报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其 它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因主要有以下几种： 胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs)nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎 叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat) nptⅡ、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作 用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。氯霉素乙酰 转移酶基因测时可通过放射自显影观察。荧光素酶基因（luciferase Gene）1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中出来的，该酶在有ATP、Mg2＋、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用植物整株或部分直接用X-光片 或专门仪器进行检测。具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的采用。β-D-葡萄糖苷酶基因该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱 、荧光等进行检测。除此之外还有庆大霉素转移酶基因等。在动物基因表达调控的研究中，已使用的报告基因主要有以下几种： 绿色荧光蛋白（gfp）基因等。绿色荧光蛋白来源于海洋生物水母，其基因可在异源组织中表达并产生荧光，GFP Cdnad 开放阅读框架长度约740bp，编码238个氨基酸残基，其肽链内部第65-67位丝氨酸－脱氢酪氨酸－甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基因，在长 紫外波长或蓝光照射下发出绿色荧光。转染后的细胞可在荧光显微镜或流式细胞仪(FACS)中直接观察基因的表达。此外还有β-半乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)等。
最近的一些分子生物学进展使得一些生物技术工具极大提高了生物发光和化学发光的检测和快速应用。这些发展方便了体外和体内持续检测生物过程（如基因表达，蛋白质－蛋白质相互间作用和疾病的进程），可应用于临床、诊断、和药物开发等。而且，结合发光酶或某些在基因水平有生物特异结合位点的发光蛋白发展了超敏感和选择性的生物分析工具，如重组细胞生物传感器，免疫分析和核酸杂交系统。发光分析信号的高度可侦测性使得它非常适合于微小化的生物分析装置（如微矩阵，微流设备和高密度的微孔板）以用于小量样品体积的基因和蛋白的高通量筛选。自从20多年前，Marlene DeLuca’s第一个成功的获得表达萤火虫荧光素酶基因（luc基因）的转基因烟草以来，生物发光的应用进入了一个新时代。生物发光和化学发光（BL/CL）的主要特点就在于发光信号的高度可测性，可以用PMT（光电倍增管）和CCD成像系统来检测极少量的光子信号。BL是属于CL范畴之内，CL反应的特点是高光子产生效率，BL为05-0.8 ，CL为0.1-0.001。因此BL/CL的检测极限可以达到10－18到10－21摩尔，这显然要比其它的光学技术强的多。BL/CL已经发展出了很多具体的分析方法来诊断目前微摩尔或纳摩尔级的生物样本。通过BL/CL结合酶反应，如氧化酶、脱氢酶和激酶等，就可以达到如此的检测灵敏度。然而，以发光技术为基础的分析主要还仅仅停留在作为一个诊断工具。如果BL/CL的潜能能够得到开发，那么许多稀有的微量样品也可以通过一个便宜、可靠甚至是点对点的方式进行测量。分子生物学和生物技术持续地进展产生了一些新的BL/CL试剂，包括重组和突变酶及相关基因，可以作为报告剂或探针。这些工具的获得，再加上新的CL高效底物，促进了革新性的生物分析技术的出现，用于许多靶标的超敏感检测。新的BL/CL生物技术工具新的BL/CL报告基因报告基因技术代表了分子生物学最近主要的进展之一。报告基因是一段DNA序列，编码一个很容易被侦测到的蛋白或酶。它们可以人工引入到一个细胞内来监测基因的表达，以得到整体细胞生物传感器或细胞定位的作用。报告基因技术应用到研发BL/CL全细胞生物传感器的原理如图1a。目前，细菌荧光素酶基因（如陆上的Photorhabdus luminescens和海洋中Vibrio harveyi细菌的lux基因），真核的来自于萤火虫Photinus pyralis和海参Renilla reniformis的luc和ruc基因是广泛应用的BL报告基因。此外，一些新的基因cDNAs也已克隆和表达。有意思的是一些新的基因，如那些能够发射红光和绿光的Phrixothrix hirtus荧光素酶，各种突变的发不同波长光的萤火虫荧光素酶。不同的荧光素酶的特性如表1。此外最近克隆和纯化的重组辣根过氧化物酶（HRP）成为一个新的生物技术工具，在不久的将来有较大的期待。实际上，高效的HRP的底物已经商业化。HRP是与CL检测组合应用最广泛的酶之一。 双报告基因系统在多重发光测试中，信号是同时产生，测试是独立进行。可以测试不同的发光动力学反应或不同的发射光波。可选择的是，反应也可以按顺序被促发，如商业化的Promega公司提供的Renilla和Firefly荧光素酶双报告基因试剂。双报告系统的原理如Figure 1b.双重分析的BL/CL分析采用连续的闪烁型（Flash）发光形式，如发光蛋白水母蛋白和acridinium-9-carboxamide标记。这种方法可以在一个反应管里定量两个分析物和测试两个发光反应。因为它建立在flash型的发光上，分析测试需要非常短的时间，所以适用于高通量的筛选。[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2006/08/200608290858_24983_1636364_3.jpg[/img]图1. 新的生物技术工具。(a)利用报告基因技术研发的生物发光和化学发光(BL/CL)全细胞生物传感器。一个被分析物质或者刺激会特异性的激活控制基因表达和蛋白合成的调控序列，再利用BL/CL技术进行检测。(b)双报告系统。控制蛋白的信号会组成性的表达，以作为一个内部参照，对以来于被分析物／刺激的信号进行校正以减小实验变异；另一种方式是在同一系统中，使用两个基因同时或先后检测两种分析物。(c)一个报告基因蛋白与一个结合蛋白融合形成BL/CL双功能融合蛋白。(d)包含有相应结合蛋白（如MagA蛋白）的融合蛋白可以被细菌磁性颗粒特异性捕获。
荧光定量PCR简介荧光定量PCR检测技术诞生至今已10多年的时间，而其应用一直都没广泛展开，究其原因，无外乎受制于相关仪器、试剂和技术的发展。近期，尤其是08年以来，仪器和试剂是遍地开花，这也使科研人员均跃跃欲试，都想借此技术使自己的研究能突飞猛进，发展势头通过查找每年所发表的文章数可一目了然。据有关统计，在 Medline 数据库中，用“Taqman” 或 ”real time PCR” 作为关键词检索，1996 年是19 篇，1999 年157 篇，到2003 年就高达2984 篇，2009年会是多少呢？我们不得而知。但其迅猛的发展势头却是不可更改的，本公司真诚希望能和众多研究人员共同努力，抓住这一大好时机，为科研事业的发展贡献自身的力量。基于这一目标，本公司长期以来对荧光定量PCR，无论是技术还是多年来的产品，均进行了深入地研究，并及时推出更加优异的荧光定量 PCR技术服务。荧光定量PCR原理荧光定量PCR最早称TaqMan PCR，后来也叫Real-Time PCR，是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针或相应的荧光染料来实现其定量功能的。其原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT值（如下图所示）。荧光域值（threshold）是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍，即：threshold。http://www.biomart.cn/upload/asset/2011/01/25/1295364674.jpgCt 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。Ct值与起始模板的关系：研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值如下图所示。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。http://www.biomart.cn/upload/asset/2011/01/25/1295364675.jpg荧光定量检测荧光定量检测根据所使用的标记物不同可分为荧光探针和荧光染料。荧光探针又包括Beacon技术（分子信标技术，以美国人Tagyi为代表）、 TaqMan探针（以美国ABI公司为代表）和FRET技术（以罗氏公司为代表）等；荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，非饱和荧光染料的典型代表就是现在最常用的SYBR GreenⅠ；饱和荧光染料有EvaGreen、LC Green等。嵌合荧光染料法（SYBR GreenⅠ）SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。http://www.biomart.cn/upload/asset/2011/01/25/1295364672.gifSYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合双链DNA结合染料的优点：实验设计简单，仅需要2个引物，不需要设计探针，无需设计多个探针即可以快速检验多个基因，且能够进行熔点曲线分析，检验扩增反应的特异性，低的初始成本，通用性好，因此国内外在科研中使用比较普遍。荧光探针法（Taqman 技术）：PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号； PCR扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的 5' － 3' 切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。其过程如下图所示http://www.biomart.cn/upload/asset/2011/01/25/1295364673.gif荧光定量PCR的应用分子生物学研究1、核酸定量分析。 对传染性疾病进行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的检测 , 比如近期流行的甲型H1N1流感， 转基因动植物基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等。2 、基因表达差异分析。 比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证3 、SNP 检测。检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义，因分子信标结构的巧妙性，一旦SNP 的序列信息是已知的，采用这种技术进行高通量的 SNP 检测将会变得简单而准确。4、 甲基化检测。甲基化同人类的许多疾病有关，特别是癌症， Laird 报道了一种称作 Methylight的技术，在扩增之前先处理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响，用特异性的引物和 Taqman探针来区分甲基化和非甲基化的 DNA ，这种方法不仅方便而且灵敏度更高。医学研究1、 产前诊断：人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，到目前为止，还只能只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。2、 病原体检测：采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。3、 药物疗效考核：对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示：病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中，HBV- DNA的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异。4、 肿瘤基因检测：尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量 PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤 ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。
