到一个合适的终点标准，我以不同的压差作为终点标准进行了多次试验。当隔板的温度与样品的温度一致，两个压力计的压力合并时，终点检测成功。结果如下图所示：上图所示为压差为 0.05 mbar 的结果，中间图为 0.03 mbar，底图为 0.025 mbar 作为终点标准。在达到终点标准之前，压差至少保持 60 分钟。隔板温度用黄线表示，样品温度用红线表示，干燥箱压力用绿线表示，皮拉尼压力计在初级干燥（白色阴影）和二级干燥（灰色阴影）上用蓝线表示。同时显示达到压力（黑线）和温度终点标准（黑色虚线）的时间，以及该点相应的温度和压力差。结果表明，只有在压差为 0.025mbar 的循环中，压力曲线和温度曲线在切换到二级干燥之前同时合并。在 0.30 mbar 的设定压力下，0.025 mbar 或更小的压差保持 60 分钟以上可被视为合适的终点标准。对于简单的甘氨酸溶液来说，这没问题，但是对于那些需要二级干燥的更具挑战性的样品呢？嗯，我决定用美味的草莓进行冷冻干燥实验。草莓在 -40°C 下冷冻 24 小时以上，并在 0.3 mbar 的压力下冷冻干燥，初级干燥时隔板温度为 25°C，二级干燥时为 40°C。选择 0.025mbar 的压差作为终点标准。最大的草莓带着一个热电偶，这样样品的温度就可以与隔板温度相比较。上图显示了整个冻干循环，下图显示了二级干燥步骤的截取图。隔板温度用黄线表示，样品温度用红线表示，干燥箱压力用绿线表示，皮拉尼压力计用蓝线表示。图中的白色阴影表示初级干燥，而灰色阴影表示二级干燥。同时还显示了达到终点标准（黑线）的时间以及该点对应的温差。另，下图中的顶部线显示 37 小时后到达终点。此时，温度曲线和压力曲线在循环转换为二级干燥之前同时合并。在草莓的二级干燥过程中，当隔板温度升高（下图）并开始蒸发时，皮拉尼压力计出现一个明显的峰值。当使用温度测量来确定终点时，通常会忽略这个峰值，这表明了比较压力测量可以用于评估具有挑战性的样品的终点标准。我想指出的是，一个合适的终点标准是高度依赖于冷冻干燥循环中的干燥箱室压。这是因为干燥阶段的压差不是绝对的，但始终是在 60% 的室压下。因此，如果冷冻干燥方法的干燥腔室压力发生变化，则需要重复实验过程寻找适当终点标准。二级干燥阶段的终点标准也应适用。在这里，最大压差通常不会达到干燥箱压力的 60%，因为样品中只剩下小部分水。与一级干燥相比，考虑较小的压差可能是有必要的，压差需要持续较长的时间，作为二级干燥的终点标准。这种方法也应该首先通过测试运行来验证。抱歉，我要去吃午饭了。这一次，我将尽量保持我的腹部和裤子之间的压力差达到最小。希望您能对更多的冻干和色谱知识保持渴望，并继续通过步琦学堂满足您的胃口。下次见！扫描左侧二维码可直接拨打电话联系我们或直拨：400-860-5168 分机号：0728仪器信息网认证，请放心拨打

由中国生物物理学会、中科院生物物理研究所、清华大学和FEI 公司联合主办的第一次中国结构生物学冷冻电镜培训班(Get acquainted with Cryo-Electron Microscopy：First Chinese Workshop for Structural Biologists)于2015 年5 月29 日-6 月3 日在北京顺利举行。本次培训班主任由中科院生物物理所孙飞研究员、清华大学王宏伟教授和美国FEI公司Marc Storms博士担任，讲授队伍来自中科院生物物理所、清华大学、北京大学、中科院上海生化细胞所、中国科技大学、英国剑桥大学LMB实验室和FEI公司等工作在冷冻电镜一线的教授和工程师们，并精心地为学员们准备了包括讲义、课件、学习资料、实习材料和数据在内的教学材料。本次培训班得到了FEI公司的独家赞助和大力支持。 　　作为生物大分子结构研究的手段之一，冷冻电子显微镜三维重构技术，尤其是单颗粒三维重构技术(SPA)，近期取得了非常瞩目的成果。近两年来，利用SPA技术解析的重要生物大分子复合体层出不穷，分辨率也日益提高。在此契机下，中国生物物理学会生物超微结构显微成像专业委员会与FEI公司进行合作，利用中科院生物物理研究所和清华大学生命科学学院在国际上领先的冷冻电子显微平台，联合发起了此次培训班，旨在为零基础学员提供全面了解和学习电镜三维重构理论和技术的机会，系统地将冷冻电镜前沿技术带给国内的相关研究人员，特别是X射线晶体学、NMR等非电镜领域的专家学者和学生们。这无疑将极大地推动我国冷冻电镜和结构生物学领域的发展。 　　培训班为期四天，包括上午讲座报告、下午实际操作和上机实习、以及晚上的答疑讨论会。来自全国百余学员参加了此次培训活动。5月30日上午，北京大学的尹长城教授对冷冻电镜的发展历史、现状进行总结并对未来的发展进行展望，提出电镜技术已经进入&ldquo 黄金时代&rdquo 。随后，清华大学的王宏伟教授和中国科技大学的蔡刚教授分别对负染色和冷冻两种电镜制样方法进行了非常详尽的介绍。5月31日上午，清华大学的雷建林教授详细讲解了透射电子显微镜(TEM)的光学系统、成像原理等关键理论，FEI公司的应用工程师王庆博士则介绍了如何操作电镜，如何进行拍照成像等具体的工作流程。6月1日上午，清华大学的高宁教授介绍了如何评估电镜数据质量，李雪明教授介绍了目前最前沿的直接电子探测相机技术及其相关的motion 校准技术，英国MRC的白晓晨博士分享了解析高分辨率电镜结构涉及到从前期制样到后期图像处理的大量技术细节。利用前三天下午的实习操作时间，学员们不仅零距离看到工程师们现场演示制作电镜样品和电镜操作，而且还亲自练习制样方法并实际操作电镜。6月2日，中科院生物物理所的孙飞研究员、中科院上海生化细胞所的丛尧教授介绍了单颗粒三维重构的基础知识和原理，中科院生物物理所的朱平研究员系统讲解了如何对重构结果进行分析和展示。2日下午学员们在老师们的指导下上机练习了两个冷冻电镜三维重构软件EMAN2和Relion，对三维重构的流程有了更加直观的认识。除此之外，每天晚上的讨论会，学员们都带着问题来的，互动交流的主动性很高，积极发言，深入讨论，将白天所学知识消化掌握，反响很好。 　　(中国结构生物学冷冻电镜培训班) 　　国际冷冻电子显微镜高级图像处理研讨会(International Workshop of Advanced Image Processing of Cryo-Electron Microscopy 2015)由清华大学隋森芳教授担任组委会主席，由清华大学王宏伟教授、中科院生物物理所孙飞研究员共同担任执行主席，于2015 年6月3日-6 月7日在北京顺利举行。教师队伍来自MRC分子生物学实验室(英国)、Brandeis University(美国)、University of Colorado Boulder(美国)、脑科学MPI 研究所(德国)、University of Basel(瑞士)等多所国外大学与研究机构。研讨会为期五天，包括上午讲座报告、下午软件操作与上机实习、及晚上的答疑讨论会，围绕近原子分辨率单颗粒重构技术、三维模型建立与精修、电子断层扫描与sub-tomo平均计算等主要议题，分别就DED图像的信息分析与处理方法、单颗粒锐化及电子密度图校正、低分辨率冷冻电镜图像的模型建立与验证、冷冻电镜图谱原子模型的搭建、近原子分辨率冷冻电镜图谱的结构细化与验证、电子断层扫描技术的理论与原理、电子断层扫描数据采集与处理中重要影响因素、sub-tomo平均计算的流程与应用、及其理论、方法与前景等多项话题展开深入的交流与细节探讨。来自日本、印度、美国等多个国家一百四十余名学员参加了本次研讨会，反响热烈。 　　(国际冷冻电子显微镜高级图像处理研讨会) 　　作为生物大分子结构研究的重要手段之一，冷冻电子显微镜技术近年来取得了非常瞩目的成果，分辨率获得极大提高。在此契机下，中国生物物理学会生物超微结构显微成像专业委员会与FEI等公司进行合作，利用中科院生物物理研究所与清华大学生命科学学院在国际上领先的冷冻电子显微镜平台，联合发起中国结构生物学冷冻电镜培训班与国际冷冻电子显微镜高级图像处理研讨会，不仅为零基础学员提供全面了解和学习电镜三维重构理论与技术的机会，同时为电镜结构生物学领域青年科学家们系统地介绍冷冻电镜前沿技术与图像处理最新研究方法与进展，积极促进国际交流与合作，极大的推动我国冷冻电子显微镜和结构生物学领域的进步与发展。

冷冻干燥机是目前较为先进的一种物质脱水干燥的设备，其原理是将含水物质在低温下冻结，而后使其中的水份在真空状态下直接升华，并用冷凝的方法捕凝升华的水汽，达到物质脱水干燥的目的。冷冻干燥机也因此被广泛应用到各行各业. 冷冻干燥机应用范围： 食品行业：冷冻干燥机常用于果蔬、肉禽、水产、调味品、方便食品及名优特产等干燥，因此冷冻干燥机也称为食品冻干机，保持食品原有的色、香、味、形、新鲜度不变的目的，且复水性好，成品便于储存和运输，费用降低，保存期延长。 药材保健：在干燥蜂王浆、人参、龟、鳖、蚯蚓等营养保健品，采用真空冷冻干燥工艺，更好的保留了原有的营养价值，更使人们相信该营养品纯真自然。 制药行业：用于血清、血浆、疫苗、酶、抗生素、激素等中西药品的脱水与保存。 生物研究：利用真空冷冻干燥技术长期保存的血液、细菌、动脉、骨骼、皮肤、角膜、神经组织和各种器官，在使用时只需供给水份即可再生，仍保持其生物理特性。 文章原创:上海田枫实业有限公司 www.tfsye.com上海田枫实业有限公司,专业生产各类制冷设备，包括层析冷柜,冻干机，冷水机，超低温冰箱，恒温槽等，一流的专业，一流的服务，上海田枫是您的最佳选择！

