冷冻机工作原理

我们知道冷冻机组是恒温恒湿试验箱的心脏，重中之重，确保冷冻机组的良好运行，才能顺利的降温并达到预设的低温，在前文恒温恒湿试验箱价格揭密中也有强调冷冻机组的重要性，恒温恒湿箱的品质保障离不开的冷冻机组。那么，是什么原因导致恒温恒湿试验箱的冷冻机组无法运转呢？宏展科技工程师根据多年的检修工作经验给带您一一分析检查。1、先检查插头与插座之间有没有接触不良，如果有的话应该接上；2、检查插座保险丝有没有烧坏了；3、拿电压仪表测量电压是不是过低而导致电压供电不足；4、检查温度调整器的指示钮是否转；5、检查过载继电器是否烧坏；6、检查马达是否被烧坏；

冷冻机油广泛应用于各行各业，用于去除设备中的热量。典型的应用包括酿造厂，使酿造厂的温度保持在零摄氏度左右，以及需要稳定的冷冻水供应的化学工艺中。制冷机通常通过制冷循环或蒸汽压缩来运行。近年来，吸收式制冷循环在工业上并没有得到广泛的应用，因此我们将把注意力集中在采用蒸汽压缩技术的制冷机上。在这种方法中，热量被制冷液吸收，制冷液沸腾后由液体变为气体。热量被去除之后，气体再被压缩回液体。就像家用空调一样，热量通常被转移到设备外部去除，所以从冷却介质到环境之间是净热传递。这些系统通常是密封的，因此制冷剂不会逸出。那么密封系统为什么需要进行油液分析？系统中的需要通过泵和卷轴进行移动和压缩。我们需要监控的是系统组件中轴承和其他运动部件的状况。具体而言，我们要监测的是轴承，卷轴，油品质量和污染。.压缩机的一个独特之处在于润滑剂必须与驱动系统的制冷剂混溶。通常，制造商会推荐与其系统和所选制冷剂兼容的润滑油。现代的臭氧友好型制冷剂通常需要合成油。多元醇酯润滑剂在冷却器系统中变也得非常普遍。为什么要进行监测?油的质量 - 润滑油的状态会影响其混溶性。我们应该检查确保用的是正确的机油，而且油的状况良好。机油污染 - 如果油被污染了，会对制冷机的效率产生负面影响。特别是水污染会降低制冷机的效率。磨损 - 正如我们所说，监控的关键部件是轴承和卷轴。过度的污染或磨损碎片可能导致轴承失效。早期检测可以在系统故障前进行修复。早期修复通常成本较低，并且可以防止停机。推荐的测试参数有哪些?水分- 水污染会降低制冷机的效率，也会导致腐蚀和冷冻问题。确保油是干燥的可以省去很多麻烦。酸值/碱值 - 对于氟利昂或R-22等氯化制冷剂，建议对总酸值(TAN)进行测试。对于氨基系统，建议对总碱值(TBN)进行测试。总碱值会影响制冷剂中润滑剂的混溶性。真空粘度 (40 ℃) -运动粘度是流体在重力作用下的阻力。这是润滑剂最重要的物理特性。如果制冷系统中润滑油粘度下降，则表明分离器不能正常工作。冷却系统中粘度的测量有时很难测量，因为制冷剂溶解在润滑剂中，在测量粘度之前，制冷剂通常必须先排气。这可能需要几个小时。幸运的是，如果你使用的是斯派超MiniVisc 3000，就不需要此步骤。MiniVisc的毛细管设计允许润滑油在测量时排出气体。磨损金属 - 金属元素分析可以确定污染源，使问题根源诊断变得更加容易。铁磁颗粒浓度 - 铁磁材料磨损的急剧增加或磨损颗粒尺寸的急剧增加通常表明磨损状况的异常或正在恶化。监测磨损金属颗粒可以让维修人员在故障发生之前进行维护。.

高低温冷热冲击试验箱是金属、塑料、橡胶、电子等材料行业必备的测试设备，用于测试材料结构或复合材料，在瞬间下经极高温及极低温的连续环境下所能忍受的程度，得以在最短时间内检测试样因热胀冷缩所引起的化学变化或物理伤害。分为两厢式和三厢式，区别在于试验方式和内部结构不同，产品符合标准为：GB/T2423.1-2008试验A、GB/T2423.2-2008试验B、GB-T10592-2008、GJB150.3-198、GJB360A-96方法107温度冲击试验的要求。　　　　高低温冷热冲击试验箱制冷工作原理：高低制冷循环均采用逆卡若循环，该循环由两个等温过程和两个绝热过程组成。其过程如下：制冷剂经压缩机绝热压缩到较高的压力，消耗了功使排气温度升高，之后制冷剂经冷凝器等温地和四周介质进行热交换，将热量传给四周介质。后制冷剂经阀绝热膨胀做功，这时制冷剂温度降低。最后制冷剂通过蒸发器等温地从温度较高的物体吸热，使被冷却物体温度降低。此循环周而复始从而达到降温之目的。　　　　高低温冷热冲击试验箱质量优势　　　　主要核心配件均采用国际大品牌的配件如法国泰康，日本路宫/和泉/三菱，施耐德，美国快达/杜邦冷媒，丹麦（DANFOSS），瑞典（AlfaLaval）等配件，假一罚十，能确保高低温冲击测试箱正常高效的运行。相比其他同行：采用国产配件或者是使用伪劣的冒牌配件充当品牌配件，发货到客户处和所说的完全不一致，质量大打折扣。　　　　高低温冷热冲击试验箱技术优势　　　　1.采用7″TFT真彩LCD触摸屏，比其它屏更大，更直观，操作简单，运行稳定，并且更节能。　　　　2.蒸发器采用水浸查漏方法，查漏彻底，确保设备稳定运行。　　　　3.采用模块化制冷机组，能确保制造质量，且维护替换非常方便。　　　　4.采用高均匀度的正压式风道系统，温度均匀高。　　　　5.采用最新的自动除霜技术，使除霜时间缩短，试设备的使用效率大大增加。　　　　6.具有多项安全保护措施,故障报警显示及故障原因和排除方法功能显示。　　　　三箱式高低温冷热冲击试验箱相比其他同行设备：　　　　1.控制器界面较小颜色单一，不便于观察和操作。　　　　2.采用传统方法，肥皂水查漏，不彻底。　　　　3.冷冻机组和机箱底板安装在一起，制造质量和维护性能不佳。　　　　4.无自动除霜技术，需手动除霜之后方可再进行试验，使用效率不佳。　　　　5.同行大部分高低温冲击测试箱，通常在运行一段时间后开始结霜，并且除霜时间非常长，使用效率低下。　　　　6.同行设备为了节省成本，导致设备的安全保护措施单一，非常容易造成安全隐患。　　　　三：三箱式高低温冷热冲击试验箱节能优势：三箱式冷热冲击试验箱采用自主研发的控制系统，精度高，稳定操作简单，控制器抛弃日本韩国等控制器的固定模式，采用最新的模糊运算技术，自动分析负载能力，合理调节冷媒流量，使设备节能高达20%。

6月29日，中国政府采购网发布《中国疾病预防控制中心公共卫生创新计划项目-病原冷冻电镜结构研究平台和高通量数字玻片成像系统公开招标公告》，中国疾病预防控制中心拟以9260万元人民币采购一批仪器设备，包含300kv冷冻透射电子显微镜1台（套），200KV冷冻透射电子显微镜1台（套），冷冻双束电镜1台（套），120kv透射电子显微镜1台（套），工作站1台（套），高压冷冻仪1台（套），冷冻电镜投入式冷冻制样设备2台，辉光放电仪1台（套），等离子清洗仪1台（套），真空离子溅射仪1台（套），正置荧光显微镜 （FIB光电联用光镜）1台（套），倒置荧光显微镜1台（套），液氮罐1台（套），高通量数字玻片成像系统1台（套）。以上仪器均接受进口产品。采购需求：包号品目号品目名称数量（台/套）是否接受进口产品分包预算金额（人民币万元）备注11-1300kv冷冻透射电子显微镜1是9000非单一产品采购包核心产品1-2200KV冷冻透射电子显微镜1是1-3冷冻双束电镜1是1-4120kv透射电子显微镜1是1-5工作站1是1-6高压冷冻仪1是1-7冷冻电镜投入式冷冻制样设备2是1-8辉光放电仪1是1-9等离子清洗仪1是1-10真空离子溅射仪1是1-11正置荧光显微镜 （FIB光电联用光镜）1是1-12倒置荧光显微镜1是1-13液氮罐1是22-1高通量数字玻片成像系统1是260单一产品采购包交货期合同签订后12个月内交货地点/项目现场中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所指定地点用途实验备注：本项目采购标的对应的《中小企业划型标准规定》所属行业为：工业采购标的需满足的质量、安全、技术规格、物理特性等要求：第1包 品目1-1 300kv冷冻透射电子显微镜一、技术参数：1、分辨率 ▲1.1、信息分辨率：≤0.12nm1.2、点分辨率：≤0.25nm1.3、线分辨率：≤0.14nm2、电子枪2.1、采用场发射电子枪2.2、使用寿命≥1年2.3、束斑漂移：≤0.5nm/min （10分钟内平均束斑漂移）2.4、亮度：≥7.5*107 A/m2srV2.5、辐射安全：≤0.5uSv/hr@距离0.1米电子枪3、加速电压3.1、最高加速电压：≥300kV3.2、在80kV至300kV间加速电压连续可调4、照明系统4.1、完全平行光系统，可实现多模式照明，在TEM模式中对大视野和可变视野都能够平行照明。▲4.2、线性畸变≤0.5% (TEM模式在18k×和155k×放大倍数之间)5、控制系统：控制软件具备应用脚本软件，用户可自行编写程序控制电镜进行特定或某些复杂的实验。6、真空系统：无油真空系统。7．放大倍数7.1、TEM模式放大倍数范围100×-700,000×7.2 在任何放大倍数实现完全无旋转成像8、物镜8.1、相机长度范围：300mm-2,500mm8.2、焦距≥3.5mm 8.3、物镜极靴间距≥10mm8.4、球差系数：≤3mm8.5、色差系数：≤3mm8.6、物镜光阑：70um、100um9．样品台系统9.1、计算机控制≥4轴样品台9.2、X/Y轴行程≥2mm9.3、Z轴行程≥0.4mm9.4、最大倾斜角度：不少于±70°9.5、最大图像漂移：X/Y方向 ≤1μm(+/- 70°内倾转)9.6、重复性：≤ 400nm(3次重复测试 ) 10. 自动进样系统10.1、一次能够装载≥10个样品，并能够自动更换和转移样品，所有样品均可回收并重复使用。10.2、待用样品在低温样品停泊装置保持在冷冻状态≥120小时。10.3、能够自动补充液氮。10.4、冰生长率：≤1%/24小时 (透射信息损耗)10.5、最低温度：≤-170 ℃10.6、样品交换后漂移：交换40分钟后：≤0.035nm/s▲10.7、同一样品在镜筒内可以保持在冷冻状态，连续收集数据时间≥72小时。11、电镜操作 11.1、具有低剂量曝光功能。11.2、可设置多个用户的等级，每个用户之间的参数 设置相对独立。11.3、要求电镜安装所需房间高度≤4m。12、直接电子探测系统 12.1、像素数≥4000×4000像素。12.2、像素大小≥5μm12.3、电子计数读出模式下量子转化效率（300kV）：0 Nyquist，DQE≥ 0.85；1/2 Nyquist，DQE，≥ 0.65；1 Nyquist，DQE≥0.25。 12.4、超分辨读出模式下，最大画幅≥10000×8000像素。12.5、辅助相机：可伸缩式；采集矩阵≥4K×4K, 像素物理尺寸≥5μm。12.6、原厂集成数据采集软件。12.6.1、能够自动进行单颗粒数据收集包括自动扫描整个样品、测定冰层厚度、进行低剂量数据收集。12.6.2、能够进行自动化电子断层扫描数据采集。13、能量过滤器探测系统 (300kV)13.1、温度稳定性（狭缝漂移/24h）：≤1.5ev13.2、能量狭缝最小宽度：≤2ev13.3、图像几何畸变：≤0.5%13.4、图像色差畸变：≤0.4%13.5、探测器内部帧率：≥200fps14、相位板系统14.1、对比度增强≥140%14.2、采用无孔相位板系统14.3、可自动加热恢复14.4、可用区域≥80%14.5、相位偏转：40-80nC剂量时，≥0.2πRad二、主要配置：1、300kV冷冻电镜主机：1套2、直接电子探测器：1套（含辅助相机）3、能量过滤器系统：1套4、三维重构软件：1套 5、相位板：1个6、备用场发射灯丝：1根7、冷冻电镜配套UPS电源（断电情况下维持一小时）：1台 8、冷冻电镜上样专用耗材：1000套三、验收和培训1、工作流验证工作：采用标准样品，达到出厂要求。2、10天应用专家现场培训。3、根据项目进展情况进行安装。安装调试完成，符合厂家性能参数验收标准，培训后2个月内，用户进行验收，验收合格后开始计算质保期。 4、供货周期：合同签订后12个月内。5、质保期：3年（包括电镜主机，包括相机，循环水机和空压机）。6、负责电镜安装场地（≤80㎡）环境改造，满足设备使用要求的电磁场、震动、温度、湿度、噪声及地线的指标。品目1-2 200KV冷冻透射电子显微镜一、技术参数：▲1、信息分辨率：≤0.23nm。2、加速电压2.1、最高加速电压：≥200kV2.2、加速电压通过软件控制切换2.3、高压稳定性：≤1ppm/10min3、电子枪3.1电子枪类型：场发射超亮型电子枪，使用寿命≥1年▲3.2 束流：≥0.5nA@1nm束斑4、放大系统4.1 放大倍数：低倍≤100倍；高倍≥650,000倍 4.2 相机长度范围：250mm-2.5m5、真空系统5.1、采用无油真空系统，由机械泵、涡轮分子泵和离子泵等构成5.2、真空度：电子枪真空度≤5 x10-7 Pa；样品区真空度≤2.7 x10-5 Pa6、物镜6.1、球差系数：≤3mm6.2、色差系数：≤3mm7、自动进样系统7.1 一次能够装载和更换≥10个样品，并能够自动更换和转移样品。待用样品在低温样品停泊装置保持在冷冻状态连续无污染存放时间≥72小时。样品可以回收和重复使用。7.2、能够自动补充液氮。7.3、冰生长率：≤5%/24小时 (透射信息损耗)7.4、最低温度：≤-170 ℃7.5、样品交换后漂移：交换60分钟后，≤0.05nm/s8、样品台 8.1、X/Y轴行程：不少于±1mm；8.2、Z轴行程：不少于±0.35mm；8.3、最大倾斜角度：不少于±70°；9、直接电子探测系统 9.1、像素矩阵≥4000×4000像素9.2、像素大小≥5μm9.3、超分辨读出模式下，最大画幅≥ 10000×8000像素9.4、原厂集成数据采集软件。9.4.1、能够自动化地进行单颗粒数据收集——自动扫描整个样品，测定冰层厚度，进行低剂量数据收集。9.4.2、能够进行自动化的电子断层扫描数据采集。10、相机系统10.1、像素数≥4000 ×4000像素10.2、像素大小≥10μm10.3、读取速率：≥1 fps@4kx4k；≥25 fps@512x51211、电镜操作11.1、具有低剂量曝光功能。11.2、可设置多个用户等级，每个用户之间的参数设置相对独立。二、主要配置：1、200kV冷冻电镜主机：1套2、直接电子探测器系统：1套3、相机：1套4、备用场发射灯丝：1根 5、配套UPS电源（断电情况下维持一小时）：1套6、三维重构软：1套 7、电镜主机配套操作和数据收集软件:1套三、售后服务：1、供货周期：合同签订后12个月内。2、质保期：验收合格后3年（包括相机，循环水机和空压机、电镜主机）。3、负责电镜安装场地（≤60㎡）环境改造，满足设备使用要求的电磁场、震动、温度、湿度、噪声及地线的指标。品目1-3 冷冻双束电镜一、设备用途： 用于冷冻电子断层三维重构样品的制备工作。二、技术参数1、电子源： 1.1、肖特基场发射电子枪；1.2、使用寿命：≥9个月；1.3、束流范围：1.5pA-300nA；1.4、加速电压范围：500V-30kV；▲1.5、冷冻状态分辨率（冷台）：≤6nm@ 2kV2、 离子源 2.1、离子源寿命：≥1000小时；2.2、加速电压范围：500V -30kV； 2.3、离子束流：1.5pA–50nA范围内≥12挡可选；2,4、具备针对非导电样品的漂移抑制模式；▲2.5、离子束分辨率（冷冻状态）：≤7.0nm@30kV3、真空系统 3.1、无油真空系统；3.2、仓室真空度：室温，≤4*10-4 Pa；冷冻，≤8*10-5 Pa；4、冷冻样品台 4.1、可旋转冷台，冷冻条件下旋转范围：≥360°；4.2、冷冻降温时间：≤30min；4.3、XY轴行程：≥50mm；4.4、Z轴行程：≥40mm；4.5、冷冻状态下倾斜角范围：-10°~ +50°；4.6、冷冻温度：≤ -170℃；5、图像处理 5.1、图像存储格式：TIFF（8bit, 16bit或24bit）、BMP、JPG；5.2、图像存储矩阵：≥ 6000×4000像素；5.3、电子扫描旋转：≥360°5.4、驻留时间范围（扫描）：25ns/pixel-25ms/pixel；6、冷冻机械臂6.1、机械臂针尖温度：≤-160°6.2、机械臂漂移：≤250nm/min6.3、集成红外观测相机，用于样品和腔室观测；6.4、内置样品沉积保护层，可以待剪薄切片层保护，避免被离子束损伤； 6.2、内置喷镀装置，对冷冻下的剪薄切片进行导电化处理。三、主要配置：1、双束主机：1套2、空压机、循环水机、UPS电源：1套3、光电联用软件：1套4、电镜主机操作系统软件：1套5、耗材5.1、备用场发射灯丝：1根5.2、备用离子源：2个5.3、上样耗材：100个四、售后服务：1、供货周期：合同签订后12个月内。2、质保期：验收合格后3年（包括相机，循环水机和空压机、电镜主机）。3、负责电镜安装场地（≤40㎡）环境改造，满足设备使用要求的电磁场、震动、温度、湿度、噪声及地线的指标。品目1-4 120kv透射电子显微镜一、技术参数：1、物镜1.1、线分辨率≤0.2nm 1.2、放大倍数：30×-600,000×，放大倍数全程连续可调，包含所有模式。1.3、恒定功率双物镜设计，具备高对比度模式，配置物镜高对比度极靴。1.4、焦距≥3mm1.5、极靴间距：≥10mm2、电子源2.1、热电子型电子源 ▲2.2、加速电压：20 kV-120kV2.3、高电压切换时间：≤1分钟3、照明系统3.1、照明模式：具备平行光模式和汇聚束模式3.2、透镜级数：≥2级聚光镜，用户可选强度限制（用于样品保护）和缩放限度（用于恒定屏幕强度）。4、成像系统▲4.1、成像系统：CPU控制≥6级透镜系统，物镜、中间镜和投影镜均≥2级。4.2、图像不随放大倍数放大而旋转， XY样品移动方向，XY坐标不变。4.3、衍射长度：0.1-8m。4.4、探测相机（速度≥40fps）和主相机，探测相机实现远程控制电镜。4.5、全自动控制聚光镜光阑、物镜光阑系统。4.6、可自动聚焦，并调整欠焦量。4.7、自动补偿：可以自动补偿合轴、自动补偿图像旋转。5、真空系统5.1、配置机械泵、分子泵和离子泵构成的无油真空系统。5.2、镜筒真空度：冷却温度下，≤2×10-5 Pa；环境温度下≤3.5×10-5 Pa6、样品台6.1 样品杆：单倾样品杆6.2、样品移动：6.2.1、样品移动：CPU控制≥5轴马达驱动。6.2.2、样品位移：X/Y：≥2 mm，调节步长≤0.05 μm；Z：≥0.70 mm。6.3、样品台倾斜角：不少于±80◦，调节步长≤0.5◦6.4、漂移：≤1 nm/min（标准样品杆）7、主相机 7.1、像素矩阵：≥4k×4k 7.2、像素大小：≥10um7.3、冷却方式：水冷7.4、图像存储模式：tiff、jpg、bmp、gif等各式自由转换。二、主要配置要求：1、120kV冷冻电镜主机：1套2、主相机：1套3、备用六硼化镧灯丝：3支4、备用钨灯丝：50支 5、120kv配套 UPS电源：1台6、主机配套标准操作软件：1套三、售后服务：1、供货周期：合同签订后12个月内。2、质保期：验收合格后3年（包括相机，循环水机和空压机、电镜主机）。3、负责电镜安装场地（≤20㎡）环境改造，满足设备使用要求的电磁场、震动、温度、湿度、噪声及地线的指标。品目1-5 工作站一、用途：用于300kv和200kv 冷冻电镜的数据存储和数据处理。二、技术参数：

