分光光度仪比色法原理

请各位前辈赐教分光光度法与比色法的有什么区别?谢谢!

谁有GB/T 20574-2006蜂胶中总黄酮含量的测定方法 分光光度比色法这个标准，求求大哥，给发一个吧！！！！！！！！！！！！！！

在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。上述的紫外光区与可见光区是常用的。但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，红外光区。　　比色法以可见光作光源，比较溶液颜色深浅度以测定所含有色物质浓度的方法。以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。比色法作为一种定量分析的方法，开始于19世纪30～40年代。比色分析对显色反应的基本要求是：反应应具有较高的灵敏度和选择性，反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定，它和显色剂的颜色差别较大。选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。　　常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定律(A＝εbc)为基础。常用的目视比色法是标准系列法，即用不同量的待测物标准溶液在完全相同的一组比色管中，先按分析步骤显色，配成颜色逐渐递变的标准色阶。试样溶液也在完全相同条件下显色，和标准色阶作比较，目视找出色泽最相近的那一份标准，由其中所含标准溶液的量，计算确定试样中待测组分的含量。光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度作图，绘制工作曲线，然后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度或含量。与目视比色法相比，光电比色法消除了主观误差，提高了测量准确度，而且可以通过选择滤光片来消除干扰，从而提高了选择性。但光电比色计采用钨灯光源和滤光片，只适用于可见光谱区和只能 得到一定波长范围的复合光 ， 而不是单色光束，还有其他一些局限，使它无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外-可见分光光度计。20 世纪30～60年代，是比色法发展的旺盛时期，此后就逐渐为分光光度法所代替。

请问用比色法定量测试六价铬是用分光光度计好还是用滤色光度计好？这两种仪器的区别和各自优势是什么？

[size=5][font=宋体]比色法蛋白质定量[/font][font=Arial][/font][font=Arial] [/font][font=宋体]蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。[/font][font=Arial][/font][font=Arial][/font][font=Arial] [/font][font=宋体]比色方法一般有[/font][font=Arial] BCA[/font][font=宋体]，[/font][font=Arial]Bradford[/font][font=宋体]，[/font][font=Arial]Lowry [/font][font=宋体]等几种方法。[/font][font=Arial][/font][font=Arial] Lowry [/font][font=宋体]法：以最早期的[/font][font=Arial] Biuret [/font][font=宋体]反应为基础，并有所改进。蛋白质与[/font][font=Arial]Cu2+[/font][font=宋体]反应，产生蓝色的反应物。但是与[/font][font=Arial] Biuret[/font][font=宋体]相比，[/font][font=Arial]Lowry [/font][font=宋体]法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含[/font][font=Arial]EDTA[/font][font=宋体]，[/font][font=Arial]Triton x-100[/font][font=宋体]，[/font][font=Arial]ammonia sulfate [/font][font=宋体]等物质的蛋白不适合此种方法。[/font][font=Arial][/font][font=Arial] BCA[/font][font=宋体]（[/font][font=Arial]Bicinchoninine acid assay[/font][font=宋体]）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与[/font][font=Arial]Cu2+[/font][font=宋体]反应产生[/font][font=Arial] Cu+[/font][font=宋体]，后者与[/font][font=Arial] BCA [/font][font=宋体]形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在[/font][font=Arial] 562 nm[/font][font=宋体]波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于[/font][font=Arial] Lowry [/font][font=宋体]法，操作简单，敏感度高。但是与[/font][font=Arial] Lowry[/font][font=宋体]法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。[/font][font=Arial][/font][font=Arial][/font][font=Arial] Bradford [/font][font=宋体]法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰[/font][font=Arial]595 nm[/font][font=宋体]。其最大的特点是，敏感度好，是[/font][font=Arial] Lowry [/font][font=宋体]和[/font][font=Arial] BCA [/font][font=宋体]两种测试方法的[/font][font=Arial] 2[/font][font=宋体]倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定[/font][font=Arial]1[/font][font=宋体]小时，方便结果；而且与一系列干扰[/font][font=Arial] Lowry[/font][font=宋体]，[/font][font=Arial]BCA [/font][font=宋体]反应的还原剂（如[/font][font=Arial]DTT[/font][font=宋体]，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。[/font][font=Arial][/font][font=Arial][/font][font=Arial] [/font][font=宋体]某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致，感到迷惑，究竟该相信哪种方法？由于各种方法反应的基团以及显色基团不一，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。例如：[/font][font=Arial]Keller [/font][font=宋体]等测试人奶中的蛋白，结果[/font][font=Arial] Lowry[/font][font=宋体]，[/font][font=Arial]BCA[/font][font=宋体]测出的浓度明显高于[/font][font=Arial]Bradford[/font][font=宋体]，差异显著。即使是测定同一样品，同一种比色法选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。如用[/font][font=Arial]Lowry[/font][font=宋体]测试细胞匀浆中的蛋白质，以[/font][font=Arial] BSA [/font][font=宋体]作标准品，浓度[/font][font=Arial]1.34 mg / ml[/font][font=宋体]，以[/font][font=Arial] a [/font][font=宋体]球蛋白作标准品，浓度[/font][font=Arial] 2.64 mg /ml[/font][font=宋体]。因此，在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。另外，比色法定量蛋白质，经常出现的问题是样品的吸光值太低，导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。关键问题是，反应后的颜色是有一定的半衰期，所以每种比色法都列出了反应测试时间，所有的样品（包括标准样品），都必须在此时间内测试。时间过长，得到的吸光值变小，换算的浓度值降低。除此，反应温度、溶液[/font][font=Arial]PH[/font][font=宋体]值等都是影响实验的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材质的比色杯，因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色，导致样品吸光值不准确。[/font][font=Arial][/font][/size][size=1][font=Arial][size=4][/size][/font][/size]

