核酸酶活性检测

当前，COVID-19 在世界范围内大流行，已造成超过两亿人次的感染和四百多万人次的累计死亡，基于 qRT-PCR(定量逆转录酶-聚合酶链反应)的检测是当前诊断 COVID-19 的金标准。尽管说这种方法具有很高的敏感性，但其操作仍然过于复杂，检测时间长达数小时，无法实现快速的即时检测。因此，开发比 qRT-PCR 更快速、更容易实施的诊断检测策略显得尤为重要。　　CRISPR/Cas 系统是用于基因编辑的分子生物学工具，有准确识别和切割特定 DNA 和 RNA 序列的能力。2020 年的诺贝尔化学奖也颁给了 CRISPR 基因编辑技术。随后，多项 CRISPR-Cas9 基因编辑临床实验开启并获得突破性结果，并已成功应用于人类疾病的治疗。　　与 Cas9 蛋白不同，Cas13 蛋白特异靶向 RNA 序列，能够在切割靶 RNA 之后仍保持活性，而且可能表现出不加区别的切割活性。这一特性使其不能被用于基因编辑，但对诊断来说却是个独特的优势，例如通过切割降解已标记的核酸来产生荧光信号，具有被应用于核酸检测的潜力。　　2021 年 8 月 5 日，加州大学伯克利分校 Jennifer Doudna(2020 年的诺贝尔化学奖得主之一)、David Savage 和 Patrick Hsu 三位科学家领导的研究团队在 Nature Chemical Biology 杂志上在线发表了题为 Accelerated RNA detection using tandem CRISPR nucleases 的文章。　　研究人员结合了两种不同的 CRISPR 酶，创造了一种能在一小时内检测到少量病毒 RNA 的方法，这种被称之为快速串联集成核酸酶检测(Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem, FIND-IT)的无扩增技术，可以为许多传染病及当前流行的 COVID-19 提供快速且廉价的诊断策略。　　主要研究内容　　LbuCas13a 结合嗜热栖热菌 Csm6(TtCsm6)可用于快速 RNA 检测　　Csm6 是一种 III 型 CRISPR-Cas 系统的 RNA 内切酶，可被激活以切割细胞中的各种 RNA 分子，基于其信号放大的内源性功能，有可能提高 RNA 检测的敏感性。　　通过筛选，研究人员发现寡核苷酸 A4-U6 可结合并刺激 TtCsm6 对报告蛋白的切割，并释放出荧光分子。此外，不同浓度的 A4-U6 激活 TtCsm6 后，在 20-30 分钟内出现荧光增长，随后达到一个平台值，最终荧光水平与 Csm6 激活剂的数量成正比。　　在荧光已经趋于平稳的 LbuCas13a-TtCsm6 反应中加入 A4-U6 激活剂可以迅速增加 TtCsm6 对靶序列的切割，而添加更多的靶 RNA 或 TtCsm6 则没有影响。这些数据表明 Csm6 的 A4P 配体会随着时间的推移而耗尽，从而使其 RNA 切割活性失活，而这种失活则限制了其产生荧光信号的数量。　　Csm6 激活剂的化学修饰　　为了解决 Csm6 激活剂失活的难题，他们想到了位点选择性化学修饰的方法，实验结果发现，这种策略不仅可以防止激活 Csm6 的寡核苷酸的降解，同时还能保持 Csm6 的高水平激活状态，使其可以反复切割和释放与 RNA 相关的荧光分子。灵敏度比未修饰的 A4-U6 激活剂提高了 100 倍。　　RNA 检测的可编程性　　为了使 TtCsm6 及其修饰的激活剂能够用于提高 RNA 检测的灵敏度和检测速度，必须保留用于串联检测的 CRISPR 核酸酶的可编程特性。　　为此，他们将 TtCsm6 及其激活剂添加到一个 LbuCas13a 蛋白中，该蛋白具有不同的 crRNA 序列，可以靶向 COVID-19 病原体 SARS-CoV-2 的 RNA 序列。采用不同的 crRNA 序列进行检测，发现其具有相似的灵敏度和动力学，这表明，这种「一步法」可以对不同的 crRNA 序列进行编程，因此可能适用于几乎任何 RNA 序列的检测。　　为了确定添加 TtCsm6 是否能加快检测时间，他们在反应 20 分钟后比较了这两种检测策略的结果，发现同时含有 LbuCas13a 和 TtCsm6 的试剂盒在 20 分钟内即可完成对每微升 31 个拷贝的样品检测。　　综上这些结果表明，通过优化 LbuCas13a 的 crRNA 和化学修饰的 TtCsm6 激活剂，串联 CRISPR 核酸酶检测能够实现对传染性病原体 RNA 序列的无扩增检测，在加速检测病原体的同时兼具高灵敏度，他们称这种策略为快速串联集成核酸酶检测(Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem, FIND-IT)。　　集合检测器实现 FIND-IT 即时检测病毒 RNA　　最后，为了证明将上述 FIND-IT 纳入即时测试流程的可行性，他们开发了一种便捷检测器，该检测器由一个带有反应室的微流控芯片、一个将反应维持在 37℃ 的加热模块和一个荧光成像系统组成。　　将含有靶标 RNA(SARS-CoV-2 RNA)或水(无靶标 RNA)的 LbuCas13a-TtCsm6 加入反应室内，1 小时后发现，当 SARS-CoV-2 RNA 每微升含有 400 拷贝时，反应信号呈非线性增加，1 h 内增加约 4.7 倍 而不含靶 RNA 的阴性对照则出现约 1.7 倍的变化。　　此外，与背景对照相比，每微升反应 400 拷贝的荧光量增加了 270%，而两个阴性对照的荧光量则同时增加了 3%。鉴于阳性和阴性样品之间荧光信号的巨大差异，这表明 LbuCas13a-TtCsm6 反应可在一个紧凑的检测器中实现，并可以用于即时诊断检测。　　结语　　综上所述，在这项研究中，该团队证明了 LbuCas13a 与 TtCsm6 联合可用于快速 RNA 检测，对其激活剂进行化学修饰后可使其敏感性提高约 100 倍。同时，将 TtCsm6 与含有不同 crRNA 的 LbuCas13a 效应体相结合，也可使提取的病毒 RNA 检测低至每微升 31 个拷贝，60 分钟检测准确率更是达到 100%。最后，他们还将这种分析策略应用于集成检测设备，保证了其便捷性。　　因此，这种「一键式」检测策略具有高灵敏性和快速的反应能力，未来可广泛应用于检测 SARS-CoV-2 RNA 以及其他病毒或细胞 RNA 序列或环境样本中的植物、真菌或微生物 RNA。　　不过，使用 FIND-IT 实现完整的即时检测还需要进一步开发合适的样本收集和处理程序，以及强大的数据分析流程，将来仍需要进行更多人类样本的测试，以验证其在临床样本检测中的稳定性和准确性。　　本研究第一作者 Tina Y. Liu 表示：「这种串联核酸酶方法——Cas13 联合 Csm6，在 37℃ 的单一温度下发生反应，并不需要其他诊断技术所需的高温加热，这为更快更简便的测试提供了可能，同时这些测试的灵敏度当前已经可以达到与其他检测技术相当的水平，并且可能在未来做到更加灵敏。」　　研究团队在接受采访时说到：「虽然我们确实是为了 COVID-19 而启动了这个项目，但我们认为这种特殊的技术不仅仅适用于此次疫情，因为 CRISPR 是可编程的，因此可以将针对流感病毒、HIV 病毒或任何类型的 RNA 病毒序列整合到 CRISPR 酶中，该系统均可用相同的方式工作。这一研究证明了这种生物化学方法是一种更简单的检测 RNA 的方法，并且快速敏感，这可能被应用于未来的即时诊断中。」

转座在生物体基因重塑过程中具有关键性的作用。IS200/IS605 和 IS607 家族的插入序列（insertion sequences, ISs）是最简单的可移动遗传元素之一，仅包含其转座和调节所需的基因。2021年9月9日，张锋团队在Science杂志上发表了一篇题为 The widespread IS200/605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases 的文章（详见BioArt报道：Science | 张锋团队再发文：源于IS200/605转座子家族的多种核酸酶或可成为基因编辑新工具）【1】，重建了CRISPR-Cas9系统的进化起源，发现了3种高度丰富但功能未知的转座子编码的可编程RNA引导核酸酶：IscB、IsrB和TnpB，并对IscB的蛋白功能进行了详细探究。该研究还发现TnpB可能是CRISPR-Cas9/Cas12核酸酶的祖先，推测TnpB也具备RNA引导的核酸酶活性。近日，来自立陶宛维尔纽斯大学的Virginijus Siksnys团队（CRISPR开创者之一，通过研究CRISPR-Cas9 生化性质，得出了Cas9酶可以定点切割DNA的结论，特别致敬CRISPR幕后的英雄们——最全的一份CRISPR英雄谱）在Nature杂志上在线发表了题为Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease的研究论文。研究人员通过一系列生化实验证实CRISPR-cas核酸酶的祖先TnpB是可重编程的 RNA 引导的功能性核酸酶。TnpB通过reRNA（right element RNA，长非编码RNA，来源于ISDra2转座子中的RE元件）引导去切割靠近TTGAT转座相关模块（Transposon associated motif, TAM）5’端的DNA，并可以切割人类基因组DNA。如图1所示，IS200/IS605家族的Deinococcus radiodurans ISDra2中包含tnpA和tnpB基因，以及位于两侧的LE（Left element）和RE（Right element）。在纯化TnpB的过程中，作者发现有许多RNA也被一同纯化。对TnpB结合的RNA进行small RNA测序（sRNA-seq）分析，发现它们大多是长度约为150nt的长非编码RNA，来源于ISDra2中的RE序列，作者将这些RNA称为reRNAs（right element RNA）。reRNA 3’端的16nt来源于IS200/IS605转座子的侧翼DNA序列，其余序列与TnpB基因的3’端和RE序列匹配，说明TnpB可以与转座子3’端来源的reRNA形成RNP复合物。图1. D. radiodurans ISDra2位点PAM（protospacer adjacent motif）序列是Cas9或Cas12核酸酶启动DNA切割所必须的，那么TnpB发挥作用可能也需要类似的序列。通过PAM鉴定实验【2】，作者观察到在目标基因5’端上游富集了大量的TTGAT序列，并称之为Transposon Associated Motif (TAM)。体外DNA切割实验证实TnpB具备RNA引导的靶向dsDNA的核酸酶活性。进一步分析发现，将TnpB序列中的RuvC-like活性位点突变后，TnpB失去了切割能力，说明RuvC模块与TnpB的活性相关。研究人员发现实现TnpB的DNA切割功能需要同时满足两个条件：（1）TAM序列；（2）与靶基因匹配的位于reRNA 3’端的序列。随后，作者对切割产物进行了测序分析，结果显示，TnpB采取的是一种交错切割模式，在NTS（non-target strand）的多个位置和 TS (target strand) 的单个位置进行切割，最终产生5’-悬挂端（overhangs）（图2）。图2. TnpB-reRNA复合物切割双链DNA的实验设计及流程最后，作者探究了TnpB在细胞内切割目标dsDNA的能力。首先，在E.coli中进行的质粒干扰实验表明TnpB可以在原核生物体内切割dsDNA。紧接着，作者想知道TnpB是否可以应用于切割人类基因组。将编码TnpB和reRNA的工具质粒转染至HEK293T细胞中，72小时后，提取基因组DNA（gDNA）测序分析目标切割位点中的序列插入和删除（insertions and deletions，indels）情况（图3）。实验结果显示，TnpB在两个测试靶点（AGBL1-2和EMX1-1）中引入突变的频率为10%-20%，这与之前报道过的CRISPR-Cas9和Cas12的效率类似【3-7】。进一步分析发现，切割位点引入的删除突变占主导地位，与Cas12切割谱中观察到的现象类似【5,7】。这些结果说明RNA引导的TnpB核酸酶可以切割真核生物的基因组DNA。图3. 利用TnpB编辑人类基因组综上所述，该研究从ISDra2系统中鉴定了一个新的具有dsDNA切割功能的核酸酶TnpB，其在原核和真核细胞中均能有效切割dsDNA，具有编辑人类基因组的巨大潜力。在进化树上，虽然TnpB与微型 Cas12f核酸酶的关系最为紧密，但作者认为两者之间依旧存在重大区别：（1）TnpB与Cas12f使用的guide RNA不同；（2）TnpB是单体，仅需要一个reRNA；而Cas12f 核酸酶是二聚体，需要结合一个拷贝的crRNA-tracrRNA duplex；（3）TnpB需要TAM序列，Cas12f需要PAM序列，两种序列截然不同。原文链接:https://doi.org/10.1038/s41586-021-04058-1

近日，上海交通大学王鹏飞教授和团队，设计一种无需预扩增的新型 DNAzyme 传感器，并将其并命名为 SPOT。图 | 王鹏飞（来源：王鹏飞）对于以 miRNA 和病毒 RNA 为代表的多种临床意义核酸标记物，本次传感器均具备检测能力，并能实现快速、便捷的临床分子诊断应用。通过针对血清 miRNA 进行敏感和特异的检测，进而可以用于乳腺癌、胃癌和前列腺癌等多种癌症的分子诊断。此外，SPOT 能从临床拭子中灵敏准确地检测 SARS-CoV-2 RNA。同时，SPOT 可以与侧流层析技术联合，实现对于核酸靶标的即时（POCT，point-of-care testing）检测。（来源：Angewandte Chemie International Edition）鉴于 SPOT 完全由合成 DNA 分子构建，避免了对于昂贵蛋白质酶的需求，具备较好的成本优势。实验显示，一次 SPOT 测定的材料成本，大约低至 0.02 美元，明显低于已有的检测体系。与现有基于 DNA 酶、或基于 CRISPR 的核酸靶标测定相比，这种灵敏且特异的分析性能、一步法的操作方案、低成本的优势、以及和 POCT 能力的结合，让 SPOT 能够成为一种更好的测定方法。未来在检验医学领域，该团队希望利用 SPOT 体系针对循环体内核酸进行检测，实现多类型疾病的灵敏特异分子诊断，从而为疾病的早期诊断和精准治疗提供新的可能。进一步地，他们也希望基于核酸适体的结合，能够进行小分子与蛋白的检测，扩展 SPOT 系统在多方面的临床诊断应用。此前，在体内递送治疗方面，传统的 DNAzyme 不具备可编程的靶向性。而该团队设计的新型 DNAzyme 体系可以快速设计和实现可编程的靶向目标链，并通过切割来达到治疗目标。总的来说，这一创新有望为疾病治疗提供更精准、更有效的手段，为基因治疗和精准医学的发展带来重要推动。（来源：Angewandte Chemie International Edition）那么，本次成果的研发必要性是什么？它弥补了已有测量工具的哪些不足？据介绍，生物体液（血液、尿液、汗液等）中存在的核酸分子，是对包括癌症和病毒感染等重大疾病进行分子诊断的一类关键生物标志物。然而，核酸标志物存在低丰度、高度动态、高异质性、背景干扰大等特点，其临床检测面临着测不出、测不准、测不全、测不了、测不起等挑战。因此，迫切需要开发超灵敏、高特异、通量高、便捷经济的核酸生物标志物检测分析方法。DNAzymes 是一类体外筛选的合成 DNA 分子，具有类似酶的催化活性，例如裂解核酸磷酸二酯键。典型的裂解核酸 DNAzyme，由具有催化能力的催化核心、以及用于通过序列互补性识别底物的两条臂组成。因此，当前许多 DNAzyme 已经广泛用于体外和体内的金属离子检测，因为它们的催化活性高度依赖于金属离子。然而，具有小分子、蛋白质或核酸检测能力的 DNAzyme 鲜有报道，导致这些目标很难被检测到。受自然酶和核酸酶的启发，通过实施异构模块（如 aptamer、toehold）来设计异构的 DNAzyme 生物传感器，可以通过小分子、蛋白质、核酸或细菌等，调节因子介导其催化活性。传统的异构 DNAzyme 生物传感器通常被设计成多组分分子复合体，通过具有 toehold 的抑制链，来抑制并释放 DNAzyme。以及通过在靶结合后分裂并恢复催化核心，或通过靶诱导的 DNAzyme-底物-靶标复合物的稳定，来实现对于核酸靶的直接检测。然而，这些生物传感系统对于定向核酸的直接检测，通常表现出皮摩尔至纳摩尔的敏感性，因此无法探测临床样本中的 miRNA 或病毒 RNA 标志物。而许多 miRNA 被视为是多种癌症的潜在生物标志物，然而由于缺乏癌症诊断的敏感性和特异性，很少有 miRNA 被证明在临床上有用。王鹏飞认为，这种多组分设计可能会对其检测能力产生负面影响。由于一些原因比如化学计量的不完善、动力学分子陷阱、催化活性受损、以及信号泄漏的风险增加，会导致低丰度目标更加难以被测量。而该课题组的主要研究兴趣是：开发简单、快捷、灵敏的新型疾病分子诊断方法。通过调研，该团队发现体液中的循环核酸已经成为多种疾病的重要液体活检生物标志物。由于这些核酸生物标志物在生物标本中的高度动态、异质性和低丰度，导致其临床检测面临着巨大挑战。传统的聚合酶链式反应（PCR，Polymerase Chain Reaction）技术需要严格的样品处理、昂贵仪器和专业操作。而新型等温扩增方法，比如重组酶聚合酶扩增（RPA，Recombinase Polymerase Amplification）、环介导等温扩增（LAMP，Loop-mediated isothermal amplification）等则能简化操作过程。而尽管 CRISPR结合等温扩增技术，能够显示出较高的灵敏度和便捷性，但是存在非特异性扩增、连续操作步骤和对昂贵易损酶的需求等缺陷，限制了临床上的应用。通过对以上这些因素的思考、并结合课题组自身优势，他们定下了本次课题。（来源：Angewandte Chemie International Edition）通过理论模拟与设计，他们设计出了这种新型 DNAzyme 传感器 SPOT。为了明确 SPOT 的机制并优化实验参数，课题组研究了具体的激活方式、以及可应用的核酸靶标长度。由于 DNAzyme 传感器的自身特性，最初他们设计的 DNAzyme 传感器信号泄漏非常严重，无论如何优化实验条件，都无法达到稳定、高灵敏的检测目的。通过大量的文献调研，以及学习和理解此前 DNAzyme 传感器的设计原理，再结合组内讨论他们认为：自封锁核酸链的设计，或许可以解决信号泄漏的问题。后来，通过一系列的实验，信号泄漏问题已经被解决。但是，DNA 酶传感器却无法被激活。于是，他们进一步优化参数，通过缩短结合臂的长度，最后成功构建了 DNAzyme 传感器。通过此，他们构造了一个单链、自锁定的单分子系统，并将这种传感系统命名为 SPOT（用于核酸检测的灵敏的环启动 DNAzyme 生物传感器）。同时，他们进一步将 SPOT 与试纸条结合，为 SPOT 实现 POCT 检测奠定了基础。经过全面优化和 SPOT 检测，在单管、一步、无预扩增和等温检测的前提下，实现了对 miR-21 的 15fM、对病毒 RNA 的 1.9aM 的强大检测灵敏度，以及对于核酸靶标的检测特异性（区分变异体）。最终，相关论文以《一种用于核酸敏感检测的可编程 DNAzyme》（A Programmable DNAzyme for the Sensitive Detection of Nucleic Acids）为题发在 Angewandte Chemie International Edition[1]。史辰致是第一作者，王鹏飞担任通讯作者。图 | 相关论文（来源：Angewandte Chemie International Edition）不过，目前只有少量临床样本在 SPOT 上进行测试。未来，课题组将对更多患者进行临床研究，以便全面评估 SPOT 测定的可靠性。同时，由于本次研究采用了无前置放大器的方案，因此 SPOT 还不够灵敏，无法在肉眼可见的测试条上，产生明显可区分的读数。因此，该团队打算进一步提高 SPOT 的灵敏度，或与基于等离子体/荧光的便携式可视化设备结合，以便让 SPOT 的 POCT 能力能被用于实际应用。未来，在临床应用层面，他们希望能够建立多中心、大规模临床队列，对 SPOT 体系的疾病诊断效能进行更大范围的论证。在技术改进层面，该团队计划拓展 SPOT 的应用范围。除了核酸检测外，他们也希望通过引入核酸适体，来实现对于小分子和蛋白标志物的检测。

