蛋白层析仪操作原理

请问：多糖疫苗的鉴定是如何做的？听说需要用到蛋白层析仪的。具体是怎么用呢？

[font=宋体]蛋白纯化介质主要应用于研究目的蛋白的结构、功用以及相互作用的和过程中。比如：在蛋白纯化过程中，由于[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析法[/b][/url]的选择性和结合力较强，分辨率也高。所以，亲和层析法是一种常用的蛋白、抗体纯化方法，天地人和生物多种简单易用的亲和纯化介质，适用于批量或利用重力进行纯化，可以高效、便捷、可靠地从品中分离蛋白和抗体，为下游应用提供有力保证。[/font][font=宋体][b]亲和层析法的原理：[/b][/font][font=宋体][font=宋体]亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原，激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等，具有高效、简单、快速的优点，是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][b][font=宋体][font=宋体]亲和层析的操作步骤[/font][font=Calibri]:[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在亲和层析中，蛋白在影响蛋白[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]或标签[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]与其配体之间结合的条件下被加载到柱子上。在不破坏特定相互作用但能破坏污染蛋白与固定相之间任何非特异性相互作用的条件下洗涤结合的蛋白。然后用含有竞争性分子的缓冲液或破坏所有蛋白[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]蛋白相互作用的条件洗脱结合的蛋白。竞争分子与配体结合，取代目标蛋白，这种竞争分子通常通过另一种色谱流程或透析法从目标蛋白中去除。[/font][/font][font=宋体] [/font][table][tr][td][b][font=微软雅黑][color=#232323]亲和层析配体和洗脱条件[/color][/font][/b][/td][td][font=微软雅黑] [/font][/td][td][font=微软雅黑] [/font][/td][/tr][tr][td][b][font=微软雅黑][color=#232323]需纯化的蛋白[/color][/font][/b][/td][td][b][font=微软雅黑][color=#232323]配体[/color][/font][/b][/td][td][b][font=微软雅黑][color=#232323]洗脱条件[/color][/font][/b][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]抗体（抗原特异性）[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]抗原肽[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]游离肽[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]多聚组氨酸标签蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]Ni2+或Co2+[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]咪唑或游离组氨酸[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]FLAG标签蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]FLAG特异性抗体[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]FLAG肽或低pH值[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]GST标签蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]还原型谷胱甘肽[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]游离谷胱甘肽[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]Myc标签蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]Myc特异性抗体[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323][font=微软雅黑]低[/font][font=微软雅黑]pH[/font][/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]抗体（类特异性）[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323][font=微软雅黑]蛋白[/font][font=微软雅黑]A、G和L或精蛋白[/font][/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]pH极端值[/color][/font][/td][/tr][tr][td][font=微软雅黑][color=#232323]DNA结合蛋白[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]肝素[/color][/font][/td][td][font=微软雅黑][color=#232323]高离子强度[/color][/font][/td][/tr][/table][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac[/font][/font]

[font=宋体][font=宋体]亲和层析是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原，激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等，具有高效、简单、快速的优点，是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析纯化步骤：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、捕获阶段[/font][/font][font=宋体]在样品捕获阶段，通过将速度和容量进行优化组合，使样品中的目标产物被有效的分离、浓缩和稳定化处理。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]捕获阶段一般选择亲和层析，离子交换层析或者疏水层析，通过吸附作用使样品和杂质实现分离。如果样品带有标签，第一步可以选择标签蛋白亲和层析；如果样品不带有标签，可以考虑使用离子交换[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]疏水层析。由于捕获阶段一般样品量较大，杂质较多，所以捕获阶段分辨率不是特别主要考虑的因素，可以主要考虑增加上样量和速度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、中度纯化阶段[/font][/font][font=宋体]在中度纯化阶段，应将注意力集中于将目标样品和大多数大体积的杂质分开。在中度纯化阶段，速度不是最重要的因素，因为经过捕获阶段样品体积会缩减。中度纯化阶段一般建议使用离子交换层析或者疏水层析进一步提高样品的纯度。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、精细纯化阶段[/font][/font][font=宋体]在精细纯化阶段，关注的重点就是如何达到高分辨率，从而完成最终的纯化。在此前的步骤中已经去除了大部分的污染物和杂质。如果需要达到较高的分辨率，可能会在此步骤造成一些回收率的损失。精细纯化阶段一般建议使用高分辨率的分子筛或者高分辨率的离子交换层析柱。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析纯化优缺点：[/b][/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加 稳定，其结果提高了活性回收率。此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化，配基与载体耦联条件激烈等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以参看义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化蛋白[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac[/font][/font]

请问一下,有没有用过国产液相色谱层析仪来纯化蛋白质的?仪器的性能如何?上海沪析好象有,但以前用的是pharmacia的AKTA,不知道国产的能不能用,不敢买,大家给提供一下意见吧

目的要求（1）了解克隆基因表达的方法和意义。（2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。实验原理克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在 37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。试剂和器材一、试剂 LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL. 氨苄青霉素：100mg/mL 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0 Washing Buffer：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0 IPTG二、器材摇床，离心机，层析柱（1′10 cm）操作方法一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中（含100ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h.4. 12，000rpm 离心10 min, 弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化1. NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mL NTA介质，并分别用8mL 去离子水，8mL上样缓冲液洗涤。2. 重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液, 用吸管抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品60min, 4℃ 12000rpm 离心 30 min, 将上清吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取10ul 上清样品用于SDS-PAGE 分析。3. 上清样品以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱，收集流出液，取10ul样品用于SDS-PAGE 分析。4. 洗脱杂蛋白：用Washing Buffer以10-15mL/h流速洗柱，直至OD280 = 0.01.分步收集洗脱液，约3-4h,取10ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE 分析。5. 洗脱目标蛋白：用Elution Buffer洗柱，收集每1 mL 级分，分别取10ul样品用于SDS-PAGE 分析。

[font=宋体]蛋白纯化介质在研究目的蛋白的结构、功能以及相互作用过程中起着至关重要的作用。亲和层析法因其出色的选择性、结合力和分辨率，成为一种常用的蛋白和抗体纯化方法。义翘神州提供的多种亲和纯化介质，不仅简单易用，而且适用于批量操作或重力驱动的纯化过程。这些介质能够高效、便捷、可靠地分离蛋白和抗体，为下游应用提供了强有力的支持，确保实验结果的可靠性和重复性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析法的原理[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]亲和层析法是利用生物大分子与特定分子间特异性、可逆结合的特性，实现生物大分子的分离。作为蛋白质分离的有效手段，通常仅需一步操作，即可获得高纯度的蛋白质。在亲和层析中，蛋白质的分离基于其与特定配体的特异性相互作用，而非共价结合的能力。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]凝胶过滤层析，又称分子筛层析法，是一种独特的蛋白质分离和纯化技术。当样本流经葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶等介质时，这些介质根据蛋白质的大小和形状进行筛选。经过这一过程，目的蛋白得以纯化，为后续的下游应用提供了高质量的原料。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析操作步骤：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在进行亲和层析时，需将蛋白在适宜的条件下加载至柱子上，确保蛋白（或标签）与其配体之间能够发生特异性结合。随后，通过洗涤步骤，清除与固定相发生非特异性结合的污染蛋白，同时保持蛋白与配体之间的特异性相互作用不受干扰。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]接下来，采用含有竞争性分子的缓冲液进行洗脱，竞争性分子能够与配体结合，从而将目标蛋白从柱子上取代下来。这一步中，竞争分子通常会在后续的色谱流程或透析处理中予以去除。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]通过以上步骤，亲和层析成功实现了目标蛋白的纯化和分离，为后续的实验和应用提供了高质量的原料。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情请关注：[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化蛋白[/b][/url][/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac[/font][/font][font=Calibri] [/font]