今日做氨氮检测时，发现比色法和纳氏试剂法的结果经常不一致。比色法的时候，颜色很浅，结果也就在0.1左右，但是用了分光光度计检测，结果在0.3以上，请问这样的情况，你们会如何处理？

目视比色法和分光光度法分析,你信谁?例如氨氮

用差示比色法时用标准溶液做参比，仪器显示“[color=#ff6666]energy low[/color]”(能量低)，致使无法正常调透光率为0和100。请问这台仪器（北京瑞利的VIS-7200N）可以用于差法比色法吗？先谢谢大家。

各位老师，你们好！我想问一下，铁离子的分析方法：[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Wp][color=#3333ff]原子吸收[/color][/url]法，分光光度计，目视比色法。分析 500ppm的水溶液或有颜色的溶液。分别用什么方法比较好？两价和三价铁有何不同吗？谢谢！

全自动定氮仪难点在于终点的判断，现在一般采用电位法,颜色法和比色法由于电极法对电极要求较高和使用上的不便，此类仪器较少。在此不做讨论。颜色法与伪颜色法（比色法）的区别： 由于有些企业由于能力和成本原因，把比色法说成颜色法，这对用户选择带来了困惑，为此作者在此讨论二者的区别。使采购者避免找到“李鬼”。1 由于滴定时，到达终点样品颜色发生变化，此时就认为滴定到终点。但是要注意的是：变化的是颜色（不仅仅是某波长的光通量的变化量，而要判断不同单色光相互关系）而不是单色光。如果用单色光(滤光片）比色而来判断，那毫无疑问数据是不可靠的。2 单色光比色就像光度计一样需要避光，所以伪颜色法（比色法）的定氮仪他的光路是密闭的，使用者看不到光路、比色杯和反应样品。而颜色法本身是复合光，判断的依据是不同颜色的关系，所以对自然光的变化对判断影响是非常小的。所以你可以看到样品杯和光线，甚至可以看到光源。这对颜色法和伪颜色法提供了直观的选择依据。3 蒸馏和滴定的关系：颜色法都是蒸馏和滴定同时进行，直到蒸馏结束来最终判断终点。而伪颜色法（比色法）由于判断方式的原因只能蒸馏后再滴定。　　你如果依据以上三点来比较，不符合颜色法的原理的，那就坚决淘汰，而不去管其他参数如何精美，否则有可能陷入陷阱（用比色法来冒充颜色法本身就是能力和品质有问题，其他精美的参数都必须打个问号，在此不做讨论）。　　注意：比色法是早已淘汰的检测方法，更无检测标准的依据，

