做微生物检验时,平板放在培养箱中培养时,为什么要倒置?培养基
用到平板培养基抑菌圈的实验有哪些?
实验室工作7年了,很多人问我怎要才可以把实验做好,做得漂亮。对于这个问题,我再看看到很多做事毛糙,手忙搅乱的师弟师妹时,只能笑而不语。生物实验不是化学实验,很少会爆炸,真的没必要慌乱,和很多工作一样,需要用“心”去做。 不说废话,回归正传。今天谈谈“含抗生素平板培养基的配制窍门”。当然,对于很多做这个实验做得炉火纯青的同行,实在没必要看下去了。下面写的只是供那些在这个环节不太了解的朋友看。 基本步骤如下: A.琼脂、蛋白粉、无机盐、…..去离子水….等等,混匀,溶解,具体成分看你培养神马菌了; B. 120度,高压灭菌; C. 加抗生素,加神马抗生素,看你要筛选神马菌,氨苄青霉素?链霉素?潮霉素B? D. 倒平板。 别以为这个大家都会。讲一个真实故事给大家听,以前有一个做实验也是蛮拼的同学,要做含青霉素的筛选平板培养基,他一次不成功,就做第二次,但是还是不成功,一直做了2个月还是不成功。。。他的科研热情实在值得学习,只是财力不是很雄厚的老板实在伤不起。我们好奇,怀疑他没加青霉素,就问他加了没,他回答时也很有底气,自信地告诉我们,加了,加了不少------可惜都是在高温灭菌前加的!如此高温,哪家的抗生素不分解啊? 在这里,我想强调的是,加抗生素,除了要选择时,还要择温度!加抗生素必须在灭菌之后加,加的时候一定要等琼脂培养基凉下来再加。温度降到什么时候为宜呢?就是45~50度的范围。当然,有些牛人,靠手摸,感觉不烫,就刚好是45~50度。作为搞科研的,我不推荐用这种方法。我推荐大家用恒温循环水浴。建议不要用国产的水浴,因为隔壁实验室发生过漏电事件……我用过几个进口品牌,发现德国IKA的恒温水浴最好,安全,精准,好用。可惜当时递交采购单时太草率,就选了一个基本型的ICC恒温水浴。五楼的小黄老师有钱就这么任性,挑了个IKA控制型,可以远远的无线控制~~听说无线控制距离可达10米~~~ 45~50度是一个很合适的温度,一方面可以保持抗生素的活性,另一方面,琼脂在这个时候不凝。轻轻晃动几下培养基,让抗生素混匀,切忌不要使劲,否则起了起泡就很难看了。后续,只要小心的把培养基倒到培养皿上,于是高质量的含抗生素的培养基就做好了~
以前初学微生物检测时师傅教俺说倒完培养基后平板左三圈右三圈使培养基跟样液混匀但前段时间在一标准上说混匀时只能朝一个方向各位平时是咋弄的呀?
1 外观控制制备好的培养基应有相应的颜色,一般的培养基应澄清、无浑浊、无沉淀。使用前应检查培养基的颜色是否发生变化,是否蒸发/脱水。2 污染控制 从每批制备好的培养基中选取部分进行污染测试(无菌试验),确定无微生物生长方可使用。3 性能测试3.1 测试菌株选择测试菌株是具有其代表种的稳定特性并能有效证明实验室特定培养基最佳性能的一套菌株,应来自国际/国家标准菌种保藏中心ATCC标准菌株,菌株的选择参考卫生行业标准WS/T232-2002《商业性微生物培养基质量检验规程》。3.2 定量测试方法改良Miles-Misra法测试菌株过夜培养物10倍递增稀释;测试平板和参照平板划分为4个区域并标记;从最高稀释度开始,分别滴一滴稀释液于试验平板和对照平板标记好的区域;将稀释液涂满整个1/4区域,37℃培养18小时;对易计数的区域计数,按公式计算生长率(生长率=待测培养基平板上得到的菌落总数/参考培养基平板上获得的菌落总数)。非选择性培养基上目标菌的生长率应不低于0.7,该类培养基应易于目标菌生长;选择性培养基上目标菌的生长率应不低于0.1。3.3 半定量测试方法 改进的划线法接种法平板分ABCD四区,共划16条线,平行线大概相隔0.5cm,每条有菌落生长的划线记作1分,每个仅一半的线有菌落生长记作0.5分,没有菌落生长或生长量少于划线的一半记作0分,分数加起来得到生长指数G。目标菌在培养基上应呈现典型的生长,而非目标菌的生长应部分或完全被抑制, 目标菌的生长指数G大于6时,培养基可接受。3.4 定性测试方法平板接种观察法用接种环取测试菌培养物,在测试培养基表面划平行直线。按标准中规定的培养时间和温度对接种后的平板进行培养, 目标菌应呈现良好生长,并有典型的菌落外观、大小和形态,非目标菌应是微弱生长或无生长。
单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体,称为菌落(colony)。当固体培养基表面众多菌落连成一片时,便成为菌苔(lawn)。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征,可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落,采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板,即培养平板(culture plate)的简称,它是指固体培养基倒入无菌平皿,冷却凝固后,盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基,每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落,形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行,100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。 1. 稀释倒平板法(pour plate method) 先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释(如1:10、1:100、1:1,000、1:10,000......),然后分别取不同稀释液少许,与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合,摇匀后,倾入灭过菌的培养皿中,待琼脂凝固后,制成可能含菌的琼脂平板,保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当,在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落,这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落,或重复以上操作数次,便可得到纯培养。 2. 涂布平板法(spread plate method) 由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡,而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长,因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿,制成无菌平板,冷却凝固后,将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面,再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面,经培养后挑取单个菌落。 3. 平板划线法(streak plate method) 用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料,在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线,微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少,并逐步分散开来,如果划线适宜的话,微生物能一一分散,经培养后,可在平板表面得到单菌落。 4. 稀释摇管法(dilution shake culture method) 用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中不立即死亡,可以采用通常的方法制备平板,然后置放在封闭的容器中培养,容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物,纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行,它是稀释倒平板法的一种变通形式* 。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右,将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释,试管迅速摇动均匀,冷凝后,在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物,将培养基和空气隔开。培养后,菌落形成在琼脂柱的中间。进行单菌落的挑取和移植,需先用一只灭菌针将液体石蜡--石蜡盖取出,再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间,吹入无菌无氧气体,将琼脂柱吸出,置放在培养皿中,用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。
不知道现在的培养温度是多少来着?貌似我用36度很容易出现培养基被蒸干失水的情况!郁闷死!培养基用量应该在15-20mL之间,因为200mL只倒了12个平板。
最近因培养箱坏,换了一个生产厂家及型号相同的培养箱,但出现了平板培养基表面失水干燥,并有开裂现象,甚至出现了培养基完全失水干燥,无法长菌和读数的现象。现求助各位同仁,找出原因,在下万分感激!!
