蛋白质电泳仪功能原理

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前言蛋白质是生命活动的直接执行者，参与生命的几乎所有过程，包括遗传、发育、生殖、物质和能量的代谢、应激等，因此通过分析蛋白质结构和性质的异常就可以获得机体的受损或病变情况。但蛋白质分子结构与性质复杂多样，如何有效的分离和分析生物体中的各个蛋白质一直面临着严峻的技术挑战。毛细管电泳（ce）技术的出现，给解决这一挑战提供了新的途径，它能够从电荷、分子量等不同维度对蛋白分子进行高效的分离分析，因此得到了广泛的应用和发展。毛细管电泳技术的原理毛细管电泳法是以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法（图1）。图1 毛细管电泳技术的原理毛细管两端分别浸入在电泳缓冲液中，并且两端连接着高压电源。当高压电源施加稳定的高压时，毛细管内产生了电渗流，使得毛细管内液体整体向负极移动。同时由于进入到毛细管中样本所含组分的荷质比不同，不同物质在毛细管中的迁移速度则不同。不同片段依次经过检测窗时被光检测模块所检测，从而实现了不同组分的分离以及定性、定量检测的目的。毛细管电泳技术的优势相比于hplc等传统的分析分离手段，毛细管电泳技术拥有如下的主要优点（图2）：1.分离效率高，分析速度快：由于毛细管能抑制溶液对流，并具有良好的散热性，允许在很高的电场下(可达400v/cm以上)进行电泳，因此可在很短时间内完成高效分离。2.操作模式多，分析方法开发灵活：只要更换毛细管填充溶液的种类、浓度、酸度或添加剂等，就可以用同一台仪器实现多种分离模式。3.适合于微量样品的分析：毛细管内径极小（20-75um），进样为纳升级或纳克级，非常适合于稀少样品的检测分析。4.应用范围广：毛细管电泳在生命科学领域有广泛应用。在核酸检测方面，可用于一代测序或基因片段分析；而在蛋白质检测方面，可应用药物分析和临床诊断。图2 毛细管电泳的主要优势毛细管电泳在临床诊断中的应用作为一种高效的生物大分子分离分析技术，毛细管电泳在临床诊断领域的主要应用如下:1.多发性骨髓瘤：进行血清蛋白电泳、血清免疫分型的检测，是多发性骨髓瘤筛查和诊断的重要依据。2.地中海贫血：进行血红蛋白电泳检测，是地中海贫血筛查的重要手段。3.糖尿病：进行糖化血红蛋白检测，相比传统hplc等方法，能够排除异常血红蛋白的干扰。 聚拓生物聚拓生物为聚光科技集团成员企业，其自主研发的clincap 1000全自动毛细管电泳仪是专门为临床检验而设计的，具有全自动、高分辨的毛细管电泳仪可满足多种临床蛋白分析项目，为临床提供精准可靠的检测结果。系首款获得医疗器械认定的国产同类产品。

蛋白质组学是指在大规模水平上以蛋白质的生物多样性为基础，研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律、蛋白质翻译后修饰以及蛋白与蛋白之间相互作用等，从而揭示疾病发生、发展和药物治疗相关的规律与机制。随着质谱技术以及色谱与质谱联用技术的快速发展，蛋白质组学分析技术在未知蛋白质的鉴定、蛋白质结构的解析、靶向蛋白质定量、以及生物技术药物研发、质量控制和体内药代动力学研究方面应用越来越广泛。药典委拟制定《中国药典》蛋白质组学分析方法及应用指导原则，并于2024年2月20日发布公示稿（详见附件）并征求意见。该指导原则适用于蛋白质组学在蛋白质组成及其变化规律、蛋白质翻译后修饰以及蛋白与蛋白之间相互作用方面的分析研究，规范蛋白质组学分析方法建立，分析过程质量控制和数据分析，确保蛋白质组学分析结果的重复性与可靠性。蛋白质组学分析方法需要具备实用性强、多肽和蛋白的检测特性好以及合适的质控过程，保证分析结果的可靠性。同时蛋白质组学在操作过程中能够处理大量样品。蛋白质组学分析基本流程主要包括：1. 蛋白样品的提取，变性还原，酶解与多肽分离富集；2. 多肽的分析与鉴定；3. 数据分析。分离和富集技术：凝胶电泳和色谱技术分析与鉴定技术：质谱、二维凝胶电泳、X射线分析、核磁共振波谱和透射电子显微镜技术附件： 蛋白质组学分析方法及应用指导原则草案公示稿（第一次）.pdf

毛细管电泳技术具有高效分离、快速分析、试剂和样品用量少、绿色环保、前处理简单等优势，并使分析化学研究应用从微升水平进入纳升水平。毛细管电泳技术在生物制药、临床医学、手性药物、食品饮料、环境分析、法医鉴定等领域具有广泛应用，是蛋白质、核酸、有机物的有效分析技术，也使单细胞及单分子分析成为可能，并有更多应用领域尚待开发。作为新型微量分析技术，其应用领域十分广泛。 2017年，海能仪器与欧洲DL公司签署战略合作协议，购买了“高效毛细管电泳仪”相关专利实施许可权及非专利技术、软件所有权等全部技术产权。2019年，海能仪器历时2年完成了毛细管电泳仪全部技术的国产化，并实现了国产毛细管电泳仪的批量化生产。为推动毛细管电泳技术的应用普及，加快国产毛细管电泳仪器的发展和应用推广，由北京理化分析测试技术学会主办，于2019年8月21至22日在海能仪器产业园举行了“毛细管电泳应用技术研讨会”。十余位长期从事毛细管电泳技术研究和应用的专家莅临海能，参加此次研讨会，就毛细管电泳技术的应用以及国产化仪器的发展与推广进行研讨交流。 专家一行详细了解了海能仪器全产业链的生产模式，参观了海能文化馆，核心部件事业部、电路板车间、精加工车间、模塑车间、钣金喷涂车间，了解海能仪器为提升科学仪器品质和水平所做出的举措，并对国产毛细管电泳仪的发展寄予厚望。 与会专家围绕毛细管电泳技术应用的热点和国产毛细管电泳仪的未来发展前景进行充分交流，分享技术经验，提出有益建议。希望海能毛细管电泳仪为相关行业的分析人员提供更多的选择和更好的服务。

美国时间2011年2月28日，安捷伦科技宣布收购领先的电泳设备及耗材供应商Lab901公司。财务及收购其他条款尚未披露。 　　Lab901公司总部位于英国爱丁堡，开发和生产用于DNA、RNA和蛋白质研究的电泳产品，其主要产品是TapeStation台式电泳仪和ScreenTape及以塑料为基础的消耗品和相关试剂。 　　Lab901公司成立于2001年，员工约45人。Lab901的前首席执行官Joel Fearnley和公司所有的员工都将加入安捷伦公司，但是安捷伦并没有详细说明Joel Fearnley的具体职位。 　　安捷伦液相分离业务副总裁Patrick Kaltenbach在一份声明中说，此项交易使安捷伦能够满足用户在生命科学领域有关电泳应用的全部需求，从半自动化到兼容96孔板的工作流程。 　　“除了安捷伦现有的生物分析平台和Agilent G7100电泳系统，Lab901 公司的ScreenTape平台提供了一个具有广泛应用的，非常灵活、自动化和高通量的凝胶电泳解决方案，”他说。 ScreenTape平台 　　ScreenTape平台是一种快速、方便的自动化台式凝胶电泳解决方案，包括TapeStation台式电泳仪及ScreenTape及以塑料为基础的消耗品、相关试剂。用户只需加载样品和ScreenTape消耗品到紧凑TapeStation仪器上，一分钟就可以得到蛋白质、RNA和DNA样品的分析结果。 　　2009年底，Lab901公司从一家英国投资集团获得了400万美元的资金用于产品开发和提高ScreenTape平台的国际销售。

p 　　据仪器信息网编辑最新获悉，牟一萍女士目前已加盟蛋白质分析仪器及相关耗材设计制造商AES (Advanced Electrophoresis Solutions Ltd.)，并担任该公司联席首席执行官(Co-CEO)一职，同时还成为了AES公司董事会成员。 /p p style=" text-align: center " img style=" width: 450px height: 328px " title=" QQ截图20160329092644.jpg" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201603/insimg/da3c305a-524a-4b46-968f-1226ed553929.jpg" width=" 450" height=" 328" / /p p span style=" font-size: 16px " 　　 /span span style=" font-size: 16px " 作为一名成功的职业经理人，牟一萍女士拥有超过20年的生命科学企业领导经验。不久前，她曾在GE医疗集团生命科学事业部担任大中华区总经理一职，在此任职期间大中华区销售额保持了两位数增长的强劲速度，实现了年销售额超过2亿美元。在此之前，她还曾担任安捷伦科技全球副总裁兼生命科学和化学分析事业部大中华区总经理；在她的带领下，安捷伦科技大中华区在不到10年的时间内营业收入从5000万美元攀升至5亿美元，并成为了该公司在全球业务上增长最快的地区；牟一萍女士不仅擅于推动业务的有力增长，还建立了以客户为中心的企业文化，并打造了优秀的售前售后服务团队。 /span /p p span style=" font-size: 16px " /span 　　对于牟一萍女士的加盟，AES公司创始人兼Co-CEO黄铁民博士表示：“我们非常高兴和幸运牟一萍女士在这个重要时刻加入AES。AES在蛋白质分析仪器系统和全系列CEInfinite产品线的开发及商品化方面投入了巨大精力，接下来我们需要对公司业务的未来发展采取进一步措施，相信牟一萍女士的领导能力和丰富的销售及市场营销技巧将把我们的业务推向新的高度。” /p p 　　对此，牟一萍女士则谈到：“我一直在寻求带给客户新的技术。AES是一个充满活力和创新的公司，它已经开发出了蛋白质iCIEF分离和质谱耦合技术，这是生命科学行业一直在寻找的独特解决方案。AES是目前全球唯一能够提供这种专利技术的公司，我非常期待与大家一起合力促进AES技术的广泛应用，我期待由此带来的挑战与机遇。” /p p strong 关于AES /strong /p p 　　AES公司位于加拿大安大略省，是一家致力于为客户提供全柱成像检测毛细管电泳系统、试剂和耗材的公司。其最新推出的新一代毛细管电泳仪系统——毛细管电泳等电聚集-全柱成像检测技术（cIEF-WCID），用户借助cIEF-WCID技术，复杂蛋白质的分离和 pI点的测定变得异常轻松。该技术将成为蛋白质药物和抗体药物研发和质量控制、蛋白质组学基础研究和生物相互作用机制探索的强有力工具，同时也是食品安全中功能蛋白检测、育种、奶制品、肉类等最新的技术手段。 /p p style=" text-align: right " strong 编辑：刘玉兰 /strong /p

2014年3月12日，上海——今天，GE医疗生命科学与国家蛋白质科学中心上海（简称“中心”）的共建生命科学实验室在张江正式启用。这是GE公司在中国继成都卓越客户中心后又一个专注于科研与应用市场的研究平台。GE医疗生命科学部大中华区总经理牟一萍女士和国家蛋白质科学中心主任雷鸣教授共同出席了启用仪式并为实验室揭幕。 GE医疗作为世界知名的生命科学设备供应商，此次携手具有一流人才与科研水平的国家蛋白质科学中心，整合双方强大的生命科学设备与技术资源，将藉由该共建实验室的成立，创建国内首个合作型蛋白和细胞技术平台，通过方法开发，应用合作和专业人才培养，助力在结构生物学，生物医药、以及转化医学等领域的研究和应用转化，切实推动中国生命科学领域的研究和发展。 牟一萍总经理在致辞时表示，生命科学作为GE医疗集团的核心业务之一，坚持通过不断创新与技术合作来与全世界科学家共同探索生命科学的奥秘。此次与国家蛋白质科学中心合作共建生命科学实验室，是继2012年生命科学研发培训中心Fast Trak在上海落成，2013年生命科学卓越客户中心CoE在成都落成后，GE医疗致力于“立足中国，服务中国”在生命科学领域的又一重大举措。 合作共建生命科学实验室将借助国家蛋白质科学中心强大的蛋白质科学研究平台，引进GE医疗国际领先的技术和设备，实现强强联合，优势互补，携手共赢，共同推进中国生命科学的发展。 雷鸣教授在致词时也表示，中心的成立属于国家“十一五”战略规划之列，旨在结合国家蛋白质科学设施运维、研究及服务外部用户等定位，凝聚人才致力于蛋白质科学的研究。由于中心作为国家的大科学装置，将基于蛋白质设施独一无二的综合性、交叉性的科研仪器设备，重点投入力量推进新技术、新方法的研究与发展。此次中心携手GE医疗集团，将共同推进这一目标的达成。 目前，共建实验室针对蛋白质研究配备了AKTA purifier，AKTA pure，AKTA start系列蛋白纯化系统，Biacore T200生物分子相互作用系统，ITC200等温滴定量热仪，Cytell细胞图像分析仪，NanoVue Plus超微量分光光度计以及双向电泳仪等。未来，双方还将根据研究需要不断完善实验室的硬件设备。 据悉，GE医疗生命科学卓越客户中心未来将根据中国市场，尤其是科研及应用领域用户的需求，开发应用技术和方法，其范围涵盖细胞培养、基因重组、细胞收获、目标分离、目标纯化、目标活性等研究，并开发中药提取、有效成分鉴定、有效成分毒理与药理分析等。 人才培训将是该共建实验室的另一项重要职能。未来，这里作为GE医疗生命科学部在东部地区的主要培训基地，将为广大用户提供更加完善而系统化的产品及应用培训课程，更好满足华东地区客户的需要。 值此共建实验室启用之机，GE医疗生命科学部还举办了GE纯化系统和细胞图像分析仪新品见面会，详细介绍并演示了GE医疗蛋白纯化家族新成员--AKTA start入门级实验室制备色谱系统，以及最新发布的Cytell细胞图像分析仪。两款产品都非常适合蛋白质研究实验室，既操作简便满足常规实验室分析，又具备强大完善的功能为研究人员提供可靠的数据。会后，与会者又参观了位于张江华佗路的GE中国科技园区和生命科学FastTrak实验室。

项目编号：OITC-G220290791项目名称：ZYCGR22011901仪器平台（第二批）科研设备采购项目预算金额：310.0000000 万元（人民币）最高限价（如有）：280.0000000 万元（人民币）采购需求：包号货物名称数量是否允许采购进口产品预算金额（万元）最高限价（万元）1全自动蛋白质表征分析系统1套是1801652毛细管电泳仪1台是130115合同履行期限：详见项目需求。本项目( 不接受 )联合体投标。

1．蛋白质组学研究的研究意义和背景 随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析(Serial analysis of gene expression, SAGE)等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，从DNA mRNA 蛋白质，存在三个层次的调控，即转录水平调控(Transcriptional control )，翻译水平调控(Translational control)，翻译后水平调控(Post-translational control )。从mRNA角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相关性更差。更重要的是，蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质－蛋白质相互作用等则几乎无法从mRNA水平来判断。毋庸置疑，蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。蛋白质本身的存在形式和活动规律，如翻译后修饰、蛋白质间相互作用以及蛋白质构象等问题，仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。虽然蛋白质的可变性和多样性等特殊性质导致了蛋白质研究技术远远比核酸技术要复杂和困难得多，但正是这些特性参与和影响着整个生命过程。 传统的对单个蛋白质进行研究的方式已无法满足后基因组时代的要求。这是因为：(1) 生命现象的发生往往是多因素影响的，必然涉及到多个蛋白质。(2) 多个蛋白质的参与是交织成网络的，或平行发生，或呈级联因果。(3) 在执行生理功能时蛋白质的表现是多样的、动态的，并不象基因组那样基本固定不变。因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。因此在上世纪90年代中期，国际上产生了一门新兴学科－蛋白质组学（Proteomics），它是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象。可以说蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是后基因组时代生命科学研究的核心内容之一。 虽然第一次提出蛋白质组概念是在1994年，但相关研究可以追溯到上世纪90年代中期甚至更早，尤其是80年代初，在基因组计划提出之前，就有人提出过类似的蛋白质组计划，当时称为Human Protein Index计划，旨在分析细胞内的所有蛋白质。但由于种种原因，这一计划被搁浅。90年代初期，各种技术已比较成熟，在这样的背景下，经过各国科学家的讨论，才提出蛋白质组这一概念。 国际上蛋白质组研究进展十分迅速，不论基础理论还是技术方法，都在不断进步和完善。相当多种细胞的蛋白质组数据库已经建立，相应的国际互联网站也层出不穷。1996年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心：Australia Proteome Analysis Facility ( APAF )。丹麦、加拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心。在美国，各大药厂和公司在巨大财力的支持下，也纷纷加入蛋白质组的研究阵容。去年在瑞士成立的GeneProt公司，是由以蛋白质组数据库“SWISSPROT” 著称的蛋白质组研究人员成立的，以应用蛋白质组技术开发新药物靶标为目的，建立了配备有上百台质谱仪的高通量技术平台。而当年提出Human Protein Index 的美国科学家Normsn G. Anderson也成立了类似的蛋白质组学公司，继续其多年未实现的梦想。2001年4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织（Human Proteome Organization, HUPO）,随后欧洲、亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，试图通过合作的方式，融合各方面的力量，完成人类蛋白质组计划（Human Proteome Project）。2．蛋白质组学研究的策略和范围 蛋白质组学一经出现，就有两种研究策略。一种可称为“竭泽法”，即采用高通量的蛋白质组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质，这种观点从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，也更符合蛋白质组学的本质。但是，由于蛋白质表达随空间和时间不断变化，要分析生物体内所有的蛋白质是一个难以实现的目标。另一种策略可称为“功能法”，即研究不同时期细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。这种观点更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。 早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式（Expression profile）, 随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。蛋白质-蛋白质相互作用的研究也已被纳入蛋白质组学的研究范畴。而蛋白质高级结构的解析即传统的结构生物学，虽也有人试图将其纳入蛋白质组学研究范围，但目前仍独树一帜。3．蛋白质组学研究技术 可以说，蛋白质组学的发展既是技术所推动的也是受技术限制的。蛋白质组学研究成功与否，很大程度上取决于其技术方法水平的高低。蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难。不仅氨基酸残基种类远多于核苷酸残基（20/ 4）, 而且蛋白质有着复杂的翻译后修饰，如磷酸化和糖基化等，给分离和分析蛋白质带来很多困难。此外，通过表达载体进行蛋白质的体外扩增和纯化也并非易事，从而难以制备大量的蛋白质。蛋白质组学的兴起对技术有了新的需求和挑战。蛋白质组的研究实质上是在细胞水平上对蛋白质进行大规模的平行分离和分析，往往要同时处理成千上万种蛋白质。因此，发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。当前在国际蛋白质组研究技术平台的技术基础和发展趋势有以下几个方面：3.1 蛋白质组研究中的样品制备 通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。也可以进行样品预分级，即采用各种方法将细胞或组织中的全体蛋白质分成几部分，分别进行蛋白质组研究。样品预分级的主要方法包括根据蛋白质溶解性和蛋白质在细胞中不同的细胞器定位进行分级，如专门分离出细胞核、线粒体或高尔基体等细胞器的蛋白质成分。样品预分级不仅可以提高低丰度蛋白质的上样量和检测，还可以针对某一细胞器的蛋白质组进行研究。 对临床组织样本进行研究，寻找疾病标记，是蛋白质组研究的重要方向之一。但临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一。如肿瘤组织中，发生癌变的往往是上皮类细胞，而这类细胞在肿瘤中总是与血管、基质细胞等混杂。所以，常规采用的癌和癌旁组织或肿瘤与正常组织进行差异比较，实际上是多种细胞甚至组织蛋白质组混合物的比较。而蛋白质组研究需要的通常是单一的细胞类型。最近在组织水平上的蛋白质组样品制备方面也有新的进展，如采用激光捕获微解剖(Laser Capture Microdissection, LCM) 方法分离癌变上皮类细胞。3.2 蛋白质组研究中的样品分离和分析 利用蛋白质的等电点和分子量通过双向凝胶电泳的方法将各种蛋白质区分开来是一种很有效的手段。它在蛋白质组分离技术中起到了关键作用。如何提高双向凝胶电泳的分离容量、灵敏度和分辨率以及对蛋白质差异表达的准确检测是目前双向凝胶电泳技术发展的关键问题。国外的主要趋势有第一维电泳采用窄pH梯度胶分离以及开发与双向凝胶电泳相结合的高灵敏度蛋白质染色技术，如新型的荧光染色技术。 质谱技术是目前蛋白质组研究中发展最快，也最具活力和潜力的技术。它通过测定蛋白质的质量来判别蛋白质的种类。当前蛋白质组研究的核心技术就是双向凝胶电泳－质谱技术，即通过双向凝胶电泳将蛋白质分离，然后利用质谱对蛋白质逐一进行鉴定。对于蛋白质鉴定而言，高通量、高灵敏度和高精度是三个关键指标。一般的质谱技术难以将三者合一，而最近发展的质谱技术可以同时达到以上三个要求，从而实现对蛋白质准确和大规模的鉴定。3.3 蛋白质组研究的新技术 做过双向凝胶电泳的人一定会抱怨它的繁琐、不稳定和低灵敏度等缺点。发展可替代或补充双向凝胶电泳的新方法已成为蛋白质组研究技术最主要的目标。目前，二维色谱 (2D-LC)、二维毛细管电泳 (2D-CE)、液相色谱－毛细管电泳 (LC-CE) 等新型分离技术都有补充和取代双向凝胶电泳之势。另一种策略则是以质谱技术为核心，开发质谱鸟枪法(Shot-gun)、毛细管电泳-质谱联用 (CE-MS)等新策略直接鉴定全蛋白质组混合酶解产物。随着对大规模蛋白质相互作用研究的重视，发展高通量和高精度的蛋白质相互作用检测技术也被科学家所关注。此外，蛋白质芯片的发展也十分迅速，并已经在临床诊断中得到应用。3.4 蛋白质组生物信息学 蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础。瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大，种类最多的蛋白质组数据库。丹麦、英国、美国等也都建立了各具特色的蛋白质组数据库。生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了更方便有效的计算机分析软件；特别值得注意的是蛋白质质谱鉴定软件和算法发展迅速，如SWISS-PROT、Rockefeller大学、UCSF等都有自主的搜索软件和数据管理系统。最近发展的质谱数据直接搜寻基因组数据库使得质谱数据可直接进行基因注释、判断复杂的拼接方式。随着基因组学的迅速推进，会给蛋白质组研究提供更多更全的数据库。另外，对肽序列标记的从头测序软件也十分引人注目。4． 蛋白质组学发展趋势 在基础研究方面，近两年来蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领域，如细胞生物学、神经生物学等。在研究对象上，覆盖了原核微生物、真核微生物、植物和动物等范围，涉及到各种重要的生物学现象，如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等等。在未来的发展中，蛋白质组学的研究领域将更加广泛。 在应用研究方面，蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的方法之一。在对癌症、早老性痴呆等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面蛋白质组技术也有十分诱人的前景，目前国际上许多大型药物公司正投入大量的人力和物力进行蛋白质组学方面的应用性研究。 在技术发展方面，蛋白质组学的研究方法将出现多种技术并存，各有优势和局限的特点，而难以象基因组研究一样形成比较一致的方法。除了发展新方法外，更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特征。另外，蛋白质组学与其它学科的交叉也将日益显著和重要，这种交叉是新技术新方法的活水之源，特别是，蛋白质组学与其它大规模科学如基因组学，生物信息学等领域的交叉，所呈现出的系统生物学（System Biology）研究模式，将成为未来生命科学最令人激动的新前沿。