[font=宋体]层析法无疑是下游处理中主要和常用的操作，因为层析法相比其他单元操作具有某些优势。例如层析法支持高分辨率的效率，可以分离分子性质非常相似的复杂粗制混合物。此外，层析法是生物工艺中遇到的稀释溶液中捕获分子的理想选择。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]柱色谱法[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]层析法[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]的原理是将一个大的蛋白池分离成许多小的蛋白池，其中一些富集了目标蛋白。虽然柱色谱法有昂贵的专业设备，但只需要基本的设备就可以了。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在所有色谱技术中，亲和层析法占主要地位。事实上，亲和层析是最特异、最有效的蛋白纯化技术，为靶蛋白纯化提供了合理的依据。它利用了生物分子识别的原理，即生物活性大分子与亲和配体形成特定的可逆复合物的能力。随着高价值蛋白的传统纯化方案被基于亲和色谱等先进的方法所取代，人们的关注重点转向了设计和选择具有高亲和力和特异性的配体。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]从用于生化表征的浓缩蛋白提取物的制备到治疗性重组蛋白的大规模生产，任何纯化过程都需要经济且足量地获得纯化蛋白。因此，下游处理面临的挑战是高产能、高分辨率和高成本效率。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]亲和层析法适用于基于高特异性相互作用的生化混合物的分离。在纯化过程中可以利用具有明确特性的靶蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析法[/b][/url]是一种常见的蛋白纯化方法，该方法基于与离子交换器的亲和力分离离子和极性分子。可溶性分子在通过色谱柱时与带相反电荷的不溶性固定相结合。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]尺寸排阻色谱法，根据分子的大小和分子量分离分子。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]疏水作用层析分离表面有疏水氨基酸侧链的靶蛋白，与疏水基团相互作用并结合在一起。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]蛋白纯化的原理为：不同蛋白质的氨基酸序列及空间结构不同，导致其在物理、化学、生物学等性质上存在差异，利用待分离蛋白质与其它蛋白质性质上的差异，即可以设计出一套合理的蛋白纯化方案。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段两个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]等分开，常用的方法为硫酸铵沉淀法。精细纯化阶段的目的是把目的蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来，[b]常用的方法有：凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等。[/b][/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]凝胶过滤层析[/b][/font][font=宋体]凝胶过滤（也叫排阻层析或分子筛）是一种根据分子大小从混合物中分离蛋白质的方法。不同蛋白的形状及分子大小存在差异，在混合物通过含有填充颗粒的凝胶过滤层析柱时，由于各种蛋白的分子大小不同，扩散进入特定大小孔径颗粒内的能力也各异，大的蛋白分子会被先洗脱出来，分子越小，越晚洗脱，从而达到分离蛋白的目的。一般来说，凝胶过滤层析柱越细、越长纯化的效果越好。凝胶过滤层析详细介绍[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]凝胶过滤层析所能纯化的蛋白分子量范围很宽，纯化过程中也不需要能引起蛋白变性的有机溶剂。缺点是所用树脂有轻度的亲水性，电荷密度较高的蛋白容易吸附在上面，不适宜纯化电荷密度较高的蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换层析[/b][/font][font=宋体][font=宋体]离子交换层析是一种依据蛋白表面所带电荷量不同进行蛋白分离纯化的技术。蛋白表面通常会带有一定的电荷，电荷的氨基酸残基均匀地分布在蛋白质的表面，在一定条件下可以与阳离子交换柱或阴离子交换柱结合。这种带电分子与固定相之间的结合作用是可逆的，在改变[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]或者用逐渐增加离子强度的缓冲液洗脱时，离子交换剂上结合的物质可与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。由于不同物质的电荷不同，其与离子交换剂的结合能力也不同，所以被洗脱到溶液中的顺序也不同，从而达到分离的效果。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析[/b][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化[/b][/url]是利用生物大分子物质具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性进行蛋白纯化的技术。该方法适用于从成分复杂且杂质含量远大于目标物的混合中提纯目标物，具有分离效果好、分离条件温和、结合效率高、分离速度快的优点。亲和层析技术可以利用配基与生物分子间的特异性吸附来分离蛋白，也可以在蛋白上加入标签，利用标签与配基之间的特异性结合来纯化蛋白。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]疏水作用层析[/b][/font][font=宋体][font=宋体]疏水作用层析是利用盐[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]水体系中样品分子的疏水基团和层析介质的疏水配基之间疏水力的不同而进行分离的一种层析方法。该法利用了蛋白的疏水性，蛋白经变性处理或处于高盐环境下疏水残基会暴露于蛋白表面，不同蛋白疏水残基与固定相的疏水性配体之间的作用强弱不同，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水用作由弱至强的组分分离。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification[/font][/font]

[font=宋体][font=宋体]离子交换层析[/font][font=Calibri](IEX)[/font][font=宋体]是一种主要基于蛋白净电荷的色谱分离方法，通常用于追踪脱酰胺和琥珀酰亚胺的形成。[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]有两种类型：阳离子交换和阴离子交换层析法。当缓冲液[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值高于此[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]时，蛋白带负电（阴离子）；当[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值低于此[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]时，蛋白带正电（阳离子）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]所有蛋白都表现出净电荷，这取决于蛋白氨基酸组成和任何共价连接的修饰。蛋白净电荷受溶解它的溶剂[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]所影响，因为溶剂会与蛋白进行氢离子交换。通常情况下，蛋白与[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]的结合必须通过反复试验来确定，使用一系列[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值的溶剂以确定蛋白保留的最佳[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]。通常溶剂的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值与[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]相差约一个[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]单位就足以实现蛋白结合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换层析优缺点介绍：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]离子交换层析法是一种常用的分离分析技术，具有分离效率高、操作简单、可靠性高、灵敏度高等优点。其优点如下：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]分离效率高：离子交换层析法可以快速、有效地分离各种生物分子和配体，对于复杂的生物样品可以获得较高的分离效果。[/font][font=宋体]操作简单：离子交换层析法的操作相对简单，不需要过多的手动操作，可以自动化进行，减少了人为误差。[/font][font=宋体]可靠性高：离子交换层析法的分离过程相对稳定，分离结果重现性好，可以用于大规模的分离分析。[/font][font=宋体]灵敏度高等优点：离子交换层析法对于低浓度的样品也能够获得较好的分离效果，对于痕量物质的分离和鉴定具有重要意义。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]但是，离子交换层析法也存在一些缺点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]生产率低：离子交换层析法的生产率相对较低，对于大规模的分离分析可能不太适合。[/font][font=宋体]需要使用大量的缓冲液和洗脱液：离子交换层析法需要使用大量的缓冲液和洗脱液，对于环境保护有一定的影响。[/font][font=宋体]对样品条件要求严格：离子交换层析法对于样品的条件要求比较严格，对于不同性质的样品需要使用不同的离子交换剂和分离条件。[/font][font=宋体]总的来说，离子交换层析法是一种有效的分离分析方法，但是也存在一些缺点，需要根据具体的实验条件和要求进行选择和使用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多关于[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification]蛋白层析纯化[/url]详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification[/font][/font]