72型分光光度计是可见光分光光度计，波长范围为420nm～700nm，它由三大部分组 成:磁饱和稳压器、光源、单色光器和测光机构、微电计。其光学系统如图5-11所示。72型分光光度计的基本依据是朗伯—比耳定律，它是根据相对测量原理工作的，即先选定某一溶剂作为标准溶液，设定其透光率为100%，被测试样的透光率是相对于标准溶液而言的，即让单色光分别通过被测试样和标准溶液，二者能量的比值就是在一定波长下对于被测试样的透光率。如图所示，白色光源经入射狭缝、反射镜和透光镜后，变成平行光进入棱镜，色散后的单色光经镀铝的反射镜反射后，再经过透镜并聚光于出射狭缝上，狭缝宽度为0.32nm。反射镜和棱镜组装在一可旋转的转盘上并由波长调节器的凸轮所带动，转动波长调节器便可以在出光狭缝后面选择到任一波长的单色光。单色光透过样品吸收池后由一光量调节器调节为适度的光通量，最后被光电电池吸收，转换成电流后由微电计指示，从刻度标尺 上直接读出透光率的值。分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。 分光光度计的简单原理分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。核酸的定量核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长260 nm。 每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如EppendorfBiophotometer的准确度≤1.0%（1A）。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如 A 260 / A 280的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是 280 nm。纯净的样品，比值大于 1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于 1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A 230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A 320 一般是 0。蛋白质的直接定量（UV法）这种方法是在280 nm波长，直接测试蛋白。选择 Warburg公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除320 nm的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求 A 280 的吸光值至少大于 0.1A，最佳的线性范围在1.0-1.5 之间。实验中选择 Warburg 公式显示样品浓度时，发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上，只要观察A 280的吸光值的变化范围不超过 1%，表明结果非常稳定。漂移的原因是因为 Warburg公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA 的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法蛋白质定量蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。比色方法一般有 BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。Lowry 法：以最早期的 Biuret 反应为基础，并有所改进。蛋白质与Cu2+反应，产生蓝色的反应物。但是与 Biuret相比，Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。BCA（Bicinchoninine acid assay）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2+反应产生 Cu+，后者与 BCA 形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在 562 nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于 Lowry 法，操作简单，敏感度高。但是与 Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰595 nm。其最大的特点是，敏感度好，是 Lowry 和 BCA 两种测试方法的 2倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定1小时，方便结果；而且与一系列干扰 Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致，感到迷惑，究竟该相信哪种方法？由于各种方法反应的基团以及显色基团不一，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。例如：Keller 等测试人奶中的蛋白，结果 Lowry，BCA测出的浓度明显高于Bradford，差异显著。即使是测定同一样品，同一种比色法选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。如用Lowry测试细胞匀浆中的蛋白质，以 BSA 作标准品，浓度1.34 mg / ml，以 a 球蛋白作标准品，浓度 2.64 mg /ml。因此，在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。另外，比色法定量蛋白质，经常出现的问题是样品的吸光值太低，导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。关键问题是，反应后的颜色是有一定的半衰期，所以每种比色法都列出了反应测试时间，所有的样品（包括标准样品），都必须在此时间内测试。时间过长，得到的吸光值变小，换算的浓度值降低。除此，反应温度、溶液PH值等都是影响实验的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材质的比色杯，因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色，导致样品吸光值不准确。细菌细胞密度（OD 600）实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。实验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。另外，需要注意的是，测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态。分光光度计的重要配件 —— 比色杯比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积，有比色杯和毛细比色杯等。一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法测定。因为反应中的染料（如考马斯亮兰）能让石英和玻璃着色，所以必须采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。由于另外测试的样品量不同，所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求。目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量，亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯，样品用量仅需50μl，比色杯单个无菌包装，可以回收样品。如Eppendorf UVette?塑料比色杯，是目前比色杯市场上一个革新。随着生命科学以及相

对于铁的测定，既可以采用目视比色法，也可以采用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Wp][color=#3333ff]原子吸收[/color][/url]分光光度法，二者的主要区别是什么？

[font=新宋体][font=黑体][font=隶书][font=黑体][font=新宋体][font=楷体_GB2312][font=宋体][font=楷体_GB2312][font=新宋体][color=#00008B][size=4]大家探讨一下分光广度法和光电比色法他们的有缺点，现在有还多仪器厂家还是喜欢选用光电比色法，他的结构简单，操作方便，不需要做标线，也不用最小二阶乘做大量的计算。请大家一起来探讨一下......[/size][/color][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font][/font]

