双荧光素酶报告基因原理

网络讲堂：报告基因的应用及检测实例解析报告基因是基因表达或与基因表达有关的细胞事件的指示者，其与目的基因融合后的表达产物易于被检测。报告基因在分子生物学领域有广泛的应用，报告基因不仅可以用于启动子、增强子和沉默子等顺式作用元件的功能研究，也可与目的基因偶联，使研究者易于观察这些基因的表达。 使用酶标仪/读板机进行报告基因的检测是一种方便、快速、高通量的方式。本期讲堂我们将详细介绍报告基因的应用及检测实例。图1 报告基因原理示意图图2 具有代表性的各种荧光蛋白（作为报告基因的表达产物）扫描下方二维码即刻报名！讲座日期：2018年12月26日周三 讲座时间：10:00-11:00（北京时间） 主讲人：刘虓，高级应用科学家，美谷分子仪器（上海）有限公司 主讲人简介：负责酶标仪及成像产品线的技术支持工作，在酶标仪的使用和应用方面有着多年的丰富经验。

01什么是双荧光素酶报告系统？双荧光素酶报告系统通常是指萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase，F-Luc）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase，R-Luc）组合而成的双报告系统。其中，F-Luc是从萤火虫Photinus pyralis中分离出来的；R-Luc则是从海肾Renilla reniformis中分离出来的。萤火虫海肾这两种酶都能催化底物发光，但它们在进化上的起源不同。因此，他们具有不同的酶学结构和底物要求：F-Luc需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光；R-Luc仅需要腔肠素和氧气。此外，他们发光的颜色不同：F-Luc的光波长为550-580nm；R-Luc的光波长为470-490nm。正是由于这两种酶的底物和发光波长不同，互不干扰，所以在双报告系统中得到广泛应用。发光反应方程式02双荧光素酶报告系统有什么优势？单荧光素酶实验的结果往往会受到各种实验条件（比如，培养细胞的数目和活力的差别，细胞转染和裂解的效率等）的影响，而双荧光素酶实验中，通常以海肾荧光素酶为内参，对萤火虫荧光素酶的检测结果做均一化处理，使得最终的数据更为准确。03双荧光素酶报告系统的应用？一、miRNA与靶标基因相互作用1. 验证microRNA同mRNA靶向互作。将待测mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该microRNA，如果荧光素酶活性下降，则提示为其靶序列。2. 验证microRNA同lncRNA靶向互作。将候选的lncRNA序列插入报告基因载体中的3’UTR区域，再共转入该microRNA，检测荧光素酶活性。二、启动子分析1. 启动子结构分析。将启动子区域序列进行分段截短或对特定位点进行突变，再分别连接到报告载体，荧光素酶活性变化可以指示启动子功能变化。2. 启动子SNP分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用荧光素酶报告系统分析其相对活性。3. 验证特定转录因子同其调控序列的作用。将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因载体，同时在实验细胞中过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高荧光素酶活性。三、信号通路分析将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，荧光素酶活性代表了通路的下游响应。04常用的双荧光素酶载体是什么？载体的选择有两种策略：第一种方案是两种荧光素酶分别位于两个载体上，。海肾荧光素酶常用载体为pRL-TK。萤火虫荧光素酶载体会根据实验需求进行不同的选择，比如启动子荧光分析相关研究可以选用Pgl3-Basic载体，miRNA与靶标基因相互作用的相关研究可以选用pMIR-REPORT载体。pRL-TKPgl3-BasicpMIR-