1、 1、血琼脂平板:适用于各类细菌的生长,一般细菌检验标本的分离都应接种到血平板上。其中肉浸液琼脂中加兔血(对嗜血杆菌生长更好)或羊血均可。用血量为5%--7%.在血平板上除可以观察菌落的形态外,还可判断溶血情况,菌落周围的培养基内红细胞完全破坏为β-溶血环,菌落周围呈绿色为α-溶血。2、巧克力平板:该平板是用马血、羊血或兔血制备,因其含有X和V因子,嗜血杆菌、奈瑟菌等生长良好,血液标本培养增菌后有细菌生长,若移种该平板上有利于分离出更多的细菌。3、中国蓝平板或伊红美兰平板:可抑制革兰氏阳性细菌,是较好的弱选择性培养基,有选择性促进革兰氏阴性菌生长。发酵型革兰氏阴性杆菌因分解乳糖能力不同,在此种平板上的菌落颜色不同,便于鉴别菌种。该培养基不含胆盐,与SS平板配对用于大便中志贺氏菌和沙门氏菌的分离培养最为理想。4、麦康凯平板:该培养基中含有胆盐,为中等程度选择性,抑菌力略强,有少数阴性菌不生长。在麦康凯平板能否生长是非发酵菌鉴定的一个依据,如果用麦康凯平板作为原始标本分离的培养基时,应注意观察该标本在血平板上的细菌分离情况,以免遗漏部分被抑制生长细菌。5、SS平板:因含胆盐较高,有较强的抑菌力,用于志贺氏菌和沙门氏菌的分离培养。在目前商品培养基中,不同厂家的产品抑菌力不同,使用时应注意,选择性过强可影响检出率,所以最好是加上一种弱选择性平板同时培养。6、碱性琼脂或TCBS或庆大霉素琼脂或4号琼脂:用于分离培养霍乱弧菌及其他弧菌。选择其中1-2种作为常规检验用就行了,这几种培养基对肠道非致病菌的抑制力各不相同,使用时应有所了解。7、M-H琼脂平板(水解酪蛋白琼脂):专用于抗菌药物敏感试验。8、营养琼脂平板:用于纯化菌种和保存菌种,以及卫生细菌学方面的细菌总数测定培养基。9、营养肉汤:用于标本及各类细菌的增菌。10、TTC沙氏培养基:(氯化三苯四氮唑培养基)用于检测酵母菌和酵母样真菌分离。11、Cary-Blair运送培养基:用于空肠弯曲杆菌、霍乱弧菌、沙门氏菌和志贺氏菌的保存运送培养基,但在该采样管中的标本只能保存72小时。12、S.F培菌液(亚硒酸盐培菌液):用于肠道致病菌的增菌培养。注意该培养基灭菌后PH为7.1,有棕黄色沉淀物出现,不宜高压蒸汽灭菌,增菌培养时标本约占培养液体积的10%,培养时间不超过24小时,此培养基储存时不超过两个星期。
用于菌数计数的半固体琼脂培养基促菌生长(灵敏度)检查的方法:对每个不同批号的脱水培养基均应进行灵敏度检查(促菌生长检查)。取预先制备好的琼脂培养基平皿3~5个,用表面涂布法每块平板表面接种30~100个试验菌,同时用已知质量保证的同型号培养基平皿3~5个(如较著名的如MERCK,DIFICOL,青岛海博产品)做对照试验,待培养基表面的菌液被琼脂培养基吸干或风干后,将培养皿倒置于培养箱的使用温度下培养48~72小时,(也可采用浇碟法进行)取出培养后的平皿点计菌落数。样品培养基上的微生物数量应不得低于对照培养基上微生物生长数量的70%。否则,需重新检查,或该培养基被视为不符合促生长要求。
1.配制溶液 向容器内加入所需水量的一部分,按照培养基的配方,称取各种原料,依次加入使其溶解,最后补足所需水分。对蛋白胨、肉膏等物质,需加热溶解,加热过程所蒸发的水分,应在全部原料溶解后加水补足。 配制固体培养基时,先将上述已配好的液体培养基煮沸,再将称好的琼脂加入,继续加热至完全融化。并不断搅拌,以免琼脂糊底烧焦。 2.调节pH值 用pH试纸(或pH电位计、氢离子浓度比色计)测试培养基的pH值,如不符合需要,可用10%HCl或10%NaOH进行调节,直到调节到配方要求的pH值为止。 3.过滤 用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好的培养基过滤。用纱布过滤时,最好折叠成六层,用滤纸过滤时,可将滤纸折叠成瓦棱形,铺在漏斗上过滤。 4.分装 已过滤的培养基应进行分装。如果要制作斜面培养基,须将培养基分装于试管中。如果要制作平板培养基或液体、半固体培养基,则须将培养基分装于锥形瓶内。 分装时,一手捏松弹簧夹,使培养基流出,另一只手握住几支试管或锥形瓶,依次接取培养基。分装时,注意不要使培养基粘附管口或瓶口,以免浸湿棉塞引起杂菌污染。 装入试管的培养基量,视试管和锥形瓶的大小及需要而定。一般制作斜面培养基时,每只15×150毫米的试管,约装3~4毫升(1/4~1/3试管高度),如制作深层培养基,每只20×220毫米的试管约装12~15毫升。每只锥形瓶装入的培养基,一般以其容积的一半为宜。 5.加棉塞 分装完毕后,需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是过滤空气,避免污染。棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作,不要用脱脂棉,以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用。制作棉塞时,要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度,揪取手掌心大小一块,铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中,用右手食指插入棉花中部,同时左手食指与姆指稍稍紧握,就会形成1个长棒形的棉塞。棉塞作成后,应迅速塞入管口或瓶口中,棉塞应紧贴内壁不留缝隙,以防空气中微生物沿皱折侵入。棉塞不要过紧过松,塞好后,以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的2/3应在管内或瓶内,上端露出少许棉花便于拔取。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札,准备灭菌。 6.制作斜面培养基和平板培养基 培养基灭菌后,如制作斜面培养基和平板培养基,须趁培养基未凝固时进行。 (1)制作斜面培养基。在实验台上放1支长0.5~1米左右的木条,厚度为1厘米左右。将试管头部枕在木条上,使管内培养基自然倾斜,凝固后即成斜面培养基。 (2)制作平板培养基。将刚刚灭过菌的盛有培养基的锥形瓶和培养皿放在实验台上,点燃酒精灯,右手托起锥形瓶瓶底,左手拔下棉塞,将瓶口在酒精灯上稍加灼烧,左手打开培养皿盖,右手迅速将培养基倒入培养皿中,每皿约倒入10毫升,以铺满皿底为度。铺放培养基后放置15分钟左右,待培养基凝固后,再5个培养皿一叠,倒置过来,平放在恒温箱里,24小时后检查,如培养基末长杂菌,即可用来培养微生物。
名称:培养基制备的标准操作程序(SOP)关键词:培养基制备 标准操作程序目的:如何使用成品培养基干粉制备各种合格的分离培养基。背景知识:选填项目原理:选填项目主体内容:操作步骤1.在玻璃容器中加入所需蒸馏水的二分之一量,然后放入一定量培养基干粉,补足水量,轻轻搅拌以促进溶解。2.校正pH:高压灭菌前可用pH计或精密pH试纸校正培养基的pH。3.分装:液体培养基一般在灭菌前分装,分装时应注意每管的分装量不应高于试管的2/3。琼脂平板是在培养基高压灭菌后冷至50-600C时再倾注平板。4.质量检查 无菌试验:将制好的培养基在350C孵育过夜,判定是否灭菌合格。 效果检验:按不同的培养要求,接种相应的菌种,观察细菌的发育、菌落形态、色素、溶血等特征,判断培养基是否符合要求。5.保存:液体培养基及琼脂平板须在40C保存,一般不超过7天,如用塑料袋密封至多保存2周。