[font=宋体][b]离子交换层析基本原理：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]离子交换层析法是蛋白纯化的一种方式，通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换，从而达到分离纯化的目的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]离子交换层析法主要依据电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法的应用很广泛。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换层析的介质：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]有许多离子交换介质都已经商品化，但不存在一种神奇的介质其最适合各种蛋白质的纯化。选择离子交换介质的标准包括应用的特异性需要、样品成分的等电点和分子大小（即目的蛋白和污染物），以及可得到的装备（如泵和柱子）。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]首先需要选择阴离子或阳离子介质，如果目的蛋白的等电点已知，选择阴离子介质且操作的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]高于目的蛋白的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]，或选择阳离子介质且操作[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]低于目的蛋白的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]。如果靶蛋白的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]未知，开始之前最好先测定它。最佳操作[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]可根据经验确定。因为大多数蛋白质的[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]低于[/font][font=Calibri]7[/font][font=宋体]，选择阴离子交换和操作[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]为[/font][font=Calibri]8.5[/font][font=宋体]开始是合理的，然后根据估计结果和优化条件。知道蛋白质溶液中污染物[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]和结合特征也是有用的。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]离子交换层析应用：[/b][/font][font=宋体][font=宋体]离子交换层析法是生物纯化中应用最广泛的色谱模式，应用于大多数下游处理平台。在[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]中结合目标蛋白、洗脱柱子和洗脱目标蛋白的典型方案被称为“结合[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]洗脱模式”，经常应用于中间纯化步骤如抗体的下游处理。阴离子交换层析是大多数血浆蛋白纯化平台的组成部分如凝血因子[/font][font=Calibri]VIII[/font][font=宋体]的纯化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]离子交换层析（[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]）具体操作步骤：[/font][/b][/font][font=宋体]平衡[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]第一步是固定相的平衡。当达到平衡时，所有的固定相带电基团都与可交换的平衡离子结合，如氯或钠。选择起始缓冲液的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]和离子强度，以确保目标蛋白与介质的结合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]上样和清洗[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]第二步的目标是结合目标分子，并清洗出所有未结合的物质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]洗脱[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]随着离子强度的增加，在选定的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值下净电荷最低的蛋白将最先从柱子上洗脱。同样地，在一定[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值下电荷最高的蛋白被保留得最牢固，并且在最后被洗脱。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]再生[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]最后用高离子强度的缓冲液进行最后一次清洗，使色谱柱再生，并去除任何仍结合的分子。然后在开始下一次运行之前，色谱柱需要在起始缓冲液中重新平衡。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析蛋白纯化[/b][/url]详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec[/font][/font]

[font=宋体]在生物科学领域，蛋白质纯化是一项关键的技术，它对于研究生物分子的结构和功能至关重要。凝胶过滤层析是一种常用的蛋白质纯化技术，它具有分辨率高、分离效果好的优点。本文将介绍用凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程，包括实验准备、样品处理、层析柱的制作和上样、洗脱和收集等步骤。通过学习本文，读者可以了解凝胶过滤层析在蛋白纯化中的应用及其优缺点，为后续的实验和研究提供参考。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]用凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程，主要分为以下步骤：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]准备凝胶柱：选择适当的凝胶材料和柱子，根据待纯化蛋白的分子大小选择合适的孔径。[/font][font=宋体]杂质去除：使用缓冲液预先洗脱凝胶，去除其中的杂质和阻塞物。[/font][font=宋体]样品加载：将待纯化的蛋白溶液加载到凝胶柱中，注意保持柱子的垂直姿势，防止样品泄漏。[/font][font=宋体]洗脱：使用缓冲液进行洗脱，以去除非目标蛋白和杂质。[/font][font=宋体]收集纯化蛋白：收集洗脱液，进行后续的分析或使用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]以上步骤只是粗略的概述，实际操作时还需要注意许多细节和技巧。例如，选择合适的凝胶类型和柱子对纯化效果有很大影响；样品加载时需要防止样品泄漏；洗脱时需要选择合适的缓冲液等。因此，建议在进行实验前仔细阅读相关文献和资料，并请教有经验的实验人员。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]凝胶过滤层析（[/font][font=Calibri]Gel Permeation Chromatography[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]）具有以下优点：[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①操作条件温和：[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]不需要使用有机溶剂等强烈的条件，因此对样品的活性影响较小。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②高分离效果：[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]可以分离不同分子量的蛋白质，且分辨率较高，能够实现样品的较纯分离。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③重复性好：[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]的层析柱可以重复使用，分离效果稳定，有利于提高实验的可重复性和数据可靠性。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]④适用范围广：[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]可用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸等的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在应用方面，[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]被广泛应用于蛋白质和其他生物分子的分离纯化。例如，从混合物中分离纯化蛋白质、去除蛋白质中的盐和缓冲剂、脱去多糖和脂质等杂质、对蛋白质进行分子量测定等。此外，[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]还可以用于分离合成多肽和基因克隆产物的纯度鉴定等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]总之，凝胶过滤层析具有温和的操作条件、高分离效果、重复性好等优点，被广泛应用于蛋白质和其他生物分子的分离纯化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]详情可以关注：义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification][b]蛋白层析纯化[/b][/url][/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification[/font][/font]

