耶拿梯度仪的原理

自从1977 年推出以来，二氧化硅胶体PercollTM已经成为全世界数以千计的研究人员对密度梯度介质的选择。其近乎完美的物理特征方便它在细胞、细胞器、病毒和其他亚细胞颗粒分离中的使用。Percoll做为第一步在进行更高分辨率分离或核酸抽提前富集细胞是非常有用的。人们会认识到在进行其他的这些方法前使用Percoll 做为第一步可以节省大量的时间和资源。对于生物学颗粒，理想的梯度培养基被描述为具有以下特征: 涵盖了足够的对于所有感兴趣的生物颗粒的恒定密度(图1) 带范围 拥有生理离子强度和pH 在全部梯度中是等渗的 低粘度 无毒性 不会渗透生物膜 无菌且可以重复灭菌 在适度的离心力下将自动形成梯度 和生物材料相容 很容易从被纯化的材料中去除 不影响分析程序 不会猝灭放射性分析 http://www.biomart.cn//upload/userfiles/image/131225996878281.jpg Percoll在现有的介质中是非常特殊的，它符合上述所有的标准，并且提供以下附加的优点： 它能形成连续梯度和不连续的两种梯度。 梯度的稳定性意味着梯度可以预制以提供可重复性的结果。 使用带颜色的Density Marker Beads进行梯度分析十分简单(GE Healthcare提供)。 Percoll 不影响被分离的材料进一步的研究。 数以千计的研究人员的成功已经记录在Percoll Reference List 中。 密度梯度离心原理当颗粒悬浮液被离心时，颗粒的沉降速率和应用的离心力是成比例的。溶液的物理性质也会影响沉降速率。在一个固定的离心力和液体粘度下，沉降速率和颗粒大小以及它自身密度与周围介质密度之间的差别成比例。在一个离心范围中一个球体的沉降方程为：http://www.biomart.cn//upload/userfiles/image/131226013987183.png这里v = 沉降速率d = 颗粒直径(流体力学等效球体) pp= 颗粒密度p1 = 液体密度 h= 介质粘度g = 离心力从这个方程中，可以观察到下列关系： 颗粒沉降速率和它的大小成比例。 沉降速率和它自身密度与周围介质密度之间的差别成比例。 当颗粒密度等于周围培养基密度时，沉降速率为0。 沉降速率随着介质粘度的增加而降低。 沉降速率随着离心力的增加而增加。 通过密度分离(等密度离心法)在这个技术中，梯度介质的密度范围包含了样品颗粒的所有密度。每种颗粒将沉降到梯度中的平衡位置，在这个位置梯度密度等于颗粒密度(等密度位置)。因此，在此类分离中，颗粒基于不同的密度而被单独分离，与颗粒大小无关。 http://www.biomart.cn//upload/userfiles/image/131226021809484.png图1显示两种类型的梯度分离(见下面的速率区带离心法)。当使用Percoll时，普遍是等密度分离颗粒而不是根据颗粒的大小差别(仅见31 页的图19，两种技术都使用)。注释: 当考虑生物学颗粒时，切记介质的渗透压能够明显地改变膜结合颗粒的大小和表观浮力密度。一个高的渗透压能够导致膜结合颗粒收缩而培养基低的渗透压将导致结合颗粒的膨胀。 http://www.biomart.cn//upload/userfiles/image/131226032040485.png图2 显示在生理条件下( 280 到320mOsm/kg H2O) 使用Percoll梯度离心的颗粒比用蔗糖或甲泛葡胺离心的颗粒有低得多的表观浮力密度 通过大小分离(速率区带离心法)在这类技术中，颗粒之间的大小差别与颗粒的密度一起影响分离。正如上述的方程所示，大颗在整个梯度中比小颗粒移动更快，因此选择密度范围以便在整个分离期间的所有的位置上的颗粒密度大于介质密度(图1)。被分离的区带到达管底部(或者它们的平衡位置) 之前运行被终止。

[b][font='Times New Roman'][font=宋体]解答：[/font][/font][/b][font=宋体][font=宋体]（[/font]1[font=宋体]）[/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]梯度洗脱是指在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，达到有效分离的洗脱方式。梯度洗脱一般采用二元流动相，通常为水相[/font][/font][font=宋体]和[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]有机相。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font]2[font=宋体]）梯度洗脱时[/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]流动相[/font][/font][font=宋体]通常[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]由多种不同极性的溶剂组成[/font][/font][font=宋体]。