[font=黑体][size=4]分光光度计的应用常识[/size][/font]分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。　　分光光度计的简单原理　　分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。　　核酸的定量 　　核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。 每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上 述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定 可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。　　事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%（1A）。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和 溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定 读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗 粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。　　从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气 泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的 比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。　　除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如 A 260 / A 280 的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是 280 nm。纯净的样品，比值大于 1.8（DNA）或者 2.0（RNA）。如果比值低于 1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A 230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320 检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A 320 一般是 0。　　蛋白质的直接定量（UV法）　　这种方法是在280 nm波长，直接测试蛋白。选择 Warburg公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。　　蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除 320 nm的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求 A 280 的吸光值至少大于 0.1A，最佳的线性范围在 1.0-1.5 之间。实验中选择 Warburg 公式显示样品浓度时，发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上，只要观察A 280 的吸光值的变化范围不超过 1%，表明结果非常稳定。　　漂移的原因是因为 Warburg 公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。　　蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如 DNA 的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。　　比色法蛋白质定量　　蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。　　比色方法一般有 BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。　　Lowry 法：以最早期的 Biuret 反应为基础，并有所改进。蛋白质与Cu2+反应，产生蓝色的反应物。但是与 Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含 EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。　　BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2+反应产 生 Cu+，后者与 BCA 形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在 562 nm 波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于 Lowry 法，操作简单，敏感度高。但是与 Lowry 法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。　　Bradford 法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰 595 nm。其最大的特点是，敏感度好，是 Lowry 和 BCA 两种测试方法的 2 倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定１小时，方便结果；而且与一系列干扰 Lowry，BCA 反应的还原剂（如 DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。　　某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致，感到迷惑，究竟该相信哪种方法？由于各种方法反应的基团以及显色基团不一，所以 同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。例如：Keller 等测试人奶中的蛋白，结果 Lowry，BCA 测出的浓度明显高于Bradford，差异显著。即使是测定同一样品，同一种比色法选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。如用Lowry 测试细胞匀浆中的蛋白质，以 BSA 作标准品，浓度1.34 mg / ml，以 a 球蛋白作标准品，浓度 2.64 mg / ml。因此，在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。另外，比色法定量蛋白质，经常出现的问题是样品 的吸光值太低，导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。关键问题是，反应后的颜色是有一定的半衰期，所以每种比色法都列出了反应测试时间，所有的样品 （包括标准样品），都必须在此时间内测试。时间过长，得到的吸光值变小，换算的浓度值降低。除此，反应温度、溶液PH值等都是影响实验的重要原因。此外， 非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材质的比色杯，因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色，导致样品吸光值不准确。　　细菌细胞密度（OD 600）　　实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600 是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。 以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。实验 中偶尔会出现菌液的OD值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。另外，需要注意的是，测试的样品不能 离心，保持细菌悬浮状态。　　分光光度计的重要配件 —— 比色杯　　比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积，有比色杯和毛细比色杯等。 一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法测定。因为反应中的染料（如考马斯亮兰）能让石英和玻璃着色，所以必须采用一次性 的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。　　由于另外测试的样品量不同，所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求。 目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量，亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯，样品用量仅需 50μl，比色杯单个无菌包装，可以回收样品。如Eppendorf UVette?塑料比色杯，是目前比色杯市场上一个革新。 随着生命科学以及相关学科发展，对此类科学的实验研究提出更高的要求，分光光度计将是分子生物学实验室不可缺少的仪器，也成为微生物、食品、制药等相关实 验室的必备设备之一。

分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。　　分光光度计的简单原理　　分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。　　核酸的定量 　　核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。 每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。　　事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%（1A）。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。　　从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。　　除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如 A 260 / A 280 的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是 280 nm。纯净的样品，比值大于 1.8（DNA）或者 2.0（RNA）。如果比值低于 1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A 230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320 检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A 320 一般是 0。　　蛋白质的直接定量（UV法）　　这种方法是在280 nm波长，直接测试蛋白。选择 Warburg公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。　　蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除 320 nm的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求 A 280 的吸光值至少大于 0.1A，最佳的线性范围在 1.0-1.5 之间。实验中选择 Warburg 公式显示样品浓度时，发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上，只要观察A 280 的吸光值的变化范围不超过 1%，表明结果非常稳定。　　　漂移的原因是因为 Warburg 公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。　　蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如 DNA 的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。　　比色法蛋白质定量　　蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。　　比色方法一般有 BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。　　Lowry 法：以最早期的 Biuret 反应为基础，并有所改进。蛋白质与Cu2+反应，产生蓝色的反应物。但是与 Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含 EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。　　　　BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2+反应产生 Cu+，后者与 BCA 形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在 562 nm 波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于 Lowry 法，操作简单，敏感度高。但是与 Lowry 法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。　　Bradford 法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰 595 nm。其最大的特点是，敏感度好，是 Lowry 和 BCA 两种测试方法的 2 倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定１小时，方便结果；而且与一系列干扰 Lowry，BCA 反应的还原剂（如 DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。　　某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致，感到迷惑，究竟该相信哪种方法？由于各种方法反应的基团以及显色基团不一，所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。例如：Keller 等测试人奶中的蛋白，结果 Lowry，BCA 测出的浓度明显高于Bradford，差异显著。即使是测定同一样品，同一种比色法选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。如用Lowry 测试细胞匀浆中的蛋白质，以 BSA 作标准品，浓度1.34 mg / ml，以 a 球蛋白作标准品，浓度 2.64 mg / ml。因此，在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。另外，比色法定量蛋白质，经常出现的问题是样品的吸光值太低，导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。关键问题是，反应后的颜色是有一定的半衰期，所以每种比色法都列出了反应测试时间，所有的样品（包括标准样品），都必须在此时间内测试。时间过长，得到的吸光值变小，换算的浓度值降低。除此，反应温度、溶液PH值等都是影响实验的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材质的比色杯，因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色，导致样品吸光值不准确。　　细菌细胞密度（OD 600）　　实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。 以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。实验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。另外，需要注意的是，测试的样品不能离心，保持细菌悬浮状态。　　分光光度计的重要配件 —— 比色杯　　比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积，有比色杯和毛细比色杯等。 一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法测定。因为反应中的染料（如考马斯亮兰）能让石英和玻璃着色，所以必须采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。　　由于另外测试的样品量不同，所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求。 目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量，亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯，样品用量仅需 50μl，比色杯单个无菌包装，可以回收样品。如Eppendorf UVette塑料比色杯，是目前比色杯市场上一个革新。 随着生命科学以及相关学科发展，对此类科学的实验研究提出更高的要求，分光光度计将是分子生物学实验室不可缺少的仪器，也成为微生物、食品、制药等相关实验室的必备设备之一。