p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/56726cd4-dd5e-45c4-a263-71b5603f050c.jpg" title=" 1.jpg" alt=" 1.jpg" style=" width: 300px height: 179px " width=" 300" vspace=" 0" height=" 179" border=" 0" / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 科研人员在读取数据　　 /span /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/36e4eddb-047d-49db-b3d1-d74e9393cc11.jpg" title=" 2.jpg" alt=" 2.jpg" style=" width: 300px height: 488px " width=" 300" vspace=" 0" height=" 488" border=" 0" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " /span span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 科研人员将样品放进冷冻电镜设备中 /span /p p 　　一个“显微镜”有多贵?答案是千万或者上亿元。 /p p 　　在南方科技大学冷冻电镜中心一栋普通科研楼里，就藏着这些身价惊人的“大家伙”。这些“宝贝”被精心呵护，娇贵得甚至容不下一点噪音。与此同时，科学家通过它们，不停地读取着生命科学、新材料、新能源研究领域中不可或缺的重要密码。 /p p 　　2018年11月19日，南科大冷冻电镜中心正式揭牌。全部建成后，这将是我国配套最齐全、最先进的冷冻电镜实验室，同时规模也将跻身世界前三。近日，深圳商报记者走进这里，探访这些表面低调却内有乾坤的“大显微镜”。 /p p 　 strong 　6台机器世界先进，还有“独家定制” /strong /p p 　　南科大冷冻电镜中心是深圳市政府出资、南科大牵头建设的重大基础科学设施平台，旨在支撑深圳市、粤港澳大湾区及中国南方在生物医药、精准医疗、新能源、新材料方面的科学研究及产业升级。 /p p 　　南科大冷冻电镜实验室拟安装300千伏冷冻电镜6台及其它71台/套相关辅助仪器和样品制备设备。目前，项目一期的2台300千伏冷冻电子显微镜已经完成安装调试，投入使用。据南科大冷冻电镜实验室主任王培毅教授介绍，这6台设备都是世界上最先进的，其中还有一台是南科大冷冻电镜中心根据需求“独家定制”的，可以说是“世界唯一”。 /p p 　　 strong 2017年诺贝尔化学奖得主理查德· 亨德森曾预言，这里将会成为全球最大的三个冷冻电镜中心之一，未来的研究能力将会达到全球的前5%。 /strong /p p 　　在全球范围，冷冻电镜近几年热度飙升，成为科学界“兵家必争之地”。2017年诺贝尔化学奖颁给了在这个领域做出贡献的三位科学家，更是说明冷冻电镜炙手可热。那么，究竟什么是冷冻电镜?王培毅教授告诉记者，冷冻电镜是电子显微镜的一种，它的工作原理和光学显微镜类似，也是通过光与样品的相互作用而成像。只是冷冻电镜所用的光源不是人们平时见到的可见光，而是电子。由于波长的限制，可见光的分辨率一般是1500倍以下，而电子的波长非常短，大约是普通光波长的十万分之一左右，因此冷冻电镜的分辨率可以达到更高的程度，能够直接观测到蛋白质分子一类的生物大分子的精细结构。 /p p 　　以生物医药领域的应用为例，冷冻电镜技术就是“把组成动、植物的蛋白用生物学的方法取出后，以快速冷冻的方式冷冻到液氮温度(-196度)，这样可以保持蛋白的活性。在这种状态下用冷冻电镜观察活蛋白，可以达到零点几纳米的分辨率，由此准确判断药物靶标的位置，并根据药物靶标来开发新药。”因为可以“看”得更精细，所以冷冻电镜技术在很多领域都被广泛应用，被视做是材料科学、生命科学等学科基础研究的利器。 /p p 　　“目前，全国购置的冷冻电镜有27台，主要集中在北京、上海等地。我们购买的冷冻电镜，根据研究的领域不同有所侧重，有些偏重于材料科学，有些偏重于生命科学。我们定制的那一台‘世界唯一’的冷冻电镜，就是希望它能够在重大疾病的诊断方面发挥作用。”王培毅教授告诉记者，2019年将是南科大冷冻电镜中心非常重要的一年，除了定制的那一台冷冻电镜外，其他购置的电镜将陆续到位，安装、调试后，电镜中心的工作将在2020年迈上新台阶。 /p p 　　 strong “大家伙”很娇贵也很辛苦 /strong /p p 　　隔着玻璃，记者顺着王培毅教授的指引，看到了目前已经使用的两台冷冻电子显微镜静静矗立。但是，近300平方米的机房内，却没有工作人员忙碌的身影。 /p p 　　这是为什么?“首先，我们的机房内一般是没有人的，工作人员的工作都通过计算机远程操控完成，只在装样品的时候才进入十几分钟。另一个原因是，今天实验室内有施工，考虑到施工带来的噪音会影响电镜工作，所以今天我们不提取数据。”王培毅教授的解释让记者大吃一惊——这些“身材魁梧”的“大家伙”，原来是一点噪音都会受影响的“娇小姐”! /p p 　　因为冷冻电镜十分精密，所以对环境的要求很严苛。据王培毅教授介绍，为了减少振动带来的影响，机房的地面厚度约1米，且是独立建设的，跟周围建筑物完全分离，甚至连空调的风速都必须严格监控。机房内必须经过严格的消磁，在里面是没有手机信号的。机房内的温度、湿度都恒定，温度变化每小时不超过0.2℃。还有一个房间专门用来制作样品，房间内的湿度保持在20%，因为只有在这样相对干燥的环境里才能保证样品的质量。如此小心翼翼地“伺候”，就是为了让冷冻电镜更好地运转、工作。要知道，除了每个月两天的维护、保养时间外，冷冻电镜可是24小时连轴转的。 /p p 　　“冷冻电镜与普通材料电镜最大的不同在于，冷冻电镜的结果是统计结果，需要大数据。普通的材料电镜，拍一张照片就有结果，但冷冻电镜需要拍成千上万的照片，然后用统计学的方法把结果算出来。这也就说明了，为什么一般机构购置冷冻电镜都需要两台以上，因为它要解析一个样品，需要几十个小时甚至更长的电镜时间。”冷冻电镜的相机灵敏度有多高?王培毅教授打了一个比方——相当于在几万公里的高空可以看到桌子上的一瓶水。这些高精度的照片存储量惊人，“一台电镜一天就能采集2T以上的数据量”，而后的数据分析和解读无疑也是一项巨大的工程。 /p p 　　 strong 期待中国原创靶向药从这里走出 /strong /p p strong 　　这几台世界先进的“大家伙”，究竟能为老百姓带来什么? /strong /p p 　　王培毅表示，在生活水平日益提高的情况下，健康成为人人关心的焦点。对于深圳而言，下一阶段的城市发展，生物医药和健康产业将是巨大的“增长点”。南科大建设世界一流的冷冻电镜中心，目的就是通过利用国际最先进的科学技术，发展基础科学研究，聚焦重大疾病诊断、新药开发、精准医疗、功能材料研发和基础学科建设等领域，促进深圳新材料、医疗卫生、健康产业和高等教育的发展，同时积极服务于国家战略需求，造福百姓。 /p p 　　尽管冷冻电镜未来在许多领域都有很大的应用空间，但在王培毅心目中，冷冻电镜研究的终极目标还是为了人类的健康事业。“想要解决重大的疑难疾病的治疗问题，就必须要研发药物，然而药物的研发过程极其漫长，从研发到上市一般需要历经十年。治疗白血病的药物研发前后则是经历了近100年。而冷冻电镜可以通过低温冷冻技术，观察活的原始样本，进而用于研究致病机理，例如发现癌症的致病机理，从而推动癌症等重大疾病的诊断和治疗，极大地缩短制药的时间。”王培毅教授说，自己的最大心愿就是缩短靶向药物的研发时间，助力中国研发自己的原创药。 /p p 　　除了生命科学领域的课题外，目前南科大冷冻电镜中心的研究重点还有新能源和新型化合物。此外，实验室还将积极开展多学科交叉研究，并与学校已经建成的X射线晶体学平台、生物质谱蛋白质组学分析平台形成互补，开展国际上最前沿的蛋白质科学研究，为结构生物学、细胞生物学、神经科学，化学、材料科学等领域搭建交叉学科平台。 /p p 　　“各个学科对于冷冻电镜的需求是十分巨大的。目前我们还未全面对外开放，但排队的样品已经排到了春节以后。”这个春节，王培毅教授和他的团队将在忙碌中度过了?? /p p 　　 strong 小资料 /strong /p p strong 　　冷冻电镜 /strong /p p 　　2017年诺贝尔化学奖，授予了瑞士科学家雅克· 杜博歇、美国科学家约阿希姆· 弗兰克以及英国科学家理查德· 亨德森，以表彰他们在冷冻显微术领域的贡献。 /p p 　　理查德· 亨德森上世纪90年代改进了传统电子显微镜，取得了原子级分辨率的图像 约阿希姆· 弗兰克在上世纪七八十年代开发了一种图像合成算法，能将电子显微镜模糊的二维图像合成清晰的三维图像 雅克· 杜博歇发明了迅速将液体水冷冻成玻璃态以使生物分子保持自然形态的技术。这些发明使低温冷冻电子显微镜的各部件得到优化。 /p p 　　2013年以来，低温冷冻电子显微镜日渐成熟并获得广泛应用。如今研究者可以在生物分子的生命周期内对其进行冷冻和成像，将以往不为人知的分子生命状态呈现出来。 /p p style=" text-align: center " img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/c2a4b517-02a9-4da8-b95a-a30a0276234b.jpg" title=" 00.jpg.png" alt=" 00.jpg.png" style=" width: 300px height: 267px " width=" 300" vspace=" 0" height=" 267" border=" 0" / /p

真空冷冻离心浓缩仪是一款常用于化学分离和纯化技术应用的实验室设备；该技术可通过将化学物质置于离心管中，利用离心力可将混合物中的各种化学物质分离开来，提高纯度。冷冻型的设备则是利用低温环境和真空状态可使化学物质在离心管中迅速冷冻、快速蒸发，从而提高实验的操作应用效率。本篇文章将深入探讨这款低温冷冻型离心浓缩设备的原理应用。　　　　　　冷冻真空离心浓缩仪利用离心和真空技术可将化学混合物中的化合物迅速分离，从而达到对样品的纯化和浓缩目的；该设备被广泛应用于分析化学、医药、生物学等行业领域。冷冻型的实验设备相比较于其他款，它是利用低温环境和真空状态分离化学物质，并将它们冷冻起来以提高实验效率。　　在使用冷冻真空浓缩设备时，需要先将样品置于离心管中，塞进盖子中央的叶轮上，接着运转机器，对离心管内的化合物进行旋转，在加入真空度后，通过减压和外部加热的方式来提高该系统内的温度以及气体流通性；随后可将化合物冷冻蒸发出来，达到样品的浓缩效果。　　　　真空冷冻离心浓缩仪是一款常用于制备RNA和DNA等高浓度浓缩样品的实验设备，该设备使用温度较低功率较少的真空泵和离心机器，可有效提高了实验对样品的纯度和浓缩效率；实验设备基于不同的原理应用，旨在提高化学物质的纯度；而冷冻型真空离心浓缩仪则比其他设备的应用更为高效。

真空冷冻干燥机也称为冻干机，冷冻真空干燥的基本原理是在低温低压条件下的传热传质。由于被冻干物料性质、冻干方法和对冻干产品质量要求的不同，描述冻干过程的模型及其解法也不相同。通常情况冷冻真空干燥过程的三大阶段冷冻阶段、升华干燥阶段、解析干燥阶段。整个过程其实就是传热和传质同时进行的过程，热和质的传递速率共同影响干燥速率，从而影响整个冻干周期，所有影响热和质传递的因素均会影响干燥速率。简单分析如下：冻干仓压力真空冷冻干燥机冻干仓内压力高低影响到传热和传质的速率，对于传质来说，压力越低越好 对于传热来说，压力越高越好。传质速率的大小，主要由升华界面与干燥层表面的温度和压力差所决定。要提高干燥层中水蒸气的逸出速率，可以提高升华界面的温度，使界面水蒸气压增大 也可以提高冻干仓的真空度，降低干燥层表面的蒸汽压。传热方式按传统的分类可划分为：热传导（有温度不同的质点在热运动中引起的，在固体，液体，气体中均能产生）、热对流（对流是由于温度不同的各部分流体之间发生相对运动，互相掺和而传递热能）、热辐射（凡是温度高于零度的一切物体，不论他们的温度高低都在不间断地向外辐射不同波长的电磁波）和介质加热(微波加热)。由于升华干燥的过程涉及到热和质(水蒸气)的传递，因此，通过哪种传热方式将热量更为有效地传递给物料，对干燥速率有较大的影响。样品内有机溶剂的浓度样品内有机溶剂的浓度对冷冻干燥速率的影响较大，浓度越高冻干速率越慢，反之浓度越低，冻干的速率越快。晶体大小预冻时形成的晶体大小在很大程度上影响冻干的速率和冻干后产品的溶解速度。速冻和慢冻过程有以下区别：速冻产生的冰晶较小，慢冻产生的冰晶较大。大的冰晶有利于升华，小的冰晶不利于升华，快速冻结会导致升华速率低，解析速率快 慢速冻结导致升华速率快，解析速率慢。样品量多少样品在冻干时，分装到容器中后存在一定的表面积与物质厚度比，即冻干与样品量有关。表面积大、厚度小有利于水分升华，容易冻干且质量理想。干燥时，单位面积料盘上被干燥的装载量是决定干燥时间的重要因素：一般情况下，物料堆积的厚度越薄，传热和传质速度越快，干燥时间越短。但是，物料越薄则单位冻干面积上每批次干燥的样品少，对提高单位冻干面积和单位时间产量不利。

冷冻电子显微学近年来在电子显微镜的硬件设备及结构解析的软件算法等方面取得了多个重要的技术突破, 正在成为结构生物学研究的重要技术手段, 为越来越多的生物学研究者所重视. 冷冻电子显微学的技术特点决定了它所具备的一些独特优势和发展方向, 同时作为一个正在迅速发展的科学技术领域, 需要多学科的交叉促进. 　　近期来自清华大学生科院的王宏伟发文介绍了冷冻电子显微学的研究现状及面临的技术挑战, 并提出未来可能实现结构生物学与细胞生物学不同尺度的研究在冷冻电子显微学技术上融合的新方法. 　　结构生物学是 20 世纪后半叶, 尤其是在 80~90年代蓬勃发展起来的重要学科. 通过对生物大分子(蛋白质、核酸及其复合体)的三维空间结构的测定, 结构生物学可以在微观尺度上精确地描述复杂生物大分子的形状, 原子与分子组合方式, 及其表面带电、亲疏水等物理性质, 从而为生物大分子发挥生物学功能的机理提供关键的解释. 进入 21 世纪以来, 结构生物学研究的技术手段日益成熟, 在现代生物学研究的各个分支领域中均发挥着重要的作用. 至今为止, 国际蛋白质结构数据库中的结构数据已经超过 100000, 其中绝大部分结构由 X 射线晶体学及核磁共振波谱学解析而来. 　　近年来, 技术的进步使得结构生物学新的研究手段取得了长足的进展. 2013 年 12 月份发表在Nature 上的利用冷冻电子显微学解析获得 TRPV1 原子分辨率结构的两篇文章, 在结构生物学领域造成了巨大的反响. 美国加州大学旧金山分校的程亦凡研究组与 Julius 研究组合作, 利用冷冻电子显微学技术首次获得了 300 kD膜蛋白 TRPV1的 3.4 Å 分辨率的三维结构, 并建立了该分子的原子模型. 　　其实在过去的几年间, 已经有若干工作报道了利用冷冻电子显微学解析病毒、蛋白酶体复合物、核糖体等近原子分辨率模型. 这些工作的里程碑式意义在于: 高分辨率结构解析过程不需要生长三维晶体, 样品用量非常少, 而且可以在短时间内同时获得多个复合体状态的三维结构. 短短一年里, 冷冻电子显微学技术作为直接解析生物大分子原子分辨率结构的技术手段受到人们的广泛关注. 　　事实上, 电子显微学是结构生物学研究中的老兵. 该技术自从 20 世纪 50~60 年代以来, 一直在研究细胞、 亚细胞及生物大分子结构的研究中扮演着独特的角色, 揭示了很多重要的细胞内精细结构. 在研究生物大分子的结构方面， 该技术采取与 X 射线晶体学及核磁共振波谱学迥然不同的原理, 在过去的几十年里逐渐建立了成熟的图像处理及分析算法, 成为结构研究的一种独特技术手段. 近 10 年来, 该领域的日臻成熟以及科研团队的扩大更快地催生了冷冻电子显微学成像技术与结构解析技术的革命性突破. 自从 2008 年以来, 冷冻电子显微学已经连续获得多种生物大分子复合体的原子分辨率结构, 而且高分辨率结构的解析速度正在呈现迅速上涨的趋势。 　　冷冻电子显微学从 20 世纪中叶开始, 经历了 80年代到 90 年代的技术方法建立时期, 21 世纪初的技术成熟期, 在过去的两年里发生了革命性的技术进步, 进入了快速发展期. 结构生物学和细胞生物学研究者如何抓住这个契机, 如何尽快适应新的局面, 掌握新的技术, 充分发挥该技术的优势从而更加更深入地研究生命现象, 将是未来几年里的一个主题. 数学、物理学、计算机科学、材料科学、化学等众多领域的研究者们必将在未来冷冻电子显微学的新技术新方法的开发中发挥重要的作用, 成为该技术的进一步完善与成熟的重要力量. 　　冷冻电子显微学领域研究者们则需要以主动开放的态度吸引其他领域研究者的合作, 并积极迎接来自更多领域研究者的挑战, 保持并发展自己的技术特长, 站在技术发展的制高点上选准研究方向, 始终在冷冻电子显微学的技术前沿上开疆拓土. 　　原文检索： 　　王宏伟. 冷冻电子显微学在结构生物学研究中的现状与展望. 中国科学: 生命科学, 2014, 44: 1020&ndash 1028 　　Wang H W. Current status and future perspective of cryo-electron microscopy in structural biology. SCIENTIA SINICA Vitae, 2014, 44: 1020&ndash 1028 doi: 0.1360/052014-140