p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201601/insimg/4a14f65e-cb82-47d8-87d5-ea4b0d204756.jpg" title=" sss_56a5b6877c56c.jpg" / /p p 　　1、蛋白质组和基因组 br/ /p p 　　蛋白质组是指一种基因组所表达的全套蛋白质1，其英文为“proteome”。 有关蛋白质组的系统研究是蛋白质组学，英文为“proteomics”。基因组是生命体中全部基因的集合体，其英文为“genome”。有关基因组的系统研究是基因组学，其英文为“genomics”。 “proteome”和“proteomics”是由Marc Wilkins 及其同事于20世纪90年代初参照基因组和基因组学两个英文单词而创造出来的2。蛋白质组学是研发、利用、改进各种技术手段研究蛋白质组或在细胞某一生理通路中相关蛋白质集合的组成、结构、功能、代谢的一门新兴科学。 /p p 　　基因决定蛋白质的水平，然而，蛋白质的水平分为转录水平和表达水平，mRNA只包含前者，后者则是由mRNA被翻译所实现，而在翻译过程中通常伴随对蛋白质功能和活性起至关重要的修饰过程，如糖基化、泛素化等3。通过研究蛋白质组学，可以获取蛋白定位与修饰的定性信息和相关定量数据，丰富认知蛋白质表达水平和相关蛋白作用，对了解生命复杂活动有更深更全的认识。 /p p 　　2、蛋白质组的发展背景 /p p 　　自二十世纪九十年代以来，传统生物学得以突飞猛进地发展，并取得瞩目成就，其中三个重要点彪炳史册，也促使传统生物学获得质的转变。 /p p 　　第一 基因、表达序列标记(EST, expressed sequence tag)、蛋白质序列数据库的成长。细菌、酵母、线虫、果蝇的全部基因序列逐渐明了，甚至后来人类基因组计划也顺利告捷 其它的植物、动物、微生物也不断在探索。人们把已经掌握的基因分门别类地建立了序列数据库。 /p p 　　第二 生物信息学的发展。易获取的浏览型生物信息工具层出不穷，这种免费的网页式数据库可以让我们从其中获得所需的特殊的物质结构，如蛋白质结构中的结构域和模体等。 /p p 　　第三 寡核苷酸微阵列技术的发展。通过不同荧光标记的DNA样本同时与微阵列反应，形成不同荧光的现象，大幅提高Northern blot 的效率4。 /p p 　　3、蛋白质组学分类 /p p 　　蛋白质组学分类可有不同原则。 /p p 　　根据蛋白质来源可分为植物蛋白质组学、动物蛋白质组学、微生物蛋白质组学。植物蛋白质组学是以来源于植物或与植物相关蛋白质为研究对象，分析其在植物发生、生长、调节、凋谢等生命过程中的作用、功能、代谢、结构等的体系。同理，动物蛋白质组学是以来源于动物或与动物相关蛋白质为研究对象，最重要的一大内容就是研究人类相关蛋白质。微生物蛋白质组学是以来源于微生物或与微生物相关蛋白质为研究对象。 /p p 　　根据研究目的和阶段不同可分为结构蛋白质组学、表达蛋白质组学、功能蛋白质组学。结构蛋白质组学主要分析蛋白质大分子的多级结构形态，包括氨基酸顺序、二级结构、三级结构和四级结构 并着重于研究其共性结构特征和特殊功能基团 也是用于建立细胞内信号转导的网络图谱并解释某些特定蛋白表达对细胞产生特定的作用5。表达蛋白质组学是以经典蛋白质组技术如双向凝胶电泳和图像分析为方法着重于研究细胞内蛋白质表达过程及结果的体系3。功能蛋白质组学是以细胞内单一同种蛋白质功能体现、蛋白质之间、蛋白质与其他大分子之间相互作用关系为研究目的，研究和表述选定蛋白质，探明有关蛋白的修饰和信号转导通路，疾病机制或蛋白-药物作用关系3。 /p p 　　根据研究内容，还可分为组成性蛋白质组学、差异显示蛋白质组学、相互作用蛋白质组学。组成性蛋白质组学是鉴定某个体系的蛋白质并阐述其翻译后修饰的特性。差异显示蛋白质组学又名比较蛋白质组学，是对重要生命过程或人类重大疾病进行生理、病理体系或过程的蛋白质表达比较。相互作用蛋白质组学则是研究蛋白质间相互作用，绘制某体系蛋白质作用网络图谱8。 /p p 　　4、白质组学研究工具 /p p 　　蛋白质组学研究的重要工具主要有四个。 /p p 　　第一，蛋白质、表达序列标记(EST, expressed sequence tag)、基因序列数据库的建立与成熟 也可以说是生物信息学。因为蛋白质组学中所用的大多数技术所获得的数据通常都是高通量、高复杂度的，只有通过生物信息学分析才能对蛋白质的种类、结构和功能进行分析确定。 /p p 　　第二，质谱(MS)技术。其将样品分子离子化，根据离子间质荷比的差异分离并确定质量，实现高灵敏度、高特异性。首先，质谱技术能准确测量高达100kDa的完整大分子蛋白质，其准确度和特异度比SDS-PAGE还要高。其次，质谱技术也能准确测量从蛋白质分解下来的多肽。最后，它还可以测定多肽的氨基酸顺序，即多肽测序4。现有三条途径，一是肽链质量图谱，二是串联质谱途径，三是联合途径7。其中一种较理想的技术平台是表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SEL-DI)技术，可分析疏水性蛋白质、pI过高或过低蛋白质、低分子量蛋白质(& lt 25 000)和未经处理的样品中许多被掩盖的低浓度蛋白质，短时间内即可获得蛋白质的分子量、PI、特殊修饰位点等参数8。 /p p 　　第三，能将MS数据与数据库中特异的蛋白质顺序匹配的软件。它是快速、特异地将第一和第二工具联系在一起的分析方式。 /p p 　　第四，蛋白分析分离方法。通过蛋白分析分离方法可以简化蛋白复合物，同时产生不同蛋白质差异比较方法。普通的蛋白质分析分离方法包括1D-SDS-PAGE、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳(CE)、等点聚焦电泳(IEF)等。其中二维凝胶电泳如2D-SDS-PAGE是目前蛋白质组学中分离单一蛋白质的广泛应用方法。当然，多维分析分离方法是最理想的分离蛋白质和多肽的方法，譬如，离子交换液相色谱与反相高效液相色谱串联形成的分离系统是分离多肽混合物的有力方法4。 /p p 　　5、白质组学的应用 /p p 　　蛋白质组学原则性应用包括四个方面4：组成性应用、蛋白质表达模型、蛋白质网络图谱、蛋白质修饰图谱。组成性应用是指运用质谱及其相关技术将目的蛋白质按相关标准定性或定量地纳入蛋白质数据库，在此过程中研发相应技术的应用。蛋白质表达模型是指研究在生理或病理状态目的蛋白质在细胞内定位并表达情况，同时研究细胞在暴露物理、化学、药物等因素下蛋白质表达状况。蛋白质网络图谱是研究两种或两种以上蛋白质在生物体内组成结构、表达功能、调节控制间作用情况。蛋白质修饰图谱是探明蛋白质的修饰定位及修饰后功能表现。 /p p 　　当然，蛋白质组学在生活中无处不在，疾病、食品、植物、药品等等。 /p p 　　蛋白质组学在疾病中应用方向主要是发现新的疾病标志物，以探明疾病发生机制、发展变化，为治疗途径提供思路。Brea等利用双向电泳串联质谱技术，差异比较心源性脑栓塞患者和粥样硬化血栓性梗死患者各12例的血清蛋白，发现触珠蛋白相关蛋白和淀粉样蛋白A等蛋白质在粥样硬化血栓性梗死患者血清中显著升高9。 /p p 　　蛋白质组学在食品中应用方向主要是检测食品中过敏源检测、鉴定食品成分等，也给食品科学研究提供了新的研究思路和技术3。李明云等优化了相应的试验条件，并将蛋白质组双向电泳相关技术引入大黄鱼肝脏蛋白质分析中，得到了较清晰的大黄鱼肝脏蛋白双向电泳图谱。 /p p 　　蛋白质组学在植物中应用方向主要是植物群体遗传、环境信号应答与适应机制、植物组织器官、植物亚细胞等7。其中，如果研究的植物是农作物如棉花、马铃薯、水稻等，就可以简单地视作蛋白质组学在农业中的运用了。Chang等对玉米强制缺氧和低氧研究，发现低氧处理的效应不仅是氧气含量过低诱导增加糖酵解酶，通过质谱鉴定了46个相关蛋白质10。 /p p 　　蛋白质组学在药品中应用方向主要是药物研发、药物作用机制、耐药机制、药物毒理学等。在对紫杉醇类药物抗癌作用研究中，Bauer等对乳腺癌复发患者进行紫杉醇类药物治疗后进行蛋白质组学分析，发现a-防卫素可作为预测该类药物治疗乳腺癌治疗作用的生物标记物11。 /p p 　　6、展望 /p p 　　蛋白质组学在短短30年间发展迅猛，渗入到生活的许多方面，也对保证人类生存质量和良性繁衍有重大作用。但其思路不开阔，技术高效性、灵敏性、特异性仍有待提高，应用普及度低，蛋白质分离、纯化技术研发，基因组学丰富度低是制约蛋白质组学及其相关技术发展的瓶颈。不过，相信随着物理技术和化学方法的不断发展，研究水平的深入，蛋白质组学会随着基因组学的发展得到更进一步地丰富。 /p p 　　参考文献： /p p 　　1.诗，吕建新主编《分子生物学检验技术》第2版 /p p 　　2.Pandey A, Mann M. 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为进一步促进我国蛋白质组学技术发展及应用，北京蛋白质组研究中心、蛋白质组学国家重点实验室和中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业委员会于2010年7月20-23日在北京中关村生命科学园联合举办“第一期蛋白质组学技术与应用高级培训班”。 　　北京蛋白质组研究中心(BPRC)于2004年成立，是蛋白质组学国家重点实验室的主体，是国家蛋白质组学研究基地和国际人类肝脏蛋白质组计划(HLPP)执行总部，建立了系统的具有国际先进水平的蛋白质组学技术平台，牵头承担着中国人类肝脏蛋白质组计划、国家973和863计划以及国家自然科学基金项目等100余重要科研项目。中心于2006年通过了ISO/IEC 17025(CNAS- CL01)实验室认可，以标准化的管理面向社会各界开放提供科研技术服务。 　　本期培训班由北京蛋白质组研究中心、军事医学科学院等国内从事蛋白质组学研究的一线专家授课，7月20-21日将就“蛋白质组学的技术与方法、实验难点与关键点、研究前沿与热点”等主题进行讲座，22-23日实验演示观摩。参加本期培训班的学员可以享受中心提供的技术服务优惠政策。 　　一、培训内容 　　(一)讲座 　　蛋白质组技术策略与应用概述 钱小红 　　蛋白质组研究中的样本制备技术 姜 颖 　　蛋白质组研究中的分离技术 张养军 　　蛋白质组研究中的鉴定技术 蔡 耘 　　蛋白质组研究中的数据分析技术 朱云平 　　SNP相关技术及应用 周钢桥 　　蛋白质相互作用研究技术与应用 王 建 　　疾病蛋白质组研究技术与应用 孙 薇 　　多肽组学研究进展 魏开华 　　蛋白质定量研究 徐 平 　　实验室参观：生物样本制备实验室、质谱鉴定实验室、蛋白质相互作用实验室。 　　(二)实验演示观摩(每项半天时间) 　　1、二维荧光差异凝胶电泳技术(2DE-DIGE) 　　在一块胶中使用三色荧光标记，同时对两个样品进行比较，大大减少了实验误差，提高了检测灵敏度和动态范围，自动分析软件简化分析流程。特别适用于入组标本例数较多，个体差异较大的差异蛋白质组比较研究。 　　2、色谱分离技术 　　结合分析型高效液相色谱、毛细管高效液相色谱以及与质谱的联用，重点介绍一般色谱系统的基本组成、各部件的基本功能、基本操作和应用中的问题及解决方法，全面了解高效液相色谱在蛋白质和多肽分离中的应用。 　　3、MALDI TOF/TOF质谱仪操作使用 　　主要包括：样品脱盐、基质配制、点靶、硬件检查与参数设置、样品表编辑、激光控制、手动采集、自动批量采集、仪器校正、二级谱采集、谱图平滑与基线处理、标峰、DataExplore操作、数据导出、数据库维护、仪器维护等。 　　4、液质联用质谱仪鉴定蛋白 　　液质联用(LC-ESI-MS)技术是针对蛋白质组学研究中复杂样本的最佳鉴定手段之一。反相HPLC连接纳升级的电喷雾离子源，以线性离子阱质谱作为手段，能够高效、准确、灵敏地连续鉴定。本期介绍实现最佳鉴定效果的关键：液相分离条件和质谱仪参数的设置，以及搜库技巧等。 　　二、培训特点 　　本次培训注重前沿技术分析，在系统梳理原理的基础上让学员掌握前沿技术 培训班在北京中关村生命科学园内举行，培训结合蛋白质组学理论讲解和实验现场演示，形成有效的技术支持 培训班针对具体技术问题可提供个性化实验设计。研讨班结束后颁发蛋白质组学培训证书。 　　三、时间和地点 　　报到：2010年7月19日9：00-18：00，20日9：00-10：00，北京海燕药业海诺康会馆(北京市昌平区生命园路16号，与北京蛋白质组研究中心隔湖相望) 　　讲座：2010年7月20-21日，北京海燕药业海诺康会馆 　　实验观摩：2010年7月22-23日，北京蛋白质组研究中心(北京市昌平区科学园路33号) 　　四、参加办法及培训费用 　　填写回执后Email/邮寄/传真至北京蛋白质组研究中心，提前注册截止日期：2010年6月18日，以银行汇款凭证为准。 　　培训费用包含会务费、培训资料和会期用餐。食宿统一安排，住宿费用自理，需住宿的请在回执中填写住宿信息。 　　(一)讲座 　　2010年6月18日前注册：每人1100元，学生900元 　　2010年6月18日后注册：每人1200元，学生1000元。 　　(二)实验演示观摩 　　2010年6月18日前注册：每人￥650元/项/半天，学生450元/项/半天 　　2010年6月18日后注册：每人￥700元/项/半天，学生500元/项/半天。 　　学生报到时须持学生证。 　　五、汇款信息 　　帐 号：0200004909200041055 　　账户名称：北京蛋白质组研究中心 　　开户银行：工商银行北京市永定路支行 　　注：汇款时请务必注明学员姓名、单位和“蛋白质组学培训班”字样。汇款后将汇款凭据传真至中心，或将扫描电子版发送至邮箱sky_proteomics@sina.com，以确保汇款安全到账。 　　六、联系方式 　　联系人及电话：注册：周建平(010)80705888 张雪莉(010)80705188 　　咨询：史冬梅(010)80727777-1520 　　传 真：(010)80705155 　　电子邮件：sky_proteomics@sina.com 　　通信地址：北京市昌平区科学园路33号(102206) 　　北京蛋白质组研究中心 　　蛋白质组学国家重点实验室 　　中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业委员会

