显微镜成像原理

Park纳米科学原子力显微镜系列讲座培训一原子力显微镜在纳米研究中的应用：AFM的成像原理2021年5月25日(周二)北京时间下午3:30-4:30原子力显微镜(AFM)作为扫描探针显微镜家族的一员，具有纳米级的分辨能力，其操作容易简便，是目前研究纳米科技和材料分析的最重要的工具之一。此外原子力显微镜还具有摩擦性能，纳米机械性能和电学性能等高级性能。 在本研究中，我们将讨论接触模式、非接触模式和轻敲模式等原子力显微镜使用中的不同操作模式；内容将概括到从原子力显微镜测量中常用的原子相互作用的基本理论，到原子力显微镜的主要硬件组成。本讲座还将讨论各模式的关键点(如设定值、反馈)。 在接触模式下，系统会给探针恒定的力作为设定的基准点也就是设定点来物理接触样品。扫描期间为了维持这个设定点而进行反馈。在三种模式中，原理相对简单。然而，由于接触模式很容易对针尖和样品造成损伤。相比之下，非接触模式允许在不接触表面的情况下进行形貌测量。因此，可以很好地保护针尖和样品。轻敲模式与非接触模式原理相似，在扫描过程中，探针轻触样品表面，以获得测量材料属性分布的额外信息(例如模量分布)。 本次讲座主要针对AFM原理的基础知识，帮助大家了解探针和样品之间的相互作用。由三种模式测出的图像对比也将在讲座中呈现。报告人 : Park原子力显微镜应用科学家Chris Jung Chris Jung, is an Application Scientist for Park Systems Korea - Research Application Technology Center (RATC) department. He received his Master’s degree in Physics from the Kyung Hee University, and his Bachelor’s degree in Physics from Dankook University in South Korea. His major project includes Evaluation of Kelvin Probe Force Microscopy (KPFM) at the perspective of resolution.Park原子力显微镜系列讲座列表（5月-9月） 想了解更多详情，请关注微信公众号：Park原子力显微镜 400电话：400-878-6829 Park官网：parksystems.cn

【研究背景】扩展显微镜（ExM）是一种新兴的成像技术，因其能够在常规显微镜上实现纳米级分辨率成像而应用于生物学等多个领域。与传统的显微技术相比，ExM 具有操作简单、成本低廉和可视化生物分子的高效性等优点。然而，现有的 ExM 方法通常只能在有限范围内进行一次性扩展（约 4–10 倍）或通过迭代扩展步骤实现更大的扩展因子（约 15–20 倍），这给研究带来了操作繁琐和时间消耗等问题，因此提升了在单次扩展中获得高分辨率成像的挑战。近日，来自麻省理工学院（MIT）Y. Eva Tan神经技术教授爱德华博伊登（Edward Boyden）（光遗传学发明人之一，技术达人）和Laura L. Kiessling课题组合作在 ExM 研究中取得了新进展。该团队设计并制备了一种名为 20ExM 的新型扩展显微镜协议，通过单次扩展步骤实现了约 20 倍的线性扩展，成功获得了小于 20 纳米的分辨率。这一创新的方法在生物样本（如细胞和脑组织）中具有显著的应用潜力。利用 20ExM，研究人员能够显著提高对微管和突触蛋白等生物分子的成像精度，成功获取了在传统显微镜下难以观测的生物结构。这一研究成果不仅为生物成像提供了新的工具，还为生物分子的定量分析和定位研究奠定了基础，推动了生物学领域对细胞和组织内部复杂结构的深入理解。通过 20ExM，未来的生物医学研究将能够更加精确地揭示生物分子在生物系统中的功能，为疾病机制的研究和新型治疗策略的开发提供新的思路。【表征解读】本文通过扩展显微镜（ExM）的原理，具体来说，利用其各向同性的物理放大特性，首次研发了20ExM仪器。这种新型仪器在单次扩展步骤中实现了约20倍的扩展，并可在常规显微镜上达到小于20纳米的分辨率，从而能够表征和发现生物样本中微管和突触纳米柱的细微结构，最终揭示了生物分子在细胞和组织中的空间分布及其相互作用。本文针对细胞和组织中的生物分子定位和表征现象，通过20ExM技术的应用，进行了高分辨率成像分析，得到了在传统显微镜上难以实现的细微结构。这一方法简化了操作流程，避免了传统迭代扩展方法所需的多步处理，进而挖掘了生物样本中潜在的结构信息，提高了成像效率。研究表明，20ExM不仅支持后扩展的抗体染色，还可与现有信号放大技术结合，从而增强信号强度，提高成像质量。在此基础上，通过高效的表征手段，包括荧光染色和高温 SDS 软化等，研究者们着重研究了不同细胞和组织样本中的纳米结构。这一研究为理解生物分子在细胞内部的功能和作用机制提供了重要依据。同时，20ExM技术的推广应用也为原位 RNA 检测、基因组成像和多重蛋白组学等研究领域带来了新的可能性。总体而言，本文的仪器开发不仅推动了扩展显微镜技术的进步，还为生物学研究提供了更加便捷和高效的工具，具有广泛的应用前景。通过对细胞和组织中生物分子进行深入的空间分布研究，进一步揭示了细胞内复杂的生物过程，为未来的生物医学研究奠定了基础。单次扩展的20ExM参考文献：Wang, S., Shin, T.W., Yoder, H.B. et al. Single-shot 20-fold expansion microscopy. Nat Methods (2024). https://doi.org/10.1038/s41592-024-02454-9

第70届美国质谱年会（70th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics）于明尼苏达州（Minnesota）当地时间2022年6月5-9日（北京时间 2022年6月6-10日）在美国明尼阿波里斯市会议中心召开（Minneapolis Convention Center）。岛津在本次会议期间特别介绍了其于20年推出的质谱成像产品，iMScope QT。iMScope QT在保留高空间分辨率，显微镜等原有仪器特点的基础上，改善了检测灵敏度和速度，实现了速度、特异性、空间分辨率、灵敏度为一体的质谱成像分析。 iMScope QT是由显微镜-MALDI单元与LCMS-9030组合而成，显微镜-MALDI单元可移动分开使用，是成像质谱与LC-QTOF的兼用系统，用一台仪器可实现定性、定量、以及定位分析。不仅如此，与产品同步提供的基质涂敷自动喷雾系统，结合原有的iMLayer升华涂敷系统，提高成像灵敏度和空间分辨率。此外，岛津可提供从前处理到数据采集，软件分析的质谱成像的整体解决方案。使用一台质谱仪就能完成所有分析，通过叠加不同检测原理的图像以及不同离子化方法的数据进行分析，为成像分析提供全新的工具。仪器信息网将持续带来ASMS2022期间的最新质谱产品技术报道，敬请关注本话题。

【研究背景】单分子定位显微镜（SMLM）是一种超分辨率显微镜技术，广泛应用于生物学领域，用于研究细胞结构，能够突破衍射极限。然而，单分子取向定位显微镜（SMOLM）作为SMLM的多维变体，除了测量单个荧光分子的精确空间位置外，还可以测量其取向。这一能力提供了关于分子如何在其环境中组织、取向、旋转和摆动的信息，对于生物系统具有重要意义。然而，SMOLM的广泛应用受到复杂实验设备和计算上昂贵的图像分析方法的限制，降低了其在生物成像领域的可及性。近日，来自英国剑桥大学Ezra Bruggeman，Steven F. Lee教授课题组的研究团队在SMOLM领域取得了新进展，提出了一种简化的SMOLM方法，称为POLCAM。该方法基于偏振检测，使用偏振相机，可以轻松地在任何宽场荧光显微镜上实现。该团队的创新设计通过对光学设备的优化和对斯托克斯参数估计算法的开发，显著提高了单分子取向成像的速度，达到现有技术的1000倍以上，从而能够近乎实时地确定分子的各向异性。此外，为了促进POLCAM的应用，研究团队还开发了开源的图像分析软件和详细的硬件安装与软件使用指导网站。利用POLCAM，研究团队成功地研究了α-突触核蛋白纤维、哺乳动物细胞的肌动蛋白细胞骨架、成纤维样细胞以及活人T细胞的质膜。这一新方法的提出，不仅简化了传统SMOLM的实验流程，还通过降低设备复杂性和提高数据处理速度，为生物学中的分子取向研究提供了新的强大工具。POLCAM的实施，将为各类生物应用中的分子取向研究带来更大的便利和可能性。【仪器解读】本文通过对偏振成像原理的深入研究，首次研发了POLCAM偏振相机（POLCAM），这是一种集成了简单实现和易用性的创新型显微成像仪器。具体来说，POLCAM结合了宽场荧光显微镜和偏振成像技术，使得研究人员能够在无标记的情况下获取样本的多重信息，进而表征并发现了样本内部的微观结构和动态过程。这一仪器的开发，不仅为生物学研究提供了全新的视角，也为未来的多重成像技术的应用奠定了基础，最终揭示了在复杂生物系统中，细胞内分子的行为与相互作用。本文针对荧光成像与无标记显微技术之间的整合现象，通过对不同类型样本的综合分析，得到了多种生物样本在不同照明模式下的偏振成像特征。这些特征不仅提高了对生物样本内部结构的分辨率，还揭示了细胞内分子在不同生理条件下的动态变化。在此基础上，通过偏振相机与其他表征手段（如荧光成像、超分辨成像等）的结合，着重研究了细胞骨架在不同刺激条件下的响应机制及其与细胞功能的关系。此外，研究还展示了POLCAM在偏振成像方面的独特优势，使其能够在荧光标记和无标记技术之间实现有效的互补。这种结合不仅使得样本的成像过程更加高效，同时也为研究者提供了丰富的生物学信息，拓展了研究的深度和广度。最终，这项工作不仅为理解细胞内复杂的生物过程提供了强有力的工具，也为将来相关技术的开发与应用指明了方向。偏振相机的单分子成像参考文献：Bruggeman, E., Zhang, O., Needham, LM. et al. POLCAM: instant molecular orientation microscopy for the life sciences. Nat Methods (2024). https://doi.org/10.1038/s41592-024-02382-8

成像质谱显微镜iMScope QT作为岛津近年来高端质谱领域发布的重磅新产品，融合光学显微镜、MALDI和Q-TOF的显微质谱成像技术很让人期待！成像质谱显微技术研究物质的空间分布具有显著优势，既可以对样品进行形态学上的细微观察，也可以得到样品上特定部位的化学信息，在医学、药学、农业食品、公共安全、资源环境、工业等领域有着广泛的应用前景。 下面小编就给大家带来一份iMScope QT的详细图文测评报告，相信大家看过之后，对这款产品一定有了更深入的了解。 开箱初见 坐着飞机悄然落地实验室的大家伙终于迎来了开箱时刻，百闻不如一见，一起来体验一下吧！iMScope QT和MS-9030合体过程 岛津的成像质谱显微镜(Imaging Mass Microscope, iMScope QT)，前端是搭载高分辨光学显微镜的大气压基质辅助激光解吸电离源（Atmospheric Pressure -MALDI），后端配置四极杆飞行时间质谱仪（Q-TOF）。 将光学显微镜和质谱仪整合成一体，既可观察得到高分辨率的形态图像，又可以对特定分子进行鉴定和可视化分布分析，可将两种不同检测原理的图像进行重叠分析，为成像分析提供了全新的工具。 镜质合璧，还原真实 作为一台搭载了光学显微镜的质谱成像仪，两种不同检测原理的图像如何进行采集，图像重叠分析时又会碰撞出怎样的火花呢？ 在下图中是从光学图像中选择肝门静脉进行质谱成像分析，可以清晰观察到肝门静脉周边的血脂和脂质的分布。 多角度测评环节正式开始 下面请随着小编从分辨率、扫描速度、灵敏度等几个角度进行测评。 空间分辨率“高清镜头”下的微观世界 作为一款搭载了光学成像镜头和质谱成像功能的仪器，iMScope QT的光学显微镜物镜最大可达到40倍率又结合质谱成像显微镜5μm空间分辨率，究竟能够将研究视野深入到什么样的微观水平呢？小编拿来了大家关注的亚细胞水平的组织器官，看看iMScope QT能观察到微观世界哪些变化。 以槲皮素为例，iMScope QT成功观察到其在肝脏部位的细胞水平分布，分析结果表明药物主要分布在细胞间质，充分显示了成像质谱显微镜分析亚细胞水平的可靠性。高空间分辨率对于药物动态分析、安全性评估和毒性机制的阐明，以及视网膜和皮肤等特殊组织的分析中都具有重要意义。 扫描速度快速制图“小能手” iMScope QT这款产品拥有超高质谱空间分辨率给细胞水平上的研究带来便利，但是小编担心如果没有快速的扫描速度作保障，在大面积样本成像时会消耗很长的时间才能完成分析。带着疑虑，小编准备了小鼠全脑切片（14ⅹ7mm），空间分辨率采用20 μm，扫描区域245000pix，2.6小时后我们获得一张高清晰度小鼠脑成像图。与同类质谱成像产品比，iMScope QT能够高速、高效地采集到高清晰度的质谱成像图。 小鼠脑成像质谱图 灵敏度“火眼金睛”看切片 质谱成像中高灵敏度分析也是至关重要的，尤其在药物代谢研究中对低浓度代谢物分布的研究。iMScope QT在硬件性能上较之前作了较大提升，后端Q-TOF型LCMS-9030的接入提高了质谱检测的灵敏度。在本次开机测评中，小编分析了给药后的大鼠肺中抗心律失常药物胺碘酮及其代谢物的分析，明确了药理学研究中的发现是胺碘酮副作用引起。给药后的大鼠肺部病理切片分析发现坏死区域质谱成像发现抗心律失常药物胺碘酮及其代谢物在坏死区域的分布，明确了药理学研究中的发现是胺碘酮副作用引起。 系统扩展性成像定位分析与液质分析的完美兼容 cope QT不仅局限在成像分析，成像单元支持移动分开和组装使用，小编实验室就是将已有LCMS-9030的Q-TOF单元与成像单元连接后使用，确实可以实现质谱成像分析和LCMS-9030的兼用系统，既可以用于准确定性定量分析，也可以完成可靠的定位分析。 结语 整体而言，成像质谱显微镜iMScope QT将光学显微镜和质谱仪整合成一体既可观察到高分辨率的形态图像，为成像分析提供了全新的工具。在拥有高空间分辨率同时，还能高速扫描，高效获得高质量成像数据。同时还能保持系统的拓展性，通过一台仪器即可获得LC-MS的定性、定量信息和质谱成像的位置信息。期待iMScope QT能够为国内相关科研工作者们的研究带来帮助，落地开花结出硕果。 撰稿人：宋玉玲

相机显微镜是一种将显微镜与专业显微镜相机结合在一起的设备，用于拍摄和记录显微镜下的图像。不仅能够帮助我们观察到微观世界，还能进行参数设置和数据采集，提供定量和定性的数据，也可以将图像投射到大屏幕上，供多人观察与分析，方便多人共览分析，是实验教学、科学研究及医学检验的理想工具。显微镜摄像头MHD800相机显微镜在生命科学领域的应用非常广泛，应用于细胞生物学、分子生物学、遗传学、免疫学等多个领域。例如，在细胞生物学中，显微镜成像系统可以用于观察细胞的结构、形态和功能，以及细胞之间的相互作用。在分子生物学中，显微镜成像系统可以用于观察DNA、RNA和蛋白质等分子的结构和功能。通过测量细胞的大小、形状和数量，我们可以了解细胞生长和分化的规律。通过观察蛋白质的分布和数量，我们可以了解蛋白质的功能和调控机制。明慧MingHui显微镜数码成像系统界面明慧MingHui显微镜数码成像系统功能特点：高分辨率：能够捕捉到更清晰、更准确的图像。自动对焦和自动曝光功能：能够快速准确地捕捉到目标物体。多种观察模式：如明场、暗场、微分干涉、荧光、偏光等，可以满足不同实验需求。配备分析软件：可以对图像进行定量和定性分析，为科学研究提供有力支持。应用广泛：适用于生命科学、医学、材料科学等多个领域的研究。产品清单：显微图像分析软件相机显微镜如果您需要一整套显微镜成像系统或者已有的显微镜需要升级拍照功能和安装，请与我们联系。

简 介 为广大科研工作者、公共平台管理人员系统了解激光共聚焦显微镜的成像原理和高阶操作技巧，获得高质量、可靠及可重复性的实验数据并提高图像采集效率，避免数据图像采集误区，由清华大学生物医学测试中心细胞生物学平台主办，徕卡显微系统上海（贸易）有限公司协办，将于2024年6月27日-29日在清华大学举办第一期显微成像高阶培训班，为广大用户提供共聚焦多维度成像技术解决方案。 本次培训班主要分为理论报告和上机实操两部分，理论报告包含共聚焦原理与多色成像解决方案、荧光寿命成像与FLIM-FRET以及STED超高分辨显微镜的样品制备及成像解决方案等内容；讨论部分重点关注1）光学成像中常见的实验设计问题并提出改进方案，2）光学显微镜故障问题的排除与解决方案。上机实操主要包含xyztλτ多维度图像采集、激发/发射荧光光谱扫描与光谱拆分、荧光寿命成像以及显微镜硬件组成及故障排查等内容。 “显微镜成像高阶培训系列-共聚焦多维度成像技术解决方案”为广大师生提供交流学习机会，欢迎大家踊跃报名！期待与您相聚清华大学！ 培训时间： 2024年6月27日-29日（周四至周六） 培训地点： 清华大学 医学科学楼C119 培训设备： 1. 激光共聚焦显微镜Leica STELLARIS 8 Falcon； 2. 受激发射损耗超高分辨率共聚焦显微镜Leica SP8 gSTED 3X 一 日程安排 二 注册与缴费 1. 本次培训线下开展，费用1500元/人，上机实操费、试剂耗材费、茶歇、会议纪念品等。参会期间交通费、餐饮及住宿费自理。 2. 为保证实操质量与效果，本次限报15人，以实际缴费时间为准，先到先得。上机实操每人可携带一份样品进行上机观察。 3. 注册时间： 2024年6月27日（周四）9:00 4. 报名截止时间： 2024年6月24日（周一） 三 报名方式 访问链接： http://sapphireking.mikecrm.com/9s2r8Om 或扫描二维码： 四联系方式 细胞生物学平台 孙老师 sunyue#mail.tsinghua.edu.cn 细胞生物学平台 崔老师 clh2021#mail.tsinghua.edu.cn （发送邮件时请将“#”改为“@”） 清华大学生物医学测试中心 徕卡显微系统上海（贸易）有限公司 北京清科创信教育科技有限公司 徕卡显微咨询电话：400-630-7761 关于徕卡显微系统 徕卡显微系统的历史最早可追溯到19世纪，作为德国著名的光学制造企业，徕卡显微成像系统拥有170余年显微镜生产历史，逐步发展成为显微成像系统行业的领先的厂商之一。徕卡显微成像系统一贯注重产品研发和最新技术应用，并保证产品质量一直走在显微镜制造行业的前列。 徕卡显微系统始终与科学界保持密切联系，不断推出为客户度身定制的显微解决方案。徕卡显微成像系统主要分为三个业务部门：生命科学与研究显微、工业显微与手术显微部门。徕卡在欧洲、亚洲与北美有7大产品研发中心与6大生产基地，在二十多个国家设有销售及服务分支机构，总部位于德国维兹拉(Wetzlar)。

2019年11月28日-11月30日 ，由中国科学院苏州生物医学工程技术研究所主办，江苏省医用光学重点实验室承办的第二届先进光学显微成像培训班圆满结束。本次培训分为超分辨显微成像成果报告和显微镜操作培训，培训内容涉及激光干涉 SIM 显微镜技术、流式光片技术、DMD-SIM 显微镜技术、STED 显微镜技术等。滨松作为会议赞助方，为最后的实操评比准备了丰厚的奖品。其中，在超分辨显微成像技术各成果报告中，华中科技大学黄教授专门讲解了滨松科研级相机的进化史，以及在大视场超分辨定位成像中的应用。滨松工程师郑一哲博士发表了《先进光学显微成像中的探测》的报告，报告中结合应用介绍了光电倍增管（PMT）和sCMOS 相机这两类在先进光学显微成像技术中应用最为广泛的滨松产品，包括其原理，以及在应用中的特点。华中科技大学黄振立教授报告：《大视场超分辨定位成像技术》滨松工程师郑一哲博士报告：《先进光学显微成像中的探测》分组培训期间，滨松展示了由科研相机“ORCA”家族的新生代ORCA-Fusion，与分光附件W-View GEMINI搭建而成的成像系统，展示了滨松针对双色成像应用的整体解决方案。ORCA-Fusion于2018年底推出，其具备优秀的噪声控制能力，读出噪声最低至0.7e(rms)，且QE/读出噪声的比值高至1.14 。此外，亦继承了ORCA家族一如既往的高帧速性能（ 100帧/秒 @470万像素；89.1帧/秒 @530万像素）。现场受到与会者们的广泛关注。