在过去的二十年中，冷冻显微镜方法已经成为生命科学家、制药研究人员等广泛使用的有效工具，用于检查接近其原生状态的生物结构1。冷冻显微镜能够可视化蛋白质和蛋白质复合物等物质的生物分子结构，是对现有的方法如x射线晶体学和核磁共振(NMR)等的有价值的补充。确定蛋白质和蛋白质复合物的结构是药物发现的一个重要部分，这对研究药物靶点非常有意义，也是深入了解疾病机制的重要课题。在这篇文章中，我们将阐述冷冻显微镜技术的使用，包括冷冻光学电子显微镜(cryo-CLEM)，冷冻干燥显微镜(FDM)，药物研究中的低温保存，以及温度控制显微镜如何使研究人员能够在低温下推进药物发现和开发研究。冷冻光学电子显微镜（Cryo-CLEM）电子显微镜(EM)使用微量材料，具备接近原子的分辨率，可以研究不同功能状态下的分子。冷冻电镜（Cryo-EM）使用极低温度，克服了真空条件下使用电子束测量高含水量生物标本的难题。在20世纪80年代冷冻电镜商业化之前，生物标本是通过化学固定或染色等方法制备的，但这些方法存在保存伪影，会影响图像分辨率。快速冷冻通常用于将样品保持在与自然生理环境相似的冷冻状态，在临床前阶段取得的结果必须在临床研究中可复制，这在药物研究中尤其重要。Cryo-CLEM结合低温荧光技术和冷冻电镜技术，提高了活检细胞内生物、化学和遗传过程的灵敏度。Cryo-CLEM能够对冷冻固定样品中的分子或分子组件(如细胞内膜、DNA或细胞结构元件)进行直接荧光标记和靶向，精确定位区域，以便后续使用EM进行高分辨率成像。为了使生物样品与EM中发现的真空条件兼容并保存结构细节，样品被嵌入玻璃状的冰中，需要保持在-140°C以下。必须避免与空气中水分接触，因为一旦接触会形成冰晶并污染样品。在低温条件下，荧光信号的结构细节被保留，光漂白显著减少。冷冻光学电子显微镜技术的进步体现在它包含了创新的冷冻荧光级，如Linkam CMS196，它能够自动获取整个电镜网格的高分辨率荧光图。这也用于样品导航，并将cryo-CLEM的案例情况与EM或与x射线显微镜等其他技术相关联。西班牙巴塞罗那的一组研究人员和临床医生使用荧光显微镜、透射电子显微镜(TEM)和低温软x射线断层扫描(cryo-SXT)，可以观察到抗癌药物顺铂在极低浓度下的有效性，确定产生效果所需的最低剂量，以最大限度地降低毒性2。该小组在荧光显微镜上对低温冷冻的细胞样本进行成像，使用CMS196冷冻荧光台在液氮温度下将它们玻璃化，然后使用cryo-SXT对样本进行分析，这使得在纳米尺度上进行3D研究成为可能。得益于现有的低温成像技术，研究结果表明，三甲碱(研究的两种佐剂之一)促进了顺铂在较低剂量下的有效治疗，这可能为化疗治疗的发展铺平了道路，减少了对患者的副作用。冻干显微镜许多药物生产为冻干或冻干配方，以增加稳定性和延长保质期。药物开发人员必须为新的药物化合物创建一个优化的冷冻干燥过程，这可能是一项复杂而昂贵的工作。为了简化流程和开发更高效的冷冻干燥循环，了解三个主要冷冻干燥步骤的温度和压力要求是很重要的。使用冷冻干燥显微镜(FDM)，研究人员可以直接可视化每个步骤，并确定药物产品在不同热条件下的行为。FDM包括一个专用的光学显微镜和一个专用的热工作台，它可以准确地控制样品的温度和压力，并允许实时进行热测量。冷冻干燥的一个关键参数是塌陷温度(Tc)，即产品失去结构完整性并导致加工缺陷的温度。FDM使药物开发人员能够密切监测样品并快速有效地调整冷冻干燥方案。英国国家生物标准与控制研究所(NIBSC)的一个研究小组正在利用先进的FDM技术研究冷冻干燥药物的复杂性。该小组由Paul Matejtschuk博士领导，正专注于研究优化冻干脂质体药物的配方。由于冻干脂质体药物物理和化学性质不稳定，这对开发提出了挑战。Matejtschuk博士和他的团队使用安装在光学显微镜上的专用冷冻台(FDCS196, Linkam科学仪器)(图1)，通过估计冻结、塌陷和融化温度，预测脂质体-冷冻保护剂混合物的理想的冷冻干燥条件3。图1:NIBSC实验室的仪器配置。Linkam FDCS196冷冻干燥冷冻台，T94控制器和液氮泵，真空泵，奥林巴斯BX51光学显微镜。图像显示FDM系统的旧版本图2: Linkam FDCS196冻干显微镜系统的最新版本这样的实验对于继续努力开发快速、可转移和可扩展的冷冻干燥方法来稳定脂质体等药物化合物至关重要。低温贮藏储存用于研究的生物标本有赖于有效的保存技术，以保持细胞的物理和生物完整性。冷冻或冷冻样品可能会导致冰晶的积聚，导致终端细胞损伤。冷冻保护剂是在冷冻过程中通过降低水的熔点来防止细胞损伤的重要物质。许多生物，如极地昆虫、鱼类和两栖动物，会产生自己的冷冻保护剂或防冻化合物。科学家们正在研究这些化合物，以开发新的冷冻保护剂来保存研究用的细胞。例如，由Matthew Gibson博士领导的英国华威大学的研究人员，正在研究防冻剂(糖)蛋白(AFP)，目的是开发新的合成AFP模拟化合物。该实验室使用低温生物学工作台(BCS196，Linkam Scientific Instruments)来测量细胞中的冰晶生长，依靠该仪器的温度控制能力来观察AFP。Gibson博士研究了使用金纳米颗粒作为探针来测量冰再结晶抑制活性现象，使用低温生物学工作台来改变温度，并开发出一种高通量方法来筛选类似AFP具有结构特征的材料。4诸如此类的发现为开发新型冷冻保护剂提供了潜力，这种保护剂可以防止冷冻保存细胞中冰的生长，从而保持细胞的完整性，因此在生物医学和药学研究中具有潜在用途。未来药物研究本文中描述的技术强调了目前已有的各种冷冻显微镜方法的选择，这些方法有助于推进药物研究。Cryo-CLEM结合了cryo-EM和低温荧光的力量，作为一种相对较新的技术，它的成功依赖于专用冷冻工作台的发展，从而促进了Cryo-CLEM工作流程。这种工作台能够在液氮温度下保持玻璃化样品，使它们在从荧光显微镜移动到冷冻电镜成像时保持无污染。其他专用的冷冻台可与广泛的显微镜技术兼容，如FDM，可在成像过程中精确控制样品的温度，低至-196°C。这些创新为制药研究人员新疗法和生产工艺评估，以及生物样本保存以供未来研究等大量应用提供了工具。 作者：Linkam Scientific Instruments销售及市场部经理Clara Ko参考文献：1. Booy, F. and Orlova, E.V. Cryomicroscopy, in: Chemical Biology: Applications and Techniques (eds Larijani, B., Rosser, C.A., and Woscholski, R.) 2007.2. Gil, S., Solano, E., Martinez-Trucharte, F., et al. Multiparametric analysis of the3. effectiveness of cisplatin on cutaneous squamous carcinoma cells using two different types of adjuvants. PLoS ONE. 2020 15(3): e0230022.4. Hussain M.T., Forbes N., Perrie Y., Malik K.P., Duru C. and Matejtschuk P. Freeze-drying cycle optimization for the rapid preservation of protein-loaded liposomal formulations. International Journal of Pharmaceutics 573, 2020 118722.5. Mitchell, D. E., Congdon, T., Rodger, A., and Gibson, M. I. Gold Nanoparticle Aggregation as a Probe of Antifreeze (Glyco) Protein-Inspired Ice Recrystallization Inhibition and Identification of New IRI Active Macromolecules. Scientific Reports, 2015 5: 15716.

骨头、塑料、生物、植物，这些商检、质检、高校等检测机构最常见样品您处理好了吗？处理后您的样品变性了吗？前处理的结果满足后续检测的需要了吗？您想让处理过程更简单吗？ 您希望一款仪器能一次解决以上所有问题，并能让样品前处理的过程更简单更安全吗？ 答案就是2009年RETSCH推出的新型研磨仪——全自动冷冻研磨仪cyomill。 她能轻易为您处理各类软性及中硬性材料的样品，特别对于塑料等热敏性材料，与cryomill更是绝佳的搭档。因为cryomill有专为冷冻研磨设置的一套智能系统！ 全自动冷冻研磨仪cryomill 现代化的设计外形让人眼前一亮：一个研磨平台，一个平衡平台；特殊接口与液氮罐相连；透明保护盖，可视研磨过程；图形显示菜单，令操作更简单，研磨程序尽在掌握之中。 利用高速撞击的球磨原理对样品进行粉碎，振动频率最大可达25HZ，能量大，可在极短的时间得到极高细度的样品，结果还可用于光谱分析样品制备。并且研磨过程始终处在-196℃液氮中，保证样品绝不变性。 突破样品前处理史上最先进的技术，cryomill可以设置程序，控制整个研磨过程，根据样品的性质及数量你可以设置预冷却时间、研磨频率和研磨时间、冷冻研磨循环次数等。仪器运行时，您只通过图形显示的面板就可以知道研磨所处的阶段，所以在整个研磨过程中你都无需与液氮接触，避免了手动操作的繁琐和危险。 每一个细节，cryomill都为您设想周全：智能系统可以储存9组参数，简化了您的实验室工作；配套液氮罐autofill自动进气功能；多种研磨配件可供选择，根据您的实际需要可以选择25ml、35ml、50ml研磨罐，选用适配器使用4个5ml 的研磨罐。 以韧性的多糖为例，使用全自动冷冻研磨仪cryomill将多糖冷冻2分钟，研磨1分钟，设置3个循环，研磨结果小于100um。 研磨前后的多糖对比 除了低温冷冻研磨之外，cryomill依然可以进行常温的干磨和湿磨，例如对纺织品、PCB板、土壤、矿石等软性、中硬性和硬性样品都能达到要求的粉碎细度。 金属矿样用cryomill常温研磨5分钟，出样尺寸小于150um。 研磨前后的矿石对比 如此智能又方便的仪器您怎能错过，记住RETSCH,记住全自动冷冻研磨仪cryomill——低温粉碎技术的新里程碑。 为让RETSCH的产品帮助到更多的实验室人员，RETSCH在推出的新品的同时举办全球客户回馈活动——”WE R PREPARED”, 登录www.retsch.cn 参与答题您就有机会参加RETSCH全球旅行，选择拉斯维加斯冒险之旅或者瑞典冰雕旅馆的非凡体验，或者直接赢取现金5000.00欧元！ 关注RETSCH, 关注2009！

真空冷冻干燥机制冷系统常见的故障及排除方法 真空冷冻干燥机广泛用于医学、制药、生物研究、化工和食品等领域。经冷冻干燥处理的物品易于长期保存，加水后能恢复到冻干前状态并保持原有生化特性。LGJ-18N系列立式冷冻干燥机，适用于实验室使用或少量生产，可满足大多数实验室常规冻干的要求。 　　真空冷冻干燥机制冷系统常见的故障及排除方法： 　　1)高压报警。出现高压报警的主要原因有: 　　①冷却水水温过高或冷却水量不足。 　　②冷凝器内部结垢，导致换热效率降低。 　　③压缩机工作时，低压管道发生泄漏，从而导致外界空气进入制冷系统。 　　④制冷管道存在未开足阀门或因管道被堵而造成排气不畅的情况。 　　解决办法: 　　①降低冷却水温度或增加水流量。 　　②清洗冷凝器的冷却水管路。 　　③对制冷管道进行检漏，如果在工作中无法实现该项操作，可将水冷凝器上方的截止阀打开，使存在于冷凝器中的空气排放出一部分。 　　④将压缩机管道.上的阀门开启到最大。 　　2)水压报警。水压报警的主要原因有: 　　①冷却水供水压力不足或供水泵不运转。 　　②水压力控制器故障。 　　解决办法: 　　①增大外部供水压力或检修供水泵。 　　②检查压力控制器的触头是否能正常工作或检查在其线路.上是否存在其他问题。 　　3)压缩机吸气温度异常。吸气温度异常的主要原因是膨胀阀调节不当，开启度过小或过大，导致回气量过小或过大。其解决办法是对膨阀进行调节，如回气量过大，应关小开启度，如回气量过小，应开大开启度，调节过程中以微调为主，多观察压缩机的回霜情况。 　　4)膨胀阀堵塞。堵塞分泌物物堵塞(脏堵)和冰堵塞两种。 　　①杂物堵塞。在堵塞不严重时，可用扳手轻轻敲打阀体，经振动使阀体疏通。若不奏效或膨胀阀很快又重新堵塞，则说明堵塞严重，应拆卸膨胀阀，对膨胀阀滤网进行清洗，清洗完后重新装上即可。 　　②冰堵。出现冰堵，应更换冷凝器出液端过滤器。 　　5)载冷剂泄漏 　　可用肉眼观察，查找板层，软管上的泄漏点。若发现可疑漏点，应放空板层或软管内的载冷剂，对泄漏点进行充压确认，确认后放气补好泄漏点，重新加入载冷剂并排出板层和软管内气体。