计划购买一台中压层析仪，不知道哪些牌子的好点，主要做天然药物分离

一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理及其应用。2. 通过测定蛋白质分子量的训练，初步掌握凝胶层析技术。二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。它广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近于球形）具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。分离原理参见“理论部分的凝胶层析一节”。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。凝胶层析分离原理示意动画。对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0～100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示，Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关：Kav = (Ve－V0)/(Vt－V0) ----------- (1)在限定的层析条件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是随着分离物分子量的变化而改变。分子量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小Ve值大，Kav值大。有关凝胶层析柱中凝胶自身（基质）体积（Vg）、外水体积（V0）、内水体积（Vi）及柱床总体积（Vt）的参见示意图。凝胶层析柱中的几种层析峰。有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子量的一个依据。在相同层析条件下，被分离物质Kav值差异越大，分离效果越好。反之，分离效果差或根本不能分开。在实际的实验中，我们可以实测出Vt、V0及Ve的值，从而计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶，在一定的分子量范围内，Kav与logMw (Mw表示物质的分子量) 成线性关系：Kav ＝－b logMw + C --------- (2)其中 b,C为常数。同样可以得到：Ve ＝－b'logMw + C' --------- (3)其中 b', C'为常数。即 Ve 与 logMw 也成线性关系。我们可以通过在一凝胶柱上分离多种已知分子量的蛋白质后，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后用同一凝胶柱测出其它未知蛋白的分子量。三、器材与试剂（一）器材1. 玻璃层析柱（(20mm×60cm）2. 恒流泵（或下口恒压贮液瓶）3. 自动部分收集器4. 紫外分光光度计5. 100ml试剂瓶6. 1000ml量筒7. 250ml烧杯8. 50ml、100ml烧杯9. 10ml（或5ml）刻度试管（二）试剂1. 标准蛋白（1）牛血清白蛋白：Mw=67,000（上海生化所）（2）鸡卵清清蛋白：Mw=45,000（美国SIGMA公司）（3）胰凝乳蛋白酶原A：Mw=24,000（美国SIGMA公司）（4）溶菌酶：Mw =14,3002. 未知蛋白质样品：由实验室准备3. 0.025M KCl－0.1M HAC(乙酸)（洗脱液1000ml）4. 蓝色葡聚糖－2000

主要是做反应中间产物的分离和鉴定。把反应体系中的有机物提出来，进行核磁、红外等分析，确定最后的物质结构。需要的量不多，我想也就是几十毫克，顶多100毫克级别的吧。查了下文献，发现可以用半制备色谱，也有用自动层析仪的。由于对这些仪器都没有什么概念，也不知道如何选择。希望这个功能实现，比较方便，不用操作那么麻烦。因为我们的主要核心研究不是 这个有机物提取。我们主要做有机物的质谱分析的。自动层析仪好像也就2-3万左右，我们这有一台闲置的LC100分析性液相色谱，如果要改造成半制备性，可能也要往里投钱。所以想请有经验的能否指导一二。

亲和层析法是一种利用共价连接有特异配体的层析介质来分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的技术。其原理主要包括以下几个步骤： ??配基固定化?：配基与载体偶联，结合成具有特异亲和性的分离介质。这一步骤是亲和层析的核心，通过化学方法将具有特定亲和性的配体共价连接到载体上，形成固定的相。??吸附样品?：将待分离的蛋白质混合物通过层析柱，目标蛋白会特异性地结合到固定化的配体上，而其他非目标蛋白则随流动相流出层析柱。?样品解吸?：通过改变流动相的条件（如pH值、离子强度等），使结合在配体上的目标蛋白解吸下来，从而实现分离。

层析柱过滤蛋白的 它的过滤膜怎么选择？

[font=宋体]蛋白质是包括人类在内的各种生物有机体的重要组成成分，是生命的物质基础之一。生物体的生长、发育、遗传和繁殖等一切生命活动都离不开蛋白质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的不断深入，人们意识到仅仅依靠基因组的序列分析来试图阐明生命活动的现象和本质是远远不够的。只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究，才能更科学地掌握生命现象和活动规律，更完善地揭示生命的本质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]由此许多学者将生命科学领域的研究焦点从基因转向蛋白质，使蛋白质成为揭示生命活动现象和分子生物学机理的重要研究对象。研究蛋白质首要的步骤是将目的蛋白从复杂的大分子混合物中分离纯化出来，得到高纯度具有生物学活性的目的物。因此，高效的纯化技术和手段是蛋白质研究的重要基础和关键之一。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的目的[/font] [/font][/b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的目的是将目标蛋白质从细胞裂解液的全部组分中分离出来，同时仍保留蛋白的生物学活性及化学完整性。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，需根据蛋白的特性选择合适的纯化方法来提高获得的蛋白制品的纯度。[/font] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的原理[/font] [/font][/b][font=宋体][font=宋体]不同蛋白质的氨基酸序列及空间结构不同，导致其在物理、化学、生物学等性质上存在差异，利用待分离蛋白质与其它蛋白质性质上的差异，即可以设计出一套合理的蛋白纯化方案。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段两个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如[/font] [font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]DNA [/font][font=宋体]等分开，常用的方法为硫酸铵沉淀法。精细纯化阶段的目的是把目的蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来，[/font][/font][b][font=宋体][font=宋体]常用的方法有：凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等。[/font] [/font][/b][font=宋体] [/font][b][font=宋体]①[/font][font=宋体]凝胶过滤层析[/font][/b][font=宋体]凝胶过滤层析（又叫做分子筛）是根据样品的分子大小对样品进行分离的一种简单温和的层析技术。凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析，是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。不同于离子交换层析和亲和层析，凝胶过滤的层析样品不与层析柱料结合，因此，缓冲液成分不直接影响分辨率。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]原理：层析柱中的填料是球状颗粒的惰性的多孔网状结构的柱料，多是交联的聚糖[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]如葡聚糖或琼脂糖[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]类物质。在加入样品之后，样品中的小分子物质能进入球状填料内部，在柱子中停留时间较长；而大分子物质不能进入球状填料内部，停留时间较短。所以当样品经过凝胶过滤层析柱分离后，样品中的不同分子大小的物质就可以被分离开了。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]根据分子大小和形状进行分离[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]是一种非吸附的分离方式[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]缓冲液成分不直接影响分辨率，只需要一种缓冲液[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]操作便捷[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]②[/font][font=宋体]离子交换层析[/font][/b][font=宋体]离子交换层析是目前蛋白质分离纯化中应用最广泛的方法之一。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]原理：不同蛋白等电点差异，分子大小差异，在同一个流动相中电荷密度分布不同，电荷量不等，与具有相反电荷的离子交换介质结合强度不同，在流动相洗脱时保留时间不同，从而得以分离。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]根据分子大小和等电点差异进行分离[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]灵敏度高，重复性，选择性好，分析速度快[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]③[/font][font=宋体]疏水层析[/font][/b][font=宋体]原理：疏水层析是依据蛋白质疏水性差异分离的。即根据蛋白质和疏水介质表面的疏水基团的可逆相互作用进行分离。蛋白的疏水性在高离子强度下被增强，因此在高离子强度环境中结合，通常采用降低离子强度的方式进行洗脱。独特的吸附分离模式使得疏水层析成为硫酸铵盐析后或离子交换高盐洗脱后理想的纯化方式。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]采用了盐的水溶液作为流动相，色谱条件温和，生物大分子的活性回收率很高。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白质在[/font][font=Calibri]HIC[/font][font=宋体]操作过程中是高盐上样，低盐洗脱（高盐浓度的样品不必作处理就可直接上样）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在一次色谱中可同时实现出去盐酸胍、蛋白质复性和分离三个目的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]温度升高，蛋白质天然折叠伸展，暴露出更多内部疏水集团，使蛋白质的[/font][font=Calibri]HIC[/font][font=宋体]保留发生变化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]色谱填料稳定性好，盐水体系作流动相无环境污染。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]④[/font][font=宋体]亲和层析[/font][/b][font=宋体][font=宋体]原理：[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析[/b][/url]是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原，激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等，具有高效、简单、快速的优点，是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以参看蛋白纯化技术[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]方法：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-techniques[/font][/font][font=Calibri] [/font]