基因测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/06/201206061012_370645_1699466_3.jpgLuminMax-C（冷光仪,又称:化学发光光度计、化合光以及生物发光检测仪、化学发光仪、BL/CL分析仪）技术简介引 言生物发光和化学发光是自然界中一种常见现象。发光主要物质是由酵素（如：虫荧光素酶）、受质（如：荧光素）及其辅助ATP等所组成。如未涉及细胞，ATP是不需要的。所以二种重要的化学物质是酵素和受质：若将这二者放在一起就会产生化学冷光。光强度与酵素浓度成线形关系，所以检测光度就可定量浓度。化学发光指化学反应过程中发射出来的光，又称冷光；生物发光是化学发光的一种，专指由酶催化的化学反应过程中发射出的光。化学和生物发光经常被用于测定样品中未知成分的量，并且在过去的十年里在基因表达和基因调控的研究中发挥着非常重要的作用。通过发射光的比率可以推出未知成分的浓度，因此测定化学反应过程中的发射光是非常有用的。反应过程中产生的光与发射光的量产率是直接相关的，相应的，与发光物质的浓度成比例。因此，反应过程中的光可以相对反映出目标样品中发光物质的量。近年来，生物发光和化学发光的研究及使用与日俱增。从测试细胞活性的ATP-荧光素酶检验，到当今的DNA、基因及蛋白质分析的应用日益扩大。与荧光发光不同，它不需要外部光源。冷光是从化学反应所产生的。利用光子计数检测器，通过对反应中所产生的光子计数，冷光检验已成为最灵敏的光学检测方法之一。美国Maxwell Sensors公司的LuminMax-C研究级化学发光仪（冷光仪）为广大用户提供了一款具有超高灵敏度和重复精度、易使用、结构紧凑及经济实用的仪器。该仪器可测量96孔微孔板（黑或白）中的发光强度。微孔板底部很清洁，因此，从孔的底部产生的发光即可被检测。用 途化学发光仪经常被用于：·ATP（三磷酸腺甙）检验、荧光素酶检验·免疫及proteomics·核酸，DNA及基因组·病毒研究（比如：SARS、禽流感病毒研究）·临床诊断研究·染色体分析·毒性试验·细胞活力试验·餐馆卫生检测·环境检测·工业、农林业、畜牧业、养殖业等其它用途最广泛用途是对利用报告基因检测目标基因的表达以及检测细胞内 ATP 水平。1. 报告基因实验：分子生物学家和细胞生物学家利用报告基因研究基因的表达和调控。将报告基因引入细胞 DNA 使之与某一特定分子事件相关，可以为这一分子事件带来可测性。通常检测的分子事件是基因功能，具有可测性的是发光。目前，市场上有许多发光报告基因出售。包括：萤火虫荧光素酶（ firefly luciferase ），β－半乳糖苷酶（ B -galactosidase ），β－葡萄糖苷酸酶（B -glucuronidase ， GUS ），碱性磷酸酶（ alkaline phosphatase ），和人生长激素（ human growth hormone ， hGH ）。 高灵敏度，低成本，快速以及使用简单使得发光检测仪成为理想的基因表达研究工具。2. ATP 水平测定：所有活细胞都含有 ATP 。 ATP 可以从细胞中提取出来，用萤火虫荧光素酶检测。在这个发光反应中，ATP 是限制性反应物。因此，到达发光检测仪光电倍增管的光与样品中 ATP 的含量成比例，相应的与提取 ATP 所用的细胞数成比例。ATP发光检测方法已经使用了几十年。ATP的测量被应用于：• 水，食物，药品，化妆品中的微生物污染检测：ATP的发光检测方法可以检测样品中的所有微生物，因而被用于检测水中的大肠杆菌含量，包括饮用水和用于oil field injection ， cooling system 以及纸加工过程的工业用水。ATP的发光检测方法还可以用于药品，化妆品，牛奶以及其它食品的微生物控制。• 生物数量评估： 微生物学家通过检测 ATP 的含量测定土壤和沉积物中的全部活生物含量。相关研究还包括污染物对淡水和海水微生物的影响。• 临床研究： 临床研究应用包括：评价抗生素对微生物生长的影响，了解不同药物对哺乳动物细胞的影响等。应用场所：· 高等院校生命科学及生物化学实验室；生物化学技术研究院所实验室· 医院研究实验室；生物制药实验室· 政府药检、商检、疾控中心实验室· 环境试验室；法医试验室· 食品等工业质量控制和检测试验室主要特点：优 点• 化学发光定量检测法相对于其它分析技术有许多优点：非常灵敏；动力学范围广；仪器设备便宜；这一新的发光实验方法的出现使得这一技术的应用非常广泛。LuminMax-C使用了超级光电倍增管作为检测器，它具有极高的灵敏度。检测灵敏度可达10-18 摩尔（HRP）以上。它具有检测从反应中产生光子数的能力，这意味着它可以检测样品中被分析物极小的份量（浓度）。• 优秀的灵敏度和低背景使发光检测仪从其它分析方法中脱颖而出。发光检测仪比吸收光谱仪灵敏 100,000 倍，比荧光仪至少灵敏 1,000 倍。• 在发光反应中，有两种成分的光能够到达检测仪。第一种与化学发光反应中的有限的反应物的浓度成比例。第二种也就是背景光，是基本不变的，与反应物中的塑料、杂质发出的磷光等有关。相对于分光光度计和荧光仪等其它检测技术，化学发光检测仪的背景光非常低。• 广泛的动力学范围和低仪器成本也是化学发光检测仪的优势。不需稀释样品或对样品细胞进行修饰，测量范围可以达到7个数量级以上的浓度。• 使用简单方便：具有用户友好界面的软件在随机奉送的光盘里，它非常容易安装。LuminMax-C不但体积小巧，而且通过简单的插入式连接（USB或者串口）与计算机相连，便于携带。当按下“GO”键，系统自动并快速地扫描所有选中的微孔，并且显示结果。计算结果以电子表格的形式显示。数据以光子数或相对光单元（RUL）作为报告被显示。技术参数：盘形式: 微光度测定盘(96孔板)光辐射探测: 生物或化合光灵敏度: 光电计数器，１attomole HRP（10-18 摩尔HRP）波长:300-680nm操作: 自动扫描所有的孔可调节integration时间 (0.01-10.0 秒)可调节扫描次数接线: 显示所有的microwell数据容易校准数据输出: Excel格式连接PC的以太网接口软件: 用户易使用的软件尺寸: 30.5 X 28 X 14 (+2.5) CM
大家好！论坛中关于转基因检测的坛友貌似很少，很多问题也很难找到同道中人交流，只能自己摸索。 在转基因测试过程中，实时荧光PCR是非常重要的方法之一，而由于该方法的灵敏性，防污染措施至关重要！由于检验行业的特殊性质，除了常见的防污染措施之外，还需要在PCR的反应体系中添加UNG酶以及dUTP。我们对市场上各大分子生物学产商都进行了咨询，除了ABI公司外，其余产商均没有UNG酶的实时荧光PCR试剂盒。而ABI公司的TaqMan Universal Master Mix价格昂贵，出于成本控制考虑，我们也未选择。为解决这一问题，我们经过反复实验，最终成功的配制了荧光定量PCR反应体系Premix（成分包括：Taq Polymerase、含dUTP的dNTP mix、反应缓冲液、ROX、UNG酶等），完美的解决荧光PCR过程中的污染问题。 各位坛友，如果大家对此感兴趣，可以发送站内信和我联系。
上海交大一项研究有望降低抗肿瘤良药成本2013年02月26日 来源： 中国科技网 作者： 王春 沈海燕 中国科技网 讯 （沈海燕 记者王春）上海交通大学微生物代谢国家重点实验室林双君研究小组通过对链黑菌素生物合成基因簇进行基因解析，阐明了链黑菌素复杂的生物合成途径。由此得到的链黑菌素类似物不仅抗癌活性高很多，其毒性上也比原始链黑菌素降低了约5倍。该研究成果近日发表在国际权威学术期刊《美国化学会会志》上。 链黑菌素是由一株绒毛链霉菌所产生的抗肿瘤抗生素，具广谱抗肿瘤活性。但在上世纪七八十年代进行二期临床实验时，因其毒性过强而被迫终止。 基因组测序技术为生物合成机制的研究提供了更多信息。林双君研究小组首先克隆了链黑菌素潜在的抗生素基因簇，定位出链黑菌素的生物合成的48个独立基因编码，再通过微生物遗传学、化学及生物化学技术和手段，获得了其中17个基因的突变菌株，从中分离鉴定了12个与链黑菌素生物合成相关化合物的化学结构，提出了链黑菌素生物合成途径的模型。 在这一过程中，还揭示了多个新颖或关键的酶催化反应的分子生物学机制。该项研究为抗生素药物新颖酶催化反应基因的挖掘，并利用合成生物学等前沿生物技术创造新的结构衍生物奠定了基础。林双君称，这是首次在基因水平实现链黑菌素的生物合成途径的解析。 课题组通过基因工程技术获得的一个链黑菌素类似物，在抗癌活性上比目前临床使用的抗癌药物高很多。这个类似物在临床应用方面，对治疗淋巴瘤、白血病、鼻咽癌等疾病将有更大的优势。林双君表示，只要将产量提高到可规模化生产，就可将链黑菌素或类似物转化为一个新型的抗癌药物，不仅有望降低药价，而且减少化疗时产生的毒副作用。 《科技日报》2013-2-26 一版
