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爱色丽分光光度仪原理

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爱色丽分光光度仪原理相关的论坛

  • 【资料】752型分光光度计结构原理及使用方法.doc

    752型分光光度计为紫外光栅分光光度计,测定波长200nm~800nm。 1.结构原理 752型分光光度计由光源室、单色器、样品室、光电管暗盒、电子系统及数字显示器等 部件组成,仪器的工作原理如图1所示。 仪器内部光路系统如图2所示。 从钨灯或氢灯发出的连续辐射经滤色片选择聚光镜聚光后投向单色器进狭缝,此狭缝正好位 于聚光镜及单色器内准直镜的焦平面上,因此进入单色器的复合光通过平面反射镜反射及准 直镜变成平行光射向色散光栅。光栅将入射的复合光通过衍射作用形成按照一定顺序均匀排 列的连续单色光谱,此时单色光谱重新返回到准直镜,然后通过聚光原理成像在出射狭缝上 。出射狭缝选出指定带宽的单色光通过聚光镜落在试样室被测样品中心,样品吸收后透射的 光经光门射向光电管阴极面。根据光电效应原理,会产生一股微弱的光电流。此光电流经电 流放大器放大,送到数字显示器,测出透光率或吸光度,或通过对数放大器实现对数转换, 显示出被测样品的浓度C值。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=91635]752型分光光度计结构原理及使用方法.doc[/url]

  • 【分享】UV分光光度计的应用原理

    UV分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。UV分光光度计是一种是利用物质对光的选择吸收现象,进行物质的定性和定量分析的光电式分析仪器,也是一种光谱仪器。常用于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。那么UV分光光度计的应用原理又是怎样呢,其实UV分光光度计的应用原理非常简单。UV分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长的光源,光源透过测试的样品后,部分光源被吸收,计算样品的吸光值,从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。

  • 【资料】原子吸收分光光度计的原理及测量技术

    [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Wp][color=#3333ff]原子吸收[/color][/url]分光光度计的原理及测量技术[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=31302][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Wp][color=#3333ff]原子吸收[/color][/url]分光光度计的原理及测量技术[/url]

  • 【资料】分光光度计的应用常识(原理与应用)

    分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。 分光光度计的简单原理 分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长的光源,光源透过测试的样品后,部分光源被吸收,计算样品的吸光值,从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。

  • 紫外分光光度计的最基本的工作原理介绍

    紫外分光光度计根本作业原理和红外光谱仪类似,使用必定频率的紫外可见光照耀被剖析的有机物质,导致分子中价电子的跃迁,它将有挑选地被吸收。一组吸收随波长而改变的光谱,反映了试样的特征。在紫外可见光的范围内,关于一个特定的波长,吸收的程度正比于试样中该成分的浓度,因而测量光谱可以进行定性剖析,而且根据吸收与已知浓度的标样的对比,还能进行定量剖析。  紫外-可见分光光度计  紫外-可见分光光度计的类型很多,但可概括为三种类型,即单光束分光光度计、双光束分光光度计和双波长分光光度计。  1、单光束分光光度计  经单色器分光后的一束平行光,轮番经过参比溶液和样品溶液,以进行吸光度的测定。这种简便型分光光度计结构简略,操作方便,维修容易,适用于惯例剖析。  2、双光束分光光度计  经单色器分光后经反射镜分解为强度持平的两束光,一束经过参比池,一束经过样品池。光度计能主动对比两束光的强度,此比值即为试样的透射比,经对数变换将它变换成吸光度并作为波长的函数记载下来。  双光束分光光度计通常都能主动记载吸收光谱曲线。由于两束光一起别离经过参比池和样品池,还能主动消除光源强度改变所导致的差错。  3、双波长分光光度计  由同一光源宣布的光被分红两束,别离经过两个单色器,得到两束不同波长1和2 的单色光;使用切光器使两束光以必定的频率替换照耀同一吸收池,然后经过光电倍增管和电子控制系统,最后由显示器显示出两个波利益的吸光度差值。关于多组分混合物、混浊试样(如生物组织液)剖析,以及存在布景搅扰或共存组分吸收搅扰的情况下,使用双波长分光光度法,通常能进步办法的灵敏度和挑选性。使用双波长分光光度计,能取得导数光谱。  经过光学系统变换,使双波长分光光度计能很方便地转化为单波长作业方式。假如能在1和2处别离记载吸光度随时刻改变的曲线,还能进行化学反应动力学研讨.