[配法] 麦芽糖40g,蛋白胨10g,琼脂20g,蒸馏水1L。 (本培养基如不加入琼脂,即为沙保罗液体培养基) 将上述成分溶于水,加热溶解,调pH至6.0±0.2,分装三角瓶或试管中,118℃灭菌15min,倾注平板或置斜面,无菌试验后备用。注:⑴ 本培养基如不加入琼脂,即为沙保罗液体培养基,供真菌及念珠菌的增菌培养用。⑵ 增加氯霉素0.05~0.125mg/ml或放线菌酮0.5mg/ml,可抑制细菌和污染的霉菌及隐球菌生长。此二种药均耐热,可直接加入培养基内高压灭菌。⑶ 添加酵母浸膏5mg/ml,可促进皮肤癣菌生长。增加维生素B 0.1mg/ml,可促进紫色癣菌和断发癣菌生长。⑷ 将麦芽糖减少到20g/L,为沙保罗20g/L麦芽糖琼脂培养基,可供诱导真菌产生孢子用。⑸ 该培养基呈酸性,应提高20%的琼脂用量。
碱性琼脂 用于霍乱弧菌分离培养蛋白胨10g ,氯化钠5g,牛肉膏3g ,脂20g ,蒸馏水1L 。将前4 种成分混合于水中,加热溶解,校正pH 至8.4 ,分装后121℃ 灭菌15min ,倾注平板。凡急性患有水样便标本做增菌培养的同时,应直接取标本接种到碱性琼脂平板或亚碲酸钾琼脂平板上。置35 ℃ 培养12-16h ,观察结果。霍乱弧菌生长较快,菌落大而扁平,呈青灰色,半透明,光滑湿润。在亚碲酸钾琼脂上菌落呈灰黑色。 各实验室凡自配培养基或商品培养基,在使用前可用标准菌株生长对照,临床实验室可送防疫部门所设立的专门检验机构进行目的菌监测,质量可靠者方可使用。EL-Tor弧菌生长良好;大肠埃希菌ATCC25922 生长抑制。 置4℃ 冰箱,1 周内用完2 碱性胆盐琼脂 用于霍乱弧菌分离培养蛋白胨10g ,牛肉膏5g,氯化纳5 -10g ,琼脂20g,胆盐(牛、猪)2.5g,蒸馏水1L。 将上述成分称量混合于水中加热溶解,校正pH 至8.4 ,分装121 ℃ 灭菌15min ,倾注平板。取粪便标本或增菌培养物1 接种环接种平板,置35 ℃ 温箱培养16-18h 。霍乱弧菌迅速生长,其它细菌生长较缓慢。在16-18h 后,霍乱弧菌的菌落,直径可达2mm左右,呈扁平,青灰色,半透明,光滑湿润,易挑起。其它细菌菌落小而凸起,不透明,或有色素。同碱性琼脂置冰箱,1 周内用完。3 庆大霉素琼脂用于霍乱弧菌分离培养。 蛋白胨10g ,牛肉浸膏3g ,氯化钠g,构椽酸钠10g,无水亚硫酸钠3g ,蔗糖(或白糖)10g ,琼脂15-20g 庆大霉素、多粘菌素B “双抗液”2 ml,蒸馏水1L 。将上述成分(除“双抗液”外)称量混合于水中,加热溶解,校正pH 至8.4 ,分装灭菌121 ℃ 15 min ,待冷却至50 ℃ 后,每100ml内加“双抗液”0.2ml,另加5g / L 亚碲酸钾溶液0.1ml,再倾注平板。最后每毫升培养基内含有庆大霉素0.5U ,多粘菌素B6U 。将粪便标本或增菌培养物划线接种到该平板上,置35 ℃ 培养16-18h。 由于该培养基抑制性强,其它非弧菌科细菌被抑制,而霍乱弧菌生长迅速,16h 菌落可达2mm,菌落青灰色半透明,扁平,光滑湿润。若培养时间长,菌落略黄色、隆起,中心厚而不透明。霍乱弧菌(小川、稻叶)生长良好,培养18-24h 菌落直径2.5-3.0mm;大肠埃希菌和变形杆菌生长抑制。置4 ℃ 冰箱内,1 周内用完。注:(1)该培养基国内有商品出售,多数产品已加入庆大霉素,使用时,应详阅说明书。(2)“双抗液”配制:98ml 工灭菌蒸馏水中加庆大霉素(25 000U / ml)1ml,多粘菌B 或抗敌E ( 300 000U / ml)1ml4 ℃ 冰箱保存,1 月用完。4 四号琼脂用于霍乱弧菌分离培养 蛋白胨10g ,氯化钠5g,牛肉浸膏3g ,亚硫酸钠(无水)3g ,枸椽酸钠10g ,猪胆汁粉5g,十二烷硫酸钠20g,利凡诺(雷佛奴尔)3g ,琼脂粉12g ,庆大霉素亚碲酸钾混合液1ml,蒸馏水1L。将前8种成分放入玻璃或搪瓷容器内(严禁用铝制容器等金属容器),加入蒸馏水,加热溶解混合后,调整至pH8.0 ,然后按12%加入琼脂,煮沸至琼脂溶化后,冷至60 ℃ 左右,按每100ml琼脂加入庆大霉素亚碲酸钾混合液(1ml 40 000U 庆大霉素加79ml蒸馏水混合后,加入0.8g 亚碲酸钾溶解混合即成,每毫升含500U 庆大霉素和10g / L 亚碲酸钾)0.1ml,摇匀,倾注平板。 取待检标本划线接种平板,置35 ℃ 培养过夜。8h 后即可初步观察结果。24h 培养后,霍乱弧菌呈中心黑色、较大而扁平的菌落。配成的培养基呈亮黄色透明;EL-Tor弧菌稻叶型生长良好;EL-Tor弧菌小川型生长良好;大肠埃希菌ATCC25922 抑制生长。注:(1)庆大和亚碲酸钾混合液应新鲜配制并置冰箱保存。(2)雷佛奴尔应避光保存,而且每批均应预试后方可使用。成品培养基应避光保存。
蜡样芽孢杆菌显色培养基Bacillus cereus Chromogenic Medium用途:用于蜡样芽孢杆菌的显色培养,蜡样芽孢杆菌显蓝绿色蜡样芽孢杆菌显色培养基是青岛海博生物公司改良的培养基,用于食品、水、乳制品和肉制品中蜡样芽孢杆菌的快速检测。蜡样芽孢杆菌显蓝绿色且菌落比较大,苏云金芽孢杆菌显蓝绿色,李斯特氏菌显深蓝色,菌落比较小,其它菌显黄色或无色,革兰氏阴性菌被抑制。 成份 (g/L) 特殊营养物质41.9 显色剂 0.5 抑菌成份 0.6琼脂 15.0 pH 7.0 ± 0.2 25 ℃ 此配方可以进行改良或增加营养成份以获得最佳的结果。 注意 此培养基仅供实验室使用。 用法 称取本品 11.6g 加入200ml蒸馏水,加热溶解并不停搅拌,煮沸不要超过1分钟。冷却至45-50℃时,倾入无菌平皿,备用。 贮存 制备好的平板可保存 2-5 天,应避免光线直接照射。干燥培养基应放置于阴暗干燥处, 保存温度 2-8 ℃,注意避光保存。 失效 干燥培养基超过保质期、结块和颜色变化都不能使用。 操作步骤 1、按国家标准、SN标准、FDA标准或其它方法制备样品液; 2、样品液在30±1℃增菌培养18-24小时; 3、取增菌液划线接种于蜡样芽孢杆菌显色培养基平板上,30±1℃培养18~24h。蜡样芽孢杆菌典型菌落为蓝绿色且菌落比较大。若24小时没有出现典型菌落,可延长培养至48小时。 4、对可疑蜡样芽孢杆菌可划线接种到营养琼脂平板上,30±1℃培养18-24小时,挑取单菌落做蜡样芽孢杆菌全套生化试验(本公司有生化鉴定管套装SHBG09 7种x2套/盒*5盒)
因实验需要,需配置含10mM的CaCl2的M17培养基,但加入氯化钙的M17培养基在煮沸溶解过程中会产生絮状沉淀,用纱布过滤去除沉淀,但在高压灭菌过程中又产生了沉淀,请问这是正常现象吗?用这种带沉淀的培养基可以倒平板然后计数吗?有没有什么办法可以不产生沉淀?