在认识和熟练使用遗传生物学单位基因的新近进展后，它已经为科学家去改变病人的遗传物质，以达到治病防病的目的迈向新的一步。基因治疗的一个主要目标是用一种缺陷基因的健康复制去提供给细胞。这一方法是革命性的：医生试图通过改变病人细胞的遗传物质，来代替给病人治疗或控制遗传疾病的药物，最终达到医治病人疾病的根本目的。 几百个主要健康问题受到基因功能的影响。在将来，基因治疗能被用于医治许多这类疾病。理论上讲为了防止遗传缺陷传给下一代，还能用于改变胚胎细胞（蛋或种子）。然而，胚胎家系基因治疗的可能性受到困难的伦理道德、社会问题和技术障碍牵制。 基因治疗还作为药物输送系统使用，为了做到这点，产生有用物质的基因将被嵌进病人细胞的DNA中。例如，在血管外科中，产生抗凝血因子的基因能被嵌入血管细胞家系的DNA中，有助于防止血栓的形成。许多其它疾病可使用这一般方法治疗来提高本身的可靠性。 当医疗治疗提高到分子水平时，药物输送使用基因治疗能节约时间减低成本。为收集大量的基因蛋白产品、提纯产品、合成药物和对病人的管理缩短了时间减少了复杂的工艺加工。 然而，基因治疗仍是处于极端新的和高度的实验阶段。被批准的试验数量是小的，今天只有少量的病人曾得到过治疗。 目前基因治疗实验的基本步骤 在目前的某些实验中，从病人的血液或骨髓中取出细胞，并在加速繁殖的实验条件下生长。然后，把需要的基因借助于不起作用的病毒嵌进细胞。选择出获得成功改变的细胞再加速繁殖，再回到病人的体内。另一种情况，脂质体（脂肪颗粒）或不起作用的病毒可被用于把基因直接输进病人体内细胞。 基因治疗的基本要求 基因治疗的潜力 基因治疗为治愈人类疾病提供了新的范例。不是通过制剂与基因产品或自身基因产品相互作用来改变疾病的表现型，而是基因治疗理论上能修正特殊基因，导致沿着简单化的管理治愈疾病。开始基因治疗是针对治疗遗传性疾病，但目前对广泛性的疾病进行研究，包括癌症、外周血管疾病、关节炎、神经变性疾病和其它后天疾病。 基因确认和克隆 即使基因治疗战略性的范围是相当多样化，成功的基因治疗也需要一定的关键的基本要素。其中最重要的要素是必须确认和克隆有关的基因。直到人类基因组计划完成，基因的有效度才被利用。但仍然等到涉及疾病的相关基因被确认和克隆出来才开始实施基因治疗战略。 转基因和基因表达 一旦确认和克隆出基因，下一步必须表达出来。有关转基因和基因表达的效率属于基因治疗研究的前沿问题。最近基因治疗领域的许多争论围绕把所希望的基因转入合适的细胞中，然后为疾病治疗获得满意的表达水平。希望将来对转基因和特殊组织基因表达的研究将在主要基因治疗试验中解决这一课题。基因治疗战略的其它认识包括：充分掌握靶点疾病的发病机理，潜在的基因治疗副作用，理解接受基因治疗的靶细胞。 术语： 与大多数领域一样，基因治疗有专门的术语，下列提供的将阐明某些最普通术语的意思。 体外转基因： 把遗传物质转至寄主外部的细胞。经遗传物质移植后的细胞再回到寄主中。这个术语还被称为转基因的非直接方法。 体内转基因 ： 遗传物质转入寄主体内的细胞。这还被称为转基因的直接方法。 基因治疗： 把选择过的基因转入具有改善或治愈疾病希望的寄主中。 细胞治疗（基因组治疗）： 把未经遗传性修正的完整的细胞转入寄主中，使被转移的细胞将产生促进与寄主结合并改善寄主功能的希望。 体细胞转化： 把基因转入非种系组织中，它具有校正病人疾病状态的希望。 种系基因： 把基因转入种系组织中（蛋或胚胎），它有希望改变下一代的基因组。 转基因： 在转基因实验中，选择试验基因。例如，如果你给患苯并酮尿症病人治病，你可计划把一校正过的苯丙氨酸羟基酶基因译本移入肝细胞中。在这个例子中，苯丙氨酸羟基酶的校正译本就是转基因。 报告基因： 常用于试验基因转换效率的基因。例子是luceriferase, --半乳糖和氯氨素乙烯转化酶。 基因转化载体： 基因被转移进细胞的机理。 转化率： 正在表达所期望的转基因百分率。
基因芯片实验操作流程包括样本DNA或RNA制备、标记、杂交及洗涤等步骤http://img1.jiansuo.net/trademd/upload/asset/meeting/2010/12/02/1291289644.JPG 基因芯片实验操作流程图 1、样本DNA或RNA制备 芯片实验中核酸的抽提没有特殊之处，参照常规的分子生物学实验手册就可以。但对于RNA样本，由于RNA的稳定性很差，在活体内的半衰期也很短，因此取材一定要新鲜，取材后迅速保存在液氮中，在整个处理过程中要非常小心，以免降解，影响实验成功率或结果的可靠性。 2、核酸标记方式 分子生物学常用的标记方法有同位素标记和非同位素标记方法，常用的同位素有33 P、32 P、125 I及3 H等化学发光标记和荧光标记，非同位素标记方法又分为化学发光法和荧光法。常用的化学发光物质有碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶，它们能催化相应的底物产生有颜色的沉淀物；生物素和地高辛是最常用的非同位素标记物。很多荧光染料、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶可直接同抗地高辛抗体及亲和素偶联。而目前常用的荧光染料种类有德克萨斯红(Texasred)、荧光系、罗丹明、Cy3、Cy5等。生物芯片中的标记方法普遍采用荧光方法，很少采用化学发光法和同位素标记方法。 核酸样本通常采用酶反应法进行标记，蛋白质样本采用化学方法或抗体―抗原间接标记的方式。核酸中常用的酶反应方法有：反转录法、随机引物法、切口平移(nicktranslation)、PCR、体外转录等。在酶反应过程中掺人带荧光的dNTP，从而标记新合成的核酸分子。如果酶反应中需要引物，如PCR、随机引物法和反转录法，也可以将荧光基团通过化学反应加到引物的末端。 3、样品标记方法 样本标记方法很多，这里仅举几种常用的方法。 (1) RNA标记方法：对于表达谱基因芯片和RNA不同剪切体的研究，是针对RNA样本进行标记。最常见的标记方式是用Cy3或Cy5荧光，通过反转录标记法，选择不同激发波长的荧光标记不同的样本。如Cy3或Cy5标记的dNTP，通过酶反应掺人到待测样品中，便可以在一张片子上同时检测两份标本的信息，做到平行性比较，数据更可靠。另外，由于反转录法所需RNA样本量大，一般需要20fig的总RNA。对于微量的组织样本很难制备足够的RNA，这时可以采用RNA线性扩增方法，最普遍采用的RNA扩增方法是RNA体外线性扩增方法。 (2) DNA样本的标记方法：当对样本进行CGH分析、SNP、分子分型或甲基化研究时，主要选用DNA作为样本。对于CGH，可以进行全基因组标记，通常采用随机引物标记方法。这种方法需要的DNA量大，一般在2pg以上的基因组DNA。虽然有人发明了全基因组DNA的线性扩增技术以减少对样本量的需求，但效果上都不很理想，很难真正做到全基因组及完全的线性扩增。对于SNP研究，可以采用类似CGH的标记方式进行全基因组标记。由于SNP检测的是DNA的“质”，而不像表达谱或CGH质检测核酸的“量”，因此不必要考虑标记时DNA的线性关系，可以采用其他的全基因组的扩增方法。但由于杂交条件的限制，一般难以做到真正意义上的高通量。因此，一般只是选择少数目的基因的少数SNP位点进行研究，可以采用多重PCR标记方法标记目的片段代替全基因组标记。甲基化研究有两种方案，一种采用SNP的检测原理，另一种类似CGH的方法。
[font=宋体][font=Calibri]qRT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]常常被用来对[/font][font=Calibri]RNA-seq[/font][font=宋体]或芯片测序得到的有意义的基因表达情况进行准确的定量分析，本文主要从[/font][font=Calibri]qRT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]的原理、定量方法等方面进行讲解。[/font][/font][font=宋体] [/font][table][tr][td][align=center][b][font=微软雅黑]区别[/font][/b][/align][/td][td][align=center][b][font=微软雅黑][font=微软雅黑]荧光定量[/font][font=微软雅黑][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][/font][/b][/align][/td][td][align=center][b][font=微软雅黑][font=微软雅黑]常规[/font][font=微软雅黑][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][/font][/b][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][b][font=微软雅黑]检测时间[/font][/b][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑][font=微软雅黑]实时[/font][font=微软雅黑]+终点[/font][/font][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑]终点[/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][b][font=微软雅黑]检测信号[/font][/b][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑]荧光染料或者探针[/font][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑]核酸染料[/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][b][font=微软雅黑]准确度[/font][/b][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑]定量[/font][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑]半定量[/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][b][font=微软雅黑]是否能检测终点产物[/font][/b][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑]能[/font][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑]能[/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][b][font=微软雅黑]是否能计算起始浓度[/font][/b][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑]能[/font][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑]否[/font][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][b][font=微软雅黑]仪器要求[/font][/b][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑][font=微软雅黑]荧光定量[/font][font=微软雅黑][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪[/font][/font][/align][/td][td][align=center][font=微软雅黑][font=微软雅黑]常规[/font][font=微软雅黑][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪[/font][/font][/align][/td][/tr][/table][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]一、[/font][font=Calibri]qRT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]定量原理[/font][/font][/b][font=宋体][font=Calibri]qRT-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]，即实时荧光定量[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]，就是通过对[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]扩增反应每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板的定量分析。