[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]梯度洗脱主要原理是通过调整不同时间段流动相的极性来调节各个组分的容量因子[/font][/font][i][font='Times New Roman']κ[/font][/i][font='Times New Roman'][font=宋体]，使得在合适的时间范围内将各个组分的保留合理分配，最终实现最佳分离。[/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体][img=,256,256]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/03/202103172158252801_395_3389662_3.jpg!w256x256.jpg[/img][/font][/font]

最近，单位要购买一台原吸，有人推荐耶拿的连续光源型的仪器，型号是contr700型。关于连续光源的原理通过耶拿厂家的产品彩页的介绍基本搞懂了，可是关于该类型仪器的背景校正原理却是含糊其辞，仅仅说是一种“独特的同时背景校正”方式。至于独特在哪里，问了许多人也讲不清，甚至询问了厂家工程师也说不出个子丑寅卯来。最后找到一篇专门介绍contr700的文献来，在这6页的产品介绍中，大量的篇幅均为介绍连续光源怎么怎么好；CCD检测器如何如何好；至于“独特的背景校正”只是一带而过。见附图：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/05/201505281640_547842_2353015_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/05/201505281640_547843_2353015_3.jpg看过的疑问是：该类型的仪器的背景校正技术是不是一个商业秘密啊？否则为何所有介绍连续光源的资料中均未涉及背景校正的原理呢？如果真的是保密的话，对于想买该类型仪器的客户而言，会不会影响信任度呢？

等度梯度你会选择谁液相色谱法中常会提到洗脱方式，大家通常提到的洗脱方式一般分为等度洗脱和梯度洗脱两种。等度洗脱是指实验过程中（做样过程）从头到尾只用一种流动相。也就是只用一个泵，输送同一种流动相。梯度洗脱是指在同一个分析周期中随着时间的变化按一定程序梯度性地改变洗脱液的比例(浓度配比、成分、离子强度、溶液极性等)或pH，以期将层析柱上不同的组分洗脱出来的方法。从而可以使一个复杂样品中性质（极性）差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。梯度洗脱一般分为二元高压梯度，二元低压梯度和四元低压梯度；二元高压梯度需要两台高压泵，二元低压梯度和四元低压梯度都是只需要一台高压泵和一个比列阀。配置特点：1. 等度洗脱只需要配置一台高压泵，配置相对简单，成本低；2. 二元高压梯度洗脱需要配置两台高压泵，一个混合器及连接管理，配置较高，成本高；3. 二元低压梯度洗脱需要配置一台高压泵、一个二元比例阀、一台在线脱气机、一个混合器（脱气机和混合器视情况而定，可不选）及连接管路，配置较低，成本较低；4. 四元低压梯度洗脱需要配置一台高压泵、一个四元比例阀、一台在线脱气机、一个混合器（视情况而定，可不选）及连接管路，配置较高，成本较低。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/12/201212222052_414496_2369266_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/12/201212222052_414497_2369266_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/12/201212222053_414498_2369266_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/12/201212222054_414499_2369266_3.jpg梯度洗脱配置相对复杂，现主要介绍下梯度洗脱的原理及洗脱要求：梯度洗脱的原理具体地讲，当样品随梯度起点的流动相进入色谱柱入口时，由于起点流动相中弱洗脱溶剂A含量较高，强洗脱溶剂B含量较低，化合物C1(保留性适中)和化合物C2(保留较强)因分配系数(k值)较高而滞留于色谱柱入口附近，几乎未移动。一段时间后，B增加到一定数值，C1的k值达到足够小(比如小于10)，其在柱中的移动速率明显增大，并且随着B的增加，其移动速率愈加快速，直到tC1时流出色谱柱，被检测器检测到并被记录成色谱峰C1，tC1虽然比等度时的保留时间长很多，但C1的的平均k值却很小，因而色谱峰并未展宽，灵敏度仍处于较高水平。