“我们开创了受激拉曼光热成像[1]这个全新的方向，这是化学成像领域的一个新突破，这项技术未来一定会发展成为能够被广泛应用的产品。”美国波士顿大学程继新教授如是说。图丨程继新（来源：程继新）在这次研究中，程继新团队利用一种新的物理机制，即受激拉曼本质上是一个化学键振动吸收过程，吸收的能量变成热形成焦点局部升温，升温改变焦点周围样品的折射率。由此，他们开发出受激拉曼光热（Stimulated Raman Photothermal，SRP）显微镜。该技术突破了此前受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering，SRS）成像的检测极限，将调制深度提高了 500 倍，极高的调制深度为更高灵敏度的检测奠定了基础。那么，与 SRS 相比，SRP 有哪些不同呢？具体来说，SRS 显微镜直接测量光被吸收后强度的变化，并提供光谱和空间信息；而 SRP 显微镜则是测量由样品热膨胀引起的光散射或由热透镜引起的折射，观察样品本身的温度、折射率等变化，进而提供光谱和空间信息。化学成像技术能够“追踪”细胞中的分子信息，但该领域最大的瓶颈之一是灵敏度。SRS 显微镜在揭示复杂系统中的分子结构、动力学和耦合方面显示出巨大的潜力。然而，由于其较小的调制深度和脉冲激光的散粒噪声，SRS 的灵敏度难以突破毫摩尔级，这导致其无法对低浓度分子的观察及对相关信息的追踪。此外，不可忽视的是，在使用 SRS 成像时，研究人员必须使用高倍物镜来收集信号。如果想得到高分辨成像，就必须将两个高倍物镜挤在一起，这在操作上带来极大的不便。而 SRP 的优势在于操作简单、方便，只需要低倍物镜就能够测量相关信号，且检测物镜和样品之间可以保持一定的距离。由于 SRP 显微镜非常灵敏，可以通过它观测不同的分子、不同的化学键，填补了该领域的数据空白。该技术有望应用于环境科学、材料科学、生命科学等领域，例如环境中微塑料检测、绘画作品成份分析、病毒单颗粒谱学、单细胞和生物组织成像等。一次“因祸得福”的聚会开启了一个新方向该技术背后的科研故事要从一次“因祸得福”的聚会说起。2021 年，在程继新 50 岁生日时，举办了一次课题组聚会，其中的主题之一是篮球比赛。组内成员博士研究生朱一凡在运动时不小心受伤了，因此需要在家休养 2 个月。于是，程教授交给他一个计算方面的任务：在受激拉曼散射成像时，聚焦焦点的温度变化具体是多少？根据朱一凡的模拟结果，在大概 10 微秒的时间里，相关温度上升了 2 至 3 摄氏度，这个结果很快引起了程教授的高度关注。“这个范围的瞬态温度变化不会损害细胞。于是，我们开始探索拉曼效应用于光热显微镜这个全新的方向。”程继新说。图丨SRP 显微镜设计（来源：Science Advances）从计算方面确定了温度升高的数据，那么，如何在实验上证实温度升高呢？研究人员想到，可以用对温度很敏感的荧光染料来做温度计。具体来说，把荧光染料加入样品，在受激拉曼激发的同时进行荧光测量。实验结果证明荧光强度呈下降趋势，以此在实验上确认了受激拉曼导致的温度升高（如下图）。图丨受激拉曼光热效应的理论模拟和实验观察（来源：Science Advances）但是，荧光测试是有标记的测量，而他们更想通过无标记（label-free）的方式测量光热信号。于是，研究人员用“第三束光”测折射率的变化，可以在纯液体中得到同样的信息，而且这种做法不受脉冲激光噪音的影响。最终，他们突破了此前 SRS 成像的检测极限，将调制深度提高 500 倍。组内成员博士研究生殷嘉泽以中红外光热显微镜（Mid-infrared photothermal microscopy）为主要研究方向，于 2021 年发展了一种新方法，用快速模数转换直接提取光热信号[2]。该方法同样适用于 SRP 显微镜，从而有效地提高了其检测灵敏度。图丨生物样品在水溶液环境中的 SRP 成像（来源：Science Advances）此外，组内成员博士研究生戈孝伟为本次开发 SRP 显微镜提供了 SRS 的实验基础。由此可见，研究是一个逐渐积累的过程，并需要团队成员发挥各自的优势，这充分体现了“众人能移万座山”的精神。图 丨相关论文（来源：Science Advances）近日，相关论文以《受激拉曼光热显微镜实现超灵敏化学成像》（Stimulated Raman photothermal microscopy toward ultrasensitive chemical imaging）为题发表在 Science Advances [1]。波士顿大学博士研究生朱一凡为该论文第一作者，程继新教授为论文通讯作者。16 年磨一剑1999 年，程继新在香港科技大学从事第一个博士后研究，他选择了一个技术较为成熟的研究方向——超快光谱学（ultrafast spectroscopy）。同年，诺贝尔化学奖颁予飞秒时间分辨的超快光谱学技术。2000 年，他加入国际单分子生物物理化学的奠基人之一、哈佛大学谢晓亮教授（现北京大学李兆基讲席教授）课题组，从事第二个博士后研究。在那里，程继新和其他同事开发了可实现高速振动光谱成像的相干反斯托克斯拉曼散射（coherent anti-Stokes Raman scattering，CARS）显微镜。2014 年，诺贝尔化学奖颁予超分辨率荧光显微技术。但是，荧光显微镜不能解决生物成像领域中所有的问题，例如，荧光染料标记会改变胆固醇、氨基酸等小分子的生物功能。因此，生命科学需要无荧光染料标记的分子成像技术。程继新表示，“选键成像很好地解决了分子选择性的问题，其不仅能看到各种分子，又不需要对分子进行荧光染料标记。”梦想很美好，现实却充满挑战。能不能通过发明新技术，去做荧光显微镜做不到事情？“继新”人如其名，从学生时代就喜欢啃“硬骨头”的他，继续探索。博士后研究工作结束后，程继新于 2003 年来到美国普渡大学任教，在那里，他将分子光谱学与生物医学工程融合，致力于化学成像这一新兴领域。2007 年，该课题组报道了一个有趣的发现：由于受激拉曼增益和损耗，一部分能量从光子转移到分子[3]。因为脉冲式的能量吸收可以产生声波，该发现促使其团队开发出受激拉曼光声显微镜（stimulated Raman photoacoustic microscope）。然而，由于当时的光声测量不是很灵敏，他们没测到受激拉曼光声信号。幸运的是，在一个意外的实验中，他们发现了基于泛频激发的光声信号[4]，并开发了检测血管内壁胆固醇的振动光声内窥镜。图丨中红外光热选键成像的原理（左）及产品展示图（右）（来源：程继新）为寻找增强化学键成像信号的方法，他们再次调整研究方向。通过“thinking out of the Raman box”，开启了中红外高分辨光热成像这一全新的方向。由于分子振动吸收的能量在皮秒的时间尺度上全部转化为热能，程继新意识到，光热效应可以用来“看”细胞里的化学键。2016 年，他们报道了高灵敏度中红外光热显微镜 (Mid-infrared photothermal microscope)，突破性地实现中红外超分辨三维动态成像。通过用可见光来测量光热效应，该技术能够以亚微米分辨率“看见”活细胞中的化学组分，首次使单细胞红外显微成像成为可能[5]。2017 年，程继新加入波士顿大学担任光学中心的 Moustakas 光学及光电子学讲席教授。他的团队致力于精准医学光子学技术的研发，研究覆盖了化学成像、神经调控、光学杀菌等三个方向。其课题组在全球首次通过光声信号来刺激、调节神经细胞（如下图）。最近，他们设计了一种用于无创神经刺激的高精度（0.1 毫米）光致超声器件，并在小鼠模型成功验证，第一次利用非遗传途径进行超高精度的无创神经调节[6]。此外，他们还发明了一种通过光解色素来杀死抗药性超级细菌的方法[7]。图丨光致超声神经刺激工作原理图和横向声场压强分布（来源：程继新）程继新认为，真正原创的工作不是被设计出来的，而是实现了从来没想过会发生的事情。“原创的科学是由直觉推动的，并得益于长期不懈的努力和积累，所谓的‘突破’其实是一个量变到质变的过程。”他总结道。不止于科学技术的创新，在推进技术产业化落地的过程中，更是让他感叹“应用范围超乎了最初的想象”。据悉，程继新拥有 30 多项国际专利，并作为联合创始人或科学顾问参与了多项技术的产业化。2015 年，基于分子振动光声技术，程教授和学生们共同创立了 Vibronix Inc.，该公司致力于振动成像技术研发和医疗设备创新，现位于苏州工业园区。2018 年，作为科学顾问参与建立了光热光谱公司（Photothermal Spectroscopy Corp.）。该公司位于美国加州，基于程教授的中红外光热成像专利开发了一款名为“海市蜃楼（mIRage）”的显微镜，寓意为“信号来自于折射率的变化”。据了解，该产品目前已销往世界各地百余实验室。2019 年，程继新联合创立了 Pulsethera 公司，旨在通过内源发色团的光解作用杀死超级细菌。2022 年，程继新成为法国巴黎 AXORUS 公司的科学顾问，该公司致力于光声神经刺激技术的医学转化。谈及技术的推进产业化落地的经验，程继新表示，在发展某项技术时，可能最开始只聚焦在生命科学领域的某个细分方向，但将技术真正发展为产品，其应用范围之广可能是当初没有想到的。他举例说道：“mIRage 现在被应用在半导体领域，用来检测芯片中的污染。芯片中的污染多数是有机物，因此能够通过化学键成像来检测芯片的质量，这完全超乎了我的想象。”图丨2023 年 8 月，程继新课题组的部分成员合影于首届化学成像 Gordon Research Conference（来源：程继新）回顾三十年的科研之路，程继新认为，最有回味的事情是每个阶段都有新惊喜。化学成像领域每经过大约 8 年就要进行一次技术革新，从 1999 年的 CARS 显微镜到 2008 年的 SRS 显微镜，到 2016 年的中红外高分辨光热成像，再到 2023 年的 SRP 技术。“几年前还觉得是天方夜谭的事情，都通过发明新的技术实现了，由此一步步将领域发展向前推进。”程继新说。下一步，该团队将继续发展无荧光标记的化学成像，进一步提升灵敏度，同时发展深组织的高分辨化学成像技术。他们希望，能够利用高能量的激光器将 SRP 的灵敏度提升到接近于荧光显微镜的微摩尔级别。同时，他们计划尽快将该技术发展为产品。据悉，美国加州的Photothermal Spectroscopy Corp.及中国苏州的威邦震电公司（Vibronix Inc.）正在推进相关的产业化进程。从 2007 年观测到受激拉曼过程的能量转移，到 2023 年报道 SRP 显微镜，对程继新来说，这是一次历经 16 年的科研旅程。在本次的 SRP 论文发表后，他在朋友圈这样写道：“科学很酷，生命短暂。我的下一个 16 年会是什么样呢？”

近年来，光学成像技术如荧光分子成像、光声成像和生物发光成像等广泛应用于小动物活体成像。同时，多模态成像技术的兴起将多种成像技术结合，为小动物活体成像提供了更精确和信息丰富的工具。为帮助广大用户及时了解小动物活体成像前沿技术、产品与整体解决方案，仪器信息网特别制作【小动物活体成像技术创新突破进行时】专题，并策划“小动物活体成像技术”主题征稿活动，以期进一步帮助广大用户从多维度深入了解小动物活体成像技术应用、主流品牌、市场动态以及相关内容。本期约稿特别邀请超维景生物科技有限公司研发总监胡炎辉，就小动物活体成像技术发展、市场规模及未来趋势进行分享，并就超维景生物科技在面对小动物自由运动活体成像瓶颈取得的突破性进展。 本期嘉宾：胡炎辉，超维景生物科技有限公司 研发总监 胡炎辉，超维景生物科技有限公司研发总监。2018年毕业于北京大学，电路与系统专业，曾参加基金委国家重大仪器专项，负责逻辑控制、微弱信号探测及系统设计，在激光扫描显微成像、微弱信号探测及高速信号处理等技术方向有着多年的积累。2017年至今，作为超维景核心创始团队成员之一，参与公司技术专利20余项，开发了新一代双光子成像处理平台，推出了科研、医疗等多款多光子产品，具有丰富的产学研融合开发及落地经验。——01—— 从单光子到多光子成像，推动活体成像技术发展在医学和生命科学研究的领域内，不断的革新和突破在成像技术方面是推进科学发展的关键，同时也是推动新的生物学发现和进步的重要引擎。其中，多光子成像技术通过激光与生物样本内的分子和原子相互作用产生荧光反应，以荧光显微的形式，允许我们以无损害的方式直接观察到组织的内部结构。尽管生物样本本身对光有较好的透光性，它们也具有强烈的散射特性。通常，细胞水平的高分辨成像技术在生物组织中的穿透深度“软极限”大约为1mm。不过，使用更长波长的激光可以减小对光的散射，并且增强穿透力。多光子吸收提供了一种非线性的荧光激活方法，其中双光子和三光子吸收的波长分别是单光子激发的两倍和三倍。与单光子相比，多光子成像可以实现几乎10倍的成像深度增强。这种非线性激发方法也带来了更高的信号-背景比及更优秀的层析成像能力。所有这些成像上的优势使得多光子成像特别适合用于复杂条件下的活体成像研究，成为一种在这些应用中非常重要的工具。Winfried Denk于1990年在康奈尔大学发明了世界上第一台双光子激光扫描显微镜。而自21世纪初以来，随着超快激光技术的突破及商业化，双光子显微成像技术迅速成为最广泛使用的活体动物成像方法。特别值得提及的，超维景的创始人程和平院士早在1992年就开始涉足双光子显微技术，成为最早的技术参与者之一，并致力于推广这一技术。历经近三十年的发展，双光子显微成像技术已变得在脑科学研究中不可或缺。尽管传统的台式双光子显微镜分辨率高，但它们体积庞大且重量重，需将实验动物固定或麻醉以完成成像，因此无法适用于自由活动的动物。微型单光子成像技术可以实现对自由活动的小鼠进行成像，但它在分辨率和对比度方面相对较低，难以达到亚细胞级别的分辨率和三维成像效果。——02——直面脑科学研究自主研发工具挑战，2.2克微型化双光子显微镜“轻装上阵”打造用于全景式解析脑连接和功能动态图谱的研究工具是当代脑科学的一个核心方向。针对如何在自由行为动物上绘制大脑神经元功能图谱的难题，超维景团队研发出了头戴式2.2克微型化双光子显微镜，首次实现自由活动小鼠大脑神经元和突触水平钙信号功能成像，为脑科学研究提供了革命性的新工具。这项技术解决了困扰领域近20年的挑战，显著领先于美国脑计划催生的微型化单光子技术，入选“2017年度中国科学十大进展”，并被评为Nature Methods“2018年度方法”。依托此技术建成“南京脑观象台”，为中国脑计划提供了“人无我有”的支撑平台；专利技术的产业转化实现高端显微成像装备自主创制的突破，完成对欧美国家的整机出口，累计实现销售额过亿元。通过技术拓展，研发了应用于人体的手持式双光子显微镜，在临床医学与航天医学中具有巨大的应用前景。为病理诊断技术带来一种全新的手段，成为临床疾病精准检查的重要工具。这项技术成果属于国家基金委重大仪器专项转化的科技成果，是国家在高端装备研发方向投入的典型产出代表。除了在脑科学、医疗应用领域的技术贡献之外，同时彰显了中国也可利用具有自主知识产权的国际领先的技术，实现在高端仪器方向的突破，提振了中国科学家在高端仪器装备方向的研究信心，并以此为核心技术来推动国内以及国际的科学研究大计划，对国内的脑科学研究领域也起到积极引领作用。——03——深耕小动物自由运动活体成像，持续提升核心竞争力超维景公司始创于2016年，公司核心力量来自北京大学院士创建和领导的多学科交叉团队，是一家专注于高端生物医学成像设备研发、生产和销售的国家高新技术企业。2017年，超维景核心团队成功研制仅2.2g的超高时空分辨微型化双光子显微镜，在国际上首次获取了小鼠在自由行为过程中大脑皮层神经元和神经突触活动的动态图像，被评为“2017年度中国科学十大进展”和《Nature Methods》“2018年度方法”（无限制行为动物成像），开启自由活动动物成像新范式，研究成果可应用于脑认知基本原理研究、脑重大疾病机理研究和脑疾病的药物研究，本技术进一步可应用于临床实时在体无创细胞级检测。部分获奖照片“微型化”是指将显微镜做到拇指大小，可以佩戴在小鼠头上，同时不影响小鼠的自由活动，进而观察小鼠在觅食、社交、睡觉等自主行为时大脑神经元的真实活动和功能连接。超维景的微型化显微镜体积微小，让小鼠能够“戴着跑”，实现了自由行为动物的清晰稳定成像，可用于在动物觅食、跳台、打斗、嬉戏、睡眠等自然行为条件下，或者在学习前、学习中和学习后，观察神经突触、神经元、神经网络等的动态变化，从而获取小鼠在自由行为过程中大脑神经元和神经突触活动的动态图像。2.2g微型双光子荧光显微镜2021年，团队的第二代微型化双光子显微镜将成像视野扩大了7.8倍，同时具备获取大脑皮层上千个神经元功能信号的三维成像能力，原始论文发表于《Nature Methods》。2023年2月，团队将微型化探头与三光子成像技术结合，成功研制微型化三光子显微镜，重量仅为2.17克，并在 《Nature Methods》 发表文章。一举突破了此前微型化多光子显微镜的成像深度极限，首次实现对自由行为小鼠的大脑全皮层和海马神经元功能成像，为揭示大脑深部结构中的神经机制开启了新的研究范式。 《Nature Methods》发表相关技术成果2023年2月，神州十五号航天员乘组使用由我国自主研制的空间站双光子显微镜开展在轨实验任务并取得成功，是目前已知的世界首次在航天飞行过程中使用双光子显微镜获取航天员皮肤表皮及真皮千层的三维图像，为未来开展航天员在轨健康监测研究提供了全新工具。图为神舟十五号航天员乘组在轨使用空间站双光子显微镜2023年12月，由超维景公司自主研发的在体双光子显微成像系统获批上市，是中国首个基于双光子显微成像原理的医疗器械。本次研发是首次实现脑科学技术跨学科助力皮肤检测的技术应用，将最前沿的双光子显微成像技术引入现代皮肤医学检测领域，实现“实时、无创、在体、原位、无标记”的高分辨率皮肤细胞及胞外组织三维成像，为患者和医生带来便利。——04——布局微型化多光子产品体系，开启自由行为动物显微成像新范式解析脑连接图谱和功能动态图谱是我国和世界多国脑计划的一个重点研究方向，但传统的多光子显微镜进行常规脑成像通常需要将动物的头部固定在台式显微镜上，这严重限制了模式动物的自由生理状态。为此需要打造自由行为动物佩戴式显微成像类研究工具。基于团队及技术发明，超维景已布局微型化多光子成像产品体系，并成功实现多款产品的产业化，包括SUPERNOVA-100一体式微型化双光子显微镜、SUPERNOVA-600集成式微型化双光子显微镜与SUPERNOVA-3000微型化三光子显微镜等，解决了困扰领域近20年的挑战，显著领先于美国脑计划催生的微型化单光子技术。超维景微型化多光子显微成像系列产品，可以在微观尺度上、不干扰自由运动动物行为的前提下，对大脑神经元和神经突触进行无创性观察和实时、动态成像，为研究神经科学、行为学、认知科学等多个领域提供了新的视角和手段，从而为脑健康研究开辟新的道路。树突棘成像 单树突棘级分辨率 神经元轴突与亚细胞结构成像 ——05——持续加码小动物自由运动活体成像系统“科研+临床”的广阔应用脑科学机理研究。大脑是一个极度复杂的器官，目前，各国脑科学计划的一个核心方向就是打造用于全景式解析脑连接图谱和功能动态图谱的研究工具。其中，如何打破尺度壁垒，融合微观神经元和神经突触活动与大脑整体的信息处理和个体行为信息，是领域内亟待解决的一个关键挑战。要想实现动物在体脑功能实时成像的研究，能够观察到整个皮层甚至更为深入的其他脑区，涉及到仪器开发、手术技术、生物研究等等不同的方面领域，技术挑战非常大。为了真正解密大脑的工作原理和流程，人们需要在对大脑神经元高分辨成像的同时，被观察者能够自由的正常活动，也就是最理想的脑功能成像需要被观察者在自由运动状态下进行脑功能观测。脑疾病机理研究。目前一些重要的脑疾病，如自闭症、精神类疾病、老年痴呆症等都是全世界的难题。以老年痴呆症为例，根据得病率统计，85岁以上老人中的 50%患有老年痴呆。预计到2050年，中国将有近1亿患者的生活需要照顾、需要医疗系统的救助，这是严重的社会负担。通过本技术对脑科学疾病研究，如果有新发现，对于老年痴呆症，就可能找到早期诊断的方法，早发现、早干预，把严重症状出现期从85岁延缓到95岁，社会负担就可以大大减轻，提高国民生活质量。神经药物筛选。微型化双光子显微镜不仅可以“看得见”大脑工作的过程，还将为可视化研究自闭症、阿尔茨海默病、癫痫等脑疾病的神经机制发挥重要作用。而此类疾病的药物开发，由于缺少快速直接的药效反馈手段，而大大受阻。微型化双光子技术的应用将极大的推动此类神经疾病药物的开发进程，为人类脑疾病的诊断和治疗提供新的手段。携手全球合作伙伴，携手共谋发展。微型化多光子成像系统已获得国内的上亿元订单，以及国外的数千万元订单。其中，国内用户包括北京大学、中科院上海神经所、中科院深圳先进技术研究院、复旦大学、上海交通大学、西湖大学、中山大学、华南理工大学、南京脑观象台等。国外用户包括加州理工、纽约大学、德国马普神经所、德国波恩大学、德国马普鸟类研究所等。未来，超维景将在多光子显微成像技术继续深挖“科研+临床”的广阔应用，这将作为神经探索领域的引路明灯，照见更多未知的领域。参考文献：• Zhao, C., et al. (2023). Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection. Nat Methods, 2023 Apr 20(4):617-622.• Zong, W., et al., Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nat Methods, 2021. 18(1): p. 46-49.• Zong, W., et al., Fast high-resolution miniature two-photon microscopy for brain imaging in freely behaving mice. Nat Methods, 2017. 14(7): p. 713-719.