用于菌数计数的半固体琼脂培养基促菌生长(灵敏度)检查的方法:对每个不同批号的脱水培养基均应进行灵敏度检查(促菌生长检查)。取预先制备好的琼脂培养基平皿3~5个,用表面涂布法每块平板表面接种30~100个试验菌,同时用已知质量保证的同型号培养基平皿3~5个(如较著名的如MERCK,DIFICOL产品)做对照试验,待培养基表面的菌液被琼脂培养基吸干或风干后,将培养皿倒置于培养箱的使用温度下培养48~72小时,(也可采用浇碟法进行)取出培养后的平皿点计菌落数。样品培养基上的微生物数量应不得低于对照培养基上微生物生长数量的70%。否则,需重新检查,或该培养基被视为不符合促生长要求。
我在做微生物培养基时,要求先高压灭菌再调pH到3.7左右,好像说是琼脂在低酸度的情况下不宜凝固,但是我把调过酸的培养基高压灭菌后,培养基只是pH升高了一点点,但是还是可以凝固的?我想问哈如果我把酸度调低点在高压灭菌,最后倒平板,不知与先灭菌再调pH有啥区别?
因环境监测,需定期配制大量平板,需求购培养基分装设备,有意者请将设备资料及报价发至邮箱hgj@kangh.com
我在做细菌菌落总数的时候,平板里面的培养基上面有许多的小白点,不知道是不是细菌菌落?在计数的时候要不要把它们计算在内呢?
(1)容器:配制和分装培养基的烧瓶、平皿或试管等器材应为中性,无酸、碱抑制物残留,平皿底部要平,以免琼脂厚薄不一,影响药敏试验结果。(2)成分来源:各种成分来源可靠,不含对目的菌生长有抑制的物质。特殊要求的培养基,如葡萄糖氧化发酵试验(O/F 试验),除加入葡萄糖外,不能含有其他糖类,指示剂不能用乙醇溶液,避免O/F试验的假阳性。培养基配制用水应是蒸馏水。(3)pH值调整:根据培养基的不同要求调整pH 值,控制在要求范围的±0.2之内。应当注意,培养基在高压灭菌后其pH 值降低0.1~0.2,故矫正时应比实际需要p H值高0.1~0.2。(4)灭菌:根据培养基所含成分及配制数量的不同,选择不同的灭菌方式,既要达到灭菌效果,又不破坏培养基成分。一般对稳定的培养基,如MH琼脂、营养琼脂可用高压灭菌,即121℃15min ;而含糖的培养基则以108℃灭菌为好,以防止糖类破坏。不耐高热的物质如血清、牛乳等,可采用间隙灭菌法灭菌。(5)分装:根据使用的目的和要求决定分装量。分装培养基所用的平皿、试管要求清洁,不残留酸碱;制备平板培养基时,操作台要水平,以避免琼脂平板厚薄不一,同时确保无菌操作。
培养基的制备方法 以下为常规方法,如配方中有特殊规定或要求,以配方为第一依据。1.根据配方,计算各种营养成分用量。一般药品可用普通药物天平称量,用量少的药品,可按比例配成高浓度溶液,再按所需量用移液管吸取。称好的药品放入玻璃烧杯或搪瓷杯中。2.在另一容器中将所需量的水(一般可用自来水,有特殊要求时需用蒸馏水)加热,取全量的1/3左右倒入放药品的容器中,用玻璃棒搅拌,待药品全溶后,再将其余热水全部倒入。3.若配制固体培养基,则称取1.5~2%的琼脂放入已溶化的营养液中,继续加热至琼脂全部溶解。加热中随时搅拌,防止溢出或糊底。烧糊的培养基营养物质破坏,并产生有毒物质,不宜再用。4.待溶化的培养基稍冷却后,按配方要求调整pH值。先取10毫升培养基装入试管中,用pH试纸测其自然pH,再用1%NaOH(或1%HCl)调至所需pH,根据用量计算,换用10%NaOH(或10%HCl)调整所配全量培养基的pH。加碱(或酸)溶液时,应边滴加边搅拌,至应加量将近用完时,再次测试,最后调至要求的pH值。5.配好的培养基,根据需要趁热分装至试管或锥形瓶中。分装需用漏斗,以免琼脂粘在管口或瓶口上。装瓶量一般为瓶容量的1/3~1/2;装试管一般为试管高度的1/5~1/4,以免灭菌时培养基上溢,粘湿棉塞。6.用预先制好的棉塞塞住管口或瓶口。棉塞既有利于通气,又有滤菌作用,故松紧、大小应适当,以免使用时影响操作(如图)。最后用牛皮纸或报纸包住棉塞,扎紧在瓶颈或试管上方,以免灭菌时水蒸汽沾湿棉塞或脱落。7.灭菌后取出的固体培养基,根据需要可将试管立即斜放,冷凝后即成斜面培养基,用于菌种扩大培养及保藏;锥形瓶中的培养基,倒入无菌培养皿中,冷凝后即制成平板培养基,可用于菌种的分离、鉴定等。液体培养基冷却后可直接根据需要接入菌种
[align=center]耗材和试剂的验收之培养基[/align]耗材和试剂如果在一定程度上影响实验室检测数据的质量情况下,我们要对其进行识别,不仅仅做符合性验收,还要根据其特性,做相应的技术性验收,本文依据GB 4789.28—2013.食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 SN/T1538.1-2005.培养基制备指南 第1部分:实验室培养基制备质量保证通则[s].SN/T1538.2-2007.培养基制备指南 第2部分:培养基性能测实用指南,[/s]为培养基的验收提供指导。 符合性验收:购买培养基到货后,由试剂管理员和微生物检测人员共同核对生产企业提供的资料、培养基名称、规格数量、外观特征、批号、保质期是否符合要求,同时应填写“培养基验收检查记录单”验收符合要求后,交由检测人员接受保管,填写培养基入库记录和建立试剂台帐。技术性验收之前需要制备培养基,小心称量所需量的脱水合成培养基(必要时佩戴口罩或在通风柜中操作,以防吸入含有有毒物质 的培养基粉末),先加入适量的水,充分混合(注意避免培养基结块),然后加水至所需的量后适当加热,并重复或连续搅拌使其快速分散,必要时应完全溶解。含琼脂的培养基在加热前应浸泡几分钟。湿热灭菌在高压锅或培养基制备器中进行,高压灭菌一般采用121 ℃±3 ℃灭菌15 min,具体培养 基按食品微生物学检验标准中的规定进行灭菌。应对经湿热灭菌或过滤除菌的培养基进行检查,尤其要对pH、色泽、灭菌效果和均匀度等指标进 行检查。在初次使用每批培养基时,均需随同检测配制一个测试培养基,在灭菌或消毒后应在25℃温度下采用精密PH 试纸测试PH值,并判断是否符合要求。购置的同一批次培养基其质量检查应能通过无菌检查(制备好的培养基经30~35℃培养48小时,真菌培养基经20~25℃培养72小时候后,应无菌生长)、新购的不同批次的商品化培养基在使用前应进行培养基性能测试,经检查合格的该批次培养基方准许使用,否则不准使用,做好检查记录。