真空冷冻干燥机制冷系统常见的故障及排除方法 真空冷冻干燥机广泛用于医学、制药、生物研究、化工和食品等领域。经冷冻干燥处理的物品易于长期保存，加水后能恢复到冻干前状态并保持原有生化特性。LGJ-18N系列立式冷冻干燥机，适用于实验室使用或少量生产，可满足大多数实验室常规冻干的要求。 　　真空冷冻干燥机制冷系统常见的故障及排除方法： 　　1)高压报警。出现高压报警的主要原因有: 　　①冷却水水温过高或冷却水量不足。 　　②冷凝器内部结垢，导致换热效率降低。 　　③压缩机工作时，低压管道发生泄漏，从而导致外界空气进入制冷系统。 　　④制冷管道存在未开足阀门或因管道被堵而造成排气不畅的情况。 　　解决办法: 　　①降低冷却水温度或增加水流量。 　　②清洗冷凝器的冷却水管路。 　　③对制冷管道进行检漏，如果在工作中无法实现该项操作，可将水冷凝器上方的截止阀打开，使存在于冷凝器中的空气排放出一部分。 　　④将压缩机管道.上的阀门开启到最大。 　　2)水压报警。水压报警的主要原因有: 　　①冷却水供水压力不足或供水泵不运转。 　　②水压力控制器故障。 　　解决办法: 　　①增大外部供水压力或检修供水泵。 　　②检查压力控制器的触头是否能正常工作或检查在其线路.上是否存在其他问题。 　　3)压缩机吸气温度异常。吸气温度异常的主要原因是膨胀阀调节不当，开启度过小或过大，导致回气量过小或过大。其解决办法是对膨阀进行调节，如回气量过大，应关小开启度，如回气量过小，应开大开启度，调节过程中以微调为主，多观察压缩机的回霜情况。 　　4)膨胀阀堵塞。堵塞分泌物物堵塞(脏堵)和冰堵塞两种。 　　①杂物堵塞。在堵塞不严重时，可用扳手轻轻敲打阀体，经振动使阀体疏通。若不奏效或膨胀阀很快又重新堵塞，则说明堵塞严重，应拆卸膨胀阀，对膨胀阀滤网进行清洗，清洗完后重新装上即可。 　　②冰堵。出现冰堵，应更换冷凝器出液端过滤器。 　　5)载冷剂泄漏 　　可用肉眼观察，查找板层，软管上的泄漏点。若发现可疑漏点，应放空板层或软管内的载冷剂，对泄漏点进行充压确认，确认后放气补好泄漏点，重新加入载冷剂并排出板层和软管内气体。

（1）生物制品的冷冻真空干燥我们做过生物制品冷冻真空干燥的品种有皮肤、角膜、海参、螺旋藻等；从文献中看到其他人做过的冻干产品有心瓣膜、活菌、活毒、骨骼、各种疫苗、血液制品等。生物制品的冻干要求保持产品的活性，活菌、活毒等微生物真空干燥后的存活率要求80%以上，以便于应用。因此，对冻干机工艺要求严格，预冻温度、速度、时间的控制很不容易，保护剂配方、剂量、加入时间和加入方法非常关键，不同的人可能采用不同的配方，达到的效果可能相同。一般各种保护剂的配方都是互相保密的。（2）药材和药品的冷冻真空干燥我们做过的品种有人参、山药、纳豆激酶、北冬虫夏草、林硅油、鹿茸等；从文献中看到其他人做过的品种有各种粉针制剂、中草药制剂、抗生素、布洛芬、脂质体和其他纳米颗粒等。药材和药品需要长期保存，真机需要速溶，放置氧化，避免污染杂菌，保持药效的长久稳定。这些要求都需要通过冷冻真空干燥技术来实现。药材和药品的冷冻真空干燥工艺要求也很严格，寻找合适的冻干保护剂、添加剂、赋形剂都很困难，生化干燥阶段的温度控制、加热速率控制都很关键，严格防止塌陷。（3）食品的冷冻真空干燥我们做的食品有菠菜、苹果、香蕉、库尔勒香梨等；从文献上查到其他人做过的品种有咖啡、茶叶、大蒜、鱼肉、调料等。食品种类繁多，形状、性质相差较大，冻干工艺需要在实验中确定。冻干食品时间较长、耗能较多、价格较高，应该合理选择冻干参数，优化冻干过程，降低冻干昂成本，根据市场需要，选择性价比较高的食品做冷冻真空干燥。（4）冷冻真空干燥在其它领域的应用冷冻真空干燥除了在生物制品、药品、食品和纳米材料制备方面的应用之外，还可以干燥超市的木质文物、古画等，冻干发出来的这些产品能恢复物品的原样；还可以干燥动植物标本，使标本长期保存，栩栩如生；医疗事业做实验用的、具有毒害物质的动物尸体采用冻干干燥法的处理，可以实现环保等。

蜀科大容量冷冻离心机由变频电机驱动、微机控制,液晶、数字双屏显示，转头自动识别，在行业中质量领先。今天小编来分析一下大容量冷冻离心机未来的发展趋势。 在国内，如今大容量冷冻离心机产品面临着前所未有的发展时机。一些国外知名公司进入我国，也为交流和学习有关工作的先进技术和管理方法供应了便当条件。但是因为我国的离心机工作起步较晚，所以我国大容量冷冻离心机长期以来一直是种类规范少、出产规划小、流通不疏通，中低档产品多，中高级产品少。一些外资公司出产的高级离心机，因为价格昂贵而影响其推广应用。而对于我国的离心机公司来说，太没有集中性，厂点太多太散，产品质量跟不上；对于离心机的商场来说，无序的比赛是商场较为混乱。 大容量冷冻离心机在将来五年将坚持持续快速增长的商场才干，商场规划将不断扩大，商场前景的看好会吸引更多公司进入该工作进行博奕，但进入者需要站稳脚步就必须体现自身的技术优势，加强自动化、制造技术以及材料质料外观设计等方面的研讨，学习国外先进技术，要让公司直接与这些高校和科研单位以多种形式联合，让公司成为技术创新的主体。当前的大容量冷冻离心机市场还有很多缺乏的东西，这缺乏也意味着时机，就看行业里的企业能不能把握住时机了。

冷冻共聚焦显微镜及其在冷冻电子断层扫描中的价值 Cryo ET（电子断层扫描）是一种专用的透射电子显微镜技术，可以重建观察区域的三维体积。借助先进的冷冻EM（电子显微镜），图像分辨率可以提升到令人难以置信的亚纳米等级。因此，可以在细胞内的原生环境中研究蛋白质以及其他生物分子，从而揭示尚未探明的分子机制。由于细胞和组织必须薄到能够透过电子，样品必须进行切片以获取足够薄的样品体积（薄层）。为对样品中的靶区进行精确的三维定位，冷冻共聚焦显微镜是必不可少的工具。 以下部分，我们将描述冷冻电子断层扫描工作流程的主要步骤，以及如何通过冷冻共聚焦显微镜定位靶区并进行切片，以提高整个工作流程的可靠性。 在EM网格上培养细胞 通常，在涂有多孔碳膜（例如 QuantifoilR）或二氧化硅（SiO2）膜的金质或钛金网格上植入急性分离或培养的细胞（图1，Mahamid等人，2019）在后续步骤中，钛金属和二氧化硅似乎更加坚硬而且稳定，无需额外添加碳层（Toro-Nahuelpan 2019） 网格通过Poly-L-Lysin或纤连蛋白（Fibronectin）实现生物激活，胰蛋白酶解离细胞在前一晚植入，以便在后续步骤中附着在碳层表面（Mahamid等人，2019）。 图1：采用12纳米厚多孔二氧化硅膜（R 1.2/20，即孔径1.2微米，间距20微米）的3毫米EM金质（Au）网格的反射图像拼接图。HeLa细胞已经植入并玻璃化。实心箭头：定位用的中心标记；空心箭头：聚焦离子束进入的切片槽；虚线箭头：空的网格方格。一个网格方格的边长：90微米。 添加微型图案 为进入细胞样品以成功实现FIB切片并在冷冻TEM中开展后续分析，必须确保相关细胞位于网格方格的中心位置或其附近。但细胞喜欢在网格条上生长或者集簇生长，因此不适合进行FIB切片和电子透射分析。为了克服这一挑战，微型图案技术允许用户控制细胞在碳膜（图2）上的位置和分布，提高相关工作流程的可靠性。 网格表面涂有聚乙二醇（PEG），可防止生物材料附着。利用紫外激光移除该涂层，即可对细胞的黏附进行针对性控制，保证FIB切片以及TEM的可操作性（Toro-Nahuelpan 2019）。此外，可以创建特定图案，从而影响整个细胞结构并且有助于使用冷冻电子显微镜研究生物力学现象。 图2：有/无微型图案的细胞分布情况左图：分布不均的细胞（小鼠A9成纤维细胞，使用Alexa Fluor 488 Phalloidin标记，以显示纤维状肌动蛋白）。右图：网格方格中心定位精确的细胞，可进行FIB（成纤维细胞黏附在纤维蛋白原微型图案表面；图片由Alvéole与德国汉堡CSSB中心教授Kay Grünewald博士共同提供。） 投入冷冻 为在固定用于电子显微镜检查的同时确保样品接近原生状态，细胞必须极速冷冻，以免产生破坏性的冰晶。这个过程称为玻璃化，因为冰片变成无结晶的玻璃状（玻璃体） 为让样品细胞达到这种效果，网格必须快速投浸到适当的冷冻剂（通常为乙烷，或者乙烷和丙烷）中。1981年，Jacques Dubochet发表了首个手动吸液和投入冷冻方法，该方法仍获广泛使用以获取出色的结果（Dubochet, J.以及McDowall, A. W.，1981）。 在投入冷冻之前，必须去除多余的液体。标准技术是使用滤纸实现受控吸液（图3，Dubochet, J等人，1982；Bellare等人，1988；Frederik, P. M.等人，1989）。 图3：在投入冷冻前，通过吸液处理对多余液体进行受控移除。使用镊子固定网格，并通过单独步骤将吸液纸移向网格。吸液传感器可以自动并反复执行该过程。 市面上有多种不同的吸液设备，例如用于自动吸液和投入冷冻的Leica EM GP2。根据不同样品类型的多种需求，可以使用多种涉及吸液步骤的样品制备方案（另见此处）。 冷冻状况下的存储、装载和转移 玻璃化之后，样品必须在整个工作流程期间处于冷冻状况下。因此，必须对从存储到转移至不同成像系统的所有步骤进行冷冻处理，以免样品析晶和/或污染这尤其困难，因为这种低温冷冻样品会像磁铁一样吸引附近的湿气和灰尘。研究人员和制造商付出巨大的努力来开发并提供解决方案，以便在工作流程的不同步骤中保证样品安全。 样品通常以四个为一组存储在网格盒内，而网格盒又保存在大型液氮（LN2）罐中的Falcon多孔试管中。还可以使用更为复杂的冰球系统。 转移并装载到样品架时，通常使用液态氮（LN2）。不幸的是，LN2往往会在一段时间后，因为空气中的水分而产生结晶冰污染。在转移时，这些冰晶可能会附着到网格上，干扰随后的切片和成像过程。此外，LN2内部的能见度很低，因为它在不断移动，而且始终会有条纹。 因此，最好在LN2上部的气相部分装载并转移样品以保持冷冻条件，同时为装载步骤（图4）提供出色的可见性。 徕卡显微系统在提供GN2（气态氮）装载和转移设备方面拥有30多年的悠久历史。新的冷冻显微镜套件就在这些经验的基础上开发而成，同时融合众多客户的反馈意见打造出先进的转移舱和夹具系统。 图4：在冷冻显微镜套件转移舱的GN2（气态氮）环境中装载网格。转移舱的可见度在冷冻条件下不受干扰。 检查样品质量和靶分布 在冷冻工作流程中，一般而言，EM操作时间尤其宝贵，因此对样品进行早期质量检查至关重要。许多因素会关系到样品能否转移到下一个工作流程步骤，包括碳箔的结构完整性、玻璃化的质量（包括冰层的厚度及其分布）、目标细胞的存在、分布和可及性，以及目标结构的存在和定位。 所有这些参数均可通过基于相机的冷冻光学显微镜（例如THUNDER Imager EM Cryo-CLEM）或使用STELLARIS冷冻共聚焦显微镜上的相机模式来检查（图5）。 透射模式显示网格、箔膜和细胞质量，反射图像显示网格表面，尤其是呈现玻璃化质量和冰层厚度，而荧光图像可以提供有关不同靶蛋白的表达水平及其分布情况的信息。 图5：不同模式呈现出网格的完整性以及靶分布。A——网格表面的反射图像可以显示碳膜或二氧化硅层的缺陷以及冰层的厚度。B——绿色荧光（线粒体）。C——液滴分布以实现高精度关联D——通过Hoechst标记的细胞核E——所有模式的叠加图像细胞由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy友情提供。一个网格方格的边长：90微米。 在LAS X Coral Cryo软件工作流程中，用户可以在引导下，通过不同图像模式对整个网格自动创建清晰的合焦概览图像。 标记标志点、薄片点以及液滴中心 为了关联冷冻LM（光学显微镜）的3D图像以及后续的冷冻FIB-SEM/TEM图像，首先需要获取网格的概览图像以便大致对齐两种模式的图像（图6）。这里，反射图像非常重要，因为它们类似于SEM图像，但也可以使用透射图像。中心标记以及其他标志点（例如碳层中的缺陷）有助于快速定位并对齐概览图。 图6：以不同模式获取整个网格的合焦概览图像，用于识别网格缺陷、对齐标记和靶分布。中心标记用实心箭头表示，二氧化硅层中的主要缺陷用空心箭头突出显示。HeLa细胞由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy友情提供。蓝色 – Hoechst染料，细胞核；绿色 — 线粒体绿色荧光探针，线粒体；红色 - 深红色液滴和Bodipy荧光染料，脂滴。一个网格方格的边长：90微米。完整网格直径：3毫米。 其次，需要超分辨率的共聚焦3D图像。这些图像堆栈用于在潜在薄片位置的范围内执行高精度关联。完成概览图对齐后，可以找到3D共聚焦堆栈的正确位置以便后续进行高精度关联这样做的前提是必须提供图像相对于概览图以及相对于彼此的位置。这就是Coral Cryo软件工作流程之后的处理步骤（图7）。 图7：相机概览图像与共聚焦Z-堆栈相机和共聚焦图像的组合含有XY坐标位置，因此可以匹配。所有图像都包含在Coral Cryo软件工作流程期间创建的相关项目文件夹中。HeLa细胞由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Ievgeniia Zagoriy友情提供。蓝色 – Hoechst染料，细胞核；绿色 — 线粒体绿色荧光探针，线粒体；红色 - 深红色液滴和Bodipy荧光染料，脂滴。一个网格方格的边长：90微米。完整网格直径：3毫米。 必须组合相机概览图像和超分辨率3D图像以检索靶区位置并在FIB-SEM上定义切片位置。这个步骤非常重要，因为在标准FIB-SEM中，无法看到荧光以及相应的靶区点位。 EM（电子显微镜）制造商近期研发出一种集成了FIB-SEM功能的荧光显微镜，可以作为在切片过程中通过检查荧光来提高工作流程的可靠性和准确性的一种绝佳选择。不过，这些系统并不具备必要的分辨率以及采集模式的灵活性，无法像单独的共聚焦系统那样实现精确的3D定位。 如何关联并检索薄片位置 作为常用的最低标准，研究人员使用LM图像的屏幕截图在EM上检索靶区的XY坐标。不幸的是，并排比较图像不仅费力耗时而且很容易出错，因此并不可靠。身为工作流程提供商，徕卡显微系统致力于通过THUNDER Imager EM Cryo-CLEM来改善这种情况。研究人员可以在图像上定位标志点和靶区标记，然后以开放EM格式的完整坐标集导出。首先，这个流程适用于2D图像，因此合乎逻辑的下一步骤就是提高分辨率并将坐标系扩展到3D坐标。 对于高精度关联和3D定位，目前广泛采用的是基于液滴的方法（Alegretti等人，2020；Klumpe等人，2021年；Bieber, A.，Capitanio, C等人，2021）液滴通常在玻璃化之前添加到细胞中，可在LM和EM中观察到，用于通过XYZ坐标对齐图像堆栈，作为图像数据相关性的基础，从而正确定位FIB切片窗口（图8）。 典型液滴的尺寸为1微米，完全呈球形，这使其中心坐标能够进行亚衍射拟合。通过SEM中的背散射电子，可以更清晰地观察到含有金属的微滴，从而将它们与大小相似的冰晶区分开来。优先选择液滴，使其荧光发射不同于实际靶的荧光发射，以便能够更好地分辨。 图8：3D共聚焦图像（左）和俯视SEM图像（右）的最大投影。荧光液滴（1微米）在两种模式中均可以观察到，因此可以用于对齐数据。SEM图像细胞由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Herman K. H. Fung和Ievgeniia Zagoriy友情提供。一个网格方格的边长：90微米。 要使用来自冷冻LM和FIB-SEM的3D数据，在冷冻LM的引导下，进行薄片制备，可以使用一款开源软件（3D关联工具箱，简称3DCT，Jan Arnold等人，2016）。 将冷冻LM图像载入到在FIB-SEM上运行的该软件中。二维LM概览图和SEM图像之间的三点关联用于初步定位。之后，使用离子束获取相关视场，并手动点击LM堆栈和FIB图像中的相同液滴图10显示了一张LM图像和一张FIB图像，其中的靶区点位以及液滴可以在定位软件中重现其排列组合。 图9：在LM和FIB图像中关联标记。左图：点击观察结构周围的液滴，并在3D图像中执行质心定义（白圈中的绿点）计算得到的位置随后投影到FIB图像（右图）上根据液滴标记，计算目标结构的位置并标记到FIB图像中（红圈中的红点）。离子束图像由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Herman K. H. Fung友情提供。比例尺：20微米。 该软件通过对X、Y、Z信号进行高斯拟合，精准确定液滴的中心。近期的改进增加了半自动液滴检测功能以及其他功能，从而更加方便地执行冷冻FIB工作流程。(SerialFIB, Klumpes等人，2021）。 在网格条上选择围绕最终目标结构的几处液滴，作为切片处理的坐标系。基本计算方法是考虑缩放、旋转以及平移之后的线性仿射变换最后，在LM图像中选择目标结构并叠加到FIB图像上。 根据目标结构的位置，就可以定位切片窗口(图10)。 图10：定位切片窗口左：离子束细胞图像，含有标记液滴和目标结构根据目标结构的计算位置，在所用FIB-SEM的切片软件中，交互定位上下切片窗口的位置（细薄条纹上方和下方的红色方块）。图像由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Herman K. H. Fung友情提供。比例尺：20微米。 Coral Cryo工作流程具有哪些优势？ Coral Cryo软件工作流程旨在为基于液滴的靶区定位工作流程提供支持。它可以提供创建合焦相机概览图像所需的成像作业（图6和图7）。所有必要的自动对焦功能均可以正确调整并分配，并且可以标记潜在薄片位置，同时能够在定义的位置执行超分辨率共聚焦Z-堆栈。 在定位管理器（图11）中，可以确定所有必要的坐标标记，并且以开放格式（*.xml）提供。此类图像会自动保存，其数据格式可以导入任何FIB-SEM软件。 图11：Coral Cryo软件模块标记点、薄片和液滴标记均可以在软件工作流程中定义。反射图像中细胞的顶部和底部坐标值可以作为在FIB SEM中正确计算靶区3D位置的额外参考。本文前述部分图像中的相同细胞经过突出显示，用于标记定义。 对齐标记用于使用相机概览图像对标记点进行初步的粗略对齐。薄片标记具有双重用途：作为进行超分辨率共聚焦3D扫描的位置标记，或者在图像采集后，作为靶结构的精确3D标记。亚像素插值确保该阶段可以在3D图像内进行高精度定位。最后，插值方法还用于标记液滴坐标，以便在FIB-SEM上进行后续液滴关联。 冷冻FIB切片 进行必要的关联并设置切片窗口，薄片位置通常会粗略切薄至大约1微米，随后进行最终的抛光步骤以达到电子透明（图12）。 图12：目标薄片的离子束图像以及SEM俯视图图像由德国海德堡欧洲分子生物学实验室（EMBL）Mahamid Group的Herman K. H. Fung友情提供。比例尺：10微米。 采用两步方法的原因在于冰污染和/或切片材料可能会沉积在薄片上。为避免在最终薄片上发生冰污染，建议采用快速抛光工艺（Schaffer M.等人，2017）。还可以采用开源的商业软件，以自动方式进行切片。 冷冻透射电子显微镜 进行冷冻FIB切片之后，含有薄片的网格转移至冷冻TEM，通过对网格（连同薄片）逐渐倾斜，采集一系列断层扫描图像。图像经过计算处理以重建所记录体积的3D断层扫描图像。通过对样品的多个图像取平均值，可以降低固有噪点，从而对蛋白质或蛋白质复合物等颗粒获得更高分辨率的结构。这种处理方式称为亚断层图像平均（Wan和Briggs，2016；Zhang 2019）。从概念上说，这相当于通过单颗粒成像（SPA），在原位实现对大分子的亚纳米分辨率。 总 结 本文旨在表明冷冻共聚焦显微镜是冷冻工作流程中的一个重要组成部分，用于评估EM网格上玻璃化样品的质量和靶分布。在冷冻条件下记录的高分辨率共聚焦数据使科学家能够在3D荧光下识别目标结构。此外，3D体积可作为相关方法的参考，以便在FIB-SEM中检索靶结构进行切片，然后在冷冻TEM中进行电子断层扫描，以获得靶区的亚纳米分辨率图像。 Coral Cryo工作流程搭配新的共聚焦平台STELLARIS，再加上Coral Cryo软件，可以帮助新手用户创建网格概览图像、超分辨率3D图像以及精确的坐标标记，为后续的FIB切片和冷冻电子断层扫描奠定坚实基础。 参考文献：（上下滑动查看更多） 1.Allegretti M, Zimmerli CE, Rantos V, Wilfling F, Ronchi P, Fung HKH, Lee CW, Hagen W, Turoňová B, Karius K, Börmel M, Zhang X, Müller CW, Schwab Y, Mahamid J, Pfander B, Kosinski J, Beck M.: In-cell architecture of the nuclear pore and snapshots of its turnover. Nature. 2020 Oct 586(7831):796-800. doi: 10.1038/s41586-020-2670-5. Epub 2020 Sep 2. PMID: 32879490. 2.Arnold, J., Mahamid, J., Lucic, V., de Marco, A., Fernandez, J., Laugks, T., Mayer, T., Hyman, A. A., Baumeister, W., Plitzko, J. M., Biophysical Journal, Vol. 110, Feb. 2016, pp 860-869. 3.Bellare, J. R., Davis, H. T., Scriven, L. E. & Talmon, Y.: Controlled environment vitrification system: an improved sample preparation technique. J. Electron Microsc. Tech. 10, 87–111 (1988). 4.Bieber, A., Capitanio, C., Wilfling, F., Plitzko, J., Erdmann, P.S.: Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo--Electron Tomography. J. Vis.Exp. (176), e62886, doi:10.3791/62886 (2021). 5.Dubochet, J. & McDowall, A. W.: Vitrification of pure water for electron microscopy. J. Microsin cryo-electron tomography and subtomogram averaging and classification. Curr Opin Struct Biol. 2019 Oct 58:249-258. Doi: 10.1016/j.sbi.2019.05.021. 相关产品 UC Enuity 超薄切片机 徕卡显微咨询电话：400-630-7761 关于徕卡显微系统 徕卡显微系统的历史最早可追溯到19世纪，作为德国著名的光学制造企业，徕卡显微成像系统拥有170余年显微镜生产历史，逐步发展成为显微成像系统行业的领先的厂商之一。徕卡显微成像系统一贯注重产品研发和最新技术应用，并保证产品质量一直走在显微镜制造行业的前列。