仪器信息网讯 2015年6月17日，&ldquo 第四届中国食品与农产品质量安全检测技术国际论坛暨展览会&rdquo 在北京国家会议中心开幕。此次会议特别设置了&ldquo 食品与农产品中重金属元素和其他有害物质检测&rdquo 、&ldquo 食品与农产品安全微生物检测&rdquo 、&ldquo 饮用水安全检测&rdquo 等九个专题。大会第二天，来自中国科学院广州生物医药与健康研究院曾令文研究员在&ldquo 食品与农产品中重金属元素和其他有害物质检测&rdquo 专题中做了题为&ldquo 核酸生物传感器在重金属离子检测中的应用&rdquo 的报告。 专题现场 中国科学院广州生物医药与健康研究院 曾令文研究员 　　在报告中，曾令文首先介绍了重金属污染的危害、污染源和污染特点。他说，随着工农业生产的迅速发展，食品污染问题越来越严重，重金属是最主要的污染物质之一，会通过食物链的富集最终残留在人体内，对人体的组织器官构成了严重威胁。重金属污染源主要有工业污染、农业污染、生活污染和环境事故污染等。具有不可逆转性、生物积累性、难以降解、生物催化以后毒性会转变等特点。 　　同时曾令文提到，与其他国家相比，我国重金属污染相对比较严重。大气、土壤、水体都存在重金属污染的现象，污染一旦产生，面积会不断扩大。 　　其次，曾令文在报告中详细介绍了目前重金属的检测方法。据他介绍，传统重金属检测方法主要有光谱法、电化学法和基于显色螯合剂的方法等。光谱法主要包括原子吸收光谱法、原子发射光谱法、原子荧光光谱法和分光光度法等方法。光谱法和电化学法需要借助相关的仪器进行检测，具有灵敏度高、特异性好等优点。但是样品处理繁琐、检测成本和技术要求较高，不利于基层单位使用。而基于显色螯合剂的方法具有简便快速、成本低等优点，但是灵敏度不足、其他离子会干扰检测的特异性。 　　为了解决传统方法在检测重金属污染中面临的问题，在曾令文的带领下，课题组研制了两种新型生物传感器，基于核酸酶(DNAzyme)的传感器和基于荧光铜纳米颗粒的荧光传感器，并进行了大量实验验证方法的可行性和灵敏度。据他介绍，两种方法具有以下优点：简单、快速、检测成本较低 降低对仪器的依赖，肉眼即可观察结果 适合在基层实验室或野外使用等。 　　在介绍基于核酸酶(DNAzyme)的传感器在重金属检测中的应用时，曾令文说，该方法在检测重金属离子时主要有两种方法，试纸条法和荧光法。 　　试纸条法中主要制备了Pb2+和Cu2+特异性的DNAzyme检测试纸条，并进行相关实验进行检验。对于Pb2+来说，该方法检测限可以达到10pM，线性范围为10pM-100nM，特异性非常好，不受其他离子干扰，用湖水做回收率分析实验，结果可达88%-106%。对于Cu2+来说，该方法检测限可以达到10nM，特异性分析实验中，铜离子为0.3&mu M，其他离子为3&mu M。 　　荧光法中，主要制备了铜离子检测的荧光传感器和基于比色法检测铜离子的传感器，铜离子检测的荧光传感器的灵敏度可达12.8pM，线性范围是20pM-1&mu M，特异性分析实验中，铜离子为1&mu M，其他离子为10&mu M。基于比色法检测铜离子的传感器，灵敏度可达240nM，线性范围是0.4&mu M-100&mu M，特异性分析实验中，铜离子为10&mu M，其他离子为100&mu M。 　　在介绍基于荧光铜纳米颗粒的荧光传感器在重金属检测中的应用时，曾令文谈道，用该方法检测铅离子，灵敏度为5nM，线性范围为5-100nM，选择性分析实验中，铅离子为0.3&mu M，其他各离子为3&mu M。 　　最后，曾令文总结了基于核酸酶(DNAzyme)的传感器和基于荧光铜纳米颗粒的荧光传感器在进行重金属检测中的优点，并展望了两种方法在未来重金属检测中的应用前景。 　　编辑：张葳

全球新冠疫情肆虐之际，也让很多人了解到了核酸检测，目前它已经成为新型冠状病毒检测的“金指标”，早在5月11日，武汉市提出对全市1000万左右的市民进行全面检测，其具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点。也在这场疫情战中起到了关键性的作用。Avantor作为全球高质量的实验室产品供应商，为科学事业提供优质的实验产品和解决方案，助力病毒检测 ，与世界科学实验者一起抗击病毒。那么病毒检测包括核酸检测的过程是什么样的呢？本期小编将带大家了解检测的过程。病毒采样：提取病人唾液鼻咽拭子，并保存于病毒采样管核酸提取：裂解细胞，提取样本中的遗传物质，并且防止遗传物质降解通常核酸裂解液的主要成分是异硫氰酸胍，能迅速破碎病毒使核蛋白与核酸迅速分离，同时抑制释放出的核酸酶活性，保证核酸一级结构的完整性，提高核酸提取效率。EDTA作为螯合剂，能防止Mg，Ca等金属离子激活核酸酶，同时，盐酸胍能抑制核酸酶，DTT能防止延缓酶的失活。扩增：由于原始样本中的核酸含量非常低，所以需要通过扩增将核酸浓度扩大，使其能够被后续检测方法检测到。检测：根据检测结果判断样本是否含有病毒。了解VWR Life Science（原Amresco）在病毒检测过程中的相关产品。点击产品名称，查看更多信息。产品列表品名货号异硫氰酸胍0380EDTA0322EDTA二钠盐 0105Tris0497Tris盐酸盐0234盐酸胍E424

当前，COVID-19 在世界范围内大流行，已造成超过两亿人次的感染和四百多万人次的累计死亡，基于 qRT-PCR（定量逆转录酶-聚合酶链反应）的检测是当前诊断 COVID-19 的金标准。尽管说这种方法具有很高的敏感性，但其操作仍然过于复杂，检测时间长达数小时，无法实现快速的即时检测。因此，开发比 qRT-PCR 更快速、更容易实施的诊断检测策略显得尤为重要。CRISPR/Cas 系统是用于基因编辑的分子生物学工具，有准确识别和切割特定 DNA 和 RNA 序列的能力。2020 年的诺贝尔化学奖也颁给了 CRISPR 基因编辑技术。随后，多项 CRISPR-Cas9 基因编辑临床实验开启并获得突破性结果，并已成功应用于人类疾病的治疗。与 Cas9 蛋白不同，Cas13 蛋白特异靶向 RNA 序列，能够在切割靶 RNA 之后仍保持活性，而且可能表现出不加区别的切割活性。这一特性使其不能被用于基因编辑，但对诊断来说却是个独特的优势，例如通过切割降解已标记的核酸来产生荧光信号，具有被应用于核酸检测的潜力。加州大学伯克利分校 Jennifer Doudna（2020 年的诺贝尔化学奖得主之一）、David Savage 和 Patrick Hsu 三位科学家领导的研究团队在 Nature Chemical Biology 杂志上在线发表了题为 Accelerated RNA detection using tandem CRISPR nucleases 的文章。研究人员结合了两种不同的 CRISPR 酶，创造了一种能在一小时内检测到少量病毒 RNA 的方法，这种被称之为快速串联集成核酸酶检测（Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem， FIND-IT）的无扩增技术，可以为许多传染病及当前流行的 COVID-19 提供快速且廉价的诊断策略。主要研究内容LbuCas13a 结合嗜热栖热菌 Csm6（TtCsm6）可用于快速 RNA 检测Csm6 是一种 III 型 CRISPR-Cas 系统的 RNA 内切酶，可被激活以切割细胞中的各种 RNA 分子，基于其信号放大的内源性功能，有可能提高 RNA 检测的敏感性。通过筛选，研究人员发现寡核苷酸 A4-U6 可结合并刺激 TtCsm6 对报告蛋白的切割，并释放出荧光分子。此外，不同浓度的 A4-U6 激活 TtCsm6 后，在 20-30 分钟内出现荧光增长，随后达到一个平台值，最终荧光水平与 Csm6 激活剂的数量成正比。在荧光已经趋于平稳的 LbuCas13a-TtCsm6 反应中加入 A4-U6 激活剂可以迅速增加 TtCsm6 对靶序列的切割，而添加更多的靶 RNA 或 TtCsm6 则没有影响。这些数据表明 Csm6 的 A4P 配体会随着时间的推移而耗尽，从而使其 RNA 切割活性失活，而这种失活则限制了其产生荧光信号的数量。Csm6 激活剂的化学修饰为了解决 Csm6 激活剂失活的难题，他们想到了位点选择性化学修饰的方法，实验结果发现，这种策略不仅可以防止激活 Csm6 的寡核苷酸的降解，同时还能保持 Csm6 的高水平激活状态，使其可以反复切割和释放与 RNA 相关的荧光分子。灵敏度比未修饰的 A4-U6 激活剂提高了 100 倍。RNA 检测的可编程性为了使 TtCsm6 及其修饰的激活剂能够用于提高 RNA 检测的灵敏度和检测速度，必须保留用于串联检测的 CRISPR 核酸酶的可编程特性。为此，他们将 TtCsm6 及其激活剂添加到一个 LbuCas13a 蛋白中，该蛋白具有不同的 crRNA 序列，可以靶向COVID-19 病原体 SARS-CoV-2 的 RNA 序列。采用不同的 crRNA 序列进行检测，发现其具有相似的灵敏度和动力学，这表明，这种「一步法」可以对不同的 crRNA 序列进行编程，因此可能适用于几乎任何 RNA 序列的检测。为了确定添加 TtCsm6 是否能加快检测时间，他们在反应 20 分钟后比较了这两种检测策略的结果，发现同时含有 LbuCas13a 和 TtCsm6 的试剂盒在 20 分钟内即可完成对每微升 31 个拷贝的样品检测。综上这些结果表明，通过优化 LbuCas13a 的 crRNA 和化学修饰的 TtCsm6 激活剂，串联 CRISPR 核酸酶检测能够实现对传染性病原体 RNA 序列的无扩增检测，在加速检测病原体的同时兼具高灵敏度，他们称这种策略为快速串联集成核酸酶检测（Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem， FIND-IT）。集合检测器实现 FIND-IT 即时检测病毒 RNA最后，为了证明将上述 FIND-IT 纳入即时测试流程的可行性，他们开发了一种便捷检测器，该检测器由一个带有反应室的微流控芯片、一个将反应维持在 37℃ 的加热模块和一个荧光成像系统组成。将含有靶标 RNA（SARS-CoV-2 RNA）或水（无靶标 RNA）的 LbuCas13a-TtCsm6 加入反应室内，1 小时后发现，当 SARS-CoV-2 RNA 每微升含有 400 拷贝时，反应信号呈非线性增加，1 h 内增加约 4.7 倍；而不含靶 RNA 的阴性对照则出现约 1.7 倍的变化。此外，与背景对照相比，每微升反应 400 拷贝的荧光量增加了 270%，而两个阴性对照的荧光量则同时增加了 3%。鉴于阳性和阴性样品之间荧光信号的巨大差异，这表明 LbuCas13a-TtCsm6 反应可在一个紧凑的检测器中实现，并可以用于即时诊断检测。结语综上所述，在这项研究中，该团队证明了 LbuCas13a 与 TtCsm6 联合可用于快速 RNA 检测，对其激活剂进行化学修饰后可使其敏感性提高约 100 倍。同时，将 TtCsm6 与含有不同 crRNA 的 LbuCas13a 效应体相结合，也可使提取的病毒 RNA 检测低至每微升 31 个拷贝，60 分钟检测准确率更是达到 100%。最后，他们还将这种分析策略应用于集成检测设备，保证了其便捷性。因此，这种「一键式」检测策略具有高灵敏性和快速的反应能力，未来可广泛应用于检测 SARS-CoV-2 RNA 以及其他病毒或细胞 RNA 序列或环境样本中的植物、真菌或微生物 RNA。不过，使用 FIND-IT 实现完整的即时检测还需要进一步开发合适的样本收集和处理程序，以及强大的数据分析流程，将来仍需要进行更多人类样本的测试，以验证其在临床样本检测中的稳定性和准确性。本研究第一作者 Tina Y. Liu 表示：「这种串联核酸酶方法——Cas13 联合 Csm6，在 37℃ 的单一温度下发生反应，并不需要其他诊断技术所需的高温加热，这为更快更简便的测试提供了可能，同时这些测试的灵敏度当前已经可以达到与其他检测技术相当的水平，并且可能在未来做到更加灵敏。」研究团队在接受采访时说到：「虽然我们确实是为了 COVID-19 而启动了这个项目，但我们认为这种特殊的技术不仅仅适用于此次疫情，因为 CRISPR 是可编程的，因此可以将针对流感病毒、HIV 病毒或任何类型的 RNA 病毒序列整合到 CRISPR 酶中，该系统均可用相同的方式工作。这一研究证明了这种生物化学方法是一种更简单的检测 RNA 的方法，并且快速敏感，这可能被应用于未来的即时诊断中。