新购的不同批次的商品化培养基在使用前应进行培养基性能测试,包括物理指标和微生物指标的测试,根据测试结果及时填写“实验室培养基质量控制性能测试记录及评估报告”物理指标控制1)测试20℃~25℃的pH值2)琼脂层厚度;色泽;透明度和(或)是否存在肉眼可见杂质。微生物学指标控制可根据要求选用定量方法、半定量方法或定性方法(参考SN/T 1538.2-2016《培养基制备指南 第2部分:培养基性能测试实用指南》和GB 4789.28—2013《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》)对培养基性能进行测试,具体操作方法如下:(1)生长率将适量测试菌株的工作培养物接种至固体、半固体和液体培养基中,每种培养基上菌株的生长率应达规定的最低限值。1)定量方法生长率PR的计算: PR = NS/NONS:从一个或多个待测培养基平板上得到的菌落总数。N0:从一个或多个规定的参考培养基平板上获得的菌落总数(该菌落总数应≥100cfu )。要求:非选择性培养基上目标菌的生长率最低应为0.7,该类培养基应易于目标菌生长;选择性培养基上目标菌的生长率最低应为0.1;每平板(或每试管)的接种水平为10CFU~100CFU。2) 半定量方法半定量方法采用生态测量技术在平板上划线,平板板连续划线区域得分的总和即为生长指数G,G值不应超过标准规定的允许范围。3) 定性方法定性方法采用划线法观察。①选择性将浓度为104CFU/mL~106CFU/mL的非目标菌工作菌株悬浮液接种至选择培养基和参考培养基中,培养基的选择性应达到规定值。②定量方法选择因子SF: SF = DO - DSDO:能在参考培养基上生长至少10个菌落的最高稀释度DS:能在测试培养基上显示生长的最高稀释度要求:非目标菌在选择性培养基上的SF至少为2 ;半定量和定量法中,非目标菌应部分或全部被抑制。③生理生化特性(选择性和特异性)规定培养基的基本特性,使用一套适当的测试菌株对培养基上的目标菌的生理生化特性(菌落形态、大小等)和非目标菌的被抑制程度进行测试。(2)性能评价和结果解释按照规定得到的所有测试菌株的性能均符合规定,则该批培养基品质优良;若只有物理指标和微生物指标符合规定,则该批培养基可被接收。综上所述,培养基在微生物实验室有着很重要的作用,其质量能够影响整个微生物检测过程,所以在其购置回来后,应该进行技术性验收,在使用过程中,也应注意存储条件和有效期,避免发生异常情况,导致检测结果出错。[s][s][/s][/s]
[font=宋体, SimSun]在整个平板培养过程中,严格遵守操作规程和消毒措施是至关重要的,以确保培养的准确性和可靠性。只有通过精心操作和细心观察,才能获得理想的培养结果,为后续的微生物实验提供可靠的基础。[/font] [font=宋体, SimSun][color=#3daad6][b][size=17px]1.为什么“倒置”培养?[/size][/b][/color][/font] [font=宋体,SimSun]"倒置"培养是微生物学实验中常用的一种培养方法,主要出于几个重要考虑。首先,倒置培养[color=#ab1942][b]可以方便取放培养皿,避免了皿盖比皿底大的设计导致的取盖或放底不慎,从而减少了固体培养基和菌种暴露在外的风险[/b][/color],降低了菌种污染的可能性。相比之下,如果采用“正置”培养方法,可能会因为皿盖上的冷凝水滴落到培养基表面而破坏菌落形态,影响实验结果的准确性。[/font] [font=宋体,SimSun]其次,“倒置”培养也[color=#ab1942][b]有利于观察计数[/b][/color],避免冷凝水对培养基和菌落的干扰。通过倒置培养可以有效减缓培养基水分的蒸发速度,避免水蒸气残留在培养基中导致干裂,尤其适用于培养周期较长的微生物,如链霉菌等。因此,“倒置”培养不仅可以保护菌落形态,还可以确保培养基的湿润度,提高培养结果的可靠性。[/font] [align=center] [/align] [font=宋体, SimSun]最后,保持培养基湿度,倒置培养可以减少培养基表面的水分蒸发,保持琼脂的弹性,延长培养基的使用寿命。[/font] [font=宋体,SimSun]总的来说,“倒置”培养方法在微生物学实验中被广泛采用,其设计合理且操作简便,有效降低了实验操作中的风险,保障了实验结果的准确性和可靠性。因此,选择“倒置”培养是一种明智的选择,为实验工作的顺利进行提供了重要支持。[b][/b][/font] [list][*] [font=宋体, SimSun][color=#021eaa][b][size=17px]“正置”培养行不行?[/size][/b][/color][/font] [/list] [font=宋体, SimSun]在微生物学实验中,虽然“倒置”培养方法被广泛采用并被认为是更为可靠的选择,但在一些特定情况下,“正置”培养也是可以采用的。例如,在培养皿较干且培养时间较短的情况下,采用“正置”方式培养可能不会对实验结果产生明显影响。此时,只需在取放培养皿时稍加注意,能够有效避免固体培养基和菌种受到外界污染的可能性。[/font] [font=宋体,SimSun]尽管“正置”培养方式相对于“倒置”方式在防止冷凝水滴落和减缓水分蒸发等方面存在劣势,但在一些简单实验中仍然可以选择使用。对于短期培养或对于实验影响不大的情况,采用“正置”培养也是一种可行的选择。[color=#ab1942][/color][b]关键在于根据具体实验要求和情况,灵活选择适合的培养方式,以确保实验结果的准确性和可靠性。[/b][/font] [font=宋体,SimSun][color=#3daad6][b]正置培养的主要优点包括:[/b][/color][/font][list][*][font=宋体,SimSun][b]便于操作:正置培养时,培养皿的放置和取用更加方便,特别是在需要频繁操作的实验中。[/b][/font][*][font=宋体,SimSun][b]适用于特定实验:某些实验可能需要正置培养,例如观察液体培养基中的微生物生长状态。[/b][/font][/list] [font=宋体, SimSun]然而,正置培养也有一些缺点,例如容易导致冷凝水滴落到培养基上,增加污染风险。因此,选择正置或倒置培养应根据具体实验需求和条件来决定。