因为在[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]扩增的指数时期，模板的[/font][font=Calibri]Ct [/font][font=宋体]值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以定量。（[/font][font=Calibri]Ct [/font][font=宋体]值：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 [/font][font=Calibri](cycle)[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]Ct [/font][font=宋体]值越小，反应扩增到达平台期所需循环数越少，目的基因起始含量越高）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]的荧光标记方法分为以[/font][font=Calibri]SYBR Green I[/font][font=宋体]染料法为主的荧光染料嵌合法，以[/font][font=Calibri]Taqman[/font][font=宋体]探针法为主的荧光探针法（[/font][font=Calibri]Cycling Probe[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]Molecular Bracon[/font][font=宋体]等），淬灭染料引物法。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]①[/font][font=Calibri]SYBR Green I[/font][font=宋体]染料法[/font][/font][/b][font=宋体][font=Calibri]SYBR Green I [/font][font=宋体]是高灵敏度的非特异性双链[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]荧光染料，具有绿色激发波长。它以非特异性方式结合在[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]双螺旋小沟区域。游离的[/font][font=Calibri]SYBR Green I [/font][font=宋体]只发出微弱的荧光信号，[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]过程中，当扩增生成[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]时，[/font][font=Calibri]SYBR Green I [/font][font=宋体]逐渐与[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]结合，荧光信号被千倍放大，荧光信号的强度与扩增得到的[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]的浓度成正比。荧光信号被仪器检测并采集得到“扩增曲线”，通过荧光信号的强度反映出体系中[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]的浓度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]但[/font][font=Calibri]SYBR Green I [/font][font=宋体]与特异性扩增产物结合时还可以同引物二聚体、非特异性扩增的[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]结合，影响结果判断。所以扩增反应结束后，还必须对生成的[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]进行分析：即通过升温，[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]双链解开，[/font][font=Calibri]SYBR Green I [/font][font=宋体]染料脱落，荧光值逐渐下降，形成温度和荧光强度的曲线即“熔解曲线（[/font][font=Calibri]Melting curve[/font][font=宋体]）”，由此判断体系中是否存在引物二聚体、非特异性扩增。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]SYBR Green I [/font][font=宋体]染料法操作简单、灵敏度高、成本较低，被广泛地应用于[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]及[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]定量、 基因表达量的研究、转基因重组动植物的研究等。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]②[/font][font=Calibri]Taqman[/font][font=宋体]探针法[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Taqman[/font][font=宋体]探针是由[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]’端标记有荧光报告基团和[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]’端标记有淬灭基团以及与目标基因特异性结合的寡核苷酸序列组成。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，此时仪器不会检测到荧光信号。在[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]扩增时，模板[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]变性解链，[/font][font=Calibri]Taqman[/font][font=宋体]探针特异性结合到目标基因处，而[/font][font=Calibri]Taq[/font][font=宋体]酶具有[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]’[/font][font=Calibri]-3[/font][font=宋体]’核酸外切酶活性，延伸至探针结合处，可将探针水解，使荧光报告基团和淬灭基团分离，从而检测到荧光信号，荧光信号的强度与扩增得到的[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]的浓度成正比。荧光信号被仪器检测并采集得到“扩增曲线”，通过荧光信号的强度反映出体系中[/font][font=Calibri]dsDNA[/font][font=宋体]的浓度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Taqman[/font][font=宋体]探针法因其特异性高，被广泛地应用于等位基因鉴别、[/font][font=Calibri]SNP[/font][font=宋体]分型、病原体和病毒检测、疾病耐药基因研究、多重定量等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]详情可以关注[font=宋体]义翘神州[/font]qPCR定量分析服务：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/real-time-[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]-service[/font][/font][font=Calibri] [/font]
仪器简介PCR是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内In Vitro的大量合成，它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。目前常用的技术，可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。根据DNA扩增的目的和检测的标准，可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR仪，原位PCR仪，实时荧光定量PCR仪四类。PCR技术原理该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆◆列举部分仪器的个别参数，仅供参考：技术参数：样品台容量:96X0.2ml PCR管、 96孔PCR板、8排/12排PCR管工作原理：TE半导体系加热致冷技术屏幕：彩色触摸屏（5.7英寸）温度控制范围：4℃-105℃ 升降温速度：≥4.0℃/秒 温度均匀性：≤0.3℃ 温控精度：≤0.1℃ (@55℃) / ≤0.2℃(@90℃以上)温度显示精度：0.1℃程序温控方式：Block模式和Tube模式变温速度可调范围：0.1-4.0℃程序可储存数：最大可存250个程序，可通过U盘扩展存贮最大循环数：99循环，可套嵌两级，可做巢式PCR实验时间递增/递减：0-9分59秒，可做Long PCR实验温度递增/递减：0.1-9.9℃，可做Touch down实验断电保护/暂停功能：有Soak功能：有运行状态显示功能：[color=
[font=arial, helvetica, sans-serif][color=#3333ff][b] [/b][/color][/font][align=center][font=arial, helvetica, sans-serif][b][size=24px]什么是荧光定量PCR[/size][/b][/font][/align][align=center][font=arial, helvetica, sans-serif][b][size=24px][/size][/b][/font][/align][font=arial, helvetica, sans-serif][color=#3333ff][color=#3333ff][b] [url=http://www.woyao17.com.cn/chanpinzhanshi/peitaoxiantiao/24.html]荧光定量PCR[/url][/b][/color][/color]又称qPCR，[color=#333333]是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次[/color]聚合酶链式反应[color=#333333]（[/color][url=http://www.woyao17.com.cn/chanpinzhanshi/peitaoxiantiao/][color=#3333ff][b]PCR[/b][/color][/url][color=#333333]）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。