免疫印迹仪实验原理

[font=宋体]免疫荧光法和免疫印迹法是生物学领域中两种常用的实验技术，它们在原理、操作过程和应用方面有着显著的区别。本文将详细探讨这两种技术的区别，以便更好地理解它们的特点和应用价值。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]首先，我们来了解免疫荧光法。免疫荧光法是一种利用荧光物质标记的特异性抗体来检测细胞内或细胞表面抗原的技术。其基本原理是抗原抗体反应，通过荧光显微镜观察荧光标记的抗原，从而实现对抗原的定位和定量分析。免疫荧光法具有高灵敏度、高特异性和定位准确的特点，广泛应用于细胞生物学、微生物学、免疫学等领域。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]相比之下，免疫印迹法则是通过检测细胞或组织提取物中特定抗原的存在和分布，以了解其在生物学过程中的作用。这种方法通常涉及到蛋白质的提取、分离、转移和检测等步骤。免疫印迹法能够检测蛋白质的分子量、表达水平以及与其他分子的相互作用，为生物学研究提供了重要的信息。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在操作过程上，免疫荧光法主要涉及细胞的固定、通透、抗体孵育和荧光显微镜观察等步骤。而免疫印迹法则需要进行蛋白质的提取、电泳分离、膜转移、抗体孵育和显色等复杂操作。因此，从操作难度和复杂性来看，免疫印迹法相对更为繁琐。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在结果解读和应用方面，免疫荧光法能够提供直观、定位准确的抗原分布信息，有助于研究细胞的结构和功能。而免疫印迹法则能够揭示蛋白质的表达水平、分子量和相互作用，为疾病诊断、药物研发和生物学机制研究提供有力支持。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]此外，免疫荧光法和免疫印迹法在应用领域上也有所不同。免疫荧光法广泛应用于细胞生物学、微生物学、免疫学等领域，特别是在病毒检测、细胞信号转导和细胞凋亡等研究中发挥着重要作用。而免疫印迹法则更多地应用于分子生物学、生物化学和病理学等领域，对于研究蛋白质的结构、功能和调控机制具有重要意义。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]免疫荧光法和免疫印迹法优缺点介绍：[/font][/b][font=宋体] [/font][table][tr][td][font=宋体]技术[/font][/td][td][font=宋体]优点[/font][/td][td][font=宋体]缺点[/font][/td][/tr][tr][td=1,4][align=center][font=宋体]免疫荧光法[/font][/align][/td][td][font=宋体]特异性强[/font][/td][td][font=宋体]非特异性染色问题尚未完全解决[/font][/td][/tr][tr][td][font=宋体]敏感性高[/font][/td][td][font=宋体]操作程序较复杂[/font][/td][/tr][tr][td][font=宋体]速度快[/font][/td][td][font=宋体]需要特殊的昂贵仪器（荧光显微镜）[/font][/td][/tr][tr][td][font=宋体]早期诊断价值[/font][/td][td][font=宋体]染色标本不能长期保存[/font][/td][/tr][tr][td=1,3][align=center][font=宋体]免疫印迹法[/font][/align][/td][td][font=宋体]操作简便[/font][/td][td][font=宋体]对于低丰度的抗原可能不够敏感[/font][/td][/tr][tr][td][font=宋体]所需实验材料相对简单[/font][/td][td][font=宋体]无法提供抗原在细胞或组织中的定位信息[/font][/td][/tr][tr][td][font=宋体]对某些特定抗原的检测具有较高的灵敏度[/font][/td][td][font=宋体]需要一定的实验技能和经验[/font][/td][/tr][/table][font=宋体] [/font][font=宋体]综上所述，免疫荧光法和免疫印迹法是两种具有不同特点和应用领域的实验技术。免疫荧光法注重抗原的定位和定量分析，操作简便直观；而免疫印迹法则关注蛋白质的表达和相互作用，操作相对复杂但能提供深入的信息。在实际应用中，我们需要根据研究目的和需求选择合适的技术手段，以获取准确、可靠的实验结果。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/immunofluorescence-service][b]免疫荧光（[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/immunofluorescence-service][b]IF[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/immunofluorescence-service][b]）检测服务[/b][/url]，更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/immunofluorescence-service[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

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[font=宋体][font=Calibri]Western Blot[/font][/font][font=宋体]原理：[/font][font=宋体][font=宋体]采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，[/font][font=宋体]“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。[/font][font=Calibri]SDS-PAGE[/font][font=宋体]可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]）上。固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]膜就称为一个印迹（[/font][font=Calibri]blot[/font][font=宋体]），用蛋白溶液（如[/font][font=Calibri]5%BSA[/font][font=宋体]或脱脂奶粉溶液）处理，封闭[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体（一抗）处理[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠[/font][font=Calibri]IgG[/font][font=宋体]的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。本文列举免疫印迹的常见问题[/font][font=Calibri](FAQ)[/font][font=宋体]，以供参考。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]1. Western blot[/font][font=宋体]结果中的背景为什么较高[/font][font=Calibri]?[/font][/b][/font][font=宋体]可能的原因及建议[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]膜封闭不够[/font][font=宋体]——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]一抗稀释度不适宜[/font][font=宋体]——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]一抗孵育的温度偏高[/font][font=宋体]——建议[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃结合过夜。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]膜在实验过程中干过[/font][font=宋体]——实验过程中要注意保持膜的湿润。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]检测时曝光时间过长[/font][font=宋体]——减少曝光时间。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]2. Western blot[/font][font=宋体]结果中杂带较多[/font][/b][/font][font=宋体]可能的原因及建议[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。[/font][font=宋体]查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。[/font][font=宋体][font=宋体]目的蛋白有其它剪切本[/font][font=宋体]——查阅文献或生物信息学分析可能性。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]样本处理过程中目的蛋白发生降解[/font][font=宋体]——加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]上样量过高，太敏感[/font][font=宋体]——适当减少上样量。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]一抗特异性不高[/font][font=宋体]——重新选择或制备高特异性的抗体。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]一抗不纯[/font][font=宋体]——纯化抗体[/font][/font][font=宋体][font=宋体]一抗或者二抗浓度偏高[/font][font=宋体]——降低抗体浓度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]3. Western blot[/font][font=宋体]结果中无信号或显示信号弱[/font][/b][/font][font=宋体]可能的原因及建议[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]检测样本不表达目的蛋白[/font][font=宋体]——选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]检测样本低表达目的蛋白[/font][font=宋体]——提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]转移不完全或过转移[/font][font=宋体]——可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]抗体不能识别测试种属的相关蛋白[/font][font=宋体]——购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]一抗孵育时间不足[/font][font=宋体]——建议[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃结合过夜。