p 　　作者：黄岚青，刘海广(北京计算科学研究中心 复杂系统研究部) /p p 　　 span style=" background-color: rgb(112, 48, 160) color: rgb(255, 255, 255) " strong 1 引言 /strong /span /p p 　　在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术，就叫做冷冻电子显微镜技术，简称冷冻电镜(cryo-electron microscopy， cryo-EM)。冷冻电镜是重要的结构生物学研究方法，它与另外两种技术：X射线晶体学(X-ray crystallography)和核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)一起构成了高分辨率结构生物学研究的基础，在获得生物大分子的结构并揭示其功能方面极为重要。 /p p 　　电子显微三维重构技术起源于1968 年，D.J. De Rosier 和Aaron Klug 在Nature 上发表了一篇关于利用电子显微镜照片重构T4 噬菌体尾部三维结构的著名论文，提出并建立了电子显微三维重构的一般概念和方法。Aaron Klug 本人也因为这个开创性的工作获得了1982 年的诺贝尔化学奖。 /p p 　　为了降低高能电子对分子结构的损伤，Kenneth A. Taylor 和Robert M. Glaeser 于1974 年提出了冷冻电镜技术，并且用于实验研究。经过三十多年的发展，冷冻电镜技术已经成为研究生物大分子结构与功能的强有力手段。冷冻电镜本质上是电子散射机制，基本原理就是把样品冻起来然后保持低温放进显微镜里面，利用相干的电子作为光源对分子样品进行测量，透过样品和附近的冰层，透镜系统把散射信号转换为放大的图像在探测器上记录下来，最后进行信号处理，得到样品的三维结构。 /p p 　　在超低温的条件下，电子带来的辐射损伤被有效控制。即便如此，分子样品所能承受的辐射剂量也是非常低的，导致信噪比非常低。另外，随着观测的进行，额外的电子会累积而造成分子的移动，导致获得的图像变得模糊。这就好比用一个简单的傻瓜相机拍摄在雨中飞驰的子弹，得到的影像必然是模糊的并且充满噪音。因此，冷冻电镜的方法技术在很长时间内只能确定个头比较大的样品的结构，比如病毒颗粒的结构，而且通常分辨率都不高。然而随着工程技术和算法的不断发展，能够确定的分辨率也越来越高(图1(a))，2016 年发布的谷氨酸脱氢酶结构的分辨率甚至已经达到了1.8 Å 。与此同时，也有越来越多的通过冷冻电镜技术得到的研究成果发表在高水平的期刊上(图1(b))，冷冻电镜正备受科学界的关注。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/5b2ef847-cad0-4d88-b1ad-ebf14bd21e9c.jpg" title=" 1.jpg" / /p p 　　图1 冷冻电镜技术和单颗粒重构技术越来越备受关注(统计数据来源于EMDataBank )(a)不同年份中利用冷冻电镜单颗粒重构技术能够达到的最高分辨率 (b)通过冷冻电镜技术进行的研究成果在不同杂志上发表的论文数 /p p 　　在最近几年，冷冻电镜技术有了革命性的进步，主要得益于三个方面的突破。首先是样品制备，通过利用薄膜碳层甚至石墨烯可以用更薄的冰层包裹分子样品来提高信噪比。第二个突破是电子的探测技术，也就是电子探测器的发明。在300 keV 电子的轰击下，传统的器件都会被高能量打坏，因此在电子探测器出现之前，冷冻电镜中使用的CCD相机需要将电子打在探测器上变成光信号，再通过CCD 把光信号转成电信号后得到图像，“电光—光电”转换的过程降低了信噪比。而现在电子探测器能够直接探测电子数量，同时，互补型金属氧化物半导体(CMOS)感光元件的应用使得探测器支持电影模式(movie mode)，可以在一秒钟之内获得几十张投影图片。通过后期对样品进行漂移修正，再把这几十张图片叠加起来，从而大幅提高成像的信噪比。模糊的子弹一下子变得清晰，冷冻电镜的分辨率不断上升。第三个突破是计算能力的提高和软件算法的进步。冷冻电镜的模型重构通常需要对几万甚至几十万张投影图片进行分析、组装和优化。这需要先进的计算资源配合有效的算法才能实现。基于贝叶斯理论的模型重构框架解决了这个问题，我们在下文中详细介绍。综上所述，冷冻电镜技术不仅提高了空间分辨率，而且可以应用于很多以前不能解决的生物大分子的结构研究。 /p p 　　具有里程碑意义的成果是，2013 年加州大学旧金山分校(UCSF) 程亦凡和David Julius 的研究组首次得到膜蛋白TRPV1 的3.4 Å 近原子级别高分辨率三维结构，结果发表在Nature 上。我国在冷冻电镜的应用领域也有很大突破，代表性工作包括清华大学的施一公研究组和剑桥大学MRC 实验室Sjors H.W. Scheres 研究组合作在2015 年获得的γ 分泌酶复合物结构( 图2(c))， 以及2015 年清华大学高宁研究组和香港科技大学戴碧瓘研究组合作得到的3.8 Å 的真核生物MCM2-7 复合物结构 2015 年北京大学毛有东研究组、欧阳颀研究组与哈佛医学院吴皓研究组合作得到炎症复合体的高分辨率三维结构(图2(a)) 2014 年中国科学院生物物理研究所朱平研究组和李国红研究组合作得到的30 nm 染色质左手双螺旋高级结构(图2(b))以及2016 年中国科学院生物物理研究所柳振峰、李梅、章新政三个研究组合作得到3.2 Å 的捕光复合物II 型膜蛋白超级复合体结构。这些成果在结构生物领域得到巨大的反响，这也使得冷冻电镜高分辨率成像技术获得空前的关注。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/44d05be3-281b-4507-b0fc-9d200025422f.jpg" title=" 2.jpg" / /p p 　　图2 我国在冷冻电镜领域中获得高质量的研究成果(a)近原子分辨率的炎症复合体结构(图中NBD为核酸结合结构域，HD1 为螺旋结构域-1，WHD为翼螺旋结构域，HD2 为螺旋结构域-2，LRR为亮氨酸重复序列) (b)30 nm 染色质左手双螺旋高级结构 (c)3.4 Å 的人源γ 分泌酶复合物结构(图中NCT是一种I 型单次跨膜糖蛋白，APH-1 为前咽缺陷蛋白-1，PS1为早老素-1，PEN-2 为早老素增强子-2) /p p 　 strong span style=" background-color: rgb(112, 48, 160) color: rgb(255, 255, 255) " 　2 图像处理技术 /span /strong /p p 　　经过多年的发展，目前冷冻电镜的数据处理部分主要包含了以下的流程(图3)： /p p 　　(1) 衬度传递函数的修正(CTF correction) /p p 　　(2) 样品分子投影数据的筛选(particle selection) /p p 　　(3) 二维投影数据的分类和降噪(2D analysis) /p p 　　(4) 三维模型的重构和优化(3D reconstruction and refinement) /p p 　　(5) 多重构象的结构分析(heterogeneity analysis) /p p 　　(6) 对重建结构分辨率的分析(structure resolution assessment) /p p 　　(7) 结合生物化学原理和实验数据对三维结构的解读(model interpretation and validation) /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/ef81cf1e-580c-4eda-9e77-e2edc542f953.jpg" title=" 3.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　图3 冷冻电镜数据分析处理流程 /p p 　　图像处理软件的发展对冷冻电镜单颗粒重构技术极其重要，当前广泛使用的电镜分析软件系统主要包括SPIDER，EMAN2， FREALIGN，SPARX，RELION等。对于刚刚接触单颗粒重构技术的人来说，更偏好集成的软件套装来完成整个分析流程。我们在表1 中列出了大部分主流的综合冷冻电镜图像处理软件，以供参考。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/f4fafde5-da41-422a-acc4-bcd118be0c8e.jpg" title=" 4.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　表1 冷冻电镜中流行的图像处理软件 /p p 　　 strong 2.1 衬度传递函数估计与修正 /strong /p p 　　衬度传递函数(contrast transfer function，CTF)是在数学上描述通过透射电子显微镜得到样品图像上的像差变化。准确地判断衬度传递函数对于确认显微图像的质量以及后续的三维结构重建极为重要。常用的估算衬度传递函数的参数软件是CTFFIND4。确定了CTF 的参数以后，就可以对采集到的冷冻电镜图像进行修正。这个修正过程其实就是图像处理中的图像复原技术。 /p p 　　 strong 2.2 颗粒挑选 /strong /p p 　　接下来需要从原始数据中筛选出颗粒投影，也被称为“颗粒挑选”，颗粒挑选的好坏也将影响所有后续的分析和处理过程，是一个重要并且繁琐的步骤。颗粒挑选方式可以分为手动挑选、半自动挑选和完全自动挑选这几种。 /p p 　　在早期的分析中，对于结构的了解还非常少，优先考虑的都是人工挑选。但是自动的颗粒图像获取方法的出现使得在很短时间内可以收集数十万张颗粒图像，人工挑选大量的颗粒图像不太现实，并且人工的挑选通常会过于集中于某一类颗粒图像，导致遗漏和偏差。 /p p 　　 strong 半自动和全自动的方法主要有以下三类： /strong /p p 　　(1)通过例如降噪、反衬增强、边缘算子等图像形态学方法搜索区域，基于数字图像处理学的原理，将颗粒图像与背景分离开来。 /p p 　　(2)基于模板的方法，通过扫描数据图像和已知的模板比较来挑选出潜在的颗粒图像，模板的来源通常为手动选出的数据图像中较为清晰的颗粒图像，或者是已知结构的投影。 /p p 　　(3)结合无模板和有模板的方法，通过一些有监督的机器学习算法进行颗粒挑选。 /p p 　　随着图像识别领域中深度学习方法的流行，各类基于深度学习的颗粒识别框架也被引入到颗粒挑选的过程中。随着深度学习方法的发展，相信如何把深度学习方法应用到单颗粒冷冻电镜图像分析领域的研究将会越来越多。 /p p 　　 strong 2.3 二维图像分析——颗粒图像的匹配与分类 /strong /p p 　　二维颗粒图像的分类是获取三维结构过程的第一步。对二维图像的分析包括两部分：颗粒图像的匹配和颗粒图像的分类。 /p p 　　匹配的过程通常会对颗粒图像应用一些变换操作，通过关联函数去判断不同颗粒图像之间的相似程度。图像匹配的算法主要分为两种，即不依赖模型的方法和基于模型的方法，取决于是否存在利用样本先验信息得到的模板。 /p p 　　随着图像匹配的完成，颗粒图像需要进行分类。主要利用多元统计分析和主成分分析方法等算法，其他流行的二维颗粒分类技术还有神经网络分类，将图像在二维空间自组织映射(self-organising mapping，SOM)再进行分类和排序。 /p p 　　二维图像分析的目的是，首先通过图像匹配消除旋转和平移的误差，利用类内紧致、类间离散的原则进行图像分类，最终可以对类内颗粒图像进行平均，提高信噪比，从而实现对高分辨率三维结构的构建。 /p p 　　 strong 2.4 模型重构和优化 /strong /p p 　　模型三维重构的基础是中心截面定理，重构过程中的关键问题是如何确定每个颗粒图像的空间角(orientation determination)。大多数模型重构和优化算法都是基于投影匹配(projection matching)的迭代方法。简单说就是，先利用粗糙的三维结构模型，进行投影得到参考的图像，和实验颗粒图像进行比对，根据结果来更新空间方位参数，继而构造新的三维结构，对实验图像的空间方位修正，形成迭代的过程，直至收敛就获得了最终的三维模型。 /p p 　　 strong 2.5 分辨率的确定及二级结构的确定 /strong /p p 　　在模型优化的过程中，通常有很多指标给出结构的分辨率信息。目前一个较为广泛使用的分辨率信息参数是被称为傅里叶壳层关联函数(Fourier shell correlation，FSC)曲线，并通过在曲线上选取一个合适的阈值来判定分辨率。 /p p 　　在模型优化中经常伴随着过拟合的问题。过拟合的出现通常由于在优化过程时无法分辨“噪声”与“信号”。为了避免过拟合对分辨率的误判，最近一种被称为“黄金标准”(gold standard)的优化过程开始被广泛使用。 /p p 　　根据不同的分辨率，可以从结构中得到不同的信息量。按照分辨率数值大致分为三个范围： /p p 　　(1)结构分辨率大于10 Å 的生物大分子结构被视为低分辨率的结构，在低分辨率的结构范围内只观察得到一个大致的整体形状，以及有可能分辨出主要成分的相互位置关系。 /p p 　　(2)一个中等分辨率的生物大分子结构精度大约在4—10 Å 之间，在这个分辨率范围内的生物大分子结构已经可以得到一些二级结构的信息和分辨出大部分组成结构的相对位置关系。分子结构之间如果存在构象变化也可以分辨出来。 /p p 　　(3)高精度甚至是近原子级别的分子结构分辨率可以达到4 Å 以下。在高分辨率的三维结构中，可以准确地看见如α肽链等的二级蛋白质结构以及部分单独的残基，多肽链的结构变得清晰起来。同时高分辨率的分子结构可以描述精确的构象变化。 /p p 　　总之，FSC 曲线等标准提供的分辨率是一个有指导意义的数字，不可作为绝对参考来评价所获得的模型质量，需要批判地对待，尤其是要与生物分子系统的生物化学知识相结合。 /p p 　　 strong 2.6 三维结构的多构象性和动态分析 /strong /p p 　　生物大分子通常具有内禀的柔性，所以生物分子的动态结构变化以及结构的不均一性一直是结构生物学的研究重点之一。在晶体状态下，生物分子的结构变化被晶格约束，一般只提供一个静态的结构和有限的动力学参数。冷冻电镜相比晶体学方法的优势在于可以捕捉生物分子在溶液中的形态，并记录下不同构象下的投影。因此针对冷冻电镜的数据可以进行多构象的重构，现有的一些算法是通过聚类分析、最大似然法分析等对多构象进行分析，得到的生物大分子结构形态和构象差异还需要结合分子功能来检验分子结构的合理性。 /p p 　　 strong span style=" background-color: rgb(112, 48, 160) color: rgb(255, 255, 255) " 3 最新进展和突破 /span /strong /p p 　　 strong 3.1 最大似然估计理论 /strong /p p 　　近年来在单颗粒分析中取得重大突破的应当是最大似然估计(maximum likelihood)理论。最大似然估计的理论可以贯彻整个单颗粒技术图像分析的过程，在图像匹配，2D、3D分类 和模型优化上均可以应用，是一个强有力的理论工具。最大似然估计的算法已经在RELION、FREALIGN 等软件中实现，方便普通用户使用，这对于推动冷冻电镜成像技术的应用有重大意义，近三四年来有许多突破性的近原子级别分辨率的分子结构大多是由基于最大似然估计理论的分析软件得到。 /p p 　　3.1.1 减少计算需求 /p p 　　最大似然估计算法的计算量很大，如何降低计算量是一个重要问题。过多的计算资源消耗曾经阻碍这个方法在冷冻电镜单颗粒重构中的广泛应用。在减少最大似然算法在冷冻电镜应用中的计算需求方面，有两个重要的贡献是空间降维(domain reduction)算法和网格插值(grid interpolation)算法。 /p p 　　我们最近在研究一个新的方法来对旋转参数进行分步处理，初步的结果显示这种方法可以把计算复杂度降低一个维度，这个方法可很好地应用于高信噪比的数据处理，但对于低信噪比的数据分析还需要对该方法进行改进。 /p p 　　3.1.2 对最大似然方法的未来展望 /p p 　　在未来的研究中，关注点是减少计算的耗时和增加准确度。通用图形处理器(GPU)的应用和CUDA 编程框架已经显示出了在高性能计算领域的威力，研究表明GPU 技术可以显著减少计算时间，而RELION 也将发布支持GPU 计算的2.0 版本。 /p p 　　在加快计算速度的同时，提高模型的重构的准确性则更为重要。如何提高颗粒图像的准确性以及最大似然方法在这些方面的应用还有待深入探索。总而言之，最大似然方法独特的、可扩展的统计理论框架可以适用在冷冻电镜的各种问题上，如多构象、低噪声、信息缺失中均有很好的应用。 /p p 　　 strong 3.2 流形嵌入方法(Manifold Embedding) /strong /p p 　　自然界的分子过程通常是连续的，比如三磷酸腺苷(ATP)合成酶等分子结构的状态变化通常都是连续的。现有的方法只能得到有限的、若干个离散的构象变化，限制了我们对于分子结构的进一步观察。而流形嵌入法则是通过将颗粒图像映射到具有特定拓扑结构的参数空间(manifold space)，可以分辨出更为细致的动力学变化，进而实现对生物分子连续的结构变化过程的研究。Ali Dashti 等人已经利用这种方法成功刻画出核糖体的结构变化路径。 /p p 　　 strong 3.3 揭开表面看实质 /strong /p p 　　冷冻电镜对更为复杂的结构并没有很好的处理方式，在一些分子量比较大，包含多层的病毒结构研究中，一直没有高分辨率的三维模型，这也是由于病毒普遍具有对称失配的特性，基因结构被壳体完全覆盖，无法通过二维图形处理的方式对内部结构直接进行重构。刘红荣教授通过改进衬度分离方法展示出了解决该类问题的途径，其发展的新方法已经成功应用在一个多面体衣壳NCPV的病毒颗粒(图4)上，通过该重构方法，使得外部的衣壳结构(图4(a))和内部的基因组结构(图4(b))分离，成功得到包含在内部的dsRNA 近原子级高分辨率结构和分布。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/7ab0c5f3-c403-4231-924f-9900a3758eb7.jpg" title=" 5.jpg" / /p p 　　图4 利用衬度分离方法得到对称失配情形下的病毒颗粒结构(a)外部的衣壳结构 (b)内部的基因组结构 /p p 　　 strong 3.4 罗马不是一天建成的(Building Protein in One Day) /strong /p p 　　最近的研究成果显示，最大似然估计算法能够更好更快地完成三维重构，多伦多大学的Marcus A. Brubaker 教授针对最大似然估计算法提出了优化，有效地缩短了三维重构所需的时间。对传统迭代算法极度依赖于初始模型结构的缺点进行改进，同时通过采样优化的方式降低了计算量，减少计算时间，据称这些优化可以达到100000倍的加速，利用一台计算机工作站在一天内就能完成模型重构。 /p p 　 strong span style=" background-color: rgb(112, 48, 160) color: rgb(255, 255, 255) " 　4 展望与总结 /span /strong /p p 　　冷冻电子显微镜技术已经发展成为一个成熟的方法，应用于各种复杂的生物分子体系的高分辨结构研究。按照目前的发展势头，解决生物分子结构组(structural proteome)的问题已经不是遥不可及的了。在解决单一静态结构的基础上，冷冻电镜也展示了其研究多构象体系的潜力。下面对冷冻电镜在结构生物学研究领域的应用做一些大胆的展望，希望能抛砖引玉。 /p p 　　 strong 4.1 解决膜蛋白的结构 /strong /p p 　　由于膜蛋白是镶嵌在磷脂分子构成的细胞膜内，目前在冷冻电镜领域的样品制备还没有很好的处理方法，因此还很少见到对膜蛋白的结构解析。随着技术的发展，新的试剂分子或者纳米尺度的容器可以用来制备单一性很高的稳定的细胞膜以及镶嵌在内的膜蛋白。这样就可以利用冷冻电镜的方法对膜蛋白进行结构研究。目前在纳米盘(nanodiscs)的研究领域已经取得了一定的进展，对 /p p 　　冷冻电镜解析高精度的膜蛋白结构，我们拭目以待。 /p p 　 strong 　4.2 细胞内分子结构测定：从溶液内(in vitro)到细胞内(in situ) /strong /p p 　　当前的高分辨分子结构基本都是在溶液中提纯出来的分子样品，也就是通常所说的in vitro 实验。现在可以利用快速冷冻的方法把细胞固定，再用高能粒子枪对细胞进行高精度切片。在细胞的某些部位，常常有大量同类分子聚集，比如在内质网(endoplasmic reticulum，ER)部分有很多核糖体，在细胞骨架上会有大量的肌动蛋白(actin)分子。对这些切片进行成像研究可以获取这些分子在细胞环境的结构信息。 /p p 　 strong 　4.3 细胞结构和分子在细胞内的分布：从部分到整体 /strong /p p 　　电镜可以用来做断层成像(cryogenic computed tomography，cryo-CT)，应用于亚细胞层面的研究，比如细胞器的结构，蛋白质分子的分布，以及一些细胞骨架的构成。与超低温样品操作结合，cryo-CT 可以提供更高分辨率的信息，衔接分子层面和细胞层面的知识，对于了解细胞功能至关重要。在电镜成像研究领域，这将是一个有广阔前景的课题。 /p p 　 strong 　4.4 多构象的识别和自由能景观确定 /strong /p p 　　人们开始不满足于近原子级别分辨率能够提供的信息，想要进一步刻画分子结构连续变化的状态。得益于冷冻电镜的成像特性，相对其他技术而言，冷冻电镜技术在时间尺度的系综上具有优势。在冷冻电镜下分子结构的动力学研究中，有两个值得关注的趋势，分别是能够获取分子结构“ 慢” 反应过程(10—1000 ms) 时间分辨(time-resolved)的冷冻电镜技术，以及能够分析出连续构象变化的分类算法。获取短期反应过程(10—1000 ms)分子结构的基础是在准备样本过程中分子反应的速度慢于冷冻样本的时间，目前混合喷雾(mixing-spraying)等快速冷冻技术的实现使得一些较慢的反应过程可以看到动力学变化。而流形嵌入算法在分类过程中取得突破，在更好地利用冷冻电镜观察分子的平衡态结构动力学变化和展现自由能景观上取得了令人鼓舞的成果。 /p p 　 strong 　4.5 从静态结构到动态分子电影 /strong /p p 　　生物分子在室温下是活跃的，而且大多数的分子功能是通过结构的变化来实现的。基于X射线， 尤其是最近发展的X 射线自由电子激光(XFEL)的结构生物学的研究重点之一便是实现时间分辨的结构生物学研究(time-resolved structure determination)。到目前为止，基于X 射线的研究取得了很大的进展，但主要还是局限在对晶体的衍射方面，比如对光合作用过程中水分子分解的研究和光敏黄蛋白的光吸收过程的研究。三维冷冻电镜的单颗粒成像技术最有希望在单分子水平上实现对时间分辨的结构变化研究，同时，这对于样品制备和实验操作提出了非常高的要求。 /p p 　 strong 　5 结束语 /strong /p p 　　冷冻电镜的技术突破及其在生物分子结构领域的应用把我们对分子生物学的研究推进了一大步，开始探索未知的区域。立足于解决单一构象的基础，对多构象以及动力学过程和热力学的研究也需要展开，这需要对现有技术进行提升并与其他方法进行结合，计算建模和模拟的方法也需要紧密结合起来，实现对生物分子系统的集成研究。 /p p 　　致谢 感谢北京大学欧阳颀教授对文章写作提出的宝贵意见。 /p