[/color][/font][size=16px][b][font=微软雅黑, sans-serif]荧光定量PCR的由来[/font][/b][/size][color=#333333] [/color][url=http://www.woyao17.com.cn][img=,690,460]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2020/09/202009270913440814_9803_4137464_3.jpg!w690x460.jpg[/img][/url] 2020年，一场突如其来的新冠疫情，让“[url=http://www.woyao17.com.cn/chanpinzhanshi/peitaoxiantiao/24.html][color=#0000ff][b]核酸检测[/b][/color][/url]”这一疾病检测方法一夜间为大家所公知。它在这次疫情防控中发挥了重大作用，成为临床诊断的 “金标准”。而实时荧光定量PCR则是此次核酸检测的主要应用方法，用以检测、判定临床样本中是否含有新冠病毒。今天小编先带大家初步了解一下什么是实时荧光定量PCR。 它的由来是这样的从20世纪90年代初开始，许多实验室开始致力于相对准确的定量PCR技术的研究。在这一过程中，应用较多的是半[url=http://www.woyao17.com.cn/chanpinzhanshi/peitaoxiantiao/24.html][color=#0000ff][b]定量PCR技术[/b][/color][/url]。引入管家基因，通过电泳后比较目的基因和管家基因的产物相对量，得到起始模板在量的差异。随后，为了进一步提高定量的准确性，人们开始设想在PCR过程中加入荧光物质，荧光物质会参与到第一轮PCR循环中，随着循环的进行和产物的增加，检测到的荧光物质也在发生变化，从而通过对荧光物质的检测实现全程监控PCR进程，最终可以计算出初始的模板量。1993年Higuchi等人将这一设想付诸实现！它的定义是这样的实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 [b][font=微软雅黑, sans-serif][size=16px]荧光定量PCR的原理[/size][/font][/b] 它检测的原理是这样的原理，包括探针类和非探针类两种。探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加；非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。探针法由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，而非探针类则简便易行。例如： 1.SYBRGreenⅠ法：SYBRGreenⅠ是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。特点：非特异性，需检测熔解曲线；单通道检测；使用方便，经济便宜；常用于实验室研究。 2.TaqMan探针法：TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。特点： 特异性好；可以多通道检测；单独设计探针；价格较高；常用于临床检测。随着荧光检测[url=http://www.woyao17.com.cn/chanpinzhanshi/peitaoxiantiao/24.html][color=#3333ff][b]PCR仪[/b][/color][/url]的商品化，实时荧光定量PCR进入了一个特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应和由计算机软件进行快速统计的全新时代，实现了PCR从定性或半定量到准确定量的飞跃。它的特点和优势是这样的 1）特异性强：引物和探针的“双保险”，避免检测的假阳性。 2）灵敏度高：分析PCR产物的对数期，自动化仪器收集荧光信号，避免了许多人为因素干扰。 3）避免污染：全封闭反应，无须PCR后处理。 4）实现定量：运用标准品获得标准曲线，结合Ct值进行准确定量。 5）高效低耗：可实现一管多检。 6）操作简便：在线式实时监测扩增结果，不必接触有害物质。 7）快速：反应时间1.5小时。[size=16px][b][font=微软雅黑, sans-serif]在分子生物学领域的研究应用[/font][/b][/size][list=1][*]定量核酸浓度：传统方法是用琼脂糖凝胶电泳或者分光光度计测定核酸浓度，其结果不准确而且易污染，实时荧光定量PCR可以解决这些问题，它的准确性、灵敏度高且无污染，对一些传染性疾病进行定量分析、病原微生物和病毒含量检测，此项技术都是首选 。[*]研究基因表达：应用实时定量PCR技术可以对基因时间、空间表达水平差异进行比较。例如，对特定基因用物理、化学、药物等不同方法处理后的差异进行比较，为人们的科学研究提供依据 。[*]用于单核苷酸多态性(SNP)检测分析：人们对疾病的易感性和对同一种药物治疗同一种疾病的效果是有差异性的，遗传物质DNA的多态性RELP，STR，ABO血型和SNP是个体差异的遗传基础。SNP在人类基因组中广泛存在，是人类可遗传变异中最常见的一种，在遗传性疾病的研究中具有重要意义 。[*]DNA甲基化检测：DNA甲基化是表观遗传学重要的标记信息，通过实时荧光定量PCR技术获得基因组甲基化水平数据对表观遗传学的时空特异性研究具有重要意义。[/list][url=http://www.woyao17.com.cn/chanpinzhanshi/][img=,690,517]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2020/09/202009270916423385_1359_4137464_3.jpg!w690x517.jpg[/img][/url]
基因芯片技术进展及应用 作者：刘炎 [关键词] 基因芯片；核酸探针序列；杂交 1 基因芯片概述 随着人类基因组计划( Human Genome Project)即全部核苷酸测序的即将完成，人类基因组研究的重心逐渐进入后基因组时代（ Postgenome Era）向基因的功能及基因的多样性倾斜［1，2］。通过对个体在不同生长发育阶段或不同生理状态下大量基因表达的平行分析，研究相应基因在生物体内的功能，阐明不同层次多基因协同作用的机理，进而在人类重大疾病如癌症、心血管疾病的发病机理、诊断治疗、药物开发等方面的研究发挥巨大的作用。它将大大推动人类结构基因组及功能基因组的各项基因组研究计划。 基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法（southern 、northern）是一致的，都是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析，基因芯片在一微小的基片（硅片、玻片、塑料片等）表面集成了大量的分子识别探针，能够在同一时间内平行分析大量的基因，进行大信息量的筛选与检测分析［3，4］。基因芯片主要技术流程包括：芯片的设计与制备；靶基因的标记；芯片杂交与杂交信号检测。 基因芯片的设计实际上是指芯片上核酸探针序列的选择以及排布，设计方法取决于其应用目的，目前的应用范围主要包括基因表达和转录图谱分析及靶序列中单碱基多态位点（single nucleotide polymorphism，SNP）或突变点的检测，表达型芯片的目的是在杂交实验中对多个不同状态样品(不同组织或不同发育阶段、不同药物刺激)中数千基因的表达差异进行定量检测，探针序列一般来自于已知基因的cDNA 或EST库，设计时序列的特异性应放在首要位置，以保证与待测目的基因的特异结合，对于同一目的基因可设计多个序列不相重复的探针，使最终的数据更为可靠。基因单碱基多态检测的芯片一般采用等长移位设计法［5］，即按靶序列从头到尾依次取一定长度的互补的核苷酸序列形成一探针组合，这组探针是与靶序列完全匹配的野生型探针，然后对于每一野生型探针，将其中间位置的某一碱基分别用其它三种碱基替换，形成三种不同的单碱基变化的核苷酸探针，这种设计可以对某一段核酸序列所有可能的SNPs位点进行扫描。 芯片制备方法主要包括两种类型：(1)点样法：首先是探针库的制备, 根据基因芯片的分析目标从相关的基因数据库中选取特异的序列进行PCR扩增或直接人工合成寡核苷酸序列［6］，然后通过计算机控制的三坐标工作平台用特殊的针头和微喷头分别把不同的探针溶液逐点分配在玻璃、尼龙以及其它固相基片表面的不同位点上，通过物理和化学的方法使之固定，该方法各技术环节均较成熟，且灵活性大，适合于研究单位根据需要自行制备点阵规模适中的基因芯片。(2)原位合成法［7～10］：该法是在玻璃等硬质表面上直接合成寡核苷酸探针阵列，目前应用的主要有光去保护并行合成法，压电打印合成法等，其关键是高空间分辨率的模板定位技术和高合成产率的DNA化学合成技术，适合制作大规模DNA探针芯片，实现高密度芯片的标准化和规模化生产。待分析样品的制备是基因芯片实验流程的一个重要环节, 靶基因在与芯片探针结合杂交之前必需进行分离、扩增及标记。标记方法根据样品来源、芯片类型和研究目的的不同而有所差异。通常是在待测样品的PCR扩增、逆转录或体外转录过程中实现对靶基因的标记。对于检测细胞内mRNA表达水平的芯片，一般需要从细胞和组织中提取RNA，进行逆转录，并加入偶联有标记物的dNTP，从而完成对靶基因的标记过程［11］，对于阵列密度较小的芯片可以用同位素，所需仪器均为实验室常规使用设备，易于开展相关工作，但是在信号检测时，一些杂交信号强的点阵容易产生光晕，干扰周围信号的分析。高密度芯片的分析一般采用荧光素标记靶基因，通过适当内参的设置及对荧光信号强度的标化可对细胞内mRNA的表达进行定量检测。近年来运用的多色荧光标记技术可更直观地比较不同来源样品的基因表达差异，即把不同来源的靶基因用不同激发波长的荧光素标记，并使它们同时与基因芯片杂交，通过比较芯片上不同波长荧光的分布图获得不同样品间差异表达基因的图谱［12，13］，常用的双色荧光试剂有Cy3- dNTP和Cy5- dNTP。对多态性和突变检测型基因芯片采用多色荧光技术可以大大提高芯片的准确性和检测范围，例如用不同的荧光素分别标记靶序列及单碱基失配的参考序列，使它们同时与芯片杂交，通过不同荧光强弱的比较得出靶序列中碱基失配的信息［14］。 基因芯片与靶基因的杂交过程与一般的分子杂交过程基本相同，杂交反应的条件要根据探针的长度、GC碱基含量及芯片的类型来优化，如用于基因表达检测，杂交的严格性较低，而用于突变检测的芯片的杂交温度高，杂交时间短，条件相对严格。如果是用同位素标记靶基因，其后的信号检测即是放射自显影，若用荧光标记，则需要一套荧光扫描及分析系统，对相应探针阵列上的荧光强度进行分析比较，从而得到待测样品的相应信息。由于基因芯片获取的信息量大，对于基因芯片杂交数据的分析、处理、查询、比较等需要一个标准的数据格式，目前，一个大型的基因芯片的数据库正在构建中，将各实验室获得的基因芯片的结果集中起来，以利于数据的交流及结果的评估与分析。