p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　詹显全，中南大学教授、博士研究生导师、博士后合作导师，英国皇家医学会会士(FRSM)、美国科学促进会(AAAS)会员、欧洲预测预防个体化医学协会(EPMA)的会士和国家代表、美国肿瘤学会(ASCO会士、欧洲科技合作组织(e-COST)的海外评审专家，中国抗癌药物国家地方联合工程实验室技术委员会委员、技术带头人和副主任，临床蛋白质组学与结构生物学学科学术带头人和学科负责人，国家临床重点专科建设项目重点实验室建设项目学科带头人，湖南省百人计划专家、湖南省高层次卫生人才“225”工程医学学的学科带头人、中南大学“531”人才工程专家。目前正致力于从多参数系统策略角度阐述肿瘤的分子机理、发现肿瘤分子标志物，研究并整合基因组、转录组、蛋白质组和代谢组的变异来实现肿瘤的预测、预防与个体化治疗及精准医学。已发表学术论文130 余篇，主编国际学术专著3 本，参编国际学术专著16 本，获得美国发明专利2 个。受邀在中科院1 区影响因子9.068 MassSpectrometry Reviews 和中科院2 区影响因子3.65 Frontiers in Endocrinology 的国际期刊上客座主编了3 个专刊。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em text-indent: 2em " 本篇文章仪器信息网获得授权转载，来源中国科技成果杂志。 /p p style=" text-align: center line-height: 1.75em " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 深入剖析蛋白质组学技术最新进展与应用 /strong /span /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　詹显全：人类结构基因组测序接近尾声，人们就从结构基因组学研究转向功能基因组学研究，即对转录组和蛋白质组进行研究。1995 年正式提出了”蛋白质组”和”蛋白质组学”的概念，距今已有25 年历史了。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em text-indent: 2em " 蛋白质组学的主要技术包括蛋白质组的分离技术、鉴定技术和蛋白质组信息学技术。 span style=" text-indent: 2em " 蛋白质组的分离技术主要有双向凝胶电泳(2DE)和多维液相色谱(2DLC)。蛋白质组的鉴定技术主要是基于质谱(MS)的技术，主要分为肽质指纹(PMF)和串联质谱(MS/MS)分析技术，其用于蛋白质大分子分析的两大离子源主要有MALDI 和ESI。质谱技术发展很快，主要朝向高灵敏度、高通量和高精度方向发展。 /span /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　蛋白质组信息学技术主要是用来构建蛋白质相互用网络的相关技术。蛋白质组的分离技术和质谱技术的不同联合就形成了各种类型的蛋白质组学分析技术：如2DE-MS和2DLC-MS。2DE-MS 又有2DE-MALDI-PMF 和2DE-ESI-LC-MS/MS, 该技术在蛋白质组学研究的头10-15 年是其主要技术，然而常规概念认为2DE 的通量不高，即一个2D 胶点中一般仅含有1 ～ 2 个蛋白质，通常一次实验其通量仅能鉴定几十到一千个蛋白质，这样其在蛋白质组学中的地位逐渐被淡化。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em text-indent: 2em " 2DLC-MS 主要有iTRAQ or TMT-based SCX-LC-MS/MS and labelfree LC-LC-MS/MS, 这就是人们通常说的“Bottomup”蛋白质组学，该技术在最近10 ～ 15 年在蛋白质组学中起着核心技术的作用，因为其通量明显增加，一次实验其通量可达到几千到一万的蛋白质能被鉴定，但该法鉴定的结果是一个protein group, 实质上鉴定的是编码蛋白质的基因, 而并没有鉴定到真正意义上的蛋白质，即蛋白质存在形式(Proteoforms 或Protein species)。蛋白质存在形式(Proteoforms)是蛋白质组的基本单元。人类基因大约2 万个，人类转录本至少10 万个，每个转录本指导核糖体按三联密码子决定一个氨基酸残基来合成氨基酸序列，刚合成出来的蛋白质氨基酸序列是没有功能的，它必须到达其指定的位置如胞内、胞外，和不同的亚细胞器等，形成特定的三位空间结构，并与其周围的相关分子相互作用，形成一个复合物(complex)才能发挥其功能作用。从核糖体刚合成出来到其指定的位置过程中有很多的蛋白质翻译后修饰(PTMs 据估计人体有400 ～ 600 种PTMs)。我们最近对蛋白质存在形式的概念给出了最新最完整的定义：蛋白质的氨基酸序列+ 翻译后修饰+ 空间构型+ 辅助因子+ 结合伴侣分子+ 空间位置+ 特定的功能。而蛋白质的概念被定义为：由同一个基因编码的所有蛋白质存在形式的集合体。这样，人类蛋白质组中的蛋白质存在形式(Proteoforms)至少有100 万或甚至达10 亿 (图1)。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 427px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/1d18fad3-b010-4ea5-a812-432853ad4ec6.jpg" title=" 1111111.png" alt=" 1111111.png" width=" 600" height=" 427" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center line-height: 1.75em " 　　图1 ：Proteoforms 的概念及形成模式 (Zhan et al,Med One, 2018 Zhan et al., Proteomes, 2019) /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　如此庞大数量的Proteoforms/Protein species, 如何对其进行大规模的探测、鉴定和定量，是一个至关重要的事情。目前关于Proteoforms 的研究有两套策略一是“Top-down”MS 技术， 二是“Top-down” 和“Bottom-up”相结合的技术即2DE-LC/MS 技术(图2)。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 415px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/94f48c94-fd0b-4959-90fb-dd399cebf074.jpg" title=" 2.png" alt=" 2.png" width=" 600" height=" 415" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center line-height: 1.75em " 　　图2 ：Proteoforms 研究技术比较(Zhan et al., Med One, 2018 Zhan et al., Proteomes, 2019) /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　“Top-down”MS 技术能探测、鉴定和定量Proteoforms，获得蛋白质的氨基酸序列和PTMs 信息，然而该技术的通量较低，目前最大通量鉴定到5700 个Proteoforms, 对应到860 蛋白质。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　最近，詹显全教授团队发现2DE-LC/MS 技术是一超高通量的技术平台，在探测、鉴定和定量Proteoforms方面, 可以鉴定达几十万至上100 万的Proteoforms。随着质谱灵敏度的显著提高，自2015 年以来，詹显全教授团队就发现每个2D 胶点包含了平均至少50 个甚至达几百个Proteoforms，并且大多数是低丰度的 并在近1 ～ 2 年来发表了相关论文来全面阐述2DE-LC/MS 的新理念和实践，完全打破了40 多年来人们对双向电泳的传统认识 (即一个2D 胶点中一般仅含有1 ～ 2 蛋白质)，为大规模的Proteoforms 研究提供了技术基础。Proteoforms/Protein species 概念的发展极大的丰富了蛋白质组的内涵，是蛋白质组学研究的更高层次，是国际科学发展的前沿，必将影响着整个生命科学和医学科学的研究和实践，有助于发现可靠而有效的疾病标志物，用于深度理解疾病分子机制和决定药物靶点，或者用于有效的预测、诊断、预后评估。另外，蛋白质组是表型组的重要成分，是基因组功能的最终执行者，是基因组和转录组研究所不能替代的，要实现真正的个性化医学和精准医学，蛋白质组学研究是不能绕过去的。 /p p style=" text-align: center line-height: 1.75em " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 基于整合组学发现疾病标志物才是精准发展之重 /strong /span /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　1. 您一直专注于肿瘤蛋白质组学的研究，例如垂体瘤、卵巢癌等相关恶性肿瘤结合组学的研究，请谈谈在这方面的最新的研究成果，以及过程中的主要挑战和解决方案 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　詹显全： 垂体瘤是颅内常见肿瘤，绝大多数是良性的，只有少数具有侵袭性和恶性，并能引起激素分泌紊乱和颅内压迫症状，出现严重的临床症状，危害人体健康。临床上分为功能性垂体瘤和非功能性垂体瘤，并且非功能性垂体瘤不表现血中激素水平增加，不易早期诊断，经常是当肿瘤体积增加到压迫周围组织器官产生压迫综合征时才被诊断，这时已经是中晚期了，且其分子 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　机制并不清楚，缺乏早期诊断标志物和药物治疗靶标。因此，非功能性垂体瘤被选为主要研究对象。虽然垂体瘤是在颅内，但我们认为垂体瘤是一种多病因、多过程、多结果的全身性的慢性疾病，并且还具有肿瘤的异质性 它涉及到一系列的分子改变，包括发生在基因组、转录组、蛋白质组、代谢组和相互作用组水平上的改变，而这些不同水平改变的分子和信号通路又不是孤零零的起作用，而是相互间具有千丝万缕的联系。因此，我们很难用一种单一因素来解决其预测、预防、诊断、治疗和预后评估 而必须从单因素模式转向多参数系统思维模式。垂体瘤的多病因、多过程、多结果、全身性、慢性、分子网络系统性给其“同病同治”提出了严峻挑战，同时为实现其个性化的精准预测、精准预防、精准诊断和精准治疗提供了机遇和条件。多组学(基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、影像组学)和系统生物学技术的发展驱动了这一多参数系统思维模式的转变、推进了其个性化医学和精准医学的研究和实践。因此，我们认为多参数系统策略观和多组学是进行垂体瘤个性化医学和精准医学的研究和实践的重要理念和技术方案。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　我们从2001 开始进行垂体瘤的蛋白质组学及其翻译后修饰组学研究，从2008 年开始进行多组学和分子网络研究，及预测预防个体化医学(PPPM)和精准医学(PM)研究。经过过去近20 年未间断的研究，我们在垂体瘤的蛋白质组学、翻译后修饰组学、多组学、分子网络和系统生物学研究方面在国际上处于了主导地位。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　在我们研究过程中，我深深体会到一个重大思转变就是从以前的单参数模式转向了多参数系统思维模式，这符合肿瘤的真实情况。另外，就是多组学技术促进了这一模式的转变，并是其主要的解决方案。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　2. 从您的研究方向及重点出发，您认为多组学研究在精准医学中接下来的研究应当侧重于哪些方面，以及如何才能比较好的实现从研究到临床的转化落地? /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　詹显全：我的研究对象是肿瘤(垂体瘤、卵巢癌、肺癌、胶质瘤)，研究理念是肿瘤的多参数系统策略观，技术手段是多组学和系统生物学，研究的目标是要解决肿瘤的预测预防个体化医学(PPPM)和精准医学(PM)。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　我们认为多组学中的不同组学对PPPM/PM 的贡献是不平衡的，即个性化的表型组是基因组通向PPPM/PM 应用实践的桥梁，而蛋白质组和代谢组是表型组中两重要成分。蛋白质组的内涵包括蛋白质的拷贝数变化、剪切变化、翻译后修饰、转位、再分布、空间构型、与周围分子相互作用、及信号通路网络问题。代谢组的内涵涉及到体内所有物质(包括糖、脂、蛋白质、核酸)的代谢产物及其代谢网络问题。要真正实现PPPM 和PM，蛋白质组和代谢组的贡献是基因组所不能替代的是不能绕过去的。人们应从以基因组为中心的研究和实践转向以表型组为中心的研究和实践。其中蛋白质组的研究又应以翻译后修饰和蛋白质存在形式(Proteoforms)作为今后的研究方向。Proteoforms 的研究必将影响着整个生命科学和医学科学。从临床转化研究来看，基于多组学的整合生物标志物是发展方向。对于这里的生物标志物，我们将其分为两类：一类是解决疾病分子机制和药物靶点的生物标志物，这类生物标志物一定要有因果关系 一类是解决预测、诊断、预后评估的生物标志物，这类标志物不一定要求有因果关系，但必要要有量的变化。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　3. 作为EPMA(欧洲预测预防个体化医学协会)的中国代表，想请您分享下国际上对于组学研究在精准医疗中的应用现状、趋势以及发展规划 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　詹显全：欧洲预测预防个体化医学协会(EPMA)是国际个体化医学领域领头的学术协会，由来自全球55 个国家和地区的专家学者组成，其创办的官方杂志EPMA Journal( 中科院2 区，ESI IF5.661) 涵盖了24 个专题内容，较全面地反映了预测预防个体化医学(PPPM)和精准医学(PM)的研究、实践与最新动态，还涉及到PPPM 和PM 的政策、伦理、卫生经济和社会保障等许多方面，为PPPM 和PM 的科研、实践提供了一个很好的交流平台。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em text-indent: 2em " 我本人作为EPMA 的中方代表(National Representative of EPMA in China) 和其官方杂志EPMA Journal 的副主编，参与了其经历的重要活动。我从2008 开始起在EPMA 中主要负责多组学和创新技术方面，在EPMA 白皮书中的“肿瘤预测预防个体化医学的多参数系统策略观”这部分最早就是我写的，之后我们写了一系列文章来论述基于多组学的多参数系统策略的研究和实践。因此，在EPMA，我们的基于多组学的多参数系统策略观还是比较早的，近五六年来多组学研究在EPMA 圈内(55 个国家和地区)发展得很快，已经深入到PPPM 的各个领域。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　另外，我认为，精准医学在理念上没错，严格意义上的精准医学是个理想化的概念，人们只能无限去逐步接近它。现阶段搞精准医学还是要回归到人类健康的保护过程，即预测、预防、诊断、治疗和预后评估，这里应该是针对个人来说而不是针对群体，严格说来应该是个性化的精准预测、精准预防、精准诊断、精准治疗和精准预后评估。对于人类健康保护过程来说，预测、预防还是上策，其次就是早诊断、早治疗。多组学研究已渗入到人类健康保护过程的每个环节，主要用来寻找基于多组学的生物标志物，当然这里的生物标志物应泛指前面说的两类：一类是解决疾病机制和治疗靶点的标志物，一类是解决预测、诊断、预后评估的标志物。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em text-indent: 2em " 因此，基于多组学的PPPM/PM 的研究和实践一定是今后发展的一个长远趋势。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 802px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/581ff7cf-5c3e-4fd6-8f5f-805989791ee5.jpg" title=" 詹.jpg" alt=" 詹.jpg" width=" 600" height=" 802" border=" 0" vspace=" 0" / /p p br/ /p

为进一步促进我国蛋白质组学技术发展及应用，北京蛋白质组研究中心、蛋白质组学国家重点实验室和中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业委员会于2010年7月20-23日在北京中关村生命科学园联合举办“第一期蛋白质组学技术与应用高级培训班”。 　　北京蛋白质组研究中心(BPRC)于2004年成立，是蛋白质组学国家重点实验室的主体，是国家蛋白质组学研究基地和国际人类肝脏蛋白质组计划(HLPP)执行总部，建立了系统的具有国际先进水平的蛋白质组学技术平台，牵头承担着中国人类肝脏蛋白质组计划、国家973和863计划以及国家自然科学基金项目等100余重要科研项目。中心于2006年通过了ISO/IEC 17025(CNAS- CL01)实验室认可，以标准化的管理面向社会各界开放提供科研技术服务。 　　本期培训班由北京蛋白质组研究中心、军事医学科学院等国内从事蛋白质组学研究的一线专家授课，7月20-21日将就“蛋白质组学的技术与方法、实验难点与关键点、研究前沿与热点”等主题进行讲座，22-23日实验演示观摩。参加本期培训班的学员可以享受中心提供的技术服务优惠政策。 　　一、培训内容 　　(一)讲座 时 间 内 容 授课专家 7月20日 9:00-10:00 蛋白质组技术策略与应用概述 钱小红 10:00-11:00 蛋白质组研究中的样本制备技术 姜 颖 11:00-11:10 茶歇 11:10-12:10 蛋白质组研究中的分离技术 张养军 12:10-13:30 午餐 13:30-14:30 蛋白质组研究中的鉴定技术 蔡 耘 14:30-15:00 UPLC原理及其在生物学研究中的应用 waters15:00-15:10 茶歇, 15:10-16:10 蛋白质组研究中的数据分析技术 朱云平 16:10-17:30 学员合影，参观BPRC实验室 7月21日 9:00-10:00 SNP相关技术及应用 周钢桥 10:00-11:00 蛋白质相互作用研究技术与应用 王 建 11:00-11:10 茶歇 11:10-12:10 疾病蛋白质组研究技术与应用 孙 薇 12:10-13:30 午餐 13:30-14:40 多肽组学研究进展 魏开华 14:40-15:10 高清质谱SYNAPT G2 HDMS在蛋白质组学中的应用 waters 15:10-15:30 茶歇，领发票 15:30-16:40 蛋白质定量研究 徐 平 16:40-17:00 发证书，交调查表 　　(二)实验演示观摩(每项半天时间) 　　1、二维荧光差异凝胶电泳技术(2DE-DIGE) 　　在一块胶中使用三色荧光标记，同时对两个样品进行比较，大大减少了实验误差，提高了检测灵敏度和动态范围，自动分析软件简化分析流程。特别适用于入组标本例数较多，个体差异较大的差异蛋白质组比较研究。 　　2、色谱分离技术 　　结合分析型高效液相色谱、毛细管高效液相色谱以及与质谱的联用，重点介绍一般色谱系统的基本组成、各部件的基本功能、基本操作和应用中的问题及解决方法，全面了解高效液相色谱在蛋白质和多肽分离中的应用。 　　3、MALDI TOF/TOF质谱仪操作使用 　　主要包括：样品脱盐、基质配制、点靶、硬件检查与参数设置、样品表编辑、激光控制、手动采集、自动批量采集、仪器校正、二级谱采集、谱图平滑与基线处理、标峰、DataExplore操作、数据导出、数据库维护、仪器维护等。 　　4、液质联用质谱仪鉴定蛋白 　　液质联用(LC-ESI-MS)技术是针对蛋白质组学研究中复杂样本的最佳鉴定手段之一。反相HPLC连接纳升级的电喷雾离子源，以线性离子阱质谱作为手段，能够高效、准确、灵敏地连续鉴定。本期介绍实现最佳鉴定效果的关键：液相分离条件和质谱仪参数的设置，以及搜库技巧等。 　　二、培训特点 　　本次培训注重前沿技术分析，在系统梳理原理的基础上让学员掌握前沿技术 研讨班在北京中关村生命科学园内举行，培训结合蛋白质组学理论讲解和实验现场演示，形成有效的技术支持 培训班针对具体技术问题可提供个性化实验设计。研讨班结束后颁发蛋白质组学培训证书。 　　三、时间和地点 　　报到：2010年7月19日9：00-18：00，20日9：00-10：00，北京海燕药业海诺康会馆(北京市昌平区生命园路16号，与北京蛋白质组研究中心隔湖相望) 　　讲座：2010年7月20-21日，北京海燕药业海诺康会馆 　　实验观摩：2010年7月22-23日，北京蛋白质组研究中心(北京市昌平区科学园路33号) 　　四、参加办法及培训费用 　　填写回执后Email/邮寄/传真至北京蛋白质组研究中心，提前注册截止日期：2010年6月18日，以银行汇款凭证为准。 　　培训费用包含会务费、培训资料和会期用餐。食宿统一安排，住宿费用自理，需住宿的请在回执中填写住宿信息。 　　(一)讲座 　　2010年6月18日前注册：每人1100元，学生900元 　　2010年6月18日后注册：每人1200元，学生1000元。 　　(二)实验演示观摩 　　2010年6月18日前注册：每人￥650元/项/半天，学生450元/项/半天 　　2010年6月18日后注册：每人￥700元/项/半天，学生500元/项/半天。 会 议 注 册 注册类型 2010年6月18日前 2010年6月18日后 注册费包含 标准票 学生票 标准票 学生票 会议资料、午餐、茶歇 技术讲座（元） 1100 900 1200 1000 实验演示观摩 （元/项/半天） 650 450 700 500 　　学生报到时须持学生证。 　　五、汇款信息 　　帐 号：0200004909200041055 　　账户名称：北京蛋白质组研究中心 　　开户银行：工商银行北京市永定路支行 　　注：汇款时请务必注明学员姓名、单位和“蛋白质组学培训班”字样。汇款后将汇款凭据传真至中心，或将扫描电子版发送至邮箱sky_proteomics@sina.com，以确保汇款安全到账。 　　六、联系方式 　　联系人及电话：注册：周建平(010)80705888 张雪莉(010)80705188 　　咨询：史冬梅(010)80727777-1520 　　传 真：(010)80705155 　　电子邮件：sky_proteomics@sina.com 　　通信地址：北京市昌平区科学园路33号(102206) 报名回执表.doc 　　北京蛋白质组研究中心 　　蛋白质组学国家重点实验室 　　中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业委员会 　　2010年6月11日