  • 紫外及可见光分光光度计的构造原理

    紫外及可见光分光光度计的可测波长范围为200一1000 nm,也有波长范围为200- 400 nm的[url=http://www.chinanoted.com/]紫外分光光度计[/url],但前者较为普遍。紫外及可见光分光光度计的构造原理与可见光分光光度计(如721型分光光度计)相似。由于玻璃吸收紫外光,因此单色器要用石英棱镜或光栅。(一)光a(light source)有钨丝灯及氢灯(或氛灯)两种。可见光区(360一1000 nm)使用钨丝灯 紫外光区 (200一360 nm)则用氢灯或氛灯。(二)吸收池(absorption cell)由于玻璃吸收紫外光.吸收池要用石英材质。(三)检浏器(detector)检侧器使用两只光电管,一为氧化艳光电管,用于625一1000 nm波长范围 另一只是锑艳光电管,用于200一625 nm波长范围。光电倍增管亦为常用的检测器,其灵敏度比一般的光电管高2个数量级。图8一22是紫外及可见光分光光度计原理图。[img=,452,200]http://www.yi7.com/file/upload/201201/10/15-02-26-80-3596.jpg[/img]紫外及[url=http://www.chinanoted.com/]可见光分光光度计[/url]分单光束和双光束型。单光束型仪器使用前一般需要预热以使仪器稳定,缺点是难以消除与补偿由于光源与电子测量系统不稳定等所引致的误差。双光束型仪器能够消除与补偿由于光源、电子测量系统不稳定等所引致的误差,所以其测盘的精确度就提高了。双光束型仪器的工作原理如图8一23所示。[img]http://www.yi7.com/file/upload/201201/10/15-02-26-97-3596.jpg[/img]其工作原理可描述为:由光源(钨丝灯氘灯,根据波长而变换使用)发出的光经人口狭缝及反射镜反射至石英棱镜或光栅,色散后经过出口狭缝而得到所需波长的单色光束。然后由反射镜反射至由马达转动的调制板及扇形镜上。当调制板以一定转速旋转时,时而使光束通过,时而挡住光束,因而调制成一定频率的交变光束。之后扇形镜在旋转时,将此交变光束交替地投射到参比溶液(空白溶液)及试样溶液上,后面的光电倍增管接受通过参比溶液及为试样溶液所减弱的交变光通量,并使之转变为测量信号。此信号经放大并用解调器分离及整流,然后以电位器自动平衡此两直流信号的比率,并依照记录器记录得到吸收曲线。

  • 【求助】原子吸收分光光度分析的基本原理是什么?

    [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Wp][color=#3333ff]原子吸收[/color][/url]分光光度分析的基本原理是什么?并从原理上比较发射光谱法和[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Wp][color=#3333ff]原子吸收[/color][/url]分光光度发的异同点和优缺点?

  • 紫外可见分光光度计测定原理分享

    紫外可见分光光度计测定的是蛋白浓度,X射线晶体衍射测的才是蛋白质结构。紫外分光光度计测蛋白浓度原理:组成蛋白质的氨基酸里,有三种氨基酸:苯丙氨酸,酪氨酸,色氨酸具有苯环的共轭结构,它们对特定波长的紫外线具有吸收光谱,也就是说:它们对紫外线是有颜色的。每种蛋白质根据苯环的数量和分布都有一定的吸收强度,总的吸收值和分子的浓度呈正比。根据蛋白质溶液对280nm紫外线的吸收强度,可以测定出蛋白质的浓度。X射线晶体衍射测蛋白结构原理:蛋白质的肽链不是杂乱无章的,按照一定的规则盘曲成了特定的形状(蛋白质高级结构),每个碳-碳键都有它特定的构象,这种特定的结构是蛋白质作为分子机器的基础。结晶的蛋白质中,分子排成了空间重复的有序的结构,而原子之间的间隙与X射线的波长类似,构成了X射线的衍射光栅。当用X射线照射这种重复性的天然光栅时,通过波的衍射形成了有规则的干涉条纹,分析这些条纹就可以解析出蛋白质分子中每个原子的位置。