研究背景Nature：清北团队合作发现CRISPR免疫增效子，建立Cas9核酸酶生长进化模型CRISPR-Cas系统是一种强大的基因编辑工具，但Cas9核酸酶活性仍需提高。现有的方法存在着种种局限性，例如优化序列可能破坏结构、改变表达方式可能导致副作用、使用辅助蛋白会增加复杂性等。因此，开发新的方法来增强Cas9核酸酶的活性仍是CRISPR-Cas系统研究中的一个重要课题。2024年5月29日，来自清华大学和北京大学的研究团队在Nature上合作发表了题为：Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity的研究论文研究团队通过生物信息学分析、结构生长轨迹分析、生化实验、冷冻电镜解析和大肠杆菌抗噬菌体实验等手段，发现了一类新型CRISPR免疫增效子PcrIIC1，可以显著增强Cas9核酸酶的活性。研究团队还建立了Cas9核酸酶生长进化模型，揭示了Cas9蛋白结构和功能的演变规律，并阐明了PcrIIC1增强Cas9活性的分子机制。这项研究为我们进一步理解CRISPR系统的进化历程，以及开发基于CRISPR免疫增效子的高效基因编辑工具奠定了基础。研究思路通过生物信息学分析，研究团队观察到一类新型关联基因（Novel-associated genes, NAGs），显著富集存在于较大蛋白体积的II-C型Cas9的基因簇中，并推测这些NAGs可能参与到Cas9介导的细菌免疫过程。图1. 结构生长轨迹分析方法（左）和II-C型Cas9的生长轨迹图（右）通过生化实验和冷冻电镜解析复合体结构表明，来自金黄色细菌属（Chryseobacterium sp.）的CbCas9生长出了一个全新的增强Cas9活性的β-REC2结构域，以及一个全新的能够与其关联基因PcrIIC1互作的CTH结构域。通过蛋白间相互作用，2个CbCas9蛋白和2个PcrIIC1蛋白能够形成异源四聚体复合物。图2. 冷冻电镜分析CbCas9和PcrIIC1结合的三个阶段蛋白质与核酸的分子互作实验表明，与单独的CbCas9相比，CbCas9-PcrIC1复合物表现出增强的DNA结合进而体现出切割活性，对原间隔区相邻基序序列的兼容性更广，对错配的耐受性更强，抗噬菌体免疫性增强。研究利用溶液中标记的分子互作方式获得亲和力，得出与单独的CbCas9相比，CbCas9-PcrIC1复合物表现出增强的DNA结合（图3a）进而体现出切割活性，对原间隔区相邻基序序列的兼容性更广，对错配的耐受性更强，抗噬菌体免疫性增强。图3. PcrIIC1增强CbCas9的DNA结合(a)、切割(b)、PAM兼容性(c)、DNA解旋 (d) 和错配容忍 (e) 能力最后，为了检验CRISPR免疫增效子PcrIIC1对CbCas9抗噬菌体免疫能力的影响，研究人员在大肠杆菌中进行了抗噬菌体实验。以上结果说明CbCas9-PcrIIC1复合体的形成对整个CRISPR-Cas系统的免疫增强至关重要。图4. PcrIIC1显著增强了CbCas9系统的细菌免疫活性FIDA如何更好复现Nature蛋白与核酸互作发文思路流体动力分散技术（FIDA）通过第一性物理原理直接获取分子的绝对流体动力学半径（Rh），通过追踪分子微妙的变化来表征生物分子的行为、特征以及功能。Fida Neo分子互作仪涵盖亲和力表征、亲和动力学表征、分子质量表征三大功能，一次实验即可获得互作与分子质控的数据，让互作的数据有“法”可依。FIDA技术无需固定、无需加热，甚至无需标记，可兼容所有缓冲液，是对现有分子互作技术是一次不一样的升级。FIDA技术可用于CbCas9-PcrIIC1复合物冷冻电镜前样品质控，CbCas9-PcrIC1复合物与DNA的亲和力实验以及动力学实验，以及CRISPR- cas以及核酸复合物的大小和定量表征等方面，具体如下:FIDA多维蛋白复合体表征，快速无稀释优化冷冻电镜样品，丰富您的蛋白质表征数据。FIDA所获得的Rh为绝对的粒径大小，可以直接与后期的电镜数据做比较。此外FIDA内置的 PDB 关联程序，可以将实际获得的 Rh 与数据库中的结构信息进行比较，有助于结构的精细解析。FIDA技术单次运行只需要40 nL 蛋白质在 4 分钟内获得的完整蛋白质 QC 图，包括冷冻电镜样品QC的关键参数表征，例如多分散性指数（PDI），聚集（Agg），粘度（Viscosity），粘附性（Stickiness），完整性（Rh）等指标，FIDA是一种非常有效的支持所有生物物理学和结构生物学的基本工具。图5. FIDA单次测试的得到8个蛋白表征数据冷冻电镜应用：FIDA：4分钟给您无稀释的冷冻电镜样品优化解决方案FIDA和本篇研究中应用的分子互作技术都是一种在溶液状态下通过荧光分子标记表征分子互作的技术。对于蛋白可能需要形成多聚体，在溶液环境下，更能有效的体现蛋白与蛋白或蛋白与核酸互作的真实情况。FIDA 可以使用含盐和洗涤剂的缓冲液条件，具有不同环境中（类体内环境）进行测试的灵活性。这使得研究者能够分析不受缓冲液成分限制的核苷酸，以确保其数据的准确性和可靠性。FIDA 这种在溶液内检测分子互作技术，是理想的结合能力检测，因为它不依赖于潜在的阻碍性表面固定，不受结合域空间方向影响的表征。图6. FIDA实验原理示意图FIDA不仅可以表征互作亲和力，也同时无标记检测CRISPR核酸酶与gDNA相互作用的热力学、亲和力、和结合动力学，全面表征蛋白与核酸互作。FIDA不仅可以完成本研究中得到的CbCas9-PcrIC1复合物表现出增强的DNA结合亲和力，还可在无标记下表征蛋白与核酸的热力学参数与结合动力学，甚至表征结合时蛋白构象变化与获得有关基因编辑过程的分子细节的定量表征。FIDA技术可以处理带负电荷分析物和带正电荷配体，使利用FIDA能够深入了解CRISPR- cas组分之间的结合相互作用，并以更高的准确性和效率表征和优化CRISPR系统。FIDA是一种序列无关的技术-不需要事先了解序列。FIDA的序列独立性质可对未知或未表征的基因组区域进行研究，同时简化工作流程。图7.(A) FIDA实验示意图。ReporterRNA用于识别RNP的大小和饱和点(上)，用其报告RNP结构作为竞争分析的起点(下) (B)正向结合(上)和反向滴定(下)期间获得的原始FIDA数据 本研究在分子层面直观的揭示了免疫增效子PcrIIC1的作用。首次发现了一类新型的CRISPR免疫增效子可以通过二聚化Cas9效应器提升Cas9活性，这些结果不仅有助于我们进一步理解CRISPR系统的进化历程，还为未来基于CRISPR免疫增效子的高效基因编辑工具的开发奠定了基础。FIDA对于蛋白质复合体的多维表征和对蛋白与核酸互作亲和力与动力学的的检测，不依赖于分子量变化，样本用量少（仅需40nL），是一种在溶液状态下且不受缓冲液成分影响的多维表征技术。对于在本研究中相似的蛋白可能需要形成多聚体，在溶液环境下，更能有效的体现互作的真实情况。

导语在实验过程中，最心累的莫过于好不容易提取的核酸却降解了。那么核酸为什么会发生降解呢，我们又该如何预防呢？关于核酸降解，你了解多少呢？让我们一起对核酸降解一探究竟吧。 什么是核酸 核酸是一种高分子化合物，核苷酸是构成核酸的基本单位。核酸水解后得到许多核苷酸，核苷酸是组成核酸的基本单位，即组成核酸分子的单体。一个核苷酸分子是由一分子含氮的碱基、一分子五碳糖和一分子磷酸组成的。根据五碳糖的不同可以将核苷酸分为脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。如果5-碳糖是核糖，则形成的聚合物是RNA；如果5-碳糖是脱氧核糖，则形成的聚合物是DNA。 核酸降解本质 核酸降解是DNA/RNA分子中的碱基和戊糖间的氮糖苷键，或磷酸二酯键在物理因素、化学因素和生物因素等作用下发生水解，使DNA/RNA链发生断裂。核苷磷酸化酶：能分解核苷生成含氨碱基和戊糖的磷酸酯酶。广泛存在于生物体内,催化的反应可逆。可在核苷水解酶作用下继续分解核苷成嘌呤碱、嘧啶碱和戊糖。核苷水解酶：主要存在于植物和微生物体内，只水解核糖核苷。 核酸降解原因 DNA降解的因素很多，主要分为物理因素，化学因素和生物因素。一、物理因素：温度，机械剪切力、核酸的反复冻融、高温煮沸及辐射等。二、化学因素：PH值，水解反应，氧化反应等。三、生物因素：酶解及微生物侵染等作用。一、物理因素的影响★ 温度：高温条件下，RNA不稳定，易加速磷酸二酯键的水解，使核酸降解；★ 机械剪切力：包括剧烈震荡、搅拌、细胞突然至于低渗溶液中，以及让溶液快速通过狭长的孔道；★ 核酸的反复冻融、高温煮沸及辐射等，均会导致核酸的降解。二、化学因素影响水解★ PH值：氢离子参与催化磷酸二酯键、糖苷键的水解，但糖苷键比磷酸二酯键更易被酸水解。过高或过低的PH值都易破坏复键。核酸(特别是RNA)在碱性溶液中十分容易降解；★ 氧化反应：会氧化碱基中的含氨杂环，使其变性，从而改变一级与二级的核酸构象；★ 苯酚在空气中被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA的分离，会使磷酸酯键断裂，造成DNA的降解。三、生物因素影响★ 酶解：核酸酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构，使其降解。1.核酸酶(磷酸二酯酶)核酸内切酶：在环境或生物体内具有识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶统称为限制性核酸内切酶。作用方式从多聚核苷酸链中间开始，在某一个位点切断磷酸二酯键。如DNase，RNase等。核酸外切酶：核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端(3' -端或5' -端)开始，逐个水解切除核苷酸。如蛇毒磷酸二酯酶，牛脾磷酸二酯酶等。2.核苷酸酶(磷酸单酯酶)专一性的磷酸单酯酶：3' -核苷酸酶，5' -核苷酸酶非专一性磷酸单酯酶。★ 微生物侵染：微生物会将DNA作为营养物质或是其分泌的化学物质含酶。 预防降解的方法 预防RNA降解的方法:★ 去除环境中RNase酶的污染或强有力地抑制其活性。★ 获取样品后最好立即提取RNA，若无条件立即实验，应于-80℃液氮中保存样品，提取时取出样品后立即在低温下研磨裂解细胞，以防RNA降解。★ 在总RNA提取分离的最初阶段，联合使用Rnase的特异抑制剂，尽可能的灭活胞内的Rnase的活性。★ 避免样品的反复冻融。★ 保证裂解液的质量，裂解液的用量不足，也会导致RNA降解。★ RNA提取后，放入-80℃保存，防止降解。预防DNA降解的方法:★ 简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏；★ 减少化学物质对DNA的降解，为避免过酸、过碱对DNA双链中磷酸二酯键的破坏；★ 防止基因组DNA的生物降解，主要是DNase降解基因组DNA，Dnase需要二价金属阳离子Mg2+等的激活，可用EDTA等金属离子整合剂整合Mg2+以抑制Dnase的活性；★ 减少物理因素对DNA的降解，物理降解因素主要包括机械剪切力(如剧烈震荡、搅拌等)；★ 避免样品的反复冻融，可将DNA分装保存于缓存液中；★ 所有试剂应用无菌水配制，耗材经高温灭菌；★ 避免DNA的过高温处理等。

又到周五啦！四小名助如约而至，给大家带来色谱耗材相关的实用技术小贴士。内容涉及色谱柱及前处理产品选择、使用、维护保养等内容。实用干货，不容错过！FAST mRNA快速核酸药物表征核酸药物不但将药物治疗拓展到了蛋白质之前的基因层面，mRNA 疫苗体液免疫与T 细胞免疫的双重免疫机制，提高了免疫活性。同时放大制备更容易。这些优势使得核酸药物成为继小分子药物，蛋白药物，抗体药物后的新一代创新药物。2018 年后Patisiran 药物的递送技术解决了小核酸药物面临的给药效果差，脱靶造成副作用的难题，更是迎来了核酸药物研发的新高潮。新guan疫情中核酸疫苗的成功更是拓宽了核酸药物的应用潜力。新赛道上如何快速表征核酸药物，话不多说，直接上干货。选对耗材是关键核苷/寡核苷酸分析和制备色谱柱的选择（点击查看大图）核酸分析色谱柱的选择（点击查看大图）滑动查看更多寡核酸药物分析全助攻寡核苷酸药物中，根据作用机理可以分为反义核苷酸，小干扰RNA,微小RNA,小激活RNA,信使RNA,适配体等，这些药物由于容易被核酸酶降解，延长半衰期的考虑，会做一些修饰，如硫代PEG修饰等等。在固相合成过程中也会有些杂质需要监控，针对这些需求，相应的方法开发和方案展示如下：01DNAPac RP分析寡核苷酸药物关键杂质滑动查看更多（点击查看大图）02DNAPac PA系列阴离子交换柱分析寡核苷酸药物关键杂质滑动查看更多（点击查看大图）核酸药物分析全助攻核酸药物特别是mRNA在新guan疫情大流行期间，同样发挥了巨大的作用，在核酸成产过程中，质粒纯度测定， mRNA序列测定，mRNA帽子结构确定，mRNA的PolyA测定，mRNA的降解产物的研究等等这些需求，对于分析技术提出了更高要求，专用DNAPac系列反相色谱柱和离子交换色谱柱可以满足这些检测需求。01mRNA原液检测攻略滑动查看更多（点击查看大图）核酸药物载体的表征核酸药物的成功，离不开药物递送技术的突破，不同基质，不同官能团的色谱柱在纳米脂质体组成的测定，腺相关病毒组成以及聚乙酰亚胺残留的检测中各显神通，点击下面详图获得。01纳米脂质体的表征滑动查看更多（点击查看大图）02腺相关病毒载体的表征滑动查看更多（点击查看大图）工艺监控在寡核苷酸和核酸生产工艺中，会用到一些有机溶剂等其他原料，这些原料如何检测，点击下图查看：滑动查看更多（点击查看大图）一键获得★ 这么多应用是不是有些眼花缭乱了呢，贴心的核酸项目分析选择手卡，扫描以下二维码，即可一键获得如需合作转载本文，请文末留言。这样的应用图书馆不来了解一下？点击进入小程序完成注册即刻抽取盲盒好礼