p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 8月10日23点， i Nature Biotechnology /i 在线发表了由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室研究员王凯研究组完成的题为《共聚焦光场显微镜对小鼠和斑马鱼大脑快速体成像》的研究论文。该研究发展了一种新型体成像技术：共聚焦光场显微镜(Confocal light field microscopy)，可以对活体动物深部脑组织中神经和血管网络进行快速大范围体成像。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 跨脑区大规模的神经元如何整合信息并影响行为是神经科学中的核心问题，解答这一问题需要在更高时空分辨率上捕捉大量神经元活动动态变化的工具。共聚焦显微镜和双光子显微镜等运用于活体脑成像的传统工具基于点扫描，时间分辨率较低，难以研究大范围脑区中神经元的快速变化。因此，近年来科研人员一直致力于开发更快的成像方法。在多种新技术中，光场显微镜具有潜力，得到广泛关注，其特点在于可以在相机的单次曝光瞬间，记录来自物体不同深度的信号，通过反卷积算法重构出整个三维体，实现快速体成像，在线虫、斑马鱼幼鱼等小型模式动物上已获得初步应用。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 传统光场显微镜存在两个难以解决的问题，限制了其在生物成像上的应用。首先，重构的结果会出现失真。2017年，王凯研究组研发的新型扩增视场光场显微镜（eXtended field-of-view Light Field Microscopy, XLFM）解决了这一问题，并应用于自由行为斑马鱼幼鱼的全脑神经元功能成像上，首次三维记录了斑马鱼幼鱼在完整捕食行为中的全脑神经元活动的变化。其次，现有光场显微成像技术缺乏光学切片能力，无法对较厚组织，如小鼠的大脑进行成像。让光场显微镜具有共聚焦显微镜一样的光学切片能力，滤除大样品中焦层之外的背景信号来提高信噪比，是提高成像质量、可广泛应用的关键所在。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 然而，传统共聚焦显微镜采用激光逐点扫描和共轭点针孔检测来降低焦面外噪声的策略不适用于三维光场显微镜。面对这一挑战，研究团队创新提出广义共聚焦检测的概念，使其可以与光场显微镜的三维成像策略结合，在不牺牲体成像速度的前提下有效滤除背景噪声，提高了灵敏度和分辨率。这种新型的光场显微成像技术称为共聚焦光场显微镜。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 研究团队在不同动物样品上测试了共聚焦光场显微镜的成像能力。团队成员对包埋的活体斑马鱼幼鱼进行全脑钙成像，对比共聚焦和传统光场显微镜的成像结果，发现加入光学切片能力后，图像分辨率和信号噪声比提高，可以检测到更多较弱的钙活动。进一步的，将共聚焦光场显微镜和高速三维追踪系统结合，对自由行为的斑马鱼幼鱼进行全脑钙成像，在ø 800 μm x 200 μm的体积内达到2 x 2 x 2.5 μm sup 3 /sup 的空间分辨率和6Hz的时间分辨率。受益于更高的分辨率和灵敏度，可以识别出斑马鱼幼鱼在捕食草履虫过程中单个神经元的钙离子活动的变化。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 团队成员验证了共聚焦光场显微镜对小鼠大脑的成像效果，对清醒小鼠的视皮层进行钙成像，可以同时记录ø 800 μm x 150 μm的体积内近千个神经元的活动，最深可达约400 μm，且连续5小时以上稳定记录超过10万帧，没有明显的光漂白。团队成员进一步尝试使用共聚焦光场显微镜对鼠脑中的血细胞进行成像，深度可达600 μm，拍摄速度70 Hz，同时记录上千根血管分支中群体血细胞的流动情况并计算血细胞的速度，相比之前的传统成像方法通量提高了百余倍。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 研究团队在自由行为的斑马鱼幼鱼和小鼠大脑上证明了共聚焦光场显微镜有更高的分辨率和灵敏度，为研究大范围神经网络和血管网络的功能提供了新的工具。同时，该技术不仅适用脑组织的成像，还可以根据所需成像的样品种类灵活调整分辨率、成像范围和速度，应用在其他厚组织的快速动态成像中。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 研究在王凯的指导下，主要由博士研究生张朕坤、白璐，以及助理研究员丛林共同完成。王凯研究组余鹏、张田蕾，中国科学技术大学本科生石万卓，杜久林研究组李福宁做出贡献，研究员杜久林参与合作并给予指导意见。研究得到中科院脑智卓越中心实验动物平台的支持。研究工作受到科技部、中科院、国家自然科学基金委员会和上海市的资助。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/9bfa0661-24ad-4d0d-9ccd-10db465617c7.jpg" title=" 图1.jpg" alt=" 图1.jpg" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 图1.（上）共聚焦光场显微镜原理示意图。（下）不同于传统光场显微镜，共聚焦光场显微镜采用片状照明，选择性激发样本的一部分，在垂直照明的方向上扫描，采集到的信号被遮挡板过滤掉焦层范围之外的部分。对采集到的图像进行重构可以得到焦层内的三维信息。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/28e2bd6d-59f5-4ff1-8085-355f6d295cbf.jpg" title=" 图2.jpg" alt=" 图2.jpg" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 图2.（左）斑马鱼幼鱼捕食行为的一个例子。0s 为斑马鱼吞食草履虫的时刻。（右）左图斑马鱼捕食行为中，共聚焦光场显微镜记录到的两个不同脑区的神经元活动。箭头所指为过程中激活的单个神经元。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/c26412e7-a408-4c67-8533-1c5a118fdb4b.jpg" title=" 图3.jpg" alt=" 图3.jpg" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(68, 68, 68) font-family: 微软雅黑 background-color: rgb(255, 255, 255) " 　 /span 图3.（左）共聚焦光场显微镜拍摄得到的小鼠视皮层中的复杂血管网络。6个在不同深度拍摄的体积连接为一个深度达600 μm的三维结构。（中）100 μm到250 μm深度血管网络的平面投影，颜色代表不同血管分支中血细胞的平均流速。（右）图中箭头所指的区域中五个血管分支在一段时间内流过血细胞数量的计数。 /p

自1965年第一台商品扫描电镜问世以来，经过50多年的不断改进，扫描电镜的分辨率已经大大提高，而且大多数扫描电镜都能与X射线能谱仪等附件或探测器组合，成为一种多功能的电子显微仪器。在材料领域中，扫描电镜发挥着极其重要的作用，可广泛应用于各种材料的形态结构、界面状况、损伤机制及材料性能预测等方面的研究，如图1所示的纳克微束FE-1050系列场发射扫描电镜。图1 纳克微束FE-1050系列场发射扫描电镜场发射扫描电镜组成结构可分为镜体和电源电路系统两部分，镜体部分由电子光学系统、信号收集和显示系统以及真空系统组成，电源电路系统为单一结构组成。1.1 电子光学系统由电子枪、电磁透镜、扫描线圈和样品室等部件组成。其作用是用来获得扫描电子束，作为信号的激发源。为了获得较高的信号强度和图像分辨率，扫描电子束应具有较高的亮度和尽可能小的束斑直径。1.2 信号收集检测样品在入射电子作用下产生的物理信号，然后经视频放大作为显像系统的调制信号。1.3 真空系统真空系统的作用是为保证电子光学系统正常工作，防止样品污染，一般情况下要求保持10-4~10-5Torr的真空度。1.4 电源电路系统电源系统由稳压，稳流及相应的安全保护电路所组成，其作用是提供扫描电镜各部分所需的电源。图3为扫描电镜工作原理示意图，具体如下：由电子枪发出的电子束在加速电压（通常200V～30kV）的作用下，经过两三个电磁透镜组成的电子光学系统，电子束被聚成纳米尺度的束斑聚焦到试样表面。与显示器扫描同步的电子光学镜筒中的扫描线圈控制电子束，在试样表面的微小区域内进行逐点逐行扫描。由于高能电子束与试样相互作用，从试样中发射出各种信号（如二次电子、背散射电子、X射线、俄歇电子、阴极荧光、吸收电子等）。图3 扫描电镜的工作原理示意图这些信号被相应的探测器接收，经过放大器、调制解调器处理后，在显示器相应位置显示不同的亮度，形成符合人类观察习惯的二维形貌图像或者其他可以理解的反差机制图像。由于图像显示器的像素尺寸远大于电子束斑尺寸，且显示器的像素尺寸小于等于人类肉眼通常的分辨率，显示器上的图像相当于把试样上相应的微小区域进行了放大，而显示图像有效放大倍数的限度取决于扫描电镜分辨率的水平。早期输出模拟图像主要采用高分辨照相管，用单反相机直接逐点记录在胶片上，然后冲洗相片。随着电子技术和计算机技术的发展，如今扫描电镜的成像实现了数字化图像，模拟图像电镜已经被数字电镜取代。扫描电镜是科技领域应用最多的微观组织和表面形貌观察设备，了解扫描电镜的工作原理及其应用方法，有助于在科学研究中利用好扫描电镜这个工具，对样品进行全面细致的研究。转载文章均出于非盈利性的教育和科研目的，如稿件涉及版权等问题，请立即联系我们，我们会予以更改或删除相关文章，保证您的权益。

这里是TESCAN电镜学堂第三期，将继续为大家连载《扫描电子显微镜及微区分析技术》(本书简介请至文末查看)，帮助广大电镜工作者深入了解电镜相关技术的原理、结构以及最新发展状况，将电镜在材料研究中发挥出更加优秀的性能！第四节 各种信号与衬度的总结前面两节详细的介绍了扫描电镜中涉及到的各种电子信号、电流信号、电磁波辐射信号和各种衬度的关系，下面对常见的电子信号和衬度做一个总结，如图2-36和表2-4。图2-36 SEM中常见的电子信号和衬度关系表2-4 SEM中常见的电子信号和衬度关系第五节 荷电效应扫描电镜中还有一种不希望发生的现象，如荷电效应，它也能形成某些特殊的衬度。不过在进行扫描电镜的观察过程中，我们需要尽可能的避免。§1. 荷电的形成根据前面介绍的扫描电镜原理，电子束源源不断的轰击到试样上，根据图2-6，只有原始电子束能量在v1和v2时，二次电子产额δ才为1，即入射电子和二次电子数量相等，试样没有增加也没减少电子，没有吸收电流的形成。而只要初始电子束不满足这个条件，都要形成吸收电流以满足电荷的平衡， i0= ib+is+ia。要实现电荷平衡，就需要试样具备良好的导电性。对于导体而言，观察没有什么问题。但是对于不导电或者导电不良、接地不佳的试样来说，多余的电荷不能导走，在试样表面会形成积累，产生一个静电场干扰入射电子束和二次电子的发射，这就是荷电效应。荷电效应会对图像产生一系列的影响，比如：① 异常反差：二次电子发射受到不规则影响，造成图像一部分异常亮，一部分变暗；② 图像畸变：由于荷电产生的静电场作用，使得入射电子束被不规则偏转，结果造成图像畸变或者出现阶段差；③ 图像漂移：由于静电场的作用使得入射电子束往某个方向偏转而形成图像漂移；④ 亮点与亮线：带点试样经常会发生不规则放电，结果图像中出现不规则的亮点与亮线；⑤ 图像“很平”没有立体感：通常是扫描速度较慢，每个像素点驻留时间较长，而引起电荷积累，图像看起来很平，完全丧失立体感。如图2-37都是典型的荷电效应。图2-37 典型的荷电效应§2. 荷电的消除荷电的产生对扫描电镜的观察有很大的影响，所以只有消除或降低荷电效应，才能进行正常的扫描电镜观察。消除和降低荷电的方法有很多种，这里介绍一下常用的方法。首先，在制样环节就要注意以便减小荷电：1） 缩小样品尺寸、以及尽可能减少接触电阻：这样可以增加试样的导电性。2）镀膜处理：给试样镀一层导电薄膜，以改善其导电性，这也是使用的最多的方法。常用的镀膜有蒸镀和离子溅射两种，常用的导电膜一般是金au和碳，如果追求更好的效果，还可使用铂pt、铬cr、铱ir等。镀导电膜不但可以有效的改善导电性，还能提高二次电子激发率，而且现在的膜厚比较容易控制，一定放大倍数内不会对试样形貌产生影响。不过镀膜也有其缺点，镀膜之后会有膜层覆盖，影响样品的真实形貌的，严重的话还会产生假象，对一些超高分辨的观察或者一些细节（如孔隙、纤维）的测量以及eds、ebsd分析产生较大影响。如图2-38，石墨在镀pt膜后，产生假象；如图2-39，纤维在镀金之后，导致显微变粗，孔隙变小。图2-38 石墨镀金膜之后的假象图2-39 纤维在镀金前（左）后（右）的图像除了制样外，还要尽可能寻找合适的电镜工作条件，以消除或减弱荷电的影响：3） 减小束流：降低入射电子束的强度，可以减小电荷的积累。4） 减小放大倍数：尽可能使用低倍观察，因为倍数越大，扫描范围越小，电荷积累越迅速。5） 加快扫描速度：电子束在同一区域停留时间较长，容易引起电荷积累；此时可以加快电子束的扫描速度，在不同区域停留的时间变短，以减少荷电。6） 改变图像采集策略：扫描速度变快后，图像信噪比会大幅度降低，此时利用线积累或者帧叠加平均可以减小荷电效应同时提升信噪比。线积累对轻微的荷电有较好的抑制效果；帧叠加对快速扫描产生的高噪点有很好的抑制作用，但是图像不能有漂移，否则会有重影引起图像模糊。如图2-40，样品为高分子球，在扫描速度较慢时，试样很容易损伤而变形，而快速扫描同时进行线积累的采集方式，试样完好且图像依然有很好的信噪比。图2-40 高分子球试样在不同扫描方式下的对比7）降低电压：减少入射电子束的能量（降至v2以内）也能有效的减少荷电效应。如图2-41，试样是聚苯乙烯球，加速电压在5kV下有明显的荷电现象，降到2kV下荷电基本消除。不过随着加速电压的降低，也会带来分辨率降低的副作用。图2-41 降低加速电压消除荷电影响8）用非镜筒内二次电子探测器或者背散射电子探测器观察：在有大量荷电产生的时候，会有大量的二次电子被推向上方，倒是镜筒内二次电子接收的电子信号量过多，产生荷电，尤其在浸没式下，此时使用极靴外的探测器，其接收的电子信号量相对较少，可以减弱荷电效应，如图2-42；另外，背散射电子能量高，其产额以及出射方向受荷电的影响相对二次电子要小很多，所以用bse像进行观察也可以有效的减弱荷电效应，如图2-43，氧化铝模板在二次电子和背散射图像下的对比。图2-42 镜筒内（左）和镜筒外（右）探测器对荷电的影响图2-43 SE（左）和BSE（右）图像对荷电的影响9） 倾转样品：将样品进行一定角度的倾转，这样可以增加试样二次电子的产额，从而减弱荷电效应。 除此之外，电镜厂商也在发展新的技术来降低或消除荷电，最常见的就是低真空技术。低真空技术是消除试样荷电的非常有效的手段，但是需要电镜自身配备这种技术。10）低真空模式：低真空模式下可以利用电离的离子或者气体分子中和产生的荷电，从而在不镀膜或者不用苛刻的电镜条件即可消除荷电效应。不过低真空条件下，原始电子束会被气体分子散射，所以分辨率、信噪比、衬度都会有一定的降低。如图2-44，生物样品在不镀导电膜的情况下即可实现二次电子和背散射电子的无荷电效应的观察。图2-44 低真空BSE（左）和SE（右）的效果对比福利时间每期文章末尾小编都会留1个题目，大家可以在留言区回答问题，小编会在答对的朋友中选出点赞数最高的两位送出本书的印刷版。奖品公布上期获奖的这位童鞋，请您关注“TESCAN公司”微信公众号，后台私信小编邮寄地址，我们会在收到您的信息并核实后即刻寄出奖品。【本期问题】低真空模式下，空气浓度高低对消除荷电能力的强弱有什么影响？（快关注微信去留言区回答问题吧~）简介《扫描电子显微镜及微区分析技术》是由业内资深的技术专家李威老师（原上海交通大学扫描电镜专家，现任TESCAN技术专家）、焦汇胜博士（英国伯明翰大学材料科学博士，现任TESCAN技术专家）、李香庭教授（电子探针领域专家，兼任全国微束分析标委会委员、上海电镜学会理事）编著，并于2015年由东北师范大学出版社出版发行。本书编者都是非常资深的电镜工作者，在科研领域工作多年，李香庭教授在电子探针领域有几十年的工作经验，对扫描电子显微镜、能谱和波谱分析都有很深的造诣，本教材从实战的角度出发编写，希望能够帮助到广大电镜工作者，特别是广泛的TESCAN客户。↓ 往期课程，请关注微信查阅以下文章：电镜学堂丨扫描电子显微镜的基本原理(一) - 电子与试样的相互作用电镜学堂丨扫描电子显微镜的基本原理(二) - 像衬度形成原理