[/font] [align=center] [/align] [font=宋体,SimSun]综上所述,“正置”培养在特定情况下是可以使用的,但在大多数情况下,为了保证实验的准确性和稳定性,推荐采用“倒置”培养方式以确保实验数据的可靠性。在实际操作中,根据实验要求和情况选择最适合的培养方式是保障实验成功的关键之一。[b][/b][/font] [list][*] [font=宋体, SimSun][color=#021eaa][b][size=17px]“[/size][size=17px]倒置”培养是不是可以少倒点培养基?[/size][/b][/color][/font] [/list] [font=宋体,SimSun][color=#ab1942][b]绝对不能因为省略一点培养基而采用少倒的方式进行“倒置”培养。[/b][/color]培养基的用量是非常关键的,减少培养基的使用量可能导致平板不平整,特别是当操作环境不是高度洁净且使用的培养皿质量不合格时更容易出现问题。平板不平整会导致部分区域的培养基过薄,最终可能引起平板开裂,导致无法使用的情况发生。[/font] [font=宋体, SimSun]在“倒置”培养过程中,确保平板的平整度是至关重要的。倒置过程中需要确保培养基均匀地分布在整个培养皿表面,以保证菌落的正常生长和观察。如果采用少倒点培养基的方式,可能导致某些区域的培养基不足,从而影响菌落的生长情况,甚至造成实验失败。[/font] [align=center] [/align] [font=宋体,SimSun]因此,在进行“倒置”培养时,应该严格按照标准配制培养基并倒入足够量的培养皿中,保证平板的平整度和培养基的充足性。只有确保操作规范和培养条件恰当,才能获得准确可靠的培养结果,为后续实验工作打下坚实基础。[b][/b][/font] [font=宋体,SimSun][color=#3daad6][b][size=17px]2.[/size][size=17px]“培养需要用封口膜“封[/size][size=17px]口”?[/size][/b][/color][b][/b][/font] [font=宋体,SimSun]在一般的微生物学实验中,培养皿通常不需要使用封口膜进行封口。[b]培养皿由皿底和皿盖组成,而它们之间并没有严密的密封结构,因此封口膜并不是必须的。[/b]培养皿在培养箱或培养室中培养时,会受到箱内恒温恒湿的环境影响,无需额外采取封口措施。[/font] [font=宋体, SimSun]实际上,对于一般的培养实验,不使用封口膜更为常见且合适。使用封口膜封口可能会产生一些不利影响,例如封口膜可能会阻碍空气和气体的交换,影响微生物的生长环境和气氛,甚至可能导致氧气和二氧化碳的不均衡,影响菌落的生长和表现。此外,封口膜的使用还会增加操作复杂性和可能引入额外的污染风险。[/font] [font=宋体, SimSun]因此,一般情况下,对于常规的微生物培养实验,培养皿不需要使用封口膜进行封口。在符合恒温恒湿条件的培养箱或培养室中,培养皿能够获得适宜的生长环境而无需额外封闭。重要的是确保培养实验操作规范,环境卫生良好,并保持培养皿与外界环境的适当通气,从而保证实验结果的准确性和可靠性。[/font] [list][*][font=宋体, SimSun][size=17px][b][color=#021eaa]采用标准培养皿,可以不封口[/color][/b][/size][/font][/list] [font=宋体, SimSun]采用标准的培养皿在微生物实验中是非常实用的选择,不需要额外使用封口膜进行封口。首先,标准培养皿设计科学,能够满足各类微生物的生长环境需求,不易受到污染,同时也能够节省封口膜的费用开支。因此,在采购过程中要特别留意,确保采购到符合标准的培养皿,以避免以次充好的情况发生。[/font] [align=center] [/align] [font=宋体, SimSun]在进行“倒置”培养时,培养皿中的培养基比较沉,皿底朝上放置后也能够自然压住皿盖,保持盖底间的紧密贴合。这种设计不仅满足微生物的生长条件,还可以完全满足足够的空气交换需求,有利于菌落的生长和观察。[/font] [font=宋体, SimSun]另外,培养时也不需要额外封口,因为封口可能导致水分蒸发速度过慢,影响培养实验的进行。培养皿的开放型设计能够保持空气的正常流通,有助于维持适宜的湿度和气氛,为微生物的生长提供良好的条件。[/font] [font=宋体, SimSun]因此,采用标准的培养皿,在培养过程中不需要额外封口措施,其设计符合微生物生长的需要,既能保证实验结果的准确性,又能提高实验操作的便利性。在实验中要注意选择符合标准的培养器材,并遵循科学的操作方法,以确保实验的顺利进行和结果的可靠性。[/font] [align=center] [/align][list][*][font=宋体, SimSun][size=17px][b][color=#021eaa]特殊情况,需要封口[/color][/b][/size][/font][/list] [font=宋体, SimSun]在一些特殊情况下,如进行厌氧培养等实验时,可能需要采用封口措施来保持适宜的培养条件。厌氧培养需要在完全没有氧气的环境中进行,以模拟厌氧微生物的生长环境。在这种情况下,封口是必要的,以阻止氧气进入培养皿并保持严格的厌氧条件。[/font] [font=宋体, SimSun]在进行厌氧培养时,可以使用专门设计的封口膜或其他氧气密封材料将培养皿密封,确保内部环境不受外界氧气的干扰。这种封口措施有助于维持厌氧微生物的生长需求,确保实验结果的准确性。[/font] [font=宋体, SimSun]因此,对于特殊情况如厌氧培养等实验,为了保证实验的科学性和可靠性,有必要采取封口措施以维持特定的培养条件。在操作过程中要注意选择适合的封口材料和方法,并严格控制气氛条件,以确保实验顺利进行并取得准确的实验结果。[/font]
按国标要求,配好的培养基导入平板里面,置于黑暗处,于2度到8度保存,应该放在哪里好,是不是可以放在冰箱的。因为要防止干燥,在一个月内使用,那么培养不是凝固了,又不能煮溶,那么下次拿出来用的时候培养基不就是凝固的状态了,在凝固的状态下可以放滤膜上去,能培养铜绿假单胞菌吗?会不会有影响,正确的方法是怎么样的?有做过这个的吗?