p 　　作者：黄岚青，刘海广(北京计算科学研究中心 复杂系统研究部) /p p 　　 span style=" background-color: rgb(112, 48, 160) color: rgb(255, 255, 255) " strong 1 引言 /strong /span /p p 　　在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术，就叫做冷冻电子显微镜技术，简称冷冻电镜(cryo-electron microscopy， cryo-EM)。冷冻电镜是重要的结构生物学研究方法，它与另外两种技术：X射线晶体学(X-ray crystallography)和核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)一起构成了高分辨率结构生物学研究的基础，在获得生物大分子的结构并揭示其功能方面极为重要。 /p p 　　电子显微三维重构技术起源于1968 年，D.J. De Rosier 和Aaron Klug 在Nature 上发表了一篇关于利用电子显微镜照片重构T4 噬菌体尾部三维结构的著名论文，提出并建立了电子显微三维重构的一般概念和方法。Aaron Klug 本人也因为这个开创性的工作获得了1982 年的诺贝尔化学奖。 /p p 　　为了降低高能电子对分子结构的损伤，Kenneth A. Taylor 和Robert M. Glaeser 于1974 年提出了冷冻电镜技术，并且用于实验研究。经过三十多年的发展，冷冻电镜技术已经成为研究生物大分子结构与功能的强有力手段。冷冻电镜本质上是电子散射机制，基本原理就是把样品冻起来然后保持低温放进显微镜里面，利用相干的电子作为光源对分子样品进行测量，透过样品和附近的冰层，透镜系统把散射信号转换为放大的图像在探测器上记录下来，最后进行信号处理，得到样品的三维结构。 /p p 　　在超低温的条件下，电子带来的辐射损伤被有效控制。即便如此，分子样品所能承受的辐射剂量也是非常低的，导致信噪比非常低。另外，随着观测的进行，额外的电子会累积而造成分子的移动，导致获得的图像变得模糊。这就好比用一个简单的傻瓜相机拍摄在雨中飞驰的子弹，得到的影像必然是模糊的并且充满噪音。因此，冷冻电镜的方法技术在很长时间内只能确定个头比较大的样品的结构，比如病毒颗粒的结构，而且通常分辨率都不高。然而随着工程技术和算法的不断发展，能够确定的分辨率也越来越高(图1(a))，2016 年发布的谷氨酸脱氢酶结构的分辨率甚至已经达到了1.8 Å 。与此同时，也有越来越多的通过冷冻电镜技术得到的研究成果发表在高水平的期刊上(图1(b))，冷冻电镜正备受科学界的关注。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/5b2ef847-cad0-4d88-b1ad-ebf14bd21e9c.jpg" title=" 1.jpg" / /p p 　　图1 冷冻电镜技术和单颗粒重构技术越来越备受关注(统计数据来源于EMDataBank )(a)不同年份中利用冷冻电镜单颗粒重构技术能够达到的最高分辨率 (b)通过冷冻电镜技术进行的研究成果在不同杂志上发表的论文数 /p p 　　在最近几年，冷冻电镜技术有了革命性的进步，主要得益于三个方面的突破。首先是样品制备，通过利用薄膜碳层甚至石墨烯可以用更薄的冰层包裹分子样品来提高信噪比。第二个突破是电子的探测技术，也就是电子探测器的发明。在300 keV 电子的轰击下，传统的器件都会被高能量打坏，因此在电子探测器出现之前，冷冻电镜中使用的CCD相机需要将电子打在探测器上变成光信号，再通过CCD 把光信号转成电信号后得到图像，“电光—光电”转换的过程降低了信噪比。而现在电子探测器能够直接探测电子数量，同时，互补型金属氧化物半导体(CMOS)感光元件的应用使得探测器支持电影模式(movie mode)，可以在一秒钟之内获得几十张投影图片。通过后期对样品进行漂移修正，再把这几十张图片叠加起来，从而大幅提高成像的信噪比。模糊的子弹一下子变得清晰，冷冻电镜的分辨率不断上升。第三个突破是计算能力的提高和软件算法的进步。冷冻电镜的模型重构通常需要对几万甚至几十万张投影图片进行分析、组装和优化。这需要先进的计算资源配合有效的算法才能实现。基于贝叶斯理论的模型重构框架解决了这个问题，我们在下文中详细介绍。综上所述，冷冻电镜技术不仅提高了空间分辨率，而且可以应用于很多以前不能解决的生物大分子的结构研究。 /p p 　　具有里程碑意义的成果是，2013 年加州大学旧金山分校(UCSF) 程亦凡和David Julius 的研究组首次得到膜蛋白TRPV1 的3.4 Å 近原子级别高分辨率三维结构，结果发表在Nature 上。我国在冷冻电镜的应用领域也有很大突破，代表性工作包括清华大学的施一公研究组和剑桥大学MRC 实验室Sjors H.W. Scheres 研究组合作在2015 年获得的γ 分泌酶复合物结构( 图2(c))， 以及2015 年清华大学高宁研究组和香港科技大学戴碧瓘研究组合作得到的3.8 Å 的真核生物MCM2-7 复合物结构 2015 年北京大学毛有东研究组、欧阳颀研究组与哈佛医学院吴皓研究组合作得到炎症复合体的高分辨率三维结构(图2(a)) 2014 年中国科学院生物物理研究所朱平研究组和李国红研究组合作得到的30 nm 染色质左手双螺旋高级结构(图2(b))以及2016 年中国科学院生物物理研究所柳振峰、李梅、章新政三个研究组合作得到3.2 Å 的捕光复合物II 型膜蛋白超级复合体结构。这些成果在结构生物领域得到巨大的反响，这也使得冷冻电镜高分辨率成像技术获得空前的关注。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/44d05be3-281b-4507-b0fc-9d200025422f.jpg" title=" 2.jpg" / /p p 　　图2 我国在冷冻电镜领域中获得高质量的研究成果(a)近原子分辨率的炎症复合体结构(图中NBD为核酸结合结构域，HD1 为螺旋结构域-1，WHD为翼螺旋结构域，HD2 为螺旋结构域-2，LRR为亮氨酸重复序列) (b)30 nm 染色质左手双螺旋高级结构 (c)3.4 Å 的人源γ 分泌酶复合物结构(图中NCT是一种I 型单次跨膜糖蛋白，APH-1 为前咽缺陷蛋白-1，PS1为早老素-1，PEN-2 为早老素增强子-2) /p p 　 strong span style=" background-color: rgb(112, 48, 160) color: rgb(255, 255, 255) " 　2 图像处理技术 /span /strong /p p 　　经过多年的发展，目前冷冻电镜的数据处理部分主要包含了以下的流程(图3)： /p p 　　(1) 衬度传递函数的修正(CTF correction) /p p 　　(2) 样品分子投影数据的筛选(particle selection) /p p 　　(3) 二维投影数据的分类和降噪(2D analysis) /p p 　　(4) 三维模型的重构和优化(3D reconstruction and refinement) /p p 　　(5) 多重构象的结构分析(heterogeneity analysis) /p p 　　(6) 对重建结构分辨率的分析(structure resolution assessment) /p p 　　(7) 结合生物化学原理和实验数据对三维结构的解读(model interpretation and validation) /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/ef81cf1e-580c-4eda-9e77-e2edc542f953.jpg" title=" 3.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　图3 冷冻电镜数据分析处理流程 /p p 　　图像处理软件的发展对冷冻电镜单颗粒重构技术极其重要，当前广泛使用的电镜分析软件系统主要包括SPIDER，EMAN2， FREALIGN，SPARX，RELION等。对于刚刚接触单颗粒重构技术的人来说，更偏好集成的软件套装来完成整个分析流程。我们在表1 中列出了大部分主流的综合冷冻电镜图像处理软件，以供参考。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/f4fafde5-da41-422a-acc4-bcd118be0c8e.jpg" title=" 4.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　表1 冷冻电镜中流行的图像处理软件 /p p 　　 strong 2.1 衬度传递函数估计与修正 /strong /p p 　　衬度传递函数(contrast transfer function，CTF)是在数学上描述通过透射电子显微镜得到样品图像上的像差变化。准确地判断衬度传递函数对于确认显微图像的质量以及后续的三维结构重建极为重要。常用的估算衬度传递函数的参数软件是CTFFIND4。确定了CTF 的参数以后，就可以对采集到的冷冻电镜图像进行修正。这个修正过程其实就是图像处理中的图像复原技术。 /p p 　　 strong 2.2 颗粒挑选 /strong /p p 　　接下来需要从原始数据中筛选出颗粒投影，也被称为“颗粒挑选”，颗粒挑选的好坏也将影响所有后续的分析和处理过程，是一个重要并且繁琐的步骤。颗粒挑选方式可以分为手动挑选、半自动挑选和完全自动挑选这几种。 /p p 　　在早期的分析中，对于结构的了解还非常少，优先考虑的都是人工挑选。但是自动的颗粒图像获取方法的出现使得在很短时间内可以收集数十万张颗粒图像，人工挑选大量的颗粒图像不太现实，并且人工的挑选通常会过于集中于某一类颗粒图像，导致遗漏和偏差。 /p p 　　 strong 半自动和全自动的方法主要有以下三类： /strong /p p 　　(1)通过例如降噪、反衬增强、边缘算子等图像形态学方法搜索区域，基于数字图像处理学的原理，将颗粒图像与背景分离开来。 /p p 　　(2)基于模板的方法，通过扫描数据图像和已知的模板比较来挑选出潜在的颗粒图像，模板的来源通常为手动选出的数据图像中较为清晰的颗粒图像，或者是已知结构的投影。 /p p 　　(3)结合无模板和有模板的方法，通过一些有监督的机器学习算法进行颗粒挑选。 /p p 　　随着图像识别领域中深度学习方法的流行，各类基于深度学习的颗粒识别框架也被引入到颗粒挑选的过程中。随着深度学习方法的发展，相信如何把深度学习方法应用到单颗粒冷冻电镜图像分析领域的研究将会越来越多。 /p p 　　 strong 2.3 二维图像分析——颗粒图像的匹配与分类 /strong /p p 　　二维颗粒图像的分类是获取三维结构过程的第一步。对二维图像的分析包括两部分：颗粒图像的匹配和颗粒图像的分类。 /p p 　　匹配的过程通常会对颗粒图像应用一些变换操作，通过关联函数去判断不同颗粒图像之间的相似程度。图像匹配的算法主要分为两种，即不依赖模型的方法和基于模型的方法，取决于是否存在利用样本先验信息得到的模板。 /p p 　　随着图像匹配的完成，颗粒图像需要进行分类。主要利用多元统计分析和主成分分析方法等算法，其他流行的二维颗粒分类技术还有神经网络分类，将图像在二维空间自组织映射(self-organising mapping，SOM)再进行分类和排序。 /p p 　　二维图像分析的目的是，首先通过图像匹配消除旋转和平移的误差，利用类内紧致、类间离散的原则进行图像分类，最终可以对类内颗粒图像进行平均，提高信噪比，从而实现对高分辨率三维结构的构建。 /p p 　　 strong 2.4 模型重构和优化 /strong /p p 　　模型三维重构的基础是中心截面定理，重构过程中的关键问题是如何确定每个颗粒图像的空间角(orientation determination)。大多数模型重构和优化算法都是基于投影匹配(projection matching)的迭代方法。简单说就是，先利用粗糙的三维结构模型，进行投影得到参考的图像，和实验颗粒图像进行比对，根据结果来更新空间方位参数，继而构造新的三维结构，对实验图像的空间方位修正，形成迭代的过程，直至收敛就获得了最终的三维模型。 /p p 　　 strong 2.5 分辨率的确定及二级结构的确定 /strong /p p 　　在模型优化的过程中，通常有很多指标给出结构的分辨率信息。目前一个较为广泛使用的分辨率信息参数是被称为傅里叶壳层关联函数(Fourier shell correlation，FSC)曲线，并通过在曲线上选取一个合适的阈值来判定分辨率。 /p p 　　在模型优化中经常伴随着过拟合的问题。过拟合的出现通常由于在优化过程时无法分辨“噪声”与“信号”。为了避免过拟合对分辨率的误判，最近一种被称为“黄金标准”(gold standard)的优化过程开始被广泛使用。 /p p 　　根据不同的分辨率，可以从结构中得到不同的信息量。按照分辨率数值大致分为三个范围： /p p 　　(1)结构分辨率大于10 Å 的生物大分子结构被视为低分辨率的结构，在低分辨率的结构范围内只观察得到一个大致的整体形状，以及有可能分辨出主要成分的相互位置关系。 /p p 　　(2)一个中等分辨率的生物大分子结构精度大约在4—10 Å 之间，在这个分辨率范围内的生物大分子结构已经可以得到一些二级结构的信息和分辨出大部分组成结构的相对位置关系。分子结构之间如果存在构象变化也可以分辨出来。 /p p 　　(3)高精度甚至是近原子级别的分子结构分辨率可以达到4 Å 以下。在高分辨率的三维结构中，可以准确地看见如α肽链等的二级蛋白质结构以及部分单独的残基，多肽链的结构变得清晰起来。同时高分辨率的分子结构可以描述精确的构象变化。 /p p 　　总之，FSC 曲线等标准提供的分辨率是一个有指导意义的数字，不可作为绝对参考来评价所获得的模型质量，需要批判地对待，尤其是要与生物分子系统的生物化学知识相结合。 /p p 　　 strong 2.6 三维结构的多构象性和动态分析 /strong /p p 　　生物大分子通常具有内禀的柔性，所以生物分子的动态结构变化以及结构的不均一性一直是结构生物学的研究重点之一。在晶体状态下，生物分子的结构变化被晶格约束，一般只提供一个静态的结构和有限的动力学参数。冷冻电镜相比晶体学方法的优势在于可以捕捉生物分子在溶液中的形态，并记录下不同构象下的投影。因此针对冷冻电镜的数据可以进行多构象的重构，现有的一些算法是通过聚类分析、最大似然法分析等对多构象进行分析，得到的生物大分子结构形态和构象差异还需要结合分子功能来检验分子结构的合理性。 /p p 　　 strong span style=" background-color: rgb(112, 48, 160) color: rgb(255, 255, 255) " 3 最新进展和突破 /span /strong /p p 　　 strong 3.1 最大似然估计理论 /strong /p p 　　近年来在单颗粒分析中取得重大突破的应当是最大似然估计(maximum likelihood)理论。最大似然估计的理论可以贯彻整个单颗粒技术图像分析的过程，在图像匹配，2D、3D分类 和模型优化上均可以应用，是一个强有力的理论工具。最大似然估计的算法已经在RELION、FREALIGN 等软件中实现，方便普通用户使用，这对于推动冷冻电镜成像技术的应用有重大意义，近三四年来有许多突破性的近原子级别分辨率的分子结构大多是由基于最大似然估计理论的分析软件得到。 /p p 　　3.1.1 减少计算需求 /p p 　　最大似然估计算法的计算量很大，如何降低计算量是一个重要问题。过多的计算资源消耗曾经阻碍这个方法在冷冻电镜单颗粒重构中的广泛应用。在减少最大似然算法在冷冻电镜应用中的计算需求方面，有两个重要的贡献是空间降维(domain reduction)算法和网格插值(grid interpolation)算法。 /p p 　　我们最近在研究一个新的方法来对旋转参数进行分步处理，初步的结果显示这种方法可以把计算复杂度降低一个维度，这个方法可很好地应用于高信噪比的数据处理，但对于低信噪比的数据分析还需要对该方法进行改进。 /p p 　　3.1.2 对最大似然方法的未来展望 /p p 　　在未来的研究中，关注点是减少计算的耗时和增加准确度。通用图形处理器(GPU)的应用和CUDA 编程框架已经显示出了在高性能计算领域的威力，研究表明GPU 技术可以显著减少计算时间，而RELION 也将发布支持GPU 计算的2.0 版本。 /p p 　　在加快计算速度的同时，提高模型的重构的准确性则更为重要。如何提高颗粒图像的准确性以及最大似然方法在这些方面的应用还有待深入探索。总而言之，最大似然方法独特的、可扩展的统计理论框架可以适用在冷冻电镜的各种问题上，如多构象、低噪声、信息缺失中均有很好的应用。 /p p 　　 strong 3.2 流形嵌入方法(Manifold Embedding) /strong /p p 　　自然界的分子过程通常是连续的，比如三磷酸腺苷(ATP)合成酶等分子结构的状态变化通常都是连续的。现有的方法只能得到有限的、若干个离散的构象变化，限制了我们对于分子结构的进一步观察。而流形嵌入法则是通过将颗粒图像映射到具有特定拓扑结构的参数空间(manifold space)，可以分辨出更为细致的动力学变化，进而实现对生物分子连续的结构变化过程的研究。Ali Dashti 等人已经利用这种方法成功刻画出核糖体的结构变化路径。 /p p 　　 strong 3.3 揭开表面看实质 /strong /p p 　　冷冻电镜对更为复杂的结构并没有很好的处理方式，在一些分子量比较大，包含多层的病毒结构研究中，一直没有高分辨率的三维模型，这也是由于病毒普遍具有对称失配的特性，基因结构被壳体完全覆盖，无法通过二维图形处理的方式对内部结构直接进行重构。刘红荣教授通过改进衬度分离方法展示出了解决该类问题的途径，其发展的新方法已经成功应用在一个多面体衣壳NCPV的病毒颗粒(图4)上，通过该重构方法，使得外部的衣壳结构(图4(a))和内部的基因组结构(图4(b))分离，成功得到包含在内部的dsRNA 近原子级高分辨率结构和分布。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/7ab0c5f3-c403-4231-924f-9900a3758eb7.jpg" title=" 5.jpg" / /p p 　　图4 利用衬度分离方法得到对称失配情形下的病毒颗粒结构(a)外部的衣壳结构 (b)内部的基因组结构 /p p 　　 strong 3.4 罗马不是一天建成的(Building Protein in One Day) /strong /p p 　　最近的研究成果显示，最大似然估计算法能够更好更快地完成三维重构，多伦多大学的Marcus A. Brubaker 教授针对最大似然估计算法提出了优化，有效地缩短了三维重构所需的时间。对传统迭代算法极度依赖于初始模型结构的缺点进行改进，同时通过采样优化的方式降低了计算量，减少计算时间，据称这些优化可以达到100000倍的加速，利用一台计算机工作站在一天内就能完成模型重构。 /p p 　 strong span style=" background-color: rgb(112, 48, 160) color: rgb(255, 255, 255) " 　4 展望与总结 /span /strong /p p 　　冷冻电子显微镜技术已经发展成为一个成熟的方法，应用于各种复杂的生物分子体系的高分辨结构研究。按照目前的发展势头，解决生物分子结构组(structural proteome)的问题已经不是遥不可及的了。在解决单一静态结构的基础上，冷冻电镜也展示了其研究多构象体系的潜力。下面对冷冻电镜在结构生物学研究领域的应用做一些大胆的展望，希望能抛砖引玉。 /p p 　　 strong 4.1 解决膜蛋白的结构 /strong /p p 　　由于膜蛋白是镶嵌在磷脂分子构成的细胞膜内，目前在冷冻电镜领域的样品制备还没有很好的处理方法，因此还很少见到对膜蛋白的结构解析。随着技术的发展，新的试剂分子或者纳米尺度的容器可以用来制备单一性很高的稳定的细胞膜以及镶嵌在内的膜蛋白。这样就可以利用冷冻电镜的方法对膜蛋白进行结构研究。目前在纳米盘(nanodiscs)的研究领域已经取得了一定的进展，对 /p p 　　冷冻电镜解析高精度的膜蛋白结构，我们拭目以待。 /p p 　 strong 　4.2 细胞内分子结构测定：从溶液内(in vitro)到细胞内(in situ) /strong /p p 　　当前的高分辨分子结构基本都是在溶液中提纯出来的分子样品，也就是通常所说的in vitro 实验。现在可以利用快速冷冻的方法把细胞固定，再用高能粒子枪对细胞进行高精度切片。在细胞的某些部位，常常有大量同类分子聚集，比如在内质网(endoplasmic reticulum，ER)部分有很多核糖体，在细胞骨架上会有大量的肌动蛋白(actin)分子。对这些切片进行成像研究可以获取这些分子在细胞环境的结构信息。 /p p 　 strong 　4.3 细胞结构和分子在细胞内的分布：从部分到整体 /strong /p p 　　电镜可以用来做断层成像(cryogenic computed tomography，cryo-CT)，应用于亚细胞层面的研究，比如细胞器的结构，蛋白质分子的分布，以及一些细胞骨架的构成。与超低温样品操作结合，cryo-CT 可以提供更高分辨率的信息，衔接分子层面和细胞层面的知识，对于了解细胞功能至关重要。在电镜成像研究领域，这将是一个有广阔前景的课题。 /p p 　 strong 　4.4 多构象的识别和自由能景观确定 /strong /p p 　　人们开始不满足于近原子级别分辨率能够提供的信息，想要进一步刻画分子结构连续变化的状态。得益于冷冻电镜的成像特性，相对其他技术而言，冷冻电镜技术在时间尺度的系综上具有优势。在冷冻电镜下分子结构的动力学研究中，有两个值得关注的趋势，分别是能够获取分子结构“ 慢” 反应过程(10—1000 ms) 时间分辨(time-resolved)的冷冻电镜技术，以及能够分析出连续构象变化的分类算法。获取短期反应过程(10—1000 ms)分子结构的基础是在准备样本过程中分子反应的速度慢于冷冻样本的时间，目前混合喷雾(mixing-spraying)等快速冷冻技术的实现使得一些较慢的反应过程可以看到动力学变化。而流形嵌入算法在分类过程中取得突破，在更好地利用冷冻电镜观察分子的平衡态结构动力学变化和展现自由能景观上取得了令人鼓舞的成果。 /p p 　 strong 　4.5 从静态结构到动态分子电影 /strong /p p 　　生物分子在室温下是活跃的，而且大多数的分子功能是通过结构的变化来实现的。基于X射线， 尤其是最近发展的X 射线自由电子激光(XFEL)的结构生物学的研究重点之一便是实现时间分辨的结构生物学研究(time-resolved structure determination)。到目前为止，基于X 射线的研究取得了很大的进展，但主要还是局限在对晶体的衍射方面，比如对光合作用过程中水分子分解的研究和光敏黄蛋白的光吸收过程的研究。三维冷冻电镜的单颗粒成像技术最有希望在单分子水平上实现对时间分辨的结构变化研究，同时，这对于样品制备和实验操作提出了非常高的要求。 /p p 　 strong 　5 结束语 /strong /p p 　　冷冻电镜的技术突破及其在生物分子结构领域的应用把我们对分子生物学的研究推进了一大步，开始探索未知的区域。立足于解决单一构象的基础，对多构象以及动力学过程和热力学的研究也需要展开，这需要对现有技术进行提升并与其他方法进行结合，计算建模和模拟的方法也需要紧密结合起来，实现对生物分子系统的集成研究。 /p p 　　致谢 感谢北京大学欧阳颀教授对文章写作提出的宝贵意见。 /p