核酸蛋白检测仪是层析分析的主要装置，核酸蛋白检测仪配上层析柱、恒流泵、部分收集器、层析谱分析系统（根据需要选配）和电脑打印设备即构成一套完整的核酸蛋白检测仪分离层析系统。它是当今从事生命科学研究、药物测定、化工、食品科学及医学研究等行业的现代分析实验仪器。核酸蛋白检测仪分析系统广泛用于工业、农业、科研和大专院校的科学研究和教学实验。其原理是根据物质（样品）对紫外光有明显吸收的特征，实现对样品成份含量比对分析，以便进行样品蛋白、核酸物质识别检测和含量测定。在生化分析、环保科学、食品研究、毒理研究、新药开发等领域中对核酸、蛋白检测、纯化和提取提供了一种独特的分析手段。

请教：疏水层析和反相层析相比对蛋白质吸附能力较弱？？原文大意如下——疏水等系和反相层析的原理都是利用疏水作用分离蛋白质、多肽的但是二者使用的介质和流动相有一定的差别其中疏水层析介质的极性反相层析介质的极性所以疏水层析的介质对于蛋白质的吸附能力较弱 可以使用温和的盐水就可以洗脱但是反相层级的介质极性较弱 需要更强的有机溶剂洗脱之【问题是——蛋白质应该是水溶性的啊？ 应该是和极性更强的疏水层析介质接近 继而疏水层析介质对蛋白质的吸附能力更强？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？？】 [em0808]

亲和层析法是一种利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的层析技术。其基本原理是通过将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。?

主要是做反应中间产物的分离和鉴定。把反应体系中的有机物提出来，进行核磁、红外等分析，确定最后的物质结构。需要的量不多，我想也就是几十毫克，顶多100毫克级别的吧。查了下文献，发现可以用半制备色谱，也有用自动层析仪的。由于对这些仪器都没有什么概念，也不知道如何选择。自动层析仪好像也就2-3万左右，我们这有一台闲置的LC100分析性液相色谱，如果要改造成半制备性，可能也要往里投钱。所以想请有经验的能否指导一二。非常感谢！

希望大家能给点儿关于硅胶柱层析方面的知识及自动液相层析仪的使用方法，谢谢~~

[font=宋体][b]亲和层析技术的原理：[/b][/font][font=宋体][font=宋体]亲和分析是利用生物聚合物与基础可逆结合的原理，通过共价键将基础与载体牢固结合而成的分析系统。这种可逆结合的作用主要取决于生物聚合物对其基础的空间结构的识别。受体蛋白、载体蛋白、外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体、核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等。它具有高效、简单、快速的优点，是目前分离纯化蛋白质最理想的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在亲和色谱中，在影响蛋白质（或标签）与其配体结合的情况下，将蛋白质装载在柱子上。在不破坏特定相互作用但能破坏污染蛋白质与固定相互作用的情况下，清洗组合蛋白质。然后用含有竞争性分子的缓冲液或破坏所有蛋白[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]蛋白相互作用的条件洗脱结合的蛋白。竞争分子与配体结合，取代目标蛋白，这种竞争分子通常通过另一种色谱流程或透析法从目标蛋白中去除。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和色谱配体和条件[/b][/font][font=宋体]需纯化的蛋白[/font][font=宋体]配体[/font][font=宋体]洗脱条件[/font][font=宋体]抗体（抗原特异性）[/font][font=宋体]抗原肽[/font][font=宋体]游离肽[/font][font=宋体]多聚组氨酸标签蛋白[/font][font=宋体][font=Calibri]Ni2+[/font][font=宋体]或[/font][font=Calibri]Co2+[/font][/font][font=宋体]咪唑或游离组氨酸[/font][font=宋体][font=Calibri]FLAG[/font][font=宋体]标签蛋白[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]FLAG[/font][font=宋体]特异性抗体[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]FLAG[/font][font=宋体]肽或低[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]标签蛋白[/font][/font][font=宋体]还原型谷胱甘肽[/font][font=宋体]游离谷胱甘肽[/font][font=宋体][font=Calibri]Myc[/font][font=宋体]标签蛋白[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]Myc[/font][font=宋体]特异性抗体[/font][/font][font=宋体][font=宋体]低[/font][font=Calibri]pH[/font][/font][font=宋体]抗体（类特异性）[/font][font=宋体][font=宋体]蛋白[/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]G[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]L[/font][font=宋体]或精蛋白[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]极端值[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]结合蛋白[/font][/font][font=宋体]肝素[/font][font=宋体]高离子强度[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和纯化蛋白的注意点：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]a. Ni[/font][font=宋体]柱进行蛋白纯化时注意点：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：[/font][font=Calibri]NH4[/font][font=宋体]，甘氨酸，精氨酸，等等；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]各种缓冲液中不能有强螯合剂，如[/font][font=Calibri]EDTA[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]EGTA[/font][font=宋体]，等等；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，，比如[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]，防止二价[/font][font=Calibri]Ni[/font][font=宋体]被还原；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4) [/font][font=宋体]不能含离子型的去垢剂，比如[/font][font=Calibri]SDS[/font][font=宋体]，防止[/font][font=Calibri]Ni[/font][font=宋体]流失；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](5)[/font][font=宋体]在破碎细胞的时候建议加入蛋白酶抑制剂，比如[/font][font=Calibri]0.1-1mM[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]PMSF[/font][font=宋体]，防止目的蛋白被降解；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](6)[/font][font=宋体]缓冲液里可以加入甘油，防止蛋白之间由于疏水相互作用而发生聚集沉淀，甘油浓度最高可达[/font][font=Calibri]50%[/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]v/v[/font][font=宋体]）[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](7)[/font][font=宋体]应避免含碳酸氢钠，柠檬酸等物质；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](8)[/font][font=宋体]缓冲液里[/font][font=Calibri]NaCl[/font][font=宋体]的浓度应在[/font][font=Calibri]300mM[/font][font=宋体]到[/font][font=Calibri]2M[/font][font=宋体]之间；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](9)[/font][font=宋体]可加入变性剂促溶，盐酸胍（最高可[/font][font=Calibri]6M[/font][font=宋体]），尿素（最高可[/font][font=Calibri]8M[/font][font=宋体]）[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](10)[/font][font=宋体]可加入非离子型去垢剂，如[/font][font=Calibri]Triton[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]Tween[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]NP40[/font][font=宋体]等，最高[/font][font=Calibri]2%[/font][font=宋体]，可以减少背景蛋白污染和去除核酸污染；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]b. gst[/font][font=宋体]柱进行蛋白纯化时注意点[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]在细胞裂解时，加入终浓度[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]10 mM DTT[/font][font=宋体]可以显著提高[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]融合蛋白的结合效率， 在[/font][font=Calibri]Binding Buffer[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]中加入[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]10 mM DTT[/font][font=宋体]，可以提高蛋白纯度，但是会导致其产率降低[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]超声太剧烈或时间过长会引起蛋白变性，导致蛋白不能与介质结合。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]在[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值低于[/font][font=Calibri]6.5[/font][font=宋体]或高于[/font][font=Calibri]8.0[/font][font=宋体]结合效率会降低，使用前需用[/font][font=Calibri]pH6.5[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]8.0[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]Buffer[/font][font=宋体]如[/font][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]进行平衡；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4)[/font][font=宋体]增大[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值。[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值调至[/font][font=Calibri]pH 8[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]9[/font][font=宋体]可以提高洗脱效率而不需要增加[/font][font=Calibri]glutathione[/font][font=宋体]的浓度；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](5)[/font][font=宋体]增加[/font][font=Calibri]Elution Buffer[/font][font=宋体]的离子强度。加入[/font][font=Calibri]0.1[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]0.2 M NaCl[/font][font=宋体]能提高洗脱效率；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](6)Elution Buffer[/font][font=宋体]中加入非离子型变性剂。非特异性的疏水作用可能会阻碍[/font][font=Calibri]GST[/font][font=宋体]融合蛋白从介质上增溶和洗脱。加入[/font][font=Calibri]0.1% Triton X-100 or 2% N-octylglucoside[/font][font=宋体]可以显著增加洗脱效率[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]c. proteinA[/font][font=宋体]柱进行蛋白纯化时注意点[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri](1)[/font][font=宋体]介质的选择[/font][font=Calibri]A,G or [/font][font=宋体]其他，其结合能力的选择[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](2)[/font][font=宋体]上样流速尽量小，让[/font][font=Calibri]Protein G[/font][font=宋体]和抗体有充分的结合时间[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](3)[/font][font=宋体]在低[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值洗脱后，快速中和。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](4)[/font][font=宋体]长时间保存加入[/font][font=Calibri]0.02-0.05[/font][font=宋体]％叠氮钠；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](5)[/font][font=宋体]加入[/font][font=Calibri]10%[/font][font=宋体]甘油，可有效防止疏水作用引起的聚集。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri](6)[/font][font=宋体]抗体纯度不够，杂蛋白含量高，易引起蛋白的沉淀。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]目前义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service]重组蛋白表达服务[/url]，包含[/font][font=Calibri]VLP[/font][font=宋体]形式的膜蛋白表达服务、原核（[/font][font=Calibri]E. coli[/font][font=宋体]）蛋白表达服务、哺乳动物细胞瞬时表达服务、杆状病毒[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]昆虫细胞蛋白表达服务、稳定细胞系构建服务等，想咨询蛋白纯化服务的用户，可以直接[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service[/font][/font]