  • 分光光度计六大优势及原理及三大注意事项

    1、分光光度计具有低杂色光,高分辩率的单光束光路结构的单色器;  2、分光光度计具有良好的稳定性,重现性和精确的测量读数;  3、明亮清晰的数字显示器可显示透射比,吸光度,浓度和所设置的波长,提高了仪器的读数准确性;  4、分光光度计采用最新微机处理技术,仪器具有自动设置0%T和100%等控制功能;  5、仪器配有标准的RS-232双向通讯接口,不仅可向计算机发送测试参数,还可接收计算机发出的指令.  6、分光光度计在已知标准溶液浓度前提下,测定未知样品浓度,在已知标准溶液浓度斜率前提下,测定未知样品浓度.  分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长的光源,光源透过测试的样品后,部分光源被吸收,计算样品的吸光值,从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。  1.分光光度计应放在干燥的房间内,使用时放置在坚固平稳的工作台上,室内照明不宜太强。热天时不能用电扇直接向仪器吹风,防止灯泡灯丝发亮不稳定。  2.分光光度计使用前,使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理,以及各个操纵旋钮之功能。在未按通电源之前,应该对仪器的安全性能进行检查,电源接线应牢固,通电也要良好,各个调节旋钮的起始位置应该正确,然后再按通电源开关。  3.分光光度计在仪器尚未接通电源时,电表指针必须于“0”刻线上,若不是这种情况,则可以用电表上的校正螺丝进行调节。

  • 分光光度计工作原理的限制性条件

    分光光度计的工作原理是1、物质对光的选择吸收,2、琅伯-比尔定律。我们这里讨论琅伯-比尔定律的限制性条件。其一:通过溶液的光必须是平行的;其二:通过溶液的光必须是单色光;其三:待测溶液必须是纯净的、均匀的且浓度不宜过高,这是琅伯-比尔定律首要的三个前提条件。但是在实际的分光光度计的制造和使用过程中这三个条件是不可能达到的。其一:因为光是直线传播的,在分光光度计制造过程中,灯源发出的光是发散的,经过聚焦镜进行聚焦等直到经过溶液的整体过程中,光是不可能平行的。其二:灯源发出的光是复合光,经过狭缝,再经过光栅分光等步骤,因为受到狭缝和光栅本身的限制,光栅分光不可能达到纯单色光。还有光度计的整体设计问题,光度计不可能没有其它的杂光存在。其三:用户的溶液也不可能是纯净的,也会含有一些杂质,这些对光度的吸收都会存在影响。除以上三个方面的影响外,在实际的光度计应用过程中还会存在其他因素的影响,例如:1、经过比色皿的光是否垂直;2、比色皿宽度是否为10mm的标准值;3、测试波长是否准确;4、程序设计是否存在漏洞等等,都会直接影响到利用琅伯-比尔定律计算出的结果。所以在日常的测试过程中,得出的结果和琅伯-比尔定律有些偏差是很正常的,只是我们关注偏差多少的问题。

  • 【资料】分光光度法原理的文章,内容精辟,图文并茂

    附件中的内容是一个关于分光光度法的原理的PDF,讲解的非常精辟,而且图文并茂,对于初学分光光度法的来说很有帮助,对于有一定基础的来说,也值得深入的研究一下。希望对大家有用![img]http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/brow/em09511.gif[/img]