前文回顾（点击查看）：蛋白质测序技术发展漫谈（上篇）；蛋白质测序技术发展漫谈（中篇）；蛋白质测序技术发展漫谈（下篇）前面描述了目前成熟的蛋白质测序方法，并对最流行的基于质谱的蛋白质测序方法进行了综述。非质谱依赖的蛋白质测序手段，除了几十年前发展的基于Edman降解法通过气相或液相色谱测序的方法，最近热门领域的方法主要包括基于荧光或纳米孔的单分子蛋白质测序，代表了未来的发展方向。基于纳米孔单分子蛋白质测序方法纳米孔测序（nanopore sequencing）法是借助电泳驱动力使待测单个分子逐一通过纳米孔，通过检测纳米孔截面的电流变化来实现对序列的测定。纳米孔测序最初在1996年被提出，通过膜通道检测多核苷酸序列，也就是单分子DNA的测序[1]。随着使用纳米孔对单分子DNA测序技术的逐渐成熟[2-5]，纳米孔技术也被应用在单分子蛋白质的鉴定上。对于DNA来说，其二级结构和电荷相对比较一致，它的聚合物比较容易处理，而且仅由四种碱基组成，单分子DNA测序比较简单。相比之下，蛋白质分子由20种氨基酸组成，并且蛋白的电荷和疏水性多变，还存在大量的二级和三级结构，因此基于纳米孔技术对蛋白质的鉴定要比DNA困难很多[6]。当前的基于纳米孔对蛋白质分析的主要探索方向是通过寡核苷酸适配子或抗体等亲和分子对纳米孔进行功能化，当蛋白质或肽段分子通过纳米孔时，由于不同氨基酸在纳米孔附近的结合或通过会引起不同幅度的电流变化，基于这些变化就可以确定氨基酸的种类，从而逐个得到所测蛋白质或肽段的序列信息（图1）。图 1 借助纳米孔的横向电流检测单分子蛋白质[2]牛津大学的Hagan Bayley[7]团队将单个α-血溶素蛋白孔插入两侧带有电极的膜中，磷酸化的蛋白质在DNA寡核苷酸的牵引下展开，并穿过纳米孔，通过记录纳米孔的电流变化区分出了202个磷酸化蛋白质的4种不同亚型，但无法鉴定蛋白质的一级结构。Francesco[8]团队将蛋白质或氨基酸吸附在金纳米星上，并施加电等离子体力将粒子推进并约束在金纳米孔内，利用金纳米星与金纳米孔壁之间的单个热点，实现了单分子表面增强拉曼散射（SERS）探测，用于检测氨基酸，并且可以分辨仅含有两个不同氨基酸的单个多肽分子抗利尿激素和催产素。Cao等[9]通过单个定点突变，在具有锥形识别位点的耻垢分枝杆菌孔蛋白A（MspA）的纳米孔内腔中引入了甲硫氨酸，从而将该反应有目的的移植到了MspA纳米孔最尖锐的识别位点，并观测到了相应的单分子反应信号。该纳米孔可以引入更多的离子电流，从而放大检测信号，其狭窄的识别位点则提供了更高的空间分辨率，大大削弱了周围氨基酸的干扰，从而拓宽生物纳米孔的单分子检测功能，有望推进基于孔道的单分子蛋白质测序研究。Ouldali[10]研究团队研发出了一种新型气溶素纳米孔，此纳米孔借助将氨基酸附着在聚阳离子载体上，使氨基酸在纳米孔上停留时间变长，并检测其通过纳米孔时电流的变化，最终可识别出组成蛋白质的15种氨基酸，也能检测到组成蛋白质的其余5种氨基酸的电流变化，但是无法对其进行区分。虽然只是对氨基酸进行识别，但作者设想通过对蛋白或者肽段末端氨基酸逐个降解，利用纳米孔技术鉴定从末端释放出来的氨基酸，从而对蛋白质或肽段序列进行测定。Zhao[11]等将一对金属电极分隔在约2nm的孔洞旁，当氨基酸线性穿过这种纳米孔的时候，每一个氨基酸都会完成一个回路，并反馈出相应的电信号，常见的20种氨基酸在通过纳米孔时都可以产生电信号。有的氨基酸需通过大约50种不同信号特征被鉴定，但绝大多数的氨基酸仅需要不到10个信号特征被鉴别。这种方法不仅能够高可信度的鉴定氨基酸，还能区分翻译后修饰的氨基酸（肌氨酸）及其前体（甘氨酸）、区分同分异构体的亮氨酸与异亮氨酸、区分对应对映异构体的氨基酸镜像分子L-天冬酰胺和D-天冬酰胺。此技术被应用于对两条由四个氨基酸组成的短肽（GGGG 和GGLL）进行测序，单分子短肽穿过纳米孔，孔道两边电极记录每个氨基酸通过时产生的电信号，通过测序算法，识别代表不同氨基酸的特征信号，从而得到短肽的序列。基于纳米孔单分子蛋白测序目前还属于初步发展阶段，除了需要根据电信号准确区分组成蛋白质的氨基酸以外，另一个关键是设计可一次拉动一个蛋白质或氨基酸穿过纳米孔的“马达”。为了让蛋白质或肽段顺利穿过纳米孔，研究者们在蛋白质一端添加了一串带有负电的氨基酸或者一段短DNA，用氨基酸或DNA链拉动蛋白质，可以使一些蛋白质打开折叠并顺利穿过纳米孔，但另一些复杂折叠的蛋白需要更多拉力，于是研究者在引导序列上添加了可以打开折叠的ClpX的识别位点[12]。这个系统能够将简单折叠的目标蛋白牵引过纳米孔，但对于折叠非常紧密的蛋白质仍要使用变性剂来打开折叠。基于纳米孔技术对单分子肽段或蛋白质测序目前还停留在对氨基酸鉴定和对短肽的区分阶段，还不能实际应用于对蛋白质的测序。虽然纳米孔测序具有高通量、对样品需求量少的优点，但是现有的纳米孔过大，失去了对氨基酸的区分能力，同时蛋白质分子通过孔道过快，加大了对信号读取难度；其次由于需要将蛋白的三级和二级结构破坏掉，纳米孔道需要能够耐受非常苛刻的化学和力学条件；第三，由于蛋白带电不均匀，控制其穿孔的速率也非常困难。所以目前的方法还不能准确的测得蛋白质的序列，基于纳米孔的单分子蛋白质测序技术还有很大的发展空间。基于荧光的单分子蛋白质测序方法基于荧光的单分子蛋白质测序同纳米孔测序一样，都可以对极少量蛋白质样品进行检测，其原理是先将蛋白质酶解成肽段，对肽段中特定氨基酸选择性标记不同的荧光基团[13]，对不同氨基酸上的荧光进行观察，从而确定肽段部分氨基酸序列，再将这些序列与蛋白质组序列比对，即可确定肽段的来源蛋白（图2）。图 2 基于荧光的单分子蛋白测序流程[14]。Ginkel[15] 和Yao [16]都利用ClpXP蛋白酶辅助对肽段进行选择性荧光标记，可对序列中的赖氨酸和半胱氨酸进行标记，通过Förster共振能量转移依次读出被标记的肽段的氨基酸的信号。Swaminathan[14] 将蛋白质酶解成肽段，再将肽段固载到玻璃片上[17]，使用特定荧光基团分别对肽段中的赖氨酸和半胱氨酸选择性标记，通过Edman降解技术对固载的肽段进行降解，每次降解后都使用全内反射荧光（TIPF）显微镜进行观测。如果被标记的赖氨酸和半胱氨酸在Edman降解中从肽段N端释放出来，被标记的以上两种氨基酸的位置就会被检测到。同时还发展了用于监测单个肽荧光强度的图像处理算法，并对误差源进行分类和建模，可以测得序列中部分氨基酸的信息。将测得的部分序列与参考蛋白质组序列比对，即可确定肽段的来源蛋白，通过与蛋白质组序列比对，可以鉴定到在人源蛋白质组中的绝大多数蛋白质。基于荧光单分子蛋白测序技术主要有三方面难点，一方面在于目前仅能对赖氨酸和半胱氨酸等几种氨基酸进行特异性荧光基团的标记，无法对所有氨基酸都进行标记；第二个难点是Edman降解是在强酸或强碱的环境中进行，对这些荧光基团的稳定性要求很高；第三个难点是对后期图像处理有较高的要求，如果序列中每个氨基酸都标记上不同的荧光基团，且发光峰易交叠难分辨，这给荧光处理算法带来了难度。因此，基于荧光的单分子蛋白测序技术虽然可以对极微量蛋白质样品分析，但目前仅能测得部分氨基酸序列，对蛋白质全序列的测定目前尚不能实现。[1] Kasianowicz J J, Brandin E, Branton D, et al. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1996, 93(24): 13770-13773.[2] Branton D, Deamer D W, Marziali A, et al. The potential and challenges of nanopore sequencing [J]. Nanoscience and technology: A collection of reviews from Nature Journals, 2010: 261-268.[3] Laver T, Harrison J, O’neill P, et al. Assessing the performance of the oxford nanopore technologies minion [J]. Biomolecular detection and quantification, 2015, 3: 1-8.[4] Karlsson E, Lärkeryd A, Sjödin A, et al. Scaffolding of a bacterial genome using MinION nanopore sequencing [J]. Sci Rep, 2015, 5(1): 1-8.[5] Huang S, Romero-Ruiz M, Castell O K,et al. High-throughput optical sensing of nucleic acids in a nanopore array [J]. Nature nanotechnology, 2015, 10(11): 986-991.[6] Nivala J, Marks D B, Akeson M. Unfoldase-mediated protein translocation through an α-hemolysin nanopore [J]. 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Unfolding and Translocation of Proteins Through an Alpha-Hemolysin Nanopore by ClpXP [M]. Nanopore Technology. Springer. 2021: 145-155.[13] Hernandez E T, Swaminathan J, Marcotte E M, et al. Solution-phase and solid-phase sequential, selective modification of side chains in KDYWEC and KDYWE as models for usage in single-molecule protein sequencing [J]. New J Chem, 2017: 462-469.[14] Swaminathan J, Boulgakov A, Hernandez E, et al. Highly parallel single-molecule identification of proteins in zeptomole-scale mixtures [J]. Nat Biotechnol, 2018, 36(11): 1076-1082.[15] Ginkel J V, Filius M, Szczepaniak M, et al. Single-molecule peptide fingerprinting [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2018, 115(13): 3338-3343.[16] Yao Y, Docter M, Ginkel JV, et al. Single-molecule protein sequencing through fingerprinting: computational assessment [J]. Phys Biol, 2015, 12(5): 055033.[17] Howard C, Floyd B, Bardo A, et al. Solid-Phase Peptide Capture and Release for Bulk and Single-Molecule Proteomics [J]. ACS Chem Biol, 2020, 15(6): 1401-1407.作者简介：中国科学院大连化学物理研究所 单亦初副研究员1997年于中国科学技术大学获理学学士学位。2002年于中国科学院大连化物所获理学博士学位。2002年10月至2009年5月在德国马普协会马格德堡研究所、美国德克萨斯大学医学院及澳大利亚弗林德斯大学工作。2009年7月应聘到中国科学院大连化物所任副研究员。主持多项研究课题，包括国家重点研发计划子课题、国家自然科学基金面上项目等。已在Analytical Chemistry、Journal of Proteome Research、Journal of Chromatography A等杂志发表论文近80篇。主要研究方向包括蛋白质组鉴定和蛋白质组相对及绝对定量、蛋白质翻译后修饰富集和鉴定、蛋白质组末端肽富集和鉴定、蛋白质相互作用分析、蛋白质全序列从头测定及药物靶蛋白筛选。（本文经授权发布,仅供读者学习参考）专家约稿招募：若您有生命科学相关研究、技术、应用、经验等愿意以约稿形式共享，欢迎邮件投稿或沟通（邮箱：liuld@instrument.com.cn ）。

2017年5月23日，全球生物技术领先企业珀金埃尔默（PerkinElmer,Inc.）公司与国家蛋白质科学中心 北京（凤凰中心）共同举办了“蛋白质功能技术研讨会”，凤凰中心坐落于中关村生命科学园内，配备了国际顶尖的硬件设备和软件工具，包括来自珀金埃尔默的多模式检测、高内涵细胞成像分析系统、小动物活体成像系统，同时也为园区内其他企业提供了开放性的专业研究平台。此次研讨会旨在服务现有客户，辐射园区客户，拓展应用范围、推动新技术交流。 技术研讨会主要以从元素、分子、细胞到动物的蛋白质研究整体解决方案为主线，由珀金埃尔默应用技术专家姚继军博士、刘治东分别对细胞中的金属元素检测新技术以及分子与蛋白相互作用的应用解决方案进行了介绍。应用技术专家王瑜与石晓月针对高内涵和小动物活体成像中的肿瘤、肝病、传染性疾病等方向做了应用案例分享。 整个研讨会互动热烈，参会的听众对新技术及新应用很感兴趣，既提出了不少实验中遇到的具体的问题，也讨论了进一步实验设计的前瞻性问题。 通过此次技术研讨会，加强了珀金埃尔默公司与广大用户的沟通与交流，现有用户对于珀金埃尔默公司的整体解决方案有了更加深刻和系统的了解。

后基因组时代蛋白质组闪亮登场 中国计量院高通量蛋白质检测技术研究取得重大突破 　　“高通量蛋白质分离检测关键技术研究取得的突破给我们很大鼓舞，但这只是我们大规模系统集成研究的一部分，我们正在着力于系统后续的研究。相信，在不久的将来，这套集成系统将为蛋白质组的分析提供一个完整规范的平台。”谈起不久前通过项目鉴定的《高通量蛋白质分离检测关键技术研究》和取得的成果，中国计量科学研究院生物、能源与环境研究所科学仪器研究室主任刘新志显得踌躇满志。 　　随着全球性的国际人类基因组计划的初步完成，一个以蛋白质和基因调节为研究重点的后基因组时代已经拉开序幕。蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。伴随人类基因组研究而发展的蛋白质组学则是研究细胞内各种蛋白质的组成及其活动规律的一门新兴学科。后基因组时代，蛋白质组将成为重点研究方向之一，并将有力推动生物产业的持续性高速发展。 　　“蛋白质组研究是一门极为年轻的科学，从诞生到蓬勃发展也不过七八年历史，我国的研究时间也只有六年而已。但其发展速度非常迅猛，应用范围也非常广泛。”刘新志说。 　　蛋白质组研究对生命科学、化学分析、食品安全、人类健康等诸多领域都有着重要意义。例如，几乎所有的药物都是通过蛋白质发挥作用，蛋白质组学在药学研究中的应用不仅可直接产生新的药物，更重要的是可减少对新药开发研制的盲目性，大大加速和简化新药研制的过程 通过对疾病不同阶段蛋白质组的研究，还可帮助诊断和防治疾病。目前，蛋白质组学已成功用于肿瘤、糖尿病、艾滋病、关节炎等多种疾病的诊断和治疗。 　　“蛋白质组研究的核心技术分为两个部分：蛋白质分离技术和蛋白质鉴定技术。实验数据表明，现阶段依赖质谱分析的蛋白质鉴定技术的发展水平远高于蛋白质分离技术的发展水平。但对大分子、复合物、细胞的分离纯化是进行更详尽的生物鉴定和工程化应用所必需的重要步骤，如果不能快速有效地进行蛋白质分离，后续的鉴定也无法进行。所以，蛋白质组研究的瓶颈来自于蛋白质分离技术的限制。”刘新志打了一个比喻：“蛋白质鉴定技术好比一条宽敞的高速路，但通往这条高速路的必经路——蛋白质分离技术就好比一条小胡同，这条小胡同严重影响了车辆的快速通行。” 　　据介绍，目前蛋白质分离技术主要有两种——双向电泳技术和高效液相色谱技术。“这两种传统技术与生俱来的缺点是很难分解出难溶性蛋白，而且不能分解出不溶性蛋白。要打通这条小胡同，就必须找到一种新的方法、研制一种新的装置，能够有效地分离出难溶性蛋白和不溶性蛋白，并且要实现高通量快速分离。”刘新志介绍。 　　由中国计量科学研究院完成的《高通量蛋白质检测关键技术的研究》课题在解决蛋白质的快速分离技术方面取得了重大突破。研究建立了以反向加样连续自由流电泳(FFE)分离方法为核心的高通量蛋白质分离检测技术中最为关键的高稳定度自由流电泳(HSFFE)装置。“该装置最显著的特点就是解决了两种传统的分离技术所不能解决的问题——从蛋白混合物中有效地分离出可溶性蛋白、难溶性蛋白、不溶性蛋白，实现了对这三种蛋白的完全分离 其次，装置的通量高，速度快，能够满足蛋白质快速分离鉴定的需要。”刘新志说。 　　专家认为，该装置是我国第一台自主研发的实用大型地基液相制备电泳装置，主要指标已经达到国际同类装置的技术水平。同时，该课题的实施具有技术上的前瞻性和集成创新性，对蛋白质组学研究提供了关键的技术支撑。具有自主知识产权的这项成果降低了我国在同类仪器设备上对国外技术的依存度，具有较高的实际应用价值。该装置不仅可以为我国的蛋白质组基础研究提供技术支撑，还可以广泛应用于生物产业的生产环节，如生物制药。同时，还能应用于医学临床，如疾病预防和临床监测。正如一位资深的生物学家所说：“其应用范围几乎可以遍及生物学、生物化学和细胞学的各个领域。” 　　“虽然这套装置本身已经可以作为独立的产品应用于相关领域，但这并不是我们的最终目的。我们的目标是实现以该装置为核心的高通量完整蛋白质分离、酶解消化、肽段分离和质谱鉴定接口的大规模系统集成，以保证蛋白质组的分析可以在一个连续自控的系统中规范化完成。到时候，我们的装置将发挥更大的作用。”刘新志信心十足。