B持续增加，在随后的某个时间点，C2的k值也降到10以下，C2的移动速率也开始变快，以与C1类似的方式于tC2被洗脱出色谱柱，其平均k值同样很小，色谱峰亦未展宽，灵敏度处于较高水平。 流动相的梯度变化即流动相极性、PH值等的梯度变化，即洗脱能力成梯度变化。 洗脱要求① 洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使各峰完全或基本分离；② 梯度的上限（强洗脱溶剂的比例）要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。③ 梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。优缺点：1.等度洗脱优点：流速不发生变化，压力稳定，实验结果准确、可靠；缺点：多组分检测或有杂质干扰情况下分离度可能会差，而且不容易优化，对于某些复杂样品分析时间长，峰形差。2.二元高压梯度洗脱优点：每台泵的流速都由程序控制，a.多组分检测或有杂质干扰情况下提高分离能力，b.缩短某些复杂样品的分析时间，c.改善峰形，减少拖尾，d.提高柱效，增加检测灵敏度；缺点：[fo

1 .梯度洗脱等于无限个等度洗脱http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/12/201512131829_577712_3047134_3.jpgfigure 1a所示，条件是60%B的等度洗脱，我们会发现，在色谱的前端，峰并没有很好地分离，而在色谱的尾端，虽然峰分离的很好，但峰变的很宽。如果降低B的比例，前面的峰的可以得到分离，而后端的峰宽将会变的更宽；如果提高B的比例，后端的峰可以快速流出，峰宽也会窄一些，但前端的峰会更加难以分离，所以，遇到这种情况，很难用等度洗脱得到很好的分离。为什么会出现这种情况？通过计算，发现1a中样品的保留因子范围是0.934(34/0.9 ≈ 38),样品的极性差别很大，而通常等度洗脱的保留因子范围是120(20/1=20), 1a中保留因子的范围38远远大于20，所以是不适合用等度洗脱的。figure 1b,梯度洗脱的条件是 50-100% in 5 min，会发现不论是前端还是后端，峰都得到了很好的分离，并且峰宽几乎是一样的Figure 1c做了一个试验，将figure 1中分析的15种物质分成了5组，每组都是等度洗脱，B的比例分别是49%，61%，72%，80%和88%，每组的保留因子大概都是k等于3，峰宽也几乎一样，是不是和figure 1b很相似？如果将c中的等度洗脱的条件叠加，就是一个梯度洗脱，也就是说梯度洗脱可以理解为是有无数个比例变化很小的等度洗脱的叠加。2.梯度洗脱的窄峰宽和等峰宽梯度洗脱的最大好处就是能够窄的峰宽，并且同一梯度内的峰宽都是一样的，为什么呢？http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/12/201512131830_577713_3047134_3.jpg如Figure 2b所示，梯度条件是 5-100% B ，梯度时间是20min，2a显示了梯度变化时，保留因子k（虚线）的变化以及峰宽（实线）的变化。在梯度开始时，有机相比例低，保留因子k最大，峰还停留在柱头，峰宽为0，随着有机相比例的增加，物质开始柱子内移动，有机相比例不断增加，k值也一直下降，物质在柱子中不断移动直到流出。峰1和峰2的保留时间虽然不一样，但其移动的模式是一样的，并且k的变化曲线也是一样的，所以在梯度洗脱条件下，其峰宽也是一样的。1梯度洗脱等于无限个等度洗脱figure 1a所示，条件是60%B的等度洗脱，我们会发现，在色谱的前端，峰并没有很好地分离，而在色谱的尾端，虽然峰分离的很好，但峰变的很宽。如果降低B的比例，前面的峰的可以得到分离，而后端的峰宽将会变的更宽；如果提高B的比例，后端的峰可以快速流出，峰宽也会窄一些，但前端的峰会更加难以分离，所以，遇到这种情况，很难用等度洗脱得到很好的分离。为什么会出现这种情况？通过计算，发现1a中样品的保留因子范围是0.934(34/0.9 ≈ 38),样品的极性差别很大，而通常等度洗脱的保留因子范围是120(20/1=20), 1a中保留因子的范围38远远大于20，所以是不适合用等度洗脱的。figure 1b,梯度洗脱的条件是 50-100% in 5 min，会发现不论是前端还是后端，峰都得到了很好的分离，并且峰宽几乎是一样的Figure 1c做了一个试验，将figure 1中分析的15种物质分成了5组，每组都是等度洗脱，B的比例分别是49%，61%，72%，80%和88%，每组的保留因子大概都是k等于3，峰宽也几乎一样，是不是和figure 1b很相似？如果将c中的等度洗脱的条件叠加，就是一个梯度洗脱，也就是说梯度洗脱可以理解为是有无数个比例变化很小的等度洗脱的叠加。2梯度洗脱的窄峰宽和等峰宽梯度洗脱的最大好处就是能够窄的峰宽，并且同一梯度内的峰宽都是一样的，为什么呢？如Figure 2b所示，梯度条件是 5-100% B ，梯度时间是20min，2a显示了梯度变化时，保留因子k（虚线）的变化以及峰宽（实线）的变化。在梯度开始时，有机相比例低，保留因子k最大，峰还停留在柱头，峰宽为0，随着有机相比例的增加，物质开始柱子内移动，有机相比例不断增加，k值也一直下降，物质在柱子中不断移动直到流出。峰1和峰2的保留时间虽然不一样，但其移动的模式是一样的，并且k的变化曲线也是一样的，所以在梯度洗脱条件下，其峰宽也是一样的。