夏季的夜晚，走到山间草丛，可以看到一种昆虫提着一盏灯在飞行，这就是萤火虫在发光。萤火虫体内的荧光素酶催化底物荧光素，发生化学反应，产生光子。这也是大家比较熟悉的，在动物活体生物发光成像当中运用到的反应原理。通过利用该原理，配合上转基因技术及动物活体成像系统，我们可以非侵入性和纵向研究小动物的基因表达、蛋白质-蛋白质相互作用、肿瘤学机制和抗肿瘤药物药效及动力学和疾病机制等；相比于传统研究手段，这种方法通过在动物整体水平上进行研究，能提供更多有用的信息，同时大幅减少实验研究所需的动物数量和降低个体间的差异。萤火虫荧光素酶反应的示意图(a)、荧光素酶以报告基因的形式进入细胞核，并翻译成功能性酶。该酶将底物荧光素、氧(O2)和三磷酸腺苷(ATP)转化为氧荧光素、二氧化碳(CO2)和二磷酸腺苷(ADP)，同时发光。(b)、萤火虫底物D-荧光素及其产物氧合荧光素的化学结构。 那么问题来了，自然界会发光的生物除了有萤火虫，还有鱼类、藻类、植物和细菌等，这些生物的发光原理是否也和萤火虫一样呢？这些发光原理能否运用到动物活体成像研究中呢？今天，小编就为大家介绍另外一种生物发光原理—细菌发光及其在动物活体成像中的应用。细菌荧光素酶对于细菌的生物发光现象，早在1875年就被发现了，研究人员Boyle首先揭示了细菌发光对氧气的依赖。而随着研究的深入，研究人员发现细菌发光涉及到的酶有荧光素酶、脂肪酸还原酶和黄素还原酶，以及底物还原性黄素单核苷酸和长链脂肪醛。在发光细菌中发现的一种操纵子，基因顺序为luxCDABEG，其中luxA和luxB基因分别编码细菌荧光素酶α和β亚基，luxC、luxD和luxE基因分别编码合成和回收荧光素酶醛底物的脂肪酸还原酶复合物的r、s和t多肽，luxG编码黄素还原酶。到目前为止所知的所有发光细菌，都是基于细菌荧光素酶介导的酶反应来产生光。这是一种大约80kDa的异二聚体蛋白，与长链烷烃单加氧酶具有同源性。该酶通过以下反应介导O2氧化还原的黄素单核苷酸(FMNH2)和长链脂肪族(脂肪)醛(RCHO)，以产生蓝绿光。细菌荧光素酶介导的酶反应1细菌发光明场图2细菌发光发光图细菌发光反应过程在发光反应中，FMNH2与酶结合，然后与O2相互作用，形成黄素-4A-过氧化氢。这种复合物与醛结合形成一种高度稳定的中间体，其缓慢的衰变导致FMNH2和醛底物的氧化和发光，反应的量子产率估计为0.1-0.2个光子。该反应对FMNH2具有高度特异性，体内的醛底物可能是十四醛。FMNH2是由NADH：FMN氧化还原酶(黄素还原酶)提供，该酶从细胞代谢(如糖酵解和柠檬酸循环)中产生的NADH中提取还原剂，还原剂通过自由扩散从FMNH2向荧光素酶的转移。长链醛的合成是由脂肪酸还原酶复合物催化。与细菌荧光素酶一样，底物FMNH2和长链脂肪醛也是细菌发光反应的特异性底物；真核生物生物发光使用不同的化学物质和荧光素酶，它们在蛋白质或基因序列水平上与细菌荧光素酶不同。细菌中的荧光素酶反应过程细菌发光原理在动物活体成像中的应用目前，细菌发光原理在动物活体成像研究中的应用有：传染病研究、菌种抗药性测试及细菌介导的肿瘤治疗等。通过将luxCDABE操纵子稳定地整合到不同的细菌基因结构中，不需要任何其他外源底物(除了氧)来产生生物发光，再通过一套超灵敏的动物活体成像系统(AniView 100)，为监测细菌物种感染负担、致病机理研究和肿瘤药物靶向治疗等提供了一种快速便捷的研究检测方法。AniView 100检测减毒鼠伤寒沙门氏菌体内靶向性肿瘤情况(箭头指向为肿瘤)应用说明如以细菌介导的肿瘤治疗为例，传统的癌症治疗方法是手术切除，治疗转移性癌症还需要与其他疗法(如放疗或化疗)相结合。这些疗法存在局限性，如放疗的疗效主要取决于组织氧水平，肿瘤内坏死区和缺氧区低氧浓度是治疗失败的常见原因；而化疗的疗效主要取决于药物的分布，肿瘤内坏死区和缺氧区的血管不规则会影响药物的输送，限制药物的疗效。