[color=#DC143C]分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。　　分光光度计的简单原理　　分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。　　核酸的定量 　　核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。 每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上 述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定 可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。　　事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%（1A）。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和 溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定 读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗 粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。　　从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气 泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的 比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。　　除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如 A 260 / A 280 的比值，用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是 280 nm。纯净的样品，比值大于 1.8（DNA）或者 2.0（RNA）。如果比值低于 1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A 230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A 320 检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品，A 320 一般是 0。　　蛋白质的直接定量（UV法）　　这种方法是在280 nm波长，直接测试蛋白。选择 Warburg公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。　　蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。由于缓冲液中存在一些杂质，一般要消除 320 nm的“背景”信息，设定此功能“开”。与测试核酸类似，要求 A 280 的吸光值至少大于 0.1A，最佳的线性范围在 1.0-1.5 之间。实验中选择 Warburg 公式显示样品浓度时，发现读数“漂移”。这是一个正常的现象。事实上，只要观察A 280 的吸光值的变化范围不超过 1%，表明结果非常稳定。　　漂移的原因是因为 Warburg 公式吸光值换算成浓度，乘以一定的系数，只要吸光值有少许改变，浓度就会被放大，从而显得结果很不稳定。　　蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如 DNA 的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。　　比色法蛋白质定量　　蛋白质通常是多种蛋白质的化合物，比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）与外加的显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。　　比色方法一般有 BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。　　Lowry 法：以最早期的 Biuret 反应为基础，并有所改进。蛋白质与Cu2+反应，产生蓝色的反应物。但是与 Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含 EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物质的蛋白不适合此种方法。　　BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法。要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2+反应产 生 Cu+，后者与 BCA 形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在 562 nm 波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。相对于 Lowry 法，操作简单，敏感度高。但是与 Lowry 法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。　　Bradford 法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰 595 nm。其最大的特点是，敏感度好，是 Lowry 和 BCA 两种测试方法的 2 倍；操作更简单，速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定１小时，方便结果；而且与一系列干扰 Lowry，BCA 反应的还原剂（如 DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的。最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。　　某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致，感到迷惑，究竟该相信哪种方法？由于各种方法反应的基团以及显色基团不一，所以 同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性。例如：Keller 等测试人奶中的蛋白，结果 Lowry，BCA 测出的浓度明显高于Bradford，差异显著。即使是测定同一样品，同一种比色法选择的标准样品不一致，测试后的浓度也不一致。如用Lowry 测试细胞匀浆中的蛋白质，以 BSA 作标准品，浓度1.34 mg / ml，以 a 球蛋白作标准品，浓度 2.64 mg / ml。因此，在选择比色法之前，最好是参照要测试的样本的化学构成，寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品。另外，比色法定量蛋白质，经常出现的问题是样品 的吸光值太低，导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大。关键问题是，反应后的颜色是有一定的半衰期，所以每种比色法都列出了反应测试时间，所有的样品 （包括标准样品），都必须在此时间内测试。时间过长，得到的吸光值变小，换算的浓度值降低。除此，反应温度、溶液PH值等都是影响实验的重要原因。此外， 非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材质的比色杯，因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色，导致样品吸光值不准确。　　细菌细胞密度（OD 600）　　实验室确定细菌生长密度和生长期，多根据经验和目测推断细菌的生长密度。在遇到要求较高的实验，需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度。OD600 是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。 以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。为了保证正确操作，必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数，做出校正曲线。实验 中偶尔会出现菌液的OD值出现负值，原因是采用了显色的培养基，即细菌培养一段时间后，与培养基反应，发生变色反应。另外，需要注意的是，测试的样品不能 离心，保持细菌悬浮状态。　　分光光度计的重要配件 —— 比色杯　　比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根据不同的测量体积，有比色杯和毛细比色杯等。 一般测试核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不适合比色法测定。因为反应中的染料（如考马斯亮兰）能让石英和玻璃着色，所以必须采用一次性 的塑料杯。而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品。　　由于另外测试的样品量不同，所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求。 目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量，亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯，样品用量仅需 50μl，比色杯单个无菌包装，可以回收样品。如Eppendorf UVette?塑料比色杯，是目前比色杯市场上一个革新。 随着生命科学以及相关学科发展，对此类科学的实验研究提出更高的要求，分光光度计将是分子生物学实验室不可缺少的仪器，也成为微生物、食品、制药等相关实 验室的必备设备之一。 [/color]