组织透明化和光片显微镜诞生的必要性生物组织的三维特性使得生命科学的研究都需基于3D空间信息而进行分析，如脑部神经投射、血管分布以及肿瘤微环境等。传统组织学检测包括对冰冻或者石蜡包埋的组织样本进行切片，从而产生微米级别的切片，研究者可以对该切片进行免疫组化染色从而获得细胞层面信息。生物学家早就认识到组织薄切片比厚组织观察起来更加容易，显微切片机将组织切割成微米厚度的二维切片，通过二维切片我们可以获得单细胞层面的信息(Richardson & Lichtman, 2015)。但是三维组织结构可以让人们全面理解器官在正常功能和病理状态下的关键信息，例如神经系统就迫切需要进行三维结构的成像，因为大多数单个神经元向许多方向延伸，它们的真实性质和功能无法通过二维切片来确定；此外，发育生物学需要在三维结构上才能更好的认识器官甚至整个动物的形态发生(Chung et al., 2013)。因此获取完整生物组织在单细胞分辨率尺度上的三维结构一直是生命科学领域的重要目标之一。怎样才能获得组织的三维层面信息？一种方法是通过将一系列连续的切片输入电脑进行三维结构重建，但是这种方法在技术上具有挑战性，因为组织在此过程会被撕裂、折叠、压缩或拉伸从而导致组织某个部分的损失或变形，由于剖面不完整，最终的体积重建可能无法还原最原始的三维结构(Oh et al., 2014)。还有一种方法是使用光学切片技术进行整体成像，比如激光共聚焦、双光子显微镜和转盘显微镜等成像显微镜的使用，这些成像显微镜可以对小组织进行三维结构成像，但是这些现代的显微技术没办法解决组织太厚带来的严重速度滞后问题，以及强激光造成的光漂白、光毒性等问题。光学成像与细胞荧光标记相结合，因其具有良好的空间分辨率和高信噪比，是收集器官或组织单细胞分辨率信息的实用方法之一。然而，组织不透明是全组织和全器官光学成像的主要障碍之一，因此要进行光学成像就要进行组织透明化。那么是什么原因导致组织不够透明？在组织中，生物物质如水、脂类、蛋白质和矿物质通常以不均匀的混合物存在，它们的不均匀分布导致光发生强烈的横向散射，此外，生物物质有时会在细胞内外形成不均匀的结构，包括脂质颗粒和细胞器（如线粒体）、大的蛋白质簇（如胶原纤维）、甚至全细胞体积（如红细胞），当光被分子、膜、细胞器和组织中的细胞反射时，本来应该以直线传播的光线会发生多次偏移，因此光不能直接穿过组织从而形成光的散射(Tuchin, 2015 Wen, Tuchin, Luo, & Zhu, 2009)。组织不透明的另一个原因是光的吸收，血红蛋白、肌红蛋白和黑色素是生物组织中吸收可见光的主要分子，血红蛋白存在于所有脊椎动物（除了鳄鱼、冰鱼）和许多无脊椎动物中，样品内的光吸收可以限制激发光进入组织和荧光发射返回到探测器(Richardson & Lichtman, 2015)。正是由于光的散射和光的吸收，导致光的分布加宽、光的强度衰减，特别是在组织的深层区域，最终导致组织不透明，无法进行全组织三维结构光学成像。因此，组织透明化的目的主要是减少光的散射和吸收，以获得更好的光学成像效果（图1）(Gracie Vargas, 2001)。图1 实现组织透明化的关键步骤 (Susaki & Ueda, 2016)当光穿过组织时，由于脂质、色素的存在，导致光发生散射和吸收，从而组织不透明；组织透明化最主要的目的是通过脱脂、脱色等步骤从而减少光的吸收和光的散射。三种组织透明化方法类型：有机溶剂型、水溶剂型、水凝胶型经科学家的不断研究和突破，多种组织透明化方法相继被提出和优化。组织透明步骤包括：①样本固定；②样本透化（依据组织特性选择脱脂、脱钙、脱色、脱水或水化）；③折射率匹配。有机溶剂型透明化方法还涉及到组织脱水过程，根据组织成像需要还要涉及到样本免疫标记(图2)(Almagro, Messal, Zaw Thin, van Rheenen, & Behrens, 2021)；为了避免组织发生形变以及检测目标丢失，在透明化之前必须进行样本固定，但是固定程度需要控制，如果固定太弱，组织会软榻，如果固定过头，会阻碍免疫标记；一般使用多聚甲醛（PFA）、戊二醛（GA）进行组织固定，PFA可以均匀的固定大于500微米直径的样品，GA比PFA固定效果好，但是速度慢（分子较大，扩散速度慢），SWITCH方法通过改变pH提高GA效率，GA一般适合固定脆弱以及蛋白表达较弱的组织；在组织切片中我们通过抗原修复减少醛固定时造成的抗原表位封闭（二硫键），在水性透明化方法SHIELD采用聚甘油-3-聚缩水甘油醚（P3PE）既能固定组织又能保存蛋白质；透化过程中用到的试剂主要有三种类型：①有机溶剂；②高水化试剂；③脱脂试剂；随后用高折射率的物质替换组织液体进行折射率匹配，实现组织透明。(Park et al., 2018)。图2 组织透明化基本流程(Almagro et al., 2021)(a) 不同来源样本获取。(b) 用不同方式（去垢剂、醇类化学试剂、电泳）增加组织通透性。(c) 组织标记（抗体、染料、凝集素）以及透明化（有机溶剂型透明化方法、水溶剂型透明化方法）。(d) 组织成像（三维数据、定量分析）。依据各透明化方法中使用的溶剂及其作用原理将现有的组织透明化方法主要分为三类：有机溶剂型、水溶剂型、水凝胶型（图3）(Matryba et al., 2020 Ueda et al., 2020b)。基于有机溶剂的组织透明化方法通过使用高折射率（RI）的有机溶剂将不同成分的RI均质，从而获得极好的组织透明度。BABB组织透明化方法可以完全透明胚胎和幼鼠大脑(Dodt et al., 2007)，但该方法中乙醇脱水作用会导致内源性GFP信号淬灭，无法透明有髓组织。通过引入四氢呋喃（THF）和二苄醚（DBE）, 3DISCO能够实现大多数成年啮齿动物器官的良好透明度，并将FPs保存几天，虽然DBE能有效保护内源荧光信号，但是DBE降解产物如过氧化氢、醛类物质会对荧光蛋白产生有害干扰(Erturk et al., 2012)。与3DISCO相比，uDISCO能够实现全身透明化和成像，并在数月内保持内源性FPs(Pan et al., 2016)。a-uDISCO是uDISCO的改良版本，通过调节pH条件提高荧光强度和稳定性(Li, Xu, Wan, Yu, & Zhu, 2018)。然而，uDISCO和a-uDISCO都不能有效的透明化高度着色的器官和硬组织。为了解决这些限制，赵瑚团队开发了聚乙二醇(PEG)相关溶剂系统(PEGASOS)，该系统可以透明所有类型的组织，同时保留内源性荧光(Jing et al., 2018)。朱丹教授团队通过温度和pH值调节开发了一种基于3DISCO，称为FDISCO，FDISCO有效的保存了FPs和化学荧光示踪剂，并允许在几个月内重复拍摄样品(Qi et al., 2019)。最近开发的sDISCO通过添加抗氧化剂稳定DBE，进一步保留了荧光信号。蛋白质也可以通过免疫标记来观察。由Renier等人开发的iDISCO可以对小鼠胚胎和成年器官进行全贴装免疫标记和体积成像(Renier et al., 2014)。vDISCO是一种基于纳米体的全身免疫标记技术。该技术将FPs的信号强度增强了100倍以上，并揭示了Thy1-GFP-M小鼠的全身神经元投射(Cai et al., 2019)。虽然有机溶剂方法表现出出色的透明性能，并实现了亚细胞分辨率的全身成像，但也存在一些不足，例如样品的大幅收缩、大多数有机溶剂的毒性和荧光蛋白的猝灭。由于油性透明化方法存在诸多缺点，水性透明化方法诞生，水性与油性透明化方法最大区别在于水性试剂具有强亲水性，更有利于荧光信号的保存，适用于自带荧光的组织样本进行透明化。水性透明化试剂主要包括：单纯浸泡透明化和高水化脱脂透明。ClearT是基于甲酰胺的浸泡型透明化方法，速度快，但是会导致组织膨胀且荧光信号会淬灭。PEG可以稳定蛋白质构象，继而发展了可保留荧光蛋白的ClearT2透明化技术，但该方法透明度比ClearT低。SeeDB技术以果糖和硫代甘油为主要成分，可以在几天内将组织透明化，但果糖粘度过高导致组织内渗透性低，在此基础上衍生出FRUIT透明化方法，尿素的使用降低了果糖粘度，提高试剂流动性和渗透性。浸泡型透明化方法不能去除脂质，因此样本透明度有限。SDS、Triton X-100可以有效去除脂质，水化法通过在透明化过程中去除脂质，利用水化作用降低样本折射率进而实现组织透明化。Scale技术利用尿素水化作用进行透明化，可保留荧光信号，但该方法操作时间较长，易导致组织破碎。CUBIC在Scale基础上添加了胺基醇，可以去除血红素使组织脱色,也可以保留荧光信号(Tian, Yang, & Li, 2021)。水凝胶解决了高浓度去垢剂导致样本形变的问题，水凝胶与样本中蛋白质和核酸分子形成共价连接便可以固定和保护细胞结构。水凝胶型组织透明化方法是一种基于水凝胶的组织透明化方法，利用丙烯酰胺凝胶将生物分子固定在它本来的位置，用水凝胶来替换组织中的脂类，让溶液中的单体进入组织，然后对其稍微加热，上述单体开始凝聚为长分子链，在组织中形成高分子网络，这一网络能够固定组织的所有结构，但不会结合脂类，随后快速将脂类抽出，便获得了完整透明的立体组织，如脑组织中的神经元、轴突、树突、突触、蛋白、核酸等都完好的维持在原位。这种独特的组织脱脂方法能够最小化结构破坏和生物分子损失。该方法的脱脂方式主要有两种：电泳和简单被动脱脂，均能有效去除脂质，从而大大提高了水凝胶组织的光学透明度和大分子通透性(Chung et al., 2013 Treweek et al., 2015)。CLARITY透明化方法利用凝胶包埋样本，并利用电场力去除脂质使样本快速透明；SHIELD通过环氧化物P3PE固定组织实现蛋白的保护，之后使用SDS进行被动或主动脱脂。水性透明化方法虽然可以部分解决荧光蛋白易淬灭的问题，但是也存在透明时间长，透明能力低的缺点，一般适用于小样本组织透明化。水凝胶透明化方法操作过程复杂，且需要一定的设备。图3 组织透明化方法的主要类型 (Ueda et al., 2020b)(A) 有机溶剂型透明化方法通过使用有机溶剂依次将组织进行脱水、脱脂、折射率匹配，在短时间内可使组织完全透明。然而，有机溶剂会快速漂白荧光蛋白的信号并且使组织皱缩。(B) 水溶剂型透明化方法以水溶性试剂对组织依次进行脱色、脱脂、折射率匹配，从而使组织完全透明。该方法具有更高的生物安全性和兼容性。(C) 水凝胶型透明化方法通过凝胶将生物分子固定在原来的位置，随后对组织进行脱色、脱脂、折射率匹配操作，从而使组织透明。基于水凝胶的方法可以保留足够的RNA用于分析，如荧光原位杂交；由于水凝胶网会固定组织，因此会使组织体积扩大几倍。组织透明化方法的选择（对于不同检测目标、不同组织、含有特定化学成分的组织选择的组织透明化方法以及试剂不同）组织透明化从2014年兴起以来，前期主要在神经科学领域广泛应用，随着透明化方法的不断改进，目前在发育生物学、免疫学、肿瘤学研究中也被广泛应用。检测目标不同，透明化方法中的试剂选择不同，水凝胶适用于不稳定分子如RNA的保存，CLARITY方法中用到的化学试剂单丙烯酰胺或双丙烯酰胺对细胞内部结构进行很好的固定，使得在后期脱脂等处理后组织内部结构依然保持；常用的样本固定试剂是甲醇，在使用过程中可以较好的固定蛋白质（表1）(Almagro et al., 2021)。表1 不同试剂适用于不同检测目标(Almagro et al., 2021)水性试剂蔗糖和尿素对内源性荧光试剂、脂类试剂比较友好；而有机溶剂苄醇-苯甲酸苄酯(BABB)会造成脂质洗脱和蛋白质荧光基团淬灭，所以不能用于脂肪组织的检测；聚乙二醇(PEG)是有机溶剂型透明化方法PEGASOS中用到的试剂，可以有效保护内源性荧光；此外在有机溶剂型透明化方法中可以通过调节pH、温度达到保护荧光的效果，如FDISCO在四氢呋喃(THF)中，维持碱性pH和低温下，EGFP荧光信号可以维持数月（表2）。此外，免疫标记中使用的小分子染料（如细胞核染料DAPI、碘化丙啶、RedDot和SYTO）、凝集素、抗体对目标进行标记，其中抗体被动扩散速度非常慢，免疫染色可以通过优化抗体浓度、温度、孵育时间等提高染色效率；我们也可以通过减小样品体积、用小分子荧光染料代替抗体增强染色效果。也可以通过改变荧光标记的亲和属性如SWITICH方法，让它们在组织中自由扩散再进行结合；通过电泳的方式也可以提高染色效率(Almagro et al., 2021)。 表2不同试剂对于荧光信号的保留(Almagro et al., 2021)此外，某些组织中含有较难去除的成分如色素、脂肪，其中血红素是组织中较难去除的色素，仅仅通过灌注PBS不足以去除肾脏、心脏、肌肉、肝脏中的血红素，可以选择含有漂白剂成分的试剂进行脱色如双氧水，并且能去除自发荧光，但是过氧化物处理会损伤目标荧光蛋白，所以荧光标记一般在漂白之后进行；前列腺和乳腺富含脂肪，会阻碍抗体进入、光线穿透，可以选择含有去垢剂成分的组合如TritonX-100、SDS、CHAPS等进行脱脂，去污剂可以破坏脂质双层使组织形成可以运输出组织的胶束，SHANEL方法中的CHAPS能生成较小的胶束，能更快的从组织中析出，具有有效的去脂效果。当组织较大时，被动去脂速度就比较慢，这时可以通过电泳的方式加快进程；电泳组织透明设备（ETC）和随机电子迁移（使用旋转电场或在单向电场内旋转样品）可以加速去脂。其它类型组织如硬组织骨骼，其中含有的钙化矿物质阻碍光的穿透，50%-70%的骨骼由遍布蛋白基质的钙化羟基磷灰石（HAP）晶体组成，这时可以选择含有钙螯合剂组合的方法如乙二胺四乙酸（EDTA）中性缓冲液，进行脱钙处理（表3）(Almagro et al., 2021)。表3不同试剂对于细胞组分去除(Almagro et al.,2021)组织透明化方法的应用范围不同组织在透明化方法的选择上都有所不同，根据组织成分、检测目标、组织类型选择不同的透明化方法，下表是不同透明化方法在不同健康以及肿瘤组织上的应用实例，对于组织在选择方法的时候可以借鉴这些实例，从而更好的避开长时间的摸索（表4）。表4 不同透明化方法应用到不同肿瘤组织举例(Almagro et al., 2021)此外，利用组织透明化方法可以实现人类器官三维成像（图4）(Ueda et al., 2020a)。图4 人类胚胎组织以及器官透明化三维结构图(Ueda et al., 2020a)(a) 胚胎周围神经三维图像。(b) 泌尿系统中的肾脏和Wolffian管。(c) 胚胎背部、手臂、头部肌肉。(d)手部脉管系统。(e)手部三种感觉神经。(f)肺上皮小管。参考文献Almagro, J., Messal, H. 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iMScope QT保留岛津质谱成像的高空间分辨率和光学显微镜融合特点的同时，连接 LCMS-9030，以MALDI-Q-TOF提高成像速度和灵敏度。iMScope QT还可以把显微镜-MALDI单元简单地分离和组装，实现了一台仪器多用途使用，从而完成定性，定量，定位的整体流程。iMScope QT 主要特点：显微镜观察和质谱成像分析的融合。高分辨率光学显微镜完美地融合在成像质谱仪，可对微小区域进行观察和分析，通过叠加光学显微镜图和质谱成像图，更准确地进行定位。高空间分辨率，高速，高精度，高效率的成像分析。使用5 μm空间分辨率，20,000 Hz的激光频率，结合LCMS-9030的快速检测系统，成像分析速度可达到50像素/秒，分析100 x 100像素的图像仅需数分钟即可完成。LCMS-9030高性能的MS/MS分析，可快速提供目标分子的结构信息和高特异性成像数据。一台质谱即可获得LC-MS的定性、定量信息和质谱成像的位置信息。iMScope QT成像单元和LCMS-9030质谱单元可以组装和分离，轻松实现质谱成像分析和LC-Q TOF定性定量分析的切换，同时满足定量成像分析的需求。?创新点：1.光学显微镜和质谱仪精准融合，可分析亚细胞水平的5um高空间分辨率图像 2.激光频率为20kHz,质谱仪的MS、MS/MS扫描速度均为100Hz，整体的成像速度可达50像素/秒以上 3.成像单元可简单移动分开和组装使用，可实现质谱成像分析和LC-QTOF定性定量分析的兼用系统 4.后端质谱仪为 Q TOF型LCMS-9030，提高了质谱检测灵敏度 成像质谱显微镜

2020年7月9日，岛津企业管理（中国）有限公司（以下简称：岛津）“镜质合璧，还原真实”成像质谱显微镜新品线上发布会成功举办。在发布会上，岛津向中国市场推出全新的成像质谱显微镜iMScope系列新品，为医学、生物学以及药物等研究领域高水平科研实验室再添利器。 岛津分析计测事业部市场部部长 胡家祥 岛津分析计测事业部市场部部长胡家祥为本次发布会致辞。胡家祥首先对参与岛津iMScope QT线上新品发布会的专家老师表示欢迎与感谢。并表示，岛津自1875年创业以来，始终坚持“以科学技术向社会做贡献”的创业宗旨，秉承“为了人类和地球的健康”这一经营理念，不断开拓创新，推出符合市场需求的高科技产品。 自1997年范德堡大学（Vanderbilt University）的Richard Caprioli等提出用质谱实现分子成像的概念以来，质谱成像技术飞速发展，广泛应用于医学研究、生物学研究、药物研究等诸多领域。为了满足质谱成像市场的需求，岛津全新推出了成像质谱显微镜iMScope QT，以更快的速度和更高的灵敏度完成定性、定量、定位整套分析流程。 iMScope QT是显微镜和质谱仪完整融合的独特产品，也是质谱成像和LC-QTOF兼容的复合系统，非常期待这款产品可以成为各位专家高水平研究工作中的好帮手。 北京大学化学与分子工程学院刘虎威教授 北京大学化学与分子工程学院刘虎威教授为本次发布会致辞。刘虎威表示，岛津的仪器技术在不断的发展，北京大学分析测试中心在2017年采购了岛津上一代的成像质谱显微镜产品，2020年岛津乘胜追击推出了新一代的成像质谱显微镜产品，新产品在原来的功能上做出了很大的改进，使其功能更加全面。既可以荧光成像，也可以质谱成像，还可以做多级质谱分析。 此外，全新的iMScope QT产品还可以与LC-MS/MS联用，是一款为科研人员量身打造的功能强大的仪器。最后，刘虎威表示希望岛津能够为中国的科研人员带来更好的产品和更加全面的服务。 iMScope QT新产品揭幕 岛津分析计测事业部市场部生命科学产品负责人韩美英博士带来新产品的技术介绍报告，岛津上一代成像质谱显微镜 iMScope TRIO 是光学显微镜与质谱仪完整融合的成像系统，既可以对样品进行形态学上的细微观察，又可以对特定的分子进行鉴定和可视化分布分析。iMScope TRIO 广泛应用于各种研究领域，包括医学研究，药学领域，农业和环境领域等。 新产品iMScope QT在保留高空间分辨率，显微镜等原有仪器特点的基础上，改善了检测灵敏度和速度，实现了速度、特异性、空间分辨率、灵敏度为一体的质谱成像分析。iMScope QT是由显微镜-MALDI单元与LCMS-9030组合而成，显微镜-MALDI单元可移动分开使用，是成像质谱与LC-QTOF的兼用系统，用一台仪器可实现定性、定量、以及定位分析。 不仅如此，同时发售基质涂敷自动喷雾系统，结合原有的iMLayer升华涂敷系统，提高成像灵敏度和空间分辨率。 此外，岛津可提供从前处理到数据采集，软件分析的质谱成像的整体解决方案。使用一台质谱仪就能完成所有分析，通过叠加不同检测原理的图像以及不同离子化方法的数据进行分析，为成像分析提供全新的工具。 随后，北京大学分析测试中心的聂洪港博士带来了题为《成像质谱显微镜应用进展》的报告，北京大学分析测试中心是国内第一台iMScope TRIO用户，聂洪港博士根据他在脂质组学、质谱成像、敞开式质谱分析领域中的经验，已开展了多种样品的分析。本次报告中聂博士介绍了岛津成像质谱显微镜相关技术在植物、动物和临床样品的分析和检测应用的部分工作进展。 发布会最后的专家报告由大阪大学工学研究科的新间秀一副教授带来精彩的分享，新间教授根据多年的成像质谱工作经验，在报告中介绍了iMScope TRIO在新领域中的应用成果。通过改善样品制备方法，提高目标化合物在组织切片上的离子化效率，实现更多成分的成像分析，应用领域也不再限于医学和药学研究。本次报告中，新间教授还回顾了其团队的最新成像数据，包括类固醇类激素成像，基于果蝇神经递质分析的神经科学研究，以及毛发分析等，分享给了国内研究学者更多宝贵的经验和建议。 目前，岛津iMScope QT询价咨询通道已经开放，扫描下方二维码参与岛津“询价有礼”活动，岛津工作人员会第一时间与您联系。

近, 法国abbelight公司研发的模块化多功能单分子定位显微 (SMLM)系统凭借其有的DAISY等技术在3D超分辨成像领域取得重大突破，在学术界引起了广泛的关注。该系统次实现在三维空间上的15 nm超3D定位；且因为模块化设计具有高兼容，仅需使用一个c-mount接口即可将客户的倒置荧光显微镜升成超分辨显微镜，是佳的超分辨搭建方案。 轴向延伸 定位Abbeligh公司系列超分辨模块采用了先进且特的双通路DAISY技术能够将以往定位不佳的Z轴精度提高到15 nm，真正实现三维空间上的15 nm超3D定位。同时此技术巧妙地结合DONALD和SAF技术的优势，有效解决采集过程中的热漂移和多色成像中不同波长激光位置不同等问题，大幅度提高了长时间和多色成像的度，并且还可实现多4色的同时3D成像。超大视野 图像采集在光路方面，SAFe light 能够实现在较低激光能量下对大视野图像的均匀照射。这使得abbelight能够在不增加采集时间的前提下，一次性采集200 × 200 μm2 范围内的图像，并且能够保证图像照射光的整体均一性。灵活兼容 轻松升abbelight具有高度兼容性，仅需使用一个c-mount接口即可将您的倒置荧光显微镜升成超分辨显微镜，并且基本不会破坏显微镜的原有功能，节约您的预算与空间。（除了模块外，abbelight也提供完整的超分辨系统）先进软件 功能强大abbelight 同时还是一台十分简便易用的设备，该设备的NEO软件简单、直观、优化良好，可提供全面的参数控制命令、实时3D漂移校正、实时3D重构图像、高速3D定位图像处理、空间分析和测量、分辨率计算等功能。初次应用 轻松上手对于超分辨中的光漂问题，abbelight的商业化成像液能够有效的降低成像过程中的光漂作用。对于初学者来说，abbelight 还提供全面的技术支持，帮助您快速的建立自己的超分辨观测方法，打开超分辨大门，助力科之路。【新发表文章】[1]. Belkahla, Hanen, et al. "Carbon dots, a powerful non-toxic support for bioimaging by fluorescence nanoscopy and eradication of bacteria by photothermia." Nanoscale Advances (2019).[2]. Jimenez, Angélique, Karoline Friedl, and Christophe Leterrier. "About samples, giving examples: Optimized Single Molecule Localization Microscopy." bioRxiv (2019): 568295.[3]. Cabriel, Clément, et al. "Combining 3D single molecule localization strategies for reproducible bioimaging." Nature communications 10.1 (2019): 1980.[4]. Capmany, Anahi, et al. "MYO1C stabilizes actin and facilitates the arrival of transport carriers at the Golgi complex." J Cell Sci 132.8 (2019): jcs225029.

药物分子定位递送多模式成像精准示踪研究 癌症是威胁人类生命与健康的重大疾病，药物治疗（化疗）是治疗癌症的有效手段之一。为进一步提高疗效、降低毒副作用，抗癌药物的定位递送和精确释放成为抗癌药物研发的重要内容。然而，如何实时在线精准示踪抗癌药物的递送过程、靶向释药过程以及生物分布与代谢是迫切需要分析科学解决的难点和核心问题。质谱成像技术是基于质谱发展起来的用于样本定性和定量检测的新型分子成像技术，其通过扫描样本，可高灵敏、高分辨地获得待测样本中目标分子的精准时空分布，为药物的递送过程、靶向释药过程以及生物分布提供重要信息。本研究工作利用荧光成像和质谱成像相结合的多模式成像分析技术成功实现了实时精准示踪靶向结直肠的新型前药定位递送、释放、分布与代谢的全过程，见图1。 图1 利用多模式成像技术实现靶向结直肠的新型前药实时精准示踪 1．新型的偶氮基前药AP-N=N-Cy的构建本研究工作设计合成了一种新型的偶氮基前药AP-N=N-Cy，该偶氮基前药由前体药物分子（AP）通过多功能的偶氮苯基团与近红外荧光团（Cy）相连接而成。研究结果表明：该偶氮基前药不仅可作为对偶氮还原酶响应的近红外探针以实时示踪药物递送过程，而且还可作为抗癌药物分子(AdP)的递送平台。在偶氮还原酶存在的情况下，AP-N=N-Cy中的多功能偶氮苯基会发生断裂进而释放AdP和Cy，其偶氮苯基团充当了开启Cy荧光的开关，它的引入使得该偶氮基前药具有了独特的荧光开-关特性（图2）。 基于偶氮还原酶会特异性地在结肠中分泌，该偶氮基前药实现了在结肠中特异性的定位递送与靶向释放。该偶氮基前药可以口服，并且在到达结肠前具有高稳定性和低毒性。鉴于抗癌药物分子释放与荧光开启过程的同步性，可利用荧光成像和质谱成像相结合的多模式成像技术对抗癌药物分子在体外、离体和体内的递送进行精确示踪。 图2 偶氮基前药AP-N=N-Cy的构建和释药机理 2. iMScope TRIO 成像质谱显微镜测试条件取健康昆明雄性小鼠，随机分为两组并禁食12小时，分别用前药AP-N=N-Cy（0.1 mL，2 mg / kg）和PBS（0.1 mL）进行灌胃，在灌胃12小时后处死、解剖，取胃、小肠、盲肠、结直肠、肾脏、心脏、肺、肝和脾脏组织并进行冷冻切片，切片厚度为15 μm。将所得组织切片放置在ITO导电载玻片上（100Ω/ m2，日本大阪松浪玻璃）。使用基质喷涂仪iMLayer（Shimadzu，Kyoto，日本）将基质α-氰基-4-羟基肉桂酸升华于组织切片表面后，使用成像质谱显微镜iMScope TRIO（Shimadzu，Kyoto，日本）对上述组织切片进行成像分析。质谱条件如下：正离子模式，采集范围m/z 150-500；激光直径10 μm；步长40μm；激光强度35。 3. 基于iMScope TRIO 成像质谱显微镜的组织成像研究利用iMScope TRIO成像质谱显微镜在分子水平上对AdP和Cy在不同组织中的生物分布进行精确分析。如图3所示，仅在前药AP-N=N-Cy灌胃的小鼠盲、结肠部位检测到AdP（MS / MS片段，m/z 476.16）和Cy（MS / MS片段，m/z 369.17）的特征信号，而给药组小鼠其余器官，包括胃、小肠、肾脏、心脏、肺、肝和脾脏等中并未能检测出药物分子AdP的分布，表明前药AP-N=N-Cy仅在小鼠结直肠中释放活性药物AdP和探针分子，且Cy和AdP在分子水平上显示出优异的同步性，使得探针分子Cy的信号可以有效地代表药物分子AdP的组织分布。图3 前药AP-N=N-Cy灌胃12 h后在小鼠组织中的质谱成像分析图 a)盲肠 b) 结肠 c) 其余器官（叠加图） 本文相关内容由中国科学院兰州化学物理研究所赵晓博博士生提供，详细研究内容已正式发表于Analytical Chemistry, 2020, 92: 9039-9047。 文献题目《Precisely Traceable Drug Delivery of Azoreductase-Responsive Prodrug for Colon Targeting via Multimodal Imaging》 使用仪器岛津iMScope TRIO 作者Xiao-bo Zhao,1,2 Wei Ha,1 Kun Gao,3 Yan-ping Shi1* 1、CAS Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences (CAS), Lanzhou 730000, People’s Republic of China, Email: shiyp@licp.cas.cn2、University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, People’s Republic of China3、College of Chemistry and Chemical Engineering, Lanzhou University, Lanzhou 730000, People’s Republic of China