更清楚地看见生命分子的结构，有助于我们了解分子的功能和各个组分之间的相互作用。图源：EMBL。Credit: Agnieszka Obarska-Kosińska/EMBL and MPI of Biophysics编者按：2023年，Frontiers for Young Minds期刊网站再度邀请五位诺贝尔奖得主，专门为青少年撰写关于他们的研究的科普文章。《赛先生》获授权翻译了这一系列文章。了解生物的分子结构，一方面有助于科学家更好地理解这些分子的生物学功能，另一方面也对药物研发具有重要的指导意义。在下面这篇文章中，2017年诺贝尔化学奖得主理查德亨德森与Frontiers for Young Minds杂志撰稿人诺亚塞格夫，详解冷冻电子显微镜技术的发展历程，以及它如何引发生命分子结构的分辨率革命。诺亚塞格夫 理查德亨德森 ｜ 撰文Ano-GPT ｜ 翻译瞿立建 ｜ 校译理查德亨德森博士。他与雅克杜博歇（Jacques Dubochet）教授和约阿希姆弗兰克（Joachim Frank）教授因“开发冷冻电子显微镜，用于溶液中生物分子结构的高分辨率测定”，获得了2017年的诺贝尔化学奖。图片：A. Mahmoud，来源：诺奖官网。本文基于塞格夫对亨德森的采访撰写而成。结构生物学是观察构成生命的各种分子的结构，这些分子存在于人类和其他动物中，也存在于微生物和植物之中。为了解析这些结构，结构生物学家使用越来越精确的成像技术，从而“看见”或确定更小更多样的分子的结构。冷冻电子显微镜是一种非常先进和强大的成像技术：电子被发送到冷冻样品中，以确定单个分子的结构，其放大倍数足以看见原子。这些图像使我们更深入地理解生命的基本结构和功能。在本文中，我们将描述冷冻电子显微镜掀起的这场“分辨率革命”的发展过程。受访者亨德森博士因为这方面的贡献最终获得2017年的诺贝尔化学奖。眼见为实：看见微观的生命分子生物体包含许多重要的结构，并进行着多种活动。在人体内，我们有很多器官，它们由细胞构成，而细胞内又有很多细胞器和分子执行维持生命所必需的功能，例如能量代谢、排出废物、物质运输和抵抗有害因子等（图1）。为了了解生物体的工作原理并最终造福人类，我们需要密切观察这些微观分子的结构，以及这些结构执行的活动。结构生物学的使命便是观察这些生物组分的结构。过去，科学家们会从生命体内正在发生的特定活动着手，例如能量的代谢、转换和存储，再寻找参与其中的分子，通常是蛋白质和酶，然后才能去解析这些分子的结构。图 1：细胞内部的艺术效果图。您可以将细胞内部想象成一个密集的游乐场，其中包含许多不同的分子和细胞器，每个分子和细胞器都执行其独特的功能。要了解生命的运作方式，我们需要了解这些生命分子的结构和功能。然而在2000年，这一从功能到结构的研究思路发生了变化。因为这一年，通过人类基因组计划，科学家首次整理出完整的人类遗传信息的“指令集”（DNA碱基序列），这些遗传信息，甚至有约80%是之前不知道的。从那时起，通过基因信息，科学家可以在不必事先了解其功能的情况下先确定相关分子的结构。这开辟了结构生物学的全新路径。那么，科学家又是如何确定这些分子的结构呢？答案是：电子！电子和显微镜电子是存在于原子中的微小带电粒子，它的流动产生了电力。电子也是光和其他形式的电磁辐射——如X射线——的来源。你能相信吗，直到1895年，人类才发现了电子。在那一年，电子首次被英国剑桥大学物理系的科学家约瑟夫汤姆孙（J. J.Thomson）识别并命名。40年后的1935年，J. J.汤普森的儿子乔治汤姆孙（G. P. Thomson）证明了电子作为一种粒子，也同时表现出波的性质：它具有频率和波长，就像其他波一样。汤姆孙父子都获得了诺贝尔奖：父亲是因为电子作为粒子的发现，儿子是因为电子作为波的发现。不久之后，科学家意识到，如果电子表现得像波一样，从某种意义上说，它们一定也表现得像光一样，因为光也是一种波。因此，科学家想到也许可以用电子照亮他们想要观察的微小样品，就像我们基于可见光用眼睛、相机或普通显微镜来观察物体一样，这就是电子显微镜的起源。电子的波长很短，大约是可见光波长的十万分之一。而波长越小，样品放大的倍数越大。这意味着用电子拍摄的照片能显示出更多的细节，也就是说电子显微镜具有很高的分辨率。由于它的高分辨率，电子显微镜可以解析以前不可能看清楚的微小分子的结构。电子显微镜如何工作？电子显微镜中装有能够发射高能电子束的装置，能够穿过待研究的样品（如图2A所示）。当电子穿过样品时，它们与样品中的原子相互作用而偏离原来的行进路径——称为衍射，偏离方式决定于样品中原子排列的方式。因此，电子通过样品时“拾取”了其结构信息。电子随后通过特别设计的电磁场进行聚焦，这种电磁场称为电磁透镜，类似于相机内的镜头，然后被电子探测器记录下来。在这个阶段，科学家得到了从样品中衍射的电子的图像，然后将其转换为样品本身的图像。这种转换基于简单的物理学，其描述了被测物体与所成图像之间的关系。这一转换取决于许多因素，包括电子的波长和所使用的透镜，但这都由显微镜专家来处理。图 2：电子显微镜。(A) 在电子显微镜中，电子源释放出一束热的高能电子，穿过被置于真空环境的样本。当电子与样品相互作用时，它们会发生衍射（散射），随后被特殊透镜收集和聚焦，然后被电子检测器检测。(B) 剑桥大学的电子显微镜，它允许科学家对冷冻生物样本进行成像。图片来源：剑桥大学电子显微镜的挑战尽管电子可以帮助我们获得非凡的分子图像，但仍需克服重大挑战。首先，正如量子物理学告诉我们的那样，单个电子的活动具有不确定性。当你问电子遇到特定分子时会发生什么时，他们不会给出明确的答案。相反，他们有一定的概率（可能性）参与每个可能的结果。在电子世界中，所有可能发生的事情都确实发生了，每个选项都有确定的概率。这意味着科学家必须从许多电子中收集答案，并开动头脑，将这些信息组合起来。为实现这一目标，我们用数百万个电子照射样本，并使用它们的总体平均值来获得合理的答案。其次，电子的能量非常高，在成像过程中必须要穿过样品，而这会对样品造成损坏。 这 些超高能电子和任何其他类型的高能辐射一样，可以将样品分子中的电子打出来。 这会改变样品分子的形状和特性，因为生物分子相对脆弱。 因此，科学家很难在单个生物分子被破坏之前获得足够的结构信息。 应对这一挑战的一种方法是，拍摄许多独立的、相同的分子的图像： 至少 500 个，并对图像进行平均以获得分子典型的结构。 另一种方法是以特殊方式冷却样品，使其更能抵抗电子损伤——这将在下一节中介绍。另一个挑战在于，电子一旦靠近任何原子就会发生衍射。这意味着电子源和样品之间必须畅通无阻，这样电子才能到达目标分子，而不会因其他分子（如空气中的氧气和氮气）挡道而散射。换句话说，科学家必须在电子显微镜的样本周围创造一个真空。然而由于生物分子总是处在含水溶液中（想一想血液中的分子），水分子难免会蒸发到真空之中，此外水分的蒸发还会使样本过于干燥，这又通常会损坏样本中的生物分子。面对这些问题，结构生物学家发挥他们的创造力，利用水的独特性质来应对这一挑战。水在极低温度下能保持液态吗？为了解水的独特性质，您可以尝试下面这个实验（图 3 ）。拿一个带盖的空罐子，装满水，在水下拧紧盖子从而避免罐子里混入气体，然后将其放置于冰箱的冷冻层。一天之后，罐子里的水温将下降至− 10 °C 或− 20 °C（通常情况下水会在0 °C时结冰）。第二天，把罐子从冰箱里拿出来看看——水是变成了固态冰，还是保持液态？图 3：家里的过冷水。(1) 取一个空罐子，装满水，确保里面没有气泡。(2) 将罐子密封好 (3) 放入冰箱冷冻一天。(4) 然后，取出罐子。水是结冰的还是液态的？如果它仍然是液体，你就制得了过冷水！大多数情况下，您会发现水仍然是液态，尽管它已经冷却到低于其冰点 (0 °C) 的温度。在我们的实验中，我们希望将水进一步冷却到− 170 °C 以下，因为在这个温度下它变得平静又稳定。我们还希望避免产生冰晶，因为它们会干扰我们的测量。为此，我们必须使用雅克杜博歇 实验室开发的特殊冷却方法，他与我 (理查德亨德森) 、约阿希姆弗兰克于2017 年共同获得了诺贝尔化学奖。在这种方法中，我们要用到非常冷的液体乙烷或丙烷（天然气中的成分，组成原子只有碳和氢），将乙烷/丙烷液体冷却至− 185 °C，然后我们将一层非常薄的水膜浸入其中，这层水膜在极端时间内——约千分之一秒——迅速冷却，以至于没有时间形成有组织的冰晶，而是保持无序的液态形式 [1]，我们称之为无定形冰。这样，我们就得到了过冷水。热电子和冷样品的神奇组合事实证明，过冷水的薄膜非常适合我们想要用电子显微镜成像的生物分子悬浮在其中。当我们将这个冷却步骤添加到成像过程中时，就是所谓的冷冻电子显微镜技术。冷冻电子显微镜技术使我们能够应对前文提到的两个挑战：一方面它使标本稳定，从而更能抵抗高能电子的破坏，另外，它允许生物分子处于自然的水环境中，避免水蒸发到真空之中。它还有一个更重要的优势：与大多数其他液体不同，水在冷却到 4 °C 以下时会膨胀，这一特性有助于生物分子在过冷水中保持完好。想象一下，如果水在冷却时收缩，它就会挤压甚至破坏要成像的分子。这种相当简单但高效的冷冻电子显微镜成像方法使我们大大提高了生物分子成像的分辨率。这就是它有时被称为“分辨率革命”的原因。图 4：冷冻电子显微镜拍出的图像。(A) 一种称为腺病毒的致病病毒的结构。该图像显示了称为衣壳的外表面，它是包裹病毒遗传物质的蛋白质外壳。颜色代表距球体中心的距离：红色距离中心最远，蓝色距离最近。(B) 一种参与微生物能量产生的酶。颜色代表酶的各个次级结构单元（片段）。(C) 2013 年（左，浅紫色）和 2017 年（右，深紫色）冷冻电子显微镜的分辨率对比。图片来源：(A) 改编自参考文献 [2]；(B) 改编自参考文献 [3]；(C) Martin Hö gbom ，斯德哥尔摩大学，基于 V. Falconieri 的图像。冷冻电子显微镜的未来电子是对生物分子成像的最佳粒子。为了让您了解它们有多好，我们把它们与另外两种常用粒子进行比较：X 射线光子（类似于光子，但波长较短）和中子（一种来自原子核的粒子）。我们可以计算出成像时所获得的结构信息量与该粒子在样本中造成的损害的比值，以此来衡量该粒子的成像效果。根据该标准，电子比 X 射线好 1000 倍，比中子好3倍！这就是我和我的同事多年前开始使用电子而不是其他粒子的原因。如今，冷冻电子显微镜已经获得非常成功的应用，使用它的结构生物学家的数量已经很多了，但还在迅速增加。冷冻电子显微镜仍有很大的改进空间。一是改进电子探测器，它们仍然不够大或效率不够高，使我们实际所用的电子比理论上应使用的电子要多得多。此外，当电子束接触样品时（包括水分子和生物分子），如果能进一步减少样品的运动将会改善成像效果[4, 5] 。我们相信，在大约 5 年的时间里，应对这些挑战将会取得重大进展。届时我们将拥有更强大的工具，让我们更好地理解许多生物学问题，例如生命如何运作以及如何繁殖。我们获得的信息可能有助于我们维护人、动物和植物的健康。我们可以期待冷冻电子显微镜的光明前景！给年轻人的建议我，理查德，想分享一些我在整个职业生涯中遵循的实用建议。这些建议来自1960 年诺贝尔生理学或医学奖得主彼得梅达沃 (Peter Medawar) 的著作。获得诺贝尔奖后，彼得梅达沃出版了《可解的艺术》（The Art of the Soluble）和《寄语青年科学工作者》(Advice to a Young Scientist)两本书。他在书中说，科学和生活中有很多有趣的东西，我们应该对一切事物保持好奇。但我们也应该选择一些我们特别感兴趣的东西来做。此外，他说科学家们应该致力于当前可以被回答的科学问题，而不是 100 年后才能被解决的那一类遥远的问题，因为那已经超出了科学家的一生。他认为科学是可解决的艺术，得专注于可以解决的问题。科学家应该基于现在的技术回答当前可以被回答的问题。我读大学的时候学的是物理，当时，我想知道物理学会走向何方，我记得我列了一个清单，列出了关于未来所有有趣的话题。有聚变研究，涉及从氢聚变中产生无限的能量。然后是高能粒子物理学，这一领域的研究促成了新粒子的发现，包括希格斯玻色子等。还有固体物理学，它推动了计算机工业和微芯片的发展。生物物理学、天体物理学、宇宙学、黑洞和中子星等都是其他有趣的话题。如果我选择其中的任何一个主题来研究，它们都会同样有意思、令人兴奋。所以，如果你决定从事科学，你必须选择你感兴趣的东西，这样你的研究和工作就是自发的，而不是因为受到任何人的强迫。当你有兴趣和上进心时，遇到困难也不太会困扰你——你只会把它当作一个挑战并继续前进。一旦你选择了一个有趣的主题，在你真正朝着那个方向前进之前，最好尽可能多地了解你为研究这个主题可以进行的各种活动。如果经过 6 个月或一年的努力，结果证明你的想法不是很好，请不要犹豫重新思考并寻找新的方向。与过去相比，今天的科学发展非常迅速。仅在 100 年前，我们甚至不知道 X 射线和电子的存在，而现在我们掌握了整个人类基因组的信息，我们拥有处理 DNA 的复杂方法，并且我们几乎可以弄清楚我们想要的任何东西。未来 100 年将是活着的好时机——也是成为科学家的好时机。享受你的生活，把自己投资在你最感兴趣的事情上！作者致谢：感谢 Alex Bernstein 提供插图、Susan Debad 对手稿的编辑。封面图来源：英国医学研究理事会（MRC）分子生物学实验室 via PNAS.

冷冻电子显微学近年来在电子显微镜的硬件设备及结构解析的软件算法等方面取得了多个重要的技术突破, 正在成为结构生物学研究的重要技术手段, 为越来越多的生物学研究者所重视. 冷冻电子显微学的技术特点决定了它所具备的一些独特优势和发展方向, 同时作为一个正在迅速发展的科学技术领域, 需要多学科的交叉促进. 　　近期来自清华大学生科院的王宏伟发文介绍了冷冻电子显微学的研究现状及面临的技术挑战, 并提出未来可能实现结构生物学与细胞生物学不同尺度的研究在冷冻电子显微学技术上融合的新方法. 　　结构生物学是 20 世纪后半叶, 尤其是在 80~90年代蓬勃发展起来的重要学科. 通过对生物大分子(蛋白质、核酸及其复合体)的三维空间结构的测定, 结构生物学可以在微观尺度上精确地描述复杂生物大分子的形状, 原子与分子组合方式, 及其表面带电、亲疏水等物理性质, 从而为生物大分子发挥生物学功能的机理提供关键的解释. 进入 21 世纪以来, 结构生物学研究的技术手段日益成熟, 在现代生物学研究的各个分支领域中均发挥着重要的作用. 至今为止, 国际蛋白质结构数据库中的结构数据已经超过 100000, 其中绝大部分结构由 X 射线晶体学及核磁共振波谱学解析而来. 　　近年来, 技术的进步使得结构生物学新的研究手段取得了长足的进展. 2013 年 12 月份发表在Nature 上的利用冷冻电子显微学解析获得 TRPV1 原子分辨率结构的两篇文章, 在结构生物学领域造成了巨大的反响. 美国加州大学旧金山分校的程亦凡研究组与 Julius 研究组合作, 利用冷冻电子显微学技术首次获得了 300 kD膜蛋白 TRPV1的 3.4 Å 分辨率的三维结构, 并建立了该分子的原子模型. 　　其实在过去的几年间, 已经有若干工作报道了利用冷冻电子显微学解析病毒、蛋白酶体复合物、核糖体等近原子分辨率模型. 这些工作的里程碑式意义在于: 高分辨率结构解析过程不需要生长三维晶体, 样品用量非常少, 而且可以在短时间内同时获得多个复合体状态的三维结构. 短短一年里, 冷冻电子显微学技术作为直接解析生物大分子原子分辨率结构的技术手段受到人们的广泛关注. 　　事实上, 电子显微学是结构生物学研究中的老兵. 该技术自从 20 世纪 50~60 年代以来, 一直在研究细胞、 亚细胞及生物大分子结构的研究中扮演着独特的角色, 揭示了很多重要的细胞内精细结构. 在研究生物大分子的结构方面， 该技术采取与 X 射线晶体学及核磁共振波谱学迥然不同的原理, 在过去的几十年里逐渐建立了成熟的图像处理及分析算法, 成为结构研究的一种独特技术手段. 近 10 年来, 该领域的日臻成熟以及科研团队的扩大更快地催生了冷冻电子显微学成像技术与结构解析技术的革命性突破. 自从 2008 年以来, 冷冻电子显微学已经连续获得多种生物大分子复合体的原子分辨率结构, 而且高分辨率结构的解析速度正在呈现迅速上涨的趋势。 　　冷冻电子显微学从 20 世纪中叶开始, 经历了 80年代到 90 年代的技术方法建立时期, 21 世纪初的技术成熟期, 在过去的两年里发生了革命性的技术进步, 进入了快速发展期. 结构生物学和细胞生物学研究者如何抓住这个契机, 如何尽快适应新的局面, 掌握新的技术, 充分发挥该技术的优势从而更加更深入地研究生命现象, 将是未来几年里的一个主题. 数学、物理学、计算机科学、材料科学、化学等众多领域的研究者们必将在未来冷冻电子显微学的新技术新方法的开发中发挥重要的作用, 成为该技术的进一步完善与成熟的重要力量. 　　冷冻电子显微学领域研究者们则需要以主动开放的态度吸引其他领域研究者的合作, 并积极迎接来自更多领域研究者的挑战, 保持并发展自己的技术特长, 站在技术发展的制高点上选准研究方向, 始终在冷冻电子显微学的技术前沿上开疆拓土. 　　原文检索： 　　王宏伟. 冷冻电子显微学在结构生物学研究中的现状与展望. 中国科学: 生命科学, 2014, 44: 1020&ndash 1028 　　Wang H W. Current status and future perspective of cryo-electron microscopy in structural biology. SCIENTIA SINICA Vitae, 2014, 44: 1020&ndash 1028 doi: 0.1360/052014-140