一、目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。二、原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。http://www.biomart.cn/upload/asset/2009/10/14/1255139447.jpg三、实验材料、主要仪器和试剂1. 实验材料小麦面粉；精密pH 试纸。2. 主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20mL×11（2）大离心管：50mL×2（3）烧杯：100mL×1（4）三角瓶：100mL×1（5）容量瓶：100mL×3（6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1（7）恒温水浴锅（8）沸水浴（9）离心机（10）扭力天平（11）分光光度计

比色法测定水中总磷漫谈 水体中磷含量过高（如超过0.2mg/L），可造成藻类的过度繁殖，直至数量上达到有害的程度（称为富营养化），造成湖泊、河流透明度降低，水质变坏。磷是评价水质的重要指标。1．方法原理 在酸性条件下，正磷酸盐与钼酸铵、酒石酸锑氧钾反应，生成磷钼杂多酸，被还原剂抗坏血酸还原，则变成蓝色络合物，通常即称磷钼蓝。2．仪器 分光光度计。3．试剂（1）（1+1）硫酸。（2）10%抗坏血酸溶液（3）钼酸盐溶液：13 g钼酸铵(NH4)6Mo7O24·4H2O）于100 ml水中。溶解0.35 g酒石酸锑氧钾（K(SbO)C4H4O6·1/2H2O）于100 ml水中。（4）浊度—色度补偿液：混合两份体积（1+1）硫酸和一份体积的10%抗坏血酸溶液。此溶液当天配制。（6）磷酸盐标准溶液：2mg/L。4．步骤（1）校准曲线的绘制 取数支25ml螺口具塞比色管，分别加入磷酸盐标准使用液0、1.00、2.00、

通常的仪器分析方法比如比色法都需要标准，红外分光光度法测油类却只需要测一次三种油类在三个波长的影响系数，而不需要标准。有点不明白，它是根据什么原理来定量计算的。那位高手讲解一下。

[font=&]求助大神帮忙解答！[/font][font=&]比色法药品全为新药品！37℃环境1h也出现紫红色化合物！但是检测吸光度时出现0.5ml浓度的乙二醇和2.5ml浓度的乙二醇的吸光度一样的数值（例如0.5ml是0.26、2.5ml也在0.26上下）[/font][font=&]急急急！！！大神解答[/font]

电子比色法的原理是什么

铂钴比色法，和铬钴比色法，色度一样的吗？

(1)基本原理: 样品经处理后，试样中的二价钴离子在弱酸性溶液中（pH=5～6）与亚硝基红盐反应生成红色络合物，其颜色的深度与钴含量成正比，用目视比色法进行钴含量的测定,浓度越高,颜色越深,根据光的吸收定律----朗泊-比耳定律,由已知标准溶液浓度对应的吸光值求算出未知浓度: A=K*ｂ*C(2)仪器及试剂:7200型分光光度计 1.0cm比色皿 100 ml容量瓶 5.0 ml、10.0 ml吸量管 0.50ml吸量管250ml烧杯（带表面皿）电炉10%乙酸-乙酸钠缓冲溶液0.2%亚硝基红盐指示剂1：1硝酸 (3)操作步骤:用0.5ml吸量管准确吸取0.2ml料液置于1号250毫升烧杯中,2号烧杯不加料液（做试剂空白），先各加10ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液,置于高温电炉上加热煮沸，后置于低温电炉加入亚硝基红盐指示剂5ml，再煮1~3分钟，最后加入1：1硝酸10ml煮1~3分钟，取下冷却，转移至100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100毫升的刻度,摇匀,放置10分钟左右(天热可放置5分钟左右),用1.0 cm比色皿,以蒸馏水做参比,在530nm波长处进行比色,记下空白样的吸光值A空,样的吸光值A样,当钴标浓度为128.8ug/ml时，其吸光值为0.265。一般很稳定(4)计算公式:C(Co2+)=(A样-A空)* 0.1288÷0.265 单位: 克每升C(Co2+)------料液中Co2+的含量,单位:克每升A样-------样的吸光值A空-------空白的吸光值V取样-------取样量(即毫升数)0.1288-----钴标浓度, g/L0.265---钴标浓度为128.8ug/ml时，其吸光值为0.265

我在做一比色法时用了以下两种方式,你觉得那种正确?样品称取,溶解定容,取一定溶液进行显色后,测得的吸光度高于标准系列最高管,所以采取以下两种方式:1.将显色后的样品直接稀释10倍比色 2.重新取样,稀释10倍后再进行显色,比色 我做出来的是,2方式的计算结果明显高于1方式,请问有何不妥???