揭示生物学样本和材料样本原本无法观察到的内部结构冷冻断裂是一种将冰冻样本劈裂以露出其内部结构的技术。冷冻蚀刻是指让样本表面的冰在真空中升华，以便露出原本无法观察到的断裂面细节。金属/碳复合镀膜能够实现样本在SEM（块面）或TEM（复型）中的成像，主要用于研究如细胞器、细胞膜，细胞层和乳胶。这项技术传统上用于生物学应用，但现在逐渐在物理学和材料科学中展现出重要意义。近年来，研究人员通过冷冻断裂电子显微镜，尤其是冷冻复型免疫标记（FRIL），对膜蛋白在动态细胞过程中所发挥的作用有了新的见解。作者：Gisela Höflinger图1：麦叶上的蚜虫适合于电子显微镜的环境电子显微镜的样品室通过抽真空处理降至极低压力。置于这种环境下的活细胞无法有效保全结构，因为细胞构成中的大部分水分会快速蒸发。生物样本的制备方法有很多种。样品材料被（固定）保存，这样后续脱水对原位结构的破坏最小，同时可以使用环境扫描电镜（SEM）或者将水冷冻。高压冷冻是观察自然状态下含水结构的唯一方法。高压冷冻所形成的冰不是六边形冰（从水变为六边形冰时体积会增加）而是无定形冰，因此体积保持不变。所以，对渗透和温度变化敏感的结构得以保留（见文章“高压冷冻基础介绍”）。要观察诸如细胞器、细胞膜、乳胶或液体的表面界面等结构，冷冻断裂是唯一的方法。通过刀片（或类似物）或释放弹簧负载的外力来破开冷冻样本，并沿着最小阻力线断裂样本。图2：冷冻断裂（来源：http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Lipids/Membrane_Fluidity） 水的升华与凝结 – 冷冻蚀刻与污染要暴露冷冻断裂面，需要把冰去除。这就需要通过把断裂面的冰升华去除以保存样品的结构。升华的过程是冰不经过液态过程直接转化为气态。而液态过程会导致样品体积和结构的破坏。图3：ES，细胞外表面；PF，细胞膜冷冻断裂面；EF，细胞膜外层冷冻断裂面；FS，细胞膜内表面；Cyt，细胞质水的升华/冷凝过程取决于特定温度下的饱和压力，以及水或冰在室内的有效水分压。注意：良好的真空度会降低水分压。例如：温度为-120℃的冰或冰冻样本饱和压力约为10-7 mbar。如果样品室内达到这个压力，则冷凝和蒸发处于平衡状态。蒸发的分子数量等于冷凝的分子数量。在更高压力下，冷凝速度要快于升华速度 – 因此冰晶会在样本表面上生长。必须采取一切手段来避免这种情况。样本上方一个较冷（比样本更冷）的冷阱会降低局部压力，从而起到了冷凝阱的作用。从样本中带出的水分子优先附着在较冷的表面上。在低于饱和压力的压力下，更多的分子升华而不是冷凝，同时会发生冷冻蚀刻。执行冷冻蚀刻直到样本完全无冰，这一过程称为冷冻干燥。仅适用于合理时间内执行的小样本。该过程分为几个步骤，需要从大约-120℃加热到-60℃，同时在每个步骤上使温度保持一定时间。该过程需要几天的时间来完成。图4：饱和蒸汽压力（感谢Umrath 1982提供的图片）样本温度低于-120℃时，蚀刻速度非常慢，蚀刻持续时间会增加到不切实际的程度。如果真空室的压力固定，则可以通过提高样本温度来提高蚀刻速度。对于生物样本，要特别小心温度高于-90℃。蚀刻速度会大幅提高。另外，要注意玻璃态冰中形成六边形冰晶从而导致脱水伪像。纯水的理论升华速度会降低，因为：• 样本深处的水升华速度比表面的水更慢。• 盐和大分子溶剂会降低升华速度。• 生物样本中大量存在的结合水会降低升华速度。通过冷冻断裂生成图像冷冻断裂和冷冻蚀刻技术往往采用高真空精细镀膜技术，将超细腻重金属和碳薄膜沉积于断裂表面。冷冻断裂样本在一定角度下用金属覆盖，然后在碳背衬膜（徕卡EM ACE600冷冻断裂或徕卡EM ACE900与徕卡EM VCT500）上生成复型进行TEM成像或在SEM的试块面上进行成像。对于这两种方法，冷冻断裂表面经过一定的蚀刻时间后以相同的方式进行镀膜。首先在一定角度下进行一层薄的（2-7nm）重金属镀膜，以形成地形对比度（阴影）。其次再针对重金属薄膜，在90°下进行一层厚的碳层（15-20nm）镀膜，以稳定超薄电子束蒸发。此时的蚀刻处理会停止。要对极小的结构进行成像，需要在极低的角度（2–8°）镀膜重金属并在镀膜期间旋转样本。这样可增加细丝状及其它细小结构的对比度。此项技术又称为小角度旋转投影。蒸镀重金属薄膜需要采用电子束蒸发镀膜技术。这种镀膜技术可实现精细定向沉积。碳的支撑层稳定了未被金属覆盖的结构。随着温度的升高，这些结构会改变它们的轮廓，样本不会完全导电，复型也不会粘在一起。冷冻断裂酵母的单向投影图5：低温SEM，BSE（背散射电子）图像。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）双层镀膜获取高分辨率低温SEM。J Microsc. 179, 229-237。图6：复型，TEM图像（感谢Electronmicroscopy ETH Zürich提供图片）。Walther P, Wehrli E, Hermann R, Müller M.（1995）双层镀膜获取高分辨率低温SEM。J Microsc. 179, 229-237。图7：徕卡高压冷冻，真空冷冻传输至冷冻断裂系统中，利用电子束发射枪和旋转样本底座来进行冷冻蚀刻和低温镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温SEM。油/水基样品，–100℃（升华）3分钟暴露油脂结构。图8：徕卡高压冷冻，真空冷冻传输至冷冻断裂系统中，利用电子束发射枪和旋转样本底座来进行冷冻蚀刻和低温镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温SEM。原生生物游仆虫混合培养的羽纹硅藻。感谢英国波特斯巴NIBSC的Roland Fleck博士提供图片图9：徕卡冷冻断裂系统及徕卡真空冷冻传输至低温SEM的HPF、冷冻断裂、冷冻蚀刻和低温镀膜。油/水基乳液破裂，露出洋葱状薄片结构，形成液滴。感谢汉堡拜尔斯多夫Stefan Wiesner博士提供的图片。图10：TEM中的酵母细胞复型。经徕卡高压冷冻和徕卡冷冻断裂复型制备。感谢Elektronenmikroskopie ETH Zürich提供的图片。图11：大麦叶上的真菌。安装于徕卡冷冻断裂仪样本台上，并通过冷却样本台在液氮下进行冷冻。徕卡冷冻断裂仪对样品进行部分冷冻干燥（在更高的样本温度下冷冻干燥）。使用钨镀膜。徕卡真空冷冻传输至低温FESEM 5keV。相关产品徕卡EM ACE900 高端EM样本制备冷冻断裂系统徕卡EM VCT500了解更多：徕卡官网