仪器信息网讯 2016年6月4日，第二届新材料、新器件与生物检测协同创新论坛暨2016年中国生物检测监测产业技术创新战略联盟产业创新论坛，2016年北京市科技新星大师讲堂与协同创新论坛在北京顺利召开。为贯彻“将科研主体与产业主体有效衔接，促进科技成果转化”的初衷，本届论坛一方面设置了“科技讲堂”、“产业对话”、“科技创新”等环节，促进学界内部传承、交流、合作，推动学界与产业界互动、衔接 另一方面，举办了《生物检测监测联盟指向性课题》启动仪式，进一步践行论坛与联盟推动科技成果转化的初衷。会议现场　　论坛开幕式由中国生物检测监测联盟秘书长周蕾主持，中国生物检测监测产业技术创新战略联盟张学记理事长、北京市科委人事教育处黄峥女士、新星代表郭维博士、山西圣点世纪科技有限公司丁晟总经理分别致辞，预祝大会圆满成功。　　张学记理事长在致辞中提出本论坛的目的有二：一是为广大研究人员提供交流平台，二是为高校、研究机构与企业搭建对接的桥梁。随着科技三会的结束，国家会正式颁布一系列的文件，减少对科研人员条条框框的约束，加大对科技成果产业化的支持，我国将迎来科技创新的春天，希望与会人员以应用为导向，研究出更多满足现实需求的成果。黄峥女士对“北京市科技新星计划”做了简单介绍，认为此论坛是一个很好的平台，希望资深专家能提携帮助青年专家的成长。启动仪式　　开幕式后，还举办了中国生物检测监测产业技术创新战略联盟《2016年生物检测监测联盟指向性课题》启动仪式，这是国内联盟中首次利用自有经费支持企业的科技需求，设置指向性课题，促进科技成果转化。“动物疫病诊断产品研发”课题的委托方为北京勤邦生物技术有限公司，承担方为合肥工业大学陈伟 “一氧化氮健康品国内标准的制定”课题的委托方为上海诺鼎生物科技有限公司，承担方为北京科技大学苏磊。张学记理事长和黄峥女士为双方分别授牌。　　北京科技大学张学记教授　　题目：从新界面新材料上的核酸传感到新器件中的定量细胞生物学　　张学记教授从界面生物学检测、荧光化学传感、核酸生物传感、微流控芯片器件在精准医学中的应用等四方面介绍了其团队在生物检测方面的研究成果。其团队利用超浸润界面的富集效应实现了对痕量DNA的检测，检测限达到1.99fM 结合石墨烯氧化物的荧光猝灭与等温链替代聚合酶反应，开发了一种简便、高灵敏度、高选择性且可以实现多组分miRNA同时检测的新方法 研发的微流控芯片在细胞图案化芯片打开后，没有细胞损失，可后续挑选用于基因表达分析。　　中国科学院半导体研究所周晓光研究员　　题目：生物(蛋白)组学技术的发展与精准医疗　　很多时候，科学的发展是因为分析技术的进步，测序技术的发展实现了高通量的基因分析，从而发展了基因组学，质谱技术的发展实现了高通量的蛋白分析，从而发展了蛋白组学。虽然基因组学被认为是精准医疗的基础，但是中国基因组学奠基人之一于军研究员认为“单一基因测序结果很难明确诊断癌症，所以基因诊断本身很难成为临床上的一个金标准”。与基因分子相比，蛋白质更能直接反应生命体的状态，故周晓光研究员认为精准医疗信息来源不能只靠基因信息，蛋白组信息的获取同样重要，应是临床医学检测技术的另一爆发点。周晓光研究员介绍了蛋白质组检测的挑战以及相应质谱技术的发展情况。　　中国生物检测监测产业技术创新战略联盟周蕾秘书长题目：新技术发布—第三代POCT：电驱控速免疫层析技术 第四代POCT：电阻抗自动免疫检测系统　　周蕾秘书长首先对POCT的市场进行了分析，并介绍了其团队针对目前第三代和第四代POCT技术的不足而进行技术开发的思路。第三代POCT技术要求精确定量检测，即精度更高，速度更快，以目前常用的上转发光免疫层析技术为基础，为解决400纳米UCP颗粒空间位阻大从而影响敏感性的问题而采用了小于100纳米的UCP颗粒，为解决微孔材料毛细虹吸动力小影响检测速度的问题而利用电场改变液体浸润效果，最终开发出纳米上转发光电致免疫层析技术即电控驱速免疫层析技术。第四代POCT技术要求自动定量检测，周秘书长的团队采用了将中心实验室大型全自动仪器便携化的研发思路。以全自动化学发光免疫分析仪为基础，磁颗粒免疫捕获技术继续保留，光学检测技术采用电化学检测技术代替，多人分试剂包采用微流控芯片技术代替，从而开发出电阻抗自动免疫检测系统。　　南开大学尹学博教授　　题目：碳点的新颖合成方法、发光机理及传感成像应用　　尹学博教授介绍了其团队发展的碳点制备新方法，提出了碳点形成机理，研究了碳点的结构与发光性质的关系，实现了从细胞到胚胎、斑马鱼再到小鼠的碳点成像。　　华东理工大学应轶伦博士　　题目：单分子弱相互作用的纳米通道研究及仪器研制　　应轶伦博士介绍了其在纳米通道单分子检测技术的研究成果，通过开发纳米通道超微电流检测仪器和开发纳米通道数据分析方法，从而实现了纳米通道高灵敏分析。　　北京科技大学董海峰教授　　题目：基于DNA四面体纳米结构及双链特异性内切酶的灵敏、多元的microRNA检测　　董海峰教授将三维的DNA四面体探针与双链特异性核酸酶结合起来构建了一个超灵敏的、多元的光学传感器，在同一溶液中同时检测三种不同的microRNA，并使其检测限达到了aM级别，双链特异性核酸酶使其具有较好的特异性识别能力，使其能够灵敏的辨别三碱基错配以及单碱基错配，此方法能在癌症细胞培养液和裂解液中检测miRNA，表明此方法在生物医学研究和临床分析中具有应用前景。　　北京大学郭少军研究员　　题目：新型异质结构纳米晶分析传感技术　　郭少军研究员的研究方向为新能源材料、催化和传感器件，核心思路为“新材料设计决定性质和应用”。主要研究内容是纳米晶尺寸、形状、成分和结构的精确调控，纳米晶功能的合理调控及实现新的功能，核心是增强燃料电池、锂离子电池、催化剂、传感器和光电器件的应用。此次报告主要介绍了其在纳米晶传感器方面的研究成果。北京大学赵美萍教授题目：活体动物脑区神经活性物质的在线连续监测　　赵美萍教授介绍了采用微流控技术对活体小鼠脑部硫化氢含量的在线连续测量技术，认为小鼠脑部硫化氢浓度范围在30-40μ M。最后还介绍了活体细胞中APE1的荧光成像技术。清华大学李海芳副教授题目：肿瘤标志物的化学发光免疫分析　　李海芳副教授的团队以酶催化化学发光为技术核心，开发了化学发光免疫分析新方法和新技术，研发了肿瘤标记物诊断试剂盒。在此研究中，改进了酶标记技术和酶催化化学发光体系，发展了微孔板磁颗粒化学发光免疫分析技术，建立了系列肿瘤标记物的CLEIA分析方法，并研制出系列试剂盒产品，证明了纳米免疫磁颗粒结合CLEIA在CTC细胞捕获和化学发光计数方面具有可行性。武汉大学林毅副教授题目：基于荧光量子点的体外检测新方法　　林毅副教授主要介绍了半导体荧光量子点制备的新方法和基于荧光量子点的体外检测新方法，认为荧光量子点技术可实现高灵敏、快速的体外检测。同济大学万錒俊教授题目：新型NO供体的制备、NO控释和原位监测　　万锕俊教授从新型NO供体的制备、NO的控释和镉类荧光量子点NO原位监测和近红外型荧光体系的NO原位监测三方面介绍了其团队在NO方面的研究成果。南京大学丁霖副教授题目：细胞功能分子的原位分析与质谱成像　　丁霖副教授从细胞表面糖基原位检测、细胞内功能分析的原位检测、癌症在体靶向治疗与疗效监测和质谱成像分析技术四方面介绍了细胞功能分析的原位分析与质谱成像技术。华东理工大学左鹏副教授题目：纳米生物传感分析系统及在健康领域的应用　　左鹏教授从纳米增强信号放大系统构建及应用、酶催化信号放大方法的构建及应用、纳米功能化微流控系统构建及应用三方面介绍了其团队在纳米生物传感分析系统的研究成果。　　除此之外，北京勤邦生物技术有限公司万宇平总经理以“勤邦生物食品安全快检市场需求分析”为题，深圳三相生物传感器科技有限公司周文强CEO以“便携式电化学传感器技术在幽门螺杆菌监测上的应用”为题介绍了公司的研发需求。参会人员合影

近日，青岛科技大学海洋学院马翠萍教授团队在病原体RNA快速检测、提高核酸检测特异性领域取得新进展。相关成果以“Engineering of a chimeric template triggers RNase H-based isothermal amplification approach for sensitive detection of pathogen RNA”和“Boron nitridenanoplate-based improvement of the specificity and sensitivity in loop-mediated isothermal amplification for Vibrio parahaemolyticus detection”为题目分别发表在国际知名期刊《AnalyticalChemistry》（中科院一区Top）（doi.org/10.1021/acs.analchem.3c04098）和《Analytica Chimica Acta》（中科院一区Top）（doi.org/10.1016/j.aca.2023.341851）上。 论文第一作者分别为海洋学院第五层次引进人才李勇副教授和研究生张鑫，以及研究生蔺硕，两项成果通讯作者均为马翠萍教授，青岛科技大学为第一单位和唯一通讯单位。病原体的准确检测对于临床诊断和生物医学研究具有重大的意义，基于DNA检测聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR）技术作为病原体检测的金标准，具有高灵敏、高特异性的优点，但存在无法区分病原体生存状态的问题；相比之下，RNA具有半衰期短、丰度高的特点，基于RNA的检测可以选择性地检出具有转录活性的病原体。针对病原菌的高灵敏、快速检测问题，马翠萍教授团队构建出一种新型等温RNA检测技术，该技术基于DNA/RNA嵌合探针触发指数扩增反应，检测结果可以通过便携式紫外灯即可进行判读，且无需精密的温度控制装置（图1）。另外，该技术可以实现靶标RNA区域的短期保护，即使在RNA酶存在的条件下，该技术至少可以保证36小时内RNA不会发生降解，避免了由于靶标降解造成的假阴性问题。该平台对于大肠杆菌RNA的检测限为1fg/μL,对于牛奶中大肠杆菌的检测限为1.0×102CFU/mL，检测过程40分钟之内即可完成，不依赖于复杂的检测设备，有望成为临床诊断和食品安全检测领域强有力的RNA检测工具。图1 基于RNaseH的等温指数扩增方法示意图此外，以DNA扩增为基础的核酸检测已广泛用于分子诊断、食品安全监测和传染病预防。然而，引物二聚体的形成、发夹结构和错配杂交导致的非特异性扩增严重限制核酸检测技术的实际应用。因此，迫切需要探索一种提高核酸检测的特异性和灵敏度的方法。马翠萍教授团队证明了纳米材料氮化硼纳米片（Boron Nitride Nanoplate, BNNP)，由于其独特的表面性质，可以与扩增反应的主要组分，如单链引物和BstDNA聚合酶相互作用，并提高溶液的导热性，BNNP的存在显著提高了PCR和环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal Amplification, LAMP）的特异性（图2）。此外，BNNP还提高了LAMP的灵敏度，并且基于BNNP的LAMP的检出限比传统LAMP低两个数量级，同时此方法被证实可用于海产品中副溶血性弧菌的检测。这是首次系统地证明BNNP可以提高PCR和LAMP扩增反应的效率和准确度，从而极大地扩展了核酸检测在实验室和现场环境中的应用。图2 BNNP提高核酸扩增方法特异性和灵敏度的原理图

10月25日，中国分析测试协会发布《乙酰胆碱酯酶 活性检测 分光光度法》CAIA标准，于12月1日实施。据悉，此标准由中国分析测试协会标准化委员会和中国材料与试验团体标准委员会科学试验领域委员会提出；由中国分析测试协会标准化委员会和中国材料与试验团体标准委员会科学试验领委员会科学试验创新方法技术委员会归口；由北京市科学技术研究院分析测试研究所、吉林大学、广东省科学院测试分析研究所、长春吉大小天鹅仪器有限公司、盘锦检验检测中心、广州市食品检验所六家单位为起草单位。文件规定了用分光光度法测定乙酰胆碱酯酶活性的方法，适用于有机磷与氨基甲酸酯类农药残留检测专用试剂中乙酰胆碱酯酶活性的测定。 具体内容详见附件：《乙酰胆碱酯酶 活性检测 分光光度法》.pdf更多内容：《中国分析测试协会标准》团体标准合集

国家标准计划《葡萄糖氧化酶活性检测方法》由 SWG11（全国工具酶标准化工作组）归口 ，主管部门为国家标准化管理委员会。 拟实施日期：发布即实施。主要起草单位 福建南生科技有限公司 、夏禾（杭州）生物技术有限公司 、夏禾（深圳）生物技术有限公司 、宁夏夏盛实业集团有限公司 、厦门银祥集团有限公司 、深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 、武汉新华扬生物股份有限公司 、廊坊诺道中科医学检验实验室有限公司 、天津博菲德科技有限公司 、广州市进德生物科技有限公司 、山西大禹生物工程股份有限公司 、河北省微生物研究所有限公司 、武汉瀚海新酶生物科技有限公司 、深圳市海拓华擎生物科技有限公司 。主要起草人 黄发灿 、郑登忠 、郑恬烨 、沈涛 、张志刚 。附件：国家标准《葡萄糖氧化酶活性检测方法》征求意见稿.pdf国家标准《葡萄糖氧化酶活性检测方法》编制说明.pdf

新一轮疫情悄然来袭，甘肃、宁夏等十余省份纷纷发生疫情，各地进入备战状态，准备迎接大规模核酸检测。面对短时间内的大规模核酸检测，其关键性卡脖子的问题在于效率，整个流程最耗费人工的部分就是采样管的开关盖和加液部分，如果还是用人工的方式操作，上万名检测人员三班倒也很难完成高通量的检测需求，还非常容易造成实验室感染等问题。 试想一下，穿上防护服，坐在生物安全柜前，连续拧开上千个盖子，戳上数千个枪头吸取上千个标本，然后再打掉上千个枪头，拧上上千个盖子… … 高危的检测实验、重复的手指动作、焖燥的作业环境、长时的体能消耗，双手也在重复动作下磨得生疼。 疫情期间医护人员的最美“战役妆”，但我们更希望检验人员的身体得到保护。采购自动化设备，可以减少人力成本，降低检验人员工作强度，同时可降低错加、漏加和感染风险。为了解决现阶段核酸检测步骤提取环节的多处难题，提升核酸实验室的自动化程度，睿科Vitae Lids分杯工作站应市而来。 Vitae Lids全自动分杯工作站是一款分子诊断样本前处理设备，可一键完成核酸检测中样本开盖、转移、关盖等操作。适用于新冠病毒检测、临床检测、法医检测和生命科学研究等领域。 1、高通量：标准配置一次完成48个原始样品的移液，更换样品架后可完成96个样品处理。2、高效性：双通道移液头，同时操作两个样本，平均18秒/样本，48个样本全程仅需15分钟。3、灵活性 ： 双通道移液头间距可调，适用于从样本管到96孔 板的样本有序转移； 抓手设计灵活可调，适应不同口径采样管； 样本管架高度可调，适应不同高度采样管； 蛋白酶 K/内参添加，有效移液范围10-1000μL；4、溯源性 ：软件可扩展扫码记录功能，实现样本溯源性。5、安全性 ：具备液滴捕获、气密防滴落设计，可配置生物防污染外罩或者直接放置到生物安全柜中使用，有效防控污染。

自PCR技术诞生以来已经有三十年了。从经典PCR、实时定量PCR再到现在的数字PCR，这一技术在不断蜕变却从未淡出我们的视野。 　　重组酶聚合酶扩增RPA(Recombinase Polymerase Amplification)，被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。英国公司TwistDx Inc以此为基础开发的TwistAmp® 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。 　　RPA技术犀利在何处 　　常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。RPA反应的最适温度在37° C-42° C之间，无需变性，在常温下即可进行。这无疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。 　　据介绍，RPA检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸(尤其是DNA)模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约1012扩增产物。而且RPA还用不着复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。 　　RPA既可以扩增DNA也可以扩增RNA，还省去了额外的cDNA合成步骤。你不仅可以对扩增产物进行终点检测，还可以对扩增过程进行实时监控，甚至可以通过试纸条(侧流层析试纸条LFD)读取结果。 　　目前，TwistAmp® 试剂盒的扩增子长度在500bp以内。不过，经过特别优化的RPA扩增，也可以生成更长的扩增产物，或者减慢扩增速度(便于定量)，甚至在更低的温度下进行反应。(详见TwistDx Inc公司官网：www.twistdx.co.uk) 　　RPA技术的基本原理 　　RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37° C左右。 　　重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。 　　相当灵活的检测模式 　　RPA扩增的基础体系(TwistAmp® Basic)含有DNA扩增所需的所有试剂，我们只要准备好引物和模板就行。扩增结果可以通过凝胶电泳进行终点检测，产物纯化后可用于下游研究。 　　在这个基础体系中添入不同的酶和探针，就可以实现多样化的RPA应用。举例来说，在基础体系里添加逆转录酶(TwistAmp® Basic RT)，可以对RNA模板进行一步法扩增。 　　将RPA基础体系、专利的exo探针技术和核酸外切酶III结合起来(TwistAmp® exo)，能实现数据的实时读取，就像荧光定量PCR一样。不过反应终点的扩增子总量有所减少，适合获得强荧光信号进行动力学分析，不适合终点检测(比如跑胶)。在TwistAmp® exo的基础上加入逆转录酶(TwistAmp® exo RT)，就可以一步实现RNA模板的实时扩增。 　　RPA基础体系、fpg探针技术和核酶fpg相结合，形成了一个实时报告体系(TwistAmp® fpg)。这个体系的荧光累积比较慢，但终点的扩增子产量不会减少，因此也能支持终点分析。 　　RPA基础体系与核酶nfo的结合(TwistAmp® nfo)，能支持&ldquo 三明治法&rdquo 的终点检测，比如测流层析试纸条LFD。 　　除此之外，RPA扩增还可以很简单的实现多重化。只需要增加引物/探针就可以一次性检测多个扩增产物。　　不一般的引物设计 　　RPA分析的关键在于扩增引物和探针的设计。PCR引物多半是不适用的，因为RPA引物比一般PCR引物长，通常需要达到30-38个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。 　　在设计RPA引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。RPA的引物和探针设计不像传统PCR那样成熟，用户需要自己摸条件进行优化。虽然还没有设计软件可以使用，不过TwistDx Inc公司在自己的网站上提供了相应的筛选指南。 　　需要注意的是，目前的TwistAmp® 扩增试剂盒都没提供RNase抑制剂。另外，受目前的生产方法所限，RPA反应不适合用于E.coli标准实验室菌株的扩增。