在适当的时候结束初级和次级干燥步骤是提高冷冻干燥过程效率的一个关键方面。使用压力作为终点判定标准是确定这两个冻干步骤终点的一个很好的方法。下文中会描述原理和相关的工具来进行压差测量。文中的实验数据对建立最合适的终点标准时会起到作用。上周末我和一群朋友去山里徒步旅行。我们走了几个小时，午饭时间到了一间小屋。此时，我们已经完全没有体力活动和呼吸新鲜的空气了。我们坐下来，点了很多好吃的东西，然后开始把自己弄得傻乎乎的。当我发现肚子里有压力和疼痛时，我才停下来。我的胃不舒服地扩大了我徒步旅行短裤的腰围，并成为这个午餐时间暴食的一个明显的终点标准。当我坐在那里，试图消化和准备继续前行时，我陷入了沉思。老实说，每当我陷入思考的时候，我通常都在想着实验室。当我感觉到胃里的压力逐渐减轻时，我回想起的不仅是一顿丰盛的饭菜，还意识到压力对于判定终点非常有帮助。我在之前已经讨论了冷冻干燥后使用温度来确定次级干燥步骤的终点。在这里，我想给您介绍一个基于压力差的替代方法。冷冻干燥事实上，压力差测试是一种非常好的无损终点检测方法，用于确定初级或次级干燥阶段的结束。该技术使用两种不同的压力计，一个皮拉尼传感器和一个电容压力计。皮拉尼传感器的工作原理是气体的热导率随压力变化。压力计用一根细导线悬挂在气体中，用电流加热来测量压力。在高压下，由于周围气体分子与金属丝的高碰撞率，金属丝将热能损失给气体。这一原理如下图所示。当真空降低时，气体分子的数量和周围介质的导电性一起减少。然后，媒介开始慢慢失去热量。由于这一过程依赖于气体分子的热导率和气体成分，皮拉尼传感器只能在其校准条件下显示正确的压力，而校准条件通常设置在纯氮或空气环境中。除了皮拉尼传感器外，电容式压力计还用于独立于气体成分测量压力。对于这种类型的压力计，电容信号的差异是由压力计内部的物理变化产生的，而不是气体性质的变化。因此，用电容式压力计测量压力与气体成分无关。如果您像我一样，您可能会想知道这两种工具在这种终点确定中是如何协同工作的。在冷冻干燥过程中，由于冰的升华，干燥室内的气体几乎完全由水蒸气组成。样品干得越多，气体成分的变化就越大。水蒸气被氮气或空气代替，直到干燥过程结束时，室内气体只含有纯氮气或空气。由于水蒸气的热导率比氮气的热导率高约 1.6 倍，皮拉尼压力计在纯水环境中的测量偏差约为 60%。皮拉尼压力计和电容式压力计只能在样品干燥后测量相似的压力，并且室内气体的成分主要是纯氮或空气。因此，当到达终点时，两个工具显示的压力相同。下图以图形方式描述了该过程。重要的是，压力波动阻止了这两种测量工具之间的差异达到零。一个合适的终点标准应高于压力波动引起的差值。该值还应足够低，以确保在切换到下一个冻干步骤之前，两个显示压力之间的差异在给定的时间内最小。听起来很简单。但是如何真正建立一个合适的终点标准呢？为了找到合适的压差，我们使用测试方案进行多次测试：我用甘氨酸溶液（去离子水中 5%W/V）作为试验溶液。将溶液在 -40°C 下冷冻 24 小时以上，并在冷冻干燥机上以 0.3mbar 的压力进行干燥。重要的是，在每次冻干循环之前，应进行真空试验，以校准皮拉尼压力计。此步骤是强制性的，以确保皮拉尼压力计在干燥阶段前后显示正确的压力。为了找到一个合适的终点标准，我以不同的压差作为终点标准进行了多次试验。当隔板的温度与样品的温度一致，两个压力计的压力合并时，终点检测成功。结果如下图所示：上图所示为压差为 0.05 mbar 的结果，中间图为 0.03 mbar，底图为 0.025 mbar 作为终点标准。在达到终点标准之前，压差至少保持 60 分钟。隔板温度用黄线表示，样品温度用红线表示，干燥箱压力用绿线表示，皮拉尼压力计在初级干燥（白色阴影）和二级干燥（灰色阴影）上用蓝线表示。同时显示达到压力（黑线）和温度终点标准（黑色虚线）的时间，以及该点相应的温度和压力差。结果表明，只有在压差为 0.025mbar 的循环中，压力曲线和温度曲线在切换到二级干燥之前同时合并。在 0.30 mbar 的设定压力下，0.025 mbar 或更小的压差保持 60 分钟以上可被视为合适的终点标准。对于简单的甘氨酸溶液来说，这没问题，但是对于那些需要二级干燥的更具挑战性的样品呢？嗯，我决定用美味的草莓进行冷冻干燥实验。草莓在 -40°C 下冷冻 24 小时以上，并在 0.3 mbar 的压力下冷冻干燥，初级干燥时隔板温度为 25°C，二级干燥时为 40°C。选择 0.025mbar 的压差作为终点标准。最大的草莓带着一个热电偶，这样样品的温度就可以与隔板温度相比较。上图显示了整个冻干循环，下图显示了二级干燥步骤的截取图。隔板温度用黄线表示，样品温度用红线表示，干燥箱压力用绿线表示，皮拉尼压力计用蓝线表示。图中的白色阴影表示初级干燥，而灰色阴影表示二级干燥。同时还显示了达到终点标准（黑线）的时间以及该点对应的温差。另，下图中的顶部线显示 37 小时后到达终点。此时，温度曲线和压力曲线在循环转换为二级干燥之前同时合并。在草莓的二级干燥过程中，当隔板温度升高（下图）并开始蒸发时，皮拉尼压力计出现一个明显的峰值。当使用温度测量来确定终点时，通常会忽略这个峰值，这表明了比较压力测量可以用于评估具有挑战性的样品的终点标准。我想指出的是，一个合适的终点标准是高度依赖于冷冻干燥循环中的干燥箱室压。这是因为干燥阶段的压差不是绝对的，但始终是在 60% 的室压下。因此，如果冷冻干燥方法的干燥腔室压力发生变化，则需要重复实验过程寻找适当终点标准。二级干燥阶段的终点标准也应适用。在这里，最大压差通常不会达到干燥箱压力的 60%，因为样品中只剩下小部分水。与一级干燥相比，考虑较小的压差可能是有必要的，压差需要持续较长的时间，作为二级干燥的终点标准。这种方法也应该首先通过测试运行来验证。抱歉，我要去吃午饭了。这一次，我将尽量保持我的腹部和裤子之间的压力差达到最小。希望您能对更多的冻干和色谱知识保持渴望，并继续通过步琦学堂满足您的胃口。下次见！扫描左侧二维码可直接拨打电话联系我们或直拨：400-860-5168 分机号：0728仪器信息网认证，请放心拨打

实验型冻干机的工作原理和应用 随着科学技术的不断进步，各种新型实验仪器也层出不穷，其中实验型冻干机就是一种近年来应用越来越广泛的一种实验室设备。该产品可以将溶液、材料等在低温下冷冻成固体，然后在真空环境下将其中的水分蒸发掉，从而得到干燥的样品。下面我们来详细了解一下该产品的工作原理和应用。　　一、工作原理　　实验型冻干机的工作原理是利用制冷技术和真空技术相结合，将待处理物质在低温下冷冻成固体，然后在真空环境下对其进行加热升温，使其从固体状态变为液体状态，最后通过蒸发除去其中的水分，从而得到干燥的样品。具体步骤如下：　　1. 预冻：将待处理物质放入该产品的容器中，然后在低温环境下进行预冻，使其变成固体状态。　　2. 冻干：将预冻后的物质放入该产品的干燥室中，然后在真空环境下进行加热升温，使其从固体状态变为液体状态。此时，被冻结的水分会逐渐蒸发掉。　　3. 重复以上步骤直至完成干燥过程。　 二、应用　　该产品广泛应用于生物医药、化学化工、食品等领域。以下是几个具体的应用案例：　　1. 生物药品生产：该产品可以用于生物药品的生产过程中，如生产血浆、疫苗等。通过冻干处理，可以保证生物药品的质量和稳定性。　　2. 化学试剂制备：该产品可以用于化学试剂的制备过程中，如制备氨基酸、维生素等。通过冻干处理，可以使化学试剂长期保存并且方便使用。　　3. 食品加工：该产品可以用于食品加工过程中，如制作汤圆、饼干等。通过冻干处理，可以使食品保持原有的口感和营养成分。　冻干机冷冻干燥机LGJ-18N普通型亚星仪科主要特点：1、本机采用进口压缩机制冷，制冷迅速，冷阱温度低。2、冷阱开口大，无内盘管，带样品预冻功能，无需低温冰箱；3、采用7寸真彩触摸液晶屏控制系统，操作简单方便，且功能强大，作为人机界面，中文(英文)可转换界面，以曲线和数字形式显示工作时间、冷凝器温度、样品温度、真空度，并记录干燥曲线；。4、工业嵌入式操作系统，ARM9核心控制电路设计，32M内存128M FLASH，操作响应速度快，存储数据量大。本机可存储多次冻干数据，FAT32文件系统，EXCEL文件存储，可存储一个月以上测量数据128M FLASH，并配置USB通讯接口，实验数据U盘一键提取。 5、控制系统自动保存冻干数据，并能以实时曲线和历史曲线的形式查看，整个冻干过程清晰明了。6、干燥室采用无色透明一次注塑成型聚碳干燥室，耐腐蚀、不易碎、无粘接、透明度高、密闭性强、样品清楚直观，可观察冻干的全过程。7、真空泵与主机连接采用国际标准KF快速接头，简洁可靠。　总之，实验型冻干机作为一种新型的实验室设备，其应用领域越来越广泛，为企业提高产品质量和降低成本提供了有力的支持。

应用电子显微镜高分辨本领和高放大倍率，对物体组织形貌和结构特征进行分析和研究的近代材料物理测试方法。但样品的制作直接影响着结果的准确性，所以制作满足要求的样品就成了整个试验的重点。现将一些常见电镜制样方法简介如下。透射电镜（TEM）TEM放大倍数可达近百万，可以看到在光学显微镜下无法看清的0.1~0.2nm的细微结构。它的样品制备工作量非常大，约占全部测试工作的半数以上或90%以上，是十分关键的。图 透射电镜样品台常用样品台分为两种：顶入式样品台和侧插式样品台顶入式样品台要求样品室空间大，一次可放入多个（常见为6个）样品网，样品网盛载杯呈环状排列，使用时可以依靠机械手装置进行依次交换。优点：每观察完多个样品后，才在更换样品时破坏一次样品室的真空，比较方便、省时间。缺点：但是需要的空间过大，使样品远离下方物镜，不宜减小物镜焦距而影响电镜分辨力。侧插式样品台样品台制成杆状，样品网载放在前端，只能盛放1～2个铜网。优点：样品台体积较小且占用空间较少，可布置于物镜内上部，利于提高电镜分辨率。缺点：不可能一次投入多个样品网中，每换一个样品都要打破一次样品室内真空，稍有不方便。支撑网的选择：支撑网有多种材质如Cu、Ni、Be、尼龙等，选择时要与待分析样品的成分分开。图 筛网尺寸制备原则• 简单• 不破坏样品表面• 获得尽量大的可观测薄区主要制备方法• 支持膜法：• 复型法：• 超薄切片法：• 薄膜试样（电解双喷减薄，离子减薄，FIB等）1. 支持膜法适用范围：纳米颗粒（防止样品从铜网缝隙中漏出）支持膜种类：• 微栅膜• FIB微栅膜• 纯碳微栅膜• 多孔碳膜• Quantifoil规则多孔膜• C-flat纯碳多孔支持膜等图 筛网尺寸制备过程：• 制备支持膜：在铜网上覆盖一层有机膜后喷碳• 选择分散剂：根据样品性质选择，常用无水乙醇• 分散：使用超声波或搅拌将粉末分散成悬浮液液滴上支持膜（两种方法）：（a）滴样：用镊子将覆盖支持膜的铜网夹住，并用滴管向支持膜上滴入数滴悬浮液，使其保持夹持状态直至干燥为止（推荐）（b）捞取：用镊子夹持载网浸入溶液捞取液滴（缺点：双面挂样制备关键和注意事项：• 样品粉末能否在支持膜上均匀分布• 确保实验过程中未带入污染物2.复型法基本原理：利用电子束透明膜（碳、塑料、氧化物薄膜）复制材料表面或者断口形态的间接试样制备方法。适用范围：在电镜中易起变化的样品和难以制成薄膜的试样。样品要求：非晶态、分子尺寸小、导电性、导热性良好，耐轰击，有足够的强度和刚度。复型法分类：塑料一级复型、碳一级复型、塑料-碳二级复型、萃取复型。（1）塑料一级复型样品上滴特定溶液，溶液在样表面展平，多余的用滤纸吸掉，溶剂蒸发后样品表面留下一层100nm左右的塑料薄膜。图 塑料一级复型（2）碳一级复型利用真空镀膜装置将碳膜蒸镀于试样表面，将试样置于真空镀膜装置内，将试样置于所配的分离液内经电解或者化学分离得到分离碳膜便可应用于分析。图 碳一级复型（3）萃取复型图 萃取复型（4）塑料-碳二级复型通俗地说，塑料的一级复型中又制造出碳复型即为二级复型。分辨率相当于塑料的一级复型，对试样无损害，耐电子束辐照，复型带重金属投影。图 碳二级复型3. 超薄切片法适用范围：生物组织、较软的无机材料等。1.取材 2.固定 3.漂洗 4.乙醇或丙酮系列脱水 5.渗透 6.包埋 7.聚合 8.修块 9.切片 10.捞片染色 11.电镜观察注意事项：• 迅速：最短时间内取样,投入固定液• 体积小：所取样品体积不超过1mm3• 轻：轻轻操作，使用锋利器械，避免拉、锯、压• 准确：所取部位有代表性• 低温：在0～4℃内操作4.离子剪薄法适用范围：用于非金属材料或非均匀金属制备过程：• 预处理：按预定取向切割成薄片，机械抛光减薄到几十μm，把边长/直径切割至3mm。• 装入离子轰击装置：• 抛光：获得平坦而宽大的薄区。图 离子剪薄法5.电解双喷减薄法适用范围：只能制备金属试样，首选大块金属。样品准备：• 磨抛厚度均匀，避免穿孔偏• 样品保证清洁• 多准备一些试样，试合适的条件制备步骤：• 样品接正极、电解液接负极，电解液从两侧喷向样品• 样品穿孔后，自动停机• 获得中间薄，边缘厚，呈面窝状的TEM薄膜样品电解液选择：根据样品；不损伤仪器优点：条件易控制，快速，重复性好，成功率较高。图 电解双喷减薄法原理图6. 聚焦离子束法（FIB）适用范围：适用于半导体器件的高精度切割与线路修复。原理：采用从液态金属镓中提取离子束，并通过调节束流强度对指定区域进行快速精细处理。方法：铣削阶梯法，削薄法（H-bar）铣削阶梯法：• 预处理：铣削出两个反向的阶梯槽，中间留出极薄的TEM试样• 标记：刻蚀出定位标记• 定位：用离子束扫描定位标记，确定铣削区域• 铣削：自动或手动完成铣削加工图 铣削阶梯法制备的样品TEM照片削薄法（H-bar）：• 使用机械切割和研磨等方法将试样做到50-100μm厚• 使用FIB沉积一层Pt保护层• 使用FIB铣削掉两侧的材料图 削薄法工作示意图扫描电镜（SEM）扫描电镜样品制备比透射电镜样品制备简单，无需包埋和切片。样品要求：样品须为固体；达到无毒、无放射性、无污染、无磁性、无水分、组分稳定。制备原则：• 表面受到污染的试样，要在不破坏试样表面结构的前提下进行适当清洗，然后烘干；• 新断开的断口或断面，一般不需要进行处理，以免破坏断口或表面的结构状态；• 要侵蚀的试样表面或断口应清洗干净并烘干；• 磁性样品预先去磁；• 试样大小要适合仪器专用样品座尺寸。常用方法：块状样品块状导电材料：无需制样，用导电胶把试样粘结在样品座上，直接观察。块状非导电（或导电性能差）材料：先使用镀膜法处理样品，以避免电荷累积，影响图像质量。图 块状样品制备示意图粉末样品直接分散法：• 双面胶粘于铜片表面，借助棉球使被测样品颗粒直接撒布于其上，并用洗耳球对样品进行轻吹以去除粘附的、没有被牢固地固定的粒子。• 将装有颗粒的玻璃片翻起，对着已准备好的试样台用小镊子或者玻璃棒轻敲，使细颗粒能够均匀地落入试样台上。超声分散法：将少量颗粒放入烧杯内，加乙醇适量，超声震荡5分钟，然后用滴管加入铜片内，使其自然干燥。镀膜法真空镀膜真空蒸发镀膜法（简称真空蒸镀）就是将蒸发容器内需要成膜的原材料在真空室内进行加热，将蒸发容器内的原子或分子气化并从表面逸出，一种形成蒸气流并将其射入固体（称为衬底或基片）的表面以冷凝成固态薄膜的工艺。离子溅射镀膜原理：离子溅射镀膜在局部真空溅射室内辉光放电生成正向气体离子；在阴极（靶）与阳极（试样）之间电压加速时，荷正电离子轰击阴极表面并原子化阴极表面材料；生成的中性原子，向四面八方飞溅，射落在样品表面，从而在样品表面生成了均匀的薄膜。特点：• 对任何待镀材料来说，溅射都是可能的，只要它能够制成靶材即可（适用于难蒸发材料和不容易获得高纯度化合物的相应薄膜材料的制备）；• 溅射所获得的薄膜和基片结合较好；• 消耗贵金属少，每次仅约几毫克；• 溅射工艺具有良好的可重复性，膜厚可控，同时能在大范围基片表面得到厚度均一的膜。• 溅射方法：直流溅射、射频溅射、磁控溅射、反应溅射。1．直流溅射图 直流溅射沉积装置示意图已经很少使用了，由于沉积速率过低~0.1μm/min、基片加热、靶材导电、直流电压和气压都必须很高。优点：装置简单，容易控制，支模重复性好。缺点：工作气压高（10-2Torr）,高真空泵不起作用；沉积速率低，基片升温高，只能用金属靶（绝缘靶导致正离子累积）2．射频溅射图 射频溅射工作示意图射频频率：13.56MHz特点：• 电子作振荡运动，延长了路径，不再需要高压。• 射频溅射可制备绝缘介质薄膜• 射频溅射的负偏压作用，使之类似直流溅射。3．磁控溅射原理：用磁场使电子移动方向发生变化，电子移动轨迹被束缚与拉长，工作气体中电子电离几率增加，电子能量得到高效利用。由此使得正离子轰击靶材产生的靶材溅射变得更高效，可以在更低气压下溅射，而被正交电磁场捆绑的电子则会被束缚于靶材周围，仅能在它们能量消耗殆尽后沉积下来的基片中溅射。图 磁控溅射原理示意图特点：低温，高速，有效解决了直流溅射中基片温升高和溅射速率低两大难题。缺点：• 靶材利用率低（10%-30%），靶表面不均匀溅射；• 反应性磁控溅射中的电弧问题；• 薄膜不够均匀• 溅射装置比较复杂反应溅射溅射气体添加氮气、氧气、烷类等少量反应气体，反应气体和靶材原子共同沉积于衬底上，对于某些不容易发现块材而制造靶材的物质，或者溅射时薄膜成分易偏离靶材原成分，均可用此法进行。反应气体：O2，N2，NH3，CH4，H2S等镀膜操作将制备完成的样品台放置在样品托上，放入离子溅射仪，加盖，旋紧螺丝并开启电源抽真空。当真空趋于稳定时，在5 X10-1mmHg左右，按下“启动”键，用调节针阀把电流调节到6~8mA,开始镀金，镀金1分钟后即自动停止镀金，关好电源、打开顶盖螺丝、放掉气体、取下试样即成。图 Cressington 108Auto高性能离子溅射仪冷冻电镜制样冷冻电镜是扫描电镜超低温冷冻制样传输技术（Cryo-SEM）可以实现液体，半液体和电子束敏感样品的直接观测，例如生物和高分子材料。样品经超低温冷冻，断裂和镀膜制样（喷金/喷碳）后可由冷冻传输系统置于电镜中的冷台上（温度可至-185°C）观察。适用范围：塑料，橡胶及高分子材料，组织化学，细胞化学等样品制备要求：能够保持本身的结构，又能抗脱水和电子辐射方法：（a）通过快速冷冻使含水样品中的水处于玻璃态，也就是在亲水的支持膜上将含水样品包埋在一层较样品略高的薄冰内。图 液氮冷冻（b）采用喷雾冷冻装置（spray-freezing equipment），结合基质混合冷冻技术（spray-freezing），可在极短时间内将两种溶液（如受体和配体）混合（ms量级），然后快速冷冻。图 喷雾冷冻装置金相制样金相分析是材料研究领域中非常重要的一个环节，也是材料内部组织研究的一种主要方法。利用定量金相学原理通过对二维金相试样磨面或者薄膜进行金相显微组织测量与计算，确定合金组织在三维空间中的形态，进而建立合金成分，组织与性能之间定量关系。制样过程：样品切割、镶嵌样品、机械制样、检验样品样品切割方法：金相最适合的切割方法是湿式切割轮切割法。优点：所造成的损伤与所用的时间相比是最小的切割片的选择：主要依据材料的硬度和韧性进行选择。图 砂轮片的选择• 陶瓷和烧结碳化物：金刚石切割片• 钢铁材料：氧化铝（Al2O3）切割片和CBN切割片• 有色金属：碳化硅（SiC）切割片镶嵌样品金相样品镶嵌技术（以下简称镶样）是将试样尺寸小或形状不规则造成研磨抛光痛苦时镶嵌或夹持，以便于试样抛磨，提高工作效率和实验精度的一种工艺方法。镶样一般分为冷镶和热镶。冷镶应用：对于温度和压力极为敏感材料、和微裂纹试样要进行冷镶，会使试样组织不发生改变。图 冷镶示意图冷镶材料：一般包括环氧树脂、丙烯酸树脂、聚脂树脂。• 环氧树脂：收缩率低，固化时间长；边缘保护好，用于真空浸渍，适用于多孔性材料；• 丙烯酸树脂：黄或白，固化时间较短，适合批量大、形状不规整样品镶样；对于含裂纹或者孔隙的试件渗透性更好；尤其是对印刷电路板的封装；• 聚酯树脂：黄色、透明、固化时间较长；适用于大批量无孔隙的试样制样，适用期长；真空浸渍：多孔材料（如陶瓷或热喷涂层）需真空浸渍。树脂能增强这些脆弱材料并能尽量减少制备缺陷（例如抽出，开裂或未开孔等）。只有环氧树脂由于其低粘度、低蒸汽压的性质，才能在真空浸渍中使用。荧光染料和环氧树脂可以被混合以方便地发现荧光灯中所有被充填的孔隙。图 冷镶制样 图片来源：司特尔公司热镶应用：适用于低温及压力不大的情况下不发生变形的样品。图 热镶示意图镶材料：目前，通常多用塑料做镶嵌材料。镶嵌材料包括热凝性塑料（如胶木粉），热塑性塑料（如聚氯乙烯），冷凝性塑料（环氧树脂加固化剂）和医用牙托粉与牙托水。胶木粉不透光、色泽多样、且较坚硬、样品不易倒角、但抗强酸、强碱耐腐蚀性较差。聚氯乙烯呈半透明或透明状，抗酸碱耐腐蚀性能良好，但柔软。热镶试样图片来源：司特尔公司机械制样机械制样可分两种操作：研磨和抛光1.研磨研磨的终极目标就是要得到损伤最小的平表面。这些小损伤会在后续抛光中短时间内被去除。研磨分为粗磨和细磨两个过程。• 粗磨粗磨过程就是把全部试样表面变成一个类似的面，用比较粗的固定研磨颗粒就能快速磨去材料。• 精磨 精磨会使样品有些微变形，但这些变形在抛光过程中就会消除掉。2.抛光抛光就像研磨，还得除去前道工序造成的伤害。它可以分为金刚石抛光与氧化物抛光两大工序。• 金刚石抛光唯有把金刚石当作研磨料来抛光才有可能在最快的时间内得到最佳研磨平面。其原因是金刚石非常坚硬，几乎能切割所有的物质和相态。• 氧化物抛光 对于特别软、韧性的样品，须采用氧化物抛光法。抛光在抛光布上完成。金刚石抛光时还须用到润滑剂。研磨和抛光设备检验样品打磨后的检测部位变的发亮，在观察组织的时候需要先将试样的检测部位腐蚀掉，做好之后使用酒精冲淋，使用吹风机吹扫。