[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析[/b][/url][/font][font=Calibri](IEX)[/font][font=宋体]是一种主要基于蛋白净电荷的色谱分离方法，通常用于追踪脱酰胺和琥珀酰亚胺的形成。[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]有两种类型：阳离子交换和阴离子交换层析法。当缓冲液[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值高于此[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]时，蛋白带负电（阴离子）；当[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值低于此[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]时，蛋白带正电（阳离子）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]所有蛋白都表现出净电荷，这取决于蛋白氨基酸组成和任何共价连接的修饰。蛋白净电荷受溶解它的溶剂[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]所影响，因为溶剂会与蛋白进行氢离子交换。通常情况下，蛋白与[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]的结合必须通过反复试验来确定，使用一系列[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值的溶剂以确定蛋白保留的最佳[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]。通常溶剂的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值与[/font][font=Calibri]pI[/font][font=宋体]相差约一个[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]单位就足以实现蛋白结合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]离子交换层析（[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]）具体操作步骤：[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]平衡[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]第一步是固定相的平衡。当达到平衡时，所有的固定相带电基团都与可交换的平衡离子结合，如氯或钠。选择起始缓冲液的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]和离子强度，以确保目标蛋白与介质的结合。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]上样和清洗[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]第二步的目标是结合目标分子，并清洗出所有未结合的物质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]洗脱[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]随着离子强度的增加，在选定的[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值下净电荷最低的蛋白将最先从柱子上洗脱。同样地，在一定[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值下电荷最高的蛋白被保留得最牢固，并且在最后被洗脱。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]再生[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]最后用高离子强度的缓冲液进行最后一次清洗，使色谱柱再生，并去除任何仍结合的分子。然后在开始下一次运行之前，色谱柱需要在起始缓冲液中重新平衡。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]以上是对离子交换层析原理和步骤的详解，具体来源可参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec[/font][/font][font=宋体] [/font]

[font=宋体]离子交换层析是一种在生物化学和生物技术领域中广泛使用的分离和纯化技术。它基于离子间的相互作用，特别是离子与固定在层析介质上的带电基团之间的相互作用，从而实现对混合物中不同离子的分离。以下将详细介绍离子交换层析的步骤及其作用。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]一、步骤[/font][/b][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、预处理：在开始离子交换层析之前，通常需要对样品进行预处理，以去除大颗粒杂质和不需要的成分。这通常包括离心、过滤和可能的浓缩步骤。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、选择合适的离子交换剂：离子交换剂是层析过程的核心。根据待分离离子的性质（如电荷、大小和与交换剂的亲和力）选择合适的离子交换剂。常见的离子交换剂包括阳离子交换剂和阴离子交换剂。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、平衡离子交换剂：在将样品加载到离子交换柱之前，需要用适当的平衡溶液（通常是水或盐溶液）冲洗离子交换剂，以去除可能存在的杂质并确保离子交换剂处于最佳状态。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、加载样品：将预处理过的样品加载到离子交换柱上。样品中的离子会与离子交换剂上的带电基团发生相互作用。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、洗脱：用洗脱液（通常是盐溶液，其浓度逐渐增加）将结合的离子从离子交换剂上洗脱下来。这一步骤是离子交换层析中最为关键的一步，因为它决定了不同离子之间的分离效果。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、收集和分析：收集洗脱下来的各个组分，并进行分析，以确定每个组分中包含的离子种类和浓度。常见的分析方法包括电导率测量、紫外[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]可见光谱和质谱等。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]7[/font][font=宋体]、后处理：根据需要对收集到的组分进行进一步的处理，如浓缩、脱盐或重新配制等。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]二、作用[/font][/b][font=宋体]离子交换层析在生物化学和生物技术领域有着广泛的应用，主要作用包括：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、分离和纯化蛋白质：离子交换层析可用于从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质，这对于后续的生物化学研究和药物开发至关重要。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、去除杂质：离子交换层析能够有效地去除样品中的离子杂质，提高样品的纯度。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、样品制备：在进行其他分析或实验之前，离子交换层析可用于样品的制备和预处理。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、研究蛋白质与离子的相互作用：通过离子交换层析，可以研究蛋白质与不同离子之间的相互作用和亲和力，这对于理解蛋白质的生物学功能和调控机制具有重要意义。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]三[/font] [font=宋体]、应用领域[/font][/font][/b][font=宋体]离子交换层析法在许多领域得到广泛应用：[/font][font=宋体]●生物制药：用于药物蛋白质的纯化，确保生物制剂的质量和稳定性。[/font][font=宋体]●生物学研究：在分离和纯化特定电荷性质的蛋白质时被广泛使用，尤其在基因表达和蛋白质互作研究中。[/font][font=宋体]●食品工业：用于提取和纯化食品中的蛋白质，改善食品的质地和口感。[/font][font=宋体]●环境监测：可用于从环境样品中分离和检测特定蛋白质，例如水体中的生物标志物。离子交换层析法凭借其良好的选择性和高效性，是生物分离和纯化领域不可或缺的重要工具。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析蛋白纯化[/b][/url][/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