  • 【我们不一YOUNG】大学里的分光光度计

    [align=center][b][font=微软雅黑][color=#333333][font=微软雅黑]【我们不一[/font][font=微软雅黑]YOUNG】[/font][/color][/font][font=微软雅黑][color=#333333]大学里的分光光度计[/color][/font][/b][/align][font=宋体][size=18px][font=宋体] 分光光度计是一种很普通的实验仪器,刚上大学时,用到的第一台分光光度计就是[/font][font=Times New Roman]721[/font][font=宋体]型分光光度计。该光度计没有电子工作站,所有操作都是通过旋钮或拉杆来完成,功能也很简单,只能测量吸光度或透过率。由于设计简单,老师对照仪器跟我们讲解原理时非常容易理解,操作起来也没什么难度。后来又逐渐接触到更高级的分光光度计,全部都设计了电子工作站,几乎所有操作都是在电脑上完成。当然功能也更多了,全波长扫描、示差、双波长、导数等高级功能都有了。虽然功能多了,但得益于电子计算机的应用,因此操作难度也没增加多少,基本的操作可以说是“傻瓜式”的,但也因为这种“傻瓜式”的操作,导致很多人只学会按部就班的流程,而对于其背后的原理很少去深究,这对于进入职业生涯后的工作是非常不利的。[/font][/size][/font]

  • 【原创大赛】色牢度评级的利器---分光光度计(测色仪)

    【原创大赛】色牢度评级的利器---分光光度计(测色仪)

    纺织品色牢度的评级一直是纺织实验室的难点所在,分光光度计(测色仪)的出现解决了人工评级主观性强的问题,为色牢度评级提供了很好的参考。下面介绍一下我们的色牢度评级利器---分光光度计(测色仪)。先来一张仪器全图:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/10/201410171620_518840_2223901_3.jpg一、仪器参数1. 重复精度 RMS E(白色色块)* :最大值 0.01 RMS ΔE CIELAB 2. 仪器间兼容性 (LAV) :最大 0.08,ΔE CIELAB*平均值3. 光源:脉冲氙灯4. 光谱范围:360 纳米 – 750 纳米5. 波长准确度:0.1 纳米 (400 – 700) 6. 波长精密度:0.05 纳米 (400 – 700) 7. 波长间隔:10 纳米8. 带通滤波器:10 纳米9. 光度测定范围:0% - 200% 反射率10. 光度测定分辨率:0.001% 11. 反射测量孔径:大孔径 (LAV) 2.54 厘米(1 英寸)中孔径 (MAV) 1.5 厘米(0.6 英寸) 小孔径 (SAV) 0.75 厘米x 1.0 厘米 (0.3 英寸 x 0.4 英寸) 超小孔径(VSAV) 0.3 厘米x 0.8 厘米 (0.12 英寸 x 0.31 英寸)大孔径图:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/10/201410171626_518848_2223901_3.jpg超小孔径图:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/10/201410171626_518852_2223901_3.jpg12.测量时间: 1 秒13.透射:全透射和直接透射14.光学配置:散射/8°(光源/测量) 15.2 厘米(6 英寸)积分球 2 个光谱分析仪二、测试原理通过自动化 SCI(包含镜面反射)和SCE(排除镜面反射)控件对样品的光泽或纹理的平面效果作出响应。三、测试过程1.测试程序⑴首先打开分光光度仪电源;(如果仪器长时间没有用过,请等待分光仪预热稳定,约20分钟;)⑵然后打开电脑电源;⑶然后点击http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/10/201410171621_518842_2223901_3.gif图标打开软件。测试界面如下:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/10/201410171624_518847_2223901_3.jpg2.新建工作或打开工作点击“新建工作”按钮来新建一个工作3.选择测量模式点击“选择模式”按钮,根据您的设置情况,里边可能有多种测量模式,根据您的应用选择相应的测量模式,比如选择“0”号。选择好后点击“close”/“关闭”按钮。4.校正分光仪仪器每隔4小时需要校正一次,点击“校正分光仪”按钮,将黑筒放置于测量位置,点击“ok”。仪器将测量黑筒,然后将校正白板放置于测量位置,点击“ok”,仪器将测量白板,接着出现校正完成,点击“确认”结束校正操作。校正黑筒和白板图:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/10/201410171623_518846_2223901_3.jpg5.创建标准点击“测量标准”按钮,输入标准的名称,比如红色123.将标准样品置于测量位置,点击“下个”,仪器将测量样品,然后可以看到数据已显示于工作中,点击“关闭”按钮,标准创建完成。6.调出标准若工作中已有多个标准,点击软件右上角的“选择标准”,在下拉菜单中