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]二抗与一抗不匹配[/font][font=宋体]——选择针对一抗来源的种属的抗体。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]洗膜过度[/font][font=宋体]——洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用[/font][font=Calibri]0.1%[/font][font=宋体]的弱去垢剂[/font][font=Calibri]Tween-20[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]其它现象：[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]膜上多处出现黑点或黑斑[/font][font=宋体]——抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]反白（条带显白色）[/font][font=宋体]——目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]蛋白分子量偏低或偏高[/font][font=宋体]——胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]5. TBS[/font][font=宋体]与[/font][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]的区别[/font][/b][/font][font=宋体][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]的缓冲能力强于[/font][font=Calibri]TBS[/font][font=宋体]（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），[/font][font=Calibri]TBS[/font][font=宋体]在[/font][font=Calibri]PH7.0[/font][font=宋体]以下缓冲能力较弱（不过[/font][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]易污染）。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选[/font][font=Calibri]TBS[/font][font=宋体]；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选[/font][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]Western blot[/font][font=宋体]中使用[/font][font=Calibri]TBS[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]PBS[/font][font=宋体]均可，只是要根据需要选择合适的浓度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]6. Western[/font][font=宋体]是否可以同时加两种或者多种一抗[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]通常情况下只加一种一抗。做[/font][font=Calibri]Western[/font][font=宋体]在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，[/font][font=Calibri]ECL[/font][font=宋体]显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，[/font][font=Calibri]ECL[/font][font=宋体]显色、压片、洗片。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]7. PVDF[/font][font=宋体]与[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]膜的区别[/font][/b][/font][font=宋体][font=Calibri]PVDF[/font][font=宋体]膜价格较贵，可重复使用，结合能力较强。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性较[/font][font=Calibri]PVDF[/font][font=宋体]膜差，韧性也不如[/font][font=Calibri]PVDF[/font][font=宋体]，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]8. Western[/font][font=宋体]一抗的选用[/font][/b][/font][font=宋体]理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]9. Western[/font][font=宋体]抗体和[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]抗体的区别[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]一般来说用于[/font][font=Calibri]western[/font][font=宋体]的抗体主要识别氨基酸序列特异性；而可用于[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[b]0. [/b][/font][font=宋体][b]“短路”现象的产生和处理[/b][/font][/font][font=宋体][font=宋体]如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层虑纸也不能因过大而相互接触，这样同样会短路，电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的，[/font] [font=宋体]最后结束时一般是开始的[/font][font=Calibri]1.5-3[/font][font=宋体]倍都是正常的。一般[/font][font=Calibri]Buffer[/font][font=宋体]和滤纸选的对就不会短路。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]11. Western Blot[/font][font=宋体]的染色[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]阴离子染料是较常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到[/font][font=Calibri]1.5[/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g[/font][font=宋体]，考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红[/font][font=Calibri]S[/font][font=宋体]和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的 皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]胶体金，灵敏度高，检测范围可到[/font][font=Calibri]pg[/font][font=宋体]级，但染色比稳定。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]生物素化灵敏度位于[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]之间，可用于任何一种膜。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]12. [/font][font=宋体]大分子量蛋白转移效率低的解决方法[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]可以在转移缓冲液中加入[/font][font=Calibri]20%[/font][font=宋体]甲醇（是指终浓度），因为甲醇能增加蛋白质和[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]膜的结合能力，同时可以延长高分子量蛋白质转移时间；转移缓冲液加入终浓度[/font][font=Calibri]0.1%SDS[/font][font=宋体]，也是为了增加转移效率；选用优质的转移膜，或使用小孔径的[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]膜（[/font][font=Calibri]0.2[/font][font=宋体]微米）；使用戊二醛交联。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]13. DAB[/font][font=宋体]显色、碱性磷酸酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗碱性磷酸酶显色原理[/font][/b][/font][font=宋体][font=Calibri]DAB[/font][font=宋体]显色在辣根过氧化酶的作用下能形成一种灰褐色的产物，该产物难溶于醇和其他有机溶剂，[/font][font=Calibri]DAB[/font][font=宋体]的氧化还能引起聚合作用，导致与四氧化锇反应而增加其染色强度和电子密度。碱性磷酸酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗碱性磷酸酶显色中，酶将奈酚磷酸（底物）水解成酚类和磷酸。酚和无色的重氮盐（显色原）结合而产生有色的、不溶性偶氮染料。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[b]4. [/b][/font][font=宋体][b]酶显色与荧光显色的优缺点[/b][/font][/font][font=宋体]免疫酶技术就是用酶标记已知抗体（或抗原），然后与组织标本在一定条件下反应并结合，结合形成的复合物中所含有的酶分子遇到底物时，会催化底物水解、氧化或还原，从而发生显色反应。免疫酶组化技术分为酶标记法与非标记抗体技术，前者是将酶通过交联剂结合在抗体分子上，形成酶标记抗体。后者是将酶作为抗原与相应的特异性抗体连接进行的免疫反应，称为非标记抗体酶技术。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]免疫荧光技术中的荧光抗体染色标本不能长期保存，对组织细胞的细微结构分辨不清，但免疫酶技术则能克服上述不足，标记免疫酶技术的敏感性更优于免疫荧光法。酶显色产物具有较高的电子密度，经过适当处理还可以进行免疫电镜观察。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]Western Blot[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]检测服务[/b][/url]，更多详情可以关注[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service[/font][/font][font=宋体] [/font]