一．简介在微流控芯片通道网络中，流体主要做层流流动，因此当两种或多种不同试剂流入同一通道时，各试剂能够保持各自流型不变，而只在相与相接触面上发生反应或分子扩散现象，形成的浓度梯度具有较高的稳定性和重现性，且通过改变通道网络的构型设计及初始液流的浓度和组合顺序，可以获得一系列复杂的浓度梯度,利用微流控浓度梯度芯片可以模拟外界环境，建立化学物质浓度梯度，在细胞以及个体水平上研究生物体对外界环境变化的反应。该技术已广泛应用于药物筛选,模式生物趋化，毒性评价等研究领域。二．应用领域药物筛选随着新药开发技术的发展，对新药化合物的活性实验从早期的验证性实验已经逐渐转变成筛选性实验，即所谓的药物筛选。借助于组合化学和计算化学的发展，人们开始有能力在短时间内合成和分离多种化合物，因而在现代新药开发过程中药物筛选已经成为新药开发过程中的重要环节之一。微流控浓度梯度芯片进行药物筛选实验时，与传统多孔板技术相比，省去了配置和分配多种药物不同浓度溶液的繁杂操作，大大简化了细胞铺板、上药、洗涤、标记等操作过程，在显著减少细胞和试剂耗量的同时,进行高通量地删选。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/07/201607011649_598843_3091062_3.png模式生物趋化模式生物能对液体和空气中传播的化学物质产生反应，感受到微摩尔浓度范围的水溶性引发剂和挥发性物质，从而产生趋向或回避行为。能否成功的提供可控的浓度梯度成为研究模式生物趋化行为的关键。微流控浓度梯度芯片能够自由控制和创建化学物质浓度梯度，形成浓度梯度时间短，提供的实验条件重复性高等特点，成为研究模式生物趋化行为的有利工具。file:///C:\Users\ADMINI~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps1223.tmp.pnghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/07/201607011650_598844_3091062_3.png毒性评价微流控浓度梯度芯片能够生成不同的化学因子浓度梯度作用于海洋微藻、斑马鱼等受试对象，通过受试对象在不同浓度化学因子刺激下，将其生化反应作为反馈信号进行化学因子毒性评价。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/07/201607011650_598845_3091062_3.png我们提供的浓度梯度芯片基于层流扩散的原理，形成的浓度梯度具有较高的稳定性和重现性，与传统的“圣诞树”型浓度梯度生成器生成的相对单一的浓度梯度不同，我们可以通过改变通道网络设计，生成包括线性、指数等多种浓度梯度。图1为线性八梯度芯片示意图，其中Input(A）为样本溶液入口，Input(B)为缓冲溶液入口，样本溶液次第向下与缓冲溶液混合形成浓度梯度，出口处浓度见表1。芯片上集成浓度梯度生成器的同时，可以按照客户需求集成多功能培养单元。在材料的选择方面，可以提供PMMA、玻璃、PDMS等多种材质供用户选择。 http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/07/201607011650_598846_3091062_3.png 图1.微流控线性八梯度芯片示意图 表1.线性八梯度浓度梯度芯片出口处浓度出口12345678浓度0(1/7)C(2/7)C(3/7)C(4/7)C(5/7)C(6/7)CC注：C为样本溶液浓度。表征结果使用PMMA材质的线性八梯度芯片进行荧光表征，图2为通入流量均为1μL/min的FITC水溶液和去离子水在芯片出口处形成的荧光图，使用Image-pro软件进行荧光强度分析。从图中可以看出，出口荧光强度保持良好的线性关系。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/07/201607011651_598847_3091062_3.pnghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/07/201607011652_598848_3091062_3.png 图2.线性八梯度芯片荧光表征使用说明1.Input(A)流量等于Input(B)流量;2.样本溶液与缓冲溶液为黏度相近的稀溶液;3.注液时需先将通道中注满缓冲溶液避免通道中产生气泡;4.入口流量小于2μL/min.