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，能将微量的DNA大幅增加。整个PCR反应过程中有几种不可或缺的物质，酶就是其中一种。不同的酶有不同的试验特性，根据其特性又可以应用在不同的场景中。如何选择试验中最适合的酶是我们在试验之初值得思考的问题，下面小编就带大家一起了解一下PCR实验中几种常见的酶。Taq DNA聚合酶PCR试验之初使用的是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ，但由于每一个循环都需要补充新的酶，其操作步骤稍显复杂。1988年科学家们从水生栖热菌中分离得到了Taq DNA聚合酶，从此DNA的自动扩增变成现实。也是由于这个酶的发现使PCR成为了一项便利、实用、普遍的技术。Taq DNA聚合酶也成为了DNA试剂盒中最为常见的一种聚合酶。野生的Taq DNA聚合酶虽然已经具备良好的功能性以及广泛的应用范围，但由于分子诊断技术要求的精确性及各项要求越来越高，因此对其扩增能力、保真性、耐热性等方面进行优化。从而提高Taq DNA酶在分子诊断中的稳定性、灵敏度以及特异性。改造后的Taq DNA酶具有以下优势：1 良好的耐热性，最适催化浓度为75-80℃，95℃半小时后仍保留50%以上的活性。2 有5’-3’聚合活性，这一特性使Taq DNA酶对温度有较高的敏感性。3 有5’-3’外切酶活性，Taq DNA酶也是少数具有这一特性的DNA聚合酶之一。4 可以在PCR产物3’末端添加无模板核苷酸，这一特性可以使Taq DNA酶的PCR产物直接用于TA克隆。但它没有3’-5’的校正活性，可能在PCR反应中引起错配，这一缺点使其在PCR扩增中的忠实性大幅度降低。PfuDNA聚合酶为了避免因错配而出现的非特异性扩增，造成试验结果不准确，科学家们对Taq DNA聚合酶进行了修饰。而PfuDNA聚合酶正是利用了酶的修饰物在常温下抑制DNA聚合酶活性，加热至变性温度时修饰物失活，释放酶活，从而使PCR反应得以正常进行。它可以很好地弥补Taq DNA聚合酶的劣势，有效提高目标基因的扩增成功率，因此应用范围较广。目前市面上常用的PfuDNA聚合酶修饰方法主要有化学修饰法、配体修饰法和抗原抗体结合法，修饰原理不同其优劣势各有不同。1 化学修饰法利用化学小分子和DNA聚合酶活性中心结合封闭酶活，当温度为95℃的时候酶活性释放。优点：酶活性维持更加稳定且无任何外源DNA污染，性价比高。缺点：酶激活的时间较长，可能会影响酶的活性，导致PCR产物的产量降低。2 配体修饰法核酸适配体（一般指一类具有特异性识别功能的单链核酸分子，DNA或者RNA）通过非共价键作用与聚合酶结合封闭酶活。当温度高于60℃酶活性释放。优点：不需要激活步骤，稳定性高，减少了样本降解的可能性。缺点：由于核酸适配体是一种可逆抑制剂，较化学修饰法来说稳定性较低，特异性不够强。3 抗原抗体结合法是当前最常用的一种方法，利用DNA聚合酶抗体与聚合酶进行结合封闭酶活性，当温度到达变性温度时（95℃）开始释放酶活性，可以大大避免错配或引物二聚体引起的非特异性扩增。另一方面针对低丰度基因，封闭抗体在避免预变性前的DNA聚合酶和模板的非特异性结合的同时，增加了引物与微量的正确模板碰撞退火的效率，从而保证低丰度基因的有效检出，大大提升反应灵敏度和扩增效率。优点：酶激活时间短，保证酶活，亲和力强，灵敏度高。缺点：抗体生产成本高，试剂配比优化时间长。逆转录酶1970 年Temin发现了逆转录酶，该酶以RNA 为模板，以dNTP 为底物，根据碱基配对的原则，按5'-3'方向合成一条与RNA 模板互补的DNA 单链。逆转录酶具有依赖于DNA或RNA模板的DNA聚合酶活性，因此没有3’-5’外切酶活性。但其具有RNase H活性，在一定程度上限制了逆转录酶的合成长度。由于野生逆转录酶的保真性和热稳定性较低，因此科学家们对其进行了改造。常见的逆转录酶主要有HINV1 RT、AMV RT、M-MLV RT，但由于前两种酶的应用范围较窄，因此研究者们主要针对最后一种逆转录酶不断进行升级改造。升级后的第三代逆转录酶整体性能有了明显的提升，表现在有更高的cDNA产量、更广的温度范围以及可以适用于复杂结构RNA模板，提升了cDNA的合成长度。虽然第四代的性能更好，但由于其价格过高，实际应用并不广泛。第三代逆转酶主要有以下优势：1卓越的延伸能力2 灵敏的检测范围3 优良的耐热特性4 高效的扩增性能5 超高的合成速度Bst链置换DNA聚合酶1972年Stenesh和Roe首次从嗜热脂肪芽孢杆菌中分离了Bst链置换DNA聚合酶，与Taq DNA聚合酶有相似的结构域。经基因工程改造去除了DNA聚合酶Ⅰ的 5’-3’核酸外切酶活性，但保留了 5’-3’ DNA 聚合酶活性和强链置换活性。Bst链置换DNA聚合酶作为等温扩增的核心酶，其优势十分明显：1 微量、高产扩增2 高灵敏度、特异性RT-LAMP扩增3 快速反应，可以在一个小时的时间内完成整个试验其缺点为不具有5′→3′外切核酸酶活性，因此没有纠错功能。不同的酶由于优劣势各有不同因此其常见的应用场景也各有侧重。Taq DNA聚合酶的应用范围十分的广泛，可应用于常规PCR扩增、易错PCR扩增、位点特异性PCR、RT-PCR、qRT-PCR，同时也是探针法qPCR技术的指定聚合酶；使用热启动Taq酶是提升PCR特异性的常用方法，因此热启动Taq酶常用于qPCR反应中，除此之外，由于其较高的特异性和高灵敏度，也经常被用于构建DNA文库、DNA测序、突变体的分析构建、基因分离、遗传病诊断、法医鉴定等；逆转录酶可以为qPCR合成第一链cDNA，有构建cDNA文库、DNA测序、末端标记DNA等作用；Bst链置换DNA聚合酶适用于较低温度下（68℃）的DNA测序、防污染的等温扩增反应，如 LAMP 等。

上海伯杰医疗科技有限公司研发的恒温核酸扩增检测分析仪、新冠病毒核酸检测试剂盒（恒温CRISPR法）本周获国家药监局批准上市，成为国内最快的新冠核酸检测自动化设备。从拭子或痰液取样到出检测结果，这套设备只需30分钟，适用于医院发热门诊、出入境检验检疫等场所。 为何能成为国内最快？伯杰医疗创始人赵百慧博士说，公司采用的恒温CRISPR法与传统的核酸检测技术不同，不需要几十次升降温，所以大幅缩短了核酸扩增环节的时间。CRISPR是一种基因编辑技术工具，具有广阔的应用前景，在核酸检测中也可以应用。将核酸靶标加入CRISPR/Cas反应体系，活性蛋白Cas的剪切活性会被激活，从而剪切反应体系中带有荧光基团的引物探针，如果样本呈阳性，就会因Cas蛋白剪切发出荧光。 这款仪器的核酸扩增环节为何能保持42摄氏度恒温？公司研发部经理李春燕解释，传统的核酸检测仪器需要通过升温将DNA（脱氧核糖核酸）的双链打开，再通过降温进行核酸扩增。伯杰医疗则采用重组酶聚合酶扩增技术，重组酶能参与基因定位重组过程，识别、切割特异的重组位点，从而在恒温条件下打开DNA双链。据介绍，升降温核酸扩增需要1.5小时左右，而恒温核酸扩增只需20分钟，实现了核酸检测的大幅提速。　　自动化也是这款仪器的一大特点。工作人员收到样本后，只需做一步人工操作——将样本管放入仪器，仅耗时1分钟。接下来的核酸提取、核酸扩增等环节都由机器自动完成，直至出具检测结果。 据了解，核酸检测可分为常规检测和快速检测。常规检测技术成熟，单次检测量大，但用时较长。快检产品用时短，手段更便捷，但是单次检测量较小，适用于小批量的随到随检场景。去年5月，国务院要求加快提高核酸检测能力，推进检测时间短、手段更便捷、无需实验室环境的核酸快速检测设备研发工作。　　在市科委支持下，伯杰医疗研发的快检产品入选了国家重点研发计划应急项目，还获得上海张江国家自主创新示范区专项发展资金重大项目支持。经过一年多自主研发，这款刷新“全国纪录”的快检设备和配套试剂盒终于获批上市，可同时检测24份样本。　　它们将应用于医院门急诊，实现院内病人快速检测，不必转运样本，让病人耗费半天时间等待检测结果。它们还有望应用于出入境检验检疫、疾控中心筛查、政府部门市场巡查等场景，使核酸检测更快、更便捷。

仪器信息网讯 9月27日-29日，两年一度的北京分析测试学术报告会暨展览会（BCEIA 2021）在北京中国国际展览中心盛大召开。乱花渐欲迷人眼，国内外七百余家分析测试领域仪器研发制造企业携新品、拳头产品竞相亮相。在众多科学仪器新品中，一家专注智能自动化技术应用与解决方案的高科技公司格外吸睛——镁伽。成立于2016年的镁伽颇受资本市场青睐，目前已经完成七轮超10亿人民币的大额融资。在BCEIA 2021展会现场，镁伽携样本前处理系统、超高通量全自动核酸检测系统等多款核酸检测产品首次公开亮相，仪器信息网小编来到镁伽公司展位，向该公司高级产品经理武文婷女士详细了解了这几款参展产品。仪器信息网编辑展位采访镁伽高级产品经理武文婷女士镁伽超高通量全自动病毒核酸检测系统首次公开亮相今年8月，镁伽推出最新自主研发的MegaMicro超高通量全自动病毒核酸检测系统（MRA-CDF-800），本次展会也是这款超通量系统首次公开亮相。据了解，镁伽超高通量全自动病毒核酸检测系统日单管检测通量可高达11,000份，同时支持5混1、10混1等混样检测，人效提升可高达40倍，名副其实超高通量！该系统能实现从核酸样本开盖分杯，核酸提取，PCR体系构建，再到封膜和qPCR检测的全流程自动化，是国内同类产品中唯一连入了分杯模块并能够真正实现超高通量的“样本进-结果出”全自动病毒核酸检测系统。了解核酸检测的同行应该知道，核酸检测的“交叉污染”问题是一大风险。镁伽这款系统内置HEPA过滤系统和紫外消毒系统，并配有传递窗，能够实施严格的PCR分区，保证生物安全的同时也符合相关法律法规的要求，能够在大规模检测时最大程度避免核酸假阳性和假阴性情况，也能更好的保证一线医务检测人员的个体安全。样品前处理机器手臂备受瞩目在核酸样品检测全流程，咽拭子样本处理是第一步，也是最危险的一步。镁伽自主研发的样品前处理系统（MRA-CDS-600）作为超高通量全自动病毒核酸检测系统（MRA-CDF-800）的重要组成部分，能够自动处理最前端的分杯步骤，其主要工作是将采集样品后的咽拭子管开盖打开，用安全的机器操作代替人工操作，最大程度保护医护人员，避免医护人员感染和暴露。该系统为去年疫情肆虐时镁伽为核酸检测应用需求专项研发的解决方案，日处理量超过12万人次，通量对比人工提升20倍以上，能够极大助力“时间紧、任务重”的核酸检测工作。核酸检测技术是一项非常灵敏的分子诊断技术，镁伽公司的高级产品经理武文婷表示，尽管镁伽研发的产品最初定位为新冠病毒核酸检测，尤其是在大规模“万人检测”方面这款超高通量全自动病毒核酸检测系统具有绝对优势。但MRA-CDF-800系统不仅可以应用到新冠病毒疫情防控，还可以应用到其他核酸检测项目，其在众多生命科学和医学应用领域具有广阔的拓展空间。不只是单品类仪器设备，镁伽还能够提供新冠病毒核酸检测全流程仪器、试剂、耗材等技术全流程整体解决方案。小编观后有感：自动化、一体化是科学仪器一大发展趋势，此外在医学应用领域，检测仪器的安全性和高通量更加关键。镁伽将机器人研发思维与医学仪器研发理念深度融合，开发出国内首款连入了分杯模块并能够真正实现超高通量的“样本进-结果出”全自动病毒核酸检测系统，这也意味着国产仪器突破了生命科学实验室自动化领域受国外垄断的“卡脖子”困境。在新冠疫情零星爆发，新冠病毒变异升级，防控难度加大的情形下，这款全自动超高通量核酸检测系统能够协助疫情防控开展大规模核酸检测，在保障基层医护人员安全的基础上，让核酸检测更高效、便捷。