由中国生物物理学会、中科院生物物理研究所、清华大学和FEI 公司联合主办的第一次中国结构生物学冷冻电镜培训班(Get acquainted with Cryo-Electron Microscopy：First Chinese Workshop for Structural Biologists)于2015 年5 月29 日-6 月3 日在北京顺利举行。本次培训班主任由中科院生物物理所孙飞研究员、清华大学王宏伟教授和美国FEI公司Marc Storms博士担任，讲授队伍来自中科院生物物理所、清华大学、北京大学、中科院上海生化细胞所、中国科技大学、英国剑桥大学LMB实验室和FEI公司等工作在冷冻电镜一线的教授和工程师们，并精心地为学员们准备了包括讲义、课件、学习资料、实习材料和数据在内的教学材料。本次培训班得到了FEI公司的独家赞助和大力支持。 　　作为生物大分子结构研究的手段之一，冷冻电子显微镜三维重构技术，尤其是单颗粒三维重构技术(SPA)，近期取得了非常瞩目的成果。近两年来，利用SPA技术解析的重要生物大分子复合体层出不穷，分辨率也日益提高。在此契机下，中国生物物理学会生物超微结构显微成像专业委员会与FEI公司进行合作，利用中科院生物物理研究所和清华大学生命科学学院在国际上领先的冷冻电子显微平台，联合发起了此次培训班，旨在为零基础学员提供全面了解和学习电镜三维重构理论和技术的机会，系统地将冷冻电镜前沿技术带给国内的相关研究人员，特别是X射线晶体学、NMR等非电镜领域的专家学者和学生们。这无疑将极大地推动我国冷冻电镜和结构生物学领域的发展。 　　培训班为期四天，包括上午讲座报告、下午实际操作和上机实习、以及晚上的答疑讨论会。来自全国百余学员参加了此次培训活动。5月30日上午，北京大学的尹长城教授对冷冻电镜的发展历史、现状进行总结并对未来的发展进行展望，提出电镜技术已经进入&ldquo 黄金时代&rdquo 。随后，清华大学的王宏伟教授和中国科技大学的蔡刚教授分别对负染色和冷冻两种电镜制样方法进行了非常详尽的介绍。5月31日上午，清华大学的雷建林教授详细讲解了透射电子显微镜(TEM)的光学系统、成像原理等关键理论，FEI公司的应用工程师王庆博士则介绍了如何操作电镜，如何进行拍照成像等具体的工作流程。6月1日上午，清华大学的高宁教授介绍了如何评估电镜数据质量，李雪明教授介绍了目前最前沿的直接电子探测相机技术及其相关的motion 校准技术，英国MRC的白晓晨博士分享了解析高分辨率电镜结构涉及到从前期制样到后期图像处理的大量技术细节。利用前三天下午的实习操作时间，学员们不仅零距离看到工程师们现场演示制作电镜样品和电镜操作，而且还亲自练习制样方法并实际操作电镜。6月2日，中科院生物物理所的孙飞研究员、中科院上海生化细胞所的丛尧教授介绍了单颗粒三维重构的基础知识和原理，中科院生物物理所的朱平研究员系统讲解了如何对重构结果进行分析和展示。2日下午学员们在老师们的指导下上机练习了两个冷冻电镜三维重构软件EMAN2和Relion，对三维重构的流程有了更加直观的认识。除此之外，每天晚上的讨论会，学员们都带着问题来的，互动交流的主动性很高，积极发言，深入讨论，将白天所学知识消化掌握，反响很好。 　　(中国结构生物学冷冻电镜培训班) 　　国际冷冻电子显微镜高级图像处理研讨会(International Workshop of Advanced Image Processing of Cryo-Electron Microscopy 2015)由清华大学隋森芳教授担任组委会主席，由清华大学王宏伟教授、中科院生物物理所孙飞研究员共同担任执行主席，于2015 年6月3日-6 月7日在北京顺利举行。教师队伍来自MRC分子生物学实验室(英国)、Brandeis University(美国)、University of Colorado Boulder(美国)、脑科学MPI 研究所(德国)、University of Basel(瑞士)等多所国外大学与研究机构。研讨会为期五天，包括上午讲座报告、下午软件操作与上机实习、及晚上的答疑讨论会，围绕近原子分辨率单颗粒重构技术、三维模型建立与精修、电子断层扫描与sub-tomo平均计算等主要议题，分别就DED图像的信息分析与处理方法、单颗粒锐化及电子密度图校正、低分辨率冷冻电镜图像的模型建立与验证、冷冻电镜图谱原子模型的搭建、近原子分辨率冷冻电镜图谱的结构细化与验证、电子断层扫描技术的理论与原理、电子断层扫描数据采集与处理中重要影响因素、sub-tomo平均计算的流程与应用、及其理论、方法与前景等多项话题展开深入的交流与细节探讨。来自日本、印度、美国等多个国家一百四十余名学员参加了本次研讨会，反响热烈。 　　(国际冷冻电子显微镜高级图像处理研讨会) 　　作为生物大分子结构研究的重要手段之一，冷冻电子显微镜技术近年来取得了非常瞩目的成果，分辨率获得极大提高。在此契机下，中国生物物理学会生物超微结构显微成像专业委员会与FEI等公司进行合作，利用中科院生物物理研究所与清华大学生命科学学院在国际上领先的冷冻电子显微镜平台，联合发起中国结构生物学冷冻电镜培训班与国际冷冻电子显微镜高级图像处理研讨会，不仅为零基础学员提供全面了解和学习电镜三维重构理论与技术的机会，同时为电镜结构生物学领域青年科学家们系统地介绍冷冻电镜前沿技术与图像处理最新研究方法与进展，积极促进国际交流与合作，极大的推动我国冷冻电子显微镜和结构生物学领域的进步与发展。

冷冻饮品是以饮用水、食糖、乳制品、水果制品、豆制品、食用油等中的一种或多种为主要原料,添加或不添加食品添加剂,经配料、灭菌、凝冻而制成的冷冻固态制品。近些年来,微生物超标依然是冷饮食品质量安全的主要问题之一。 　　质监局有关专家介绍，每年质监部门都不定期对市场上的冷饮进行抽查，每次抽查的结果都没有100%达到合格。问题主要集中在生产、运输和销售的环节上。菌落总数、霉菌、酵母菌等微生物超标是冷饮常见的问题。菌落总数超标，冷饮爽口不爽心夏天吃冷饮固然爽口又爽心，吃到不合格产品，一只冰糕下肚，等于吞下去不计其数的霉菌、酵母菌。 　　存在的主要问题是细菌菌落总数和大肠菌群超标。细菌菌落总数的超标可能是生产过程中设备的通道、包装容器材料、空瓶、瓶盖消毒不彻底，生产工艺落后所致，因此必须加强生产工具、容器机械清洗消毒和机械设备的清洗消毒，改进落后的生产工艺，提高机械清洗消毒和机械化的生产能力。大肠菌群超标可能与水源直接或间接受到污染，从业人员个人卫生习惯较差有关，为此应加强法制教育，严格执行《食品卫生法》和国家对冷饮食品的卫生管理办法，坚持对从业人员体检和冷饮卫生知识的培训。应加强冷饮食品卫生预防性监督管理力度和卫生知识宣传教育的深度，把重点放在防止微生物的污染和个体私营单位的管理。 　　冷饮在加工过程中，需要经过复杂的过程，对调料的配置、配料的粉碎等等，都需要经过较长的过程，且加工的过程中，冷饮直接裸露于空气之中的时间较长，容易造成菌落数超标和二次污染的问题，在包装之前，需要不间断的对于整个加工过程进行消毒灭菌。 　　所以，需要找到一种正确实用高效的消毒灭菌方式才能很好解决冷饮菌落总数超标问题。 　　动态消毒灭菌方式能够很好地应用于冷饮的加工过程，在包装之前，能够对于整个生产环境进行不间断消毒灭菌。据上海康久消毒技术有限公司工程师周立法介绍，这种消毒灭菌技术的杀菌原理是通过特殊的脉冲信号使得NICOLER发生腔产生逆电效应，生成大量的等离子体。在负压风机的作用下，污染空气被抽进发生腔内，带负电细菌被分解击破，整个杀菌过程只需0.1秒，再经药物浸渍型活性炭等组件二次杀菌过滤后，受控环境保持在“无菌无尘”标准。由于在对车间消毒时，人可同时在车间内工作，所以，该杀菌技术也可称作为“食品动态杀菌机”。 　　定期清理奶垢能有效的防止微生物的滋生，而在清理奶垢时应注意空气杀菌，可大幅度减少微生物超标的可能性。

冷冻干燥（也称为冻干）行业对生产力和盈利能力的需求正在增加。这种增加促使业内从业者考虑冷冻干燥与喷雾干燥相比的优势。因此，在本文中，我们在考虑两者的优势，以帮助您选择最适合您的项目和产品的干燥技术。冷冻干 燥or喷雾干燥如何抉择？ 干燥在生物制药行业被广泛认为是保存各种药物制剂和生物制品的首选方法。当液态稳定性不足、储存要求过于严格或需要固体形式的产品以延长保质期或实现不同气候和环境之间的运输时，就需要使用合适的干燥技术。 冷冻干燥无疑是各种材料和应用中公认的“首选”干燥工艺。然而，由于成本、API的可用性以及有时加工和生产量，对替代方法进行评估以确保使用最适合产品和/或项目的干燥方法。 *的冷冻干燥替代方法是喷雾干燥。喷雾干燥具有多种优势。尽管与冷冻干燥相比，它是行业中的新手，但它展示了在可扩展级别（连续而不是逐批处理）处理更高吞吐量的能力。因此，喷雾干燥也可被视为产品干燥的可行选择，具体取决于相关加工要求和产品应用。两者的干燥过程冷冻干燥冷冻干燥的原理涉及以受控方式对产品进行初始冷冻，以控制冰晶结构。 然后将其置于真空中，在真空中进行升华（或初步干燥）以去除未结合的水。接下来是二次干燥以升华结合水，将材料降至用户定义的残留水分水平。此阶段的目标是结合水而不是未结合/游离水，因此需要更多的能量来通过将搁板温度提高到+20°C或更高来驱动该过程。当加上低气压时，它会导致冰直接变成水蒸气（通过液相），这个过程叫做升华。 根据在给定冻干周期中干燥的样品的性质，温度和真空之间的微妙平衡对于确保在干燥后生产成功的批次而不影响产品功效和活力至关重要。为实现这一点，不同类型的产品及其体积可能需要根据其固有的样品特性进行12小时到5天的冷冻干燥。喷雾干燥喷雾干燥通常被认为是一个更简单（和更快）的过程，涉及在一个步骤中将液体制剂转化为干粉。溶液被雾化成细小的液滴，然后在一个大室中使用热气体快速干燥。然后用旋风分离器收集所得干燥颗粒。尽管根据经验，喷雾干燥比冷冻干燥更快且更便宜，但其中一个显着缺点是它需要高加工温度和剪切力。当然，在受到严格控制的制药和生物技术行业中，这些是许多客户力图避免的，在这些行业中，有效性的可行性和工艺参数与敏感的 API 和配方相关；因此，喷雾干燥更适合用于相当耐寒的产品。冷冻干燥中的产品温度在初级干燥中通常低于0°C，在二级干燥中通常为20-30°C，而喷雾干燥中的产品温度通常高于 80°C。在这些较高 (80°C) 温度下工作的直接影响可能是干燥后样品质量在固有产品特性方面的整体损失，例如：1.功效/生存力；2.味道/气味/颜色；3.一致性；4.营养价值，即食品相关产品中的营养素；5.生物产量—更高水平的细胞（即细菌）对数减少；6.蛋白质降解。 行业中的应用这两种工艺都可用于广泛的应用。例如，冷冻干燥通常用于保存不同类型的细胞、精细化学品、实验室试剂和注射疫苗，以及食品工业和乳制品。因为它通常是用直接装在小瓶或其他容器中的产品进行的，所以这种加工方法最适合干燥后不需要进一步加工的配方；此外，小瓶可以在冷冻干燥机的原位密封，从而避免循环完成时的潜在污染。另一方面，喷雾干燥更常与批量加工相关，而不是基于小瓶的加工。 然而，一个普遍的误解是喷雾干燥仅适用于食品和稳定的原料药，而当代研究表明它可能是用于某些复杂产品（例如微囊化细菌和纳米颗粒）的有效方法。 效率、质量与成本人们普遍认为与喷雾干燥相关的成本低于冷冻干燥的成本，这使得该技术成为某些市场感兴趣的技术之一。与冷冻干燥相关的分批形式不同，喷雾干燥对更大的吞吐量潜力更开放，可以被视为“连续过程”。此外，冷冻干燥的优势在于产品的稳健质量。 精确控制低加工温度可*限度地降低产品固有特性的任何风险，例如塌陷、共晶熔化或超过玻璃化转变温度，从而使冻干产品加工成最高质量。生物制药在喷雾干燥过程中可能会受到剪切应力，再加上所需的高加工温度会使蛋白质等化合物不稳定并损害产品性能，*降低产品功效。总结总之，两种产品干燥工艺方法在正确使用且适用于合适的产品时都是有效的。为了在包括干燥阶段的产品加工中获得*结果，*决定哪种方法最适合项目或持续加工需求的因素将是*产品的质量及其如何到达*用户 。

冷冻干燥机是目前较为先进的一种物质脱水干燥的设备，其原理是将含水物质在低温下冻结，而后使其中的水份在真空状态下直接升华，并用冷凝的方法捕凝升华的水汽，达到物质脱水干燥的目的。冷冻干燥机也因此被广泛应用到各行各业. 冷冻干燥机应用范围： 食品行业：冷冻干燥机常用于果蔬、肉禽、水产、调味品、方便食品及名优特产等干燥，因此冷冻干燥机也称为食品冻干机，保持食品原有的色、香、味、形、新鲜度不变的目的，且复水性好，成品便于储存和运输，费用降低，保存期延长。 药材保健：在干燥蜂王浆、人参、龟、鳖、蚯蚓等营养保健品，采用真空冷冻干燥工艺，更好的保留了原有的营养价值，更使人们相信该营养品纯真自然。 制药行业：用于血清、血浆、疫苗、酶、抗生素、激素等中西药品的脱水与保存。 生物研究：利用真空冷冻干燥技术长期保存的血液、细菌、动脉、骨骼、皮肤、角膜、神经组织和各种器官，在使用时只需供给水份即可再生，仍保持其生物理特性。 文章原创:上海田枫实业有限公司 www.tfsye.com上海田枫实业有限公司,专业生产各类制冷设备，包括层析冷柜,冻干机，冷水机，超低温冰箱，恒温槽等，一流的专业，一流的服务，上海田枫是您的最佳选择！