（一）原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。所以，要根据具体情况选择使用。前实验中样品体积较小，凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。（二）试剂与器材（1）Sephadex G-25。（2）0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液。（3）奈氏（Nessler）试剂：于500ml锥形瓶内加入碘化钾150g，碘110g，汞150g及蒸馏水100ml。用力振荡7～15min，至碘的棕色开始转变时，混合液温度升高，将此瓶浸于冷水内继续振荡，直到棕色的碘转变为带绿色的碘化钾汞液为止。将上清液倾入2000ml量筒内，加蒸馏水至2000ml，混匀备用。（4）20%（W/V）磺基水杨酸溶液。（5）1.5cm×20cm层析柱。（6）黑、白比色磁盘。

材料琼脂糖凝胶介质镍亲和柱紫外检测仪蛋白电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件5 ml 注射器0.45 μm 滤器超声破碎仪试剂1. 结合缓冲液：20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，10 mM 咪唑，pH=8.02. 洗脱缓冲液：20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，不同梯度浓度的咪唑，pH=8.03. 20%乙醇4. 三蒸水5. 透析液：20 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH=8.0注：纯化所用所有试剂均用三蒸水进行定容，溶液配完后均用0.22 μm 滤膜经滤器过滤，4℃保存。在实验中，可以先配制相应pH值的高浓度母液，在使用时进行稀释。如：（1）1 M Tris-HCl，pH=8.0称取60.57 g Tris溶于400 mL 三蒸水中，充分溶解，调pH至8.0，补加三蒸水定容至500 mL。用0.22 μm 滤膜过滤，置于玻璃瓶中4℃保存。（2）2.5 M NaCl，pH=8.0称取36.53 g NaCl溶于200 ml 三蒸水中，充分溶解，调pH至8.0，补加三蒸水定容至250 mL。用0.22 μm 滤膜过滤，置于玻璃瓶中4℃保存。（3）1 M 咪唑，pH=8.0称取17.02 g 咪唑溶于200 mL 三蒸水中，充分溶解，调pH至8.0，补加三蒸水定容至250 mL。用0.22 μm 滤膜过滤，置于玻璃瓶中4℃保存。步骤样品制备将经过IPTG诱导的菌液离心，7000 rpm，10 min。收集菌体细胞，用PBS漂洗两遍，再用纯化所用的平衡液漂洗一遍，最后用平衡液重悬（35 mL/g 菌体沉淀），将收集好的菌液超声破碎，直至澄清，13000 rpm，离心10 min，取上清，用0.45 μm 滤器过滤。纯化过程1. 准备将保存于4℃的试剂开盖超声脱气40 min，平衡到纯化的温度。2. 装柱装柱前先在柱子内加满三蒸水，打开开关至最大流速，使三蒸水快速流过柱子以去除柱子中的气泡。将凝胶填料从4℃冰箱内取出，用吸管将上层20%乙醇吸走，加入三蒸水轻轻重悬，缓缓加入柱内，加满三蒸水，打开开关至最大流速，保持柱子垂直，使凝胶压紧，必要时可以用注射器从出口轻吸，给凝胶一定负压，使凝胶压的更紧密。3. 平衡提前打开紫外检测仪，调节波长至280 nm，灵敏度为100%，预热。向柱内加满结合缓冲液，打开开关，使液体匀速向下流（3 mL/min）。此时，调节光量，使吸光值保持100稳定，此时为调满。待吸光值稳定后，调节灵敏度为0.5 A/0.2 A，使吸光值保持0稳定，此时为调基线。4. 上样将提前处理好的样品加入20 mM 咪唑，有时可根据不同蛋白特性适当提高上样咪唑浓度，以减少非特异性结合。沿壁缓缓加入柱内，尽量避免气泡的产生。打开开关，保持尽量较低的流速（1 mL/min），待吸光值大于20时，用50 ml 离心管接流出的蛋白溶液，称流穿。流穿内的蛋白应为未与凝胶结合的菌体蛋白。5. 洗涤沿壁缓缓加入结合缓冲液，打开开关，走大于10柱体积的结合缓冲液，流速3 mL/min。使吸光值恢复到基线或接近于基线水平。6. 洗脱初次纯化一个新的重组蛋白一般选择40 mM、60 mM、80 mM 咪唑作为流洗浓度，主要洗脱非特异结合在凝胶中的菌体蛋白，100 mM、200 mM、300 mM 咪唑作为洗脱浓度，主要洗脱目的蛋白，500 mM 咪唑洗脱与凝胶结合较顽固的蛋白。将每个洗脱浓度的蛋白进行SDS电泳检测，确定洗脱杂蛋白以及目的蛋白的最佳浓度，作为以后洗脱条件。每个浓度洗涤（脱）时，都要使吸光值达到一个稳定的最低值。一般作为流洗的洗涤液尽量多一些。7. 平衡最后洗脱结束后，加入结合缓冲液，直至吸光值平衡基线或接近于基线水平。8. 保存向柱内缓缓加入5倍凝胶体积的20%乙醇，使凝胶充分浸在乙醇中。最后，用乙醇慢慢重悬凝胶，取出置于干净的离心管中，用乙醇冲洗柱子几次，使凝胶的损失达到最小。做好使用记录，4℃保存凝胶。9. 透析（1）将存放于4℃的透析袋从水中（用于煮透析袋的去离子水）取出，戴一次性手套，去掉水，将一头折起，用封闭夹封闭。透析液试漏。（2）倒掉透析液，将不同梯度洗脱的蛋白加入透析袋内，上口折起，用封闭夹封闭。检查不漏后放入2 L 透析液中。（3）用玻璃棒将透析袋固定在烧杯内，以防止透析袋随透析液转动，影响透析效果，4℃透析，两小时后更换透析液，然后透析过夜。10. 电泳检测上样、流穿、洗涤、各个梯度洗脱的蛋白，每个样品取20 μL，加入等量2×SDS-buffer，沸水煮样8 min，进行SDS-PAGE电泳检测。常温染色过夜，为避免染色时污染，染色液仅回收一次。蛋白浓度测定每纯化出的蛋白在保存之前都要进行蛋白浓度测定方法如下：取5 mL 考马斯亮蓝G-250置于干净试管中，空白对照加入100 μL 0.9%NaCl，测定组加入适量（考马斯亮蓝G-250由棕红色变为蓝色为止）未知蛋白，用0.9%NaCl补齐到100 μL，混匀，放置5 min。用721型分光光度计（需提前预热20 min）测定其595 nm的吸光值（玻璃比色皿，用空白对照调0），带入标准曲线，得出蛋白浓度。做好标记，保存于-20℃。蛋白浓缩若纯化出的蛋白浓度过低，在浓度测定之前要使用超滤杯或硫酸铵沉淀的方法对其进行浓缩。1. 超滤杯使用使用前先将超滤杯用三蒸水涮洗三遍，然后在超滤杯内加入三蒸水，3000 rpm，离心10 min，目的将滤膜彻底清洗干净。倒掉三蒸水，加入待浓缩的蛋白样品，3000 rpm，离心，直至达到所需体积后停止离心，将浓缩后的蛋白样品取出，进行电泳检测和蛋白浓度测定。超滤杯如同使用前用三蒸水涮洗三遍，加入三蒸水，3000 rpm，离心10 min。最后加入20%乙醇，是滤膜浸泡在乙醇中，4℃保存。2. 硫酸铵沉淀法蛋白溶液与饱和硫酸铵按1：1比例混合，4℃放置30 min，13000 rpm离心10 min，弃掉上清，沉淀的蛋白用500 μL PBS溶解（可根据沉淀的量适当增加PBS用量），溶解后用透析液透析。