与传统方法相比，使用细菌进行癌症治疗有以下优势：首先，细菌会在肿瘤中选择性积累，肿瘤中的细菌聚集量大约是正常器官的1000倍，肿瘤特有的坏死区和缺氧区一般不会在大多数器官中形成。其次，细菌的增殖能力使得它们可以进行持续治疗；最后，许多细菌的全基因组测序已经完成，能够通过基因组操作提高它们在人类使用中的安全性，并增强其杀瘤效果。目前，细菌介导的肿瘤治疗广泛应用于DNA或siRNA的传递、运送经工程改造的毒素或前药物和触发机体免疫反应，进而达到抑制或杀灭肿瘤细胞、起到抗击肿瘤的作用。应用案例 静脉注射3天后，表达lux的鼠伤寒沙门氏菌在各种肿瘤中积聚。CT26：小鼠结肠癌，4T1：小鼠乳腺癌，MC38：小鼠结直肠腺癌，TC-1：小鼠肺癌,Hep3B：人肝细胞癌，ARO：人甲状腺癌，ASPC1：人胰腺癌应用案例 携带受L-阿拉伯糖诱导启动子pBAD表达系统控制的细胞毒蛋白(溶细胞素A)、表达lux报告基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌，用于肿瘤治疗。总结利用生物发光原理进行动物活体成像，目前主要有两种方式。一种是使用萤火虫荧光素酶，最适合在哺乳动物细胞中表达；另外一种是细菌荧光素酶，广泛应用于原核生物。细菌Lux操纵子由于编码生物发光所需的所有蛋白质，包括荧光素酶、底物和底物生成酶，不需要外源底物，成像更加的方便，不需要像萤火虫荧光素酶一样，考虑ATP的可用性、底物分子的渗透、药代动力学和生物分布等对成像的影响。但是，细菌荧光素酶的发射波长较短(490nm)，组织吸收较大，这会影响成像数据的量化；而且，对于某些真核微生物(包括真菌和寄生虫)和真核细胞，仍然需要使用萤火虫荧光素酶标记，原因在于lux报告基因没有得到足够的优化，还不能在真核细胞中稳定表达。不过由于细菌荧光素酶和萤火虫荧光素酶的发射波长不同，从而可以进行多光谱成像，用于同时定量评估小动物的不同生物过程，进一步扩展生物发光原理在动物活体成像中的应用。TipsAniView 100多模式动物活体成像系统 AniView 100多模式动物活体成像系统作为广州博鹭腾生物科技有限公司推出的高灵敏度动物活体成像系统，其采用全密闭抗干扰暗箱，避免外界光源及宇宙射线对拍照影响的同时，配合零缺陷、科研级高灵敏背部薄化、背部感应型冷CCD相机，极大地提高成像的灵敏度。AniView 100可以检测到100个luciferase标记细胞，对于动物活体细菌荧光素酶的生物发光信号，无论是在皮下或器官，均可以轻易检测到。快来关注我们，申请免费试用！

活体光学成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物发光（bioluminescence）技术与荧光（fluorescence）技术。生物发光是用荧光素酶(Luciferase)基因标记细胞或DNA，今天，生物发光标记物可以标记到任何一种基因上，使对基因功能的全面细致研究成为现实。而荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP, Cyt及dyes等）进行标记，利用荧光蛋白在外源光源或是内源发光照射下被激发产生的荧光作为检测信号。研究人员能够利用一套非常灵敏的光学检测仪器直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为。 该技术可被广泛应用于标记细胞或基因的示踪及检测；基因治疗在活体动物体内直接的观察和检测；基因组、蛋白组学、药学及生物技术在活体动物内的研究；药物及化学合成药物的药物代谢及毒理学监测；食品菌落生长成像；皮肤医学中皮肤疾病的体内成像；法医鉴定；微孔板成像，例如：免疫分析、报告基因、基因探针和嗜菌作用分析等；荧光团的体内成像，例如：Alzheimer疾病研究中结合嗪的β-淀粉沉淀物分析；转基因植物中通过报告基因对生理周期节奏的研究；凝胶成像分析等等。 但在研究过程中，研究者们必须事先用基因技术进行荧光素酶基因标记，或者某种荧光报告基团标记。