人的肉眼分辨本领在0.1毫米左右，我们是怎么一步步地看见细菌、病毒，乃至蛋白质结构的呢？这背后离不开这群“强迫症”。采访专家：张德添（军事医学科学院国家生物医学分析中心教授）“我非常惊奇地看到水中有许多极小的活体微生物，它们如此漂亮而动人，有的如长矛穿水而过，有的像陀螺原地打转，还有的灵巧地徘徊前进，成群结队。你简直可以将它们想象成一群飞行的蚊虫。”1675年，一名荷兰代尔夫特市政厅的小公务员给英国皇家学会写了这样一封信，向学会的会员们描述自己用自制的显微镜观察到的奇妙景象。作为给当时欧洲最富盛名的学术组织寄去的一封学术讨论信件，这名公务员并没有进行大篇幅严谨却枯燥的科学论证，而是用朴实的语言，在字里行间留下了自己发现新事物时那种孩童般的惊奇与喜悦。这位当时默默无闻的小公务员，正是大名鼎鼎的微生物学和显微镜学先驱者—安东尼范列文虎克。在50年的时间里，列文虎克用制作的显微镜观察到了细菌、肌纤维和精细胞等微观生物，并先后给英国皇家学会寄去了300多封信件来讨论他的新发现。正是在列文虎克的不懈坚持下，人类观察世界的眼睛终于来到了微生物层面。初代显微镜：拨开微生物世界的迷雾列文虎克能发现色彩斑斓的微生物世界，主要得益于他在透镜制作方面的天赋。他一生中制作了多达400多台显微镜，与今日我们熟知的显微镜存在很大不同，列文虎克的显微镜绝大多数属于单透镜显微镜，仅由一个小黄铜板构成，使用时需要仰身将这个铜板面向阳光进行观察。列文虎克凭借他的一系列惊人发现迅速成为当时科学界的“网红级”人物。然而真正奠定显微镜学理论基础的，则是同时期的英国科学家罗伯特胡克。在列文虎克还在钻研透镜制作技艺时的1665年，在英国皇家学会负责科学试验的胡克，就制作了一台显微镜，与列文虎克使用的单透镜显微镜不同，这是一台复式显微镜，其工作原理和外形已经很接近现代的光学显微镜了。胡克用这台显微镜观察一片软木薄片，发现了密密麻麻的格子状结构，酷似当时僧侣居住的单人房间，因此胡克就用英语中单人间一词“cell”来命名这种结构，而这个单词在当代被翻译为“细胞”。不久，胡克写就了《显微图谱》一书，将这一重要观察成果写入书中。胡克的研究成果很快引起了列文虎克的注意，他曾研究过胡克的显微镜，但最后还是使用了自制的单透镜显微镜来进行观察。原因就在于胡克显微镜存在严重的色差问题。所谓色差，就是在光线经过透镜时，不同颜色的光因折射率不同，会聚焦于不同的点上，使得样品的成像被一层色彩光斑所包围，严重影响清晰度。列文虎克提出的解决方案也很简单，就是在透镜研磨的精细程度上下功夫，将单透镜制成小玻璃珠，并将之嵌入黄铜板的细孔内，这样在放大倍数不低于胡克显微镜的基础上，最大程度避免色差对成像的干扰。但代价是，由于观察时是需要对着阳光，对观测者的眼睛伤害很大。除了色差，早期显微镜还存在着球面像差问题，即光线在经过透镜折射时，接近中心与靠近边缘的光线不能将影像聚集在一点上，使得成像模糊不清。自显微镜诞生之日起，色差和球面像差就成为“与生俱来的顽疾”，一直制约着人们向微观世界进军的步伐。直到19世纪，光学显微技术才在工业革命的助力下完成了一次实质性蜕变，从而在根本上解决了这两个难题。挑战色差与球面像差：逐渐清晰的微观视角首先是1830年，一个名为李斯特的英国业余显微镜学爱好者首先向球面像差发起挑战，他创造性地用几个特定间距的透镜组，成功减小了球面像差影响。此后，改进显微镜的主阵地很快转移到了德国，其中1846年成立的蔡司光学工厂，更是在此后一个世纪里成为领头羊。1857年蔡司工厂研制出第一台现代复式显微镜，并成功打入市场。不过在研制和生产过程中，蔡司也深受色差之苦：当时通行的增加透镜数量的做法，虽能提升显微镜的放大倍数，却仍无法消除色差对成像清晰度的干扰。1872年，德国耶拿大学的恩斯特阿贝教授提出了完善的显微镜学理论，详细说明了光学显微镜的成像原理、数值孔径等科学问题。蔡司也迅速邀请阿贝教授加盟，并研制出一批划时代的光学部件，其中就包括复消色差透镜，一举消除了色差的影响。在阿贝教授的技术加持下，蔡司工厂的显微镜成为同类产品中的佼佼者，很快成为欧美各大实验室的抢手货，并奠定了现代光学显微镜的基本形态。不久，蔡司又拉来了著名化学家奥托肖特入伙，将其研制的具有全新光学特性的锂玻璃应用在自家产品上。1884年，蔡司更是联合阿贝与肖特，成立了“耶拿玻璃厂”，专为显微镜生产专业透镜。显微镜技术的突飞猛进也让各种现代生物学理论不断完善，透过高分辨率的透镜，微观世界中各种复杂的结构逐步以具象的形式呈现在人类眼前。由于微观层面的生物结构大多是无色透明的，为了让他们在镜头下变得清晰可见，当时的科学家普遍将生物样品染色，以此提高对比度方便观察。这一方法最大的局限在于，染料本身的毒性往往会破坏微生物的组织结构，这一时期染剂落后的材质，也无法实现对某些特定组织的染色。直到1935年荷兰学者泽尼克发现了相衬原理，并将之成功应有于显微镜上。这种相衬显微技术，利用光线穿过透明物体产生的极细微的相位差来成像，使得显微镜能够清晰地观察到无色透明的生物样品。泽尼克本人则凭借此次发现斩获了1953年的诺贝尔物理学奖。军事医学科学院国家生物医学分析中心教授，长期致力于电子显微镜领域研究的张德添向记者介绍道：“人的肉眼分辨本领在0.1毫米左右，而光学显微镜的分辨本领可以达到0.2微米（1毫米=1000微米）的水平，能够看到细菌和细胞。但由于光具有波动性，衍射现象限制了光学显微镜分辨本领的进一步提高。”二战结束后，随着各种新理论新技术的不断应用，光学显微镜得到了长足进步，但也是在这一时期，光学显微镜的潜力已经被发掘到了极限。为蔡司工厂乃至整个显微镜学立下汗马功劳的阿贝教授就提出了“分辨率极限理论”，认为普通光学显微镜的分辨率极限是0.2微米，再小的物体就无能为力了—这一理论又被称为“阿贝极限”，这就好像一层屏障将人类的探索目光阻隔在更深度的微观世界大门之前，迫使科学家们另寻他途。电子显微镜：另辟蹊径，重新发现既然可见光存在这样的短板，那么能否利用其他波长较短的光束来实现分辨率的突破呢？张德添进一步介绍道：“1924年后，人们从物质领域内找到了波长更短的媒质—电子，从而发明了电子显微镜，其分辨本领达到了0.1纳米的水平。”1931年，德国科学家克诺尔和他的学生鲁斯卡在一台高压示波器上加装了一个放电电子源和三个电子透镜，制成了世界首台电子显微镜，就此为人类探索微观世界开拓了一条全新的思路。电子显微镜完全不受阿贝极限的桎梏，在分辨率上要远远超越当时的光学显微镜。鲁斯卡在次年对电子显微镜进行了改进，分辨率一举达到纳米级别（1微米=1000纳米）。在这个观测深度，人类终于亲眼看到了比细菌还要小的微生物—病毒。1938年，鲁斯卡用电子显微镜看到了烟草花叶病毒的真身，而此时距离病毒被证实存在已经过去了40年时间。对于电子显微镜技术的发明，张德添这样评价道：“电子显微镜是人们认识超微观世界的钥匙和工具，它解决了光学显微镜受自然光波长限制的问题，将人们对世界的认识从细胞水平提高到了分子水平。” 从肉眼只能观察到的毫米尺度，到光学显微镜能够达到的微米尺度，再到电子显微镜能进一步下探到纳米尺度，显微成像技术正在迅速突破人类对微观世界的认知极限。不过电子显微镜本身的缺憾也愈加明显。由于电子加速只能在真空条件下实现，在真空环境之下，生物样品往往要经过脱水与干燥，这意味着电子显微镜根本无法观测到活体状态下的生物样品，此外电子束本身又容易破坏样品表面的生物分子结构，这就导致样品本身会丢失很多关键信息。这一顽疾在此后又困扰了科学家多年。直到1981年，IBM苏黎世实验室的两位研究员宾尼希与罗雷尔，用一种当时看起来颇有些“离经叛道”的方法，首先解决了电子束损害样品结构的问题。他们利用量子物理学中的“隧道效应”，制作了一台扫描隧道显微镜。与传统的光学和电子显微镜不同，这种显微镜连镜头都没有。在工作时，用一根探针接近样品，并在两者之间施加电压，当探针距离样品只有纳米级时就会产生隧道效应—电子从这细微的缝隙中穿过，形成微弱的电流，这股电流会随着探针与样品距离的变化而变化，通过测量电流的变化人们就能间接得到样品的大致形状。由于全程没有电子束参与，扫描隧道显微镜从根本上避免了加速电子对生物样品表面的破坏。扫描隧道显微镜在今天也被称为“原子力显微镜”，“在微米甚至纳米水平，动态观察生物样品表面形貌结构的变化规律，原子力显微镜是有其独特优势的”，张德添向记者解释说，“如果条件允许，还可以检测生物大分子间相互作用力的大小，为结构与功能关系研究提供便利。”1986年，宾尼希和罗雷尔凭借扫描隧道显微镜，获得当年的诺贝尔物理学奖，有趣的是，与他们一起分享荣誉的，还有当初发明电子显微镜的鲁斯卡，当时的他已是耄耋老人，而他的恩师克诺尔也早已作古。新老两代电子显微镜技术的里程碑人物同台领奖，成为当时物理学界的一段佳话。老树新芽：突破“阿贝极限”的光学显微镜电子显微镜在问世之后的几十年间，极大拓展了人类对生物、化学、材料和物理等领域认知疆界。而无论是鲁斯卡，还是宾尼希和罗雷尔，他们所作的贡献不仅让自己享誉世界，还助力其他领域的学者登上荣誉之巅。比如英国化学家艾伦克鲁格凭借对核酸与蛋白复杂体系的研究获得1982年度诺贝尔化学奖，而他的科研成果正式依靠高分辨电子显微镜技术和X光衍射分析技术而取得的。在克鲁格获奖的当年，以色列化学家达尼埃尔谢赫特曼更是使用一台电子显微镜，发现了准晶体的存在，并独享了2011年的诺贝尔化学奖。目前，电子显微镜已经成为金属、半导体和超导体领域研究的主力军。但在生物和医学领域，电子显微镜本身对生物样品的损害，依旧是难以逾越的技术难题。于是不少科学家开始从两条路径上寻求解决之道：一条是研发冷冻电镜技术，这种技术并不改变电子显微镜整体的工作模式，而是从生物样品本身入手，对其进行超低温冷冻处理。这样状态下，即使处在真空环境中，样品也能保持原有的形态特征与生物活性。“由于观测温度低，生物样品也处于含水状态，分子也处于天然状态，样品对辐射的耐受能力得以提高。我们可以将样品冻结在不同状态，观测分子结构的变化。”张德添向记者解释道。瑞士物理学家雅克杜波切特、美国生物学家乔基姆弗兰克和英国生物学家理查德亨德森凭借这项技术分享了2017年度诺贝尔化学奖。新冠疫情暴发后，冷冻电镜技术又为人类研究和抗击疫情做出了突出贡献。2020年，西湖大学周强实验室就利用这种技术，首次成功解析了此次新冠病毒的受体—ACE2的全长结构，让人类对新冠病毒的认识向前迈出了关键性一步。另一条路径是从传统的光学显微镜入手。在电子显微镜的黄金时代，不少科学家就开始着手研制超高分辨率光学显微镜，甚至开始尝试突破一直以来困扰光学显微镜的“阿贝极限”，而“荧光技术”就成为实现这一切的关键。早在19世纪中叶，科学家们就发现：某些物质在吸收波长较短而能量较高的光线（比如紫外光）时，能将光源转化为波长较长的可见光。这种现象后来被定义为“荧光现象”。荧光现象在自然界是普遍存在的，这一现象背后的原理也在20世纪迅速被应用在光学显微镜上。1911年，德国科学家首次研制出荧光显微镜装置，用荧光色素对样品进行荧光染色处理，并以紫外光激发样品的荧光物质发光，但成像效果不佳，而且把荧光物质当作染色剂，和早期的染色剂一样，本身的毒性会伤害活体样品。直到1974年，日本科学家下村修发现了绿色荧光蛋白，其毒性远弱于以往的荧光物质，是对活体标本进行荧光标记的理想材料——这一发现成为日后科学家突破“阿贝极限”的有力武器。时间来到1989年，供职于美国IBM研究中心的科学家莫尔纳首次进行了单分子荧光检测，使得光学显微镜的检测尺度精确到纳米量级成为可能。随后在莫尔纳的基础上，美国科学家贝齐格开发出一套新的显微成像方法：控制样品内的荧光分子，让少量分子发光，借此确定分子中心和每个分子的位置，通过多次观察呈现出纳米尺度的图像。通过这种方法，贝齐格轻而易举地突破了光学显微镜的阿贝极限。几乎在同时，德国科学家斯特凡赫尔在一次光学研究中突发奇想：根据荧光现象原理，如果用镭射光激发样品内的荧光物质发光，同时用另一束镭射光消除样品体内较大物体的荧光，这样就只剩下纳米尺度的分子发射荧光并被探测到，不就能在理论上得到分辨率大于0.2微米的微观成像了吗？他随即开始了试验，并制成了一台全新显微镜，将光学显微镜分辨率下探到了0.1微米的水平。困扰光学显微技术百年的阿贝极限难题，就这样历经几代科学家的呕心沥血，终于在本世纪初被成功攻克。莫尔纳、贝齐格和赫尔三位科学家更是凭借“超分辨率荧光显微技术”分享了2014年度的诺贝尔化学奖。时至今日，在探索微观世界的征途上，光学显微镜和电子显微镜互有长短、相得益彰。当然在实际应用中，科学家越来越依赖于将多种显微成像技术结合使用。比如今年5月，英国弗朗西斯克里克研究所就依托钙化成像技术、体积电子显微技术等多种显微成像技术，成功获得了人类大脑神经网络亚细胞图谱。在未来，多种显微成像技术相结合，各施所长，将进一步完善我们在生物、医学、化学和材料等领域的知识结构，把这个包罗万象的奇妙世界更完整地呈现在我们眼前。

p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " strong span style=" text-indent: 2em " 仪器信息网讯 /span /strong span style=" text-indent: 2em " 2020年7月9日，岛津企业管理（中国）有限公司（以下简称：岛津）“镜质合璧，还原真实”成像质谱显微镜新品线上发布会在仪器信息网新品首发栏目成功举办。在发布会上，岛津向中国市场推出全新的成像质谱显微镜iMScope系列新品，为医学、生物学以及药物等研究领域高水平科研实验室再添利器。 /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 335px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/9246f59f-3653-4936-a6a0-fa8c8bdc2b45.jpg" title=" 胡部长.png" alt=" 胡部长.png" width=" 600" height=" 335" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " span style=" text-align: justify text-indent: 2em " 岛津分析计测事业部市场部部长 胡家祥 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 岛津分析计测事业部市场部部长胡家祥为本次发布会致辞。胡家祥首先对参与岛津iMScope QT线上新品发布会的专家老师表示欢迎与感谢。并表示，岛津自1875年创业以来，始终坚持“以科学技术向社会做贡献”的创业宗旨，秉承“为了人类和地球的健康”这一经营理念，不断开拓创新，推出符合市场需求的高科技产品。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 自1997年范德堡大学（Vanderbilt University）的Richard Caprioli等提出用质谱实现分子成像的概念以来，质谱成像技术飞速发展，广泛应用于医学研究、生物学研究、药物研究等诸多领域。为了满足质谱成像市场的需求，岛津全新推出了成像质谱显微镜iMScope QT，以更快的速度和更高的灵敏度完成定性、定量、定位整套分析流程。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " iMScope QT是显微镜和质谱仪完整融合的独特产品，也是质谱成像和LC-QTOF兼容的复合系统，非常期待这款产品可以成为各位专家高水平研究工作中的好帮手。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 325px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/dec2f987-eee4-44b7-a23f-03c7386acc18.jpg" title=" 刘虎威.png" alt=" 刘虎威.png" width=" 600" height=" 325" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " span style=" text-align: justify text-indent: 2em " 北京大学化学与分子工程学院刘虎威教授 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " & nbsp span style=" text-indent: 2em " 北京大学化学与分子工程学院刘虎威教授为本次发布会致辞。刘虎威表示，岛津的仪器技术在不断的发展，北京大学分析测试中心在2017年采购了岛津上一代的成像质谱显微镜产品，2020年岛津乘胜追击推出了新一代的成像质谱显微镜产品，新产品在原来的功能上做出了很大的改进，使其功能更加全面。既可以荧光成像，也可以质谱成像，还可以做多级质谱分析。此外，全新的iMScope QT产品还可以与LC-MS/MS联用，是一款为科研人员量身打造的功能强大的仪器。最后，刘虎威表示希望岛津能够为中国的科研人员带来更好的产品和更加全面的服务。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/1837fae9-6e9c-4897-b1ea-8d45de64ab2d.jpg" title=" iMScope QT.png" alt=" iMScope QT.png" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " iMScope QT新产品揭幕 /span /p p style=" text-indent: 2em line-height: 1.75em text-align: justify " span style=" text-align: justify text-indent: 2em " & nbsp /span span style=" text-align: justify text-indent: 2em " 岛津分析计测事业部市场部生命科学产品负责人韩美英博士带来新产品的技术介绍报告，岛津上一代成像质谱显微镜 iMScope TRIO 是光学显微镜与质谱仪完整融合的成像系统，既可以对样品进行形态学上的细微观察，又可以对特定的分子进行鉴定和可视化分布分析。iMScope TRIO 广泛应用于各种研究领域，包括医学研究，药学领域，农业和环境领域等。 /span /p p style=" text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-align: justify text-indent: 2em " /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 300px height: 327px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/1522efcc-ab59-4929-81ec-b10fe523335f.jpg" title=" 韩美英.jpg" alt=" 韩美英.jpg" width=" 300" height=" 327" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 436px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/e5e72f8e-edcb-48b3-b245-3397ca1164f6.jpg" title=" 韩美英.png" alt=" 韩美英.png" width=" 600" height=" 436" border=" 0" vspace=" 0" / /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 新产品iMScope QT在保留高空间分辨率，显微镜等原有仪器特点的基础上，改善了检测灵敏度和速度，实现了速度、特异性、空间分辨率、灵敏度为一体的质谱成像分析。 iMScope QT是由显微镜-MALDI单元与LCMS-9030组合而成，显微镜-MALDI单元可移动分开使用，是成像质谱与LC-QTOF的兼用系统，用一台仪器可实现定性、定量、以及定位分析。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 不仅如此，同时发售基质涂敷自动喷雾系统，结合原有的iMLayer升华涂敷系统，提高成像灵敏度和空间分辨率。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 此外，岛津可提供从前处理到数据采集，软件分析的质谱成像的整体解决方案。使用一台质谱仪就能完成所有分析，通过叠加不同检测原理的图像以及不同离子化方法的数据进行分析，为成像分析提供全新的工具。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 300px height: 300px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/fadfeb03-b334-4987-9224-cc56ebd9c938.jpg" title=" 500-500北大讲师图片.png" alt=" 500-500北大讲师图片.png" width=" 300" height=" 300" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 334px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/130f779f-d33c-4ef0-8dfc-a767c0a57ffa.jpg" title=" 聂洪.png" alt=" 聂洪.png" width=" 600" height=" 334" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify line-height: 1.75em " span style=" text-align: justify text-indent: 2em " 随后，北京大学分析测试中心的聂洪港博士带来了题为《成像质谱显微镜应用进展》的报告，北京大学分析测试中心是国内第一台iMScope TRIO用户，聂洪港博士根据他在脂质组学、质谱成像、敞开式质谱分析领域中的经验，已开展了多种样品的分析。本次报告中聂博士介绍了岛津成像质谱显微镜相关技术在植物、动物和临床样品的分析和检测应用的部分工作进展。 /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 454px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/8cf23e96-81f1-45b4-8e04-991ba16dbb29.jpg" title=" 新间秀一.png" alt=" 新间秀一.png" width=" 600" height=" 454" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/91274e39-6264-4128-ad28-1b87eb402470.jpg" title=" 300-300大阪大学教授图片.png" alt=" 300-300大阪大学教授图片.png" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 发布会最后的专家报告由大阪大学工学研究科的新间秀一副教授带来精彩的分享，新间教授根据多年的成像质谱工作经验，在报告中介绍了iMScope TRIO在新领域中的应用成果。通过改善样品制备方法，提高目标化合物在组织切片上的离子化效率，实现更多成分的成像分析，应用领域也不再限于医学和药学研究。本次报告中，新间教授还回顾了其团队的最新成像数据，包括类固醇类激素成像，基于果蝇神经递质分析的神经科学研究，以及毛发分析等，分享给了国内研究学者更多宝贵的经验和建议。 /p p br/ /p