[font=宋体]免疫层析法和胶体金法是两种常用的生物检测技术，它们在原理、应用和优缺点等方面存在显著差异。[/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]①原理区别：[/font][/b][font=宋体][font=宋体]免疫层析法是一种基于抗原[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗体反应的生物检测技术，利用标记有荧光物质、酶、胶体金等物质的抗体或抗原，检测样品中是否存在相应的抗原或抗体。当样品中的抗原与标记的抗体结合后，可以通过层析作用将结合物分离并检测。[/font][/font][font=宋体]而胶体金法则是利用胶体金作为标记物，通过免疫学方法检测样品中的生物分子。胶体金是一种由氯金酸水溶液在还原剂作用下形成的金颗粒，这些金颗粒分散在溶液中形成胶体溶液。当生物分子与胶体金结合后，可以通过显色反应判断是否存在该生物分子。[/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]②应用区别：[/font][/b][font=宋体]免疫层析法主要应用于医学诊断、食品安全、环境监测等领域。例如，用于检测尿液、血液、组织液等生物样品中的病毒、细菌、蛋白质等物质。[/font][font=宋体]胶体金法则主要应用于免疫分析、生物传感器等领域。由于胶体金法操作简便、灵敏度高、[/font][font=宋体]特异性好等特点，被广泛应用于临床诊断、生物制品质量控制等方面。[/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]③优缺点区别：[/font][/b][font=宋体]免疫层析法和胶体金法在优缺点方面也存在差异。[/font][font=宋体]免疫层析法的优点在于其高特异性、高灵敏度、高重复性等特点，能够快速准确地检测出样品中的目标物质。但是免疫层析法的操作较为繁琐，需要经过多个步骤才能完成检测，而且成本较高。[/font][font=宋体]胶体金法的优点在于其操作简便、快速、无需特殊设备等特点，能够在短时间内完成大量样品的检测。但是胶体金法的缺点在于其灵敏度相对较低，对于低浓度目标物质的检测可能会出现假阳性或假阴性的情况。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]总的来说，免疫层析法和胶体金法各有其优缺点，具体应用应根据实际情况选择。在某些情况下，可以将两种方法结合使用，以获得更好的检测效果。例如，在检测病毒抗原时，可以先使用免疫层析法进行初筛，然后再用胶体金法进行确认，以提高检测的准确性和特异性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]总之，免疫层析法和胶体金法是两种常用的生物检测技术，它们在原理、应用和优缺点等方面存在显著差异。在实际应用中，应根据具体情况选择合适的方法，以达到最佳的检测效果。同时，随着技术的不断发展，相信这两种方法将会在未来的生物检测领域发挥更加重要的作用。[/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification][b]蛋白层析纯化[/b][/url]详情：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification[/font][/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/01/201701191656_647384_2507958_3.gif层析技术的基本原理及其应用主讲人：吴云涛 默克密理博公司 工程师 活动时间：2013年8月21日 下午 14:30http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/01/201701191656_647384_2507958_3.gif【简介】 层析（chromatography）技术在制药领域中是一种广泛应用的技术。作为一种非常重要的分离纯化手段，其他分离技术相比，层析技术提供了较高的分辨率和选择性，可以把一些非常接近的杂质分离开来，从而获得高纯度的制剂。尤其是在生物制药领域，如单抗、重组蛋白、疫苗和血液制品等，其纯化工艺更是和层析技术息息相关。本次讲座主要讲述了层析技术的分类和基本原理，层析的基本参数及优化，以及层析技术在单抗中的应用，用以帮助大家了解层析技术的基础及其应用。-------------------------------------------------------------------------------1、报名条件：只要您是仪器网注册用户均可报名参加。2、参加及审核人数限制：限制报名人数为120人，审核人数100人。3、报名截止时间：2013年8月21日4、报名参会：http://simg.instrument.com.cn/meeting/images/20100414/baoming.jpg5、参与互动： *参会期间您还可以将有疑问的数据通过上传的形式给老师予以展示，并寻求解答*6、环境配置：只要您有电脑、外加一个耳麦就能参加。建议使用IE浏览器进入会场。7、提问时间：现在就可以在此帖提问啦，截至2013年8月20日8、会议进入：2013年8月21日14:00点就可以进入会议室9、特别说明：报名并通过审核将会收到1 封电子邮件通知函(您已注册培训课程)，请注意查收，并按提示进入会议室!为了使您的报名申请顺利通过，请填写完整而正确的信息哦~http://simg.instrument.com.cn/webinar/20110223/images/zb_11.gif注意：由于参会名额有限，如您通过审核，请您珍惜宝贵的学习交流机会，按时参加会议。如您临时有事无法参会，请您进入报名页面请假。无故不参会将会影响您下一次的参会报名。快来参加吧：我要报名》》》