目前活体光学成像系统的知名制造商，如Berthold、GE、Xenogen、Photometrics、Carestream Health等，不仅为客户提供先进的仪器，也提供具体实验所需的整套解决方案，包括试剂、实验手册、特殊用途的质粒、细胞株、转基因动物、细胞处理和动物处理设施等配套技术支持。出色的多任务处理能力，人性化的整体设计，便捷精确的操作系统，使实验室影像分析领域进入了一个全新的时代。 下面以研究干细胞活体移植后的存活率为例，简介一两种内源性荧光色素标记的实验方法，供专业人士参考。 用荧光色素DiD标记 间充质干细胞 1. 先用胰蛋白酶消化待标记材料，使之成为一定密度的悬浮液； 2. 从细胞培养箱中取出间充质干细胞，吸取含原有培养基的细胞悬浮液进行标记； 3. 用10 ml Mg/Ca-free PBS （不含钙镁离子的磷酸缓冲液）清洗细胞，吸去PBS， 钙镁离子会影响胰蛋白酶的活性，必须小心； 4. 加入预热的0.05% 胰蛋白酶液，加液量以T75型瓶为例，每瓶加5ml， 确保瓶的表面被完全覆盖； 5. 在细胞培养箱中37° C 孵育约 5 分钟； 6. 然后在显微镜下确认细胞已经完全分散，如果有细胞贴壁情况，轻拍若干次或延长孵育时间直至酶解消化完全成功； 7. 加入等量含 10% FCS的培养基中和胰蛋白酶； 8. 用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散； 9. 然后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中； 10. 400 RCF离心5 分钟； 11. 小心移去上清液，不要扰动细胞； 12. 将细胞重新悬浮于DMEM 并进行计数； 13. 需要待标记细胞在无血清DMEM溶液中的密度应为1x106 /ml ； 14. 每ml细胞悬浮液加入5 ?L DiD 染色液； 15. 用移液器将染色液与细胞悬浮液混合均匀； 16. 在6孔低附着性细胞板上37 °C 孵育20分钟； 17. 孵育完全后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中； 18. 400 RCF离心5 分钟； 19. 小心移去染色液，不要扰动细胞； 20. 用PBS清洗细胞，用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散； 21. 重复洗三次； 22. 细胞重新计数并用台盼蓝染色法检测细胞活性； 23. 可以进行活细胞成像了！ 用荧光色素ICG标记 人胚胎干细胞 1. 必须先准备好吲哚菁绿溶液（血容量、心输出量、肝功能测定剂）作为对照品 ，然后使之与转染试剂鱼精蛋白（抗凝血作用）混合； 2. 测出1ml吲哚菁绿溶液的活力，然后在100 ?L DMSO中溶解ICG； 3. 向混合物中加入 400 ?L Dulbecco的改良Eagles 培养基 (DMEM + 10% 胎牛血清)， 震荡均匀，吲哚菁绿溶液终浓度为2mg/ml； 4. 加入转染试剂鱼精蛋白，鱼精蛋白作为对照品的载体，使之能够有效进入细胞； 5. 在300 ?L ICG 和 300 ?L 无血清Dulbecco改良 Eagles 培养基中混入 5 ?L 硫酸鱼精蛋白溶液, 使之终浓度为 10mg/ml,； 6. 震荡5分钟使之形成复合物，标记溶液制备完毕； 7. 从 hESC 10mm Petri 培养皿中移去原有培养基； 8. 加入5ml预热的 DMEM； 9. 加入制备好的鱼精蛋白/ICG 溶液， 37 °C下孵育1h； 10. 孵育完全后移去染色液； 11. 用5 ml PBS漂洗培养皿以清除染色液； 12. 移去 PBS 再加入 5ml 0.25 % 胰蛋白酶液，37 °C下孵育5分钟使之酶解，适当震摇培养皿效果会更好； 13. 用移液器反复吸取几次确保细胞均匀分散； 14. 加入等量含 10% KSR的培养基中和胰蛋白酶； 15. 然后移取细胞悬浮液至15ml 已灭菌的有盖聚丙烯离心管中，400 RCF离心5 分钟； 16. 