由Mullis等在1983年建立的PCR技术已成为分子生物学、遗传学等学科研究领域的经典实验方法。近年来,该技术本身获得了长足发展,可靠性不断提高,在聚合酶链式反应基本原理的基础上,发展了一系列新的概念和实验方法,在生命科学研究中具有重要价值。实时定量RT - PCR的原理、方法和应用1、实时定量RT - PCR的原理实时定量PCR的发明归功于两个重要的发现:一是发现DNA Taq酶有5′ 3′外切酶活性,二是利用荧光能量传递技术构建了双标记寡核苷酸探针,即TaqMan探针。在PCR过程中,这些荧光信号可以被探测器所“即时”捕获,电脑软件可以通过等式ΔRn = R+n - R-n 计算ΔRn ,其中, R+n 是表示每点测量的荧光强度, R-n 表示荧光基线强度,ΔRn 的值表示PCR过程中,探针降解的量,就是PCR产物的量 。Comp lex探针技术:该技术的特点是先合成荧光探针和淬灭探针,荧光探针为25个碱基左右, 5′端有荧光报告基团,淬灭探针长度为15个碱基左右, 3′端有荧光淬灭基团,并能与荧光探针5′端杂交。当荧光报告基团与淬灭基团靠近时,荧光信号被吸收。当反应体系中没有特异性模板时,不能检测到报告基团的荧光信号。当有特异性模板存在时,在PCR复性阶段荧光探针优先与模板结合,以致两探针分离,报告基团的荧光信号可被释放出来,其强度与被扩增的模板数量成正比,因而可进行PCR定量。2、方法首先提取细胞因子mRNA,合成cDNA,可以采用TR Izol试剂盒,也可以采用Higher Pure RNA isolationkit从组织中提取RNA,所得到的RNA必须有较高的纯度,且不含DNA;然后,确定管家基因,设计引物和探针;再进行PCR扩增和基因定量。3、实时定量RT - PCR的应用实时定量PCR可用于基因表达研究,转基因研究,单核苷酸多态性及突变分析,病原体检测,药物疗效考核,肿瘤基因检测等。
化学发光是指能量来自于化学反应引起的发光。相对于化学发光的生物发光，是指能量来自于酶促催化下的生化反应引起的发光。化学发光作为一种分析工具的吸引之处就在于检测的简单性。化学发光的实质是自身发光，这意味着化学发光的分析测试仪器只需要提供一种可以检测光信号和纪录结果的方法就可以了。简单的说，化学发光 (ChemiLuminescence ，简称为 CL) 分析法是分子发光光谱分析法中的一类，它主要是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的一种痕量分析方法。发光技术的应用：Ø 钙流检测Ø 活性氧分析Ø 发光免疫分析Ø 基因调控（Luciferase 报告基因）Ø 蛋白质相互作用（BRET,生物发光共振能量传递）BRET是细胞内实时分析蛋白质－蛋白质相互作用的工具。
双链DNA荧光毛细管分析法的研究报告人：李乔婧四川大学http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/11/201211071545_402129_1732407_3.jpg
如题[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=24112]叶绿素荧光原理[/url]
[size=14px] [/size] [size=14px]心肌梗死性心力衰竭（HF）是世界范围内导致死亡和残疾的主要原因，心衰的特征是线粒体能量产生受损，类视黄醇X受体a（RXRa）是一种配体激活的转录因子，可以形成同型二聚体或异源二聚体，激活参与底物利用和氧化磷酸化的基因转录，是调节线粒体能量代谢的理想靶点。然而，目前缺乏具有高亲和力和特异性激活RXRa二聚体的激动剂。[/size] [size=14px]黄芪甲苷是黄芪的主要有效成分，已有研究报道多种黄芪甲苷可以改善线粒体功能。其中黄芪甲苷Ⅳ已被观察到在腹膜纤维化中调节RXRa，这意味着黄芪甲苷家族的化合物具有激活RXRa和改善线粒体功能的潜力。因此，作者推测黄芪甲苷可能作为RXRa同型二聚体的潜在激动剂。此外，作者还研究了靶向RXRa的下游机制。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]黄芪甲苷III（AS-III）是一种理想的直接靶向RXRa的激动剂。机制上，AS-III通过与RXRa相互作用激活RXRa二聚体，随后上调Ndufs4的转录。更重要的是，AS-III在体外和体内均有助于改善线粒体损伤和心功能障碍。该研究为心衰治疗提供了一种新的治疗策略，通过RXRa同型二聚体的反激活来上调Ndufs4并促进能量代谢。[/size] [size=14px]图片[/size] [size=14px]1、AS-III靶向RXRa，保护线粒体功能，发挥心脏保护作用[/size] [size=14px]作者首先通过通过分子对接、表面等离子体共振（SPR）和微尺度热电泳（MST），鉴定出黄芪甲苷III（AS-III）是黄芪甲苷家族中亲和力最高的化合物（附件中）。SPR（图1a）和MST（图1b）结果显示AS-III特异性结合RXRa, KD值分别为3.05x10^-7和1.35x10^-7 mol/L，表明AS-III对RXR具有较高的亲和力。分子对接显示AS-III成功地停靠在二聚体的界面上（图1c）。对AS-III和RXRa蛋白进行均方根偏差（RMSD）模拟，结果表明它们在20 ns后达到稳定构象（图1d）。由于Ccl6受RXRa同型二聚体的转录调控，作者使用Ccl6启动子荧光素酶报告基因发现AS-III成功诱导了Ccl6的转录，表明AS-III是一种具有高亲和力的RXRa激动剂（附件）。采用体外氧葡萄糖剥夺/恢复（OGD/R）模型和体内左前降（LAD）结扎诱导HF模型确定了AS-III的保护作用，其作用与临床治疗HF的药物辛伐他汀相似（图1f和1g）。RXRa siRNA一致地逆转了AS-III依赖性的OGD/R损伤的保护作用，表明RXRa是AS-III的关键治疗靶点（图1e）。AS-III低剂量和高剂量的心脏保护作用相当，因此后续实验选择低剂量AS-III。随后采用透射电镜（TEM）和高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]（HPLC）检测心肌组织线粒体结构和功能，发现AS-III部分减轻线粒体损伤（图1h），AS-III改善了ATP浓度（图1i），表明它促进了HF小鼠ATP的产生。此外，western blotting显示AS-III在小鼠HF模型中抑制RXRa下调（图1j）。RNA测序分析结合q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]验证证实，AS-III治疗上调了线粒体复合物亚基（Ndufs1-6和8），它们在模型组中严重受损（图1k和1）。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]2、AS-III通过激活RXRa上调Ndufs4在心脏中的表达促进线粒体功能[/size] [size=14px]越来越多的证据表明RXRa以依赖配体激活的方式调节线粒体复合体I，但其调控机制尚不明确。结合现有文献和前面的实验结果，作者推测RXRa通过Ndufs调控线粒体复合体I。作者利用HUMAN TFDB网站和Cytoscape软件确定Ndufs1-8是RXRa的直接转录靶基因。接着利用q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]验证RXRa与Ndufs1-8之间的关系，发现RXRa siRNA下调Ndufs2、Ndufs4、Ndufs6和Ndufs8（图2a），而RXRa过表达上调了Ndufs4（图2b）。Western blot结果显示RXRa敲低显著降低了Ndufs4水平，RXRa过表达上调了Ndufs4水平（附件）。CUT和Tagseq分析用于确定RXRa和nduf4之间的调控关系，在Ndufs4基因中鉴定出RXRa结合序列（图2c）。此外，采用ChIP-q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]方法证实RXRa与Ndufs4的互作。双荧光素酶报告基因实验发现RXRa激活了ndufs4驱动的荧光素酶基因表达。然而，在突变的Ndufs4荧光素酶活性中没有观察到这种差异（图2d）。这些结果支持RXRa直接靶向Ndufs4从而促进其转录的观点。q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]结果显示在转染RXRa质粒的H9c2细胞中，9-cis RA（RXRa泛激动剂）能诱导Ndufs4表达，而LG100754（PPAR/RXR的激动剂，但是RXR同型二聚体的拮抗剂）不能诱导Ndufs4表达，且LG100754和9-cis RA共处理未能上调Ndufs4的表达，这表明RXRa以其同二聚体形式调控Ndufs4的转录（图2e）。进一步使用已知与RXRa同型二聚体结合的rxre -荧光素酶报告基因发现AS-III通过激活RXRa同型二聚体来发挥作用。与分子对接结果一致，AS-III可以诱导RXRa同型二聚体的转录激活（图2f）。此外，AS-III上调了Ndufs4 mRNA的表达，RXRa siRNA显著减弱了Ndufs4 mRNA的表达（图2g）。还有，AS-III改善了OGD/R损伤的线粒体结构和功能，在LAD模型中发现AS-III通过rxra - ndufs4介导的线粒体功能发挥心脏保护作用（图2h，i）。Western blot结果显示AS-III处理强烈诱导Ndufs4表达，然而这种效应在AAV-RXRa KD小鼠中被破坏（2j）。在AAV-RXRa KD + LAD结扎组，AS-III对线粒体的保护作用减弱（图2K）。[/size]
技术参数 酶标板类型 1、6、12、24、48、96和384孔酶标板（包括Terasaki板） 也可以为特定的板型编程 。最大尺寸：90mm×134mm×25mm 检测速率 96孔酶标板作动力学研究需最低时间为15秒 摇床 轨迹摇床，转速60-1200rpm，直径1-50mm 进样器 1-3个加样器 处理体积 5-1000ul ，5ul增量 进样速度 25秒/板（96孔板，5ul/孔） 孵育温度范围 室温+3℃—45℃ 光学系统 光源 石英卤素灯 检测器 PMT 激发波长 320nm—700nm 发射波长 360nm—800nm 滤器 高质量杂波滤器 激发光滤器 320nm，355nm，390nm，444nm，485nm，530nm，544nm，584nm 发射光滤器 405nm，460nm，485nm，510nm，527nm，538nm，555nm，590nm，612nm，620nm （其它过滤器可定制） 理论灵敏度 0.01 pmol Flurescein/孔，黑色96孔Comiplate 动力学范围 5 数量级(5 decades) -------------------------------------------------------------------------------- 技术文章此仪器没有任何技术文章 -------------------------------------------------------------------------------- 主要特点用户友好，操作简易的软件界面 市场上占领先地位的自动进样系统利于快速动力学检测 读取从1孔到384孔多种板型的酶标板 从板上、下两个方向读取荧光数据 内置温育功能，便于细胞和酶动力学研究 内置可调速轨迹摇床混匀样品 可与自动机械臂联用，处理高通量样品 高性能的光学系统 Floskan Ascent系列荧光分析的光学系统通过反射镜和棱镜系统，能产生高度会聚的光束，消除交叉影响。两种可选光束系统用于读取1-96孔板和384孔板。一般光束直径为3mm，狭窄光束直径为1.5mm.系统可以采取从板上下两方向读取数据。对细胞生物学应用，从板底部读取数据能更贴近细胞，提供更高的精度。从上部读取数据能减少交叉影响，降低背景信号，提高信噪比。 独特的进样系统 对Ca2+检测、酶动力学 分析和其它对时间要求严格的研究，系统可以配置多至3个自动进样器。自动进样器能精确加入试剂，可调范围为5-1000ul。 易与自动机械臂联用 Floskan Ascent系列荧光分析仪能多种自动机械臂联用。可选配酶标板托架便于与自动机械臂联用。Ascent软件具有与自动和HIS/LIMS系统联用的功能。预先设定的分析过程可以远距离控制，Ascent软件能够实现数据自动输入/输出。 功能强大的软件 Ascent软件为荧光应用专门设计，它能够根据研究的需要设定运行程序，也可以更改内设的固定程序。例如以下两个典型的实验： 检测细胞内Ca2+浓度 为满足Ca2+浓度检测对时间优化的严格要求，以在独特的进样器，系统能够加样和检测同时进行。Ascent软件便于灵活的分析设置，允许在加入活性物质和读取实际数据前检测荧光基线（每孔一次）。每块板均能获得对于最大和最小钙信号，所有的数据均放在同一个工作表内以进行数据分析和报告。 细胞增殖和细胞毒性分析 Floskan Ascent系列荧光分析仪能够检测置于多种型号的培养板中的细胞培养物—从板的上方或下方读取数据。每个读取点可以方便地选定或删除。为获得最佳的结果而不影响细胞，信号读取速率可以根据板的类型和溶液的粘度进行调整。在细胞毒性测试中，系统计算Survival Index以获得每个病人的灵敏度分布图。 Floroskan Ascent系列荧光分析仪应用领域： 细胞内Ca2+检测（Intracellular Ca2+） 细胞增殖 (Cell proliferation) 细胞毒性 (Cytotoxicity) 多药物耐药性 (Multi-drug resisent) 细胞粘附 (Cell adhesion) DNA定量（DNA quantitatilon） 报告基因分析（Reporter gene assay） 杂交分析（Hybridization assay） 免疫分析（Immunoassays） 酶活性分析（Enzyme activity） 细菌定量（Bacterial quantitation） 细胞溶解作用（Phagocytosis）