[font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/category/wb-faq][b][font=Calibri]WB([/font][font=宋体]蛋白质印迹[/font][font=Calibri])[/font][/b][/url][font=宋体]是一种用于检测样本（如细胞提取物或组织匀浆）中特异性蛋白的技术，也用于分析体外合成的重组蛋白。蛋白免疫印迹法还可以根据某种抗原与其相对抗体之间的特殊亲和力来鉴定靶蛋白。蛋白免疫印迹法一般包含三个主要步骤分别为[/font][font=Calibri]SDS-PAGE[/font][font=宋体]、样品印迹和免疫学检测。通过蛋白免疫印迹法可以获得关于靶蛋白的定性和半定量数据。在蛋白质领域，蛋白免疫印迹法被广泛用于蛋白表达水平的检测。下面针对[/font][b][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]在实验过程中遇到的问题进行罗列及解答：[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、为什么抗磷酸化酪氨酸抗体会出现高背景或信号减弱？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]请您检查所使用的封闭液并注意封闭以及洗膜的时间。有两种常用的封闭液：脱脂奶粉或[/font][font=Calibri]BSA[/font][font=宋体]。脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白的封闭，因为脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，会结合在膜上并与磷酸化特异性抗体结合导致高背景。并且稀释抗磷酸化酪氨酸抗体与脱脂奶粉中的酪蛋白结合后，用于检测的抗体较少导致信号减弱。此外，避免封闭时间过长，否则会掩盖抗原表位，阻止抗体结合。洗膜时间不宜过长或过短，过长会导致信号减弱（抗体被洗脱），过短则会导致高背景。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]我们建议使用含[/font][font=Calibri]1% BSA[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]TBS[/font][font=宋体]，含吐温[/font][font=Calibri]20[/font][font=宋体]作为封闭液，请勿使用脱脂奶粉。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、为什么随着时间的推移，蛋白免疫印迹法中的抗体活性会降低？[/font][/font][font=宋体]如果您使用我们的一种抗体进行蛋白免疫印迹分析，并且反应性似乎随着时间的推移而降低，可能的原因及解决方案如下：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①可能的原因一：使用了不同的样本。[/font][font=宋体]解决方案：培养的细胞会随着时间的推移而变性，因此我们建议解冻新鲜细胞。[/font][font=宋体]②可能的原因二：样品在储存期间或反复冻融后降解。[/font][font=宋体]解决方案：制备新鲜样品，避免反复冻融。[/font][font=宋体]③可能的原因三：抗体被污染。解决方案： 旋转小瓶，检查是否有沉淀。[/font][font=宋体]④可能的原因四：二抗失效。解决方案：更换新的二抗。[/font][font=宋体]⑤可能的原因五：蛋白质转膜效率低。解决方案：配置新的转膜液；根据蛋白分子量大小调整转膜时间。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、如何避免转膜不充分或结果不理想的问题？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]确定蛋白质的大小。如果蛋白质大于[/font][font=Calibri]180 kDa[/font][font=宋体]，则需要通过以下方式优化转膜条件：[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 使用[/font][font=Calibri]20% MeOH[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 加入[/font][font=Calibri]0.05% SDS[/font][font=宋体]转膜缓冲液。[/font][/font][font=宋体]? 增加裂解物的上样量。[/font][font=宋体][font=宋体]? [/font][font=Calibri]110 V[/font][font=宋体]恒压转[/font][font=Calibri]150 min[/font][font=宋体]，湿法转膜。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、如何避免“斑点状”或不均匀的蛋白免疫印迹？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]为避免进行蛋白免疫印迹法时出现[/font][font=宋体]“斑点状”或不均匀的印迹，有以下几种方法[/font][font=Calibri]: [/font][/font][font=宋体]? 延长封闭时间，以优化封闭效果。[/font][font=宋体]? 延长洗涤次数 （这对组织匀浆样品尤为重要）。[/font][font=宋体]? 在配置封闭液时，确保奶粉完全溶于溶液。[/font][font=宋体]? 在取出抗体溶液使用之前，旋转装有抗体溶液的试管，防止出现蛋白沉淀。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、如何避免印迹上出现“点状”、不均匀的斑点？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]为避免印迹上出现[/font][font=宋体]“点状”或不均匀斑点，请尝试以下几种方法：[/font][/font][font=宋体]? 检查所有缓冲液是否被细菌污染。[/font][font=宋体]? 确保在抗体和清洗孵育过程中膜完全浸入。[/font][font=宋体]? 在转膜时，排除薄膜和凝胶之间的所有气泡。[/font][font=宋体]? 将膜放在摇床上，确保均匀地接触。[/font][font=宋体]? 清洗蛋白免疫印迹所需的设备。[/font][font=宋体][font=宋体]? 过滤[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]结合物，除去任何可能的聚集物。[/font][/font][font=宋体]?减少底物暴露时间。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、选择什么作为[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]抗体的阳性对照？[/font][/font][font=宋体]为了使您的蛋白免疫印迹抗体中获得最佳性能，请使用技术数据表中推荐的阳性对照。阳性对照将帮助您按照制定的方案，在实验中获得准确的结果。[/font][font=宋体][font=宋体]我们建议将这些裂解物放置在[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]℃下长期储存。裂解物非常稳定，它们是细胞制剂，所有酶均变性和灭活。我们做了大量的研究，证实了不同条件下的稳定性。例如，大多数裂解物的完整性和质量不受反复冻融的影响，可在[/font][font=Calibri]25[/font][font=宋体]℃下储存长达[/font][font=Calibri]12[/font][font=宋体]周。但裂解物在[/font][font=Calibri]37[/font][font=宋体]°[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]下[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]周时开始降解。然而，根据裂解物的来源，稳定性可能存在一些轻微差异，因此我们建议将其储存在[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]℃下。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]7[/font][font=宋体]、应该分析多少蛋白质？[/font][/font][font=宋体]我们建议：[/font][font=宋体]样本类型[/font][font=宋体]每条泳道[/font][font=宋体]全细胞裂解液[/font][font=宋体][font=Calibri]50 [/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g[/font][/font][font=宋体]细胞核提取物[/font][font=宋体][font=Calibri]25 [/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]8[/font][font=宋体]、应该使用多少浓度的丙烯酰胺凝胶来分离蛋白？[/font][/font][font=宋体]为了更好地分离感兴趣蛋白，丙烯酰胺凝胶的百分比应基于蛋白分子量。我们建议：[/font][font=宋体][font=宋体]蛋白大小（[/font][font=Calibri]kDa[/font][font=宋体]）[/font][/font][font=宋体][font=宋体]丙烯酰胺凝胶百分比（[/font][font=Calibri]%[/font][font=宋体]）[/font][/font][font=宋体][font=Calibri] 80[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]7.5[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]9[/font][font=宋体]、蛋白免疫印迹法应使用哪种印迹膜？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]我们建议使用硝酸纤维素（[/font][font=Calibri]NC[/font][font=宋体]）膜。虽然聚偏二氟乙烯（[/font][font=Calibri]PVDF[/font][font=宋体]）膜、尼龙膜和[/font][font=Calibri]DEAE[/font][font=宋体]纤维素膜也可以使用，但有时会产生升高的背景，特别是实验过程中使用山羊多克隆抗体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]10[/font][font=宋体]、应该使用什么封闭缓冲液？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]封闭液的选择与目标蛋白有关，我们建议一般使用[/font][font=Calibri]1X TBS[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]5%[/font][font=宋体]脱脂奶粉、[/font][font=Calibri]0.05%[/font][font=宋体]吐温[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]作为封闭液，在室温下封闭[/font][font=Calibri]30-60[/font][font=宋体]分钟或在[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃下封闭过夜。请注意，如果封闭过夜，缓冲液中应不加吐温[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]。如果目标蛋白较特殊（如磷酸化），建议使用[/font][font=Calibri]1X TBS[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]1% BSA[/font][font=宋体]并含有吐温[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]的封闭液，可得到较清晰条带。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]11[/font][font=宋体]、一抗的稀释倍数一般是多少？[/font][/font][font=宋体]请查看各个抗体的数据表，因为这通常记录起始稀释度。如果数据表上没有具体稀释信息，我们建议您对相关的阳性和阴性对照进行连续滴定。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]12[/font][font=宋体]、为什么实际的蛋白免疫印迹条带大小与预期的不同？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]蛋白免疫印迹法是根据蛋白质大小分离蛋白的技术。一般来说，蛋白越小，其在[/font][font=Calibri]SDS-PAGE[/font][font=宋体]凝胶中移动的速度就越快。然而，移动速率也受到其他因素的影响，因此实际条带大小可能与预测不一致。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]可能的原因[/font][font=宋体]备注[/font][font=宋体]①翻译后修饰[/font][font=宋体]例如磷酸化、糖基化等，可增加蛋白质的大小。[/font][font=宋体]②翻译后切割[/font][font=宋体]大多数蛋白质首先合成为前体蛋白形式，再经切割产生活性形式，例如前体半胱天冬酶。[/font][font=宋体]③剪接变体[/font][font=宋体][font=宋体]可变剪切会产生从同一基因产生不同大小的蛋白质。剪接变体的表达具有高度变异性，取决于使用的特定组织和实验条件[/font] [font=宋体]。[/font][/font][font=宋体]④亚型[/font][font=宋体]许多蛋白质表达多种不同大小的亚型。相同靶蛋白不同亚型的表达具有高度变异性，取决于使用的特定组织和实验条件。参照不同的网站，确定特定靶标的亚型。[/font][font=宋体]⑤相对电荷[/font][font=宋体][font=宋体]氨基酸组成（带电[/font][font=Calibri]vs.[/font][font=宋体]不带电）。[/font][/font][font=宋体]⑥多聚体[/font][font=宋体]例如蛋白质二聚化。尽管相互作用可能导致出现较高条带，但在还原条件下需防止该情况。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]13[/font][font=宋体]、为什么蛋白免疫印迹结果信号微弱或完全没有信号？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]可能的原因[/font][font=宋体]备注[/font][font=宋体]①抗体滴定 [/font][font=宋体][font=宋体]应使用多种抗体浓度进行抗体滴定实验，以确定最佳信噪比的合适抗体浓度。一般而言，滴定浓度应在[/font][font=Calibri]0.2-5.0 [/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g/mL[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②组织[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]细胞特异性 [/font][/font][font=宋体]靶蛋白表达取决于待测的细胞或组织。应进行文献检索，确保您正在使用的细胞等条件适用于检测靶蛋白。[/font][font=宋体]③复溶 [/font][font=宋体]在重新溶解冻干抗体时应注意，确保抗体全部溶解。尽管冻干抗体沉淀通常位于试管底部，但有时粉末可能位于管壁上。因此，溶解时应覆盖试管的整个表面，以确保抗体完全溶解。然后进行短暂离心，确保将所有粉末收集在试管底部。[/font][font=宋体]④阳性对照 [/font][font=宋体]在您的蛋白免疫印迹中添加阳性对照泳道是评价抗体是否正常工作和实验条件是否适当的最佳方法。另外，基于文献或实验结果的阳性对照也可以用来评估抗体是否正常发挥作用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]蛋白免疫印迹法常见问题详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/category/wb-faq[/font][/font][font=宋体][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]Western Blot[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]检测服[/b][/url]务：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service[/font][/font]