在全培养基中悬浮细胞； 17. 如果还有细胞团块，可以移去原有培养基用10ml预热的全ESC培养基重新悬浮细胞，重复酶解再离心； 18. 在这一点上，鼠源饲喂细胞需从hESCs中分离； 19. 然后将细胞悬浮液移至涂布琼脂的10 cm 培养皿中； 20. 37 °C 孵育 45 分钟，注意不要晃动培养皿，如此鼠源饲喂细胞会贴壁而干细胞保持悬浮； 21. 从Petri 培养皿中移出已标记的单细胞人胚胎干细胞悬浮液； 22. 细胞重新计数并用台盼蓝染色法检测细胞活性； 23. 可进行活细胞成像了！

前言：生物发光是一种在生物体内由酶将化学能转化为光能的现象，在自然界中有超过30种生物发光体系，而我们所熟知的萤火虫的发光体系就是其中研究最早，应用也最广泛的一种。萤火虫的发光现象是由其体内的萤光素酶（luciferase）的催化下三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)与发光底物萤光素（lucierin）发生反应产生光。ATP被认为是一种在所有生物体生存和繁殖的细胞合成中必不可少的普遍能量来源，形象的说，它是一种通用的能量“货币”。ATP可以通过水解产生AMP和一个磷酸基团，同时释放出能量，供给细胞活动。ATP结构图发光反应的方程式：研究历史：1885年萤光素及萤光素酶第①次被Dubois提取出来；1952年Strehler和Totter首次使用萤光素酶粗制品测定ATP；1961年White等人工合成了萤光素；1985年Dewet, JR等首次克隆了P. Pyralis萤光素酶基因并在大肠杆菌中表达，从中得到具有活性的萤光素酶，从而开启了萤光素酶作为报告基因的历程。ATP的含量直接反应了细胞或微生物的含量，通过监测ATP含量的改变，可以评价多种药物、生物制剂或生物活性物质引起的细胞杀伤、细胞抑制和细胞增殖作用；另外ATP也常作为微生物污染的一个指标，检测ATP含量能直接反映出其受污染程度。测定生物体中ATP的水平及其动态变化便成为监测生物体必不可少的手段。接下来，小编将向大家具体介绍一下他在近年来的应用领域。应用领域01食品安全人类的身体健康、生命安全长期受到微生物污染的威胁，营养琼脂平板计数法是国际上针对微生物检测的现有标准方法，然而该方法要求在 37 ℃下持续培养 48 h，过于繁琐的操作无法实现快速检测。现下，国内也加大了对核酸法、电阻抗测量、免疫学方法、微菌落技术等各类微生物快速检测技术展开了研究、应用。ATP生物发光法因快速、简便且具有较高灵敏度的缘故，可用于实时监控微生物污染，与食品行业需求相符合，故而有关该技术的研究与应用十分广泛。其检测步骤通常为：①首先根据ATP发光检测试剂盒的使用说明将标准ATP按梯度稀释，与酶、底物、缓冲液按比例混合，使用发光检测设备（比如博鹭腾发光检测系列）测量对应的发光值，绘制标准曲线。②提取样品细胞中的ATP，稀释，之后按比例与酶、底物、缓冲液混合，使用发光检测设备测定发光值，代入标准曲线，即可知道样品中ATP浓度。（ATP浓度与细胞浓度关系的测定：取对数生长期的细胞，离心浓缩后用苔盼蓝染色，计活细胞数，之后在 96孔培养板上等比稀释，测定其发光值，发光值代入标准曲线获得ATP浓度，经过计算即可获得ATP浓度与细胞浓度关系。）应用案例：酒类制作过程中微生物浓度检测食品生产线卫生学检测环境保护部门水体微生物检测卫生监管部门微生物数量检测对应文献：[1]吴慧清.ATP生物发光法饮用水中细菌总数快速测定方法研究[J].中国卫生检验杂志,2009,19(9):1975-1978.[2]刘阳,牟金明.ATP生物发光法快速测定物体表面的菌落总数[J].安徽农业科学,2016,44(1):125-128.[3]易琳.微生物检测中 ATP 生物发光法的应用研究现状[J].生物化工,2019,5(1):124-126.[4]高红阁.ATP 生物荧光法在卫生监督工作中的应用进展[J].疾病监测与控制杂志,2013,7(9):548-550.