2023年2月23日，北京大学程和平-王爱民团队在 Nature Methods 在线发表题为 Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection 的文章。 文中报道了重量仅为2.17克的微型化三光子显微镜（图1），首次实现对自由行为小鼠的大脑全皮层和海马神经元功能成像，为揭示大脑深部结构中的神经机制开启了新的研究范式。 图1 小鼠佩戴微型化三光子显微镜实景图 解析脑连接图谱和功能动态图谱是我国和世界多国脑计划的一个重点研究方向，为此需要打造自由运动动物佩戴式显微成像类研究工具。2017年，北京大学程和平院士团队成功研制第一代 2.2 克微型化双光子显微镜，获取了小鼠在自由行为过程中大脑皮层神经元和神经突触活动的动态图像。2021年，该团队的第二代微型化双光子显微镜将成像视野扩大了 7.8 倍，同时具备获取大脑皮层上千个神经元功能信号的三维成像能力。 微型化三光子显微镜突破成像深度极限 海马体位于皮层和胼胝体下面，在短期记忆到长期记忆的巩固、空间记忆和情绪编码等方面起重要作用。在啮齿类动物研究模型中，海马距离脑表面深度大于一个毫米。由于大脑组织，特别是胼胝体，具有对光的高散射光学特性，所以突破成像深度极限是长期以来困扰神经科学家的一个极大的挑战。此前的微型化单光子及微型化多光子显微镜均无法实现穿透全皮层直接对海马区进行无损成像。此次，北京大学最新研发的微型化三光子显微镜一举突破了此前微型化多光子显微镜的成像深度极限：1、显微镜激发光路可以穿透整个小鼠大脑皮层和胼胝体，实现对小鼠海马CA1亚区的直接观测记录（图2）。神经元钙信号最大成像深度可达1.2 mm，血管成像深度可达1.4 mm。2、在光毒性方面，全皮层钙信号成像仅需要几个毫瓦，海马钙信号成像仅需要20至50毫瓦，大大低于组织损伤的安全阈值。因此，该款微型化三光子显微镜可以长时间、不间断连续观测神经元功能活动，且不产生明显的光漂白与光损伤。图2 微型三光子显微成像记录小鼠大脑皮层L1-L6和海马CA1的结构和功能动态。CC：胼胝体。绿色代表GCaMP6s标记的神经元荧光钙信号，洋红色代表硬脑膜、微血管和脑白质界面的三次谐波信号。 全新的光学构型设计 北京大学微型化三光子显微镜成像深度的突破得益于全新的光学构型设计。（图3）图3 微型化三光子显微镜光学构型 通过对皮层、白质和海马体建立分层散射模型进行仿真，发现荧光信号从深层组织到达脑表面时已经处于随机散射的状态，使得显微物镜荧光收集效率降低，从而极大限制了成像深度。针对这一问题，经典阿贝聚光镜结构被引入构型设计中：微型阿贝聚光镜与简化的无限远物镜密接可以提高散射光的通透效率；阿贝聚光镜与激发光路中的微型管镜部分复用，可以进一步简化结构，降低损耗。总体上，新微型化显微镜的散射荧光收集效率实现了成倍的提升。 生物应用 同时，利用微型化三光子显微镜，作者研究了小鼠顶叶皮层第六层神经元在抓取糖豆这一感觉运动过程中的编码机制：发现大约37%的神经元在抓取动作之前就开始活跃且在抓取时最活跃，大约5.6%的神经元在抓取动作之后开始活跃，说明不同神经元参与了不同阶段的编码。（图4）这一结果初步展示了微型化三光子显微镜在脑科学研究中的应用潜力。 图4 小鼠顶叶皮层第六层神经元在抓取糖豆任务中的不同反应类型北京大学未来技术学院博士后赵春竹、北京大学前沿交叉学科研究院博士研究生陈诗源、北京大学分子医学南京转化研究院研究员张立风为该论文的共同第一作者，北京大学程和平、王爱民、赵春竹为论文的共同通讯作者，北京超维景生物科技有限公司胡炎辉、李谊军、陈燕川、付强、高玉倩、江文茂、张颖也参与了此项工作的开发。该项目得到科技创新2030-“脑科学与类脑研究”重大项目、中国医学科学院医学与健康科技创新工程—脑疾病的线粒体机制研究创新单元、国家自然科学基金委、国家重大科研仪器研制专项、科技部重点研发计划等经费支持。超维景一直致力于前沿生物医学成像技术的产业转化，为推动生命科学的研究与发展提供优质的、系统化的解决方案。 经过多年的沉淀 我们即将推出自主研发的最新一代微型化三光子显微成像系统敬 请 期 待 ！Nature Methods 原文链接：https://doi.org/10.1038/s41592-023-01777-3

优势● iMScope QT可测量的最大范围超过100万像素，能够进行大面积样本分析，例如在一次检测中对小鼠大脑全切片进行分析。● iMScope QT的分析速度比前一代产品快8倍以上，能够进行快速分析。● iMScope QT具有高质量准确度、分辨率及高空间分辨率，能够进行精确质谱成像分析。 概述质谱成像技术可以通过质谱仪直接检测生物分子和代谢物，同时保留其在样本组织上的位置信息，因此，可以生成不同生物分子基于特定离子信号强度和位置信息的二维质谱图像。iMScope成像质谱显微镜是用于质谱成像分析的整合型仪器，结合了光学显微镜和质谱仪，能够分析物质的结构和分布特征，拓展了药物研发和代谢物研究等领域的范围。通过将MALDI转换成LC和ESI系统，iMScope还可用于LC-MS定性及定量分析。本文将介绍配备Q-TOF质谱仪的新型iMScope QT（图1），并与前一代iMScope TRIO设备进行比较。图1 iMScope QT 小鼠全脑切片分析前一代iMScope TRIO设备的最大可测量范围是250 × 250像素。在iMScope QT中，可测量范围已扩展至1024 × 1024像素，能够以15 μm的空间分辨率分析小鼠全脑切片（约17mm × 9.4 mm）。根据表1条件进行检测，可在m/z 885.557处获得磷脂酰肌醇PI (38:4)，并在m/z 888.631处获得硫苷脂(C24:1)的清晰质谱图像（图2）。 此外，由于iMScope QT的最大激光频率为20 kHz，分析速度比iMScope TRIO快8倍以上。结果显示完成图2所示的小鼠全脑切片（702624 pix）质谱成像分析仅需6小时。 表1 分析条件图2 小鼠全脑切片的质谱成像结果（空间分辨率：15 μm） 小鼠小脑的高空间分辨率分析对小鼠小脑附近的区域进行高空间分辨率质谱成像分析，如图2（a）中红色部分所示。根据表1中的分析条件，空间分辨率为5 μm。如图所示，可在m/z 885.557处获得 PI (38:4)、在m/z 888.631处获得硫苷脂(C24:1)，检测到更清晰更详细的质谱图像（图3(b)和(d)）。 此外，由于iMScope QT的质量准确度和分辨率较高，能够分离和检测PI (38:4)的同位素（m/z 888.573）和硫苷脂(C24 :1)（m/z 888.631），并能提取每种同位素的质谱图像（图3(c)和3(d)）。而iMScope TRIO则无法获得以上结果。 图3 小鼠小脑的光学图像和质谱图像（空间分辨率：5 μm） (a) 光学图像(b) PI (38:4)的质谱图像，m/z 885.557(c) PI (38:4)同位素的质谱图像，m/z 888.573(d) 硫苷脂(C24:1)的质谱图像，m/z 888.631 结论与iMScope TRIO相比，iMScope QT的分析范围更广，分析速度更快，可实现更广泛的快速成像分析。此外，随着检测准确度和分辨率的提高，能够对各种目标化合物进行高精确度、高特异性的质谱成像分析。 iMScope QT不仅整合了质谱和形态学分析，而且能够在更广泛的领域实现更快速、更灵敏以及更高的空间分辨率的检测。 本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

自然界中一些最基本的过程发生在微观尺度上，远远超出了我们肉眼所能看到的极限，这推动了技术的发展，使我们能够超越这个极限。早在公元4世纪，人们发现了光学透镜的基本概念，并在13世纪，人们已经在使用玻璃镜片，以提高他们的视力和放大植物和昆虫等对象以便更好地了解他们。随着时间的推移，这些简单的放大镜发展成为先进的光学系统，被称为光学显微镜，使我们能够看到和理解超越我们感知极限的微观世界。今天，光学显微镜是许多科学和技术领域的核心技术，包括生命科学、生物学、材料科学、纳米技术、工业检测、法医学等等。在这篇文章中，我们将首先探讨光学显微镜的基本工作原理。在此基础上，我们将讨论当今常用的一些更高级的光学显微镜形式，并比较它们在不同应用中的优缺点。　　　　什么是光学显微镜?　　光学显微镜用于通过提供它们如何与可见光相互作用(例如，它们的吸收、反射和散射)的放大图像来使小结构样品可见。这有助于了解样品的外观和组成，但也使我们能够看到微观世界的过程，例如物质如何跨细胞膜扩散。　　显微镜的部件以及光学显微镜的工作原理　　从根本上说，显微镜包括两个子系统：一个用于照亮样品的照明系统和一个成像系统，该系统产生与样品相互作用的光的放大图像，然后可以通过眼睛或使用相机系统进行观察。　　早期的显微镜使用包含阳光的照明系统，阳光通过镜子收集并反射到样品上。今天，大多数显微镜使用人造光源，如灯泡、发光二极管(LED)或激光器来制造更可靠和可控的照明系统，可以根据给定的应用进行定制。在这些系统中，通常使用聚光透镜收集来自光源的光，然后在聚焦到样品上之前对其进行整形和光学过滤。塑造光线对于实现高分辨率和对比度至关重要，通常包括控制被照亮的样品区域和光线照射到它的角度。照明光的光学过滤，使用修改其光谱和偏振的光学过滤器，可用于突出样品的某些特征。图1：复合显微镜的基本构造：来自光源的光使用镜子和聚光镜聚焦到样品(物体)上。来自样品的光被物镜收集，形成中间图像，该图像由目镜再次成像并传递到眼睛，眼睛看到样品的放大图像。　　成像系统收集与样品相互作用的照明光，并产生可以查看的放大图像(如上图1)。这是使用两组主要的光学元件来实现的：首先，物镜从样品中收集尽可能多的光，其次，目镜将收集的光中传递到观察者的眼睛或相机系统。成像系统还可包括诸如选择来自样品的光的某些部分的孔和滤光器之类的元件，例如仅看到已从样品散射的光，或仅看到特定颜色或波长的光。与照明系统的情况一样，这种类型的过滤对于挑出某些感兴趣的特征非常有用，这些特征在对来自样本的所有光进行成像时会保持隐藏。　　总的来说，照明和成像系统在光学显微镜的性能方面起着关键作用。为了在您的应用中充分利用光学显微镜，必须充分了解基本光学显微镜的工作原理以及当今存在的变化。　　简单复合显微镜　　单个镜头可以用作放大镜，当它靠近镜头时，它会增加物体的外观尺寸。透过放大镜看物体，我们看到物体的放大和虚像。这种效果用于简单的显微镜，它由单个镜头组成，该镜头对夹在框架中并从下方照明的样品进行成像，如下图2所示。这种类型的显微镜通常可以实现2-6倍的放大倍率，这足以研究相对较大的样本。然而，实现更高的放大倍率和更好的图像质量需要使用更多的光学元件，这导致了复合显微镜的发展(如下图3)。图2：通过创建靠近它的物体的放大虚拟图像，将单个镜头用作放大镜。图3：左：简单显微镜。右：复合显微镜。　　在复合显微镜中，从底部照射样品以观察透射光，或从顶部照射样品以观察反射光。来自样品的光由一个由两个主要透镜组组成的光学系统收集：物镜和目镜，它们各自的功率倍增，以实现比简单显微镜更高的放大倍率。物镜收集来自样品的光，通常放大倍数为40-100倍。一些复合显微镜在称为“换镜转盘(nose piece)”的旋转转台上配备多个物镜，允许用户在不同的放大倍数之间进行选择。来自物镜的图像被目镜拾取，它再次放大图像并将其传递给用户的眼睛，典型的目镜放大率为10倍。　　可以用标准光学显微镜观察到的最小特征尺寸由所使用的光学波长(λ)和显微镜物镜的分辨率决定，由其孔径数值(NA)定义，最大值为NA =1空中目标。定义可区分的最小特征尺寸(r)的分辨率极限由瑞利准则给出：　　r=0.61×(λ/NA)　　例如，使用波长为550nm的绿光和典型NA为0.7的物镜，标准光学显微镜可以分辨低至0.61×(550nm)/0.7≈480nm的特征，这足以观察细胞(通常为10µm大小)，但不足以观察较小生物的细节，例如病毒(通常为250-400nm)。要对更小的特征成像，可以使用具有更高NA和更短波长的更先进和更昂贵的物镜，但这可能不适用于所有应用。　　在标准复合显微镜(如下图4a)中，样品(通常在载玻片上)被固定在一个可以手动或电子移动以获得更高精度的载物台上，照明系统位于显微镜的下部，而成像系统高于样本。然而，显微镜主体通常也可以适应特定用途。例如，立体显微镜(如下图4b)的特点是两个目镜相互成一个小角度，让用户可以看到一个略有立体感的图像。在许多生物学应用中，使用倒置显微镜设计(如下图4c)，其中照明系统和成像光学器件都在样品台下方，以便于将细胞培养容器等放置在样品台上。最后，比较显微镜(如下图4d)常用于法医。图4：复合显微镜。a)标准直立显微镜指示(1)目镜，(2)物镜转台、左轮手枪或旋转鼻镜(用于固定多个物镜)，(3)物镜、调焦旋钮(用于移动载物台)(4)粗调，(5)微调，(6)载物台(固定样品)，(7)光源(灯或镜子)，(8)光阑和聚光镜，(9)机械载物台。b)立体显微镜。c)倒置显微镜。　　光学显微镜的类型　　下面，我们将介绍一些当今可用的不同类型的光学显微镜技术，讨论它们的主要操作原理以及每种技术的优缺点。　　亮视野显微镜　　亮视野显微镜(Brightfield microscopy，BFM)是最简单的光学显微镜形式，从上方或下方照射样品，收集透射或反射的光以形成可以查看的图像。图像中的对比度和颜色是因为吸收和反射在样品区域内变化而形成的。BFM是第一种开发的光学显微镜，它使用相对简单的光学装置，使早期科学家能够研究传输中的微生物和细胞。今天，它对于相同的目的仍然非常有用，并且还广泛用于研究其他部分透明的样品，例如透射模式下的薄材料(如下图5)，或反射模式下的微电子和其他小结构。图5：亮视野显微镜。左图：透射模式-在显微镜下看到的石墨(深灰色)和石墨烯(最浅灰色)薄片。在这里，图像上看到的亮度差异与石墨层的厚度成正比。右图：反射模式-SiO2表面上的石墨烯和石墨薄片，小的表面污染物也是可见的。　　暗视野显微镜　　暗视野显微镜是一种仅收集被样品散射的光的技术。这是通过添加阻挡照明光直接成像的孔来实现的，这样只能看到被样品散射的照明光。通过这种方式，暗场显微镜突出显示散射光的小结构(如下图6)，并且对于揭示BFM中不可见的特征非常有用，而无需以任何方式修改样品。然而，由于在最终图像中看到的唯一光是被散射的光，因此暗场图像可能非常暗并且需要高照明功率，这可能会损坏样品。　　图6：亮视野和暗视野成像。a)亮视野照明下的聚合物微结构。b)与a)中结构相同的暗视野图像，突出显示边缘散射和表面污染。c)与a)和b)相似的结构，被直径为100-300nm的纳米晶体覆盖。仅观察到纳米晶体散射的光，而背景光被强烈抑制。　　相差显微镜　　相差显微技术(Brightfield microscopy，PCM)是一种可视化由样品光路长度变化引起的光学相位变化的技术.这可以对在BFM中产生很少或没有对比度的透明样品进行成像，例如细胞(如下图7)。由于肉眼不易观察到光学相移，因此相差显微镜需要额外的光学组件，将样品引起的相移转换为最终图像中可见的亮度变化。这需要使用孔径和滤光片来操纵照明系统和成像系统。这些形状和选择性地相移来自样品的光(携带感兴趣的相位信息)和照明光，以便它们建设性地干涉眼睛或检测器以创建可见图像。图7：人类胚胎干细胞群落的相差显微图像。　　微分干涉显微镜　　与PCM类似，微分干涉显微镜(differential interference contrast microscopy，DICM)通过将由于样品光路长度变化引起的光学相位转换为可见对比度，从而使透明样品(例如活的未染色细胞)可视化。然而，与PCM相比，DICM可以实现更高分辨率的图像，并且减少了由PCM所需的光学器件引入的清晰度和图像伪影。在DICM ，照明光束被线性偏振器偏振，其偏振旋转，使其分裂成两个偏振光束，它们具有垂直偏振和小(通常低于1µm)间隔。穿过样品后，两束光束重新组合，从而相互干扰。这将创建一个对比度与图像成正比的图像差在两个偏振光束之间的光相位，因此命名为“差”干涉显微镜。DICM产生的图像出现与采样光束之间的位移方向相关的三维图像，这导致样品边缘具有亮区或暗区，具体取决于两者之间的光学相位差的符号(如下图8)。图8：微分干涉对比显微镜。左：DICM的原理图。右图：通过DICM成像的活体成年秀丽隐杆线虫(C.elegans)。　　偏光显微镜　　在偏振光显微镜中，样品用偏振光照射，光的检测也对偏振敏感。为了实现这一点，偏振器用于控制照明光偏振并将成像系统检测到的偏振限制为仅一种特定的偏振。通常，照明和检测偏振设置为垂直，以便强烈抑制不与样品相互作用的不需要的背景照明光。这种配置需要一个双折射样品，它引入了照明光偏振角的旋转，以便它可以被成像系统检测到，例如，观察晶体的双折射以及它们的厚度和折射率的变化(如下图9)。图9：偏光显微镜。橄榄石堆积物的显微照片，由具有不同双折射的晶体堆积而成。整个样品的厚度和折射率的变化会导致不同的颜色。　　荧光显微镜　　荧光显微镜用于对发出荧光的样品进行成像，也就是说，当用较短波长的光照射时，它们会发出长波长的光。示例包括固有荧光或已用荧光标记物标记的生物样品，以及单分子和其他纳米级荧光团。该技术采用了滤光片的组合，可阻挡短波长照明光，但让较长波长的样品荧光通过，因此最终图像仅显示样品的荧光部分(如下图10)。这允许从由许多其他非荧光颗粒组成的样品中挑出和可视化荧光颗粒或已被染料染色的感兴趣细胞的分布。同时，荧光显微镜还可以通过标记小于此限制的粒子来克服传统光学显微镜的分辨率限制。例如，可以用荧光标记标记病毒以显示其位置在生物样品的情况下，可以表达荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白。结合各种新颖形式的样品照明，荧光显微镜的这一优势实现了“超分辨率”显微镜技术，打破了传统光学显微镜的分辨率限制。荧光显微镜的主要限制之一是光漂白，其中标记物或颗粒停止发出荧光，因为吸收照明光的过程最终会改变它们的结构，使它们不再发光。图10：荧光显微镜。左：工作原理-照明光由短通激发滤光片过滤，并由二向色镜反射到样品。来自样品的荧光通过二向色镜，并被发射滤光片额外过滤以去除图像中残留的激发光。右图：有机晶体中分子的荧光图像(晶体轮廓显示为黄色虚线)。由于来自其他分子和晶体材料的荧光，背景并不完全黑暗。　　免疫荧光显微镜　　免疫荧光显微镜是主要用于在微生物的细胞内的生物分子可视化的位置荧光显微镜的具体变化。在这里，用荧光标记物标记或固有荧光的抗体与感兴趣的生物分子结合，揭示它们的位置。(如下图11)图11：免疫荧光显微镜。肌动蛋白丝(紫色)、微管(黄色)和细胞核(绿色)的免疫荧光标记的两个间期细胞。　　共聚焦显微镜　　共聚焦显微镜是一种显微镜技术，它可以逐点成像来自样品的散射或荧光。不是一次对整个样品进行照明和成像，而是在样品区域上扫描源自点状光源的照明点，敏感检测器仅检测来自该点的光，从而产生2D图像。这种方法允许以高分辨率对弱信号样本进行成像，因为来自采样点之外的不需要的背景信号被有效抑制。在这里，所使用的波长和物镜在所有三个维度上都限制了成像光斑的大小。这允许通过将物镜移动到距样品不同的距离，在样品内的不同深度处制作2D图像。然后可以组合这些2D图像“切片”以创建样本的3D图像，这是所讨论的其他宽视场显微镜技术无法实现的，并且还允许以3D方式测量样品尺寸。这些优势的代价是无法一次性拍摄图像，而是必须逐点构建图像，这可能非常耗时并阻碍样本的实时成像(如下图12)。图12：单分子荧光的共聚焦荧光图像。小点对应于单个分子的荧光，而较大的点对应于分子簇。此处的荧光背景比简单的荧光显微镜图像弱得多，如亮点之间的暗区所见。　　双光子显微镜　　双光子显微镜(Two-photonmicroscopy，TPM)是荧光显微镜的一种变体，它使用双光子吸收来激发荧光，而不是单光子激发。在这里，通过吸收两个光子的组合来激发荧光，其能量大约是单个光子激发所需能量的一半。例如，在该方案中，通常由单个蓝色光子激发的荧光团可以被两个近红外光子激发。在TPM中，图像是逐点建立的，就像在共聚焦显微镜中一样，也就是说，双光子激发点在样品上扫描，样品荧光由灵敏的检测器检测。与传统荧光显微镜相比，激发和荧光能量的巨大差异导致了多重优势：首先，它允许使用更长的激发波长，在样品内散射较少，因此穿透更深，以允许在其表面下方对样品进行成像并创建3D样品图像。同时，由于激发能量低得多，光漂白大大减少，这对易碎样品很有用。激发点周围的荧光背景也大大减少，因为有效的双光子吸收仅发生在激发光束的焦点处，因此可以观察到来自样品小部分的荧光(如下图13)。　　TPM的一个缺点是双光子吸收的概率远低于单光子吸收，因此需要高强度照明，如脉冲激光，才能达到实用的荧光信号强度。图13：双光子显微镜。花粉的薄光学切片，显示荧光主要来自外层。　　光片显微镜　　光片显微技术是荧光显微术的一种形式，其中样品被垂直于观察方向的薄“片”光照射，从而仅对样品的薄切片(通常为几微米)进行成像。通过在样品在光片中旋转的同时拍摄一系列图像，可以形成3D图像。这要求样品大部分是透明的，这就是为什么这种技术通常用于形成小型透明生物结构的3D图像，例如细胞、胚胎和生物体。(如下图14)图14：光片显微镜。左：工作原理。右：通过荧光成像用光片显微镜拍摄的小鼠大脑的荧光图像。　　全内反射荧光显微镜　　全内反射荧光(Totalinternal reflectionfluorescence microscopy ，TIRF)是一种荧光显微技术，可通过极薄(约100nm厚)的样品切片制作2D荧光图像。这是通过照明光的渐逝场激发样品的荧光来实现的，当它在两种不同折射率(n)的材料之间的边界处经历全内反射时就会发生这种情况。消逝场具有与照明光相同的波长，但与界面紧密结合。在TIRF显微镜中，激发光通常在载玻片(n=1.52)和样品分散的水介质(n=1.35)之间的界面处发生全内反射。渐逝场的强度随距离呈指数下降来自界面，这样在最终图像中只能观察到靠近界面的荧光团。这也导致来自切片外区域的荧光背景的强烈抑制，这允许拾取微弱的荧光信号，例如在定位单个分子时。这使得TIRF非常适用于观察参与细胞间相互作用的荧光蛋白(如下图15)的微弱信号，但也需要将样品分散在水性介质中，这可能会限制可以测量的样品类型。图15：TIRF图像显示培养的视网膜色素上皮细胞中的蛋白质荧光。每个像素对应67nm。　　膨胀显微镜　　膨胀显微镜背后的基本概念是增加通常需要高分辨率显微镜的样品尺寸，以便可以使用标准显微镜技术(尤其是荧光显微镜)对其进行成像。这适用于保存的标本，例如生物分子、细胞、细菌和组织切片，可以使用下图16中所示的化学过程在所有维度(各向同性)均匀扩展多达50倍。扩展样本可以隔离感兴趣的个别特征通常是隐藏的，可以使它们透明，从而可以对它们的内部进行成像。图16：膨胀显微镜的样品制备。细胞首先被染色，然后连接到聚合物凝胶基质上。然后细胞结构本身被溶解(消化)，使染色的部分随着凝胶各向同性地膨胀，从而使染色的结构更详细地成像。　　光学显微镜中的卷积　　除了使光学系统适应特定用例之外，现代光学显微镜还利用了数字图像处理，例如图像去卷积。该技术通过补偿光学系统本身固有的模糊，可以提高空间分辨率以及光学显微镜拍摄图像的定位精度。这种模糊可以在校准步骤中测量，然后可以用于对图像进行去卷积，从而减少模糊。通过将高性能光学元件与先进的图像处理相结合，数字显微镜可以突破分辨率的极限，以更深入地观察微观世界。(如下图17)图17：图像解卷积。左：原始荧光图像。右：解卷积后的图像，显示细节增加。　　光学显微镜与电子显微镜　　光学显微术通常使用可见光谱中的光波长，由于瑞利准则，其空间分辨率固有地限制为所用波长的大约一半(最多约为200nm)。然而，即使使用具有高NA和高级图像处理的物镜，也无法克服这一基本限制。相反，观察较小的结构需要使用较短波长的电磁辐射。这是电子显微镜的基本原理，其中使用电子而不是可见光照亮样品。电子具有比可见光短得多的相关波长，因此可以实现高达10000000倍的放大倍数，甚至可以分辨单个原子。(如下图18)　　图18：同心聚合物结构中纳米晶体放大15000倍的扫描电子显微镜图像，即使是细微的细节，例如基材的孔隙，也能分辨出来。　　总结与结论　　光学显微镜是一种强大的工具，可用于检查各种应用中的小样本。通过调整用于特定用例的照明和成像技术，可以获得高分辨率图像，从而深入了解样品中的微观结构和过程。文中，我们讨论了各种光学显微镜技术的特点、优势和劣势，这些技术在光线照射和收集方式上有所不同。显微镜种类优点技术限制典型应用亮视野显微镜结构相对简单，光学元件很少低对比度、完全透明的物体不能直接成像，可能需要染色对彩色或染色样品和部分透明材料进行成像暗视野显微镜显示小结构和表面粗糙度，允许对未染色样品进行成像所需的高照明功率会损坏样品，只能看到散射图像特征细胞内颗粒成像，表面检测相差显微镜实现透明样品的成像复杂的光学设置，需要的高照明功率会损坏样品，通常图像较暗跟踪细胞运动，成像幼虫微分干涉对比显微镜比PCM更高的分辨率复杂的光学设置，需要的高照明功率会损坏样品，通常图像较暗活的、未染色的细胞和纳米颗粒的高分辨率成像偏光显微镜来自样品非双折射区域的强背景抑制，允许测量样品厚度和双折射需要双折射样品成像胶原蛋白，揭示晶体中的晶界荧光显微镜允许挑出样品中的单个荧光团和特定的感兴趣区域，可以克服分辨率限制需要荧光样品和灵敏的检测器，光漂白会减弱信号成像细胞成分、单分子、蛋白质免疫荧光显微镜使用抗体靶向可视化特定的生物分子大量样品制备，需要荧光样品，光漂白识别和跟踪细胞和蛋白质共聚焦显微镜低背景信号，可以创建3D图像成像速度慢，需要复杂的光学系统3D细胞成像，荧光信号较弱的成像样品，表面分析双光子显微镜样品穿透深度、背景信号低、光漂白少成像速度慢，需要复杂的光学系统和大功率照明神经科学，深层组织成像光片显微镜图像仅样品的极薄切片，可通过旋转样品创建3D图像成像速度慢，需要复杂的光学系统细胞和生物体的3D成像全内反射荧光显微镜强大的背景抑制，极精细的垂直切片成像仅限于样品的薄区域，需要复杂的光学系统，样品需要在水介质中单分子成像，成像分子运输膨胀显微镜提高标准荧光显微镜的有效分辨率需要对样品进行化学处理，不适用于活体样品生物样品的高分辨率成像　　参考：　　1. Rochow TG, Tucker PA. A Brief History of Microscopy. In: Introduction to Microscopy by Means of Light, Electrons, X Rays, or Acoustics. Springer US 1994:1-21. doi:10.1007/978-1-4899-1513-9_1　　2. Smith WJ. Modern Optical Engineering: The Design of Optical Systems.