配制后质量控制(1)培养基外观情况:包括颜色、透明度、有无沉淀和凝固。如发现培养基表面有裂纹或与培养皿的边缘分离,说明培养基有脱水现象,必须丢弃。(2)无菌试验:每一批配好的培养基均须进行无菌试验。先灭菌后分装的培养基,可采用抽样方法试验,少于100个样本通常选取5%~10%的量,如果配制大量培养基,则任意选取10 个培养基;无菌分装培养基则需全部做无菌试验。样本在35 ℃ 或其他适宜的温度下隔夜培养,如培养基含有血液,则需再置于室温1天,以检查嗜冷菌。选择性培养基因含有抑制物质,能抑制许多微生物,因此,可加入10倍量的无菌液体培养基,稀释抑制物质,以利于检出污染菌。即使做过无菌试验,接种时,也要检查每个平板上的可见菌落。(3)性能测试:每一批新制或新购的培养基,使用前均须取已知性质的库存菌种进行性能测试。培养基按目的不同可分为增菌培养基、分离培养基和鉴定培养基。①增菌培养基:接种少量难以生长的细菌,在一定时间内观察增菌情况,细菌能生长的最小接种浓度越小,说明增菌培养基性能愈好。②分离培养基:要求目的菌生长良好,非目的菌被抑制。一般要求生长的目的菌接种量不可过多,较好的方法是将测试菌调成0.5麦氏浊度的菌悬液,再用0.001ml的标准接种环涂划在培养基上,观察菌落生长。③鉴定培养基:应选择具有典型特征的菌株作性能试验。如三糖铁琼脂,须用弗劳地枸橼酸杆菌、福氏志贺菌及铜绿假单胞菌3种菌分别接种3支培养基,若反应结果为斜面产酸/高层产酸、硫化氢阳性,斜面产碱/高层产酸,斜面产碱/高层产碱,质量才算合格。
一、实验目的1、了解并掌握培养基的配制、分装方法;2、掌握各种实验室灭菌方法及技术。二、实验原理 培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型,对营养物质的要求也各不相同,加之实验和研究的目的不同,所以培养基的种类很多,使用的原料也各有差异,但从营养角度分析,培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外,培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质,是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98~100℃下融化,于45℃以下凝固。但多次反复融化,其凝固性降低。任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌,以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。三、实验材料 1、器皿及材料 天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱。 2、药品试剂 蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽计、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。 3、流程 称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。 四、实验步骤 1 培养基的制备 1.1 称量药品 根据培养基配方依次准确称取各种药品,放入适当大小的烧杯中,琼脂不要加入。蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速。 1.2 溶解 用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中,在放有石棉网的电炉上小火加热,并用玻棒搅拌,以防液体溢出。待各种药品完全溶解后,停止加热,补足水分。如果配方中有淀粉,则先将淀粉用少量冷水调成糊状,并在火上加热搅拌,然后加足水分及其它原料,待完全溶化后,补足水分。 1.3 调节pH 根据培养基对pH的要求,用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等。 1.4 溶化琼脂 固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后,置电炉上一面搅拌一面加热,直至琼脂完全融化后才能停止搅拌,并补足水分(水需预热)。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。 1.5 过滤分装 分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口,以免浸湿棉塞,引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装装量为管高的1/5,半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜;分装三角瓶,其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。 1.6 包扎标记 培养基分装后加好棉塞或试管帽,再包上一层防潮纸,用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称,制备组别和姓名、日期等。 1.7 灭菌 上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为121℃20min,以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后,如需要作斜面固体培养基,则灭菌后立即摆放成斜面,斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜;半固体培养基灭菌后,垂直冷凝成半固体深层琼脂。1.8 倒平板 将需倒平板的培养基,于水浴锅中冷却到45~50℃,立刻倒平板。2、灭菌方法 灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物,灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种,即加热灭菌。 加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内 蛋白质凝固变性,从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关,含水量越高,其凝固所需要的温度越低。在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大,因为在湿热情况下,菌体吸收水分,使蛋白质易于凝固;同时湿热的穿透力强,可增加灭菌效力。 2.1 湿热灭菌 煮沸消毒法 :注射器和解剖器械等均可采用此法。先将注射器等用纱布包好,然后放进煮沸消毒器内加水煮沸。对于细菌的营养体煮沸约15~30min,对于芽孢则需煮沸约1~2h。 高压蒸汽灭菌法:高压蒸汽灭菌用途广,效率高,是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时,水蒸气的温度升高到121℃,经15~30min,可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。 2.2 操作方法和注意事项 加水:打开灭菌锅盖,向锅内加水到水位线。立式消毒锅最好用已煮开过的水,以便减少水垢在锅内的积存。注意水要加够,防止灭菌过程中干锅。 装料、加盖:灭菌材料放好后,关闭灭菌器盖,采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋,使蒸汽锅密闭,勿使漏气。 排气:打开排气口(也叫放气阀)。用电炉加热,待水煮沸后,水蒸气和空气一起从排气孔排出,当有大量蒸汽排出时,维持5min,使锅内冷空气完全排净。 升压、保压和降压:当锅内冷空气排净时,即可关闭排气阀,压力开始上升。当压力上升至所需压力时,控制电压以维持恒温,并开始计算灭菌时间,待时间达到要求(一般培养基和器皿灭菌控制在121℃,20min)后,停止加热,待压力降至接近“0”时,打开放气阀。注意不能过早过急地排气,否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。 灭菌后的培养基空白培养:灭菌后的培养基放于37℃培养箱中培养,经24h培养无菌生长,可保存备用;斜面培养基取出后,立即摆成斜面后空白培养;半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后,空白培养。 2.2 干热灭菌法 通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后,放入电烘箱中烘烤,即加热至160~170℃维持1~2h。 干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。凡带有胶皮的物品,液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。 2.2.1 灭菌前的准备 玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞,以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染。常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下:平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内;三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸,用棉绳以活结扎紧,以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染;吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中心,轻轻捅入管口,松紧必须适中,管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去,灭菌时将吸管装入金属管筒内进行灭菌,也可用纸条斜着从吸管尖端包起,逐步向上卷,头端的纸卷捏扁并拧几下,再将包好的吸管集中灭菌。 2.2.2 干燥箱灭菌 将包扎好的物品放入干燥烘箱内,注意不要摆放太密,以免妨碍空气流通;不得使器皿与烘箱的内层底板直接接触。将烘箱的温度升至160~170℃并恒温1~2h,注意勿使温度过高,超过170℃,器皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧。如果是为了烤干玻璃器皿,温度为120℃持续30分钟即可。温度降至60~70℃时方可打开箱门,取出物品,否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂。 用此法灭菌时,绝不能用油、蜡纸包扎物品。 [/siz
作环境监测每周都需要几百几百的平板,手动分装太累,而且分装量不是很准,有时还污染,大家都怎么分的呢?有没有人用培养基分装器?