根据MarketsandMarkets发布的新的市场研究报告，2017年全球蛋白质组学市场将增加到172亿美元。尽管当前的经济气候不佳，但复合年增长率相当于14.2%。 　　该报告共504页,分为三个部分，包括四个地区：美国、欧洲、亚洲和世界其他地区。仪器技术部分包括蛋白质微阵列、光谱、x射线结晶学、色谱法、电泳、表面等离子体共振系统、蛋白质分离系统；试剂部分包括芯片、光谱、x射线结晶学、色谱法、电泳、免疫、微球、蛋白质分离试剂；最后一部分是服务，包括分析实验室服务和数据分析与维护。 　　该报告还包括了一个市场概述、地理分析、本领域21个公司的简介。蛋白质组学领域主要公司有Thermo Fisher, Agilent, Life Tech, Sigma-Aldrich, Danaher, Waters, Roche, Bio-Rad and Luminex。

1 人类蛋白质组草图公布 　　之前，尽管不少大型的蛋白质组数据集，已经收集约上万个蛋白数据，然而覆盖80%的人类蛋白质组的草图却并未绘制。此次的研究，则突破了这一局限。 　　该图谱由德国慕尼黑工业大学、约翰霍普金斯大学/印度生物信息研究所等机构的两个团队独立完成。其中，在印度生物信息研究所和美国约翰霍普金斯大学等机构绘制了17 924个基因编码的蛋白质草图，其总数约占人类基因总数的84% 而慕尼黑理工大学领衔的团队，则对19 629个基因编码的蛋白质绘制草图，其总数约占人类基因总数的92%。不过，印度和美国团队，与德国团队所采用的实验数据来源略有不同，印度和美国的研究者从30个人体组织的许多不同的样品及细胞系(包括7种胎儿组织和6种血细胞类型)中提取、纯化所有蛋白质，并用质谱技术揭示组成各蛋白片段的氨基酸序列，因而两种数据的分析方法相对统一 德国的团队所采用的数据从公共数据库收集获得，而后与实验室生成的数据合并完成分析。在德国的研究中，慕尼黑工业大学的Bernhard Kü ster等人建立了搜索性公共数据库ProteomicsDB，而公共数据库收集获得的质谱分析数据约占ProteomicsDB数据的60%，其他的数据来自于60个人类组织体液，13个体液，147个癌细胞系。 　　这些蛋白大多为健康人群中组织和器官中表达的蛋白，对于理解疾病状态下发生的变化，具有现实的意义，如德国团队完成的数据能用于识别数百个翻译的基因间非编码RNAs(lincRNAs)，比较分析通过蛋白质对癌症药物的敏感性，发现mRNA和组织中蛋白的定量关系等。同时，这两项研究也发现了许多新蛋白，而编码这些蛋白的基因之前被认为位于基因组的非编码区域，因而也丰富了对于遗传学研究的认识。 　　2 研究团队的基本背景 　　此次研究的美国和印度团队，由约翰霍普金斯大学的副教授Akhilesh Pandey领衔，而他也是印度生物信息学研究所首席科学顾问。此前，印度生物信息学研究所和约翰霍普金斯大学的生物信息学团队就有广泛的合作，例如两个机构的26名科学家经过18个月的努力，排列出了人类的X染色体顺序，并将其与黑猩猩、老鼠的基因组相比较，发现了新基因。 　　慕尼黑工业大学的化学和功能蛋白质组学分析者Bernhard Kü ster，其研究的主要领域是探索蛋白质的相互作用及其与活性药物成分的相互作用，分析癌症发生发展的分子机制，以及开发相应的临床治疗方法。作为研究者，Bernhard Kü ster也曾参与了蛋白质组技术平台上具有雄厚基础的Cellzome公司的发明(新的酶相互作用化合物的方法)。而Cellzome公司的药物研发平台，可对于特定蛋白相互作用的药物进行筛选，其具有高度的灵敏性，而葛兰素史克(GSK)公司也正在看中了这一点已将其并购。 　　3 中国人类蛋白质组计划(CNHPP) 　　在人类蛋白质组草图公布的同时，&ldquo 中国人类蛋白质组计划(CNHPP)&rdquo 已经由科技部正式批准启动实施。此前，中国科学家已倡导并领衔人类第一个器官(肝脏)国际蛋白质组计划(HLPP)。 　　在&ldquo 中国人类蛋白质组计划&rdquo 中，&ldquo 激光解析基体辅助离子源-蛋白测序仪器&rdquo 课题是重点研究方向之一，致力于蛋白质测序仪器和试剂国产化，从而加速蛋白质组学和生物质谱技术在临床领域的研究与应用。 　　4 蛋白质组测序技术的开发 　　蛋白质组是一个细胞、组织、有机体在一定时间内表达的所有蛋白质(总蛋白质)。对蛋白质组进行系统的、全面的研究，而快速、准确、低成本的蛋白质分离纯化技术(如双向电泳、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术等)的发展，则是系统、全面研究的基础。有了基因组计划和基因组测序技术的发展经验，人类在蛋白质组草图公布的前后，也就有了对低成本、高效率的蛋白质组测序技术的格外重视。例如，亚利桑纳州立大学的Stuart Lindsay团队正在致力于研究让单链肽段穿过纳米孔的技术，从而将纳米孔单分子DNA测序技术(第三代基因测序技术，采用纳米孔的单分子读取，与之前的测序技术测序时间长、价格比较昂贵、测序分子需要大量扩增、还需要进行荧光标记等相比，第三代测序技术读取数据更快，测序成本明显降低)的设计理念应用于蛋白质组的测序，开发蛋白质单分子测序技术。 　　5 蛋白质组学与个性化医疗 　　人类蛋白质组草图的成果表明，有数百种蛋白质是由此前认为不具备相关功能的DNA片段(脱氧核糖核酸)及&ldquo 假基因&rdquo 形成。这也说明了基因组和蛋白质组之间的巨大差别。例如，表观遗传研究的核心内容即是基因的拼接和翻译后修饰，而蛋白质随时间和空间的动态变化等，使得蛋白质组的研究远比基因组研究复杂。 　　尽管目前的个性化医疗以基因解析为特征，然而真正衔接基因型与疾病表型的还是蛋白质。随着蛋白质组测序技术的快速发展，也许蛋白质组学的研究会带动个性化医疗新的发展阶段。 　　本文作者：中国科学院上海生命科学信息中心 于建荣 江洪波。

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超纯水器,定氮仪,蛋白质纯化,离心机,水活度分析仪,紫外分光光度,色谱检测器,液相色谱仪,PCR 开标时间： 2021-09-01 09:00 采购金额： 373.40万元 采购单位： 河北农业大学 采购联系人： 苗老师 采购联系方式： 立即查看招标代理机构： 方大国际工程咨询股份有限公司 代理联系人： 齐育萱 代理联系方式： 立即查看 详细信息 海洋生物资源高值化利用服务平台设备采购项目（进口）招标公告 河北省-保定市 状态：公告 更新时间： 2021-08-10 招标文件: 附件1 海洋生物资源高值化利用服务平台设备采购项目（进口） 招标公告 发布时间： 2021-08-10 一、项目基本情况 项目编号： FDBD-HW-2021-012 项目名称： 海洋生物资源高值化利用服务平台设备采购项目（进口） 采购方式： 公开招标 预算金额： 3734000.00 最高限价： 1包最高限价：2232000.00元 2包最高限价：1502000.00元 采购需求： 1包：全自动微量凯氏定氮仪、实时荧光定量PCR、电泳仪、电转仪（电穿孔仪）、高速冷冻离心机、质构仪、蛋白质纯化系统、示差折光检测器、荧光检测器 2包：分析型液相色谱仪、新鲜度分析仪、超纯水机、光学显微镜、小垂直板电泳槽、小型转印槽、基础电泳仪电源、冷热台、紫外可见分光光度计、水分活度仪。#detail#招标公告#_#pdf#_#7666969a-ba72-4d92-8dd7-2385dca0715f 合同履行期限： 合同签订生效后120日历天内 本项目（是/否）接受联合体投标： 0 二、申请人的资格要求 1.满足《中华人民共和国政府采购法》第二十二条规定； 2.落实政府采购政策需满足的资格要求： / 3.本项目的特定资格要求： 接受进口产品投标；所投产品为进口产品时，投标人需具备《海关进出口货物收发货人报关注册登记证书》；投标人为代理商时，需提供制造商同意其在本次投标中所投产品(1包：蛋白质纯化系统、实时荧光定量PCR、全自动微量凯氏定氮仪,2包：分析型液相色谱仪)的正式专项授权书，或制造商在国内的总代理商对所投产品(1包：蛋白质纯化系统、实时荧光定量PCR、全自动微量凯氏定氮仪,2包：分析型液相色谱仪)的正式专项授权书（总代理商需提供有效授权证明文件） 三、获取招标文件 时间：2021年08月11日至 2021年08月17日， 9:00-12:00-12:00-17:00（北京时间，法定节假日除外） 地点： 河北省公共资源交易服务平台（http://www.hebpr.gov.cn/hbjyzx/）自主下载文件，并及时查看有无澄清和更正 方式： 其它 售价： 0 四、提交投标文件截止时间、开标时间和地点 2021年09月01日09点00分（北京时间） 地点： 本次招标采用全流程电子化形式在河北省公共资源交易服务平台递交；线下地点为：保定市公共资源交易中心第5开标室 四、响应文件提交 截止时间： 2021年09月01日09点00分 五、开启 时间： 2021年09月01日09点00分 地点： 本次招标采用全流程电子化形式在河北省公共资源交易服务平台递交；线下地点为：保定市公共资源交易中心第5开标室 五、公告期限 自本公告发布之日起5个工作日。 六、公告期限 自本公告发布之日起3个工作日。 六、其他补充事宜 七、其他补充事宜 1、本公告发布媒体：中国河北政府采购网、河北省公共资源交易服务平台。 2、本项目采用全流程电子招投标，各投标人请按照“河北省公共资源交易平台”（网址：http://www.hebpr.cn/）首页“信息动态”中“采购代理机构及投标人进行注册登记的通知”的要求办理相关市场主体注册手续，并办理数字证书CA（CA咨询电话4007073355），已注册、已办理数字证书CA的无须重新办注册或办理。完成注册并办理CA后，投标人凭CA秘钥登录电子交易系统自行下载所参加项目的采购文件和时间场地信息文件，采购文件格式（.bdzf）。在“保定市公共资源交易综合信息平台”中【业务管理-交易文件下载】菜单中搜索计划参与项目，并从系统中直接下载招标文件（必须在系统中获取），下载成功则视为报名参与成功。若经开标现场查验投标人未在网上下载招标文件，该单位将不能进入评审阶段，后果自负。具体操作可参考“河北省公共资源交易信息平台”（网址：http://www.hebpr.cn/）中的《投标人投标操作手册》技术支持电话：4009980000。投标人请随时关注平台，如本项目有信息变动，投标人延误自行负责。 3、河北省公共资源交易服务平台中市场主体在企业资质、法人、业绩、企业基本账户等重要信息发生变更时，应在投标确认前及时对河北省公共资源交易服务平台中主体信息进行修改更新，并选择审核地点，携带证明材料进行修改确认，否则视为无效变更。投标确认后至交易项目结束前，限制修改企业名称、企业基本账户信息，如特殊原因造成信息变化的，及时向河北省公共资源交易中心提交证明资料，未及时变更或资料无效从而影响响应的，责任自负。 七、对本次招标提出询问，请按以下方式联系。 八、对本次招标提出询问，请按以下方式联系。 1.采购人信息 名 称： 河北农业大学 地址： 保定市灵雨寺街289号 联系方式： 苗老师 0312-7526518 2.采购代理机构信息 名 称： 方大国际工程咨询股份有限公司 地 址： 保定市北二环5699号大学科技园3号楼南侧3层302 联系方式： 齐育萱 17692331906 3.项目联系方式 项目联系人： 齐育萱 电 话： 17692331906 × 扫码打开掌上仪信通App 查看联系方式 $('.clickModel').click(function () { $('.modelDiv').show() }) $('.closeModel').click(function () { $('.modelDiv').hide() }) 基本信息 关键内容：超纯水器,定氮仪,蛋白质纯化,离心机,水活度分析仪,紫外分光光度,色谱检测器,液相色谱仪,PCR 开标时间：2021-09-01 09:00 预算金额：373.40万元 采购单位：河北农业大学 采购联系人：点击查看 采购联系方式：点击查看 招标代理机构：方大国际工程咨询股份有限公司 代理联系人：点击查看 代理联系方式：点击查看 详细信息 海洋生物资源高值化利用服务平台设备采购项目（进口）招标公告 河北省-保定市 状态：公告 更新时间： 2021-08-10 招标文件: 附件1 海洋生物资源高值化利用服务平台设备采购项目（进口） 招标公告 发布时间： 2021-08-10一、项目基本情况 项目编号： FDBD-HW-2021-012 项目名称： 海洋生物资源高值化利用服务平台设备采购项目（进口） 采购方式： 公开招标 预算金额： 3734000.00 最高限价： 1包最高限价：2232000.00元 2包最高限价：1502000.00元 采购需求： 1包：全自动微量凯氏定氮仪、实时荧光定量PCR、电泳仪、电转仪（电穿孔仪）、高速冷冻离心机、质构仪、蛋白质纯化系统、示差折光检测器、荧光检测器 2包：分析型液相色谱仪、新鲜度分析仪、超纯水机、光学显微镜、小垂直板电泳槽、小型转印槽、基础电泳仪电源、冷热台、紫外可见分光光度计、水分活度仪。#detail#招标公告#_#pdf#_#7666969a-ba72-4d92-8dd7-2385dca0715f 合同履行期限： 合同签订生效后120日历天内 本项目（是/否）接受联合体投标： 0 二、申请人的资格要求 1.满足《中华人民共和国政府采购法》第二十二条规定； 2.落实政府采购政策需满足的资格要求： / 3.本项目的特定资格要求： 接受进口产品投标；所投产品为进口产品时，投标人需具备《海关进出口货物收发货人报关注册登记证书》；投标人为代理商时，需提供制造商同意其在本次投标中所投产品(1包：蛋白质纯化系统、实时荧光定量PCR、全自动微量凯氏定氮仪,2包：分析型液相色谱仪)的正式专项授权书，或制造商在国内的总代理商对所投产品(1包：蛋白质纯化系统、实时荧光定量PCR、全自动微量凯氏定氮仪,2包：分析型液相色谱仪)的正式专项授权书（总代理商需提供有效授权证明文件） 三、获取招标文件 时间： 2021年08月11日至 2021年08月17日， 9:00-12:00-12:00-17:00（北京时间，法定节假日除外） 地点： 河北省公共资源交易服务平台（http://www.hebpr.gov.cn/hbjyzx/）自主下载文件，并及时查看有无澄清和更正 方式： 其它 售价： 0 四、提交投标文件截止时间、开标时间和地点 2021年09月01日09点00分（北京时间） 地点： 本次招标采用全流程电子化形式在河北省公共资源交易服务平台递交；线下地点为：保定市公共资源交易中心第5开标室 四、响应文件提交 截止时间： 2021年09月01日09点00分 五、开启 时间： 2021年09月01日09点00分 地点： 本次招标采用全流程电子化形式在河北省公共资源交易服务平台递交；线下地点为：保定市公共资源交易中心第5开标室 五、公告期限 自本公告发布之日起5个工作日。 六、公告期限 自本公告发布之日起3个工作日。 六、其他补充事宜 七、其他补充事宜 1、本公告发布媒体：中国河北政府采购网、河北省公共资源交易服务平台。 2、本项目采用全流程电子招投标，各投标人请按照“河北省公共资源交易平台”（网址：http://www.hebpr.cn/）首页“信息动态”中“采购代理机构及投标人进行注册登记的通知”的要求办理相关市场主体注册手续，并办理数字证书CA（CA咨询电话4007073355），已注册、已办理数字证书CA的无须重新办注册或办理。完成注册并办理CA后，投标人凭CA秘钥登录电子交易系统自行下载所参加项目的采购文件和时间场地信息文件，采购文件格式（.bdzf）。在“保定市公共资源交易综合信息平台”中【业务管理-交易文件下载】菜单中搜索计划参与项目，并从系统中直接下载招标文件（必须在系统中获取），下载成功则视为报名参与成功。若经开标现场查验投标人未在网上下载招标文件，该单位将不能进入评审阶段，后果自负。具体操作可参考“河北省公共资源交易信息平台”（网址：http://www.hebpr.cn/）中的《投标人投标操作手册》技术支持电话：4009980000。投标人请随时关注平台，如本项目有信息变动，投标人延误自行负责。 3、河北省公共资源交易服务平台中市场主体在企业资质、法人、业绩、企业基本账户等重要信息发生变更时，应在投标确认前及时对河北省公共资源交易服务平台中主体信息进行修改更新，并选择审核地点，携带证明材料进行修改确认，否则视为无效变更。投标确认后至交易项目结束前，限制修改企业名称、企业基本账户信息，如特殊原因造成信息变化的，及时向河北省公共资源交易中心提交证明资料，未及时变更或资料无效从而影响响应的，责任自负。 七、对本次招标提出询问，请按以下方式联系。 八、对本次招标提出询问，请按以下方式联系。 1.采购人信息 名 称： 河北农业大学 地址： 保定市灵雨寺街289号 联系方式： 苗老师 0312-7526518 2.采购代理机构信息 名 称： 方大国际工程咨询股份有限公司 地 址： 保定市北二环5699号大学科技园3号楼南侧3层302 联系方式： 齐育萱 17692331906 3.项目联系方式 项目联系人： 齐育萱 电 话： 17692331906