自岛津成像质谱显微镜iMScope TRIO面世以来，各应用领域行业对它给予了高度期待，目前针对于医药研发、食品分析、生命科学等应用研究，利用岛津iMScope TRIO带来那些收获和成果呢？7月16日在岛津北京分公司成功举办了成像质谱显微镜技术交流会。专程邀请了大阪大学工学院研究课副教授新间秀一博士、北京大学分析测试中心聂洪港博士、岛津日本公司iMScope TRIO产品经理Koretsugu Ogata博士来到会议现场为用户分享研发尖端内容，现场交流气氛十分热烈。会议首先由岛津公司分析测试仪器市场部胡家祥部长发表致辞，胡部长首先欢迎各位的到来，他讲到iMScope TRIO成像质谱显微镜iMScope的最新一代产品。“TRIO”进一步发扬光大iMScope独有的质谱分析成像、光学图像、定性分析3大特长。岛津公司始终期望提供科技便利，搭建沟通桥梁，为科技研发共同进步。会议现场 岛津公司分析测试仪器市场部胡家祥部长发表致辞 大阪大学大学院工学研究科新间秀一(Shuichi Shimma) 副教授发表了题为《Seeing is believing - Development of iMScope TRIO and applications》的报告。他根据多年的成像质谱工作经验，介绍了iMScope TRIO在医学，药学，食品科学，农药残留以及毛发类的研究成果。分析样品的种类可涉及到动物组织，植物组织，毛发样品，分享给国内的客户很多宝贵的经验和建议。 大阪大学大学院工学研究科新间秀一副教授发表北京大学分析测试中心聂洪港博士发表内容为《成像质谱显微镜应用介绍》。北京大学分析测试中心购买了国内第一台iMScope TRIO，装机不到半年的时间，以聂洪港博士为中心，进行了很多样品的分析。聂博士分享了一些使用iMScope TRIO分析的结果，使参会的客户对岛津的成像质谱更具有信心。北京大学分析测试中心聂洪港博士发表来自岛津公司日本本部iMScope TRIO产品经理Koretsugu Ogata博士发表内容为《成像质谱显微镜以及最新分析软件的介绍》。他介绍了成像质谱显微镜的硬件和最新分析软件。新软件的功能弥补了现有软件的很多缺陷，使iMScope TRIO的数据采集到分析更加流畅，分析结果更加满足了很多研究者的需求。岛津日本本部iMScope TRIO产品经理Koretsugu Ogata博士发表岛津公司市场部生命科学产品经理韩美英博士，她简单介绍了2018 ASMS新推出的四极杆飞行时间质谱仪LCMS-9030的高置信度定性和定量的性能，以及获得CFDA认证的临床质谱仪。岛津公司市场部生命科学产品经理韩美英博士发表 交流现场随后由岛津中国质谱中心iMScope TRIO负责人董静博士，带领用户参观了质谱中心并介绍了组织切片的方法以及涂敷基质方法等前处理的技巧，给参会人员演示了简单的仪器操作流程，让客户实际体验iMScope TRIO。 仪器讲解演示关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司，在中国全境拥有13个分公司，事业规模不断扩大。其下设有北京、上海、广州、沈阳、成都分析中心，并拥有覆盖全国30个省的销售代理商网络以及60多个技术服务站，已构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。本公司以“为了人类和地球的健康”为经营理念，始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务，为中国社会的进步贡献力量。

新加坡国立大学耗资2400万元设立国大生物成像科学中心(NUS Centre for BioImaging Sciences)，并引进东南亚首台高端显微镜，希望通过新型成像技术协助解决在生命科学、医学、环境和能源等方面所面对的问题。 　　这个中心结合了国大其他学院，包括理学院、工程学院、杜克—国大医学研究生院，以及新加坡力学生物学研究所的多名优秀生物学家、化学家、工程师和电脑科学家的能力，在传染性疾病、植物生物学和神经退行性疾病等方面进行跨学科研究。 　　新加坡科技研究局主席林泉宝昨早在国大为新中心主持开幕仪式致词时说:“生物成像在未来有潜力在转化型研究，尤其是在观察分子互动、抗癌功能，及人体组织的代谢与基因表达等方面扮演举足轻重的角色。” 　　他因此给予这个新中心厚望，并“相信这个中心将能进一步协助提高本地的生物成像能力。” 　　这个中心获得国立研究基金(National Research Foundation)与教育部资助，拥有约9名研究员。 　　低温透射显微镜 耗资500万元引进 　　中心最大的亮点就是为进行生命科学研究而特地耗资500万元引进FEI Titan Krios低温透射电子显微镜(cryo transmission electron microscope)。这是全世界第15台，也是亚洲除中国有的两台以外，这个区域的第三台。 　　这台高端显微镜将能在低温或液氮(liquid nitrogen)条件下进行成像，这个特点对研究员来说尤其重要，因为与其他技术如染色和嵌入等事前准备技术相比，利用前者将不会改变样品的生物特性，因此能使所获得的研究结果更具准确性。

2023年2月23日，北京大学程和平/王爱民团队在Nature Methods在线发表题为“Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection”的文章。文中报道了重量仅为2.17克的微型化三光子显微镜（图1），首次实现对自由行为小鼠的大脑全皮层和海马神经元功能成像，为揭示大脑深部结构中的神经机制开启了新的研究范式。图1 小鼠佩戴微型化三光子显微镜实景图解析脑连接图谱和功能动态图谱是我国和世界多国脑计划的一个重点研究方向，为此需要打造自由运动动物佩戴式显微成像类研究工具。2017年，北京大学程和平院士团队成功研制第一代2.2克微型化双光子显微镜，获取了小鼠在自由行为过程中大脑皮层神经元和神经突触活动的动态图像。2021年，该团队的第二代微型化双光子显微镜将成像视野扩大了7.8倍，同时具备获取大脑皮层上千个神经元功能信号的三维成像能力。此次，北京大学最新的微型化三光子显微镜一举突破了此前微型化多光子显微镜的成像深度极限：显微镜激发光路可以穿透整个小鼠大脑皮层和胼胝体，实现对小鼠海马CA1亚区的直接观测记录（图2，Video 1-2），神经元钙信号最大成像深度可达1.2 mm，血管成像深度可达1.4 mm。另外，在光毒性方面，全皮层钙信号成像仅需要几个毫瓦，海马钙信号成像仅需要20至50毫瓦，大大低于组织损伤的安全阈值。因此，该款微型三光子显微镜可以长时间不间断连续观测神经元功能活动，而不产生明显的光漂白与光损伤。图2 微型三光子显微成像记录小鼠大脑皮层L1-L6和海马CA1的结构和功能动态。CC：胼胝体。绿色代表GCaMP6s标记的神经元荧光钙信号，洋红色代表硬脑膜、微血管和脑白质界面的三次谐波信号。Video1 这是使用北大微型化三光子显微镜拍摄的小鼠大脑从大脑皮层到胼胝体再到海马CA1亚区的三维重建图。绿色代表GCaMP6s标记的神经元荧光信号，洋红色代表硬脑膜、微血管和脑白质界面的三次谐波信号。左上角显示成像深度，可以看到，激光进入大脑，以硬脑膜作为0点，向下移动z轴位移台，我们一次看到了皮层L1至L6分层的神经元胞体和微血管，之后我们看到了胼胝体致密的纤维结构。在穿过胼胝体后，我们继续向下，我们终于看到了位于海马CA1亚区的神经元胞体。Video2 左下图是小鼠佩戴着微型化三光子探头，在鼠笼(长29厘米× 17.5厘米宽× 15厘米高)中自由探索。左上图是此时小鼠佩戴的微型化三光子探头正在对深度为978 μm的海马CA1亚区神经元荧光钙信号进行成像（帧率8.35Hz，物镜后的光功率为35.9 mW）。右图展示了左上图中10个神经元的钙活动轨迹，尖峰代表钙信号发放。钙活动轨迹上移动的蓝线与小鼠自由行为视频同步。海马体位于皮层和胼胝体下面，在短期记忆到长期记忆的巩固、空间记忆和情绪编码等方面起重要作用。在啮齿类动物研究模型中，海马距离脑表面深度大于一个毫米。由于大脑组织，特别是胼胝体，具有对光的高散射光学特性，所以突破成像深度极限是长期以来困扰神经科学家的一个极大的挑战。此前的微型单光子及微型多光子显微镜均无法实现穿透全皮层直接对海马区进行无损成像。北京大学微型化三光子显微镜成像深度的突破得益于全新的光学构型设计（图3）。作者通过对皮层、白质和海马体建立分层散射模型进行仿真，发现荧光信号从深层组织到达脑表面时已经处于随机散射的状态，使得显微物镜荧光收集效率降低，从而极大限制了成像深度。针对这一问题，经典阿贝聚光镜结构被引入构型设计中：微型阿贝聚光镜与简化的无限远物镜密接可以提高散射光的通透效率；阿贝聚光镜与激发光路中的微型管镜部分复用，可以进一步简化结构，降低损耗。总体上，新微型化显微镜的散射荧光收集效率实现了成倍的提升。图3 微型化三光子显微镜光学构型同时，利用微型三光子显微镜，作者研究了小鼠顶叶皮层第六层神经元在抓取糖豆这一感觉运动过程中的编码机制：发现大约37%的神经元在抓取动作之前就开始活跃且在抓取时最活跃，大约5.6%的神经元在抓取动作之后开始活跃，说明不同神经元参与了不同阶段的编码（图4，Video 3）。这一结果初步展示了微型化三光子显微镜在脑科学研究中的应用潜力。图4 小鼠顶叶皮层第六层神经元在抓取糖豆任务中的不同反应类型Video3 左图是佩戴着微型化三光子显微镜的小鼠在0.5厘米狭缝中用手抓取糖豆吃。中间图是此时微型化三光子显微镜探头拍摄的PPC脑区皮层第6层神经元（位于650微米深度）荧光钙信号（GCaMP6s标记的神经元，帧率15.93 Hz）。右图是选取中间图中5个神经元的钙活动轨迹，其中每条绿线表示一次小鼠的抓取动作。移动的蓝色线与左图的小鼠行为视频以及中间图中的神经元活动同步。视频以正常(×1)、慢速(×0.5)和快速(×10)的速度播放，以便于查看抓取行为。北京大学未来技术学院博士后赵春竹、北京大学前沿交叉学科研究院博士研究生陈诗源、北京大学分子医学南京转化研究院研究员张立风为该论文的共同第一作者，北京大学程和平、王爱民、赵春竹为论文的共同通讯作者。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41592-023-01777-3这是程和平院士领衔发表的又一重大微型化显微成像成果。更早之前，由程和平院士牵头研发的微型化双光子活体成像技术，被Nature Methods评为“2018年度方法”，被国家科技部评为“2017度中国十大科学进展”。该技术将传统双光子显微镜中的核心探头，都缩减在一个仅有2.2克重的微小部件中。这项自主研发的核心技术已经成功商业化生产，产品为配戴式双光子显微镜，目前已经在世界多地实现销售，被国内外科学家应用于神经科学研究的多个领域，并获得了业内知名专家学者的高度认可。

2022年的春节已接近尾声，科研的小伙伴已经开始忙碌起来了，对于新学期是不是也有新的计划，发一篇sci的文章顺利毕业，脱单flag，头发多一点点，细胞养好，科研项目进展顺利，老师能给买台心仪已久的显微镜；你想知道选择什么种类的显微镜，正置还是倒置，宽场显微镜、超高分辨率显微镜、激光共焦显微镜等等，小本本备好，我们开始了。1不同成像原理，不同分辨率的显微镜如何选择显微镜作为生命科学领域研究的必须工具，其结构复杂，配置繁多，根据不同的配置和结构，相应的价格有很大的差异。那很多用户在实际采购过程中，看到长串的配置不知如何去选择，怎么用合理的价格去买到一个完全能够满足自己实验需求的显微镜呢？从今天这期推文开始，将会着重介绍选择显微镜的几个关键核心问题，目的是让用户能够在自己的预算范围内选择出符合自己实验需求的显微镜。首先要知道显微镜从开始诞生发展到现在，主要通过分辨率来划分，分为宽场显微镜、超高分辨率显微镜、激光共焦显微镜以及电镜。这一系列显微镜的分辨率从光镜的200纳米到超高与共聚焦的100多到几十纳米再到电镜的0.2纳米。并不是说显微镜的分辨率越高，就越适合我们的研究。分辨率越高，意味着其价格和操作的难度系数是逐级增长的。那我们如何去选择一个适合我们的显微镜呢？要根据老师和用户自己样品的大小去选择。2不同机型的选择我们在根据样品的大小和观察的实验需求，确定了某一类型的显微镜之后。我们需要根据实验样品去选择相对应的合适机型。显微镜的主要机型，根据其光路设计的不同，主要分为体视显微镜、正置显微镜和倒置显微镜。体视显微镜：体视显微镜，是一种具有正像立体感的显微镜，被广泛应用于材料宏观表面观察、失效分析、断口分析等工业领域。以及生物学、医学、农林、工业及海洋生物各部门。因为体视显微镜的光路设计，符合人体眼睛夹角的偏角，所以通过体视显微镜观察物体时，类似于我们眼睛的成像光路，这样会让我们看到立体的图像呈现。正是由于此设计，体视显微镜的分辨率要远低于传统的正置或倒置显微镜。体视显微镜更多的是观察小物体的宏观表象，而不是更为精细的细节。正置显微镜：正置显微镜作为最早诞生的机型它更多的是要配合玻片来对样品实现显微观察。如何来定义正置显微镜呢？显微镜物镜朝下，观察的样品在物镜的下方，这样的显微镜我们称之为正置显微镜。一般适用于的观察样品为：透明样品、薄的样片、生物切片、涂片等。但由于正置显微镜的机械设计，样品位于载物台与物镜中间。低倍物镜齐焦时，与载物台之间的距离大约为三厘米左右。像无法切割的厚样品，类似矿石、零件或者是在孔板、培养皿、培养瓶中培养的细胞，就无法在正置显微镜下进行观察，那由此人们设计了倒置显微镜。倒置显微镜：顾名思义，倒置显微镜与正置显微镜正好相反，那么定义也是相反的，物镜朝上，要观察的样品在物镜的上方，此类显微镜我们称之为倒置显微镜。我们可以看到倒置显微镜，物镜和载物台之间不再放观察的样品，样品是放于载物台的上面，所以样品的厚度就不会受到载物台与物镜之间距离的限制。因此倒置显微镜主要用于微生物、细胞、细菌、组织培养、悬浮体、沉淀物等的观察。介绍了三种不同形式的显微镜，相信我们的老师和用户对自己的样品适用于什么类型的显微镜已经有了一个大体的判断。当我们更多的去观察样品的立体结构，对细节和分辨率没有更高追求的时候，我们通常会选择体视显微镜。当我们的样品无法制成玻片或者不能放在玻片上时，我们就去选择倒置显微镜。如果能制成玻片就选择正置。为什么说能制成玻片就去选择正置呢？因为对于倒置显微镜来说，正置显微镜的高倍数观察更方便，比如60X和100X的油镜。同时，因为它的光路要比倒置更短，搭配高分辨率聚光器后分辨率更高，对比度更好。通过我们这期推文的介绍，老师对于选择哪种分辨率水平的显微镜，以及什么类型的显微镜会有一个较为清楚的了解。这些只是我们采购或选择显微镜的第一步，就是我们确定显微镜的类型。针对不同的观察样品，又会有其更为适应的观察方式，又有不同的光源，不同品质的物镜，供我们去选择。欲知后事如何，且听下回分解。｜申请试用｜ECHO 显微镜可以申请试用哦！关注“深蓝云生物科技”公众号，点击“云活动”→“试用中心”即可。