免疫elisa实验原理

酶联免疫吸附试验elisa原理

一、定义 用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。二、原理 根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。三、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。四、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。2）免疫酶标方法 免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。 本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。 免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等。3）免疫胶体金技术 免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。五、被检测的物质 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激 素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。六、特点 1）特异性强。免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉反应。2）敏感性高。在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP三步法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。3）定位准确、形态与功能相结合。该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学领域开展深入研究是十分有意义的。七、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与Western blotting、ELISA的异同 1）Western blotting：蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；当然Western blotting也可定性和定位（通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组化技术。2）ELISA：酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。

在发明蛋白质印迹法（Western Blot）出现了30多年之后，这项技术仍然是获取特定蛋白可靠鉴定的关键。许多近期涌现的产品利用各种方法来提高蛋白质印迹实验的可重复性、敏感性、定量性以及速度。有三个人都被认为发展了蛋白质的免疫印迹方法，但其中只有一人才算得上是“Western Blotting（蛋白质印迹法）”的命名者，他就是当时在西雅图哈钦森癌症研究中心Bob Nowinski实验室工作的W. Neal Burnette。“Western Blotting”的命名中暗含了Southern Blotting（Edwin Southern在1975年发明的一项技术，使用胶、尼龙膜和吸水纸去鉴定一个复杂个体中特定的DNA序列）、Northern Blotting（随后发明出的相似策略，用于鉴定RNA）以及位于西海岸（West Coast）的Nowinski实验室三者之意。http://www.ibioo.com/data/attachment/portal/201309/22/095234xzm2pso06fsmtbof.jpgBurnette的技术成果直到1981年才得以发表。他回想起来，当时审稿人“特别”反对使用“Western blotting”这一名称。但尽管如此，这个名称还是沿袭了下来，而且蛋白质印迹技术也成为了最广泛使用的免疫化学技术之一。工作原理蛋白质印迹法的第一步涉及到用凝胶电泳（Gelelectrophoresis）按照大小分离蛋白质，然后通过将膜置于胶上，将蛋白质转移到膜上（通常是硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜），并在膜上加上若干片吸水纸，然后将这套堆层放在缓冲溶液中，这样就能通过毛细管作用将蛋白质向上拉拽到膜上。这也就是所谓的湿法或槽式转印法。另外两项技术是干法和半干转印法，这两种方法比传统的湿转印法更快也更规整，但是对于高分子量蛋白质而言，效率更低。对于半干转印方法来说，膜和胶放置在被缓冲液浸泡过的滤纸层之间，将这些都夹在阴极和阳极之间，电流就能驱动蛋白质转移到膜上。三种方法中，干法转印最快，但转印效率也最低。转印结束后，膜被放在稀释过的蛋白质溶液中用来封闭非特异性的蛋白质结合。然后将膜与一抗进行孵育、洗脱，再与标记了信号检测探针的二抗进行孵育。最后一步是检测，通常采用化学发光或者荧光方法。在化学发光检测中，与酶交联的二抗能够与检测抗原产生光发生反应，可以被胶片或成像装置捕获。而在荧光检测中，抗体探针被荧光集团所标记。荧光检测方法的主要优势在于，它可以同时检测多个蛋白质，并且其信号更加一致。因此与化学发光检测相比，也更有利于量化研究。不少制造蛋白质印迹相关设备、软件和消耗品的公司正在努力推动其中一些或所有步骤的自动化，期望能够将这一实验变得更加简单有效。同时在实验中加入了一些验证点，让研究人员能够随时监测实验进展，甚至重新打造整个过程。科学家们寻求的是高效性、稳健性和策略化，从而能够帮助他们避免浪费宝贵的造价高昂的抗体。加速免疫检测过程转印、抗体孵育、上样和洗脱步骤占据了蛋白质印迹法实验80%的时间，EMD Millipore公司“蛋白质印迹法解决方案”产品经理Michele Hatler这样介绍。这家总部位于加州泰梅库拉的公司推出的SNAP i.d. 2.0蛋白质检测系统加速了整个过程，使用真空装置通过膜推入试剂，而不仅仅依赖于扩散作用。这样就能将免疫检测的时间从4小时缩短到30分钟，Hatler表示。她解释说：“我们真正致力于提高蛋白质印迹工作流程的效率。我们仍然是按照传统的步骤走，只是加了一个真空装置。”Hatler指出，2.0版本是于2012年9月推出的，相比之前的版本有几个方面的优势。它可以使用中等大小的凝胶（8.5×13.5厘米）和迷你凝胶（7.5×8.4厘米），之前则只能用迷你凝胶。“这一设备很便宜，操作也很简便，但切实提高了实验效率，节省了实验时间。” Hatler说。伯乐公司（Bio-Rad）的Trans-Blot Turbo蛋白质转移系统是实验台面大小的仪器，能够提供快速而高效的转印。得益于新的转印缓冲液配方，特殊的过滤材料和增强的电流强度（由一个集成电源调节），这一系统能够在短至3分钟的时间内完成转印，并且印迹结果能与槽式转移相媲美。传统的半干转移系统需要15到60分钟时间，而且通常无法提供高分子量蛋白质转移的有力结果。增加验证点以缓解忧虑蛋白质印迹法的高失败率常常令人感到非常沮丧，尤其是你需要若干天来换取一个结果。“这是一项非常不稳定的技术，”伯乐公司“蛋白质印迹组”市场经理Ryan Short说，“我们对用户调查时发现，一半的用户报告他们用此技术的失败率至少是25%。”Short还说：“几乎没有什么机会可以检查实验过程是否满足期望。由此就产生了焦虑。我们正在引入可视验证点的概念来增加信心和确定性。”这家公司的标准和Mini-PROTEAN免染色预制胶，利用其ChemiDoc MP胶成像系统，使得研究者可以快速观测到他们的蛋白是否正确地载入到凝胶上，进而确证高质量的蛋白质转移，便于决定是否应该转向下一个步流程或是重新开始。ChemiDoc MP系统是为化学发光和多元荧光斑点成像技术所设计，能够在个人电脑上用ImageLab软件来操作。这些验证点“真的很有用”，在实验室使用该系统的加州大学戴维斯分校助理教授Aldrin Gomes表示：“我们可以成像这些免染的凝胶，不用加入额外的染料，而且能够快速判断跑在胶上的样品是否出现问题。我们还能在蛋白质转膜之后再去对凝胶成像，如果其中任何一个步骤出现问题，我们都可以在这一点上停止实验进程。”成像和软件提高定量性当许多科学家仍在使用胶片分析蛋白质印迹时，世面上开始出现越来越多的宽范围免胶片凝胶记录成像系统，这些系统可以用来成像并分析化学发光的印迹、荧光的印迹斑点或者同时检测这两种印迹。许多公司开始纷纷努力，争相制造尽可能便捷的成像仪及其分析软件。很多公司提供了按键式成像捕捉系统，其大小可在实验台上操作。Syngene公司于2012年4月推出了非常简洁的一键操作系统PXi，分析化学发光和荧光印迹。该系统是基于该公司的G:BOX成像系统，并配有GeneSys成像软件。2012年10月，赛默飞世尔公司（Thermo Fisher Scientific）推出了myECL成像仪，使用紫外和可见光透射法，专业的滤镜和电荷耦合器件（CCD）摄影技术去捕获和分析蛋白质印迹以及蛋白和核酸凝胶。

原理是里面的抗原抗体的结合，然后萃取出毒素，再进行测定。免疫亲和柱我在网上搜了一下，也通过朋友问了一下，有个普瑞邦的柱子还不错，其实测定的时候还会用到光化学柱后衍生器。为了解决样品过柱时的繁琐，解放双手提高效率，Pribolab公司推出了一款简单、好用的免疫亲和柱架体系——泵流操作架，用于辅助免疫亲和柱的使用。该产品采用坚固、耐化学腐蚀的结构和材料，含有8个操作位，可同时处理8支免疫亲和柱，其中含2个大体积30ml，满足不同样品需要，大大提高了处理效率。采用正压，不会出现流速过快，流速控制开放式，容易清洁，而且能够很好的配合普瑞邦免疫亲和柱，无需转接头。操作架的可拆卸性和便携性也给了实验操作更多更灵活的空间。现在检测真菌毒素也挺多的，各种产品琳琅满目，但真正好用的，老牌的进口的都很贵，而且他们也没有专业的实验室，普瑞邦在国内有总代理，而且又专业的实验室，

免疫层析原理

[b][font=inherit]项目概况[/font][/b]艾滋病患者免疫功能评价及阳性复核试剂耗材采购(二次)采购项目的潜在供应商应在公告期内凭用户名和密码，登录黑龙江省政府采购管理平台(http://hljcg.hlj.gov.cn/)，选择“交易执行-应标-项目投标”，在“未参与项目”列表中选择需要参与的项目，确认参与后即可获取采购文件，并于 2022年11月03日 09时00分 （北京时间）前提交响应文件。[b][font=inherit]一、项目基本情况[/font][/b]项目编号：[230001]ZTBC-H[CS]20220008-1项目名称：艾滋病患者免疫功能评价及阳性复核试剂耗材采购(二次)采购方式：竞争性磋商预算金额：2,451,700.00元采购需求：合同包1(艾滋病患者免疫功能评价及阳性复核试剂耗材采购第一包):合同包预算金额：1,676,500.00元[table=100%][tr][td]品目号[/td][td]品目名称[/td][td]采购标的[/td][td]数量（单位）[/td][td]技术规格、参数及要求[/td][td]品目预算(元)[/td][td]最高限价(元)[/td][/tr][tr][td]1-1[/td][td]其他生物制剂[/td][td]CD4+T淋巴细胞检测试剂 CD4/CD8/CD3[/td][td]2,400(人份)[/td][td]详见采购文件[/td][td]216,000.00[/td][td]-[/td][/tr][tr][td]1-2[/td][td]其他生物制剂[/td][td]CD4+T淋巴细胞检测试剂 CD3/CD4/CD8/CD45[/td][td]8,500(人份)[/td][td]详见采购文件[/td][td]892,500.00[/td][td]-[/td][/tr][tr][td]1-3[/td][td]其他生物制剂[/td][td]CD4/CD8/CD3检测试剂盒[/td][td]4,600(人份)[/td][td]详见采购文件[/td][td]414,000.00[/td][td]-[/td][/tr][tr][td]1-4[/td][td]其他生物制剂[/td][td]CD4+T淋巴细胞检测试剂 CD3/CD4/CD45[/td][td]1,000(人份)[/td][td]详见采购文件[/td][td]100,000.00[/td][td]-[/td][/tr][tr][td]1-5[/td][td]其他生物制剂[/td][td]CD4盲样考核[/td][td]9(盒)[/td][td]详见采购文件[/td][td]54,000.00[/td][td]-[/td][/tr][/table]本合同包不接受联合体投标合同履行期限：自合同签订之日起3个月。合同包2(艾滋病患者免疫功能评价及阳性复核试剂耗材采购第二包):合同包预算金额：775,200.00元[table=100%][tr][td]品目号[/td][td]品目名称[/td][td]采购标的[/td][td]数量（单位）[/td][td]技术规格、参数及要求[/td][td]品目预算(元)[/td][td]最高限价(元)[/td][/tr][tr][td]2-1[/td][td]其他生物制剂[/td][td]HIV1+2确证试剂（免疫印迹法）[/td][td]4,080(人份)[/td][td]详见采购文件[/td][td]775,200.00[/td][td]-[/td][/tr][/table]本合同包不接受联合体投标合同履行期限：自合同签订之日起3个月。