[5]伍季.ATP生物发光法快速检测啤酒中的菌落总数[J].河南科学,2006,24(1):63-65.[6]李春艳,霍贵成.ATP生物发光法快速测定生乳中微生物总数的研究[J].食品工业科技,2008,29(7):233-238.[7]魏树源.三磷酸腺苷生物发光快速微生物检测法在疫苗中间品无菌试验中的应用[J].中国生物制品学杂志,2010,23(10):1120-1124.[8]丛苑,李平兰.ATP 发光法快速检测玉米中的霉菌[J].中国食品学报,2014,14(8):233-238.02药物敏感实验化疗是恶性肿瘤主要治疗手段之一，其地位已越来越重要。但因为不同类型的肿瘤以及不同个体的同类肿瘤存在异质性，以致惯用的经验式化疗效果尚不理想。临床上迫切需要有切实可靠的检测方法，在化疗实施前筛选出有效药物，进行个体化治疗，以提高疗效而减少毒副作用。ATP生物发光法是近年来发展起来的一种高度敏感的药物敏感试验。文献表明 ,将ATP生物发光法应用于临床个体肿瘤药物敏感性的预测，与临床有较好的相关性。基本思路为：①将癌细胞与药物体外混合培养一段时间。②与食品安全检测类似：绘制发光标准曲线→测定与药物混合培养细胞的发光值→代入标准曲线，最 后计算出药物对肿瘤的杀伤强度。应用案例：化疗药物筛选结核药物筛选细胞活性测定

一起涨“姿势”——那些年在我们身体里的基因表达近年来，阻碍人类健康长寿的第一大杀手就是疾病，例如癌症，是目前最难攻克的疾病之一。疾病研究和药物开发也一直是生命科学领域的专家学者不断攻克的领域。而目前的研究显示，人类的大多数疾病都会与细胞因子表达异常引起信号通路异常有关。报告基因对于基因表达的研究来说是非常有用的工具，它可以代替要研究的目的基因，从而帮助我们了解目的基因的信号通路和相关的疾病。荧光素酶是最常用的报告基因，使用光度计和化学发光功能的微孔板读板机我们可以很容易的检测到荧光素酶，另一方面，由于在细胞实验中其背景较低，因此具有很高的灵敏度。我们通常用萤火虫荧光素酶表达水平高低反映出我们感兴趣的基因在系统中的地位。而海肾来源的荧光素酶则更常在多荧光实验中作为第二种报告基因，来规范化多种在不同样本中变化较大的指标如转染效率，细胞活力等。NF- κB是参与细胞进程中许多基因表达的“主要调节者”，如炎症，免疫，分化，增殖和凋亡。肿瘤坏死因子α (TNF- α)可以激活细胞信号通路来降解NF- κB的抑制剂，从而促使其释放并进入核内，调节数百目的基因的表达。NF- κB通路的紊乱可以诱发多种疾病，如多发性硬化病，糖尿病，阿尔兹海默病等，因此利用合适的工具加深我们对NF- κB通路的理解是十分必要的。图1 NF-κB信号通路。TNF-α激活信号层级反应使NF-κB抑制剂IKB降解，并释放NF-κB转录因子。（了解更多资料请咨询美谷）SpectraMax® DuoLuc™ Reporter 试剂盒可以对哺乳动物细胞中的萤火虫和海肾荧光素酶进行高灵敏度的定量。依次向微板孔中加入两种适量的反应试剂即可检测荧光。这种双荧光信号检测系统可以在归一化检测荧光信号(萤火虫荧光)的同时提供持续表达的对照荧光信号(海肾荧光)。运用SpectraMax® iD5 多功能微孔板读板机、注射器系统和 SmartInject™ 技术可以将实验条件最优化。在这里我们将展示如何在哺乳动物细胞模型中， 通过双荧光报告检测系统和SpectraMax iD5 微孔板读板机来检测核转录因子κB (NF- κB)的活性。

双相情感障碍（Bipolar disorder，BPD）是常见的重性精神障碍。流行病学发现，BPD具有较高的发病率和死亡率。研究表明，BPD的发生与遗传和环境因素有关。BPD的遗传力为80%左右，表明遗传因素在BPD的发生中起主要作用。全基因组关联研究（GWAS）已报道许多BPD风险基因座（loci）。然而，这些风险基因座内的遗传变异如何影响BPD的易感机制尚不清楚。利用功能基因组学研究方法，中国科学院昆明动物研究所研究员罗雄剑和李明课题组合作，探究BPD风险遗传变异的调控机制。