大米中磷脂类化合物的空间分布质谱成像分析 “五谷者，万民之命，国之重宝”，粮食生产是安天下、保供给、促发展、稳民心的战略产业。大米是地球上主要的粮食作物之一，里面含有90%以上人体所需的营养物质，是全世界一半人口的主要食粮。磷脂是大米中重要的脂类化合物，占谷物总脂质含量的10%，具有重要的营养价值。然而，大米在储藏过程中，磷脂会发生水解产生醛、酮、酚等挥发性有机化合物，导致大米产生腐败气味，降低其食用和利用价值。因此，系统性研究大米中磷脂类化合物的空间分布分析，对改善大米存储条件、减缓大米陈化、保障食品安全、提高大米的食用品质等具有十分重要的意义。 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱成像（MALDI-TOF-MSI）是近年发展起来的新型分子成像技术，可直接分析样品组织，同时获得多种生物分子，如蛋白、多肽、脂质、糖类等内源性代谢物的空间分布信息。本研究工作利用具有高空间分辨率、高灵敏度的MALDI-TOF-MSI质谱成像技术成功实现了大米中磷脂类化合物的空间分布分析（Fig.1）。 Fig. 1. 基于MALDI-TOF-MSI技术的大米中磷脂类化合物空间分布分析示意图 1. iMScope TRIO 成像质谱显微镜测试条件 10% 明胶水溶液包埋大米，-80°C 冷冻8小时, 采用CM1950 切片机 (Leica, Wetzlar, 德国) 进行冷冻切片，切片厚度为16 μm。所得组织切片放置在ITO导电载玻片上 (100Ω/ m2，日本大阪松浪玻璃)，用基质升华仪iMLayer (Shimadzu，Kyoto，日本) 在大米组织切片上均匀沉积 2,5-二羟基苯甲酸（DHB）基质。采用成像质谱显微镜iMScope TRIO (Shimadzu，Kyoto，日本) 对大米组织切片进行MALDI 质谱成像，使用Imaging MS solution Ver.1.30 (Shimadzu) 软件分析质谱数据，根据二级质谱图与文献、脂质数据库联用进行分析物鉴定。质谱条件如下：正离子模式，质量扫描范围为m/z 500-1000；激光强度25，激光斑点大小设置为1（大约为10 μm，an arbitrary unit of iMScope），激光频率为1000 Hz；检测电压1.85 kV；步长35μm。 iMScope TRIO 2. 基于 iMScope TRIO 成像质谱显微镜进行大米中磷脂类化合物的空间分布分析 采用iMScope TRIO成像质谱显微镜在分子水平上对大米中磷脂类化合物的空间分布进行精准分析。如图Fig.2，正离子模式下，m/z 500-1000 范围内共获得12个代表性磷脂分子的空间分布图像，显然，磷脂分子的分布模式与糙米植物学结构密切相关，在糙米组织切片中显示出不同的空间分布模式。溶血卵磷脂类化合物（LPC）分布于整个糙米籽粒中，内胚乳中的含量相对较高。卵磷脂类化合物（PC）主要位于胚芽和种皮中，胚芽中含量相对较高，内胚乳中含量极少。本研究实现了大米中磷脂化合物的可视化，为大米营养价值的评价提供了理论依据。 3. 基于iMScope TRIO 成像质谱显微镜进行大米加工过程中磷脂类化合物变化规律探究 粮食安全是事关国家和社会稳定的重大问题，个别商贩通过低价收购陈化大米，经二次加工添加矿物油、石蜡、色素等物质改变陈米外观形态，将其推向市场牟取利益。因此，为保证粮食安全，采用MALDI-TOF-MSI质谱成像技术，对大米加工过程中磷脂类化合物变化规律进行探究，结果表明（图Fig.3），糙米经过研磨、抛光，美白等系列加工过程，去除了米糠层和胚芽成为精白米，这一加工过程中随着研磨、抛光程度的增加，大米表层卵磷脂的含量逐渐减少直至消失，由此说明大米表面的卵磷脂可以作为重要指标用以大米加工程度的鉴定。 Fig. 2. 糙米组织切片中12个磷脂化合物MALDI-TOF-MS质谱图像Fig. 3. 精白米和糙米中磷脂类化合物的MALDI-TOF-MS质谱图像 本文相关内容由中国科学院兰州化学物理研究所张燕霞博士生提供，详细研究内容已正式发表于Journal of Chromatography A 1651 (2021) 462302。 文献题目《Spatial distribution analysis of phospholipids in rice by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry imaging》 使用仪器岛津iMScope TRIO 作者Yan-Xia Zhang a, b, Xiao-Bo Zhao a, Wei Ha a, Yi-Da Zhang a,*, Yan-Ping Shi a,*a Chinese Academy of Sciences Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources and Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, Chinab University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 数十年来，科学家一直在使用荧光显微镜来研究生物细胞和生物的内部运作。但是，这些平台中的许多平台通常太慢，无法跟随3D的生物学作用，并可能在强光照射下对生物样本造成破坏。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 为了应对这些挑战，由香港大学（HKU）电气与电子工程学系副教授兼生物医学工程学学士学位课程主任、项目负责人Kevin Tsia博士领导的研究团队开发了一种新的光学成像技术——编码光片阵列显微术（CLAM）。它可以高速进行3D成像，并且具有足够的功率效率和柔和度，能够在扫描过程中以现有技术无法达到的水平保存活体标本。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 360px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202004/uepic/8b848a8f-6895-4507-a695-f4520371e1c7.jpg" title=" 1.jpg" alt=" 1.jpg" width=" 600" height=" 360" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-indent: 0em text-align: center " strong span style=" font-size: 14px " Kevin Tsia博士（右一）和他的团队开发了一种新的光学成像技术，可以使3D荧光显微镜更高效，更不损坏。 /span /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 这项先进的成像技术最近发表在《光：科学与应用》上，这项创新已经提交了美国专利申请。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 新光学成像技术——编码光片阵列显微术（CLAM） /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 现有的3D生物显微镜平台速度较慢，因为必须依次扫描标本的全部体积，并逐点、逐行或逐平面成像。在这些平台上，单个3D快照需要在标本上重复照明，标本的光照强度通常是日光的数千倍至百万倍，这很可能会损坏标本本身，因此不利于长期用于各种解剖学、发育生物学和神经科学等领域的生物成像。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 此外，这些平台通常很快耗尽有限的荧光“预算”——这是一个基本限制，即荧光灯只能在有限的时间内通过照明产生，然后在一个称为“光漂白”的过程中永久消失，这就限制了在一个样本上可以执行多少图像采集。& nbsp /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 360px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202004/uepic/3ca9166f-5215-4fb8-b0e0-a6eee546de6d.jpg" title=" 　编码光片阵列显微镜（CLAM）.jpg" alt=" 　编码光片阵列显微镜（CLAM）.jpg" width=" 600" height=" 360" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-indent: 0em text-align: center " strong span style=" font-size: 14px " 编码光片阵列显微镜（CLAM） 香港大学 /span /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " Tsia博士说：“ 样品上的重复照明不仅会加速光致漂白，而且还会产生过多的荧光，最终无法形成最终图像。因此，荧光& #39 预算& #39 在这些成像平台上被大大浪费了。而CLAM允许以高帧速率进行3D荧光成像，与最先进的技术（每秒约10倍的体积）相当。更重要的是，它比科学实验室中广泛使用的标准3D显微镜更节能，比标准3D显微镜温和1000倍以上，这大大减少了扫描过程中对活体标本造成的损害。”& nbsp /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 据介绍，CLAM的核心技术是使用一对平行反射镜将单个激光束转换成高密度的“光片”阵列，以荧光激发的方式将其扩散到整个样品区域。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 整个3D体积内的图像可以同时（即并行化）拍摄的，而无需按其他技术的要求逐点、逐行或逐平面扫描样本。这样的CLAM中的3D并行化可产生非常柔和而有效的3D荧光成像，而不会牺牲灵敏度和速度，CLAM在降低光漂白效果方面也胜过普通的3D荧光成像方法 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 同时，为了在CLAM中保持图像分辨率和质量，团队转向了码分复用（CDM），这是一种图像编码技术，已广泛应用于电信领域，用于同时发送多个信号。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 开发该系统的另一位博士后研究员Queenie Lai博士解释说：“这种编码技术使我们能够使用2D图像传感器同时捕获和数字重建3D中的所有图像堆栈。CDM以前从未在3D成像中使用过，我们采用了这项技术，并取得了成功。” /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 作为概念验证的演示，该团队应用CLAM以每秒超过10体积的体积速率捕获微流体芯片中快速微粒流动的3D视频。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 挑战极限 提高CLAM扫描速度& nbsp /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " CLAM对成像速度没有根本的限制，唯一的限制来自系统中使用的检测器（即用于拍摄快照的相机）的速度。随着高速相机技术的不断发展，CLAM始终可以挑战其极限，以达到更高的扫描速度。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 该团队进一步采取了行动，将CLAM与HKU LKS医学院新开发的组织清除技术相结合，以高帧频对小鼠肾小球和肠血管系统进行3D可视化。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 280px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202004/uepic/f453719f-bebb-406d-8486-fef778022593.jpg" title=" 2.jpg" alt=" 2.jpg" width=" 600" height=" 280" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-indent: 0em text-align: center " strong span style=" font-size: 14px " 使用CLAM进行3D高速成像。学分：香港大学& nbsp /span /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 蔡医生说：“我们预计，这种组合技术可以扩展到档案生物学样本的大规模3D组织病理学研究，例如在大脑中绘制细胞组织以进行神经科学研究。由于CLAM成像比其他所有方法都要温和得多，因此它独特地有利于对生物样本以其活体形式进行长期和连续的& #39 监视& #39 。这可能会影响我们对细胞生物学许多方面的基本了解，例如不断跟踪动物胚胎发育成成年形式；实时监测细胞/生物如何被细菌或病毒感染；观察癌细胞如何被药物杀死，以及当今现有技术无法实现的其他挑战性任务。” /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " CLAM可以通过最少的硬件或软件修改就适用于许多当前的显微镜系统。利用此优势，该团队计划进一步升级当前的CLAM系统，以进行细胞生物学、动植物发育生物学研究。 /p p style=" text-align: left text-indent: 2em " 原文链接： a href=" https://www.sensorexpert.com.cn/article/7303.html" _src=" https://www.sensorexpert.com.cn/article/7303.html" https://www.sensorexpert.com.cn/article/7303.html /a /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 附： /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 讲座：《四合一数码显微镜，多种难题一机解决！》 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 主讲人：夏天齐& nbsp & nbsp 基恩士 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 时间：4月22日10:& nbsp 00 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 主要报告内容：此次讲座希望让更多使用显微镜的客户，了解到数码显微镜能解决的常规问题，作为技术储备，认识到VHX系列产品的一些功能和应用场景。 /p p style=" text-align: left text-indent: 2em " a href=" https://www.instrument.com.cn/webinar/meeting_13067.html" target=" _self" span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 点击报名，免费听课：https://www.instrument.com.cn/webinar/meeting_13067.html /span /a /p

镜质合璧 还原真实成像质谱显微镜用于米曲中磷脂和葡萄糖的可视化分析 引言米曲是清酒酿造中的关键元素。它在清酒酿造中的主要作用被认为是提供分解淀粉和蛋白质的消化酶。众所周知，米曲成品的成分对清酒的品质（味道和香气）有很大的影响。然而，目前为止对米曲质量的评估经常依赖于首席酿酒师的经验。这意味着此领域相关科学知识的不足，且仍有发展空间。当首席酿酒师评估米曲质量时，米曲的物理结构，即外观和质地似乎是质量指标之一。在过去的研究中利用扫描电子显微镜来研究米曲的内部结构，但直到近几年，评估米曲结构和成分关系的研究仍然进展甚微。由于岛津iMScope成像质谱显微镜可同时观察样品结构和成分分布，在本应用报告中，我们将iMScope应用于发酵领域，并尝试可视化分析米曲结构和成分分布。 如图1所示，质谱成像（MSI）是非常适合观察米曲结构以及决定其有效成分分布的技术。MSI应用于食品的论文，已有芦笋中天冬酰胺和姜黄根中姜黄素分布可视化的应用报告⑴,⑵。本文针对食品科学研究中的“发酵”新应用领域，尝试着将米曲内的结构和成分分布可视化。由于米曲非常易碎，在进行MSI分析时，未经前处理制作米曲切片几乎是不可能的。因此，我们研究了各种切片制备方法，并成功实现从生米到蒸米和米曲过程中的代谢物可视化分析。图1 质谱成像（MSI）工作流程 实验 2-1试剂使用羧甲基纤维素（CMC）（FUJIFILM Wako）为包埋剂，配制浓度为4%的CMC水溶液，并将溶液放入70℃的恒温箱过夜来确保完全溶解。本实验中使用的基质是α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）和N-(1-萘基)聚乙烯二胺二盐酸盐（NEDC）（Merck），溶剂为乙腈、异丙醇和甲醇（FUJIFILM Wako）、超纯水。 2-2切片制备使用清酒酿造用的抛光率为70%的山田锦大米（白鹤酒造株式会社）制成的蒸米和米曲。生米可视化研究中使用市售大米。如前所述，这些样品材料极其脆弱。因此，采用冷冻切片机制备切片并使用粘性冷冻膜（cryo-lab）回收获得的切片。将米粒包埋在上文所述的4%羧甲基纤维素溶液中，在-80℃冷冻。切片厚度为20 μm，获得的薄膜利用导电双面胶带（3M公司）固定在ITO涂层玻璃载玻片上（无MAS涂层，表面电阻：100 Ω/m2）（松浪玻璃工业株式会社）（图2）。图2 米曲切片制备 2-3基质涂敷在检测米粒切片和米曲切片中的磷脂时，使用岛津iMLayer基质升华系统将CHCA沉积在样品表面（图3），接着喷涂CHCA溶液(3)。基质升华的膜厚度为0.5 μm。利用由乙腈、异丙醇、超纯水（3: 1: 6）构成的含0.1 %甲酸的混合溶剂溶解CHCA，调节其浓度为10 mg/mL。已知可以有效电离葡萄糖的基质NEDC，利用iMLayer进行升华，升华时设置温度为220℃、时间为10分钟。NEDC基质升华后，利用5%甲醇溶液进一步进行重结晶。图3 iMLayer基质升华系统 2-4质谱成像MSI检测使用岛津iMScope成像质谱显微镜进行。激光照射次数为100次/点。正离子模式检测磷脂，空间分辨率为25 μm，负离子模式检测葡萄糖，空间分辨率为50 μm。检测范围：正离子模式m/z　400-800，负离子模式m/z 180-230。在所有检测中，激光强度均设置为45，检测器电压为2.1 kV。 2-5构建MS图数据分析和MS图像构建采用岛津MSI分析软件Imaging MS Solution和IMAGEREVEAL MS进行。IMAGEREVEAL MS是通过统计学功能实现非靶向分析的软件。它拥有卓越的校正函数（图像过滤、像素插值），并含有“相似图片提取”功能。本文后半部分所示的葡萄糖可视化数据是利用IMAGEREVEAL MS软件进行分析。 结果 3-1生米、蒸米和米曲中磷脂的分布图4显示了生米、蒸米和米曲切片中胆碱的分布。胆碱是一种在米曲制作过程中分布和数量会发生巨大变化的典型成分。生米的结果在碾米之前测得，且结果表明胆碱累积在大米胚芽中。在碾碎后的蒸米中，来自胆碱的峰急剧下降，但在米曲的内部则观察到极强的峰。这表明胆碱在米曲发酵过程（即米曲制作过程）形成。因此，使用MSI 可以观察到米曲制作过程中胆碱数量和空间分布发生急剧变化的现象。图4 生米、蒸米和米曲中胆碱的分布 在米曲的内部还观察到各种磷脂（包括溶血磷脂）的累积（图5）。尤其是溶血磷脂酰胆碱LPC（16:0），m/z 496.34和LPC（18:2），m/z 520.34显示这一趋势(4)。而磷脂m/z 748.35和786.30的MS图像显示出其在米曲中的不均匀分布。这种异质性被认为由曲霉（米曲霉，Aspergillus oryzae）侵入蒸米中生长出雾状菌丝导致，这个过程就被称为“hazekomi”。下一部分我们将介绍一种将hazekomi过程可视化的方法开发以及将这种方法与MSI结合使用的结果。图5 米曲（山田锦，稻米抛光率：70 %）中溶血磷脂和磷脂的分布 3-2hazekomi可视化及其与MSI的配合使用⑸,⑹haze指的是米曲霉菌丝在蒸米表面扩散时呈现的白点，在首席酿酒师进行米曲目检时被作为一个结果指标。在早期的hazekomi可视化研究中，Yoshii等人发表了一篇基于扫描电子显微镜（SEM）观察的报告，他们通过将米曲霉传播过程直接可视化的方式成功观察到了米曲中米曲霉的生长，该结果有助于改善制曲过程（7）。 利用SEM将hazekomi过程可视化时，观察微观区域的能力是一个重要特征。不过，我们认为将整个米曲hazekomi过程可视化的方法以及可获取成分分布信息的技术也是有用的。为了解决这一问题，我们引入了采用β-葡萄糖醛酸酶（GUS）作为标志基因的GUS报告系统用于hazekomi可视化。具体来说，通过构建米曲霉GUS表达株以及生产使用该菌株的米曲（以下称为GUS米曲）来实现对制曲过程中米曲霉生长的清晰观察。GUS米曲的使用实现了通过颜色反应来可视化米曲霉位置，而当这种技术和MSI配合使用时，可获取关于成分分布的信息。这两种技术的结合同时实现了整个米曲的hazekomi可视化以及成分分布的可视化研究。 在此我们将对这种旨在把GUS报告基因系统应用于米曲的创新研究进行阐述。GUS报告基因系统最初是为了将植物组织中菌丝体的可视化而开发的。在植物组织中，常见做法是将样品浸泡在5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷（X-Gluc）溶液中，这是一种用于着色的显色底物。拥有极硬细胞壁的植物组织即便是长期浸泡在X-Gluc溶液中，也能够毫无问题地维持样品观察所需的形态。 不过，如前所述，米曲非常脆弱，且其性状和植物组织完全不同。这意味着采用现有的着色方案将极为困难。事实上，我们证实了在米曲浸泡在X-Gluc溶液中固定着色所需时间内，样品的形态由于吸水而发生了很大的改变。为了避免这一问题，必须改变添加X-Gluc的方式。因此，我们构思了一种通过将X-Gluc溶液喷洒在GUS米曲切片上的方法来可视化分析hazekomi过程。 图6显示了采用这种方法得到的结果。这里制曲使用的是抛光率为70%的抛光白鹤锦稻米（白鹤酒造株式会社的酒米），并在制曲开始24h、31h以及43h后取样。随着制曲的进行，可以观察到靛蓝色从曲的表面渗透到内部。尤其是在43小时之后、制曲完成时，不仅在曲的表面，在内部也能检测到浓烈的靛蓝色，表明米曲霉已经到达了稻米内部。 曲的一个主要作用是在酿造（发酵）阶段提供各种酶，以便形成酵母菌所需的营养。观察到的主要酶为α-淀粉酶或葡萄糖淀粉酶，这两者会形成作为酵母生长所需的葡萄糖。此外，也有报道表示α-淀粉酶可能是影响曲霉菌丝体侵入性生长的非常重要的酶。图6 GUS米曲中hazekomi过程的可视化分析（比例尺：1 mm（插入图片：200 μm）） 尽管既往研究中报道了制曲后葡萄糖的增加，但hazekomi和葡萄糖分布之间的关系尚未明确。在制曲过程每个阶段的米曲质谱图中，确实观察到了葡萄糖峰强度的升高（图7）。已有报道表明NEDC可以增加癌组织中葡萄糖检测的灵敏度（8）。因此，当使用NEDC作为葡萄糖MSI的基质时，[M+Cl]-= m/z 215.02在负离子模式下被检测到。 为了研究GUS米曲的hazekomi过程和葡萄糖分布之间的关系，使用GUS染色切片相邻的切片进行了MSI，比较获得的葡萄糖离子强度和GUS染色图像的分布，图8显示其结果。 观察葡萄糖分布及与GUS染色图像的叠加可以了解到从制曲初始阶段到后期阶段，葡萄糖从外到内增加。这一结果表明hazekomi和葡萄糖分布之间存在相关性。 另外，有些区域由于X-Gluc为深色且葡萄糖强度很高而成像为蓝色（黑色箭头显示），同时在本实验中也能看到有些部分虽然也观察到了hazekomi，但葡萄糖强度低，例如以黑色圆圈表示的区域。这些结果表明位置不同，hazekomi产生的葡萄糖量存在差异性。今后，可以通过包含各种代谢物（例如氨基酸、糖类、糖醇）分析的探讨来实现从化学角度更好地了解hazekomi现象。 虽然目前的考察着重于葡萄糖并解释了伴随hazekomi过程葡萄糖分布的变化，但可以想象，形成的酶的扩散范围和活性也会受到诸如米粒特征等其他因素的影响。这种新的可视化技术（GUS米曲和MSI的融合）预期可以改进米曲和其他曲衍生产品的制曲流程。图7 利用NEDC基质获得的葡萄糖峰的时间依赖性变化图8 GUS米曲中葡萄糖（[M + Cl]–）的可视化（比例尺：1 mm） 结论 在本研究中，分析了磷脂在山田锦大米（清酒酿造米）中的空间分布，并利用白鹤锦米（白鹤酒造株式会社的专有清酒米）可视化分析hazekomi过程和葡萄糖分布之间的关系。同时还利用白鹤锦米制备了一种表达GUS的米曲品系，并用于揭示hazekomi过程和葡萄糖分布之间的关系。这种新的可视化技术利用了GUS米曲和MSI相结合，可有助于更好地了解米曲和其他曲衍生产品的制曲流程并改进制曲方法。由于本实验中采用的岛津iMScope成像质谱显微镜能同时实现微观区域的光学显微镜观察以及显微镜下的质谱分析，将iMScope应用于各种酒曲和其他麦芽的分析，可以获得发酵领域相关新科学知识。 iMScope QT（图9）是iMScope的新一代产品，于2020年6月发布。在延续iMScope TRIO卓越的显微镜观察功能和空间分辨率的同时，新的iMScope QT提供了更高的质量分辨率、检测灵敏度和分析速度，让分析变得更轻松。同时，由于能够分析更宽的质量范围，期待MSI技术可以进一步扩展在不同研究领域应用的可能性。图 9 iMScope QT (1) K. Miyoshi, Y. Enomoto, E. Fukusaki, and S. Shimma, Shimadzu Application Note (No. 57).(2) S. Shimmaand T. Sagawa, Shimadzu Application Note (No. 63).(3) S. Shimma, Y. Takashima, J. Hashimoto, K. Yonemori, K. Tamura, and A. Hamada, J. Mass Spectrom., 2013, 48, 1285(4) N. Zaima, N. Goto-Inoue, T. Hayasaka, and M. Setou, Rapid Commun.Mass Spectrom., 2010, 24, 2723.(5) A.P.Wisman, Y. Tamada, S. Hirohata, K. Gomi, E. Fukusaki, S. Shimma, J. Biosci.Bioeng., 2020, 129, 296(6) A.P.Wisman, Y. Tamada, S. Hirohata, K. Gomi, E. Fukusaki, and S. Shimma, J. of Brew.Soc.Japan (in press).(7) M. Yoshii and I. Aramaki, J. of Brew.Soc.Japan, 2001, 96, 806.(8) J. Wang et al., Anal.Chem., 2015, 87, 422. 文献题目《成像质谱显微镜用于米曲中磷脂和葡萄糖的可视化分析》 使用仪器岛津iMScope TRIO 作者Shuichi Shimma *1, 2, Yoshihiro Tamada *3, Adinda Putri Wisman *1, Shuji Hirohata *3, Katsuya Gomi *4 Eiichiro Fukusaki *1,2*1 大阪大学工程研究生院生物技术系*2 大阪大学岛津组学创新研究室*3 白鹤酒造株式会社*4 日本东北大学农学研究生院未来生物产业的生物科学与生物技术系