一）原理　　化学发光免疫测定属于标记抗体技术的一种，它以化学发光剂、催化发光酶或产物间接参与发光反应的物质等标记抗体或抗原，当标记抗体或标记抗原与相应抗原或抗体结合后，发光底物受发光剂、催化酶或参与产物作用，发生氧化还原反应，反应中释放可见光或者该反应激发荧光物质发光，最后用发光光度计进行检测。　　　　（二）标记物　　1.发光剂直接标记 常用鲁米诺及其衍生物等，它们属环肼类化合物，能与很多氧化物如氧、次氯酸、磺、过氧化物等反应而发光。因此可直接将鲁米诺或其衍生物标记抗体或抗原进行CLIA。这类方法特异性强，但往往会因交联影响发光物特性，降低敏感性。　　2.发光催化酶标记 常用辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、葡萄糖氧化酶等标记抗体或抗原。与酶标抗体测定基本相同，差别在于CLIA是用发光性底物指示反应，有人称为发光酶免疫测定。　　3. 标记物产物参与反应 标记物不直接催化发光反应，而其反应产物能使反应系统发光。如用草酸类标记抗体或标记抗原，在有H2O2作用下，生成二噁二酮，后者可使红荧稀（Rubrene）激化发光。　　（三）应用　　CLIA特异性强、敏感性高，可检测到10-5mol/L的抗原量。快速，一般几十分钟或1-3小时内完成。操作简便，可进行固相和均相分析。试验重复性好，试剂易标准化和商品化。目前已用于多种药物、激素、病原微生物及其代谢产物、抗体及其他生物活性物质的测定。

[font=宋体][font=宋体]酶联免疫吸附实验（[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]）是一种高灵敏度的免疫分析方法，通过将抗原或抗体结合在固相载体表面，利用抗原抗体的特异性结合，以及抗体或抗原上标记的酶催化特定底物发生显色反应，实现对目标物的高精度检测。其检测灵敏度可达到皮摩尔（[/font][font=Calibri]pmol[/font][font=宋体]）级别，为生物医学研究、临床诊断等领域提供了强有力的技术支持。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]技术原理[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]可用于测定抗原，也可用于测定抗体。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）将已知的抗体或抗原精细地结合在某种固相载体上，确保其免疫活性得以完好保存。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）在测定过程中，待检样本与固相载体表面吸附的抗体或抗原按照特定的顺序进行反应。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）通过一系列精确的洗涤步骤，将抗原[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗体复合物与游离成分彻底分离。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）加入特定的酶作用底物，催化显色反应，从而实现定性和定量的检测。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]常见类型[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、[/font][/font][font=宋体]直接法：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]将抗原按一定的比例稀释好包被到固相载体上，然后加入稀释好的特异性的酶标抗体，孵育后加入底物显色并判读结果。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]优缺点：[/font][font=宋体]适用于检测小分子抗原，优势：实验步骤少，检测速度快，无须使用二抗可避免交互反应，结果较准确。缺点：每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗，实验灵活性低，灵敏度低。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、[/font][/font][font=宋体]间接法：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原一待测抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]优缺点[/font][font=宋体]常用于抗体的检测，只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗体检测各种与抗原相应的抗体。优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它多的免疫反应性。缺点：可能会发生交叉反应，与直接法比，实验周期长。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、[/font][/font][font=宋体]夹心法：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]类型：分为直接夹心和间接夹心。检测抗体是酶标抗体，则可称为直接夹心[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]；检测抗体不带有标记，则还需要使用酶标二抗与检测抗体结合，这种称为间接夹心[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]直接夹心又分为双抗体夹心和双抗原夹心。夹心[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]实验需要用到配对抗体（捕获抗体和检测抗体），原理：将捕获抗体结合到[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]板上，通过捕获抗体固定抗原，随后通过直接或间接[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]的方式进行检测。在夹心[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]实验中，最重要的是对配对抗体进行验证，确保配对抗体能同时与抗原结合，以确保实验的顺利进行。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]优缺点[/font][font=宋体]常用于抗原测定，适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原。优点：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、[/font][/font][font=宋体]竞争法：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]首先将特异性抗体吸附于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液；而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]优缺点：[/font][font=宋体][font=宋体]常测定小分子抗原：如激素和药物之类，也可以用来检测大分子抗原物质甚至是抗体。检测大分子抗原物质时，由于空间位阻的影响，使得该检测方法没有双抗体夹心法检测大分子抗原物质灵敏度高。优势：可适用不纯的样本，快速高效。[/font] [font=宋体]缺点：整体的敏感性和专一性都较差。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/elisa-service]酶联免疫吸附测定[/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/elisa-service](ELISA)[/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/elisa-service]检测服务[/url]，其优势：[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]①拥有庞大的产品库：[/font][font=Calibri]6,000[/font][font=宋体]多种优质[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]应用抗体，[/font][font=Calibri]500[/font][font=宋体]多种[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]试剂盒。[/font][/font][font=宋体]②技术人员长期从事于抗体质控工作，经验丰富，实验结果可靠。[/font][font=宋体]③价格优惠，如使用义翘自有产品进行检测，享特殊优惠。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/elisa-service[/font][/font]

空心阴极灯是原子吸收仪器的光源，它的稳定性将决定测试结果的稳定性和准确性听说新生产出来的空心阴极灯，在出厂前都需要对其进行老化处理不知道哪位仁兄知道，这种空心阴极灯老化的过程，和老化的原理？我在此开个题目，欢迎大家对此题目进行讨论！！！

全自动化学发光免疫分析仪的原理以及了临床应用。全自动化学发光免疫分析仪采用光电比色原理来测量体液中某种特定化学成分的仪器。是用于检测肿瘤标志物、贫血、甲状腺、孕筛查等项目，是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术，目前应用的自动化分析仪是分析中的取样、加试剂、去干扰物、混合、保温、比色、结果计算、书写报告和清理等步骤的部分或全部由模仿手工操作的仪器来完成，大大提高了工作效率及准确性。

胶体金免疫层析法原理

电化学发光免疫测定（Electrochemiluminescence immunoassay,ECLI）是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术，是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合的产物。 它的标记物的发光原理与一般的化学发光（CL）不同，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程。ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。ECL 不仅可以应用于所有的免疫测定，而且还可用于DNA／RNA探针检测。[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2006/08/200608290841_24973_1636364_3.gif[/img]

[font=宋体]在生物学和医学领域，免疫组化和免疫分型是两种常用的实验技术，它们各自具有独特的应用和优势。虽然这两种技术都涉及到免疫学的原理和方法，但它们在实验目的、操作过程、结果解读等方面存在显著的差异。本文将对免疫组化和免疫分型进行详细的比较和讨论，以揭示它们之间的区别。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]定义区别：[/font][/b][font=宋体][font=宋体]免疫组化（[/font][font=Calibri]Immunohistochemistry[/font][font=宋体]）是一种利用免疫学原理，通过特异性抗体与细胞或组织中的抗原进行反应，进而通过染色或标记等方法来定位和检测抗原的技术。其主要应用于组织切片或细胞涂片的染色，以观察和研究抗原在细胞或组织中的分布、定位及表达情况。免疫组化技术可以帮助我们了解细胞或组织的类型、功能状态以及病理变化，对于疾病的诊断、预后评估以及药物研发等方面具有重要意义。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]免疫分型（[/font][font=Calibri]Immunophenotyping[/font][font=宋体]）是一种通过检测细胞表面或细胞内的特定抗原，来识别和分析细胞类型的技术。该技术主要应用于对免疫细胞（如淋巴细胞、巨噬细胞等）进行分型，以了解其在免疫系统中的功能和作用。免疫分型技术可以帮助我们深入了解免疫系统的结构和功能，揭示免疫细胞在疾病发生和发展过程中的作用，为疾病的诊断和治疗提供新的思路和方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]实验目的区别：[/font][/b][font=宋体]免疫组化主要关注抗原在细胞或组织中的定位和表达情况，而免疫分型则侧重于对免疫细胞进行分型和功能分析。从操作过程来看，免疫组化通常需要对组织或细胞进行切片、固定、染色等步骤，而免疫分型则可能涉及到细胞的分离、培养、流式细胞术等操作。从结果解读来看，免疫组化的结果主要表现为抗原在细胞或组织中的分布和表达模式，而免疫分型的结果则提供了关于免疫细胞类型、比例和功能状态的信息。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]应用领域区别：[/font][/b][font=宋体]免疫组化在病理学、肿瘤学、神经科学等领域有广泛应用，可以帮助医生进行疾病的诊断和预后评估。而免疫分型则更多地应用于免疫学、血液学、感染病学等领域，有助于深入了解免疫系统的功能和疾病发生机制。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]综上所述，免疫组化和免疫分型是两种具有不同特点和应用领域的实验技术。虽然它们都涉及到免疫学的原理和方法，但在实验目的、操作过程、结果解读以及应用领域等方面存在显著的差异。因此，在实际应用中，我们需要根据研究目的和需求选择合适的技术手段，以获取准确、可靠的实验结果。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service][b]流式细胞检测技术服务[/b][/url]，详情关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/flow-cytometry-service[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