仪器信息网讯 6月3日晚，&ldquo 国际冷冻电镜图像处理技术培训班&rdquo 在清华大学正式开讲。当晚国际著名结构生物学家Sjors Scheres博士(被《科学》杂志评为2014年度十大科技人物之一)通过视频直播做了关于单颗粒冷冻电镜技术最新进展及展望的报告。虽然是晚上，会场里依然挤满了人，报告结束后，学员们向Sjors Scheres博士提问交流了许多问题，会议直到很晚才结束。 　　本次培训班将一直持续到6月7日，每天的培训从早晨8:30分开始，上午举行培训报告、下午进行实际操作、晚上是讨论环节，直到晚上9点一天的培训才结束。如此紧凑的培训安排，学员们依然精神饱满，每次培训现场都是人员爆满，经常能看到大家向前来授课的专家请教，或是相互间讨论学习，现场气氛十分热烈。 　　看到这样的情景，本次大会的执行主席清华大学王宏伟教授和中科院生物物理所孙飞研究员颇感欣慰。一直以来，他们希望通过这个培训班，能够让大家更好地学习和掌握最前沿的冷冻电镜领域技术，从而推动我国冷冻电镜技术的创新发展。 国际冷冻电镜图像处理技术培训班讲座现场 　　立足国际前沿，培养高层次冷冻电镜人才 　　2012年，孙飞去瑞士参加Gordon Research Conference，会议上关于冷冻电镜图像处理算法的讨论特别多。而当时国内对于这方面的了解还很少，这让他深深地体会到国内的相关研究已经有些落后了。所以回国后，他就和王宏伟讨论决定举办培训班来加强和推进我国在这方面的研究工作，他们的想法得到了隋森芳院士的肯定和支持。2013年在中科院生物物理所举办了第一届培训班。今年在清华大学举办的是第二届。 　　由于冷冻电镜图像处理技术涉及很多理论和实践细节，为了保证培训班的效果，孙飞和王宏伟也是花费了不少心思&mdash &mdash 早在半年前他们就开始了本次培训班的筹备工作。他们邀请了这个领域里顶尖的冷冻电镜图像处理技术专家和软件作者前来授课。对于培训的主题，经过与报告人的多次沟通交流和细化，最终确定大家最感兴趣的前沿和热门技术领域。 　　&ldquo 这让我们能够比较快地跟上国际步伐，站到技术发展的最前沿。比如本期培训班，我们根据冷冻电镜技术的发展方向，有倾向性地选择了培训的内容，除了单颗粒蛋白质结构解析之外，还增加了针对细胞结构解析的培训内容，如Tomography、Sub-Tomogram Averaging等，还有建立高分辨率原子模型的技术等。&rdquo 王宏伟说道。 　　另外，培训班还设置了充分的时间来进行实际操作和讨论。王宏伟说：&ldquo 操作和讨论是培训非常重要的环节。如果只有报告，那就成为国际会议了。而安排实际操作确实是非常不容易，它要求我们要有相应配套的硬件设施，要有足够的计算机终端，把所有的软件都事先安装调试好。因此我们也不得不筛选和控制学员人数，确保来学习的人能有最大的收获。&rdquo 国际冷冻电镜图像处理技术培训班实际操作现场 　　晚上的讨论环节在目前国内的培训班中还是很少见的。对此，孙飞说道：&ldquo 其实经过白天的讲座和实际操作，大家肯定会有很多问题，晚上的讨论环节能够很好地及时帮助大家解决问题，更好地巩固学到的知识。另外，在培训班举行之前，许多培训材料就已经上传到网上，供大家下载预习，这对于提高学习效果也很重要。看看我们的安排，就知道大家在培训期间根本没有时间出去放松，必须将所有的精力都聚焦在培训上。&rdquo 　　在精心的组织安排下，培训班取得了非常好的效果。王宏伟介绍说：&ldquo 第一届培训班之后，许多学生都成长起来了，有一些到了国外很快就掌握了相关技术并做出了突出成绩，有些学生甚至都已经参与到图像处理新方法的开发中了。&rdquo 　　开展基础培训，让更多人了解冷冻电镜技术 　　就在本次国际冷冻电镜图像处理技术培训班举行之前，孙飞和王宏伟负责组织的另外一个培训班&mdash &mdash &ldquo 2015年度国内首届冷冻电镜成像技术培训班&rdquo 刚刚结束。据介绍，和图像处理技术培训班针对已经有一定冷冻电镜基础的人员不同，这个培训班主要是为了满足其他非电镜领域研究人员的需求，以介绍基础概念、理论和操作为主。 国内首届冷冻电镜成像技术培训班实际操作现场 　　孙飞介绍说：&ldquo 随着冷冻电镜技术的飞速发展，很多以前从事结构生物学研究的人，特别是利用X射线晶体学技术和核磁共振技术的研究人员，对冷冻电镜技术充满了兴趣。但是该技术门槛比较高，需要专门的培训才能掌握。我们和国内的冷冻电镜专家还有电镜厂商交流过，他们都非常愿意参与这个培训班的教学工作并贡献自己的力量。所以我们就组织了这样一个培训班，结果也是报名人数非常多，我们最后不得不筛选并控制人数。&rdquo 　　近年来，国家对于电镜平台的建设非常支持，尤其在冷冻电镜技术领域国内先后有多家科研院所建立了相应的研究平台。但是正如孙飞所言，仪器设备可以买、软件可以买，但是要真正用好这些仪器和软件、掌握好关键技术，我们还需要优秀的人才，要通过不断积累并逐步开展方法学研究，将来做一些由我们自己引领的研究。相信通过这一系列的培训班，会有越来越多的人了解冷冻电镜，越多越多的人成长起来，成为我国在该技术领域强有力的新生力量，未来为我国冷冻电镜技术的发展贡献自己的力量。 　　撰稿：秦丽娟

p 　　精确认识细胞当中的大分子结构对于理解它们的功能至关重要。Amunts等人利用冷冻电镜获得线粒体核糖体大亚基3.2埃的分辨率结构，还有最近利用冷冻电镜获取的其他一些高分辨率结构，这些成就预示着分子生物学研究的新时代，获取近原子分辨率的大分子结构将不再是X射线晶体学和核磁共振的特权。 /p p style=" text-align: center " img alt=" " src=" http://img1.17img.cn/17img/old/NewsImags/images/2014912171159.jpg" style=" width: 600px height: 350px " / /p p 　　图：利用冷冻电镜获得的近原子分辨率结构：(A)酵母线粒体核糖体大亚基，分辨率3.2 埃。(B) TRPV1离子通道，分辨率3.4 埃。(C)F sub 420 /sub -还原[NiFe]氢化酶，分辨率3.36埃。注：该图并不是按比例绘制的。 /p p 　　核糖体是古老的，大规模的蛋白RNA复合物，它将线性遗传密码翻译成三维蛋白质。线粒体——半自主细胞器，为细胞提供能量，拥有它们自己的核糖体，这一点和细菌非常类似。许多抗生素，如红霉素，通过阻止细菌的核糖体翻译机器来抑制细菌的生长。当设计新的抗生素，不能让他们同时阻断线粒体核糖体很重要。因此，认识这两种核糖体的详细结构是很有价值的。其他核糖体的结构已经通过X射线晶体学确定。Amunts等利用冷冻电镜确定了线粒体核糖体的高分辨率结构，这在不到一年前，很少有人会想到可能实现。 /p p 　　不用晶体而能够做到这一点无异于是一场革命。主要是因为采用了新的探测器——具有前所未有的速度和灵敏度的直接电子探测器。直接电子探测器能够直接检测电子，而不是需要先将它们转换成光子，然后再转化为光电子探测进行，目前广泛使用的CCD(电荷耦合器件)相机就是这样，但它们的分辨率不是很好。照相胶片从工作原理上来说，高分辨率成像效果应该更好，但它很难和越来越重要的快速读出电子速度及高数据吞吐量相兼容。 /p p 　　大约10年前，Henderson和Faruqi意识到，应该有可能设计出一种结合了CCD相机和胶片优点的直接探测电子的传感器。他们和两个竞争团队研发的探测器，采用了和大多数手机中的摄像头芯片基本相同的有源像素传感器技术。然而，手机的芯片不能用于电子显微镜，因为强烈的电子束会瞬间破坏它们。因此，首先探测器必须能够抗辐射。第二，探测器所需的像素要大很多，以防止富含能量的电子一次激发多个像素。第三，摄像头采用的芯片必须非常薄，完成每次读出电子160万像素，否则电子散射将会使图像模糊并降低分辨率。目前传感器的厚度大约是一张纸厚度的一半。 /p p 　　冷冻电镜只需要少量的样品，因此那些无法分离得到大量样品，利用X射线晶体学方法进行分析的物质，现在可以利用冷冻电镜得到高分辨率结构。这同样适用于不容易结晶的非均相样品或柔性复合物，因为不同颗粒或构象的物质的冷冻电镜图像在图像处理阶段很容易分离开。 /p p 　　新的检测器提供了另一种决定性的优势：当电子束撞击薄的、不支持冷冻的样品时，它们的快速读出能够补偿小的不可避免地移动。在新的相机问世前，由于电子束诱导移动引起的模糊是一个看似不可逾越的问题。现在，通过快速连续拍摄，可以得到一个区域的数十张图像，并且电子束诱导移动被检测到并反转在电脑上。这种去除模糊的影响戏剧性的和天文学哈勃望远镜相类似，尽管在这两种情况下引起模糊的原因是不同的。 /p p 　　新的相机也促使了低温电子断层扫描成像的重大突破，低温电子断层扫描能够得到全细胞、细胞片、或细胞区室的三维图像，如线粒体。利用断层成像识别分子特征，采用标准CCD相机甚至已达到亚纳米细节，新的探测器问世也必然给断层成像研究带来巨大的变化。 /p p 　　在新相机问世的同时，强大的极大似然图像处理程序也被开发出来。这些程序定义可靠客观的标准，来对几万或几十万个的单粒子图像进行平均处理，为的是要实现高分辨率。先进的检测器和软件相结合，获取的冷冻电镜结构，在相同的标称分辨率下，其清晰度和map definition比采用X射线晶体学解析的结构要好，因为在冷冻电镜图像中包含着高质量的相位信息。 /p p 　　冷冻电镜的分辨率革命是否意味着X射线蛋白质晶体学时代即将结束?当然不是。在可预见的将来，分子量小于100kD的小蛋白，分辨率达到2 Å 或更好将依然是X射线晶体学的领域。但是对于大的，易碎的，或者柔性结构蛋白(如膜蛋白复合物)，它们很难形成晶体，但却在生物医学中起着关键的作用，新技术将对此带来重大突破。在未来，对分子量大、已知的蛋白复合物，如核糖体，进行结晶将可能不再是必要的。相反，它们的结构可以从容并迅速的通过冷冻电镜来确定。这真是激动人心的时刻。（编译：秦丽娟） /p p & nbsp & nbsp 原文检索： a href=" http://www.sciencemag.org/content/343/6178/1443.short" http://www.sciencemag.org/content/343/6178/1443.short /a /p

冷冻干燥（也称为冻干）行业对生产力和盈利能力的需求正在增加。这种增加促使业内从业者考虑冷冻干燥与喷雾干燥相比的优势。因此，在本文中，我们在考虑两者的优势，以帮助您选择最适合您的项目和产品的干燥技术。冷冻干 燥or喷雾干燥如何抉择？ 干燥在生物制药行业被广泛认为是保存各种药物制剂和生物制品的首选方法。当液态稳定性不足、储存要求过于严格或需要固体形式的产品以延长保质期或实现不同气候和环境之间的运输时，就需要使用合适的干燥技术。 冷冻干燥无疑是各种材料和应用中公认的“首选”干燥工艺。然而，由于成本、API的可用性以及有时加工和生产量，对替代方法进行评估以确保使用最适合产品和/或项目的干燥方法。 *的冷冻干燥替代方法是喷雾干燥。喷雾干燥具有多种优势。尽管与冷冻干燥相比，它是行业中的新手，但它展示了在可扩展级别（连续而不是逐批处理）处理更高吞吐量的能力。因此，喷雾干燥也可被视为产品干燥的可行选择，具体取决于相关加工要求和产品应用。两者的干燥过程冷冻干燥冷冻干燥的原理涉及以受控方式对产品进行初始冷冻，以控制冰晶结构。 然后将其置于真空中，在真空中进行升华（或初步干燥）以去除未结合的水。接下来是二次干燥以升华结合水，将材料降至用户定义的残留水分水平。此阶段的目标是结合水而不是未结合/游离水，因此需要更多的能量来通过将搁板温度提高到+20°C或更高来驱动该过程。当加上低气压时，它会导致冰直接变成水蒸气（通过液相），这个过程叫做升华。 根据在给定冻干周期中干燥的样品的性质，温度和真空之间的微妙平衡对于确保在干燥后生产成功的批次而不影响产品功效和活力至关重要。为实现这一点，不同类型的产品及其体积可能需要根据其固有的样品特性进行12小时到5天的冷冻干燥。喷雾干燥喷雾干燥通常被认为是一个更简单（和更快）的过程，涉及在一个步骤中将液体制剂转化为干粉。溶液被雾化成细小的液滴，然后在一个大室中使用热气体快速干燥。然后用旋风分离器收集所得干燥颗粒。尽管根据经验，喷雾干燥比冷冻干燥更快且更便宜，但其中一个显着缺点是它需要高加工温度和剪切力。当然，在受到严格控制的制药和生物技术行业中，这些是许多客户力图避免的，在这些行业中，有效性的可行性和工艺参数与敏感的 API 和配方相关；因此，喷雾干燥更适合用于相当耐寒的产品。冷冻干燥中的产品温度在初级干燥中通常低于0°C，在二级干燥中通常为20-30°C，而喷雾干燥中的产品温度通常高于 80°C。在这些较高 (80°C) 温度下工作的直接影响可能是干燥后样品质量在固有产品特性方面的整体损失，例如：1.功效/生存力；2.味道/气味/颜色；3.一致性；4.营养价值，即食品相关产品中的营养素；5.生物产量—更高水平的细胞（即细菌）对数减少；6.蛋白质降解。 行业中的应用这两种工艺都可用于广泛的应用。例如，冷冻干燥通常用于保存不同类型的细胞、精细化学品、实验室试剂和注射疫苗，以及食品工业和乳制品。因为它通常是用直接装在小瓶或其他容器中的产品进行的，所以这种加工方法最适合干燥后不需要进一步加工的配方；此外，小瓶可以在冷冻干燥机的原位密封，从而避免循环完成时的潜在污染。另一方面，喷雾干燥更常与批量加工相关，而不是基于小瓶的加工。 然而，一个普遍的误解是喷雾干燥仅适用于食品和稳定的原料药，而当代研究表明它可能是用于某些复杂产品（例如微囊化细菌和纳米颗粒）的有效方法。 效率、质量与成本人们普遍认为与喷雾干燥相关的成本低于冷冻干燥的成本，这使得该技术成为某些市场感兴趣的技术之一。与冷冻干燥相关的分批形式不同，喷雾干燥对更大的吞吐量潜力更开放，可以被视为“连续过程”。此外，冷冻干燥的优势在于产品的稳健质量。 精确控制低加工温度可*限度地降低产品固有特性的任何风险，例如塌陷、共晶熔化或超过玻璃化转变温度，从而使冻干产品加工成最高质量。生物制药在喷雾干燥过程中可能会受到剪切应力，再加上所需的高加工温度会使蛋白质等化合物不稳定并损害产品性能，*降低产品功效。总结总之，两种产品干燥工艺方法在正确使用且适用于合适的产品时都是有效的。为了在包括干燥阶段的产品加工中获得*结果，*决定哪种方法最适合项目或持续加工需求的因素将是*产品的质量及其如何到达*用户 。