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DNA甲基化是哺乳动物基因组中最常见的表观遗传事件之一，即DNA中核苷酸与甲基基团的共价修饰[2]。DNA甲基化与人的生命进程有着密不可分的关系。细胞的增殖与分化、染色体完整性的维护或者X染色体的活性等等都离不开DNA甲基化的控制，DNA甲基化流程在胚胎发育中是无处不在的[1]。如果DNA甲基化进程出现异常，会导致生物体出现各种各样的疾病以及身体的生长缺陷或生理紊乱。DNA与蛋白质之间的相互作用如果出现异常，会影响基因的表达，从而引起人体内肿瘤的发生或者肿瘤的转移，这一切的源头都是DNA甲基化进程出现异常的结果[3]。DNA甲基化酶是肿瘤治疗靶点DNA甲基化酶是一种修饰酶，经常与限制性内切酶一同出现。在真核生物基因组以及原核生物基因组中，普遍存在DNA甲基化酶维持以及催化DNA甲基化过程的现象。DNA甲基化酶被广泛认为是一种治疗靶点以及预测生物甲基化过程的标志物，在单细胞水平上准确灵敏地检测DNA甲基化酶对于肿瘤医学上的临床诊断以及临床治疗甚至是生物学研究有着至关重要的作用。根据甲基化的核苷酸和位置被分为三组，即腺嘌呤的甲基化、胞嘧啶的4-N甲基化和胞嘧啶的5-C甲基化。所有已知的DNA甲基化酶在其甲基化过程中以s-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体。最常见的DNA甲基化不仅发生在胞嘧啶嘧啶环5-C位置的CpG位点上，还发生在对称四核苷酸5’-G-A-T-C-3’ 中腺嘌呤环的6-N位置[4,5]。传统DNA甲基化酶检测方法有局限 DNA甲基化酶活性的高灵敏度检测在基因调控、表观遗传修饰、临床诊断和治疗等方面具有重要意义。传统用于检测DNA甲基化酶活性的方法包括高效液相色谱法(HPLC)[6], 聚合酶链反应(PCR)[7]，凝胶电泳[8]，高效毛细管电泳(HPCE)[9]，以及使用同位素标记的s-腺苷甲硫氨酸甲基化检测[10,11]。尽管这些技术在实验室实践中被证明是有用的，但它们具有局限性。例如，大多数技术不仅使用笨重昂贵的设备，而且需要复杂的样品制备和数据分析所需的大量时间。同位素标记等技术是有效的，但它们往往需要费力的样品制备、同位素标记、复杂的设备和大量的DNA，使得它们不适合在医护点使用。所以，DNA甲基化酶活性检测迫切需要简单、便携、高灵敏度和低成本的检测方法。在最近的技术进步中，许多替代的DNA甲基化酶活性测定方法，如放射法、比色法、荧光法、电化学法等已被提出。此外，其中许多与纳米材料或酶结合，以显著提高它们的敏感性。放射法、蛋白质纳米孔等新型检测技术兴起 放射法：同位素标记作为最早检测DNA甲基化酶活性的方法之一，早期广泛应用于检测DNA甲基化酶和DNA甲基化的活性[12,13]。在由DNA甲基化酶催化的甲基化过程中，同位素标记的甲基部分转移到DNA上，从而赋予甲基化的DNA放射性。这种放射性可以很方便地用闪烁计数器或放射自显像仪来检测。可惜的是，放射性试剂的介入是限制这种试验在中央实验室进行的最大缺点。对无辐射DNA甲基化酶活性检测的研究导致了甲基化特异性PCR[14]、HPCE[9]和HPLC等替代品的发展[7,14]，而甲基化特异性PCR被认为是较好的方法。尽管非放射性，上述DNA甲基化酶活性检测需要庞大且通常昂贵的设备，冗长且耗时的样品制备和数据分析，以及繁琐的检测方案，这在临床实践中也比较难以实现全覆盖。比色法：比色法用于DNA甲基化酶活性检测依赖于颜色变化的目视观察或与DNA甲基化酶相关的吸收光谱的光谱测量。它们具有成本低、简单、可移植性和在某些情况下无需仪器的优点。虽然紫外-可见光谱法可以量化DNA，但甲基化和未甲基化DNA在紫外-可见吸收特性上的低灵敏度和不显著差异基本否定了紫外-可见光谱法直接检测DNA甲基化酶活性[15~17]。金纳米粒子：金纳米粒子(AuNPs)由于其表面的等离子体共振吸收的高消光系数且强依赖于粒子间距离，在DNA甲基化酶活性检测的比色法研究中引起了广泛关注。如图1 所示，金纳米粒子表面包覆有双链DNA (ds-DNA)，其中一条链包含DNA甲基化酶识别序列和5’-硫醇末端。在DNA甲基化酶存在的情况下，如图1 B 所示，DNA甲基化酶被共价标记在ds-DNA中碱基环的6-C位置，因为在5-N位置缺乏一个质子阻止了β-消除，甲基化的DNA不能被核酸外切酶 ExoⅠ剪切，因此金纳米粒子仍然均匀地分散在溶液中 [18]。从而实现DNA甲基化酶活性的检测。结果表明，在526 nm处，金纳米粒子聚集物的吸光度与DNA甲基化酶的活性呈2 ~ 32 U / mL的线性关系，检出限为0.5 U/ mL。图1. (A)基于ABP的比色生物传感器的示意图(B) DNA甲基化酶的检测机制 荧光法：荧光指吸收激发荧光团的光，以促进电子从基态到激发态，电子迅速地回到激发态的最低能级，然后当电子最终返回基态时，发出波长较长的光。与其他DNA甲基化酶活性测定法相比，荧光法检测DNA甲基化酶活性的优点是检测过程简单，灵敏度高，但其复杂的光学性能限制了其在集中实验室的应用[19~20]。图2. 基于外切酶的靶循环的DNA甲基化酶活性检测原理图电化学法：电化学生物分析技术的发展一直是现代分析化学研究的热点之一。电化学法用于DNA甲基化酶分析包括测量电流、电压、电荷和电阻等电量，以反映DNA甲基化酶的活性。与许多其他类型的DNA甲基化酶活性的检测相比，它们具有低成本、高灵敏度、执行现场监测的能力以及非常适合微型化和集成微制造技术的优点[22~23]。Zhi-Qiang Gao等人在2014年报道了一种简单、高灵敏度的DNA甲基化酶电化学活性测定方法。该方法采用电催化氧化抗坏血酸(AA)的信号放大手段，通过一个螺纹插层N,N -2(3-丙基咪唑)-1,4,5,8-萘二酰亚胺(PIND)电催化氧化还原Os(bpy)2Cl+ (PIND-Os)，包含5’-CCGG-3’ 对称序列的ds-DNA首先固定在金电极上。然后用DNA甲基化酶孵育电极，经过酶催化特定CpG二核苷酸的甲基化，然后用识别5’-CCGG-3’ 序列的限制性内切酶 Hpa II 剪切酶处理电极，从而实现DNA甲基化酶活性检测的目的[24]。图3. DNA甲基化酶活性的检测原理示意图蛋白质纳米孔：蛋白质纳米孔检测技术是在单分子水平上以低成本、无标签和高通量的方式研究生物分子的检测技术。近年来，纳米孔技术正从生物传感的角度进行研究[25]。应用于核酸特征鉴定、化学反应过程的测量、蛋白质分析、疾病相关蛋白状态的检测以及酶动力学的研究等[26]。α-溶血7素是一种蛋白质纳米孔，它自发地插入到脂质双层膜中，形成一个纳米孔[27]。当一个带电分子在外加电势下通过蛋白质纳米孔时，它会引起离子电流的瞬态变化，电流变化事件被记录下来。被分析物可以通过当前电流发生的频率进行量化，特征电流信号则可以揭示被分析物的各种特征[28~30]。该检测方法不需要对DNA探针进行任何化学修饰，既方便又节约成本，减少了样品消耗。 图4. 用于分析DNA甲基化酶活性的纳米孔试验的示意图 在过去的十几年中，DNA甲基化酶活性的检测取得了重大进展。有几种方法有希望可在临床检测，使得该方法在用于癌症诊断、预后和治疗方面显示出了希望。比色法依赖于颜色变化的目视观察或与DNA甲基化酶相关的吸收光谱的光谱测量，具有成本低、简单、可移植性和在某些情况下无需仪器的优点，但是检出限相对较高。荧光法检测DNA甲基化酶活性的检测过程简单，检出限相对理想，但其复杂的光学性能以及昂贵的仪器设备限制了其在生活中的应用。电化学法由于需要构建较复杂的反应电极材料而使得其在临床上受到了一定的限制。蛋白质纳米孔的检测方法不需要对DNA探针进行任何化学修饰，既方便又节约成本，减少了样品消耗，检出限相对较为理想，并且已经成功应用于人类血清样本。这类检测可能最终为常规DNA甲基化酶活性的检测和分子诊断打开大门，为疾病的管理和诊断带来新的前景。 作者：王家海、骆 乐 作者简介：王家海，博士，教授，硕士生导师/博士生导师，广州大学化学化工学院；分析化学专业；主要研究领域为“基于核算纳米结构为信号传导载体的纳米孔传感器”；在核酸探针和仿生纳米孔两方面开展了一系列分子识别的工作，也为将来进一步开展分析化学研究打下了坚实的基础，期间积累了多种前沿分析方法和技术：仿生纳米孔制备和检测；微纳米加工技术；核酸探针人工合成技术。参 考 文 献 [1] 陈晓娟,闫少春,邵国,等.人DNA甲基化转移酶的分类及其功能[J].包头医学院学报,2014,30(04):136-138.[2] Das PM, et al. 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做核酸检测时有哪些注意事项？科技日报记者就此专访了北京佑安医院呼吸与感染科主任医师李侗曾，专家详细解答了做核酸检测时要注意的这10个问题。北京市海淀区中关村街道的一处临时核酸检测采样点，医护人员为市民进行核酸采样。新华社记者 任超 摄1、做核酸检测前30分钟内别喝热水有道理吗？李侗曾：核酸检测前喝热水可能会冲淡附着于咽部的病毒，而且病毒不耐热，喝热水还会抑制病毒的活性。为提高咽拭子核酸检测的准确度，建议检测前30分钟内受检者不要喝热水。此外，喝饮料稀释会病毒，以及嚼口香糖分泌更多唾液从而稀释病毒，也可能导致漏检。但不能说，喝热水、喝饮料、嚼口香糖就一定导致检测结果不准确。因为检测结果受很多因素影响。比如，受检者体内的病毒量。如果受检者体内病毒量低，喝热水稀释可能让采集到的病毒量更少，影响检测结果；而如果受检者体内病毒量高，即便喝了热水仍能检测出阳性。其实，对检测结果影响更大的是采样方法。核酸采集咽拭子的具体位置在咽峡两侧、扁桃体隐窝以及咽后壁的位置。通常情况下，核酸采集咽拭子需要反复擦拭3-5次，以确定收集到黏膜细胞，期间避免拭子接触舌头、悬雍垂、口腔黏膜以及唾液，以免影响检测结果。但实际检测中，可能有些采样人员划拉两三下就完了，或者只在咽部擦一擦，没有到达咽后壁，检测结果的误差就会变大。总而言之，检测方法不到位可能导致阳性率下降，再加上受检者喝热水就会对结果产生较大影响。2、喝水可以降低传染性？李侗曾：对于新冠病毒感染者，喝水可能暂时稀释了口腔内的病毒，但病毒可能半小时以后就又复制了。因为病毒复制很快，病毒的传染性并不会因为喝水就降低。3、做核酸检测前30分钟内能不能刷牙或漱口？李侗曾：跟喝热水一样，刷牙漱口也可能降低口腔内的病毒量。如果提前一两个小时刷牙漱口，肯定不影响。如果采样人员规范采集到了咽后壁的样本，刷牙漱口对检测结果影响不大。怕的是刷牙漱口之后，核酸检测采样人员只采了口腔前半部分的样本，这样可能会影响结果。怎么判断采样靠不靠谱呢？其实，真正采集咽后壁样本时，一般会引起受检者有想呕吐的感觉。4、核酸检测前尽量不要饮酒是为什么？李侗曾：酒精和热水一样，会影响病毒的活性，从而降低核酸检测结果的准确率。另外，做核酸检测前半个小时内饮酒，可能导致在做核酸时更易引起消化道的一些反应，如呕吐反应等。5、做核酸检测时尽量不要清嗓子、大声说话、深呼吸或发出“啊”的声音？李侗曾：对。主要是为了防止病毒扩散，引起交叉感染。因为感染者呼气时可能导致病毒扩散，增加周围人感染的风险，清嗓子、发出声音也是这个道理。而在检测时深吸气，如果此时正好空气中有病毒，就可能导致自己在吸气时被病毒感染。所以，在做核酸检测时尽量屏住呼吸，赶紧做完戴好口罩，尽快离开现场。6、每次做完核酸检测后有必要更换口罩吗？李侗曾：做核酸检测时口罩被污染的概率较小，一般可以继续戴。我们建议做核酸时带备用口罩，但不要求做完核酸检测必须换。现在北京要求排队做核酸检测时保持两米距离，大家排队时都朝同一个方向，口罩被污染的概率很小。而且，我们一般要求核酸检测点设置单向通道，不要离开通道和排队等候通道有交叉，避免让做完的和等待做的人面对面。不过，如果在检测过程中把口罩放在容易污染的检测台面上，或口罩掉在了地上，就建议更换。如果在检测时有人和你面对面，而且他咳嗽、打喷嚏，那考虑口罩可能被污染，建议更换。7、为什么做核酸检测前2小时尽量避免进食？李侗曾：主要是考虑受检者舒适度问题。一般，我们担心核酸检测前两个小时内进食，容易导致在核酸时呕吐，尤其是吃得太饱后去捅嗓子眼，更容易引发呕吐反应。8、有人在核酸时从下巴往上把口罩掀起来，确保挡住鼻子，这有必要吗？李侗曾：抗原检测一般是受检者在家里自测，按照规范操作就行。

自2020年初开始，SARS-CoV-2新型冠状病毒肆虐全球。面对此类突发性公共卫生事件，早发现、早隔离、早治疗是控制疫情发展的有效举措。在国家卫健委更新的各版本《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》中，利用实时荧光RT-PCR进行病毒核酸检测始终是确诊新型冠状病毒的金标准。然而，面对大规模突发传染性疾病的巨大检测需求，病原体核酸检测的安全性、时效性、标准化，日益成为包括新冠病毒在内的病原体核酸检测的首要需求。病原体核酸检测面临的问题由于疫情爆发迅猛，新增及累积病患人数较多，巨大的检测需求与相对低效的人工操作成为疫情防控的绊脚石。在利用定量PCR技术进行核酸检测的全流程中，虽然结果出自最后一步的定量PCR仪，但大量的工作存在于样本处理、核酸提取及反应体系构建过程中。通过人工操作的方式完成整个流程，既耗时耗力，又难以统一标准，更重要的是对于检测人员存在极大的安全风险。1. 准确性与假阴性问题，核酸提取效率与纯度、核酸检测的灵敏度与稳定性、人工操作的重复性和人为错误（阴阳性样品误混）等因素可能影响检测的准确性。2. 核酸检测时效性问题，面对巨大工作量并且检验人手有限的情况，复杂、耗时的操作流程，让准确性和时效性难以兼得。3. 操作安全性问题，医务工作人员与研究人员频繁接触样本，有被感染的风险。可以预期，在今后各种类型的病原体核酸检测场景中，检测人员对于整体检测流程的安全性、准确性、检测效率和标准化将有更高要求。鲲鹏基因-核酸检测自动化整体解决方案为保障检测人员远离病原体感染风险，提升病原体核酸检测的准确性和效率，鲲鹏基因全新推出从核酸提取至定量检测的自动化整体解决方案，包含从高效全自动核酸提取至快速定量PCR检测分析的产品组合。满足包括疾控、海关、医院、医学检验等机构对于安全防控性、通量灵活性及快速自动化的应用需求。全自动核酸提取纯化鲲鹏基因匠心打造的ArchiPure系列全自动核酸提取纯化仪，具有操作简单、提取稳定高效的特点，可以从病毒、细菌、全血等样本中自动提取纯化核酸，所提取核酸满足后续分子生物学实验需求。丰富的试剂品种能够满足不同样品类型的提取需求。人性化的预封装设计减少手工操作产生的误差，最快13分钟即可完成12或96个样本的核酸纯化，得到高质量的核酸。鲲鹏基因可为每个忙碌的实验室提供高一致性及稳定性的自动核酸纯化解决方案，广泛用于科学研究、临床分子诊断、动植物疫病监测等领域。高精度定量PCR检测分析Archimed X4/X6实时荧光定量PCR系统采用镂空式温控模块结合边缘温度补偿技术设计，光学检测模块应用了创新的高灵敏大尺寸MPPC结合时间分辨逐孔扫描技术。具有优异的性能表现：温度均一性及准确性达±0.1℃，高灵敏，多重检测防串扰等。适用于市面各种病原体核酸检测试剂盒，具有极佳的动态范围和检测灵敏度，检测下限低至100 copies/mL。在新冠疫情期间，已广泛服务于各级疾控及第三方检测实验室。Archimed Mini 16超快速便携式定量PCR系统在保证检测灵敏度和准确性的基础上，具备更快的检测速度（30分钟），极大提升核酸检测时效性。应用Mini 16结合A厂家的一步法免提取新冠病毒快速检测试剂盒，可将从咽拭子至获取最终扩增数据的全流程时间缩短至40 mins以内，同时保证极高的检测灵敏度（300 copies/mL）。Archimed qPCR + ArchiPure Extractor = 安全、准确、快速