化学发光放大技术同样利用抗原一抗体反应原理,将酶或其他非放射性标记物标记于抗原或抗体,然后与已知抗原或抗体反应,标记的酶使反应底物进行发光,经光电倍增管测量后可得到被测样本的每秒钟发光计数CPS,再根据内置的标准曲线将CPS转换为样本的浓度值"由于这项技术的应用,使抗原一抗体的反应时间缩短,特异性程度和灵敏度得到提高,同时辅以单克隆技术的应用,使整个反应的全自动化实现成为可能,并一改过去依赖于手工加样,再交由仪器测量的半自动化技术的局面,也是近十年来免疫检验技术的一个飞跃。 化学发光免疫分析系统由以下子系统构成:反应杯传送系统,测试包被珠装载系统,样本装载系统,条码读取系统,试剂装载系统,加样系统,温育系统,离心清洗系统,发光计数测量系统,计算机控制系统组成。1.微粒子捕捉酶免疫分析技术(MEIA) 下面以双抗体夹心法为例介绍微粒子捕捉酶免疫分析技术:已包被了抗体的塑料微珠试剂中,加入待测标本后,经温育,再加入碱性磷酸酶标记的抗体!形成抗体一抗原一酶标记抗体复合物"然后将其转移到玻璃纤维柱上,用缓冲液洗涤,没有结合的抗原!酶标抗体被洗掉,结合抗原抗体的塑料微珠则被保留在纤维柱滤膜的上方"这时再加入底物,4一甲基伞型酣磷酸盐，酶标抗体上的碱性磷酸酶将4一甲基型酣磷酸盐分解,脱磷酸后形成甲基伞型酣,在365nm激发光的照射下,发出448nm的荧光,经过荧光读数仪的记录、放大,计算出所测物质的含量"。2.荧光偏振免疫分析技术(FPIA) 这是一种均相荧光免疫分析法,主要用于测定小分子量物质,如药物浓度测定"原理是:标记在小分子抗原上的荧光素经485nm的激发偏振光照射后,吸收光能,越入激发状态,激发状态的荧光素不稳定,很快以发出光子的形式释放能量而还原"发射出的光子经过偏振仪形成525～55Onm的偏振光,这一偏振光的强度与荧光素受激发时分子转动的速度呈反比,游离的荧光素标记抗原,分子小,转动速度快,激发后发射的光子散向四面八方,因此通向偏振仪的光信号很弱,而与抗体大分子结合的荧光素标记抗原,因分子大,分子的转动慢,激发后产生的荧光比较集中,因此偏振光信号比未结合时强得多"，在测定过程中待测抗原小分子!荧光标记抗原小分子和特异性抗体大分子同时加入到一反应杯中,经过温育,待测抗原和荧光标记抗原竞争性地与抗体结合,待测抗原越少,与抗体竞争结合的量越少,而荧光标记抗原与抗体结合量就越多,当激发光照射时,荧光偏振的程度与荧光标记物分子转动的速度成反比,而荧光标记的小分子抗原与大分子抗体结合后,其分子的转动速度减慢,因此荧光偏振信号强"结果是待测抗原的浓度低,可以通过计算获得其含量。3.利用化学发光技术和磁性微粒子分离技术相结合此方法以叮咤酶为发光的标记物,固相载体为极细小的磁性颗粒"其测定原理与放射免疫和酶联免疫中的双抗体夹心法和竞争结合法相似。4.采用酶联免疫技术!生物素亲和素技术和增强化学发光技术此方法是用辣根过氧化物酶(日RP)标记抗原或抗体!以子弹头型塑料小孔管为固相载体,鲁米诺为化学发光剂,并加入化学发光增强剂,可使化学发光强度增强,时间延长而且稳定。 在链霉亲和素包被的子弹头型塑料小孔管中,加入生物素标记的特异性抗体和待测标本,经过37e温育,链霉亲和素与生物素结合,特异性抗体与标本中的抗原结合,形成链霉亲和素一生物素一抗体一抗原复合物,经过洗涤,将多余的标本和生物素标记抗体除去，加入辣根过氧化物酶标记抗体,经37e温育,形成链霉亲和素一生物素一抗体一抗原一酶标抗体复合物,并固定在小孔管壁上，加入氧化剂日202,增强化学发光剂和鲁米诺,这时结合在固相载体上的辣根过氧化物酶在强氧化剂的作用下将增强化学发光剂亚铁原吟琳激活,接着它催化并激活鲁米诺发光,这种化学发光强渡比单独鲁米诺发光强,持续时间长,而且稳定,易于测定。鲁米诺发光强度经光量子记录系统记录,经计算从标准曲线上得出待测抗原含量。

[B]分子印迹技术在样品前处理中的应用[/B][I]作者：胡小刚 李攻科[/I]摘 要 分子印迹聚合物具有选择性高、稳定性好及制备简单的特点，可用于生物、医药、环境样品等复杂基体中痕量分析物的高选择性分离与富集，因此在样品前处理中的应用特别引人关注。本文介绍了分子印迹技术的基本原理，综述了分子印迹技术在样品前处理中应用的研究进展。关键词 分子印迹，样品前处理，固相萃取，固相微萃取，膜分离，评述1 引 言　　复杂基体如生物、医药和环境样品中痕量、超痕量物质分析要依赖高效和高选择性的样品前处理技术。但相对于仪器分析技术的发展，样品前处理技术的进展一直较缓慢。　　固相萃取(SPE)是70年代中期出现的技术。其萃取机制取决于分析物与固相（填充剂）表面的活性基团之间的分子间作用力。SPE填充剂主要为键合材料，如C8、C18离子交换树脂等，选择性不强，在富集分析物的同时，大量基体和干扰物质也被富集，导致洗脱液中仍含有基体和杂质，干扰最后的色谱分析。近来出现一种利用抗体自身选择性的免疫吸附剂[1]，作为固相萃取材料具有选择性高的优点，但制备复杂、耗时且可供选择的抗体种类少，机械强度和稳定性均较差。　　1989年Belardi等提出了固相微萃取(SPME)技术，SPME是基于分析物在流动相以及固定在熔融SiO2纤维表面的高分子固定相之间两相分配的原理，实现对样品中的有机分子进行萃取和富集。然后可直接在联用仪器中解吸、进样及分析，使样品预处理过程大为简化，提高了分析速度及灵敏度。与传统的样品前处理技术如液液萃取、索氏提取、SPE相比，克服了需使用大量溶剂和样品、处理时间长、操作繁琐、易产生二次污染及不易在线联用等缺点，在环境、食品、生物以及药物等领域得到了广泛应用。在SPME技术中，纤维涂层的材料是最关键的。但目前商品化的纤维涂层仅有少数几种，并且以非特异性吸附作用为主，选择性不够高，在样品前处理时仍有大量化学、物理性质相近的基体物质同时被富集,处理极性或碱性药物时会遇到较大的困难[2，3]。虽然一些文献报道了新的SPME涂层的研制工作[4~5]，但主要是用于测定挥发或半挥发性的有机环境污染物，急需研制出选择性更高的纤维涂层。　　分子印迹（MI）技术的发展，可望解决以上问题。分子印迹技术是将要分离的目标分子与功能单体通过共价或非共价作用进行预组装，与交联剂共聚制备得到聚合物。除去目标分子后，聚合物中形成与目标分子空间互补并具有预定的多重作用位点的“空穴”，对目标分子的空间结构具有“记忆”效应，能够高选择性识别复杂样品中的印迹分子。分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer, MIP）制备简单，能够反复使用，机械强度较高，稳定性好。因此它非常适合用作SPE的填充剂或SPME的涂层材料来分离富集复杂样品中的分析物，以达到分离净化和富集的目的。MIP作为膜分离的材料可将膜的筛分作用与MIP的高选择性结合在一起，用于样品的富集、回收或去除杂质等。　　2 分子印迹技术的基本原理　　MIP是以某种化合物分子为模板合成的聚合物，对模板分子具有较高的特异性识别能力，类似于酶底物的“钥匙锁”相互作用原理。目前，根据印迹分子与功能单体在聚合过程中相互作用的机理,将分子印迹技术分为共价法与非共价法两种类型。目前各类文献上报道的MIP制备方法基本上是非共价法。在此方法中，印迹分子与功能单体之间通过分子间的非共价作用预先自组装排列，以非共价键形成多重作用位点，这种分子间的相互作用通过交联聚合后保留下来。常用的非共价作用有：氢键、静电引力、金属螯合作用、电荷转移、疏水作用以及范德华力等，其中以氢键应用最为广泛［６］。 　　目前，文献报道中制备出的MIP一般均具有较好的物理和化学稳定性：机械强度较高；耐高温、高压；能抵抗酸、碱、高浓度离子及有机溶剂的作用；在很复杂的化学环境中能保持稳定[7]。研究表明，MIP反复使用300次之后印迹能力也未发生衰减[8]；保存八个月之后其性能不发生改变[9]。　　关于MIP的制备和性能研究，国内外已有较多综述文章详细介绍[10~12]，本文不再详述。[color=#DC143C][B]注：其他的三篇相关文献在4-6楼。[/B][/color]

利用酶联免疫法测定食品中氯霉素的原理是什么？

利用酶联免疫法测定食品中氯霉素的原理是什么？

近二十几年来，免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法（Enzyme—Linked Immunosorbent Assay，ELISA），本法自70年代初期由VAN WEEMEN、SCHUARS.ENGVALL及PERLMARN等相继分别报道后，现已引起广泛重视。 ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面： 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。 二、方法的基本原理和种类 ELISA的基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 由于ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有特异性。而另一方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物，它可以催化底物分子发生反应，产生放大作用，正因为此种放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此，ELISA法是一种既敏感又特异的方法。