[size=16px][font=宋体,SimSun]EMB( eosin-methylene blue)培养基,又叫伊红美蓝培养基,是一种鉴别培养基,供沙门菌属及志贺菌属鉴别用,如大肠埃希菌、变形杆菌、产气杆菌等。又是伊红和美蓝。[/font] [font=宋体, SimSun][b]1.EMB鉴别原理[/b][/font] [font=宋体, SimSun]EMB培养基中的伊红和亚甲蓝两种苯胺染料可抑制[/font][font=宋体, SimSun]G[/font][sup]+[/sup][font=宋体, SimSun]细菌和一些难培养的G[/font][sup]-[/sup][font=宋体, SimSun]细菌。在低酸度下,这两种染料会结合并形成沉淀,起着产酸指示剂的作用。[/font] [font=宋体,SimSun][/font][font=宋体,SimSun]因此,试样中多种肠道细菌会在EMB培养基平板上产生易于用肉眼识别的多种特征性菌落,尤其是[i]E.coli[/i],因其能强烈分解乳糖而产生大量混合酸,菌体表面带H[sup]+[/sup],故可染上酸性染料伊红,又因伊红与亚甲蓝结合,故使菌落染上深紫色,且从菌落表面的反射光中还能看到绿色金属闪光。[/font] 肠道致病菌因不分解乳糖或蔗糖,形成透明无色的菌落;变形杆菌则形成橙色孤立菌落,菌落周围培养基变色,其他菌落周围,培养基无变化;产气杆菌为大而黏性的菌落,中心小而暗黑色或黑色,很少见金属光泽。 [b]2.EMB成分[/b] [font=宋体, SimSun]2%无糖琼脂100mL,2%伊红Y水溶液2mL,0.65%美蓝兰水溶液1mL,乳糖1g[/font] [font=宋体,SimSun]蛋白胨提供碳源和氮源;乳糖是大肠菌群可发酵的糖类;磷酸氢二钾是缓冲剂;琼脂是培养基凝固剂;伊红和亚甲蓝是抑菌剂和pH指示剂。[/font] [font=宋体,SimSun][b][b]3.EMB培养基[/b]制法[/b][/font] [font=宋体,SimSun]在无糖琼脂内加入乳糖,加热融化(pH=7.6),冷至50℃左右时,加入经高压灭菌的伊红及美兰溶液,混匀后,倾注平板。[/font] [/size][font=宋体,SimSun][b][size=16px]4.注意事项[font=宋体, SimSun](1) pH不要调过头,以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。[/font] [font=宋体, SimSun](2)严格按照培养基配方配制。[/font] [font=宋体, SimSun](3)高压灭菌需彻底,保证无菌状态。[/font] [font=宋体,SimSun](4)EMB培养基除有鉴别不同菌落特征的作用外,同时兼有抑制G[sup]+[/sup]细菌和促进G[sup]-[/sup]肠道菌生长的作用。[/font] [/size] [/b][/font]
微生物常用培养基中英文对照一、显色培养基:大肠杆菌显色培养基 E.Coli Chromogenic Medium大肠菌群显色培养基 Coliform Chromogenic Medium大肠杆菌/大肠菌群显色培养基 E.Coli/Coliform Chromogenic Medium细菌总数显色培养基 Total Genes Chromogenic MediumO157显色培养基 O157 Chromogenic Medium沙门氏菌显色培养基 Salmonella Chromogenic Medium李氏菌显色培养基 Listera Chromogenic Medium金黄色葡萄球显色培养基Staphylococcus Chromogenic Medium霉菌和酵母菌显色培养基 Mould and Yeast Chromogenic Medium弧菌显色培养基Vibrio Chromogenic Medium坂崎杆菌显色培养基Enterobacter sakazakii Chromogenic Medium二、常用检测培养基:平板计数琼脂(PCA) Plate Count Agar月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(LST) Lauryl Sulfate Tryptose Broth煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB) Brilliant Green Lactose Bile BrothEC 肉汤 E.Coli Broth伊红美蓝琼脂 (EMB) Eosin-Methylene Blue Agar营养肉汤 (NB) Nutrient Broth营养琼脂 (NA) Nutrient Agar乳糖胆盐发酵培养基 Lactose Bile Broth乳糖发酵培养基 Lactose Broth结晶紫中性红胆盐琼脂 (VRBA) Violet Red Bile Agar去氧胆酸盐琼脂 Desoxycholate Lactose Agar肠道菌计数琼脂 (VRBDA) Violet Red Bile Dextrose Agar肠道菌增菌肉汤(EE) Enterobacteria Enrichment Broth7.5%氯化钠肉汤 7.5% Sodium Chloride BrothBaird-Parker琼脂基础 Baird-Parker Agar Base胰蛋白胨大豆肉汤(TSB) Trypticase (Tryptic) Soy Broth胰蛋白胨大豆琼脂(TSA) Tryptose Soya Agar胰月示-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础 (TSC) Tryptose Sulfite Cycloserine Agar Base甘露醇卵黄多粘菌素琼脂基础(MYP)Mannitol-Egg-Yolk-Polymyxin Agar Base亚碲酸盐卵黄增菌液 Egg-Yolk Tellurite Emulsion缓冲蛋白胨水(BPW) Buffered Peptone Water亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC) Selenite Cystine Broth四硫磺酸盐煌绿增菌液基础(TTB) Tetrathionate Broth Base胆硫乳琼脂(DHL) Deoxycholate Hydrogen Sulfide Lactose AgarSS 琼脂 Salmonella Shigella Agar亚硫酸铋琼脂(BS) Bismuth Sulfite Agar亚利桑那菌琼脂(SA) Salmonella Arizona AgarHE 琼脂(HE) Hekton Enteric Agar三糖铁琼脂(TSI) Triple Sugar Iron Agar马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) Potato Dextrose Agar高盐察氏琼脂 Salt Czapek Dox Agar沙氏琼脂培养基 Sabouraud’s Agar孟加拉红培养基 Rose Bengal MediumYPD琼脂Yeast Peptone Dextrose Agar胰酪胨大豆多粘菌素肉汤基础Trypticase-Soy-Polymyxin Broth Base酪蛋白琼脂Casein Agar产芽孢肉汤Sporulation Broth溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基 Glucase Peptone Water Medium李氏菌增菌肉汤(LB1,LB2)基础Listeria Enrichment Broth Base半固体动力培养基Motility Test三、培养基基础:胰蛋白胨Tryptone酪蛋白胨Peptone from Casein植物(大豆)蛋白胨Peptone from soy月示胨Proteose peptone多价蛋白胨Polypeptone特殊蛋白胨Peptone Special牛心浸粉Beef Heart Infusion肝浸粉Liver Infusion牛肉浸粉Beef Extract Powder酵母浸粉Yeast Extract Powder酸水解酪蛋白Casein acid Hydrolysate细菌琼脂粉Bacterial Agar牛胆盐Bile Salt