第七届中国蛋白质组学大会暨第三届国际蛋白质组学论坛将于2011年4月14-18日在浙江杭州市第一世界大酒店召开。贝克曼库尔特公司将参加此次会议，介绍超高灵敏度的毛细管电泳质谱联用新技术。展位号A10。期待您的光临。 会议连接http://61.50.138.116/bprchy/cn/

p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " strong span style=" text-indent: 2em " 仪器信息网讯 /span /strong span style=" text-indent: 2em " 蛋白质组学是生命科学领域中的一门新兴学科，可以高通量的分析正常及病理条件下机体、组织、细胞或亚细胞成分中全部蛋白质，对不同空间、不同时间上动态变化的蛋白质组的整体进行比较，分析不同蛋白质组之间在表达数量、表达水平和修饰状态下的差异。蛋白质组学可以发现与疾病相关的特异性蛋白质，对病变相关蛋白的研究可以为探索病毒本身及其感染机制提供信息，且这些蛋白还可能作为疾病诊断潜在的生物标志和治疗的药物靶点。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 蛋白质组概念的提出及常用技术 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 蛋白质组（proteome）这一概念由Wilkins和Williams等在1994年首次提出，以它作为研究对象的蛋白质组学是后基因组时代产生和发展的一门新兴学科，其从整体上分析组织，细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与翻译后修饰，探索蛋白质的功能及蛋白质之间相互作用与联系。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 蛋白质组学中对蛋白表达分析方面的研究应用较多的技术有双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）、基于2-DE将其重复性和精确性加以改进的双向差异凝胶电泳（two-dimensional difference electrophoresis,2D-DIGE），以及对筛选到的差异表达蛋白进行快速精确鉴定的串联质谱技术（mass spectrometry,MS），其中质谱技术是蛋白质组学研究中的核心技术。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 在质谱技术中的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrum,MALDI-TOFMS）是分析多肽和蛋白质混合物的主要方法，此外，使用标记的氨基酸在细胞中进行稳定同位素标记（stable-isotope labeling by amino acids in cell culture,SILAC）& nbsp 是一种鉴定和定量病毒感染后细胞蛋白中表达差异的有效方法。蛋白质组学技术在病毒学中的应用有助于病毒感染及病毒宿主间的相互作用机制研究。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 蛋白组学技术在及其感染机制研究中的应用案例 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 病毒寄生于宿主细胞中，需要不断地适应和改变宿主的环境。他们能够编码多种多功能蛋白质，这些蛋白能与宿主蛋白发生一系列的相互作用以完成病毒的各种功能。目前，许多病毒的基因组已完成测序，但由于受到病毒影响而发生相应改变的宿主蛋白组、宿主蛋白翻译后修饰等还未被完成阐明。近年来，高通量技术的兴起，如基于质谱技术的定量或半定量蛋白组方法，已被广泛应用于病毒宿主相互作用的研究中。依托质谱技术的蛋白质组学飞速发展，不仅促进了病毒蛋白质组学研究的不断进步，同时也加快了对于病毒相关的宿主蛋白鉴定。今后相关研究数据仍会急速增加，这需要更加先进的生物信息学技术对数据进行处理，更全面地了解病毒感染过程。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 案例1: SARS（severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus,SARS-CoV）冠状病毒研究中的蛋白组学技术 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " SARS基因组的基因产物包括20多种蛋白质，据报道，有研究学者首次应用DIGE技术分析了SARS-CoV感染的Vero E6细胞，鉴定出355个在SARS-CoV感染后表达发生变化的蛋白，其中186个显著差异表达蛋白，为理解SARS-CoV的感染和致病机制提供了线索。对感染SARS-CoV的BHK21细胞进行SILAC定量分析及进一步功能分析表明，BAG3可以抑制SARS-CoV的复制。对感染病人的血清蛋白质组分析，有助于返现可用于病毒感染的诊断、预后及治疗的生物标记。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 案例2: 禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）研究中的蛋白质组学技术 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 据报道，研究学者利用2-DE技术筛选H9N2感染人源细胞系后不同时间点的差异表达蛋白，运用质谱技术鉴定到22种蛋白，主要包括细胞骨架蛋白、RNA加工途径相关蛋白和代谢相关蛋白等，其中表达差异显著的蛋白主要参与细胞骨架网络的构成。这些蛋白的鉴定有助于理解禽流感病毒在哺乳动物中的复制及其宿主之间的相互作用。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 案例3: 揭示新型寨卡病毒宿主因子的蛋白质组学技术 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 寨卡病毒(ZIKV)是一种与登革热病毒，西尼罗河病毒和丙型肝炎病毒（HCV）有关的黄病毒，具有单链RNA基因组，编码多蛋白，共翻译和翻译后加工成三个结构蛋白，前体膜和包膜以及七种非结构蛋白。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 据报道，有研究学者使用人类神经前体细胞和神经细胞 SK-N-BE2 进行整合蛋白质组学方法，以表征细胞在病毒侵染后的蛋白质组和磷酸化蛋白质组变化，并使用亲和蛋白质组学来鉴定ZIKV蛋白的细胞靶标。通过亲和纯化结合液相色谱和串联质谱技术（AP-LC-MS / MS）鉴定与人SK-N-BE2神经母细胞瘤细胞中表达的10种ZIKV蛋白中的每一种相互作用的细胞蛋白和相关复合物，研究鉴定到了386种 ZIKV 相互作用蛋白、ZIKV 特异性和泛黄病毒活性相关的宿主因子，这些宿主因子已知与神经元发育、视网膜缺陷和不育相关。由此，相关论文作者绘制了神经元细胞中的ZIKV蛋白-宿主蛋白相互作用网络。此外，研究还分析确定了在 ZIKV 感染后特异性上调或下调的1,216个磷酸化位点，表明病毒感染引起基本信号传导通路为 ZIKV 感染引起的增殖停滞提供了新的见解。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 当前， span style=" text-indent: 2em " 通过比较蛋白质组学对病毒感染前后的蛋白表达图谱进行鉴定，进一步对病毒感染引起的差异表达蛋白进行功能分析和验证，探索其在病毒感染中的潜在作用机制、寻找病毒的作用靶标，为病毒的预防诊治提供理论依据和解决途径。& nbsp /span 因此，在继病毒感染细胞的差异蛋白质组分析后，为更能反映真实的变化规律，更到位的解释病毒感染和致病机制，进行病毒感染宿主机体的差异及功能蛋白质组分析将是研究发展的趋势。 /p p br/ /p p br/ /p p br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " /span br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " strong 参考文献： /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 董 书 伟 ，荔 霞 ，刘 永 明 ，等 .蛋 白 质 组 学 研 究 进 展 及 其 在 中 兽 医 学 中 的 应 用 探 讨 [J ] . 中 国 畜 牧 兽 医 ， 2 0 1 2 ， 3 9 (1 ) : 4 5 ~ 4 9 . /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " Liu H.Advances of SARS-Cov genome[J].Journal of Chinese General Practice，2003，2(11):1~4. /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " Liu N，Song W，Wang P，et al.Proteomics analysis of diferen- tial expresion of celular proteins in response to avian H9N2vi- rus infection in human cels[J].Proteomics，2008，8(9):1851~ 1858. /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " Pietro S ,Alexey S , Haas D A , et al. An orthogonal proteomic survey uncovers novel Zikavirus host factors[J]. Nature, 2018. /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " & nbsp /p p br/ /p

蛋白质印迹实验具体操作步骤 蛋白质印迹免疫分析的过程包括蛋白质经凝胶电泳分离后，在电场作用下将凝胶上的蛋白质条带转移到硝酸纤维素膜上，经封闭后再用抗待检蛋白质的抗体 作为探针与之结合，经洗涤后，再将滤膜与二级试剂-放射性标记的或辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶 偶联抗免疫球蛋白抗体 结合，进一步洗涤后，通过放射自显影或原位酶反应来确定抗原-抗体-抗抗体复合物在滤膜上的位置和丰度。 【蛋白质印迹实验所需试剂】 1.IgG 标准品 2.羊抗人辣根过氧化物酶（HRP）标记的IgG 抗体 3.转移buffer:Tris 3.03g,Gly14.4g,甲醇200ml,加三蒸水至 1000ml充分溶解，4℃冰箱贮存。 4.Tris buffer（TBS）：Tris 2.42g,NaCl 29.2g,溶于600ml三蒸水，再用1N HCl调至pH7.5,然后补加三蒸水至1000ml. 5.漂洗液（TTBS）：TBS液500ml,加 Tween20 250ul. 6.封闭液：5%脱脂奶粉。 7.抗体buffer:1.5g BSA溶于50ml TTBS. 8.显色液DAB（3.3-diaminobenzidine,3.3-二氨基联苯胺）配制：5mg DAB溶于10ml 柠檬酸buffer（0.01mol/L 柠檬酸2.6ml,0.02 mol/L Na2HPO4 17.39ml），加30% H2O2 10 &mu l（临用时现配）。 9.脱色液：甲醇250ml,冰醋酸100ml,加蒸馏 水至1000ml. 10.氨基黑染色液（0.1%氨基黑 -10B）：0.2g 氨基黑-10B 溶于200ml 脱色液中，充分搅拌溶解，滤纸 过滤。 【蛋白质印迹实验操作步骤】 一、样品的SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳 按实验四操作步骤进行。加样时，注意在同一块胶上按顺序做一份重复点样，以备电泳结束时，一份用于免疫鉴定，一份用于蛋白染色显带，以利相互对比，分析实验结果。 二、转移印迹 1.转移前准备：将滤纸，硝酸纤维素膜（NC）剪成与胶同样大小，NC膜浸入蒸馏 水中 10-20min 后浸入转移buffer中平衡30min . 2.凝胶平衡：将电泳后的SDS -PAGE胶板置于转移buffer 中平衡 30-60min. 3.按图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。 4.开始转移，连接正负极，盖好盖子，接上电源，恒流 0.8mA/cm,室温下转移1h,转移后的凝胶再用氨基黑10B染色液染色20min ,然后脱色检测转移效果。 三、免疫染色 1.转移后的NC膜于5%脱脂奶粉中封闭，4℃过夜。 2.TBS洗膜1-2次，10min/次。 3.加HRP标记的抗体，室温1h . 4.TBS 洗3次，10min/次。 5.NC膜再转入DAB显色液中，置暗处反应，待显色反应达到最佳程度时，立即用三蒸水洗涤终止反应。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章Quantitative Structural Proteomics Unveils the Conformational Changes of Proteins under the Endoplasmic Reticulum Stress1，文章的通讯作者是来自美国佐治亚理工学院的Ronghu Wu助理教授。在真核细胞中，内质网(endoplasmic reticulum，ER)负责蛋白质组中40%蛋白质的合成和成熟。蛋白质合成或折叠过程中的变化都将影响内质网的稳态，进而导致未折叠蛋白的积累和蛋白分泌效率的降低。在过去几十年的研究中，内质网应激反应被广泛研究，但是内质网应激反应后蛋白质折叠状态的变化却没有被深入研究。基于丰度的蛋白质组学方法不能直接用于分析蛋白质状态的变化，在这篇文章中，作者整合了半胱氨酸(cysteine，Cys)共价标记、选择性富集和定量蛋白质组学，称为半胱氨酸靶向共价蛋白绘制(cysteine targeted covalent protein painting，Cys-CPP)，用于研究蛋白质组范围内的蛋白质结构和变化(图1A)。　　使用CPP分析蛋白质结构，需要一种具有高反应活性的探针。作者设计了一种针对半胱氨酸的探针，其中包含半胱氨酸反应基团、用于富集的生物素部分和用于生成半胱氨酸特异性识别位点标签的可裂解连接部分(图1B)。以变性处理后的蛋白样品作为蛋白质展开形式的参考，计算肽段在原始样本和变性样本中的比例从而获得宝贵的蛋白质结构信息。　　图1.利用半胱氨酸反应探针定量分析人细胞蛋白质组中半胱氨酸暴露率的原理。(A)Cys-CPP的一般工作流程。(B)半胱氨酸残基与探针之间的反应。富集后，进行紫外裂解，在修饰的半胱氨酸上留下一个小标记，用质谱进行位点特异性分析。　　半胱氨酸暴露率Rexpo通过每条肽段在原始样本和变性样本中的比值进行计算。结果显示：(1)半胱氨酸的暴露率和溶剂可及性呈现正相关(图2C) (2)在丝氨酸和苏氨酸等极性氨基酸残基旁边的半胱氨酸具有相对较高的暴露率，这与人们普遍认为亲水残基更有可能暴露在蛋白质表面的观点一致 (3)甘氨酸和脯氨酸附近的半胱氨酸具有更高的暴露率，这是因为这两种氨基酸通常出现在蛋白质的转角和环结构中，对半胱氨酸的空间位阻较小 (4)半胱氨酸暴露率与其有/无序区(图2D)或所处二级结构(图2E)的相关性分析均表明，较低的暴露率与更稳定和结构化的局部环境有很好的相关性。这些数据结果共同证明目前的方法可以准确地测得半胱氨酸暴露率，并为蛋白质结构提供有价值的信息。　　图2.HEK293T细胞中半胱氨酸暴露率的分析。(A) VAHALAEGLGVIAC#IGEK(#代表标记位点)的串联质谱样本。报告离子的强度使我们可以准确定量一个半胱氨酸的暴露率(左框为报告离子强度的放大视图)。(B)蛋白CCT3中被定量半胱氨酸的定位和暴露率演示(PDB代码：6qb8)。(C−E)比较不同的溶剂可及性(C)、预测无序区(D)和二级结构(E)的半胱氨酸暴露率。　　衣霉素(Tunicamycin，Tm)可抑制 N-糖基化并阻断 GlcNAc 磷酸转移酶 (GPT)。由于蛋白质的N-糖基化经常发生在共翻译过程中，在蛋白质折叠的调节中起着至关重要的作用，所以衣霉素会引起细胞内质网中未折叠蛋白的积累并诱导内质网应激。基于此，作者用衣霉素对细胞进行处理，计算并对比了衣霉素处理样本和正常样本中的半胱氨酸暴露率。正如预期的那样，Tm处理样本中许多半胱氨酸的暴露率升高，且Tm对于蛋白质不稳定区域的作用尤为显著。根据Tm处理样本和正常样本之间半胱氨酸暴露率的差值，作者将所有位点划分为5个部分，在Tm处理下，近三分之一的半胱氨酸定位区域没有明显的结构变化(差值在-0.05~0.05之间)，而28%的位点则高度暴露(差值0.15)(图3B)。对这两种蛋白质进行基因本体(GeneOntology，GO)功能富集分析(图3C)，结果显示：差值在-0.05~0.05之间的蛋白通常是糖异生或折叠过后具有良好结构区域的蛋白，而差值0.15的蛋白则是与囊泡转运相关的蛋白。这表明抑制N-糖基化主要影响经典分泌途径中的蛋白质，与预期相符。　　图3.利用Tm抑制蛋白质N-糖基化对蛋白质折叠影响的系统研究。(A)Tm处理和对照样品之间半胱氨酸暴露率的比较。(B) 不同暴露率变化范围内的蛋白质数量。(C)在具有高度展开或稳定区域半胱氨酸的蛋白之间进行GO功能富集分析。　　由于Tm对于预先存在的、折叠良好的蛋白质所产生的影响可能远小于对新合成蛋白的影响，分别研究Tm对这两种蛋白的影响是必要的。作者通过将目前的方法Cys-CPP与细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记(pSILAC)结合(图4A)，探究了细胞中已存在蛋白和新合成蛋白在内质网应激作用下的不同变化。结果显示：(1)抑制N-糖基化对新合成蛋白的去折叠影响比对已存在蛋白的影响更显著(图4C) (2)N-糖基化除了调节蛋白质的二级结构外，在蛋白质三级或四级结构的形成中起着更重要的作用(图4D)。　　图4. 抑制N-糖基化对新合成蛋白和已存在蛋白折叠状态影响的研究。(A)量化新合成蛋白和已存在蛋白折叠状态变化的实验设置。(B) 经Tm处理和未经处理的细胞中新合成和已存在蛋白质的重叠。括号内为每组蛋白质数。(C)不同蛋白质组中暴露率的分布。(D) 在有或没有Tm处理的细胞中、在不同的二级结构下，新合成和已存在蛋白之间半胱氨酸暴露率的差值分布。　　本文通过设计一种半胱氨酸靶向探针，定量半胱氨酸残基的暴露率，系统地研究了蛋白质的结构以及结构的变化。结果表明，半胱氨酸暴露率与蛋白质局部结构的相关性非常好。利用该方法，作者研究了Tm引起的内质网应激反应下细胞中蛋白质的结构变化。此外，通过将Cys-CPP与pSILAC结合，研究了在内质网应激反应下原有蛋白和新合成蛋白的结构变化差异，并详细分析了内质网应激对蛋白质去折叠的影响，深入和准确地了解内质网应激下的蛋白质结构变化，有助于深入了解蛋白质的功能和细胞活性。　　参考文献：[1] Yin K, Tong M, Sun F, et al. Quantitative Structural Proteomics Unveil the Conformational Changes of Proteins under the Endoplasmic Reticulum Stress[J]. Analytical Chemistry, 2022,

p 　　简介： /p p 　　1999年，Yates研究组提出“鸟枪法”(shotgun)，其基本技术路线是针对液体或SDS-PAGE条带的复杂混合物用酶(Trypsin)酶解成肽段混合物，然后对肽混合物进行多维毛细管液相色谱分离和串联质谱分析以及数据库检索，从而确定蛋白质的种类，可同时鉴定成百上千种蛋白质。他们把这种思路称为多维蛋白质鉴定技术，即Mud PIT(multidi-mensional protein identification technology)。与传统的双向电泳技术相比具有灵敏度更高，动态检测范围更广等特点。 /p p 　　鸟枪法(shotgun)可以分析全细胞裂解样品和组织抽提物，也可以分析亚细胞分级组分、分离的细胞器等其他亚蛋白质组。如果样品已经过稳定同位素标记。根据不同标记的信号强度比例就可以精确确定化学上具有均一性的蛋白在不同样品中的相对丰度，这种多重分析可以利用在谱图上产生前后次序的质量标记得以完成。质谱分析以前在样品中加入同位素标记的某种质量校准肽，通过对此肽的相对定量就可以获得绝对定量的信息。实现目的肽段的绝对定量，而这一性质可以被充分应用以提供临床诊断的标准值或阈值。 /p p 　　差异蛋白质的定量研究是基于肽段水平而非完整的蛋白质，成为该技术最大的技术特色，该技术实现了样品分离与鉴定直接联合，完全自动化操作，可以用于各种蛋白质混合物的蛋白质组学分析，如血清、组织、各种体液以及尿液等。 /p p 　　技术路线： /p p 　　鸟枪法为基因组测序，是先将基因组打断，分段测序， 然后利用计算机重组在一起。从而确定一段的基因序列。 /p p 　　鸟枪法在蛋白质组研究中的应用方式与此相类似，首先将蛋白质混合物酶解成肽段的混合物， 利用质谱进行分析确定该肽段的氨基酸序列，然后计算机根据设定好的运算法则根据肽段的信息在理论蛋白质数据库中检索出这些蛋白质，从而确定该混合物中的蛋白质成分。 /p p style=" text-align: center " img title=" 1.gif" style=" float: none " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/130ae366-baaa-4006-9cf4-2c70b8441925.jpg" / /p p style=" text-align: center " img title=" 2.gif" style=" float: none " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/fe437d70-d969-4f29-a6c9-4e8e1d3e7b65.jpg" / /p p 　　分析目标： /p p 　　寻找差异表达蛋白，并分析蛋白功能。 /p p 　　Gene ontology分析 /p p 　　GO数据库包含了基因参与的生物过程，所处的细胞位置，发挥的分子功能三方面功能信息，并将概念粗细不同的功能概念组织成DAG(有向无环图)的结构。Gene Ontology是一个使用有控制的词汇表和严格定义的概念关系，以有向无环图的形式统一表示各物种的基因功能分类体系，从而较全面地概括了基因的功能信息，纠正了传统功能分类体系中常见的维度混淆问题。在基因表达谱分析中，GO常用于提供基因功能分类标签和基因功能研究的背景知识。利用GO的知识体系和结构特点，旨在发掘与基因差异表达现象关联的单个特征基因功能类或多个特征功能类的组合。 /p p 　　对于每一种表达趋势的基因，选择性的进gene ontology功能分析。对差异表达的所有基因向gene ontology数据库的各节点映射。计算每个节点的基因数目，并结合整个数据库的基因作为背景分部，对于每个节点，得到一个2x2的表格，使用超几何分布检验基因在每个GO节点的富集或贫乏程度。 /p p 　　Pathway enrichment分析 /p p 　　找出差异表达基因在生物学通路中的位置，以阐明其生物学功能以及不同基因之间的相互作用。 /p p 　　1)把差异表达基因定位在生物学通路(Pathway)上。 /p p 　　2)统计分析，确定差异基因可否可以代表某些生物学通路 /p p 　　优点：信息量大，样本量低，检测低丰度蛋白更多，相对定量 /p p 　　应用领域： /p p 　　1)差异蛋白组分析(疾病早期诊断、疗效监测) /p p 　　2)细胞差异性分析(如正义转染vs空载、目标基因RNAi vs空载) /p p 　　3)疾病标志检测(肿瘤标志物，如无血清培养后的分泌蛋白质组) /p p 　　4)治疗检测(术前vs术后) /p p 　　5)药物开发(给药vs对照) /p p 　　6)癌症研究(原位肿瘤细胞系vs转移) /p p 　　Shotgun法可以检测动态范围10000:1内的低丰度肽段，是目前蛋白质组学研究最主要的技术路线。 现已成功应用于中大规模蛋白质的分离鉴定，不再依赖于双向凝胶电泳。 /p p 　　因大部分蛋白质在酶解后总有部分肽段是可用质谱鉴定的，因此，多维蛋白质鉴定技术弥补了碱性、疏水蛋白质、相对分子量极大和极小蛋白质在分离和鉴定方法上的不足。 /p p 　　该方法可达到对低丰度蛋白、极端等电点、分子量、完整膜蛋白具有与其他蛋白有相同的灵敏度。 如鸟枪法可鉴定出10个跨膜域以上的膜蛋白，而2DE仅能检测出2~4个跨膜域的。 /p p 　　Shotgun法可实现自动化、快速、高通量的蛋白组学分析。 /p p 　　但Shotgun法数据冗余复杂，需要专业人员进行分析。 /p p 　　在医学领域，Shotgun技术可用于以下方面： /p p 　　除血清血浆外，还可用于研究体液及组织的蛋白组 /p p 　　分泌蛋白组 /p p 　　大脑皮层神经元细胞蛋白组 /p p 　　新生物标记物的发现 /p p 　　疫苗研究，分析感染源的表面蛋白质，从而发现潜在的抗原。如，在分析人类疟疾致病源plasmodium falciparum时，发现了大量潜在的抗原, 目前这些抗原的特性巳经被评估出来。 /p p 　　发现新的药靶。如，研究发现甲硫氨酸氨基肤酶是肿瘤生长抑制因子bengmide的分子作用靶点。 /p p 　　部分参考文献： /p p 　　1)A proteomics approach to discovering natural products and their biosynthetic pathways, Stefanie B Bumpus, Bradley S Evans, Paul M Thomas, Ioanna Ntai1, Neil L Kelleher, Nature Biotechnology,27,951-956,2009 /p p 　　2)High-throughput generation of selected reaction-monitoring assays for proteins and proteomes, Paola Picotti, Oliver Rinner, Robert Stallmach, Franziska Dautel, Terry Farrah, Bruno Domon, Holger Wenschuh, Ruedi Aebersold, Nature Methods 7, 43-46 (6 December 2009) /p p 　　3)Large-scale analysis of the yeast proteome by means of multidimensional protein identification technology, M.P. Washburn, D. Wolters and J. R. YatesNature Biotechnology, 19, 242-247, 2001 /p p 　　4)Comparison of alternativeanalyticaltechniques for the characterisationof thehuman serumproteomein HUPO Plasma ProteomeProject, XiaohaiLi, Xiaohong Qian etc. Proteomics, 5, 3423–3441,2005 /p p 　　5)An Automated Multidimensional Protein Identification Technology for Shotgun Proteomics, Dirk A. Wolters, Michael P. Washburn, and John R. Yates, Anal. Chem., 73 (23), 5683-5690, 2001 /p p & nbsp /p