柱层析比色法检测β-胡萝卜素：操作要点与故障排除 1. 准备工作 首先，得把仪器设备准备好，比如说柱层析装置、分光光度计等等。然后呢，咱们得准备一些化学试剂，像石油醚、乙醇啦，这些都是萃取β-胡萝卜素的好帮手。 2. 样品处理 把含有β-胡萝卜素的样品，比如胡萝卜或者番茄，磨碎后放入圆底烧瓶中。接着，加入一些含KOH的甲醇溶液，放到水浴上加热回流一段时间，这样就能把β-胡萝卜素从样品中提取出来了。 3. 柱层析分离 这一步可是重头戏！咱们得先制备一个层析柱，里面装上氧化铝。氧化铝就像个小磁铁，能把β-胡萝卜素和其他色素分离开来。然后，把提取液倒入层析柱中，用适当的溶剂冲洗，β-胡萝卜素就会最先被洗脱出来。 4. 比色测定 把洗脱出来的β-胡萝卜素溶液放到分光光度计中，在特定的波长下（比如452nm）测量它的吸光度。通过吸光度值，咱们就能算出样品中β-胡萝卜素的含量了。 故障排除 提取效率低：可能是溶剂选择不当或者提取时间不够。试试调整溶剂比例，延长提取时间。 层析柱堵塞：氧化铝装填不均匀或者有杂质会导致柱子堵塞。记得装填时要均匀紧凑，必要时用溶剂冲洗柱子。 测量结果不准确：可能是仪器没有校准或者溶液中有杂质。定期校准仪器，确保溶液纯净无杂质。 好啦，以上就是柱层析比色法检测β-胡萝卜素的操作要点和故障排除方法。希望这些内容能帮到你们。