在基因表达研究中，研究者比较注意选择合适的表达载体和宿主系统，而往往忽视基因本身是否与载体和宿主系统为最佳匹配这样一个实质性问题。基因的最佳化表达可以通过对基因的重新设计和合成来实现，如消除稀有密码子而利用最佳化密码子，二级结构最小化，调整GC含量等。以下就密码子最佳化、翻译终止效率和真核细胞中异源蛋白表达的问题加以说明。密码子最佳化（codon optimization）遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(optimal codons)，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子(rare or low-usage codons)。实际上用做蛋白表达或生产的每种生物（包括大肠杆菌，酵母 ，哺乳动物细胞，Pichia，植物细胞和昆虫细胞）都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。大肠杆菌、酵母 、果蝇、灵长类等每种生物都有独特的8个密码子极少被利用。有趣的是，灵长类和酵母 有6个同样的利用率低的密码子。大肠杆菌、酵母 和果蝇中编码丰度高的蛋白质的基因明显避免低利用率的密码子。因此，重组蛋白的表达可能受密码子利用的影响（尤其在异源表达系统中）的事实并不很奇怪。你的基因利用的密码子可能不是你正在利用的蛋白生产系统进行高水平表达所偏爱的密码子，这种情况是可能的。利用偏爱密码子(preferred codons)并避免利用率低的或稀有的密码子可以合成基因，基因的这种重新设计叫密码子最佳化。在同源表达系统中，同较低水平表达的基因相比，较高表达的基因可能有很不同的密码子偏爱。通过对密码子利用的归类分析，人们可以真正预测任何基因在酵母 中的表达水平。在诸如Zea mays的其他生物中，大量高表达基因强烈偏爱以G或C结尾的密码子。而且，在Dictyostelium中，同低水平表达的基因比较，高表达基因有较大数目的偏爱密码子。在大肠杆菌中表达哺乳动物基因是不可预测和具有挑战的。例如直到最近才实现了人血红蛋白的过表达。为了达到血红蛋白的好的表达水平，Alpha-球蛋白cDNA不得不用大肠杆菌偏爱的密码子进行重新合成。在异源宿主中实现象血红蛋白这样复杂的蛋白质的过表达可能需要最佳化密码子，这些研究者为此提供了令人信服的资料。成簇的低利用率的密码子抑制了核糖体的运动，这是基因不能以合适水平表达的一个明显机制。核糖体翻译由九个密码子组成的信使（含几个低利用率密码子或全部为低利用率密码子）时的运动速度要比翻译不含低利用率密码子的同样长的信使的速度慢。即使低利用率密码子簇位于3'端，信使最后也会被核糖体”拥挤”而损害，核糖体又回到5'端。3'端低利用率密码子簇的抑制效应可以和全部信使都由低利用率密码子组成的抑制效应一样大。如果低利用率密码子簇位于5'端，其效应是起始核糖体数目的全面减少，导致蛋白合成中信使的低效率。散在分布的稀有密码子对翻译的效应还未很好地研究，但是有证据表明这种情况的确对翻译效率有负面效应。其他因素也可以影响蛋白表达，包括使mRNA去稳定的序列。重新设计合成基因可以去除或改变这些序列，导致高水平表达。消除稀有密码子、去除任何去稳定序列和利用最佳密码子的基因的重新设计都可能增加蛋白产量，使的蛋白生产更有效和经济。翻译终止效率蛋白表达水平受许多不同因素和过程影响。蛋白稳定性、mRNA稳定性和翻译效率在蛋白生产和积累中起主要作用。翻译过程分为起始、延伸和终止三个期。对于翻译的起始，原核mRNA需要5'端非翻译前导序列中有一段叫Shine-Dalgarno序列的特异核糖体结合序列。在真核细胞，有效的起始依赖于围绕在起始密码子ATG上下游的一段叫Kozak序列的序列。密码子利用或偏爱对延伸有深刻的影响。例如，如果mRNA有很多成簇的稀有密码子，这可能对核糖体的运动速度造成负面影响，大大减低了蛋白表达水平。翻译终止是蛋白生产必须的一步，但其对蛋白表达水平的影响还没有被研究清楚。但是最近的科学研究表明终止对蛋白表达水平有很大的影响。总的来说，更有效的翻译终止导致更好的蛋白表达。绝大多数生物都有偏爱的围绕终止密码子的序列框架。酵母 和哺乳动物偏爱的终止密码子分别是UAA和UGA。单子叶植物最常利用UGA，而昆虫和大肠杆菌倾向于用UAA。翻译终止效率可能受紧接着终止密码子的下游碱基和紧靠终止密码子的上游序列影响。在酵母 中通过改变围绕终止密码子的局部序列框架，翻译终止效率可能被减低几个100倍。对于UGA和UAA，紧接着终止密码子的下游碱基对有效终止的影响力大小次序为GU，AC；对于UAG是U、ACG。对于大肠杆菌，翻译终止效率可因终止密码子及临近的下游碱基的不同而显著不同，从80%（UAAU）到7%（UGAC）。对于UAAN和UAGN系列，终止密码子下游碱基对翻译的有效终止的影响力大小次序为UGA、C。UAG极少被大肠杆菌利用，相比UAAN和UGAN，UAG表现了有效的终止，但其后的碱基对有效终止的影响力为GU，AC。对于哺乳动物，偏爱的终止密码子为UGA，其后的碱基可以对in vivo翻译终止有8倍的影响（A、GC、U）。对于UAAN系列，in vivo终止效率可以有70倍的差别，UGAN系列为8倍。如果终止密码子附近序列没有最佳化，可能发生明显增加的翻译通读，因此减少了蛋白表达。例如，在兔网状细胞无细胞翻译系统里，UGAC的翻译通读可以高达10%，而第四个碱基如果为A，G或C，翻译通读为1%。总的来说，翻译起始框架、翻译终止序列框架和密码子利用应该仔细选择，以利于蛋白的最高水平表达。翻译终止序列框架能几倍地改变蛋白生产水平。真核细胞中的异源蛋白表达异源蛋白质在细菌中表达是目前使用的主要的蛋白生产系统。大肠杆菌一直是最经济的系统之一。然而为了生产需要特异修饰、胞外分泌或有特异折叠需要的蛋白质，其他表达系统也是需要的。真核细胞在表达原核来源的基因、真核基因的cDNA拷贝或其他无内含子的基因时可能表现很多特异问题。富含AT的基因在很多真核细胞中表达时会遭遇很剧烈的障碍。主要的真核信号序列如 加poly-A的位点、酵母 转录终止位点和真核mRNA去稳定序列都是富含AT的。内含子序列也趋向于富含AT，尽管他们有参与剪切过程的很特异的识别序列。虽然绝大多数原核基因没有剪切或聚腺苷过程，但这些真核过程需要的保守序列可能存在于原核基因中，因此当这些基因在真核细胞中表达时可能引起特异的问题。而且诸如哺乳动物和单子叶植物细胞的特异真核表达系统可能不能有效地表达无内含子的基因。 真核mRNA在离开细胞核进而在胞浆的核糖体上被翻译前需要特异的处理和修饰。这些过程包括去除内含子、5'端甲基化帽子形成和3'端加poly-A。内含子去除需要5'剪切位点、G75/G100U100A65AG65U保守序列、3'剪切位点、富含密啶NC66A100G100/G56保守序列和C72T98R77A100Y75保守序列。有效的加poly-A和mRNA剪切需要一个由两个部分组成的信号：加poly-A保守序列AAUAAA和在切割位点内的50个碱基的富含GT的序列。酵母 真核转录终止序列（几个不同的富含AT序列,如含TTTTTATA，TATATA，TACATA，TAGTAGTA的一个38bp区域）被研究的最清楚。这些结果来自对酵母 突变体CYCI mRNA的mRNA水平和相对长度的确定的实验。近期用in vivo质粒稳定性分析的研究结果证明：TATATA似乎和原始的38bp野生型区域一样有效地终止转录，而TAGATATATATGTAA和TACATA效率差些，TTTTTTTATA几乎没有效率。所有这些序列在反方向时没有终止转录功能。不幸的是几乎没有其他真核表达系统转录终止序列方面的信息。内含子对几个哺乳动物基因的正常表达是必需的，包括Beta-球蛋白、SV40 late mRNA和二氢叶酸还原酶基因。单子叶植物细胞充分表达乙醇脱氢酶的cDNA拷贝、报告基因氯霉素乙酰转移酶、Beta葡萄糖苷酸酶和其他缺乏内含子的基因时也依赖内含子。转录区域内引入内含子可以通过未确定的转录后机制增强表达。（免疫球蛋白基因）内含子可能也包含转录增强子，因此通过转录机制增强表达。 总的来讲，如果存在某些DNA序列，真核异源蛋白表达可能是个难题。为避免剧烈的表达减少，需要对基因进行扫描，确认是否含上述提及的富含AT的序列。而且，在几个真核系统表达无内含子基因可能需要引入内含子以实现外源蛋白的充分表达。
前言：针对转基因产品安全性问题，农业部于4月也组织专题新闻发布会，公开说明情况，这是近年来头一次。农业部公开表示：转基因 “致癌、致不育、欧美不吃”都是谣言。美国科学院于5月17日发布的一份详尽报告称，没有证据表明转基因农作物对人类或环境有害。去年，仪器信息网也对崔永元“反转”的行为做了一个调查，过半认为小崔的翻转并非“恶”为。👉小崔的“反转”是恶与否？科研人当以确凿的数据论证http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/05/201605251700_594788_1610895_3.jpg转基因是否有害的言论形成“两极”分化，对此您怎么看？美国科学院、工程院和国家医学院召集了50多位科学家、研究人员、农业和工业专家组成编写委员会，花费两年时间撰写完成了这份长达388页的报告。报告回顾了自转基因作物诞生以来，20年间的900多项研究和相关数据。此次发布的报告名叫《基因工程作物：经验与展望》（Genetically Engineered Crops: Experiences and Prospects），旨在对有关转基因作物和食品的安全性和环境、社会效应的研究做一次客观的综述。 http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/05/201605251701_594790_1610895_3.jpg01转基因对人体无害？为了确定转基因作物制成的食品对人类是否安全，编写委员会将美国、加拿大与英国和西欧国家近年来的疾病报告进行了比较。美国和加拿大从20世纪90年代中期便开始消费转基因作物，而英国和西欧地区则一直消费得较少。结果发现，自90年代转基因作物问世以来，美国和加拿大并没有哪种疾病的发病率呈现出长期的增长态势。肥胖或2型糖尿病与转基因食物之间没有任何相关性。乳糜泄，即对麸质（小麦中的蛋白质）不耐受的问题，在欧美两地人群中均有增加。此外，英美两国儿童自闭症谱系障碍的增长趋势也是相似的。