11月23日晚间，上交所官网显示，鉴于翌圣生物尚有相关事项需要进一步核查，决定取消原定于25日的审核。翌圣生物是一家体外诊断（IVD）检测行业的上游原料商，主要从事分子类、蛋白类和细胞类生物试剂，公司的业务涉及新冠检测试剂生产原料及少量研发试剂的供应，2020年、2021年与2022年上半年营业收入中，新冠相关收入分别占比25.42%、24.77%、38.28%。今年6月23日，翌圣生物的科创板IPO申请获上交所受理，11月18日，上交所通知其即将上会审核。仅仅5天后，翌圣生物的IPO之路突然中止。这5天发生了什么，让上交所的态度发生了变化？“尚有相关事项需要进一步核查”具体是指什么？我们不得而知。一个明确的信号是，11月21日深夜，沪深交易所称高度关注涉核酸检测企业的上市申请，坚持从严审核，尤其是企业的可持续经营能力。翌圣生物成了新规发布后第一家被取消IPO申请审议的公司。产业界遇到最严重舆论危机这可能是新冠疫情之后，“涉核酸检测企业”遭遇的最严重的舆论危机。让我们先来梳理下舆情发酵的时间线。疫情近3年来，普通大众都感核酸检测之苦，虽然医保连续降价和药监局的集中采购把新冠检测价格压至极限，但核酸检测仍然在为这些企业贡献营收。沪深交易所连夜发声后，大众将目光投向了与核酸检测相关的企业。恰逢财报季，几家头部涉核酸检测企业的2022年前三季度营收被整理出来，其中九安医疗 、迪安诊断 、金域医学 等公司的百亿营收，睿智医药 、安旭生物 、亚辉龙 等公司超400%的净利增长率，在当下的市场环境中格外显眼。除此之外，一些排队上市的涉核酸检测企业过会材料也被拿出来“审视”。这些企业得到的“疫情红利”在当下显得尤其扎眼，舆论反应如同烈火烹油。随后媒体又爆出广州某小区15例阳性11人复查却是阴性，甘肃兰州出现“阳性转运者核酸阴性”事件，各种乱象和违规情况让人愤怒、疑虑与不安。特别是11月25日，甘肃省兰州市卫健委通报称，兰州核子华曦实验室（下称兰州华曦）工作人员误将个别核酸检测异常人员名单信息录入阴性人员信息包中上传至工作系统。兰州华曦是核子基因的全资控股公司，至此，核子基因和背后的实控任张姗姗浮出水面，其造假丑闻成为矛头所指，引发了最大的一波舆情。更多疫情期间成立、或在疫情期间急速扩张的核酸检测企业经营模式被接连“起底”。国家卫健委在11月29日表示，将持续加大监管力度。从检测机构，到医疗设备公司，再到翌圣生物为代表的上游公司，可以说，此轮舆情波及的产业面非常之广。一时，产业界的声音在汹涌的舆论场里显得格外式微。一位IVD上游企业负责人对媒体感叹，“现在社会舆论有点激烈，我们也不敢出来说话了。”但是他补充，“绝大部分核酸企业是为疫情防控作贡献的一批企业，专业并有良心，不能拿一小部分人的非法专营来污蔑整个行业。”也有部分涉核酸检测企业希望站出来澄清，如达科为董秘吴宏翔在接受南都湾财社采访时表示，达科为并非核酸概念公司，核酸相关业务营收占比只有8%左右，并强调公司自1999年成立，主营业务就是科研代理服务和医疗设备的研发、生产和销售。目前达科为的状态为提交注册状态，距发行上市仅一步之遥，但因“靠核酸采样管年入8.4亿”为人诟病，同样被推上风口浪尖。IVD行业专家宋海波11月26日发文力挺核酸检测相关企业，文章得到了不少产业人士的转发。宋海波是上海市实验医学研究院副院长、全国医学检验产业分会会长、实验医学分会秘书长。文中称，“可以理解近三年来在疫情的重压之下，一个舆情的发生缘由可能只是网络情绪的宣泄点，但对网络上明显不符事实的情绪宣泄情况，我们应冷静公正客观的对待。”他也回应了“核酸检测相关的企业毛利都很高”的问题，指出，高毛利与高垄断息息相关，但是我国的体外诊断企业的每一个产品，都有数十家甚至上百家公司在进行充分的市场竞争，产品价格也是极度透明的，罕有垄断暴利行为。现实中的核酸检测扣除成本，毛利率并不高。大部分生产防疫相关产品的企业赚钱的原因，主要是市场需求的巨大规模产生的薄利多销的巨大规模效应。“涉核酸检测企业”到底靠新冠赚了多少钱？那么，“涉核酸检测企业”是不是都靠新冠赚到盆满钵满？小编整理了疫情以来，一些在创业板和科创板上市/待上市的“涉核酸检测企业”的主营业务，与营收中的新冠业务占比情况：▲资料整理自公司财报、招股书、业绩说明会等从整理的信息中可以发现，近两年来科创板与创业板上市的“涉核酸检测企业”，大部分是IVD上游试剂公司，而非大众印象中临时组办的“检测实验室”。这一领域的确是近年来国产替代发力的重要战场，国内IVD赛道一直被海外巨头占据市场50%以上的份额，尤其是化学发光的国产率只有20%，仪器以封闭设计为主，下游客户需要持续购买高昂的试剂，国内公司同时有仪器和试剂生产能力的凤毛麟角，但近年来国内IVD行业一直在进行技术追赶。新冠疫情是一个契机，让IVD上游被资本市场注意到，给予了这些公司走上二级市场募集资金、发展业务以打破国外巨头垄断的机会。有相关企业创始人表示：“以前，大家更关注临床市场，都不愿意投入上游原料市场。受疫情影响，原料行业迅速曝光在聚光灯下，资本的投资意愿陡增。”从披露的营收情况来看，新冠相关业务的确为这些公司业绩增色不少，但很多公司的新冠业务在营收中占比并不算高，且有些公司的新冠业务呈现逐年下降的趋势。以百普赛斯 为例，尽管公司新冠业务连续两年多带动公司业绩增长，不过新冠业务收入增加的同时，占整体营收比却显著下降。公司的新冠业务占比已经从2020年的29.52%降低到了今年第三季度的18.6%，且其新冠业务的应用范围主要是疫苗和药物类，而非诊断类，可持续性更高，或者说新冠对公司营收和估值的影响较小。百普赛斯 主营产品为重组蛋白，重组蛋白是运用基因工程和细胞工程等技术获得的具有一定功能和活性的蛋白质，是生物药、细胞免疫治疗及诊断试剂研发和生产过程不可或缺的关键生物试剂。作为国内重组蛋白龙头之一，百普赛斯的客户主要为工业端大药企，覆盖强生 、辉瑞 等全球Top20医药企业以及恒瑞医药 、信达生物 等国内知名生物医药 企业。今年9月，赶在上交所新规发布前上市的另一家蛋白试剂公司近岸蛋白，虽然也有涉核酸检测业务，但主要发力的是mRNA原料酶领域。分析近岸蛋白发展史会发现，的确是2020年疫情之后，近岸蛋白才正式开始mRNA原料酶的规模化生产。疫情推动了mRNA疫苗的进程，从而拉动了近岸蛋白的营收。2021年，近岸蛋白把握市场机会，成为沃森生物 、艾博生物等国内重要的mRNA疫苗药物企业的主要供应商之一，其mRNA原料酶及试剂实现了约1.3亿元的收入。但是，mRNA原料酶属于mRNA产业链的上游，创新含金量较高，也是价值链上的重点环节。据介绍，目前近岸蛋白mRNA原料酶产品指标已经达到国际先进水平。甚至包括被上交所“打回”的翌圣生物，本质上讲是专注于分子酶的公司，而非纯粹的核酸检测上游公司。2020年之前，分子酶进口比例在80%以上，壁垒高，生产难度大。新冠疫情以来资本关注生命科学工具，使得翌圣生物等企业能够开始在仪器设备以及生产厂房方面提升，快速发展。分子酶除了在新冠检测中能够发挥作用，更重要的是它可以成为高端肿瘤精准诊断原料。肿瘤精准医疗诊断中，以肿瘤早筛以及伴随诊断为主，翌圣生物针对PCR和NGS两种技术平台，均能匹配高质量的产品以及酶原料。此前翌圣生物在访谈中还表示，公司在拓展多种技术创新产品线，包括细胞治疗、基因治疗，类器官、合成生物等上游原料。所以，将这些公司一并用核酸检测企业加以概括，显得过于武断。我们也简单整理了主板上市的“涉核酸检测企业”，从成立时间来看，都是较为老牌的检测试剂公司，从上市时间来看，绝大多数公司都是在新冠疫情前就已上市，并非借东风大赚一把后包装上市：▲资料整理自公开信息如果细看收入情况，也能发现一些公司的主要收入并非来自国内核酸检测，比如九安医疗 的半年报显示，其海外销售额达229亿，最主要销售的市场是在美国，国内销售额仅3亿。以及万泰生物 ，其半年报显示新冠抗原产品主要售卖到欧盟国家，同时公司的另一主打产品为二价HPV疫苗，帮助公司收入和利润实现高速增长。不过这些企业从新冠疫情以来，由于大众和市场对核酸检测的态度与预期变化，大都经历了一波“追涨”后的“杀跌”，如何证明自身未来价值，是它们要面对的重要命题。摆脱新冠概念，寻找可持续增长曲线另一个舆论矛头的指向，正是“涉核酸检测企业”到底有没有未来？此次证监会、沪深交易所的动作，主要针对的问题是：涉核酸检测企业到底有没有资格在二级市场募集资金？因为股票是永久性的债券和融资工具，而核酸检测生意是短期不可持续的。特别像翌圣生物等公司申报的是科创板上会，创新属性需经得起推敲。这次翌圣生物被取消审核，其中的原因可能是自2020年涉足核酸检测服务后，新冠收入占比快速提升，但对应净利润快速下滑，引发了市场对于公司常规业务的核心盈利能力和可持续性的怀疑。新冠疫情业务的确让这些公司收入“起飞”了一把，但二级市场的估值往往提前支付了公司的未来成长性，只有可持续性的增长才能一直“飞”下去。很多公司从疫情早期爆发的贴靠新冠概念，逐渐转向摆脱新冠概念。靠新冠疫情取得了一些增长的公司，也同样在焦虑如何平衡新冠和非新冠业务。从今年过会企业的招股书，以及已上市企业的年报中可以观察到，很多公司会将新冠和非新冠业务做区隔。比如义翘神州 在2020年初新冠疫情时，抢先研发出一系列新冠相关试剂产品，并借此大力提升自身品牌影响力，但在今年的报告中，则强调在非新冠业务的发展态势，如：2022前三季度非新冠病毒相关业务实现营收3.02 亿元，同比增长12.58%；Q3非新冠病毒相关业务实现营收1.11 亿元，同比增长18.06%。再比如，近期亚辉龙 表示，新冠业务的盈利为公司获得现金流，公司以此投入非新冠主业的研发，大大加快了公司非新冠新产品的研发和上市进度。翌圣生物的负责人在IPO前也对媒体表示，企业快速增长后，会注重拓宽产品线和海外市场，为全球化竞争和长期竞争做准备，最终目标是成长为生命科学工具行业的基石公司。不可否认的是，有一些所谓的“基因检测公司”、“核酸检测实验室”在疫情期间快速成立、扩张，圈地牟取暴利，但这些公司仅靠核酸检测申请上市是不可能的，因为资本市场很难接受没有增长潜力和技术含量的公司。尤其是创业板、科创板，其创立初衷是为了扶持国家的科技创新型产业，面向世界科技前沿、面向经济主战场、面向国家重大需求，主要服务于符合国家战略、突破关键核心技术、市场认可度高的科技创新企业。从前文分析中不难看出，新冠疫情以来上市的“涉核酸检测企业”大部分都为生命科学工具厂商，生命科学工具是一个基于交叉学科创新的综合体系，过去一直被进口品牌垄断，本土企业需要努力钻研关键技术，加速对进口品牌的替代。宋海波也在上文中指出，疫情常态化之后，没有新冠业务，核酸检测企业的发展也并不是没有了前途。他指出，技术发展以及企业发展有一般性规律，就像mRNA疫苗技术可以拓展应用到很多领域，疫情同样促进了更多新的检测技术的应用和提高。“利用核酸检测这一技术平台，我们可以研发出很多新的检验项目，许多企业一定会利用这一技术路径研制出更多更好的体外诊断产品，来为人民的健康事业服务。”总有企业会在当下的市场环境中赚钱，但我们希望能赚到钱的是那些在疫情中作出贡献，同时最富创新性的企业。

p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.5em " span style=" font-family: 黑体, SimHei " strong 仪器信息网讯 /strong 美国媒体近日披露，美国医疗保健和医疗补助服务中心打算从2021年1月1号起实施新规，操作新冠病毒高通量检测的实验室，如果无法在采集标本的2天之内完成检测，单次的检测所获联邦经费将会被削减。 /span /p script src=" https://p.bokecc.com/player?vid=2C6F7FD2EF17FCDC9C33DC5901307461& siteid=D9180EE599D5BD46& autoStart=false& width=600& height=350& playerid=621F7722C6B7BD4E& playertype=1" type=" text/javascript" /script p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.5em " span style=" color: rgb(192, 0, 0) " strong 2天内不完成检测，单次检测消减25美元经费 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.5em " 据悉，为提高新冠病毒检测量，美国政府4月中旬经由医疗保健项目给实验室甜头，其利用高通量检测仪器，每完成一次检测可获100美元，无论检测耗时多长，按照明年起实施的新规，100美元将降至75美元。实验室如果要获得25美元额外奖励，需在两天内完成检测。 美国7月新冠病例和检测需求激增，今年夏天美国人涌入医生办公室，药品连锁店要求做检测，而大型商业实验室完成检测需耗时一周甚至更长。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.5em " span style=" color: rgb(192, 0, 0) " strong 实验室不能“背锅”，真正原因是耗材供应不足 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.5em " 一些业内人士认为，联邦政府这一惩罚手段不妥，检测周期延长是由检测物资短缺导致不应让实验室“背锅”。政府以削减经费施压，不能解决实验室面临的根本问题。 美国病理学家协会会长帕特里克哥德比说，实验室缺乏检测所需的化学试剂、吸液管、试管等耗材，病理学家实验室本身无法控制供应链，却为此受罚。这项新政策可能引发多米诺效应，严重影响病人获得检测。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.5em " span style=" color: rgb(192, 0, 0) " strong 热门核酸检测耗材一览 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.5em " 仪器信息网特整理核酸检测过程中涉及的部分实验室耗材供大家了解。核酸检测主要在核酸提取和样品转移过程中会使用到很多耗材，笔者整理如下（欢迎评论区留言补充）： /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.5em " strong 核酸提取过程： /strong 一次性病毒采样管，DMEM病毒保存液、移液吸头（带滤芯），一次性离心管，磁力架、核酸提取板，磁棒套或磁棒梳，提取试剂及磁珠...... /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.5em " strong 核酸样本转移： /strong 8联排移液器，核酸试剂，移液器吸头（带滤芯），96孔PCR八连管及管盖， PCR板及盖...... /p p style=" text-align: center text-indent: 0em line-height: 1.5em " a href=" https://www.instrument.com.cn/ca/show/" target=" _blank" span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 更多的实验室耗材，尽在仪器信息网耗材主页（点击下图进入） /strong /span /a /p p style=" text-align: center line-height: 1.5em " a href=" https://www.instrument.com.cn/ca/show/" target=" _blank" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202010/uepic/1a7ca472-1e91-4174-90ad-9a4955325a1c.jpg" title=" 耗材配件专场.png" alt=" 耗材配件专场.png" / /a /p

p 　　恶性肿瘤严重威胁人类的生命健康，其发病率和死亡率非常高。因此，肿瘤的早期诊断对于癌症的预防和治疗是至关重要的。肿瘤标志物是由肿瘤组织自身产生，可以反映肿瘤存在和生长的一类生化物质，主要包括胚胎抗原、天然自身抗原、肿瘤相关的酶、激素以及癌基因等。miRNA是一类长度为18～25个核苷酸的非编码单链RNA，不仅在基因表达调控中起到非常重要的作用，同时还在细胞增殖、分化、凋亡、造血等多个生物学过程中发挥着至关重要的作用。研究表明，miRNA的表达水平与多种肿瘤的发生、发展有着密切的关系。对于miRNA表达水平的监控，在疾病的早期诊断和预后观察等方面具有十分重要的意义。 /p p 　　近期，中国科学院苏州生物医学工程技术研究所研究员缪鹏课题组开发了多种针对miRNA的超灵敏电化学分析方法。利用核酸分子的组装，制备了多种功能纳米材料，如聚集态金纳米颗粒、双链核酸模版-铜纳米颗粒、核酸-多孔氧化铁纳米复合物等，并利用不同的信号放大技术，如级联链置换聚合反应、酶催化分子循环反应(T7核酸外切酶、双链特异性核酸酶)等，极大地提高了信号强度，最终通过电化学测量，实现了aM级的检测灵敏度。这些新型的分析方法还具有稳定性高、特异性好、易改造等优点，有望为miRNA的超灵敏检测提供有力的工具。 /p p 　　相应工作已发表(Anal. Chem., 2018, 90, 2395-2400 Anal. Chem., 2018, 90, 11154-11160 Chem. Commun., 2018, 54, 7366-7369 ACS Appl. Mater. Interfaces, 2018, 10, 36796-36804)。 /p p /p p style=" text-align: center " img title=" asdasdasdasd.jpg" alt=" asdasdasdasd.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/b01b1693-bd34-4e0d-80e5-be7f7d0fafb2.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　miRNA超灵敏电化学检测示意图 /p p & nbsp /p

前言人类基因组中仅有1%是负责蛋白质编码的基因，其中疾病相关的蛋白大约有 3000个，只有不到700种被目前获批的药物作为靶点，绝大多数疾病相关的蛋白被认为是不可靶向的。针对疾病相关的非编码RNA以及不可成药的蛋白靶点，使用小分子靶向RNA的结构是治疗相关疾病的一种策略。但是小分子的结合并不一定能产生生物活性，有些小分子可能结合在RNA的非功能位点，或者小分子的结合强度不足以影响RNA的生物功能。高分文献解读2023年5月24日，Scripps研究所的Matthew D. Disney教授及其合作者在Nature杂志发表了题为“Programming inactive RNA-binding small molecules into bioactive degraders”的研究论文，利用核糖核酸酶靶向嵌合体技术将非活性小分子重编程为靶向RNA降解剂，成功降解miR-155和癌症靶标MYC、JUN的RNA。https://doi.org/10.1038/s41586-023-06091-8IF: 69.504 Q1研究人员基于二维组合筛选进行RNA和小分子高通量分子间相互作用检测，发现了一些可以与pre-miRNA-155结合的小分子。接下来使用Monolith分子互作仪完成了大量RNA小分子结合表征。研究人员验证了C1仅结合于5′GAU/3′C_A motif，其他RNA凸起或者点突变RNA在相同检测浓度范围内看不到明显的结合信号。在使用Monolith检测时无需固定RNA，仅需带有CY5标记即可直接在溶液中精确表征Kd，检测一对样品仅需10min。图1：pre-miR-155-binder C1结合曲线构建靶向嵌合体小分子结合于pre-miRNA-155的非活性位点，并不会对细胞内的miRNA-155表达水平产生影响。接下来研究人员构建了双功能小分子核糖核酸酶靶向嵌合体，一端与目标RNA结合，另一端招募并激活RNA酶，从而靶向降解目标RNA。改造后的嵌合体成功在细胞内降低miRNA-155的表达水平，并且在细胞和小鼠模型中抑制了三阴乳腺癌。图2：将结合pre-miR-155的惰性结合物转化为活性RIBOTAC降解剂为了测试该方法的适用性，研究人员又构建了靶向MYC和JUN的核糖核酸酶靶向嵌合体。这两种蛋白都是重要的癌症靶点，但都是无序蛋白，被认为是不可成药的。改造后的核糖核酸酶靶向嵌合体获得了生物活性并在细胞内精准地靶向降解各自的靶向RNA，使这些癌蛋白驱动的转录和蛋白组学进程失效。这项研究表明对于由这些常见但具有挑战性的致癌基因驱动的癌症，重编程非活性小分子为靶向RNA降解剂可能会带来新的变革。图3. JUN-RIBOTAC选择性降解JUN mRNA抑制胰腺肿瘤细胞的增殖和迁移Monolith系列分子互作检测仪在此项研究中，NanoTemper的Monolith分子互作检测仪在RNA小分子结合表征的检测中提供了可靠的实验数据。RNA分子量小，体外容易降解，而Monolith系列分子互作仪对分子量无限制，同时10分钟的快速检测可以最大程度避免RNA的降解。Monolith系列分子互作仪覆盖几乎任何分子类型、缓冲液成分或亲和力强弱的检测项目，并且检测不依赖于分子量，能够轻松应对不同类型的分子间相互作用检测难题，助力靶向RNA降解剂研究。NanoTemper微量热泳动分子互作检测仪Monolith-实用应用手册_诺坦普科技（北京）有限公司 (instrument.com.cn)