冷冻干燥是利用升华的原理进行干燥的一种技术，是将被干燥的物质在低温下快速冻结,然后在适当的真空环境下,使冻结的水分子直接升华成为水蒸气逸出的过程. 冷冻干燥得到的产物称作冻干物，该过程称作冻干。 物质在干燥前始终处于低温(冻结状态),同时冰晶均匀分布于物质中,升华过程不会因脱水而发生浓缩现象,避免了由水蒸气产生泡沫、氧化等副作用。干燥物质呈干海绵多孔状，体积基本不变，极易溶于水而恢复原状。在最大程度上防止干燥物质的理化和生物学方面的变性。 冷冻干燥机原理简单易懂，但是在应用在具体行业里时，却也有着很多的区别。 近代干燥机开始使用的是间歇操作的固定床式干燥机。19世纪中叶，洞道式干燥机的使用，标志着干燥机由间歇操作向连续操作方向的发展。回转圆筒干燥机则较好地实现了颗粒物料的搅动，干燥能力和强度得以提高。一些行业则分别发展了适应本行业要求的连续操作干燥机，如纺织、造纸行业的滚筒干燥机。 20世纪初期，乳品生产开始应用喷雾干燥机，为大规模干燥液态物料提供了有力的工具。40年代开始，随着流化技术的发展，高强度、高生产率的沸腾床和气流式干燥机相继出现。而冷冻升华、辐射和介电式干燥机则为满足特殊要求提供了新的手段。60年代开始发展了远红外和微波干燥机。 用于进行干燥操作的机械设备类型很多，根据操作压力可分为常压和减压（减压干燥机也称真空干燥机）。根据操作方法可分为间歇式和连续式。根据干燥介质可分为空气、烟道气或其他干燥介质。根据运动（物料移动和干燥介质流动）方式可分为并流，逆流和错流。 按操作压力，干燥机分为常压干燥机和真空干燥机两类，在真空下操作可降低空间的湿分蒸汽分压而加速干燥过程，且可降低湿分沸点和物料干燥温度，蒸汽不易外泄，所以，真空干燥机适用于干燥热敏性、易氧化、易爆和有毒物料以及湿分蒸汽需要回收的场合。 在具体应用中，如：海参冻干，机械冻干，药物冻干，食品冻干，都是应用着不同的类型的冻干设备。 简单的说，就是冻干所需要技术条件，科技条件。难度越大，要求越高，产品的成本自然也更高，价格也更高。 产品的捕水量，最低温度也是有区别的。具体的需求量，还是要看产品的要求。

p style=" text-align: center " strong 第四届全国冷冻电子显微学与结构生物学专题研讨会在京举行 /strong /p p 　 strong 　仪器信息网讯 /strong 2015年6月8日-11日，第四届全国冷冻 a href=" http://www.instrument.com.cn/zc/1139.html" 电子显微 /a 学与结构生物学专题研讨会在北京举行，本次会议的主题为“中国冷冻电子显微学的新阶段”。这是冷冻电镜研究领域第一次独立举行的全国性会议，相比于2009年在中国电子显微学年会期间二三十人的一个分会场，此次会议的参加人数达到了近200人。来自海内外的华人学者共聚一堂，交流冷冻电子显微学的最新研究成果。 /p p span style=" color:#0000ff " 　 strong 　三十年的坚持与守望 /strong /span /p p 　　据了解，我国在该领域的研究起始于上个世纪八十年代，当时国内的条件非常艰苦，电镜都没有几台，更不用说计算机、软件系统。然而就是在当时那样艰苦的条件下，以清华大学隋森芳院士为代表的老一辈科学家因为看好这一技术的发展前景，依然坚持推进我国在这一领域的研究工作。同时，一直以来许多海外学者对于国内冷冻电子显微学的发展给予了极大的支持和帮助。 /p p 　　隋森芳在此次会议中多次提到海外学者对于我国冷冻电子显微学发展的贡献。他说：“我们所有这个领域的人都不能忘记他们的贡献。在上个世纪90年代，国内的条件非常困难，我们还处在起步阶段。王大能、周正洪他们这些在国外都已经很有名的学者，每次回来都会来我们的实验室，不分日夜的帮我们安装软件、调试程序，手把手的教学生制样，培养学生。一直到现在，程亦凡、隋海心、章佩君、徐晨等许多海外学者还经常到国内来交流和培训学生。” /p p span style=" color:#0000ff " 　　 strong 迎来新的发展阶段 /strong /span /p p 　　近几年来，随着国家科研投入的加大以及一批优秀的海外学者回到国内。我国在该研究领域与国际先进水平的差距逐渐缩小。在本次会议上就有不少优秀的研究成果展示，如清华大学施一公教授研究组在世界上首次揭示了人源& amp #947 分泌酶复合物(& amp #947 -secretase)的精细三维结构 清华大学王宏伟、生物物理所刘迎芳课题组合作揭示了A型流感病毒RNA聚合酶复合体的三维冷冻电镜结构等。 /p p 　　另外，还有一些学者已经开始从事方法学的研究，尽力去发展完善这一技术。如：中科院生物物理所孙飞与中国科学院计算技术研究所张法合作开发了针对断层扫描成像三维重构算法ICON。 /p p 　　北京大学尹长城介绍说：“在2009年第一届会议上，只要是相关的研究，都可以在会议上作报告。但是现在只有高水平的研究成果才有机会展示。”美国匹兹堡大学教授章佩君也表示：“本次会议报告的水平非常高，我们看到了许多一流的研究成果。” /p p 　　同时为了推进人才培养，近年来国内组织开展了一系列的培训班。如自2008年起每隔一年举行的郭可信电子显微学和晶体学暑期培训班，以及自2013年起每隔一年举行的国际冷冻电镜图像处理技术培训班和今年开始举行的冷冻电镜成像技术培训班。 /p p 　　当前，我国已经有许多年轻的学者成长起来，他们在国际顶尖的实验室做着非常出色的工作，如：英国MRC的白晓辰、畅磊福，还有美国加州大学洛杉矶分校的江健森等。 /p p span style=" color:#0000ff " 　 strong 　百尺竿头 更进一步 /strong /span /p p 　　虽然目前我国在该领域的研究取得了一定的成绩，隋森芳仍然提出：“国内冷冻电子显微学研究这5年的发展非常快，也有一些重要的成绩，但总的来说都还是点，整个领域还需要进一步发展。” /p p 　　另外，国内科研的软环境与国外相比还是有一定的差距。中科院生物物理所黄小俊介绍说，“目前国内研究所需的一些耗材试剂，需要从国外采购，这样不仅耗时、遇到问题沟通交流也不是很方便。”据了解，有时遇到试剂质量问题，甚至会给科研人员的研究带来不必要的困扰，耽误研究进程。 /p p 　　还有伴随着国内冷冻电子显微学的快速发展，技术人才短缺的问题逐渐显现出来。在本次会议上，国家蛋白质科学研究中心(上海)研究员丛尧，还有浙江大学教授洪健都发出了求贤令，希望能有合适的人才加入工作。洪健在会议中表示：“由于待遇体制等方面的原因，引进课题负责人相对容易，要招到合适的冷冻电镜技术人员却很难。” /p p span style=" color:#0000ff " 　 strong 　科研文化的坚守与传承 /strong /span /p p 　　近年来，随着冷冻电镜仪器、直接电子探测相机、图像处理算法的发展，冷冻电镜的分辨率取得了革命性的突破，吸引了越来越多研究人员的关注，许多以X射线晶体学、NMR为技术手段的研究人员也开始进入这一领域。 /p p 　　在隋森芳院士看来，我国冷冻电镜领域的研究人员就像一个大家庭，海内外的研究人员关系一直非常融洽。长期以来，大家相互帮助、相互支持，有很多的交流和合作。他殷切的期望这种文化氛围随着该领域人员队伍的壮大，依然能够得到很好的坚守和传承。 /p p 　　同时，隋森芳指出冷冻电镜的工作需要积累，要做好这一工作，需要从样品制备、电镜技术、结构解析，到问题的解决都要去学习，这是一个系列的完整的工作，切忌急功近利，要耐得住性子，仔细的做好这项工作。 /p p 　　据了解，到目前为止我国已经在清华大学、生物物理所、国家蛋白质科学中心(上海)采购并安装了最先进的Titan Krios透射电子显微镜，浙江大学的第一台Titan Krios即将落户，而电镜三维重构技术的发源地英国目前也只有一台类似的冷冻电子显微镜。王宏伟表示：“和老一辈科学家的艰苦条件相比，我们现在的科研环境好了很多，我们应该抓住机遇，做出更好的成绩。” /p p style=" text-align: right " strong 　　撰稿：秦丽娟 /strong /p p style=" text-align: center " a href=" http://www.instrument.com.cn/webinar/icem2015/" img alt=" " src=" http://img1.17img.cn/17img/old/NewsImags/images/201565105926.gif" style=" width: 600px height: 151px " / /a /p

p 　　精确认识细胞当中的大分子结构对于理解它们的功能至关重要。Amunts等人利用冷冻电镜获得线粒体核糖体大亚基3.2埃的分辨率结构，还有最近利用冷冻电镜获取的其他一些高分辨率结构，这些成就预示着分子生物学研究的新时代，获取近原子分辨率的大分子结构将不再是X射线晶体学和核磁共振的特权。 /p p style=" text-align: center " img alt=" " src=" http://img1.17img.cn/17img/old/NewsImags/images/2014912171159.jpg" style=" width: 600px height: 350px " / /p p 　　图：利用冷冻电镜获得的近原子分辨率结构：(A)酵母线粒体核糖体大亚基，分辨率3.2 埃。(B) TRPV1离子通道，分辨率3.4 埃。(C)F sub 420 /sub -还原[NiFe]氢化酶，分辨率3.36埃。注：该图并不是按比例绘制的。 /p p 　　核糖体是古老的，大规模的蛋白RNA复合物，它将线性遗传密码翻译成三维蛋白质。线粒体——半自主细胞器，为细胞提供能量，拥有它们自己的核糖体，这一点和细菌非常类似。许多抗生素，如红霉素，通过阻止细菌的核糖体翻译机器来抑制细菌的生长。当设计新的抗生素，不能让他们同时阻断线粒体核糖体很重要。因此，认识这两种核糖体的详细结构是很有价值的。其他核糖体的结构已经通过X射线晶体学确定。Amunts等利用冷冻电镜确定了线粒体核糖体的高分辨率结构，这在不到一年前，很少有人会想到可能实现。 /p p 　　不用晶体而能够做到这一点无异于是一场革命。主要是因为采用了新的探测器——具有前所未有的速度和灵敏度的直接电子探测器。直接电子探测器能够直接检测电子，而不是需要先将它们转换成光子，然后再转化为光电子探测进行，目前广泛使用的CCD(电荷耦合器件)相机就是这样，但它们的分辨率不是很好。照相胶片从工作原理上来说，高分辨率成像效果应该更好，但它很难和越来越重要的快速读出电子速度及高数据吞吐量相兼容。 /p p 　　大约10年前，Henderson和Faruqi意识到，应该有可能设计出一种结合了CCD相机和胶片优点的直接探测电子的传感器。他们和两个竞争团队研发的探测器，采用了和大多数手机中的摄像头芯片基本相同的有源像素传感器技术。然而，手机的芯片不能用于电子显微镜，因为强烈的电子束会瞬间破坏它们。因此，首先探测器必须能够抗辐射。第二，探测器所需的像素要大很多，以防止富含能量的电子一次激发多个像素。第三，摄像头采用的芯片必须非常薄，完成每次读出电子160万像素，否则电子散射将会使图像模糊并降低分辨率。目前传感器的厚度大约是一张纸厚度的一半。 /p p 　　冷冻电镜只需要少量的样品，因此那些无法分离得到大量样品，利用X射线晶体学方法进行分析的物质，现在可以利用冷冻电镜得到高分辨率结构。这同样适用于不容易结晶的非均相样品或柔性复合物，因为不同颗粒或构象的物质的冷冻电镜图像在图像处理阶段很容易分离开。 /p p 　　新的检测器提供了另一种决定性的优势：当电子束撞击薄的、不支持冷冻的样品时，它们的快速读出能够补偿小的不可避免地移动。在新的相机问世前，由于电子束诱导移动引起的模糊是一个看似不可逾越的问题。现在，通过快速连续拍摄，可以得到一个区域的数十张图像，并且电子束诱导移动被检测到并反转在电脑上。这种去除模糊的影响戏剧性的和天文学哈勃望远镜相类似，尽管在这两种情况下引起模糊的原因是不同的。 /p p 　　新的相机也促使了低温电子断层扫描成像的重大突破，低温电子断层扫描能够得到全细胞、细胞片、或细胞区室的三维图像，如线粒体。利用断层成像识别分子特征，采用标准CCD相机甚至已达到亚纳米细节，新的探测器问世也必然给断层成像研究带来巨大的变化。 /p p 　　在新相机问世的同时，强大的极大似然图像处理程序也被开发出来。这些程序定义可靠客观的标准，来对几万或几十万个的单粒子图像进行平均处理，为的是要实现高分辨率。先进的检测器和软件相结合，获取的冷冻电镜结构，在相同的标称分辨率下，其清晰度和map definition比采用X射线晶体学解析的结构要好，因为在冷冻电镜图像中包含着高质量的相位信息。 /p p 　　冷冻电镜的分辨率革命是否意味着X射线蛋白质晶体学时代即将结束?当然不是。在可预见的将来，分子量小于100kD的小蛋白，分辨率达到2 Å 或更好将依然是X射线晶体学的领域。但是对于大的，易碎的，或者柔性结构蛋白(如膜蛋白复合物)，它们很难形成晶体，但却在生物医学中起着关键的作用，新技术将对此带来重大突破。在未来，对分子量大、已知的蛋白复合物，如核糖体，进行结晶将可能不再是必要的。相反，它们的结构可以从容并迅速的通过冷冻电镜来确定。这真是激动人心的时刻。（编译：秦丽娟） /p p & nbsp & nbsp 原文检索： a href=" http://www.sciencemag.org/content/343/6178/1443.short" http://www.sciencemag.org/content/343/6178/1443.short /a /p

真空冷冻离心浓缩仪是一款常用于化学分离和纯化技术应用的实验室设备；该技术可通过将化学物质置于离心管中，利用离心力可将混合物中的各种化学物质分离开来，提高纯度。冷冻型的设备则是利用低温环境和真空状态可使化学物质在离心管中迅速冷冻、快速蒸发，从而提高实验的操作应用效率。本篇文章将深入探讨这款低温冷冻型离心浓缩设备的原理应用。　　　　　　冷冻真空离心浓缩仪利用离心和真空技术可将化学混合物中的化合物迅速分离，从而达到对样品的纯化和浓缩目的；该设备被广泛应用于分析化学、医药、生物学等行业领域。冷冻型的实验设备相比较于其他款，它是利用低温环境和真空状态分离化学物质，并将它们冷冻起来以提高实验效率。　　在使用冷冻真空浓缩设备时，需要先将样品置于离心管中，塞进盖子中央的叶轮上，接着运转机器，对离心管内的化合物进行旋转，在加入真空度后，通过减压和外部加热的方式来提高该系统内的温度以及气体流通性；随后可将化合物冷冻蒸发出来，达到样品的浓缩效果。　　　　真空冷冻离心浓缩仪是一款常用于制备RNA和DNA等高浓度浓缩样品的实验设备，该设备使用温度较低功率较少的真空泵和离心机器，可有效提高了实验对样品的纯度和浓缩效率；实验设备基于不同的原理应用，旨在提高化学物质的纯度；而冷冻型真空离心浓缩仪则比其他设备的应用更为高效。

原位硅油冷冻干燥机：精确控制与高效保护的结合一、用途：　　原位硅油冷冻干燥机是一种广泛应用于食品、医药、化工等行业的先进设备。它以其出色的性能和高效能力，成为实现物料低温干燥、保持原有品质和延长储存周期的理想选择。　　二、原理：　　该产品利用了“减压降温”技术来进行低温干燥。首先，将待处理物料置于真空环境中，在减压条件下蒸发水分。然后，通过对硅油进行循环加热和降温，使得润湿在待处理物料表面的水分迅速被固化并转化为固态水。最后，在真空状态下通过恢复常压给予样品光辐射或微波加热使定向剂从乳液中释放出来, 以达到快速脱溕目标。　　三、性能特点：　　1. 精确控制：该设备配备了智能控制系统，可实时监测和调整各项参数如温度、压力和时间。操作人员可以根据需求进行精确设置，以实现最佳的干燥效果。　　2. 高效保护：该产品在干燥过程中能有效减少对物料的损伤。通过低温处理，能够很好地保留物料的营养成分、香气和口感，在同时降低细菌滋生的风险的情况下延长其储存周期。　　3. 广泛适用：该设备可用于各种食品、药品等材料的干燥处理。不同类型和状态（固体、液体或胶体）的样品均可以使用该产品进行高质量的干燥处理。　　4. 结构稳定耐用：设备采用优质材料制造，并经过严格测试，确保工作稳定并提供长期可靠使用。　　四、结论：　　原位硅油冷冻干燥机是一款功能强大且高效可靠的工业设备，在多个行业中都担当着关键角色。通过其精确控制和高效保护性能，它为企业提供了更好地保存产品质量和延长储存期的保障。无论是食品加工、医药生产还是化工领域，该产品都展示出了其重要性和价值。

真空冷冻干燥机也称为冻干机，冷冻真空干燥的基本原理是在低温低压条件下的传热传质。由于被冻干物料性质、冻干方法和对冻干产品质量要求的不同，描述冻干过程的模型及其解法也不相同。通常情况冷冻真空干燥过程的三大阶段冷冻阶段、升华干燥阶段、解析干燥阶段。整个过程其实就是传热和传质同时进行的过程，热和质的传递速率共同影响干燥速率，从而影响整个冻干周期，所有影响热和质传递的因素均会影响干燥速率。简单分析如下：冻干仓压力真空冷冻干燥机冻干仓内压力高低影响到传热和传质的速率，对于传质来说，压力越低越好 对于传热来说，压力越高越好。传质速率的大小，主要由升华界面与干燥层表面的温度和压力差所决定。要提高干燥层中水蒸气的逸出速率，可以提高升华界面的温度，使界面水蒸气压增大 也可以提高冻干仓的真空度，降低干燥层表面的蒸汽压。传热方式按传统的分类可划分为：热传导（有温度不同的质点在热运动中引起的，在固体，液体，气体中均能产生）、热对流（对流是由于温度不同的各部分流体之间发生相对运动，互相掺和而传递热能）、热辐射（凡是温度高于零度的一切物体，不论他们的温度高低都在不间断地向外辐射不同波长的电磁波）和介质加热(微波加热)。由于升华干燥的过程涉及到热和质(水蒸气)的传递，因此，通过哪种传热方式将热量更为有效地传递给物料，对干燥速率有较大的影响。样品内有机溶剂的浓度样品内有机溶剂的浓度对冷冻干燥速率的影响较大，浓度越高冻干速率越慢，反之浓度越低，冻干的速率越快。晶体大小预冻时形成的晶体大小在很大程度上影响冻干的速率和冻干后产品的溶解速度。速冻和慢冻过程有以下区别：速冻产生的冰晶较小，慢冻产生的冰晶较大。大的冰晶有利于升华，小的冰晶不利于升华，快速冻结会导致升华速率低，解析速率快 慢速冻结导致升华速率快，解析速率慢。样品量多少样品在冻干时，分装到容器中后存在一定的表面积与物质厚度比，即冻干与样品量有关。表面积大、厚度小有利于水分升华，容易冻干且质量理想。干燥时，单位面积料盘上被干燥的装载量是决定干燥时间的重要因素：一般情况下，物料堆积的厚度越薄，传热和传质速度越快，干燥时间越短。但是，物料越薄则单位冻干面积上每批次干燥的样品少，对提高单位冻干面积和单位时间产量不利。

p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(31, 73, 125) " strong Eppendorf 5910 R 台式高速多功能冷冻离心机 /strong /span /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/dc0472e5-ebea-4277-ac39-9623c4dd51a1.jpg" title=" Centrifuge-5910-R.png" / /p p 　　型号：5910 R /p p 　　品牌： Eppendorf /p p 　　供应商报价： 面议 /p p 　　参考报价： 13万-18万 (备注：实际价格11万-17万间) /p p 　　样本： 暂无 /p p 　　产地：德国 /p p 　　5910 R 台式高速多功能冷冻离心机 核心参数 /p p 　　最大离心力 22,132 x g /p p 　　典型配置 水平转子离心机 /p p 　　仪器功能 冷冻离心机 /p p 　　仪器种类 台式离心机 /p p 　　产地类别 进口 /p p 　　离心等级 生物大分子 /p p 　　尺寸 770x660x370 mm /p p 　　最大转速 14,000 rpm /p p 　　最大容量 4*750 mL /p p 　　特征参数 高速离心机 /p p 　　全新 5910 R 台式高速冷冻离心机离心容量高达 4 × 750 mL，新型水平转子可实现离心管、离心瓶及工作板的离心—无需更换转子吊篮和适配器。 /p p 　　本款离心机在实现高通量和高性能的同时，还兼具精致小巧的外观和人体工程学的操作。采用备受欢迎的 5920 R 高速冷冻离心机的现代化用户操作界面和高级温控管理系统，为您带来全新体验。 /p p 　　 strong span style=" color: rgb(31, 73, 125) " S-4x通用水平转子 /span /strong /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/3bb1f303-104f-42f9-a8e7-c57d5e8cf59c.jpg" title=" Rotor-S-4xUniversal_conicals-50+DWP.jpg" / /p p 　　S-4 x 通用水平转子具有出色的多用途性--一个吊篮，可实现离心管、离心瓶和工作板的离心。 /p p 　　& gt “三合一”组合适配器：一个适配器，可离心 50 mL 锥底管、250 mL 平底瓶、175-225 mL 锥底瓶和 96/384 孔微孔板 /p p 　　& gt “二合一”组合适配器：一个适配器，可离心 5 mL、15 mL 和工作板 /p p 　　 strong span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 优势： /span /strong /p p 　　通用转子、通用吊篮与适配器，节省更换的时间，提升效率，且可选择QuickLock 气密性吊篮盖，方便操作。 /p p 　　& gt 节约时间：无需更换吊篮与适配器 /p p 　　& gt 节省成本：组合适配器，节约购买多种适配器的选择 /p p 　　& gt 节省空间：无需额外的空间保存不同的吊篮 /p p 　　简便而智能的操作系统 /p p 　　5910 R 离心机操作系统功能强大 /p p 　　& gt 菜单操作式系统提供多语言选择，大型背光显示屏 /p p 　　& gt 可储存多达99个用户自定义程序 /p p 　　& gt 5个快捷程序按键，快速运行常用程序 /p p 　　& gt FastTemp pro 自动快速制冷编程功能，在预定的时间和日期自动快速制冷 /p p 　　产品特性 /p p 　　& gt 水平吊篮和多种适配器选择，适用于 0.2 mL 至 750 mL 离心管和试剂瓶 /p p 　　& gt 工作板转子可离心各类 MTP 微孔板、PCR 板、细胞培养板和深孔板 /p p 　　& gt 固定角转适用于高离心力分子生物学应用，可离心 0.2 mL 至 50 mL 离心管 /p p 　　& gt 最大相对离心力 22,132 × g(14,000 rpm) /p p 　　& gt Eppendorf QuickLock& reg 气密性快速锁定转子盖和吊篮盖，便于快速操作 /p p 　　& gt 轻轻一按即可关闭离心机盖 /p p 　　& gt 静音操作，提供舒适的实验室环境 /p p 　　& gt 占地面积小，节省了宝贵的实验室空间 /p p 　　& gt 转子自动识别和失衡检测，确保离心安全 /p p 　　& gt 温控范围：-11 ° C 至 40 ° C /p p 　　& gt FastTemp 快速制冷功能 /p p 　　& gt FastTemp pro& reg 快速制冷编程功能，可以预先设定制冷时间和日期 /p p 　　& gt 持续制冷功能，在离心结束后，仍维持设定温度 - 保护您的样品 /p p 　　& gt ECO 自动待机功能，8 小时(可调节)无使用后自动停止压缩机工作，节约能耗，延长压缩机使用寿命 /p p 　　& gt 动态压缩机控制技术(DCC)，优化制冷性能 /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 0, 0) " strong 相关资料 /strong /span /p p style=" line-height: 16px " img src=" /admincms/ueditor1/dialogs/attachment/fileTypeImages/icon_pdf.gif" / a href=" http://img1.17img.cn/17img/files/201808/ueattachment/6dc08415-2e69-4ce5-a633-92170d4f8386.pdf" 5910 R 台式高速多功能冷冻离心机.pdf /a /p

p 　　蛋白酶体是细胞中发现和降解不需要或者受损蛋白的分子机器。这些需要被降解的蛋白会被标上特殊的标签，然后蛋白酶体上一个由6个亚基组成的“机械手”依靠ATP提供的能量，将需要降解的蛋白“抓”到蛋白酶体的降解室中。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/8fab9fd2-0c33-4660-89ee-41c68e895067.jpg" title=" 冷冻电镜.png" alt=" 冷冻电镜.png" / /p p style=" text-indent: 2em " 美国斯克里普斯研究所(The Scripps Research Institute)的研究人员使用冷冻电镜技术，解析了这一“机械手”与需要降解的蛋白相结合时的结构。这项研究揭示了这一“机械手”的6个亚基如何利用ATP水解的能量，改变自身构象，将需要降解的蛋白装入蛋白酶体的过程。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201812/uepic/6c510877-c48f-4cb9-a059-6e0d883903da.jpg" title=" 冷冻电镜 FEI Titan Kiros 300kV .jpg" alt=" 冷冻电镜 FEI Titan Kiros 300kV .jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(127, 127, 127) " FEI& nbsp Titan& nbsp Kiros& nbsp 300kV& nbsp 冷冻电镜（示例图） /span /p