[font=宋体][font=宋体]多重荧光免疫组化技术[/font] [font=Calibri](Multiplex immunohistochemical[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]mIHC) [/font][font=宋体]也称作酪氨酸信号放大 [/font][font=Calibri](Tyramide dignal amplification[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]TSA) [/font][font=宋体]技术，是一类利用辣根过氧化酶 [/font][font=Calibri](Horseradish Peroxidase, HRP) [/font][font=宋体]对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]这一技术基于酪胺信号的放大效应，实现对单个细胞或组织样本上多个目标靶点的同时检测。这为全面研究细胞组成、细胞功能以及细胞间的相互作用提供了强大的工具。通过多重荧光免疫组化技术，科学家们可以更深入地了解细胞的奥秘，揭示生命现象的复杂性。[/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]mIHC [/font][font=宋体]实验原理及流程[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]TSA [/font][font=宋体]技术采用 [/font][font=Calibri]HRP [/font][font=宋体]标记的二抗，[/font][font=Calibri]HRP [/font][font=宋体]催化加入体系的 [/font][font=Calibri]TSA [/font][font=宋体]衍生荧光染料，生成活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸共价结合，将信号共价结合到抗原上。之后用热修复洗去非共价结合的抗体，再换下一种一抗来第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]原理：[/font][/b][font=宋体][font=宋体]带有染料标记的底物酪胺[/font] [font=Calibri](T) [/font][font=宋体]分子在过氧化氢氧化环境下，被抗体或探针固定的 [/font][font=Calibri]HRP [/font][font=宋体]转化为具有短暂活性的中间状态 [/font][font=Calibri](T*)[/font][font=宋体]，然后被激活的中间态分子 [/font][font=Calibri](T*) [/font][font=宋体]迅速与相接蛋白分子的富含电子区域 [/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]酪氨酸残基[/font][font=Calibri]) [/font][font=宋体]进行稳定的共价结合，未被标记的酪胺分子将被洗脱，借此实现对抗原的特异性染色。由于相接的蛋白 [/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]包括 [/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]，抗体，目标抗原[/font][font=Calibri]) [/font][font=宋体]都含有大量的酪氨酸结合位点，所以目标抗原处会富集大量标记分子，使信号被有效放大 。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]多重免疫荧光染色的步骤包括样品制备、抗原诱导、抗原解露等。[/font][/b][font=宋体]具体如下：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①样品制备：根据细胞或组织的不同，选择不同的处理方式。对于细胞样品，需要固定和渗透化处理以保持其形状和蛋白质结构。对于组织样品，需要切片并进行染色前的去脂处理。[/font][font=宋体]②抗原诱导：如果目标标记物是蛋白质，那么需要选择适当的抗体来识别目标蛋白质。抗体可以人工合成或从动物体内提取。[/font][font=宋体]③抗原解露：对于细胞样品，可以利用活液解离细胞，并将细胞固定在载玻片上。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]IHC [/font][font=宋体]与 [/font][font=Calibri]mIHC[/font][font=宋体]区别与联系[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service][b]免疫组化[/b][/url]，是应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性的研究。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]简单来说，[/font][font=Calibri]mIHC [/font][font=宋体]属于 [/font][font=Calibri]IHC [/font][font=宋体]的升级版本！[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Tips[/font][font=宋体]：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]相同点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]能够完整显现组织原位形态信息。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]不同点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]常规免疫组化的分析属于定性分析，其判断大多依赖于经验，其分析结果会有差异。而多重荧光免疫组化属于定量分析，其利用软件可对组织中的细胞进行精准的结果分析。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]常规免疫组化受传统染色成像的限制，靶标少于 [/font][font=Calibri]3 [/font][font=宋体]个，无法完整分析组分信息。而多重荧光免疫组化可实现多因子共定位，可以获取更多的生物信息，且样本需求量较少。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供的[/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/fluorescent-multiplex-ihc-services][b]TSA[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/fluorescent-multiplex-ihc-services][b]法多重荧光免疫组化服务[/b][/url]，有一系列屏蔽自发荧光干扰的手段，配合激光共聚焦显微镜的拍摄条件，提供更优质的图像质量，收获更特异的染色结果。[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/fluorescent-multiplex-ihc-services[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b][font=Calibri] [/font]

B 1 的酶联免疫吸附测定原理：利用固定相酶联免疫吸附原理，将 AFB 1 特异性抗体包被于聚苯乙烯量反应板的孔穴中，再加入样品提取液（未知抗原）及酶标 AFB 1 抗原（已知抗原），使两者与抗体之间进行免疫竞争反应，然后加酶底物显色，颜色的深浅取决于抗体和酶标 AFB 1 抗原结合的量 , 即样品中 AFB 1 多，则被抗体结合酶标 AFB 1 抗原少，颜色浅，反之则深，用目测法或仪器法与 AFB 1 标样比较判断样品中AFB 1 的含量。最低检测浓度为0 。 01ug/kg 。

PCR................................................................................................................................. 2RT-PCR............................................................................................................................ 4琼脂糖核酸电泳............................................................................................................... 6胶回收纯化DNA.............................................................................................................. 6大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）.......................................................................... 7乙醇沉淀DNA.................................................................................................................. 8酶 切............................................................................................................................. 8连 接............................................................................................................................... 8感受态细胞的制备............................................................................................................ 9转 化............................................................................................................................. 10重组子的筛选和鉴定...................................................................................................... 10真核细胞的转染.............................................................................................................. 11转染细胞的稳定筛选....................................................................................................... 11重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量.......................................................................... 12肿瘤细胞体外传代培养及保种........................................................................................ 13肿瘤动物模型的建立...................................................................................................... 14小鼠尾静脉注射方法...................................................................................................... 14肿瘤蛋白疫苗预防性动物实验........................................................................................ 14人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养................................................................................. 14实验动物免疫方案.......................................................................................................... 15血清制备........................................................................................................................ 16ELISA............................................................................................................................ 16血清学筛选克隆新抗原/新基因....................................................................................... 17ELISPOT........................................................................................................................ 20藻酸盐包裹实验............................................................................................................. 21重组腺病毒构建，扩增及纯化基本技术操作................................................................... 21（细菌内同源重组AdEasy System）............................................................................... 21组织病理技术................................................................................................................. 26免疫组化染色................................................................................................................. 27流式细胞仪常用的几种检测方法..................................................................................... 29Western Blot(免疫印迹法)................................................................................................ 34PVDF膜上蛋白的可逆染色............................................................................................. 37人肿瘤抗原的识别与鉴定............................................................................................... 39－免疫沉淀实验流程...................................................................................................... 39蛋白质组实验流程.......................................................................................................... 41SDS-PAGE胶染色.......................................................................................................... 44数据库搜索(Databases search)......................................................................................... 45主要的公共数据库及网址............................................................................................... 46蛋白质的序列分析流程................................................................................................... 48聚丙烯酰胺凝胶的配制................................................................................................... 49双向电泳常用溶液配方................................................................................................... 51分子生物学常用溶液配制............................................................................................... 53另外给大家推荐一个资料共享的地方http://www.yiqi120.com/zlzx.asp,好东西大家一同分享.[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=128143]国内某重点实验室分子生物学实验方法与总结[/url]

免疫测定（immunoassay，IA）是应用免疫学技术测定标本的方法，其基本原理是抗原抗体的特异性识别。酶联免疫吸附试验 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是实验室比较常用的免疫检测方法。因为可用于农残的初筛,所以特转载本专题为您详细讲解免疫检测中的基础知识、实验操作步骤、影响因素及质量控制。希望大家能对它有所了解.