仪器信息网讯，2009年11月24日由中国生物化学与生物学会蛋白质组学专业委员会、北京蛋白质组研究中心、岛津国际贸易(上海)有限公司共同主办的题为“翻译后修饰蛋白质组技术及应用”研讨会在北京蛋白质组研究中心成功举办，约200多位多从事相关研究的学者出席了此次研讨会 会议由钱小红教授、杨芃原教授共同主持。 　　在大会上做报告的专家有：Koichi Tanaka(田中耕一，岛津公司研究实验室，2002年诺贝尔化学奖获得者)，Catherine Fenselau (University of Maryland)，Robert J. Cotter (Johns Hopkins University), Emmanuel Raptakis (Kratos Analytical., Shimadzu Biotech), Pengyuan Yang(复旦大学)，Siqi Liu (Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences), Xiaohong Qian (Bdijing Proteome Research Center) Fuquan Yang, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences) Koichi Tanaka(田中耕一，岛津公司研究实验室，2002年诺贝尔化学奖获得者) 　　Title：MALDI Matrix Development History 　　蛋白质是生命的物质基础，每一种生命运动形式，都是特定蛋白质群体发挥功能的结果；因而蛋白质组研究是人类研究细胞功能和疾病发生发展过程的中心环节。目前蛋白质组研究采用的主要技术是双向凝胶电泳和质谱法。具备测定大分子、快速、大规模分析的MALDI-TOF技术是用于蛋白质组分析的主要手段之一，并被认为是蛋白质分析领域的一项重大突破。在蛋白质组研究中，除了研究蛋白质一级结构外，还要对翻译后修饰的进一步分析，如蛋白质的糖基化、蛋白质的磷酸化等，MALDI-TOF在其中发挥了极其重要的作用。 　　田中耕一先生发明的“激光解吸附软电离技术”使分析生物大分子成为可能。MALDI是这一技术直接的商品化，广泛用于测定多肽和蛋白质的分子量、肽指纹图谱、以及氨基酸序列等。　　 Catherine Fenselau (University of Maryland) 　　Title: Proteomic Strategies for Longer Peptides: How and Way 　　Robert J. Cotter (Johns Hopkins University) 　　Titel: Characterization of Protein Post-Translational Modifications Using MALDI Mass 　　Emmanuel Raptakis (Kratos Analytical., Shimadzu Biotech) 　　Title: Using the Power of a MALDI-quadrupole Ion Trap-TOF to Elucidate Structures of Complex Biomolecules 　　Pengyuan Yang(复旦大学) 　　Titel:Mass Spectrometry Based Protein Glycosylation Analysis 　　Siqi Liu (Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences) 　　Title: Proteomic and Functional Analysis Towards the Nitrated Proteins in the Heart Mitochondria of db/db Diabetic Muse Model 　　Xiaohong Qian (Beijing Proteome Research Center) 　　Titel:Globel Analysis of Core-fucosylated Glycoprotein 　　Fuquan Yang, (Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences) 　　Title: Phosphoproteome Analysis of Rat L6 Myotubes Using Reverse Phase C18 Prefractionation and Titanium Oxide Enrichment 大会现场

在生物学的中心法则中，信息从DNA流向RNA，最终转化为执行生物学功能的蛋白质。由于遗传变异、RNA可变剪接和翻译后修饰（PTMs）的存在，蛋白质形成了多样的蛋白分子形式（proteoforms）。目前，Top-Down 蛋白质组学（TDP）已经成为了全面研究蛋白分子形式的最强大技术，它通过Top-Down质谱（TDMS）的实验，不需要酶切，直接分析完整的蛋白质，以提供蛋白分子形式的整体视图。TDMS既需要对完整蛋白的精确质量分析（Top），也需要控制下游气相离子的碎裂来获取序列的信息和PTMs的位点（Down）。与TDP不同，Bottom-Up蛋白质组学（BUP）通过分析酶切后的肽段（通常小于3 KDa）来获取蛋白质的信息，由于多肽相对于完整蛋白更加容易分离、电离和断裂，BUP有着比TDP更加广泛的应用。但是由于BUP获取的肽段数量有限，因此提供的序列覆盖普遍偏低，这就导致了蛋白分子形式信息的丢失。此外，相较于TDP来说，BUP无法提供组合的PTMs信息。（如图1） 图1. TDP和BUP的对比TDP的基本实验流程如图2所示，包括前端样品制备和分离，完整质量分析和碎片分析，以及关于蛋白分子形式的鉴定表征和定量的信息学。 图2. TDP的基本工作流程样品制备传统的蛋白质提取方法使用Good’s缓冲液，它具有高盐浓度(100 mM)，蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和表面活性剂，用于总蛋白质的溶解。这些常规试剂往往与TDP不相容，因为它们会干扰蛋白质离子检测并抑制质谱信号。不相容的盐和小分子可以通过超滤管离心或使用尺寸排除色谱(SEC)自旋柱去除。在样品制备过程中应注意尽量减少人工引入的蛋白分子形式。例如，蛋白酶和磷酸酶抑制剂通常包括在萃取缓冲液中，以尽量减少体外蛋白质降解和去磷酸化。蛋白应该低温保存，以减慢任何的修饰反应。表面活性剂能促进疏水膜蛋白的细胞渗透和增溶，但是表面活性剂会对蛋白的质谱分析造成信号抑制。蛋白质沉淀法通常使用氯仿/甲醇混合物或丙酮，可以去除表面活性剂和其他质谱不相容的污染物。然而，蛋白质沉淀方法耗时且可能导致蛋白质损失、实验变异性或溶解性问题。因此，可切割表面活性剂已被开发出来，如可酸降解的Rapigest、ProteaseMAX、MaSDeS；可光降解的4-己基苯基偶氮磺酸酯；可氧化还原降解的N-十二烷基二硫-β-d-麦芽糖苷等。样品分离和富集前端分离和富集策略可以选择性地分离亚蛋白质组，在质谱分析之前从复杂的生物样品中捕获和富集低丰度蛋白质。例如，可以通过差速离心的方式获取细胞器，蛋白再从细胞器中提取。另一种方式是通过亲和纯化的方式，基于抗体的方式已经在完整蛋白的靶向分析上得到了应用，但是该方法受到高特异性和高质量抗体需求的限制。为了解决这些挑战，可特异性捕获蛋白的表面功能化的多价超顺磁性纳米颗粒和集成纳米蛋白质组学的方法被开发出来。仪器早期的TDP实验依靠单四极杆和三四极杆(分别为Q和QqQ)质谱仪进行完整蛋白分析。这些系统具有较差的质量分辨能力，使得电荷状态测定困难，并且有限的质量电荷比(m/z)范围导致对大蛋白质的适用性较低。高质量分辨能力对于TDP尤为重要，因为完整蛋白质产生的片段离子可以产生卷曲的质谱，其中具有不同电荷态的各种离子可以部分重叠。许多现代质谱仪器可以可靠地实现高分辨率，包括傅里叶变换质谱系统，如离子回旋共振(FTICR)和Orbitrap质谱仪，以及飞行时间(TOF)和四极杆-飞行时间 (Q-TOF)仪器。完整蛋白的分离蛋白质组的复杂性给TDP带来了巨大的挑战，需要在质谱分析之前分离完整的蛋白质。当处理较大的蛋白质(≥30 kDa)时，这一挑战尤其明显，因为随着蛋白质大小的增加，ESI质谱中的离子信号迅速减少。早期的分离方法使用凝胶电泳技术，例如二维凝胶电泳分离、虚拟的二维凝胶电泳分离、直接利用MALDI MS的干胶法和PEPPI-MS等。还可以通过SEC（尺寸排阻色谱）、RPLC（反相液相色谱）、HIC（疏水相互作用色谱）、IEX（离子交换色谱）以及多维的LC方法来分离。例如一个3D LC方法，通过耦合HIC - IEX - RPC，相较于2D IEX -RPLC MS将蛋白质的鉴定数目提高了14倍。此外，CE-MS的最新进展可以用于变性和非变性的TDP分离。离子淌度质谱（IMS）是基于分子在电场作用下的气相运输性质和碰撞截面积（CCS）分离蛋白质，高分辨率的IMS已被证明可以用于分离高序列同源性的蛋白。串联质谱技术串联质谱（MS/MS）技术，在TDP中通常包括通过选择前体蛋白离子，将其解离成更小的片段离子并分析片段离子，从而得出蛋白质的初级结构和修饰（如图3a）。有多种活化/解离方法可用于生成产物离子。大多数仪器可以进行碰撞诱导离解(CID)，也称为碰撞激活离解，通过与中性气体分子(如氮气或氩气)相互作用的碰撞激活来产生b/y离子(图3b)。红外多光子解离(IRMPD)涉及吸收低能红外光子产生b/y离子，并可能在吸收多光子后产生二级和高阶片段离子，从而产生更广泛的蛋白质序列信息。基于电子的解离方法（ExD），如电子捕获解离（ECD）和电子转移离解(ETD)，在产生高序列覆盖率方面往往优于CID。ExD产生的c/z产物可用于确定的蛋白质形态表征和PTM定位。使用193 nm或213 nm激光，紫外光解离（UVPD）可以生成更复杂的串联质谱，序列覆盖率与ExD方法相当或更高。此外，结合四极质量过滤器、线性离子阱和Orbitrap的混合平台可以进行质子转移电荷还原（PTCR），以简化产物离子谱。图3. a, 串联质谱技术示意图。b, 不同解离方式产生的碎片离子。数据采集可采集的谱图数量取决于仪器的占空比和峰的宽度。最常见的TDP数据采集方法是数据依赖的采集（DDA）。在DDA中，收集一个完整的质谱扫描，并选择几个前体离子（通常是最丰富的）进行片段化。与数据非依赖的采集（DIA），即不分离前体离子的质谱扫描碎片，正在迅速发展并在BUP工作流程中采用，为TDP提供了令人兴奋的机会。结果处理TDP的数据信息丰富但是解析难度大，考虑到同位素和电荷态的影响，以及人类蛋白质组的高动态范围，使得谱图分析和对于低丰度蛋白的检测更加困难。TDP的谱图往往有更加复杂的同位素包络，通常不会观察到单同位素峰。大多数工具依赖于Averagine模型来解同位素并预测理论同位素分布。当谱图不能进行同位素分解时，谱图去卷积可以使用多个电荷态离子来推导出一种蛋白分子形式的平均质量。目前正在开发用于存储质谱数据的标准化文件格式。最通用的文件格式是mzML（最新版本1.1.1），这是一种由人类蛋白质组组织蛋白质组学标准倡议(HUPO-PSI)支持的XML格式。几个开源软件库可以转换，读取和写入质谱文件格式，包括ProteoWizard，JmzML，mzJava和pymzML。获得去卷积谱图后的下一步是针对蛋白质或蛋白质序列数据库搜索去卷积质谱，以识别具有错误发现率(FDR)控制的蛋白分子形式并表征PTMs，具体的搜索原理的概述可以查看原文Results-data analysis部分，在这里不再赘述。最后，定量分析不同样品间丰富度的差异。数据库可以使用来自UniProt、RefSeq、GENCODE或相关资源的蛋白质序列数据库。这些数据库只包含序列，不包含PTMs的信息。可以根据PTMs位点和类型，构建可用的数据库，但要注意限制PTMs的可变数目，否则产生的组合数据会过于庞大。DNA或RNA-seq数据可用于构建具有样品特异性基因突变和备选剪接事件的蛋白分子形式序列数据库。定性与定量分析TDP提供了对蛋白分子形式的全面了解，使鉴定、新蛋白分子形式的发现和深入的序列表征成为可能。TDP具有独特的优势，因为它可以表征组合PTMs与多基因家族中不同基因编码的同型异构体，这些异构体通常具有高序列同源性。例如，肉瘤蛋白具有多种亚型和PTMs，如N端二甲基化、乙酰化、磷酸化和甲基化。单个肌肉细胞的蛋白质形态变化可以通过TDP进行研究。当单个蛋白分子上存在多个PTMs时，TDP是唯一可以解析复杂蛋白形态和组合PTMs的技术。例如，TDP可以鉴定组蛋白的多种蛋白分子形式，以及定量描述PTMs之间的化学计量学。TDP的定量方式和BUP类似，主要有非标记定量（label free）：采用不同蛋白分子形式的信号强度定量；同位素标记（isotope labeling）:采用不同分子量的同位素标记来定量；化学标记（chemical labeling）：采用化学报告基团来定量，尤其是在MS2水平上。（如图4）其他标记技术——如氨基酸稳定同位素标记(SILAC)、同量异位（isoabric）标记、假同量异位（pseudoisobaric）标记和NeuCode SILAC——已经显示出定量TDP的潜力。图4. 不同定量方法统计学分析和错误率计算TDP的软件通常会使用E值和P值来反映串联质谱和蛋白分子形式的匹配程度，此外FDR值也常被用来描述鉴定的可靠性。对于定量的TDP.对于定量TDP分析，统计分析通常使用单向方差分析和Stundent’s 检验(双尾)。多次测试调整通常使用benjamin - hochberg方法进行。如有必要，可采用非参数Kruskal-Wallis单因素方差分析和Wilcoxon秩和检验进行组间比较。对于人类临床样本的定量TDP，随机截距的线性混合效应模型可以进一步表征人类个体之间的异质性。作者还介绍了一些TDP软件，例如，TopPIC、MSPathFinder、TopMG和pTop等。应用作者在这一部分列举了许多相关研究，考虑到篇幅限制，感兴趣的读者可以在原文中的Application部分查看。主要包括（1）全球蛋白分子形式的发现。（2）癌症：例如，一项全球TDP研究从结直肠癌细胞的2332种蛋白质中鉴定出23000多种蛋白分子形式，并揭示了转移性和非转移性细胞之间蛋白分子形式水平的巨大差异。（3）心血管疾病：将蛋白质组学应用于心脏生物学和临床诊断已经取得了进展。例如，TDP分析了“CARDIA研究”中的配对血清样本，揭示了载脂蛋白AI和AII与心脏代谢指标之间的蛋白分子形式特异性关联。（4）神经退行性疾病：失调的PTMs可以影响神经退行性疾病中的蛋白质聚集，许多PTMs是神经退行性疾病中蛋白质病变的调节剂。例如，阿尔茨海默病受到β或tau淀粉样蛋白磷酸化和β淀粉样蛋白中异天冬氨酸形成的影响。（5）传染病。（6）生物制剂：例如单克隆抗体，抗体偶联药物等基于蛋白的药物。（7）临床TDP，例如，使用MALDI-TOF-MS鉴定病原体，它可以直接从完整的细菌细胞表面快速检测到蛋白分子形式。重现性与数据存储TDP是一个相对较新的领域，与成熟的BUP方法不同，普遍接受的实验方法和数据报告标准尚未制定。由CTDP（Consortium for TDP）领导的标准化工作正在推动实验室间的比较，以更好地了解挑战并提高重现性。蛋白分子形式易受样品处理和仪器方法变化的影响，因此科学的严谨性和充分的数据报告实践非常重要。所有TDP数据都应公开提供。许多期刊已经实现了这一要求，但这需要共同的努力来确保正确的数据处理和报告实践得到执行。CTDP的Proteoform Repository为科学家提供了一个独特的中心，可以浏览存储的蛋白分子形式并提供TDP数据集。数据存储库对于TDP数据遵守FAIR数据存储标准是必不可少的。将TDP数据集平台化并作为中央存储库的新途径和举措将对促进TDP数据的可访问性和共享非常有价值，这反过来将使TDP领域受益。面临的挑战与优化策略TDP的新技术在不断地发展，但是仍旧面临着诸多的挑战：（1）灵敏度。传统的TDP工作流程需要大量的样品（微克级的总蛋白或者数百万的细胞），以获得高质量的数据。新的高灵敏度的方法正在开发，例如CE-MS可实现对于单个细胞的检测，Nanopots技术可用于TDP，还有可以提高蛋白提取率的表面活性剂与尿素联用。（2）高分子量的蛋白质分子形式。高分子量的蛋白质难分离、信号差、仪器负担大。这就需要超高分辨率的平台，如FTICR质谱仪。在质谱分析之前，基于SEC或凝胶技术的基于尺寸的分离方法，例如，整合蛋白质组学方法或PEPPI-MS，可以解决大离子分析的挑战。但是没有单一的分离策略或者MS/MS仪器可以分析整个蛋白质组，需要开发新方法、新仪器以及改进的信息学工具来克服。（3）蛋白质的串联质谱。蛋白质在序列末端的片段化效率较高，而在中间的片段化覆盖率有限。这种差异在较大的蛋白质中更为明显，并且被认为是由于在变性条件下仍然存在的。内部碎片离子是由至少两个骨干断裂产生的，没有N或C端，在TDP碎片离子中越来越多地被考虑。最近开发的TDP软件ClipsMS可以将内部片段质量分配给蛋白质序列，从而提高整体覆盖深度。（4）定位修饰位点。由于不稳定的PTMs，低丰度的蛋白形式，PTMs的实验定位和蛋白质分子形式化学成分的精确表征具有挑战性。富集策略可以增强低化学计量或低丰度信号；还需要优化特定的碎片方法，例如，通过使用更温和的基于电子的方法，如ETD或ECD。（5）通量问题。TDP相对较低的吞吐量和较高的数据复杂性是新老用户的主要障碍。基于发现的TDP数据处理包括去卷积和数据库搜索，这可能需要几个小时到几天，具体取决于软件性能和搜索参数。自动制备和分离系统的发展，以及软件性能的提升都有助于改善通量的问题。展望TDP是目前唯一能够确定蛋白质形分子形式特征并量化其丰度的技术。由于蛋白质分子形式的基本重要性及其作为细胞、环境或生物系统健康标志的潜在作用，TDP技术有望继续快速发展。需要解决的两个关键领域是改进复杂蛋白质分子形式混合物的深度表征和大分子量蛋白的识别和表征。一个令人兴奋的发展是单离子测量，它可以在现有的商业仪器和专门的前体类型上实现。液相色谱固定相、CE-MS、基于IMS的分离的发展以及与多维方法的整合将继续改善蛋白质组学的测量。利用基因组、转录组以及BUP的信息，可以构建更精准的数据库，用于分析一些更复杂的PTMs，例如蛋白的糖基化，这也是TDP的一个优化方向。为了将蛋白质分子形式与相关的可测量输出(例如转录物和代谢物)联系起来，并破译生物学的基本原理，可以将多组学的测量结合起来。此外，通过结合微流体、质谱成像和单离子测量等先进技术，有望将单细胞和空间生物学扩展到蛋白质分子形式分析。本文发表在Nature Reviews Methods Primers 上，Top-Down Proteomics[1] ，通讯作者是美国威斯康辛大学麦迪逊分校化学系的Lloyd M. Smith和Ying Ge教授。文章介绍了Top-Down蛋白质组学的基本工作流程、应用以及面对的挑战。[1] Roberts, D.S., Loo, J.A., Tsybin, Y.O., et al. Top-down proteomics[J]. Nature Reviews Methods Primers，2024，4(1)：38.