  • 紫外可见光分光光度测量的原理与使用

    紫外可见光分光光度测量的原理与使用[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=17587]紫外分光光度计的原理与使用.pdf[/url]

  • 【原创】72型分光光度计 原理

    72型分光光度计是可见光分光光度计,波长范围为420nm~700nm,它由三大部分组 成:磁饱和稳压器、光源、单色光器和测光机构、微电计。其光学系统如图5-11所示。72型分光光度计的基本依据是朗伯—比耳定律,它是根据相对测量原理工作的,即先选定某一溶剂作为标准溶液,设定其透光率为100%,被测试样的透光率是相对于标准溶液而言的,即让单色光分别通过被测试样和标准溶液,二者能量的比值就是在一定波长下对于被测试样的透光率。如图所示,白色光源经入射狭缝、反射镜和透光镜后,变成平行光进入棱镜,色散后的单色光经镀铝的反射镜反射后,再经过透镜并聚光于出射狭缝上,狭缝宽度为0.32nm。反射镜和棱镜组装在一可旋转的转盘上并由波长调节器的凸轮所带动,转动波长调节器便可以在出光狭缝后面选择到任一波长的单色光。单色光透过样品吸收池后由一光量调节器调节为适度的光通量,最后被光电电池吸收,转换成电流后由微电计指示,从刻度标尺 上直接读出透光率的值。分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸,蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。 分光光度计的简单原理分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源,通过系列分光装置,从而产生特定波长的光源,光源透过测试的样品后,部分光源被吸收,计算样品的吸光值,从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。核酸的定量核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA,以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。 每种核酸的分子构成不一,因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸,事先要选择对应的系数。如:1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度。测试前,选择正确的程序,输入原液和稀释液的体积,尔后测试空白液和样品液。然而,实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器,表现出的吸光值漂移越大。事实上,分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定的准确度和精确度。如EppendorfBiophotometer的准确度≤1.0%(1A)。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动,都是正常的。另外,还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值,离子浓度等:在测试时,离子浓度太高,也会导致读数漂移,因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液,如TE,可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素:由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内,颗粒的干扰相对较小,结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低,或者过高(超过光度计的测试范围)。最后是操作因素,如混合要充分,否则吸光值太低,甚至出现负值;混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致;不能采用窗口磨损的比色杯;样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。除了核酸浓度,分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度,如 A 260 / A 280的比值,用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是 280 nm。纯净的样品,比值大于 1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于 1.8 或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A 230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品,A 320 一般是 0。蛋白质的直接定量(UV法)这种方法是在280 nm波长,直接测试蛋白。选择 Warburg公式,光度计可以直接显示出样品的浓度,或者是选择相应的换算方法,将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单,先测试空白液,然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质,一般要消除320 nm的“背景”信息,设定此功能“开”。与测试核酸类似,要求 A 280 的吸光值至少大于 0.1A,最佳的线性范围在1.0-1.5 之间。实验中选择 Warburg 公式显示样品浓度时,发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上,只要观察A 280的吸光值的变化范围不超过 1%,表明结果非常稳定。漂移的原因是因为 Warburg公式吸光值换算成浓度,乘以一定的系数,只要吸光值有少许改变,浓度就会被放大,从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说,速度快,操作简单;但是容易受到平行物质的干扰,如DNA 的干扰;另外敏感度低,要求蛋白的浓度较高。比色法蛋白质定量蛋白质通常是多种蛋白质的化合物,比色法测定的基础是蛋白质构成成分:氨基酸(如酪氨酸,丝氨酸)与外加的显色基团或者染料反应,产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关,从而反应蛋白质浓度。比色方法一般有 BCA,Bradford,Lowry 等几种方法。Lowry 法:以最早期的 Biuret 反应为基础,并有所改进。蛋白质与Cu2+反应,产生蓝色的反应物。但是与 Biuret相比,Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂;反应需要的时间较长;容易受到非蛋白物质的影响;含EDTA,Triton x-100,ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。BCA(Bicinchoninine acid assay)法:这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2+反应产生 Cu+,后者与 BCA 形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在 562 nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强,反应后形成的化合物非常稳定。相对于 Lowry 法,操作简单,敏感度高。但是与 Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法:这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应,产生的有色化合物吸收峰595 nm。其最大的特点是,敏感度好,是 Lowry 和 BCA 两种测试方法的 2倍;操作更简单,速度更快;只需要一种反应试剂;化合物可以稳定1小时,方便结果;而且与一系列干扰 Lowry,BCA 反应的还原剂(如DTT,巯基乙醇)相容。但是对于去污剂依然是敏感的。最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大,无可比性。某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致,感到迷惑,究竟该相信哪种方法?由于各种方法反应的基团以及显色基团不一,所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。例如:Keller 等测试人奶中的蛋白,结果 Lowry,BCA测出的浓度明显高于Bradford,差异显著。即使是测定同一样品,同一种比色法选择的标准样品不一致,测试后的浓度也不一致。如用Lowry测试细胞匀浆中的蛋白质,以 BSA 作标准品,浓度1.34 mg / ml,以 a 球蛋白作标准品,浓度 2.64 mg /ml。因此,在选择比色法之前,最好是参照要测试的样本的化学构成,寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。另外,比色法定量蛋白质,经常出现的问题是样品的吸光值太低,导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。关键问题是,反应后的颜色是有一定的半衰期,所以每种比色法都列出了反应测试时间,所有的样品(包括标准样品),都必须在此时间内测试。时间过长,得到的吸光值变小,换算的浓度值降低。除此,反应温度、溶液PH值等都是影响实验的重要原因。此外,非常重要的是,最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材质的比色杯,因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色,导致样品吸光值不准确。细菌细胞密度(OD 600)实验室确定细菌生长密度和生长期,多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验,需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液,之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作,必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数,做出校正曲线。实验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值,原因是采用了显色的培养基,即细菌培养一段时间后,与培养基反应,发生变色反应。另外,需要注意的是,测试的样品不能离心,保持细菌悬浮状态。分光光度计的重要配件 —— 比色杯比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积,有比色杯和毛细比色杯等。一般测试核酸和紫外定量蛋白,均采用石英杯或者玻璃杯,但是不适合比色法测定。因为反应中的染料(如考马斯亮兰)能让石英和玻璃着色,所以必须采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。由于另外测试的样品量不同,所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求。目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量,亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯,样品用量仅需50μl,比色杯单个无菌包装,可以回收样品。如Eppendorf UVette?塑料比色杯,是目前比色杯市场上一个革新。随着生命科学以及相