火箭电泳实际是一种定量免疫电泳。其原理为：在电场作用下，抗原在含定量抗体的琼脂介质中泳动，二者比例在合适时在较短时间内形成状似火箭或锥形的沉淀线，而此沉淀线的高度常与抗原量成正比关系，因此本法可以测定样品中抗原的含量。一、材料1. 诊断血清（抗体）：抗人IgG或IgA免疫血清。2. 待检血清（抗原）：人血清。3. 参考血清。4. pH8.6，离子强度0.05 M 巴比妥缓冲液配制（见对流免疫电泳实验）。5. 其它：琼脂粉，微量进样器，打孔器，玻璃板，电泳仪。二、方法1. 抗体琼脂板的制备同单向扩散法，但注意稀释液应用pH8.6离子强度0.05 M 的巴比妥缓冲液。2. 打孔见下图。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/02/B1361084635_small.jpg3. 将用缓冲液稀释的适宜浓度的参考血清及适当稀释的抗原（人血清）分别加入各孔中，每孔10或20 μl，要求加量准确而不外溢。4. 把加完样的免疫琼脂板放入电泳槽中进行电泳，电压4~6 V/cm，电泳时间1~5 h，直到大部分抗原孔前端出现顶端尖窄而完全闭合的火箭状沉淀线，关闭电源。5. 取下琼脂板，以抗原孔中心为起点，量出各火箭状沉淀线的高度。同单向琼脂扩散法绘制标准曲线，查出待检血清中Ig含量。

[font=宋体][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]又叫蛋白质印迹，是一种用于检测样本（如细胞提取物或组织匀浆）中特异性蛋白的技术，也用于分析体外合成的重组蛋白。蛋白免疫印迹法还可以根据某种抗原与其相对抗体之间的特殊亲和力来鉴定靶蛋白。蛋白免疫印迹法一般包含三个主要步骤分别为[/font][font=Calibri]SDS-PAGE[/font][font=宋体]、样品印迹和免疫学检测。通过蛋白免疫印迹法可以获得关于靶蛋白的定性和半定量数据。在蛋白质领域，蛋白免疫印迹法被广泛用于蛋白表达水平的检测。下面是关于蛋白质印迹[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]的常见问题解析：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、为什么抗磷酸化酪氨酸抗体会出现高背景或信号减弱？[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]检查您所使用的封闭液。脱脂奶粉适用于除磷酸化酪氨酸印迹外的所有印迹，磷酸化酪氨酸印迹具有与膜结合的磷酸化蛋白。使用该试剂进行封闭，潜在的表位会出现在印迹结果里。在该溶液中稀释抗磷酸化酪氨酸抗体将占据许多表位，可用于检测的抗体较少。我们建议使用含[/font][font=Calibri]1% BSA[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]TBS[/font][font=宋体]，含吐温[/font][font=Calibri]20[/font][font=宋体]作为封闭液，请勿使用牛奶。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、为什么随着时间的推移，蛋白免疫印迹法中的抗体活性会降低？[/font][/b][/font][font=宋体]如果您使用我们的一种抗体进行蛋白免疫印迹分析，并且反应性似乎随着时间的推移而降低，需要考虑的要点是：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]可能的原因及解决方案：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①原因一：使用了不同的样本。[/font][font=宋体]解决方案：培养的细胞会随着时间的推移而变性，因此我们建议解冻新鲜细胞。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②原因二：样品在储存期间或反复冻融后降解。[/font][font=宋体]解决方案：制备新鲜样品，避免反复冻融。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③原因三：抗体被污染。[/font][font=宋体]解决方案：旋转小瓶，检查是否有沉淀。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]④原因四：第二步的试剂不起作用。[/font][font=宋体]解决方案：更换第二步的试剂。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]⑤原因四：样品在储存过程中或在反复冻融后降解。蛋白质转印无效。[/font][font=宋体][font=宋体]解决方案：转印后用墨汁对印迹进行染色，确认蛋白从凝胶转印到印迹。请注意，抗体非常稳定，如果适当储存，不太可能随时间[/font][font=宋体]“消失”。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、如何避免转印不充分或结果不理想的问题？[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]确定蛋白质的大小。如果蛋白质大于[/font][font=Calibri]180 kDa[/font][font=宋体]，则需要通过以下方式优化转印条件：[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 使用[/font][font=Calibri]20% MeOH[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 加入[/font][font=Calibri]0.05% SDS[/font][font=宋体]转印缓冲液。[/font][/font][font=宋体]? 增加裂解物的上样量。[/font][font=宋体][font=宋体]? 在[/font][font=Calibri]1 A[/font][font=宋体]转印电压下转印[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]小时。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、如何避免“斑点状”或不均匀的蛋白免疫印迹？[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]为避免进行蛋白免疫印迹法时出现[/font][font=宋体]“斑点状”或不均匀的印迹，有以下几种方法[/font][font=Calibri]: [/font][/font][font=宋体]? 延长封闭时间，以优化封闭效果。[/font][font=宋体]? 延长洗涤次数 （这对组织匀浆样品尤为重要）。[/font][font=宋体]? 在加入印迹之前，确保奶粉完全溶于溶液。[/font][font=宋体]? 在取出抗体溶液使用之前，旋转装有抗体溶液的试管，防止出现蛋白沉淀。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri][b]5[/b][/font][font=宋体][b]、蛋白免疫印迹法应使用哪种印迹膜？[/b][/font][/font][font=宋体][font=宋体]我们建议使用硝酸纤维素膜。虽然[/font][font=Calibri]PVDF[/font][font=宋体]和其他类似的膜也可以使用，但有时会产生升高的背景，特别是山羊多克隆制剂。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、应该使用什么封闭缓冲液？[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]我们建议使用[/font][font=Calibri]1X TBS[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]5%[/font][font=宋体]牛奶、[/font][font=Calibri]0.05%[/font][font=宋体]吐温[/font][font=Calibri]-20[/font][font=宋体]。在室温下封闭[/font][font=Calibri]30-60[/font][font=宋体]分钟或在[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]℃下封闭过夜。请注意，如果孵育过夜，缓冲液中应不含吐温。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=Calibri]7[/font][font=宋体]、该抗体是否会在不同物种中与同种靶蛋白发生交叉反应吗？[/font][/b][/font][font=宋体]义翘神州所有抗体的主要种属反应性均通过蛋白免疫印迹分析来确定。这主要使用来源于原代种属的细胞系或组织进行。这主要使用源自主要物种的细胞系或组织进行。义翘神州网站上可查询主要种属反应性以及所使用的验证组织数据表。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]Western Blot[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service][b]检测服务[/b][/url]，服务内容包含：检测纯化蛋白、细胞或细胞裂解液、组织及组织裂解液、[/font][font=Calibri]Sally Sue[/font][font=宋体]高通量检测服务；更多详情可以参看：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service[/font][/font]

[font=宋体][font=宋体]多重荧光免疫组化（[/font][font=Calibri]TSA[/font][font=宋体]技术）是一种基于酪胺信号放大技术的染色方法，利用抗原抗体反应对样本中的多种蛋白标志物进行荧光染色标记。这种技术能在同一组织切片上实现多个靶标蛋白的共染色，最多可同时标记数十种蛋白，从而揭示组织微环境中的复杂信息。通过荧光图像分析，我们可以进行定量分析、细胞分型、以及空间关系分析等多方面的深入研究。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]一、技术原理[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]酪酰胺信号放大（[/font][font=Calibri]TSA[/font][font=宋体]）技术利用辣根过氧化酶（[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记。在[/font][font=Calibri]H2O2[/font][font=宋体]环境下，荧光标记的酪胺分子被[/font][font=Calibri]HRP[/font][font=宋体]催化激活，产生大量酶促反应，使荧光素与抗原紧密结合部位沉积，实现信号放大。[/font][font=Calibri]TSA[/font][font=宋体]技术通过循环使用不同荧光染料，可在一张组织切片上实现多种蛋白的共染色。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]二、优势[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①[/font][font=Calibri]TSA[/font][font=宋体]技术能够显著增强荧光放大信号，其增强幅度大约是普通荧光的[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]10[/font][font=宋体]倍，使得检测更为敏感和准确。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②在[/font][font=Calibri]TSA[/font][font=宋体]技术中，一抗抗体的种属来源不受限制。不同于普通荧光免疫组化共染的要求，[/font][font=Calibri]TSA[/font][font=宋体]技术每一轮染色后可以将上一轮的一抗和二抗洗掉，对后续染色无影响。这意味着同一种属来源的一抗并不会影响实验结果，为实验提供了更大的灵活性。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③在[/font][font=Calibri]TSA[/font][font=宋体]技术的实验过程中，无需严格避光。这是因为荧光素具有较高的稳定性，不易淬灭。即使在实验操作过程中没有采取避光措施，也不会对实验结果产生影响。更为便利的是，染色后的玻片可以保存数月之久而不发生淬灭，方便后续重新扫描和分析。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]三、注意事项[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①在准备染料时，要确保完全溶解并混合均匀。若试剂含有有机溶剂并出现沉淀，需先行过滤。[/font][font=宋体]②实验过程中，要防止切片干燥并注意避光，以保持荧光染料的稳定性，防止其淬灭，从而提高实验的准确性和可靠性。[/font][font=宋体]③选择高特异性的第一抗体是关键，它能更准确地识别目标蛋白，减少非特异性染色，从而提高实验的敏感性和特异性。[/font][font=宋体]④选择荧光染料时，要根据第一抗体的表达量来搭配。表达量高的应与弱光搭配，而表达量低的应与强光搭配，以平衡不同抗体间的荧光强度，使实验结果更准确可靠。[/font][font=宋体]⑤在实验前，务必制定详细的方案，包括确定染色顺序、修复条件和每一种抗体所搭配的荧光染料。通过合理的方案设计，可以确保实验的顺利进行，提高实验的一致性和可重复性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/fluorescent-multiplex-ihc-services][b]多重荧光免疫组化服务[/b][/url]，详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/fluorescent-multiplex-ihc-services[/font][/font]