面向原位结构解析的冷冻电子断层成像（cryo-ET）是研究生物大分子复合物的原位高分辨率结构及其相互作用关系的关键技术。但受限于电子束穿透能力，需要先利用聚焦离子束（cryo-FIB）将细胞和组织样品减薄成200纳米左右的薄片后才能进行cryo-ET数据采集。冷冻光电关联成像技术可以为cryo-FIB精准制备包含特定目标结构的冷冻含水切片提供荧光定位指导，但是冷冻荧光显微镜的光学分辨能力以及光镜、电镜图像的对齐精度是制约冷冻光电关联实验成功率的关键因素。　　为了解决上述技术瓶颈，中国科学院生物物理研究所蛋白质科学研究平台生物成像中心一直致力于开发新型冷冻光电关联成像技术，在前期自主研发的冷冻光电关联成像高真空光学冷台HOPE（Journal of Structural Biology，2017）基础上，通过引入结构光照明成像技术，成功研制了冷冻结构光照明成像系统HOPE-SIM，实现了横向优于200纳米的光学分辨率，以及优于150纳米的光镜-聚焦离子束三维关联对齐精度，相关研究成果于4月29日在线发表在《通讯-生物》（Communications Biology）上。 　　光镜-电镜关联成像技术（Correlative Light and Electron Microscopy，CLEM），是利用荧光特异标记对特定生物大分子或亚细胞结构进行荧光示踪，实现对整个细胞的三维荧光定位成像，之后通过荧光图像和电镜图像的配准，获得荧光标记信号和电镜超微结构的关联信息。冷冻光电关联成像技术的应用方向之一，是通过关联图像，指示出荧光标记的结构在电镜图像中的具体位置，实现对荧光示踪目标物的电镜高分辨率结构解析。而得益于光镜成像对生物样品的无损特性，可以在不损伤样品的前提下获得样品内部的三维荧光定位信息，再通过光电关联成像流程和关联对齐软件，将三维荧光图像与扫描电镜图像关联匹配，实现在荧光信号的指导下进行cryo-FIB对目标区域的减薄加工。如此，便可以避免“盲切”，实现对荧光指示目标物的指导切割，以期提高冷冻聚焦离子束技术用于电子断层成像切片样品制备的效率。 　　目前，光电关联成像指导cryo-FIB减薄技术流程的实现方式有多种类型，根据系统构成可以分为光镜电镜分体式光电关联成像系统和集成型光电关联成像系统。生物成像中心技术团队自2013年开始专注于冷冻光电关联成像技术方法学研究，在光镜电镜分体式光电关联成像系统研制方面， 于2017年自主研制了一款可搭载在倒置荧光显微镜上的高真空光学冷台HOPE（High-vacuum Optical Platform for cryo-CLEM），HOPE可与透射电镜冷冻样品杆适配连接，完成荧光定位后样品将随冷冻样品杆被转移进电镜当中进行高分辨率数据采集，同时结合光电关联定位软件，可以实现大视野光学定位成像与电镜成像的匹配。HOPE采用冷冻样品杆来实现冷冻光镜成像、冷冻传输以及冷冻透射电镜成像，有效避免了光电关联成像过程中对冷冻载网的反复夹取，保证了冷冻样品的完整性和同一性，有效提高了关联成功率和实验效率。　　然而，基于宽场成像技术的HOPE系统受限于光学衍射极限和冷冻光学成像装置的空间限制等，仅能使用长工作距离、低数值孔径的冷冻荧光成像系统，所能达到的横向分辨率约为400-500纳米，纵向分辨率则达微米级，这对于精准捕获数微米厚度细胞内百纳米尺度的目标结构而言，是非常不利的。　　结构光照明超分辨荧光成像技术在能提高宽场荧光显微镜一倍分辨率的前提下，还具备不需要特殊的荧光探针、成像速度快、辐照密度低等技术优势，是所有超分辨成像技术中最适合应用到冷冻环境中对冷冻样品进行高分辨率成像的技术。因此，研究团队选择了结构光照明成像技术作为提高冷冻荧光成像分辨率的手段，基于倒置荧光显微镜自主研制了大腔室高真空冷台，腔室内置0.9NA长工作距离光学物镜和防污染器系统（ACS和cryo-box）、外接真空传输系统（TPS）以及冷冻电镜样品杆（cryo-holder）适配器。同时，借助三维结构光照明（SIM）光路，实现了真空环境下对冷冻样品的三维结构光照明成像，在提高冷冻光镜分辨率的同时，有效增强了光电关联成像样品传输过程中对冷冻样品的保护。图1 冷冻结构光照明成像系统HOPE-SIM。a.HOPE-SIM硬件组成，b. HOPE-SIM设计原理图，c. HOPE-SIM光路原理图 　　借助HOPE-SIM高分辨率冷冻光电关联成像系统以及自主编写的三维关联对齐软件3D-View，团队成功制备了包含宿主细胞内鼠疱疹病毒（图2）和海拉细胞内荧光标记的中心体（图3）的细胞切片样品，通过冷冻电子断层原位结构分析图像处理流程和软件分析其在原位结构。实验结果表明，基于HOPE-SIM技术的高精度冷冻光电方法可以实现优于150nm的三维对齐精度，为尺寸较大、胞内丰度高的目标物的原位捕获提供了一种高效、精确的靶向冷冻聚焦离子束减薄技术方案。图2 基于 HOPE-SIM冷冻光电联技术捕获宿主细胞中的MHV-68病毒颗粒。a.冷冻明场透射光图像；b.HOPE-SIM荧光图像的z投影。绿色，荧光微球。红色，MHV-68病毒；c将b中的荧光图像与a中的明场图像合并，以显示目标信号的位置；d.冷冻SIM和冷冻FIB图像之间的三维关联匹配；e.对目标区域减薄后的冷冻FIB图像；f.减薄后冷冻扫描电镜图像，与b中冷冻SIM图像的融合；g.制备的冷冻含水切片的冷冻透射电镜显微照片（3600倍）；h.冷冻断层扫描成像，放大倍率为64000倍，显示了被捕获的病毒颗粒。 图3 基于HOPE-SIM技术流程精准捕获海拉细胞内红色荧光标记的中心体。a.3D-View光-电关联软件获得的冷冻结构光-cryo-FIB关联配准图；b.cryo-FIB对红色荧光标记所在区域进行减薄；c.cryo-FIB减薄获得的200nm冷冻含水切片；d.冷冻含水切片在透射电镜下8700倍成像，黄色框线内为目标中心体；e.目标中心体的cryo-ET数据采集（53000倍）激光指向位置主动稳定系统示意图。 　　相关研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、中科院战略性先导科技专项（B类）等项目的资助。　　值得一提的是，在集成型光电关联成像系统研制方面， 2023年1月，《自然-方法》（Nature Methods）报道了中科院院士、生物物理所研究员徐涛和研究员纪伟团队研发的cryo-CLIEM系统和生物成像中心技术团队自主研发的三束共焦成像系统ELI-TriScope系统，在双束扫描电镜真空腔室内集成了光学成像系统，避免了样品传输过程，有效提高了冷冻光电关联成像的精度和成功率。其中生物成像中心技术团队自主研发ELI-TriScope系统集成了一个基于冷冻样品杆的传输系统（cryo-transfer system），并在冷冻样品下方嵌入了一个倒置荧光成像系统（cryo-STAR system），从而实现电子束(E)、光束(L)和离子束(I)被精确地聚焦到同一点上，可以在cryo-FIB减薄的同时实时监控目标分子的荧光信号，显著提高了cryo-FIB减薄技术对特定目标物的捕获精度，将制备冷冻含水切片的时间成本从每片2-2.5小时降低到约0.8小时。 　　生物成像中心技术团队研发的基于结构光照明技术的HOPE-SIM系统可以实现三维高分辨率冷冻荧光成像，同时还可以通过冷冻样品杆直接衔接三束共焦光电关联成像系统ELI-TriScope，实现高分辨三维冷冻荧光成像的同时，完成后续原位荧光实时监控聚焦离子束减薄全技术流程，有效提高了冷冻聚焦离子束减薄的效率、准确性、成功率和样品制备通量，为原位结构解析研究提供了成功的解决方案，在未来的原位结构生物学中有巨大应用潜力。

蛋白质降解调控是极其重要的基本生物化学过程，在细胞周期、信号转导、免疫响应、基因调控、新陈代谢、神经退行、癌症肿瘤、病毒感染以及蛋白毒性响应等主要细胞分子过程中发挥关键调控作用。在真核细胞中，绝大部分胞内蛋白都是通过泛素蛋白酶体途径（Ubiquitin-proteasome pathway），经过泛素化标记被蛋白酶体全酶降解的。2004年，Aaron Ciechanover, Irwin Rose和Avram Hershko三位科学家被授予了诺贝尔化学奖，以表彰他们对该泛素化通路介导蛋白质降解的历史性发现。蛋白酶体全酶，又称为26S proteasome，是由中间一个圆柱形20S核心颗粒和两端覆盖的一个或两个19S调节颗粒组成。19S包含一个环形异源六聚体马达——AAA-ATPase，通过多个协同ATP水解模式调控蛋白酶体降解泛素化底物。蛋白酶体功能紊乱与人体多种疾病相关，如癌症、神经退行性疾病和免疫疾病等。蛋白酶体是美国FDA批准的多种治疗癌症的上市小分子药物的直接靶标。在正常细胞中，蛋白酶体的功能受到多个水平的严格调控。去泛素化酶USP14是最主要的蛋白酶体调控分子，被认为是一个潜力巨大的治疗癌症和神经退行性疾病的重要靶标，其小分子抑制剂曾进入过美国一期临床研究，但围绕USP14功能机制的一系列悬而未决的关键问题极大限制了其靶向药物分子的开发和临床应用。USP14通过结合26S而被激活，然后以毫秒的时间尺度剪切底物上的泛素链。它是如何被蛋白酶体激活并调控蛋白酶体功能的，一直是全球研究机构和生物制药领域期待解决的关键科学问题。生命分子机器通过高度复杂的非平衡动力学过程和结构变化来实现其特殊功能，这一过程进而受到各种复杂分子间相互作用的精准调控。如何在原子水平直接观察天然态超大分子机器的功能态动力学过程，给现有的原子结构动态分析技术提出了空前挑战。毛有东教授实验室长期致力于发展基于冷冻电镜的动力学重建方法，围绕蛋白酶体、炎症小体等具有重大临床应用前景的靶点系统的结构功能、动力学机制和靶向调控分子设计深入开展前沿交叉研究——2016年报道了人源蛋白酶体基态的3.6 Å冷冻电镜结构及其他三个亚纳米分辨构象，并首次发现一个亚稳态构象的核心颗粒物转运通道处于开放状态（PNAS 2016 113: 12991-12996）。2017年，利用冷冻电镜解析高分辨率蛋白酶体19S调控复合体在结合组装伴侣p28的自由态的三维结构，阐释了组装伴侣蛋白Gankyrin/p28在蛋白酶体组装过程中构象选择的组装机理（Molecular Cell 2017 67: 322-333）。2018年4月，报道了6个ATPγS结合状态下的26S蛋白酶体动态结构，包括三个核心颗粒复合物开放态对应的亚稳简并态近原子分辨（4~5 Å）结构（Nature Communications 2018, 9: 1360）。2018年11月，在Nature首次报道了人源蛋白酶体26S在降解底物过程中的七种中间态构象的高分辨（2.8~3.6埃）结构，在原子水平呈现了蛋白酶体和底物相互作用的动态过程，首次实现了对AAA-ATPase六聚马达分子内ATP水解全周循环的完整过程的原子水平观测（Nature 2019 565:49-55）。这一系列工作揭示了蛋白酶体的原子架构、组装原理和降解泛素化底物的动力学基本规律。图1. (A) USP14调控下蛋白酶体复合体降解多泛素化底物的原子结构模型之一。(B) 时间分辨率冷冻电镜解析13种中间态的统计分布随蛋白质降解进程的时间演化。（Youdong Mao, CC BY 4.0）本研究课题进行之初，首先要克服的问题就是“时间分辨”。蛋白酶体降解底物的过程是很快的，时间尺度在毫秒至秒之间。正常条件下，想要通过冷冻电镜技术捕获此过程的中间态结构，是非常困难的。所以，课题组首先要让这个过程慢下来。通过大量的条件摸索，重建反应动力学体系和优化反应条件，包括优化缓冲体系、反应温度等条件，课题组优化出较为可行的实验方案，从而使得时间分辨冷冻电镜技术应用成为可能，最终获得了含时的45,193张USP14-26S复合体降解泛素底物过程中的冷冻电镜透射图样，挑取了3,556,806个USP14-26S-泛素底物复合体的颗粒图像。接下来面临的极端挑战就是“三维分类”，冷冻电镜捕获的复合体图像需要经过一系列的分类，将它们归为不同的构象类别，才能呈现出蛋白反应的动态过程。USP14结合到26S蛋白酶体后，使得降解底物的动力学过程更加复杂，想要在如此多的异构复合体颗粒图像中，鉴别出降解过程的各个时态的高分辨率非平衡构象，传统的三维分类方法是无法实现的。低精度的三维分类将导致低分辩的三维重建，从而无法获取原子水平的动力学信息，无法对含时的数据赋予自洽的动态变化的物理意义。课题组结合经过数年自主开发的新型深度学习高精度三维分类和四维重建方法，捕获了USP14-26S复合体降解多泛素化底物过程的13种不同功能中间状态的高分辨率（3.0~3.6埃）非平衡构象，通过时间分辨冷冻电镜分析，重建了受控蛋白酶体的完整动力学工作周期，并结合分子生物学功能和基因突变研究，阐明了USP14和26S相互调控活性的原子结构基础和非平衡动力学机制。研究发现USP14的活化同时依赖于泛素识别和蛋白酶体RPT1亚基的结合。出人意料的是，USP14通过别构效应，诱导蛋白酶体同时沿着两条并行状态转变路径发生构象变化；课题组成功捕获到了底物降解中间状态向底物抑制中间状态的瞬时转化。在底物降解途径中，USP14活化变构地重编程AAA-ATP酶马达的构象景观（Conformational landscape）和统计分布，并刺激20S底物通道的打开，从而观察到底物持续转运过程的ATPase六聚马达非对称ATP水解和近乎完整的全周循环周期。USP14-ATPase的动态相互作用，使得ATPase马达底物识别与26S自身的去泛素化酶RPN11催化发生去耦合效应，并在26S的泛素识别、底物的起始易位和泛素链回收过程中引入三个调控检查点（动力学分岔点）。这些发现为USP14调节26S的完整功能周期提供了全新的高分辨见解，并为USP14靶向药物治疗发现奠定了极为重要的机制基础。图2. 通过时间分辨冷冻电镜分析获取的USP14调控蛋白酶体底物降解的并行路径模型。（Youdong Mao, CC BY 4.0）Nature同期在线发表了题为“Control of human protein-degradation machinery revealed”的Research Briefing专栏推介文章，发表了审稿人和Nature编辑团队的官方点评，其中审稿人评价“该工作是一项重大研究，终于在原子水平解决了USP14活化和其调控蛋白酶体功能的机制问题”，Nature编辑团队指出“这一工作通过时间分辨冷冻电镜，结合功能分析，… … ，呈现了蛋白质降解过程中USP14和蛋白酶体的构象连续体”。这是首次将人工智能四维重建技术用于提升时间分辨冷冻电镜分析精度，针对重大疾病靶蛋白复合体，实现原子水平功能动力学观测的国际领先原创成果，展示了一类新型的蛋白质复合动力学研究范式。课题组博士后张书文与2019级博士生邹士涛为论文共同第一作者，毛有东教授为通讯作者。该论文的全部冷冻电镜数据在北大电子显微镜实验室和冷冻电镜平台上完成采集，大部分数据分析工作在北大高性能计算平台上完成。这项工作得到了北京市自然科学基金委员会重点专项、国家自然科学基金面上项目、国家杰出青年科学基金、国家重点实验室和北大-清华生命科学联合中心的支持。相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41586-022-04671-8Nature Research Briefing官方点评：https://doi.org/10.1038/d41586-022-01144-w

骨头、塑料、生物、植物，这些商检、质检、高校等检测机构最常见样品您处理好了吗？处理后您的样品变性了吗？前处理的结果满足后续检测的需要了吗？您想让处理过程更简单吗？ 您希望一款仪器能一次解决以上所有问题，并能让样品前处理的过程更简单更安全吗？ 答案就是2009年RETSCH推出的新型研磨仪——全自动冷冻研磨仪cyomill。 她能轻易为您处理各类软性及中硬性材料的样品，特别对于塑料等热敏性材料，与cryomill更是绝佳的搭档。因为cryomill有专为冷冻研磨设置的一套智能系统！ 全自动冷冻研磨仪cryomill 现代化的设计外形让人眼前一亮：一个研磨平台，一个平衡平台；特殊接口与液氮罐相连；透明保护盖，可视研磨过程；图形显示菜单，令操作更简单，研磨程序尽在掌握之中。 利用高速撞击的球磨原理对样品进行粉碎，振动频率最大可达25HZ，能量大，可在极短的时间得到极高细度的样品，结果还可用于光谱分析样品制备。并且研磨过程始终处在-196℃液氮中，保证样品绝不变性。 突破样品前处理史上最先进的技术，cryomill可以设置程序，控制整个研磨过程，根据样品的性质及数量你可以设置预冷却时间、研磨频率和研磨时间、冷冻研磨循环次数等。仪器运行时，您只通过图形显示的面板就可以知道研磨所处的阶段，所以在整个研磨过程中你都无需与液氮接触，避免了手动操作的繁琐和危险。 每一个细节，cryomill都为您设想周全：智能系统可以储存9组参数，简化了您的实验室工作；配套液氮罐autofill自动进气功能；多种研磨配件可供选择，根据您的实际需要可以选择25ml、35ml、50ml研磨罐，选用适配器使用4个5ml 的研磨罐。 以韧性的多糖为例，使用全自动冷冻研磨仪cryomill将多糖冷冻2分钟，研磨1分钟，设置3个循环，研磨结果小于100um。 研磨前后的多糖对比 除了低温冷冻研磨之外，cryomill依然可以进行常温的干磨和湿磨，例如对纺织品、PCB板、土壤、矿石等软性、中硬性和硬性样品都能达到要求的粉碎细度。 金属矿样用cryomill常温研磨5分钟，出样尺寸小于150um。 研磨前后的矿石对比 如此智能又方便的仪器您怎能错过，记住RETSCH,记住全自动冷冻研磨仪cryomill——低温粉碎技术的新里程碑。 为让RETSCH的产品帮助到更多的实验室人员，RETSCH在推出的新品的同时举办全球客户回馈活动——”WE R PREPARED”, 登录www.retsch.cn 参与答题您就有机会参加RETSCH全球旅行，选择拉斯维加斯冒险之旅或者瑞典冰雕旅馆的非凡体验，或者直接赢取现金5000.00欧元！ 关注RETSCH, 关注2009！

2016年6月24日上午，由北京博医康举办的“2016冷冻干燥技术华东区域研讨会”在上海举行。作为国内冻干机生产制造行业的代表企业，由博医康举办的此次研讨活动，也吸引了很多华东区域的冻干技术科研人员、冻干机用户及经销商参与。 本次研讨会的主题，包含了“冻干原理及冻干工艺、制品冻干效果分析、科学设计新样品的冻干配方，中试向生产型工艺放大，中外厂商品牌介绍及冻干设备选型指导”等几大内容。颇为丰富的研讨内容，也吸引了包括上海交通大学、第二军医大学、齐鲁制药、上海医药集团等多家研究机构和企业的相关人员的参与。 会上，作为主讲人，北京博医康副总经理叶明徽先生，和与会者进行了现场的分享和交流探讨。近十年来，叶明徽先生一直从事冻干工艺研究领域的工作，并先后为多家研究院及制药企业设计和开发过冻干配方，长期的一线工作过程中，让他积累了丰富的冻干研发经验。因此，通过本次研讨会，也让众多与会者感觉对日后的工作研究有大帮助。 据悉，本次研讨会是继博医康北京研讨会之后，再次举办的专业技术研讨活动。通过举办此类活动，博医康不仅加强了与广大冻干用户的联系，促进了相互之间的交流和了解。同时，也对冷冻干燥这一具备诸多优势的干燥技术的普及应用起到了很大推动作用。