  • 紫外可见分光光度计的工作原理

    分光光度计的工作原理主要是基于琅伯-比尔定律,18世纪初,琅伯在前人的基础上,进一步研究了物质对光的吸收与物质厚度的关系,并于1760年指出:如果溶液的浓度一定,则光对物质的吸收程度与它通过的溶液厚度成正比,这就是琅伯定律,其数学表达式为:A=lgI。/I=K。b式中,A为吸光度;I。为入射光强度;I为透射光强度;b为液层厚度(即光程);K。为比例常数。1852年,比尔研究了各种无机盐的水溶液对红光的吸收后指出:光的吸收和光所遇到的吸光度的数量有关;如果吸光物质于不吸光的溶剂中,则吸光度和吸光物质的浓度成正比,这就是比尔定律,其数学表达式为:A=lgI。/I=K1C式中,A为吸光度;I。为入射光强度;I为透射光强度;C为溶液的浓度;K1为比例常数。将琅伯定律和比尔定律结合起来,则为琅伯-比尔定律,公式如下:A=lgI。/I=K2bC式中,A为吸光度;I。为入射光强度;I为透射光强度;C为溶液的浓度;b为液层厚度(即光程);K1为比例常数。比尔定律认为:当一束光平行的单色光通过某一均匀的有色溶液时,溶液的吸光度与溶液的浓度和光程的乘积成正比,这就是琅伯-比尔定律的真正物理意义,它是光度分析中定量分析的最基础、最根本的依据,也是紫外可见分光光度计的基本原理。

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