研究整合人类脑组织（或神经细胞系）的染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）数据和位置权重矩阵（position weight matrix，PWM）数据，鉴别到16个影响转录因子结合的BPD风险遗传变异。研究通过双荧光素酶报告基因、等位基因特异性表达分析、转录因子敲低、CRISPR/CAS9介导的基因编辑等功能实验，探索了这些功能遗传变异的调控机制。进一步表达数量性状基因座分析揭示了受这些功能性遗传变异调控的潜在靶基因。此外，科研人员通过研究PACS1（已鉴定的功能性SNPs rs10896081和rs3862386调控的潜在靶基因）对树突棘的调控，发现在小鼠原代皮层神经元中过表达PACS1会影响树突棘的密度，提示该基因在BPD中潜在的生物学机制。上述结果提示，这些遗传变异可能通过影响转录因子结合，进而调控双相情感障碍易感基因的表达，最终导致双相情感障碍的发生。该研究系统性地从GWAS鉴别到的BPD风险遗传变异中识别出具有功能后果（或潜在致病）的功能性遗传变异，并解析这些功能性遗传变异的调控机制。此外，该研究将功能性遗传变异与其潜在靶基因联系起来，对功能性遗传变异和候选基因的进一步功能鉴定和机制研究将有助于阐明BPD的遗传机制和致病机理，从而为BPD的治疗提供新的潜在靶点。相关研究成果以Functional genomic analysis delineates regulatory mechanisms of GWAS-identified bipolar disorder risk variants为题，在线发表在Genome Medicine上。研究工作得到国家自然科学基金、云南省杰出青年基金、中科院“西部之光”人才培养计划创新团队项目及云南省重点研究项目的支持。 　　论文链接 双相情感障碍风险功能遗传变异rs10896081可能通过影响与PBX3转录因子结合调控PACS1基因表达

捷克共和国昆虫研究所（ENTU）的科学家们利用Tecan Infinite® M1000多功能酶标仪，以小时为单位对转基因果蝇进行自动化发光检测，以此来研究昆虫的生物钟。该研究所David Dolež el博士说，&ldquo 我们正利用含有荧光素酶报告基因的转基因果蝇对其昼夜节律钟基因的表达进行研究，而此荧光素酶报告基因的启动子也仍处于研究阶段。于是，我们需要一台配有不同滤光片且具有发光检测模块的多功能酶标仪，准确区分红色和绿色荧光素酶，从而帮助我们跟踪研究每一个微孔中的同效基因。当然，为了保证全天候的定时检测，此酶标仪需要具备自动转板功能。&rdquo David博士进一步解释道：&ldquo Tecan Infinite® M1000酶标仪结构紧凑，能够非常方便地放置在我们实验室的培养箱内，这样一来，我们就能精确控制光亮与温度，研究环境变量对实验产生的影响。此外，Infinite® M1000的微孔板型允许我们同时在酶标仪中加载上数百只转基因果蝇，对突变的果蝇细胞进行大批量筛选，在两周内非常顺利地完成了数百次检测。总而言之，Infinite® M1000酶标仪优异的表现及使用高度灵活性让我们印象非常深刻。&rdquo 典型基因模型D. melanogaster（左），与家蝇（Musca domestica）对照图 更多有关Tecan Infinite® M1000酶标仪的信息，请访问以下网址或咨询Tecan当地员工/经销商：www.tecan.com/infinitem1000 关于帝肯： 瑞士帝肯www.tecan.com是全球领先的生命科学与生物制药、法医和临床诊断领域自动化及解决方案供应商。公司成立于1980年，总部设在瑞士Mä nnedorf，分别在瑞士、北美和奥地利设有自己的研发和生产基地，目前公司主要经营的产品有三大类：全自动化液体处理平台( Liquid Handling&Robotics )、多功能酶标仪（Multimode Reader）和OEM组件；销售服务网络遍布世界52个国家，客户覆盖制药企业、生物技术公司、科研院所、法医、医院、血站系统和疾病控制中心（CDC）等。