近日，国际生物医学专业期刊MedComm（IF：9.9）在线发表中南大学、湖南家辉遗传专科医院邬玲仟、梁德生教授课题组在遗传病检测领域的最新研究成果：课题组开发出了一种创新的核酸检测平台，并申请了2项国家发明专利。它是一种集无PAM限制、多重与定量核酸检测于一身的强大新技术，其优势在于使用通用型PAM与crRNA，利用Cas12a的活性，并采用条形码技术，即可实现准确、高效、多重和定量的核酸检测。快速、准确、经济、灵敏的核酸检测在传染病早期的快速诊断、遗传疾病的筛查和诊断以及食源性病原体的检测中发挥着重要作用。在这项研究中，课题组开发了一种基于条形码的Cas12a介导的DNA检测（BCDetection）技术，能克服传统基于CRISPR核酸检测技术依赖于特异性的crRNA并受限于PAM而无法识别任意靶序列，只能进行单通道检测，且难以进行定量检测的局限性。　　基于Cas12a的通用检测可以通过与特定目标序列的探针杂交来完成，而不需要固有的PAM。此外，多对探针杂交可在单个反应中检测β地中海贫血的多个突变。　　定量检测目标基因或病原体的拷贝数在医学科学中发挥着至关重要的作用，包括评估生育遗传病患儿的风险，预测健康风险，及对疾病严重程度进行分类。在这项研究中，BCDetection具有定量检测能力，其可有效检测人类基因组中的拷贝数变异（CNV），例如SMA携带者和正常个体之间的差异。　　鉴于CRISPR/Cas12a平台的多功能性、可编程性和灵活性，BCDetection可进一步优化从而实现对不同目标进行快速、多重的可视化检测，有望对遗传分析和个性化疾病诊断产生重大影响。该研究获得了国家自然科学基金会、中国博士后科学基金会、湖南省科技创新计划和湖南省自然科学基金会的支持。　　邬玲仟、梁德生教授团队在遗传病诊断和产前诊断新技术研发和临床应用研究领域一直处于国际前沿，近年来瞄准国家重点防控的复杂单基因病，开发并推广应用了一系列三代测序靶向基因检测新技术，包括：三代地中海贫血（CATSA）、三代先天性肾上腺皮质增生症（CACAH）、三代脆性X综合征（CAFXS）等，不断完善我国出生缺陷精准防控新技术体系。

过去三年，核酸检测结果作为新冠病毒患者确诊的“金标准”，所处行业成为了最火热的赛道之一，吸引了众多企业在此布局。相关报道曾测算称，核酸常态化要求下，补检测能力短板预计能带来400亿元的仪器市场（pcr设备和核酸提取仪）、280亿元的核酸检测试剂市场（含保存和提取试剂，单价为目前最低的广东联盟集采价标准的80%）、680亿元icl检测市场。不过，随着疫情褪去，核酸检测的实际需求量大规模萎缩，原本暴利行业的核酸检测正在迎来凛冬。就此，我们对人工智能ChatGPT发起提问，听听它是如何回复的。Q:疫情过后，核酸检测技术未来的热点应用领域会是哪些？ChatGPT：核酸检测行业在疫情时代发挥了重要的作用，它能够帮助我们及时发现新冠病毒的感染情况，并迅速采取有效措施，减少病毒的传播。随着疫情的控制，核酸检测行业将继续发挥重要作用，不仅将继续参与监测和预防疫情，还将被用于病毒检测、病毒源检测、病毒抗体检测等检测领域，帮助准确评估疫情的发展趋势，并有助于后续的疫情防控工作。在疫情时期，核酸检测行业将延续疫情时代的飞速发展，它将在疫后时代重新定义，进一步拓展服务领域，成为疫后时代的重要支柱。1、临床诊断：利用核酸检测技术可用于检测癌症、传染病等疾病，可以更快捷、准确地诊断病情，从而指导治疗。2、生物成像：核酸检测技术可以利用特异的核酸序列设计探针，用于跟踪活细胞中的活性蛋白质，以及其在不同细胞状态下的表达差异。3、药物开发：利用核酸检测技术，可以快速鉴定药物作用靶点，从而提高药物的有效性和安全性。4、环境监测：利用核酸检测技术可以检测环境中的有害物质，以便及时采取防御措施。5、基因组学：核酸检测技术可以用于分析基因组的结构和功能，可以更好地理解生物的发育进化过程。ChatGPT的语言对话能力不可小觑，但对于科学仪器行业预测是否有参考依据不得而知，希望它的出现可以在科学仪器行业发挥正向作用，让我们拭目以待。

我要测讯 诺如病毒(Norovirus)是一组杯状病毒属病毒，其原型株诺瓦克病毒(Norwalk-like viruses)于1968年在美国诺瓦克市被分离发现。诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，可通过污染的水源、食物、物品、空气等传播，常在社区、学校、餐馆、医院、托儿所、孤老院及军队等处引起集体暴发。感染者发病突然，主要症状为恶心、呕吐、发热、腹痛和腹泻。 　　世界上很多地区都有暴发的案例，例如2010年广州从化因为水污染引起的诺如病毒感染事件，共有429人发病 2012年9月底，德国首都柏林以及东部三个地区1万多名小学生和托儿所的幼儿发生疑以诺如病毒食物中毒 尤其以2012年12月，日本各地接连发生一系列因诺如病毒而引起的集体食品中毒事件最此人关注，从爱知县名古屋市一直到广岛县广岛市总的中毒人数1809人。 　　诺如病毒是全球流行性与散发性腹泻的主要病原之一，受污染的食品、水源是诺如病毒传播的重要污染源，例如贝类、水果、蔬菜、饮用水、水源水等。目前，我国在食品与水样中诺如病毒检测方面还没建立有相关的国家标准。根据文献报道，诺如病毒的检测方法主要包括电镜法、免疫法及分子扩增法(主要为PCR方法)，其中分子扩增方法被认为是食品中检测诺如病毒的唯一方法(其他两种方法灵敏度差)，而PCR则为“金标准”而被广泛作地采用。因此，完整的食品与水样中诺如病毒检测的主要流程共包括病毒的提取、核酸的纯化以及病毒的分子检测。 　　食品及水样中诺如病毒的检测方法 　　(protease K digestion & real-time reverse transcription-PCR) 　　一、实验原理 　　挑取被检样本或者被检样本中病毒易富集部位(例如贝类的消化腺组织)，通过蛋白酶K消化的方法解离病毒，然后通过异硫氰酸胍等试剂纯化病毒RNA，接下来继续将病毒RNA进行反转录，最后将产物cDNA进行PCR检测。 　　二、仪器和试剂 　　荧光定量PCR仪、振荡培养箱、涡旋振荡器、离心机，TRIzol试剂、MMLV反转录试剂盒、Taqman realtime-PCR试剂盒超均为商品化试剂，其他试剂为国产分析纯，实验用水为不含核酸酶的超纯水。 　　三、实验方法 　　1.食品前处理 　　选取被检适当量样本(不同种类食品样本量不同)。以贝类样本为例，一般取5~10个左右，用无菌水冲洗干净贝壳表面后撬开贝壳，然后用无菌的手术刀切取其中的消化腺组织共1.5g，并尽量切碎贝类组织。 　　2.蛋白酶K消化 　　诺如病毒解离的方法有很多，包括PEG沉淀法、超滤法、超速离心法等等，而蛋白酶K消化的方法由于其自身简单、耗时短、稳定性高等特点，而被欧洲标准化委员会认定为贝类中诺如病毒解离的标准操作方法。 　　①向1.5g被检样本中加入2mL PBS，并加入蛋白酶K至浓度0.2mg/mL 　　②涡旋振荡混匀后，置于37℃、300r/min的振荡器中孵育1h 　　③孵育后样本置于65℃10min，进行蛋白酶K灭活处理 　　④灭活后样本于3000r/min下离心5min，取上清进行下一步实验。 　　3.核酸纯化 　　RNA纯化用硅胶膜试剂盒与TRIzol试剂是目前主要采用的病毒RNA的纯化方法。目前本实验室采用TRIzol试剂法进行诺如病毒RNA的纯化： 　　①取300μL上清液，加入到含1mL预冷的Trizol的EP管中，混匀后室温放置5min，加入0.2mL氯仿，充分混匀或旋窝震荡15s，室温放置5min，12000g离心15min 　　②小心取上层水相600μL至含有预冷的600μL异丙醇的EP管中，混匀，室温放置10min，12000g离心10min 　　③小心倒掉上清，加入1ml 75%乙醇(用DEPC处理的水进行配制)，洗涤沉淀，12000g离心5min 倒掉上清，尽量吸净残留液体，室温放置风干数分钟 　　④加入50μL无Rnase的H2O溶解RNA，可选择于70℃水浴5min加速RNA溶解，然后放于-80℃保存或直接用于反转录操作。 　　4.反转录 　　本实验目前采用两步法RT-PCR的方法进行诺如病毒的检测，因此首先将纯化的RNA进行反转录操作。采用M-MLV反转录试剂盒进行病毒RNA的反转录： 　　①取10μLRNA，2μL Rondom Primer(50uM)，5.5μL无Rnase的H2O，混匀后70℃热激5min并立即冰浴 　　②加入1μLM-MLV(200U/ul)，0.5μLRNA酶抑制剂(40U/μL)，5μL5×Buffer，1μL dNTP(10μmol/L)，共25μL混匀离心 　　③按以下程序进行反转录：30℃预处理10min，37℃反转录60min，最后70℃处理15min以灭活反转录酶等。 　　5.PCR检测 　　PCR检测的方法可分为定性检测与定量检测，而realtime PCR被引入到诺如病毒检测后，由于其灵敏度高、检测时间短、污染风险小等优点而被广泛使用。本实验室目前采用Taqman realtime-PCR方法进行诺如病毒的定量检测。 　　①采用国际上普遍使用的引物与探针 名称 引物序列 方向 QNIF2d ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA + COG2R TCGACGCCATCTTCATTCACA - QNIFS FAM- AGCACGTGGGAGGGGATCG -TAMRA QNIF4 CGCTGGATGCGNTTCCAT + NV1LCR CCTTAGACGCCATCATCATTTAC - NV1LCpr TGGACAGGAGAYCGCRATCT 　　②首先加入10 μL 2×PCR Mix，然后加入适当浓度的引物及探针，然后加入2 μL模板，最后ddH2O补足20 μL体系。 　　③按以下程序进行反应：94℃预变性10 s，然后94℃变性5 s，60℃延伸20 s，共循环45次。 图1 荧光定量PCR仪 图2 荧光定量PCR反应 　　5.对照设置 　　为了保证实验的准确性，在过程每一步均设立阳性对照与阴性对照。其中阴性对照均采用超纯水，而阳性对照分别为：PCR过程采用构建的标准质粒，RT过程采用标准质粒体外转录得到的标准RNA。 　　四、附图：Realtime PCR定量检测的标准曲线 图3 两步法Taqman RT-qPCR标准曲线 　　其中X轴为检测模板拷贝数的对数值，Y轴为qPCR检测的CT值。一般以CT值处于15~35之间为检测范围，对应的检测模板量约为102~108copies。 　　附：广东省微生物分析检测中心 　　广东省微生物分析检测中心是1999年经广东省机构编制委员会批准，在广东省微生物研究所的基础上成立，并于当年通过计量认证(CMA)，现隶属广东省科学院，在检测业务上接受广东省质量技术监督局领导。2004年，中心通过中国实验室国家认可委员会(CNAS)认可，是具有独立法人地位的第三方实检测验室。 　　主要对外业务包括：食品、保健品、饮料及饮用水检测 食品安全性检测与评价 农产品检测 药品、一次性使用医疗用品检测 化妆品、日化产品、卫生用品检测 防霉、抗菌、消毒产品及消毒器械的检测 玩具、电器、空气净化器、室内装饰装修材料检测 公共场所用具及包材检测 微生物菌剂的环境安全性测试和评价 水质检测 空气检测 菌种鉴定 微生物控制及检测培训与技术服务等。 　　检测中心自成立以来，业务遍及全国，具有很高的知名度和影响力。检测中心的科技人员积极跟踪国内外相关行业的国际标准、国家标准的制定、修订的发展情况，主持和参与了50多项国家标准、行业标准、地方标准的制修订工作。2006年被广东省科技厅批准为 “广东省食品安全检测与评价科技创新平台”食品微生物安全性检测与评价中心，并成为该平台建设的主要承担单位。2010年亚运会在广州举办之时，受邀参与“第十六届亚运会公共卫生保障合作实验室”，成为广州地区共同承担“亚运期间新发传染病、食物中毒等重大突发公共卫生事件实验室检验检测工作”的8家实验室之一。

近年来，随着科学技术的发展，隐身于细胞中数以万计的环形RNA逐渐浮出水面。但与已经被科学家反复深度剖析论证与人类生命活动密切相关的线形RNA相比，RNA分子家族的“新人”——环形RNA身上至今仍有许多未解之谜。当长链的核糖核酸（RNA）“变身”成环形RNA后，这些“重塑外形”的RNA是否连“内涵”也发生了脱胎换骨的变化？中国科学院生物化学与细胞生物学研究所陈玲玲研究组新的研究发现，环形RNA就像参与天然免疫系统调控稳定的“天使”一样，管理着抗病毒“卫士”——天然免疫因子PKR的活性。在细胞受到“害虫”——病毒感染时，“天使”环形RNA会被大规模“清除”从而释放抗病毒“卫士”PKR参与抗病毒免疫反应；而在抗病毒“卫士”PKR过度激活的自身免疫性疾病——系统性红斑狼疮疾病病人体内，环形RNA含量显著降低，无法作为天然免疫系统调控稳定的“天使”继续发挥功能。这一研究成果公布在4月25日Cell杂志上，文章通讯作者为生化与细胞所陈玲玲研究员，中国科学院-马普学会计算生物学伙伴研究所杨力研究员和上海交通大学医学院附属仁济医院沈南研究员。作者为刘楚霄、李响和南芳。铜钱草叶般的环形RNA的形状人类基因组序列中仅1-2%为蛋白质编码序列，而98%为非编码序列，其中很多是长非编码RNA及环形RNA。环形RNA是一类具有闭合环状结构的非编码RNA分子，这项新研究发现大部分环形RNA内部可形成16-26 bp的双链RNA茎环结构的独特“造型”。在正常细胞状态下，抗病毒“卫士”——天然免疫因子PKR结合并被束缚在“天使”环形RNA分子上。当病毒入侵细胞后，环形RNA会被核糖核酸酶L大规模“切割”降解，而环形RNA生成速度又很缓慢，不足以回补被降解分子，从而抗病毒“卫士”PKR免疫因子得以释放而进一步激活，引发一系列抗病毒的“连锁反应”。众所周知，系统性红斑狼疮是一种自身免疫性疾病，病人免疫系统中抗病毒“卫士”例如PKR等过度激活。研究人员通过检测红斑狼疮病人体内数据发现，在环形RNA降解中发挥重要“切割”功能的核糖核酸酶RNase L在病人体内处于“弱激活状态”，与之对应的是环形RNA普遍在病人体内数量很低，天然免疫因子PKR及其下游免疫信号通路则在体内过度激活“运转”。科研人员通过使用技术手段让环形RNA在病人来源的免疫细胞内数量增多，可以观察到过度激活“运转”的抗病毒“卫士”PKR及其下游免疫信号通路被显著“控制”，进一步提示环形RNA就像参与天然免疫系统调控稳定的“天使”一样，管理着抗病毒“卫士”PKR的活性。这些发现不仅首次揭示了环形RNA的降解途径及其特殊二级结构特征，并提示环形RNA作为之前被忽略的一类新RNA分子家族可以通过形成双链茎环结构发挥免疫调控的新功能。它们的“缓慢生成”、“快速降解”以及“形成茎环结构”的特性使得它们在调控免疫稳态过程中扮演重要角色。相关研究进展为环形RNA代谢和功能研究奠定了重要基础，也为红斑狼疮等自身免疫病的临床诊断和治疗提供了新思路。 该研究为环形RNA在天然免疫中的重要功能研究奠定基础，并为自身免疫病的临床诊断和治疗提供了新思路。原文标题：Structure and Degradation of Circular RNAs Regulate PKR Activation in Innate Immunity