该报告最后总结道：转基因作物与传统方式种植的作物相比，并不会为人体健康带来更高的风险。 02与传统育种没有明显差异？该报告指出，从总体上来看，转基因作物减少了农民的劳作时间，降低了杂草和害虫带来的损失，因此为农民节省了不少费用。但对于害虫控制、农耕活动和农业基础设施而言，转基因既有积极影响，也存在一些消极影响。此外，该报告还指出，从某种程度上来说，并不太确定采用转基因作物是否让让农业产量明显增加。虽然种植转基因大豆、棉花与玉米对农民有着积极的经济影响，但“产量增长的速率没有变，至少没有显著性改变。”转基因作物的增产潜力对发展中国家来说影响更大。一些新的作物改良技术可能会增加产量的增长率，但报告无法给出肯定回答，因此建议通过多种农业技术保证产量稳定提高。当然，报告也指出，任何育种技术都有可能产生安全问题，不可能一概而论其益处和风险。因此，无论新植物品种是通过转基因技术还是杂交技术培育的，都应接受安全评价。03“基因污染”是否存在？“没有可靠证据表明转基因作物与环境问题之间存在因果关系。”报告称，“使用抗虫或抗除草剂的作物并没有减少农场中植物和昆虫整体多样性，抗虫作物的大田甚至还会有更多的昆虫多样性。” 没有证据表明大斑蝶种群数量的减少与转基因作物的种植相关。尽管基因漂移（基因从转基因作物到野生近缘物种）已经产生，但没有实例证实这种转移对环境产生了不利影响。总体而言，委员会未发现转基因作物和环境问题之间存在因果关系。然而，即使对于杂交作物，由于评估长期环境变化的复杂性，也很难得出明确的结论。04监管困境：评估方法被批判？报告还批评了根据生产技术对食品进行分类的监管方法。“国家科学院从1987年就在讨论应该基于食品本身，而不是过程。”报告委员会主席，北卡罗来纳州大学演化生物学家Fred Gould对美国《科学》杂志（Science）说道，“现在的监测问题是，你如何决定某样食品比其他食品需要更多的检验？”报告指出，监管部门应主动向公众传播转基因技术的原理，农业产品如何被监管，以及监管的新方法，也应积极向公众就这些问题征询意见。不是所有的问题都是在科学层面，关于转基因作物的政策将涉及科学、法律和社会的各个层面。对于急需指导的监管部门，美国国家科学院将于今年年底发布另外一项报告，以预测下一个10年内的生物科技产品及监管这些产品所需的科学工具。05争议仍在继续在美国，这份近400页的报告并未结束转基因作物引发的的争论。据《纽约时报》报道，生物科技创新组织(Biotechnology Innovation Organization)表示“很高兴”，这项报告指明，“农业生物技术能为农场主、消费者及环境带来许多益处”。而消费者联盟资深科学家Michael Hansen对转基因作物的应用持批判态度，他指出这些作物并没有显著的产量提升。在一份声明中他说，“这些作物并不是世界饥饿问题的解决方案。”也许也正是因为这些问题的敏感性与复杂性，这份文件的许多结论都列出了警告作为限定。来源：仪器信息网
关于转基因作物的安全性已出现新的疑虑，一份新的研究报告指出转基因作物广泛应用的Bt毒素，在人体血液中第一次被发现。 转基因作物含有从细菌中提取，使它们抵抗虫害的基因。 这些基因使作物对害虫曾毒性，但声称对环境和人体健康不构成危险。转基因茄子，其商业版本在一年前已经停止运作，它里面转入了一种称为苏云金杆菌（Bt）的土壤细菌毒素。 截至目前为止，推销转基因作物的科学家和跨国公司认为，Bt毒素对人类健康不会构成危险，它的蛋白质会在人体肠道中被分解。但是，人体血液中存在这种毒素推翻了这一说法。
云唐ATP荧光检测仪工作原理：该设备为全新升级产品，大屏幕触摸显示屏，代替传统按键。操作采用生物化学反应方法检测ATP含量，ATP荧光检测仪基于萤火虫发光原理，利用“荧光素酶—荧光素体系”快速检测三磷酸腺苷(ATP)。ATP拭子含有可以裂解细胞膜的试剂，能将细胞内ATP释放出来，与试剂中含有的特异性酶发生反应，产生光，再用荧光照度计检测发光值，微生物的数量与发光值成正比，由于所有生物活细胞中含有恒量的ATP，所以ATP含量可以清晰地表明样品中微生物与其他生物残余的多少，用于判断卫生状况。[img=,690,690]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2023/09/202309041718145953_7240_5604214_3.jpg!w690x690.jpg[/img]
微生物基因重组育种 方法与原理微生物基因重组育种 方法与原理http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/01/201101161048_274406_2019107_3.jpg
[size=2]求助各位同行： 在报告、讲座中经常看到各位专家、厂家用比较漂亮的双光子显微系统的原理示意图，直观上可以形象地区分激光扫描共聚焦显微镜与双光子显微镜的异同，请教大家是否有这方面的图片？ 多谢各位！！！[/size]
（1）限制性核酸内切酶 一种内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA，俗称“分子手术刀”。内切酶是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。 （2）DNA连接酶 DNA酶能利用ATP或NAD+水解提供的能量催化DNA链的5'-磷酸末端与另一DNA链的3'-OH生成3',5'-磷酸二酯键，从而把两个DNA链连接起来。常见实验室常用的DNA连接酶，包括T4 DNA连接酶和Taq DNA连接酶等。 （3）DNA聚合酶 DNA聚合酶主要是催化脱氧核苷酸之间的聚合反应，连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，在DNA复制中起到关键作用。 DNA聚合酶与DNA连接酶的区别：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3'末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。 此外，DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，因此，DNA连接酶不需要模板。 （4）RNA聚合酶 RNA聚合酶以完整的双链DNA为模板，转录时DNA的双链结构部分解开，转录后DNA仍然保持双链的结构。常见RNA聚合酶：rRNA、mRNA、tRNA和其它小分子RNA，在RNA复制和转录中起作用。 （5）逆转录酶 逆转录酶具有三种酶活性，即RNA指导的DNA聚合酶、RNA酶、DNA指导的DNA聚合酶。在分子生物学实验中，广泛用于建立基因文库、获得目的基因等工作。 （6）解旋酶 解旋酶是一类解开氢键的酶，通过水解ATP供能，并识别复制叉的单链结构，因此，大部分解旋酶都具有ATP酶的活性。解旋酶大部分移动方向是5'→3'。 （7）核酸酶 核酸酶是指能降解核酸的酶，与聚合酶的功能相反，通过水解或打开在多核苷酸链中的相邻核苷酸的磷酸二酯键内的酯键发挥作用。核酸酶分为内切核酸酶和外切核酸酶，内切核酸酶能水解多核苷酸链中的内部键，而外切核酸酶则必须从末端开始水解反应。 （8）蛋白酶K 蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的蛋白溶解酶，具有很高活性，用于质粒或基因组DNA、RNA的分离和抽提。 （9）UNG酶 UNG酶可以选择性水解断裂含有dUTP的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，破坏形成的有缺失碱基的DNA链，从而降低非特异性扩增。
聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。1973 年，台湾科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。Khorana (1971)等最早提出核酸体外扩增的设想：“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因。”但由于当时基因序列分析方法尚未成熟，热稳定DNA聚合酶尚未报道以及引物合成的困难，这种想法似乎没有实际意义。加上70年代初分子克隆技术的出现提供了一种克隆和扩增基因的途径，所以，Khorana的设想被人们遗忘了。1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法。1983年12月，Mullis用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片段；1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），Mullis是第一发明人；1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者；1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大taq酶taq酶量应用，并逐步应用于临床。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
下载地址：http://www.instrument.com.cn/download/shtml/036497.shtml本书由数十位中青年医学分子生物学专家集体编著。详细系统的介绍了基因和基因工程概论、基因组的结构、基因的转移和重组、基因表达的调控、工具酶及其应用、基因工程载体及其选用、聚合酶链反应、基因的克隆及其进展、外源基因表达系统、转基因动物、基因诊断、基因工程抗体、基因工程药物、基因治疗及基因工程疫苗等，还收录了数10种常用的分子生物学试验方法。具有简明扼要、图文并茂、可操作性强等特点。希望大家尊重原创，并在引用时，注明出处。
科技日报讯（戴欣郭阳虎）近日，解放军302医院临床检验医学中心科研人员开发出一种针对丙型肝炎患者的新型基因检测技术。该技术对患者本身的白介素28B基因进行多态性分析，在国内率先将多色荧光探针技术（PCR）运用于丙肝患者临床抗病毒疗效的预测和评估中。这为快速检测丙肝患者对某种抗病毒药物是否有效提供了重要依据，从而能更有效地指导临床医务人员准确选择用药，提升治疗效果。 由于患者身体基因型的不同而导致抗病毒用药使用疗效的差异，一直是广大医师用药的困扰。业界许多专家认为，丙肝患者体内白介素28B基因的分布与抗病毒疗效可能存在非常密切的关系，掌握其分布有助于更准确的用药选择。目前国内外科研人员已相继开发了多项针对这一基因位点的检测技术，但由于操作程序复杂、周期长、准确性较差，很难应用推广，给丙肝临床诊断治疗带来一定困难。 302医院的临床检验医学中心毛远丽和王海滨带领的课题组，通过对上千例丙肝患者基因样本进行分析、检测，成功研制出一套针对丙肝患者的抗病毒治疗易感基因检测技术。该技术对多组白介素28B的基因进行筛选，通过合成DNA序列探针，构建双色荧光PCR体系，通过对患者的染色体内白介素28B的基因进行多态性分析，从而得出患者本身个别基因突变的位点。运用该方法，一小时即可完成检测，快速准确，能为患者的临床治疗提供更加准确有效的诊疗依据。 该技术在国内率先将多色荧光探针技术运用于丙肝患者临床抗病毒疗效的预测和评估，大大提高了丙肝临床诊治水平，也标志丙肝个性化诊疗迈出了重要一步。它有助于临床医生更好地选择适合丙肝患者的个性化治疗方案，准确选择抗病毒药物的种类和治疗持续时间，有效缩短患者治疗时间的同时减少就医成本。来源：中国科技网-科技日报 作者：郭阳虎 2014年01月21日
各位大神，如果一株菌测得全基因序列中并没有某个酶的基因，那么这株菌产的蛋白，测N末端氨基酸序列，可能会有这个酶的存在吗
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