氮是植物生长发育的重要营养元素之一，植物叶片中氮素含量高低常可作为施氮效应及氮素需要的诊断指标。因此，氮素含量的测定在教学中是一个重要的教学内容，在科研研究中是常测定的一个指标。植物组织全氮测定常用方法是凯氏定氮法，即利用浓H2SO4-H2O2消煮，将样品中有机物和有机含氮化合物转化为无机铵盐，再用蒸馏滴定的方法测定全氮含量。有文献报道，植物样品中氮的含量也可采用纳什比色法测定，即获得消化液后，采用纳什比色方法测定消煮液中铵离子的浓度，然后通过计算获得样品中氮的含量。　　甘蔗是需氮量较大的作物，氮肥不足会影响甘蔗的生长，氮营养过剩则会增加生产成本，造成肥料浪费和环境污染。本试验利用H2SO4-H2O2法消化获得消煮液，用蒸馏滴定法和纳什比色法测定甘蔗叶片样品中的全氮含量，分析比较2种方法的测定结果及其优缺点，为植物样品的快速测定提供一定的参考依据。　　1 材料与方法　　1.1材料来源　　取生长盛期健康的甘蔗+3叶片，在105℃烘箱内杀青30min，在60℃～70℃烘干至恒重，用粉碎机粉碎密封保存备用。　　1.2待测液的获得　　准确称取0.2g（精确至0.0001g）粉碎样品置于消化管中，3次重复，加入5mL浓H2SO4，瓶口加一个小漏斗，摇匀，过夜，另取一个消化管，不加样品，只加同样的浓硫酸作为对照。将消化管置于控温式远红外消煮炉上消煮，中间视消化情况加1mLH2O21～2次加速氧化，直至消煮液呈无色或清亮色。待消化管冷却，用少量水冲洗小漏斗，将消化液无损失转入100mL容量瓶并定容，澄清上清液即为待测液。　　1.3滴定法测定全氮　　对蒸馏装置进行洗涤，并确保干净后，准确吸取定容后的消煮液10.0mL于反应器中开始蒸馏，将馏出液出口的冷凝管下端管口插入盛有30ml的硼酸吸收液和5～6滴混合指示剂的三角瓶中，当三角瓶中溶液开始变绿时开始记时，四分钟后将三角瓶移离冷凝管口，继续蒸馏1分钟后将三角瓶移离蒸馏装置，用水冲洗冷凝管及馏出液管，然后用0.01mol/LHCL标准酸滴定，溶液由绿色变为淡紫色为滴定终点并记录所用酸体积，同时作一空白试验。依据公式计算全氮含量：　　N（%）=（V1-V0）×C×14×Ts×10-3×100/m　　其中：N：植株的全氮含量；V1：样品测定值消耗标准酸的体积数（mL）；V0：空白试验所消耗标准酸的体积数（mL）；C：标准酸的浓度（mol/L）；14：氮原子的原子质量（g/mol）；Ts：分取倍数；m：干样品质量（g）。　　1.4纳什比色测定　　标准曲线的制作：分别吸取10μg/mLN（NH4-N）标准液0、2.50、5.00、7.50、10.00、12.50mL于6个50mL容量瓶中，每个加入100g/L酒石酸钠溶液2mL，充分摇匀，加入纳什试剂2.5mL，用水定容后充分摇匀。30min后用分光光度计在波长420nm测定。用所得数据制作标准曲线，根据标准曲线计算NH4+浓度。　　吸取待测液2mL于50mL容量瓶中，按照标准曲线的方法测定样品中中的NH4+OD值，同时在样品测定的同时做空白试验，根据标准曲线计算比色液中NH4+-N浓度，再根据下面公式计算含氮量。　　N（%）=p×V×Ts×10-4/m　　其中：p：从标准曲线查的显色液N（NH4+-N）的质量浓度（μg/mL）；V：显色液体积（mL）；Ts-分取倍数：m：干样品质量（g）。　　2.结果与分析　　2.1比色方法的线性关系　　根据所测定的OD值，制作标准曲线如图1所示，标准曲线的函数关系式为Y=0.2228x-0.0297，相关系数R2=0.9995，线性关系较高，可以满足试验的下一步计算。　　2.2两种测定方法的结果比较　　试验中所采用的两种测定方法结果的偏差除了第16号外，其他几个样品的结果偏差都小于2%，滴定法与纳氏比色法比值大于1的样品有1、8、10、13号（表1）。滴定法测定结果的标准差和标准误都小于纳氏比色法测定结果，同时滴定法的变异系数也比纳氏比色法的要小，但二者都小于2%（表2），两种测定结果都是可靠的。对两种测定方法的t检验结果从表3可知，95%置信区间的上下限分别为0.017和0.174，t值为2.582大于0.021，说明两组测定结果之间差异不显着，即用凯氏滴定法和纳氏比色测定法两种方法测定甘蔗样品的全氮含量差异不显着，表明用两种方法的任何一种测定甘蔗叶片全氮，均不影响其试验结果。　　3 讨论与结论　　[url=http://www.kaishitest.com/][color=#ffffff]凯氏定氮法[/color][/url]是测定植物组织全氮的国家标准方法。该方法虽不需复杂的仪器设备，但滴定终点易受人为因素的影响，且蒸馏耗时太多，对快速批量测试来说费时费力。纳什比色法采用比色的方法，根据分光光度计比色槽的设定可同时测定5～7个样品，避免人工蒸馏和滴定的繁琐过程，大大提高了工作效率。　　本试验测定结果表明，凯氏定氮法和纳什比色法二者测定结果关系不显着，其中凯氏滴定法变异系数小，蒸馏结果准确可靠，优于纳什比色法，但纳什比色法设备简单，效率较高，且与滴定法没有达到显着差异，如果样品量较大，又仅仅是比较不同处理间的氮含量差异，纳什比色法是一种快速效率较高的测定方法，减少了凯氏定氮法中的蒸馏与滴定操作，节省时间与资源，更为方便。在实验过程中，可根据自己试验的目的要求，选择合适的测定方法。　　值得注意的是要使测定结果有更好的准确度，在测定过程中要认真掌握各个细节及相应的注意事项。如在滴定法测定时要注意加入NaOH量得控制，过多反应剧烈，造成NH4+-N损失，过少蒸馏又不完全。在应用纳什比色法测定时要注意显色溶液的pH值应≥11，NH4+-N的浓度控制在0.2～3.0mg/L；稳定时间要有保证，当温度低时应稳定1h再进行比色测定。只有注意到这几个测定细节，才能保证测定结果的准确性。　　因此，[url=http://www.kaishitest.com/]凯氏滴定法[/url]和纳什比色法都可以用来测定甘蔗组织中的全氮含量，二者的测定结果差异不显着。在方法选择上，可根据自己的试验条件和试验目的要求，选择合适的测定方法，但在使用两种方法的同时，应该细致掌握各方法的注意事项。