大家好，本周为大家分享一篇发表在J Proteome Res.上的文章，Systematic Identification of Proteins Binding with Cisplatin in Blood by Affinity Chromatography and a Four-Dimensional Proteomic Method，该文章的通讯作者是华中科技大学药学院的杜支凤教授。以顺铂为代表的铂类抗癌药物广泛应用于治疗多种癌症肿瘤，如胃肠道癌、头颈部癌和卵巢癌等。在静脉滴注后，这些药物水解形成活性分子，与DNA结合并抑制DNA链的合成与复制，最终致使细胞死亡。然而，由于铂与硫醇的高亲和力，大多数铂在静脉注射后会与血液中的蛋白质结合；例如，人血清白蛋白 (HSA) 是含量最丰富的血清蛋白，也是血液中铂类药物的主要结合蛋白；另外，在红细胞中负责运输氧气的血红蛋白 (HB) 也被发现与铂结合，因此，有必要研究铂类药物在血液中的蛋白结合行为。先前的研究已经证明，利用质谱方法可以实现对高丰度蛋白质的可靠鉴定；然而，由于高丰度蛋白的干扰，占总蛋白的 80% 以上的低丰度蛋白则很少被鉴定。此外，由于缺乏足够信息，以及在胰蛋白酶消化过程中还原和烷基化剂的使用导致蛋白上的铂化位点无法被确定。更重要的是，目前排除假阳性结果的唯一方法是根据铂化肽的特征同位素模式，人工对比理论同位素和实验同位素，从而导致鉴定过程非常耗时并且具有较强的主观性。因此，有必要开发一种可靠、高效的方法来鉴定血液中铂类药物的结合蛋白质组。在血液蛋白质组学研究中，免疫亲和层析常用于消耗高丰度蛋白并富集低丰度蛋白。它有利于低丰度蛋白的鉴定和定量，从而可以提高血液中的蛋白质组覆盖范围。除了色谱分离外，离子淌度质谱 (IM−MS) 根据离子的迁移率差异进行分离，同样有助于低丰度蛋白质的分析。在金属化蛋白的鉴定中，金属化肽和游离肽的同位素分布模式明显具有差异，这有助于确定这些肽是否与金属药物结合。已经开发了一些数据处理软件程序来自动分配金属药物在已知蛋白质上的结合位点，如智能数字注释程序 (SNAP) 算法和 Apm2s 。本文结合高丰度蛋白分离和4D蛋白质组学方法 (IM-MS) ，系统、全面地鉴定了血液中顺铂的结合蛋白，并利用铂化肽的特征同位素模式和相似性算法来消除假阳性的识别。如图1所示，首先用超滤去除游离药物，然后使用多亲和去除柱分离血液样本中的高丰度和低丰度蛋白；用FAIMS Pro界面的nano-LC−MS/MS进行消化和分析；用MaxQuant对铂化的多肽和蛋白进行鉴定，用相似性算法Apm2s排除假阳性结果。在此基础上，采用基于平行反应监测 (PRM) 的方法测定了血浆中多肽与顺铂的结合率。本研究为系统鉴定血液中金属药物的结合蛋白提供了一种新方法，鉴定出的蛋白可能有助于了解铂类抗癌药物的毒性。图1 铂化蛋白的分离和鉴定以及用蛋白质组学方法测定顺铂与多肽之间的结合率的示意图本研究采用顺铂与人血浆的反应混合物建立了一种分析方法。为了与文献进行比较，样品的制备方法与文献中的制备方法相同1。选择CID作为碎裂方式，结果表明，从低丰度部分共鉴定出212个蛋白，从高丰度部分共鉴定出169个蛋白。在低丰度部分，共鉴定出1192个游离肽和208个铂化肽。其中，154个铂化肽被排除为假阳性结果，如文中表S1所示。高丰度部分的游离肽数和铂化肽数分别为1124个和169个，其中，144个铂化肽被排除为假阳性，如表S2所示。低丰度结合蛋白的鉴定在以往的研究中，由于高丰度蛋白的干扰，很少发现低丰度蛋白与铂的结合。本研究在高丰度蛋白被消耗后，从29个蛋白中共鉴定出54个铂化肽。APOA4中铂化肽的理论和实际质谱如图2所示，前体离子和铂化产物离子表现出特征的同位素峰。图片显示了关键的碎片离子的质谱图，用于分配铂化位点。在鉴定出的铂化蛋白中，CERU、FETUA、ITIH1和B4E1Z4有4个或更多的含铂肽，这表明铂可以与这些蛋白质的多条肽段结合。虽然低丰度蛋白只占血液中蛋白的一小部分，但它们具有非常重要的功能，对于维持正常生理活动不可或缺。例如，CERU可以将Fe2+氧化为Fe3+，并在铁代谢中发挥重要作用；B4E1Z4与补体激活相关。顺铂与这些蛋白的结合是否会对其功能产生影响仍有待进一步研究。图2 从低丰度蛋白部分鉴定出的铂化蛋白APOA4。(A)铂化肽的理论（左）和实验质谱（右）；(B)铂化肽的MS/MS和指示铂化位点的关键碎片离子的质谱图高丰度结合蛋白的鉴定IGHG1中一个铂化肽的理论和实验质谱如图3所示，其前体离子和铂化产物离子表现出特征同位素峰。根据关键的碎片离子确定了铂化位点。在已鉴定的蛋白中，ALBU（白蛋白）和CO3（补体C3）有4个或更多的含铂多肽。HSA负责血液中药物和小分子的运输，CO3在补体系统的激活中起着重要作用。高丰度蛋白与顺铂的结合已被用于提高肿瘤化疗的疗效和选择性，而新发现的高丰度结合蛋白有助于相关研究。与低丰度组分鉴定的铂化蛋白相比，大部分与低丰度组分蛋白不同，两个组分中仅共同检测到FETUA和CFAH作为铂化蛋白，这表明亲和层析对高丰度蛋白和低丰度蛋白的分离效果较好。图3 从高丰度蛋白部分鉴定出铂化蛋白IGHG1。(A)铂化肽的理论（左）和实验质谱（右）；(B)铂化肽的MS/MS和指示铂化位点的关键碎片离子的质谱图IM−MS分离铂化肽异构体如图4所示，通过nano-LC−IM−MS/MS成功分离了低丰度蛋白组分中FETUA的铂化肽异构体。同分异构体a和b是典型的铂化肽，由质谱图的同位素模式显示，它们被很好地分离。它们的MS/MS不同，根据关键碎片离子，异构体a和b的铂化位点分别被划分为M和H/T。这个例子显示了IM−MS对复杂样品的分辨能力。图4 用nanoLC−IM−MS/MS分离的低丰度蛋白组分中FETUA的铂化肽异构体。(A)m/z=764.67提取离子色谱和异构体a、b的质谱，理论质谱见中间；(B)异构体的MS/MS和关键碎片离子的质谱图结合蛋白的铂化位点在本文的两项研究中，His 和 Met 是首选的铂结合位点。此外，D、E、S和Y也被发现是铂结合位点。这也是合理的，因为血清蛋白的供氧氨基酸已被证明是顺铂的动力学首选结合位点。很少有Cys残基被鉴定为结合位点，这可能是由于没有还原和烷基化。肽的半胱氨酸常形成二硫键，不经还原和烷基化就无法识别，因此，序列覆盖率会很低。在未来的研究中，应使用替代还原剂来提高肽序列覆盖率。生物信息学分析 为了揭示铂化蛋白质的定位、功能和途径，将从高丰度和低丰度部分中鉴定的蛋白质组合起来并通过生物信息学工具进行分析。如图5A所示，GO分析表明大部分结合蛋白位于细胞外区域，发挥蛋白结合、金属离子结合、酶抑制剂等功能；因此，镀铂蛋白的定位证实了鉴定的可靠性。此外，这些蛋白质参与内肽酶活性、免疫系统过程、补体激活、炎症反应和凝血的负调节。为了阐明所涉及的途径，对鉴定的蛋白质进行了KEGG途径富集分析，结果表明最显着的富集途径是补体和凝血级联途径（图5B）。补体和凝血级联途径已被证明在造血干/祖细胞的动员中发挥关键作用，这对造血具有重要意义。顺铂的血液学毒性与其在补体和凝血级联途径中与血液蛋白的结合之间的相关性值得进一步研究。图5 (A)通过GO 分析确定的铂化蛋白的定位、分子功能和生物学过程；(B)铂化蛋白的富集途径血液蛋白与顺铂的结合率 由于未检测到一些铂化肽的游离形式，因此仅使用高丰度组分中的13种肽进行亲和力研究。可靠地计算了属于五种蛋白质的六种铂化肽的结合率。PRM分析中这些肽的信息见表S5，定量结果见图6。其中，富含组氨酸的糖蛋白的一种肽与顺铂的结合率最高，这可能是由于顺铂对含组氨酸和带负电荷的生物分子的高亲和力。Apoa1 蛋白的一个肽与顺铂的结合率最低。在本研究中可以确定结合率的铂化肽数量较少，这主要是由于某些肽的质谱响应低以及某些肽存在氧化形式。因此，这些肽的结合比率不能通过 PRM 方法确定。然而，与以往的研究相比，根据属于同一蛋白质的肽的质谱计数粗略估计某种蛋白质的丰度，这种方法可以更准确地确定高丰度肽与铂的结合率。图6 根据PRM分析多肽与顺铂的结合亲和力顺铂与血液蛋白的结合与其药代动力学、活性、毒性和副作用密切相关。然而，血液蛋白质组的复杂性限制了低丰度结合蛋白的鉴定。在本研究中，基于亲和色谱和nanoLC-IM-MS/MS 的 4D 蛋白质组学方法被用于分离低丰度和高丰度蛋白质并分析这两个部分。基于铂化肽的特征同位素分布和相似性算法，排除了假阳性鉴定。结果，共有 39 种蛋白质被鉴定为铂化蛋白质，这比之前研究中的数量要高得多。随后的生物信息学分析表明，这些结合蛋白位于细胞外区域，主要参与内肽酶活性、免疫系统过程、补体激活、炎症反应和凝血的负调控。最显着的富集途径是补体和凝血级联，这可能与顺铂的血液学毒性有关。高丰度部分的 PRM 分析表明，富含组氨酸的糖蛋白中的肽与高丰度组分中的顺铂的结合率最高。综上所述，本研究揭示了人类血液中与顺铂结合的蛋白质组，并计算了顺铂与血液蛋白的结合率。这种方法虽然在数据分析方面比较耗时，但它可以识别复杂系统中金属药物的低丰度结合蛋白，并且可以准确测量药物与血液蛋白的结合率。

1月22日，《高通量蛋白质检测关键技术的研究》项目验收鉴定会在中国计量院召开。此次科技基础条件平台项目的验收，得到了科技部、国家质检总局的重视，国家科技部条财司条件处郑健博士，国家质检总局科技司技术发展处姚泽华副处长，计量院段宇宁副院长、科发部及生能环所的相关人员参加了验收会。会议由姚泽华副处长主持，以中国科学院生物物理研究所杨福全研究员为组长的8位专家对该项目进行验收鉴定。 　　近年来，随着生命科学、食品安全等领域需求的不断涌现，蛋白组学的发展非常迅速，已成为各项相关分析技术的必备手段。一直以来，蛋白质组分析技术的发展受限于蛋白质分离手段的滞后，目前完整蛋白质的分离主要依赖于双向电泳和高效液相色谱，不能满足复杂蛋白质混合物的有效分离 FFE技术(反向加样连续自由流电泳)的出现能较好地解决蛋白质组研究的两大难题：蛋白质组的复杂程度和现有检测手段的低通量。 　　《高通量蛋白质检测关键技术的研究》课题建立了以FFE分离方法为核心的高通量蛋白质分离检测技术中最为关键的“高稳定度自由流电泳(HSFFE)”装置，为高通量完整蛋白质的酶解、肽段分离和质谱鉴定接口的大规模系统集成奠定了基础，也是我国第一台自主研发的实用大型地基液相制备电泳装置。该装置通过对自适应高压稳定电源、腔体热交换工艺、速率调整机构、应力同步机构等关键技术的完成，实现了高通量蛋白质制备分离 装置的整体技术水平已达到国际先进水平，其中一些技术方法处于国际领先水平，对于改变我国蛋白质组分离长期以来依靠国外技术装备的现状，将发挥重大作用。 　　科技部条财司郑健博士谈到，科技部一直比较重视科学仪器的自主研发工作，近几年来在科技支撑计划的支持下，我国的科学仪器自主创新已经到了一个新高度。该项目的研究成果改变了我国在蛋白质分离技术研究方面依赖国外进口仪器设备的现状，希望计量院能进一步加强现有产品、现有装置、现有成果的工程化和应用方法的研究。通过大家的共同努力，使下一步我国的仪器创新发展获得更大的进步。 　　姚泽华副处长祝贺项目组出色完成了任务，他谈到，质检总局面临的许多社会问题是突发的、紧急的，又极具推动力的，如：08年的三聚氰胺，推动了国产仪器液相色谱的发展 09年的H1N1流感，又推动了国产的红外测温仪的发展。而计量院在此方面的研制开发一直是非常及时和有效的。该课题是计量院近年来在科学仪器自主研发方面所取得的又一重要成果。希望计量院能够继续研制出更多具有国际领先水平的国产科学仪器装置，为我国进出口的产品贸易提供良好的支撑，满足国家社会更多更广泛的需求。 　　该项目的研制成功不仅增强了我国生命科学的系统创新能力，而且具有普及性强、性能价格比高和市场容积率高的优点，尤其是该系统的结构模块化、系统单元相对独立的特点，有效避免了国外仪器设备固有的售后维修困难问题，具有较好的国内和国际市场需求潜力。

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用于蛋白质组学应用的高级LC-MS组学分析软件实现了前所未有的高速度和可靠性 巴尔的摩–2014年6月16日–沃特世公司（纽约证券交易所代码：WAT）今天发布了蛋白质组学数据分析软件的最新成果，即用于蛋白质组学的Progenesis QI 2.0版，该款软件可对实验室样品中不同的蛋白质进行前所未有的快速可靠的定量和鉴定。用于蛋白质组学的Progenesis QI 2.0版的发布扩充了沃特世用于组学数据分析的世界领先信息学组件。用于蛋白质组学的Progenesis QI 2.0版的新功能包括有助于对所得MS数据进行生物学理解的Pathway Analysis；评估LC-MS数据质量以利于排除次优测量结果的QC Metrics；以及无需编写重复步骤以加快分析速度的Process Automation。这一全新软件支持用户自选HiN的蛋白质定量方法，以及二维液相色谱(2D-LC)实验的全面HiN功能。用于蛋白质组学的Progenesis QI 2.0版通过让用户快速定量和鉴定蛋白质样品间的差异，将基于组学的数据分析提升到一个新的水平。它可以根据研究人员的工作方式设置直观易学的步骤，并提供灵活的工作流程以及高度可视化的用户界面，从而提高用户对所得数据的信心。“用于蛋白质组学的Progenesis QI 2.0版为用户带来了前所未有的掌控力和功能性。它解决了生物学研究的主要瓶颈，”沃特世全球营销和信息部门副总裁Rohit Khanna博士表示，“扩展后的功能拓宽了在蛋白质组学研究、健康科学和食品研究领域的应用。沃特世通过这款全新软件推出了新一代的前沿信息学应用。”2014年4月，在德国慕尼黑的Analytica Conference（分析研讨会）上，沃特世继收购组学数据分析软件领域的全球领导者Nonlinear Dynamics Ltd.之后，推出了Progenesis QI和用于蛋白质组学的Progenesis QI。有关用于蛋白质组学的Progenesis QI 2.0版软件的详细信息，请访问我们的网站：http://www.nonlinear.com/progenesis/qi-for-proteomics/。 关于沃特世公司（www.waters.com）50多年来，沃特世公司（纽约证券交易所代码：WAT）通过提供实用、可持续的创新，使医疗服务、环境管理、食品安全和全球水质监测领域有了显著进步，从而为实验室相关机构创造了业务优势。作为一系列分离科学、实验室信息管理、质谱分析和热分析技术的开创者，沃特世技术的重大突破和实验室解决方案为客户的成功创造了持久的平台。2013年沃特世拥有19亿美元的收入，它将继续带领全世界的客户探索科学并取得卓越成就。 ###媒体联系：Vivian Qian沃特世科技（上海）有限公司市场服务部Vivian_Qian@waters.com孙玲玲(Linda Sun)泰信策略(PMC)18027283917Linda.sun@pmc.com.cn