目前，拉曼光谱技术已经在食品、医药、化工、材料等多个领域获得了广泛的应用。其应用在肉品品质检测中时多会受到多种信号干扰，部分指标检测需要联合SERS技术，本文邀请到了中国肉类食品综合研究中心白京老师向大家介绍拉曼光谱在冷冻肉中的应用。1、 简介冷冻肉品是当前最常见的原料肉贮藏品类，其一般是指畜肉宰杀后，经预冷、排酸、速冻（-28℃至-40℃ ），继而在-18℃以下储存，深层肉温达-6℃以下的肉品。冷冻猪肉在贮藏过程中，蛋白氧化、脂肪氧化和微生物及冰晶的传热传质等会大大降低其感官品质、食用品质及加工性能。目前，在冷冻肉贮藏流通过程中对其品质的评判主要是通过感官评定或相关理化指标检测，但是这些评判方法需要耗费大量人力物力，易受主观影响，准确度较低，不适合大宗贮藏批量交易的检验要求，亟需开发冷冻肉品质的无损快速检测方法。拉曼光谱技术具有快速、原位、无损伤检测等优点，在食品领域的应用研究受到了广泛关注。2、 拉曼光谱无损快速技术研究理论基础当激发光的光子与物质分子相碰撞，可产生弹性碰撞和非弹性碰撞。在弹性碰撞中二者未发生能量交换，光子频率不变，这种散射现象称为瑞利散射。在非弹射碰撞过程中，光子与分子有能量交换，光子转移一部分能量给散射分子，或从散射分子中吸收一部分能量，从而使其频率改变，这种分子对光子的非弹射散射效应即是拉曼散射。由于不同的化学键或基团有不同的能量改变，并产生相应的光子频率变化，故根据光子频率变化即可判断分子中所含的化学键或基团，此为拉曼光谱技术。散射光频率与入射光频率差值即为拉曼位移。图1拉曼散射原理3、 拉曼光谱技术在肉中的应用基础及现状肉品的物质组成、含量及其在贮存加工过程中蛋白质二级结构的变化能通过拉曼位移直接反应，主要体现在酰胺Ⅰ带：1645cm-1~1685cm-1（结构：α-螺旋： 1650cm-1~1658cm-1；β-折叠： 1665cm-1~1680cm-1；β-转角： 1680cm-1；无规则卷曲： 1660cm-1~1665cm-1）和酰胺Ⅲ带：1200cm-1~1235cm-1，其分子结构来自色氨酸等多种氨基酸、C=CN等基团、C=C基团和C-H相关基团等。另外，肉品脂质饱和程度在1260、1264、1290、1438、1445、1656、1658、1745 cm-1等拉曼位移处有直接体现，分子结构来自C=H形变、C=H扭转振动、=CH2剪振、=CH2形变、C=C拉伸和C=O等。目前拉曼光谱技术作为一种指纹识别图谱，在肉品领域应用主要集中在加工品质（pH值、嫩度、肉色、保水性）、营养品质（脂肪含量、脂肪酸含量）、安全品质（食源性致病菌、兽药残留（结合表面增强拉曼光谱））和掺假分析（牛肉中掺假马肉、鸭肉等）中。但因为肉品组成成分复杂，肉品拉曼光谱数据量较大且复杂，因此多需要结合化学计量学方法提取相关特征信息4、 拉曼光谱无损快速检测技术在冷冻肉中的应用-以酸价、过氧化值检测为例冷冻肉蛋白氧化可以直接引发肉质变色，脂肪氧化使其营养、味道、质构和外观发生改变，蛋白氧化程度和脂肪氧化程度是评价冷冻肉贮藏期内品质变化的重要指标。酸价是评价猪肉脂质水解的指标，可以综合反映脂质水解氧化程度，过氧化值是反映油脂和脂质氧化状态的最常见指标之一。本研究实例基于拉曼光谱技术和化学计量学技术研究冷冻猪肉在冷冻贮藏过程中的酸价和过氧化值的变化，从脂肪氧化角度研究冷冻猪肉在贮藏过程中的变化规律，建立拉曼光谱快速预测冷冻猪肉酸价和过氧化值的快速无损检测方法，为快速预测判断冷冻猪肉品质和贮藏时间提供一定技术支撑。具体地，对宰后冷却成熟胴体分割取下猪IV号肉，并将其分成750±100g的样品，用保鲜膜进行密封包装，在-30℃环境下进行快速冻结，并立即在相对湿度90%~95%、温度-18℃以下的冷藏库中储存，冷藏库温度一昼夜升降幅度不超过1℃。选取冷冻猪IV号肉贮藏过程中的不同时间点进行检测，以冻结后入冷藏库前作为0d，分别选取0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360 d 13个时间点进行酸价、过氧化值检测和拉曼光谱检测。如下图为样品表面脂质拉曼光谱预处理后的平均值和最大值、最小值光谱曲线。样品表面脂肪的拉曼特征峰集中在1000-1800cm-1和2800cm-1附近，其中1064和1124cm-1为C-C键伸缩振动，1300cm-1为CH2弯曲振动，1443cm-1为CH2剪切振动，1658cm-1为C=C伸缩振动，1745cm-1为C=O伸缩振动，2725、2834和2860cm-1为CH3的对称振动，这些均为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的特征峰，可以表征脂肪的饱和程度，在一定程度上反映脂肪的氧化程度可以看出在特征峰位置上，拉曼强度在特征峰位置上与酸价和过氧化值大小呈现一定相关性。本研究中，酸价和过氧化值最大值和最小值分别对应同一个样品。经比较原始光谱、经过airPLS、SG-5点平滑、SNV、SG-5点平滑+airPLS、SNV+airPLS预处理后光谱经PLSR建模分析发现，经过SNV+airPLS预处理后的酸价、过氧化值PLSR预测模型效果最好。对经过SNV和airPLS预处理的拉曼光谱数据应用CARS算法，选取特征拉曼位移，建立CARS-PLSR的特征拉曼位移处的拉曼强度预测酸价和过氧化值模型。随着样品运行次数的增加，单个酸价值和过氧化值的PLSR模型保留的样品拉曼位移变量数逐渐减少，且减少的速度由高到低，表明变量筛选过程是粗筛到细筛的。当运行次数达到一定值时（酸价值运行38次，过氧化值运行35次），与预测酸价值和过氧化值的大量无关拉曼位移变量被剔除，交叉验证均方根误差（RMSECV）值最小，表明PLSR模型的预测能力最强，最终选取出变量子集和酸价值、过氧化值预测相关的特征拉曼位移变量，分别为53和58个拉曼位移变量，分别为总变量数的2.93%和3.21%。可以看出，预测酸价和过氧化值的特征变量分别集中在495、1064、1124、1300、1443、1658、2834、2860 cm-1和1064、1124、1300、1443、2834、2860 cm-1拉曼位移附近，表明1064、1124、1300、1443、2834、2860cm-1拉曼位移处代表的信息（C-C键伸缩振动、CH2弯曲振动、CH2剪切振动和CH3的对称振动）均对预测酸价和过氧化值变化贡献较大，但495 cm-1和1658cm-1处代表的COC的对称变形和C=C伸缩振动仅对酸价的预测贡献较大。CARS筛选拉曼特征变量CARS-PLSR预测酸价和过氧化值结果5、 小结拉曼光谱作为一种分子散射光谱，在肉品品质检测方面具有无损、快速、指纹性、半定量的优势，但其应用环境较为复杂，需要应用多种分析方法，有效提取特征信息，以便提高拉曼光谱检测肉品品质指标的准确性，扩大应用范围。作者简介中国肉类食品综合研究中心动物源性食品研究部工程师，长期致力于生鲜肉品快速无损检测研究，参与多项“十三五”、“十四五”国家重点研发计划项目，发表相关论文10余篇，申请发明专利10余件，登记软件著作版权3项，参与制订国家标准《GB/T 41366-2022畜禽肉品质检测 水分、蛋白质、脂肪含量的测定 近红外法》等多项标准。

冷冻饮品是以饮用水、食糖、乳制品、水果制品、豆制品、食用油等中的一种或多种为主要原料,添加或不添加食品添加剂,经配料、灭菌、凝冻而制成的冷冻固态制品。近些年来,微生物超标依然是冷饮食品质量安全的主要问题之一。 　　质监局有关专家介绍，每年质监部门都不定期对市场上的冷饮进行抽查，每次抽查的结果都没有100%达到合格。问题主要集中在生产、运输和销售的环节上。菌落总数、霉菌、酵母菌等微生物超标是冷饮常见的问题。菌落总数超标，冷饮爽口不爽心夏天吃冷饮固然爽口又爽心，吃到不合格产品，一只冰糕下肚，等于吞下去不计其数的霉菌、酵母菌。 　　存在的主要问题是细菌菌落总数和大肠菌群超标。细菌菌落总数的超标可能是生产过程中设备的通道、包装容器材料、空瓶、瓶盖消毒不彻底，生产工艺落后所致，因此必须加强生产工具、容器机械清洗消毒和机械设备的清洗消毒，改进落后的生产工艺，提高机械清洗消毒和机械化的生产能力。大肠菌群超标可能与水源直接或间接受到污染，从业人员个人卫生习惯较差有关，为此应加强法制教育，严格执行《食品卫生法》和国家对冷饮食品的卫生管理办法，坚持对从业人员体检和冷饮卫生知识的培训。应加强冷饮食品卫生预防性监督管理力度和卫生知识宣传教育的深度，把重点放在防止微生物的污染和个体私营单位的管理。 　　冷饮在加工过程中，需要经过复杂的过程，对调料的配置、配料的粉碎等等，都需要经过较长的过程，且加工的过程中，冷饮直接裸露于空气之中的时间较长，容易造成菌落数超标和二次污染的问题，在包装之前，需要不间断的对于整个加工过程进行消毒灭菌。 　　所以，需要找到一种正确实用高效的消毒灭菌方式才能很好解决冷饮菌落总数超标问题。 　　动态消毒灭菌方式能够很好地应用于冷饮的加工过程，在包装之前，能够对于整个生产环境进行不间断消毒灭菌。据上海康久消毒技术有限公司工程师周立法介绍，这种消毒灭菌技术的杀菌原理是通过特殊的脉冲信号使得NICOLER发生腔产生逆电效应，生成大量的等离子体。在负压风机的作用下，污染空气被抽进发生腔内，带负电细菌被分解击破，整个杀菌过程只需0.1秒，再经药物浸渍型活性炭等组件二次杀菌过滤后，受控环境保持在“无菌无尘”标准。由于在对车间消毒时，人可同时在车间内工作，所以，该杀菌技术也可称作为“食品动态杀菌机”。 　　定期清理奶垢能有效的防止微生物的滋生，而在清理奶垢时应注意空气杀菌，可大幅度减少微生物超标的可能性。

生物大分子的三维结构可以直观地揭示其生物学功能、细胞内进程以及探索其在疾病中发挥作用的方式。冷冻电镜（cryo-electron microscopy,cryo-EM）单颗粒分析技术通过对生物大分子的直接成像进行高分辨率结构测定，已成为结构生物学的重要研究手段。冷冻电镜单颗粒分析技术需要对生物大分子溶液的冷冻样品采集大量电子显微数据，以进行三维结构解析，因此高质量的冷冻样品制备在其中起着至关重要的作用。良好的制样方法需要能够简便地、可控地制备出接近理想状态的生物大分子冷冻样品。诺贝尔化学奖获得者雅克杜博切特（Jacques Dubochet）等人于1984年发明了冷冻样品制备的滤纸夹置法（Pipet-blot-plunge），至今仍然是冷冻电镜样品制备的主要手段。在这种传统的制样方法中，研究人员难以精确控制样品冰层厚度和大分子颗粒分布，导致冷冻样品的均一性和可重复性较差。越来越多的证据表明，在样品被冷冻之前的瞬间，生物大分子会吸附在超薄的液体层的气液界面（Air-water interface, AWI）上，导致生物大分子的颗粒结构损伤、变性或产生优势取向，减低了高分辨率冷冻电镜结构分析的效率和成功性。如何获取可重复的高质量的生物大分子冷冻样品仍然是冷冻电镜技术应用中的一个难题。图1. ESI-cryoPrep方法设计和仪器装置示意图4月25日，清华大学生命科学学院王宏伟课题组和精密仪器系欧阳证、周晓煜课题组在《自然方法学》（Nature Methods）在线发表了题为“电喷雾辅助的冷冻电镜样品制备方法用以减轻界面吸附效应”（Electrospray-assisted cryo-EM sample preparation to mitigate interfacial effects）的研究论文。研究采用非变性质谱（Native mass spectrometry, native MS）中广泛使用的电喷雾电离（Electrospray ionization, ESI）技术，设计并搭建了一种新型冷冻样品制备装置ESI-cryoPrep（图1），成功实现了无需滤纸夹吸的冷冻样品制备，并获得了多种生物大分子近原子分辨率的三维结构。研究表明，ESI-cryoPrep可以有效地将生物大分子颗粒完整嵌入无定形态薄层冰中，避免其吸附在空气-水、固体-水界面上，并对该装置制备生物大分子冷冻样品过程中的界面模型进行了机理阐释。ESI-cryoPrep以“软”电离技术ESI为基础，通过向蛋白溶液施加高电压形成大量带电的蛋白液滴，可以有效地减少蛋白的变性与碎裂。在电场的驱动下，带电液滴飞向电镜载网的过程中伴随着去溶剂化的进行；液滴表面的电荷密度激增至瑞利极限导致库仑裂变形成带电的次级液滴；这一过程循环往复直至液滴最终沉积在电镜载网上；收集到带电液滴的电镜载网被插入液氮冷却的液态乙烷中即可实现对液滴的快速冷冻。该过程完全省却了滤纸的夹吸，避免了滤纸材料对液体和生物大分子的影响。因为液滴表面的小分子离子形成了双电层效应，生物大分子与液体的界面被隔绝开，从而避免了生物大分子吸附到气液或固液界面上，更好地保持了生物大分子的天然结构。该研究首次对ESI液滴中的生物大分子的天然结构（Native structures）进行了直接测定，指导获得ESI的“软着陆”电离参数进行冷冻制样与非变性质谱分析。该工作是冷冻电镜与质谱技术的交叉融合，共同致力于解答生物大分子结构解析与分析的科学问题。研究团队在搭建的设备上，经过多次摸索确定了制备高质量冷冻样品的相关参数。这些参数既能满足保存高比例完整结构生物大分子颗粒的需求，又能促进带电液滴在附着电镜载网表面的扩展和浸润。研究团队运用优化的ESI-cryoPrep装置制备了五种生物大分子的高质量冷冻样品，获得了与目标生物大分子尺寸相对应的理想冰层厚度，并实现了全部测试样品70Sribosome、20Sproteasome、apo-ferritin、ACE2和streptavidin的高分辨率三维结构解析，分辨率分别为2.7[gf]c5[/gf]、2.0[gf]c5[/gf]、2.1[gf]c5[/gf]、3.3[gf]c5[/gf]和1.9[gf]c5[/gf]。研究团队对冷冻电镜数据进行了深入的挖掘与分析，发现与预期假设一致的结果。ESI-cryoPrep可以有效地将生物大分子颗粒完整嵌入无定形态冰的薄层中间，抑制目标生物大分子在空气-水或石墨烯-水界面的吸附（图2），从而避免蛋白质颗粒的结构损伤或者优势取向问题。研究工作提出了电荷残留模型，阐明了电喷雾电离产生的液滴表面的电荷不均匀分布保护蛋白质颗粒免于界面吸附的作用和机制。这种学科交叉的研究成果不仅将为冷冻电镜样品制备提供应用价值，还将对冷冻电镜技术和非变性质谱领域的交叉和发展产生积极影响，为更多创新应用开辟新的可能性。自主研发的高质量冷冻电镜样品制备装置，一方面可以缩短结构解析的漫长探索过程，更高效地获得高分辨三维结构，分析其作用机理；另一方面也提升了原创研发具有自主知识产权和高精尖技术的能力，减少对国外相关仪器和设备的依赖。图2.ESI-cryoPrep方法制备的冷冻样品中蛋白质颗粒在断层成像中的代表性空间分布清华大学生命科学学院2017级博士生杨梓和精密仪器系2018级博士生范菁津（已毕业）为该论文共同第一作者，清华大学生命科学学院教授王宏伟，精密仪器系教授欧阳证和副教授周晓煜为论文共同通讯作者。清华大学生命科学学院王家副研究员和范潇博士等为课题的启动和推进作出重要贡献。研究得到国家自然科学基金、腾讯基金会等的资助，并得到清华大学冷冻电镜中心和计算中心的技术支持。

上海卢湘仪离心机仪器有限公司作为专业生产离心机的企业，生产历史悠久、技术力量雄厚，深受业内欢迎。近期上海卢湘仪又传来重大消息，即山东某制药厂又订购了一批上海卢湘仪L800R大容量冷冻离心机。 据了解，L800R大容量冷冻离心机是专门针对大容量需求的客户设计，此机型样品处理量大，是中心血站、制药、生物工程等领域的专业产品，一次可分离12x400ml三联袋或四联袋，24x200ml三联袋；该离心机采用进口高性能压缩机组，无氟制冷剂R404a，符合环保要求；另外该离心机拥有强大的控制系统，可实现分段阶梯离心预设程序调用、分级密码管控， 确保使用仪器安全可靠，便于精细化管理。 生物制药离心机的制药技术作为一种高新技术，为医疗业、制药业等相关行业的发展开辟了广阔的前景，较大地改善了人们的生活，提高了工作生产效率。因此，生物技术被世界确定为21世纪科技发展的关键技术和新兴产业。 生物制药离心机是专业针对固体颗粒微小、比重非常接近的液固两相、液液固三相分离，是制药、食品、化工、生物制品、饮料制品等多个行业的重要设备。其工作原理是通过强大离心作用下将不同比重的物料从而有效分离，从而达到分离目的。 随着国家对仿制药与原研药的科研不断投入，国内的药品市场已由国外进口药的主导市场慢慢向国内仿制药或原研药的市场转变，虽然中国目前暂时还是仿制药大国，仿制药品种、品规数量都很巨大，多数国产仿制药质量与原研药存在较大差距，但是随着国内制药设备与制药生产技术的不断提升，国产药品的质量和疗效也将会实现质的突破，逐渐拉近与市场上进口原研药差距并最终实现取代。 上海卢湘仪有着悠久的历史和雄厚的技术力量，从企业成立到现在，一直致力于推进国产离心机的创新发展，目前上海卢湘仪的离心机拓展国际市场已出口到美国、德国、英国、加拿大、泰国等30多个国家。在国内满足国内销售的同时一直注重制药企业的发展，通过不断改良离心机的制作工艺与产品精度，为国内制药企业对制药离心机的需求与发展历程上助上一臂之力。 据了解，历经四十多年的发展，上海卢湘仪已先后设计生产了国内高速冷冻离心机GL-25M。制造了国内的316L不锈钢材质的连续流转子。超大容量冷冻离心机在2400ml方杯的基础上，研制出制药行业提取方便的2000ml圆杯，并配有316L不锈钢材质的离心杯，为制药行业认证企业提供了良好的配套。此次山东某制药厂订购上海卢湘仪L800R大容量冷冻离心机也是对其产品品质、技术力量以及良好服务的再一次肯定。

p 　　 strong 仪器信息网讯 /strong 2018年11月28日，青岛海洋科学与技术国家实验室发展中心的冷冻电镜生物影像平台项目，在政府采购平台发布中标公告，赛默飞中标了项目中的冷冻透射电子显微镜2套、透射电镜1套、冷冻双束电镜1套。 /p p 　　具体中标信息如下表： /p table cellspacing=" 0" cellpadding=" 0" border=" 1" align=" center" tbody tr class=" firstRow" td style=" border: 1px solid windowtext padding: 0px 7px " width=" 32" p strong span style=" font-family:宋体" 中标时间 /span /strong /p /td td style=" border: 1px solid windowtext padding: 0px 7px " width=" 62" p strong span style=" font-family:宋体" 采购单位 /span /strong /p /td td style=" border: 1px solid windowtext padding: 0px 7px " width=" 188" p strong span style=" font-family:宋体" 中标标的名称 /span /strong /p /td td style=" border: 1px solid windowtext padding: 0px " width=" 95" p strong span style=" font-family:宋体" 产品名称 /span /strong /p /td td style=" border: 1px solid windowtext padding: 0px " width=" 170" p strong span style=" font-family:宋体" 中标供应商 /span /strong /p /td /tr tr td rowspan=" 4" style=" border: 1px solid windowtext padding: 0px 7px " width=" 32" p span 11 /span span style=" font-family:宋体" 月 /span span 28 /span span style=" font-family:宋体" 日 /span /p /td td rowspan=" 4" style=" border: 1px solid windowtext padding: 0px 7px " width=" 62" p span style=" font-family:宋体" 青岛海洋科学与技术国家实验室发展中心 /span /p /td td style=" border: 1px solid windowtext padding: 0px 7px word-break: break-all " width=" 188" p span 300KV /span span style=" font-family: 宋体" 冷冻透射电镜 /span /p /td td style=" border: 1px solid windowtext padding: 0px " width=" 95" p span 1 /span span style=" font-family:宋体" 套 /span /p /td td rowspan=" 4" style=" border: 1px solid windowtext padding: 0px " width=" 170" p span style=" font-family:宋体" 赛默飞（ /span span FEI /span span style=" font-family:宋体" ） /span /p /td /tr tr td style=" border: 1px solid windowtext padding: 0px 7px word-break: break-all " width=" 188" p span 200KV /span span style=" font-family: 宋体" 冷冻透射电镜 /span /p /td td style=" border: 1px solid windowtext padding: 0px " width=" 95" p span 1 /span span style=" font-family:宋体" 套 /span /p /td /tr tr td style=" border: 1px solid windowtext padding: 0px 7px word-break: break-all " width=" 188" p span 120kV /span span style=" font-family: 宋体" 透射电子显微镜 /span /p /td td style=" border: 1px solid windowtext padding: 0px " width=" 95" p span 1 /span span style=" font-family:宋体" 套 /span /p /td /tr tr td style=" border: 1px solid windowtext padding: 0px 7px " width=" 188" p span style=" font-family:宋体" 冷冻双束电镜 /span /p /td td style=" border: 1px solid windowtext padding: 0px " width=" 95" p span 1 /span span style=" font-family:宋体" 套 /span /p /td /tr /tbody /table p 　　青岛海洋科学与技术试点国家实验室于2013年12月获得科技部批复、2015年6月正式运行，由国家部委、山东省、青岛市共同建设，定位于围绕国家海洋发展战略，以重大科技任务攻关和国家大型科技基础设施为主线，开展战略性、前瞻性、基础性、系统性、集成性科技创新，依托青岛、服务全国、面向世界，着力突破世界前沿的重大科学问题，攻克事关国家核心竞争力和经济社会可持续发展的关键核心技术，率先掌握能形成先发优势、引领未来发展的颠覆性技术，建成引领世界科技发展的高地、代表国家海洋科技水平的战略科技力量、世界科技强国的重要标志和促进人类文明进步的世界主要科技中心。 /p p 　　2018年9月9日，山东省科技厅、财政厅组织的山东省重大科技创新工程专项和重大科研平台建设项目专家论证会在青岛海洋科学与技术试点国家实验室(以下简称“海洋试点国家实验室”)学术交流中心召开。论证会上，与会专家听取了“透明海洋”“海洋高端装备”“深蓝渔业”“蓝色药库”“健康海洋”技术创新工程专项和“海洋大数据中心”“海洋高端仪器设备研发平台”“ span style=" color: rgb(0, 176, 240) " strong 冷冻电镜生物影像平台 /strong /span ”“海洋地质年代测定平台”“海洋能海上试验场”重大科研平台建设项目汇报，审阅了相关材料。 /p p br/ /p

（1）生物制品的冷冻真空干燥我们做过生物制品冷冻真空干燥的品种有皮肤、角膜、海参、螺旋藻等；从文献中看到其他人做过的冻干产品有心瓣膜、活菌、活毒、骨骼、各种疫苗、血液制品等。生物制品的冻干要求保持产品的活性，活菌、活毒等微生物真空干燥后的存活率要求80%以上，以便于应用。因此，对冻干机工艺要求严格，预冻温度、速度、时间的控制很不容易，保护剂配方、剂量、加入时间和加入方法非常关键，不同的人可能采用不同的配方，达到的效果可能相同。一般各种保护剂的配方都是互相保密的。（2）药材和药品的冷冻真空干燥我们做过的品种有人参、山药、纳豆激酶、北冬虫夏草、林硅油、鹿茸等；从文献中看到其他人做过的品种有各种粉针制剂、中草药制剂、抗生素、布洛芬、脂质体和其他纳米颗粒等。药材和药品需要长期保存，真机需要速溶，放置氧化，避免污染杂菌，保持药效的长久稳定。这些要求都需要通过冷冻真空干燥技术来实现。药材和药品的冷冻真空干燥工艺要求也很严格，寻找合适的冻干保护剂、添加剂、赋形剂都很困难，生化干燥阶段的温度控制、加热速率控制都很关键，严格防止塌陷。（3）食品的冷冻真空干燥我们做的食品有菠菜、苹果、香蕉、库尔勒香梨等；从文献上查到其他人做过的品种有咖啡、茶叶、大蒜、鱼肉、调料等。食品种类繁多，形状、性质相差较大，冻干工艺需要在实验中确定。冻干食品时间较长、耗能较多、价格较高，应该合理选择冻干参数，优化冻干过程，降低冻干昂成本，根据市场需要，选择性价比较高的食品做冷冻真空干燥。（4）冷冻真空干燥在其它领域的应用冷冻真空干燥除了在生物制品、药品、食品和纳米材料制备方面的应用之外，还可以干燥超市的木质文物、古画等，冻干发出来的这些产品能恢复物品的原样；还可以干燥动植物标本，使标本长期保存，栩栩如生；医疗事业做实验用的、具有毒害物质的动物尸体采用冻干干燥法的处理，可以实现环保等。