其液体处理技术已拥有行业经验30年，在全球处于领先地位，备受世界领先生命科学实验室的青睐。 帝肯（上海）贸易有限公司是瑞士帝肯集团公司亚太区总部，2008年4月成立于上海浦东。帝肯（上海）目前拥有一支专业的售前和售后服务团队，在科研、医院、血站和CDC领域构建了良好的经销网络，并以&ldquo 力求比客户期望做得更好&rdquo 的服务理念，给广大终端用户提供专业的服务。 市场部：Libby Zhu Tel: 021 2206 3206 / 010 8511 7823 Fax: 021 2206 5260 / 010 8511 8461 infotecancn@tecan.com www.tecan.com

CRISPR/Cas9被誉为“基因魔剪”，是基因编辑的利器，在基础研究、农业育种和基因治疗等领域得到了广泛应用。但是CRISPR/Cas9工具还存在很多局限，常用的SpCas9编辑范围广，活性高，但是其基因较大，给病毒载体递送带来困难。常用的SaCas9基因小，但是编辑范围小。其他Cas9活性低，应用较少。为了找到理想的Cas9工具酶，复旦大学王永明课题组建立了大规模筛选Cas9的平台，对自然界中数百种Cas9进行系统性筛查。2020年该课题组筛选到了SauriCas9，具备活性高、编辑范围广、基因小等优点，但是精准性不理想，介于SpCas9和SaCas9之间。2021年3月15号，王永明课题组联合王红艳和李继喜课题组，在 Nucleic Acids Research 杂志发表了题为：Discovery and engineering of small SlugCas9 with broad targeting range and high specificity and activity 的研究论文。研究团队经过鉴定和改造，开发出了SlugCas9-HF工具酶，性能突出，它识别简单的NNGG PAM，具备活性高、精准性高、编辑范围广、基因小等优点。研究团队同时还开发出ShaCas9、SlutrCas9、Sa-SlugCas9等工具。为了方便研究人员选择合适的工具酶使用，作者对本团队开发的7种工具酶和SaCas9的活性和精准性进行了比较。综合看，SlugCas9-HF在编辑活性、精准性和编辑范围都具有优势。在12个内源位点对8个工具酶活性进行比较该研究的第一作者胡子英博士兴奋地说：“我们后继工作对SlugCas9-HF和SpCas9的活性进行了比较，它们活性没有差异。也就是说SlugCas9-HF兼具了SpCas9和SaCas9的优点。这是我们一直寻找的理想工具酶，它在很多场景都可以取代SpCas9和SaCas9。我们还找到很多有优点的工具酶，将陆续与同行分享。”利用GFP报告基因对8个工具酶在脱靶位点的编辑效率进行比较。在脱靶位点编辑效率越低精准性越高。胡子英博士和张成东博士是论文的共同第一作者，王永明教授、王红艳教授和李继喜教授是论文的共同通讯作者。跟着我们涨知识！由仪器信息网举办的第五届PCR技术网络会议将于4.14日-4.16日举行，我们特别邀请到王永明老师给我们讲诉这把神奇的基因魔剪，大家千万不要错过噢~点击此处即可报名听会！

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clamp)等技术的发明和有效使用，得以使科学家在亚微米空间尺度(单个神经突触连接)，亚毫秒时间尺度(单次神经冲动电位)对神经元的功能进行研究。而最令人激动人心的是，近几年来蓬勃发展的光学显微成像技术，给实验神经科学带来了很多前所未有的思路和成果。2008年钱永健等人由于荧光蛋白(GFP，绿色荧光蛋白)的发现和使用，获得了诺贝尔化学奖，是对荧光成像技术的一次巨大肯定和推动。光学成像本身具有高分辨率、高通量(高速)、非侵入、非毒性等特点，再与荧光蛋白以及荧光染料等标记物在细胞中的定位与表达技术相结合，使得科学家可以特异性的分辨生物体乃至细胞内部不同结构与成分，并且能够在生命体和细胞仍具有活性的状态下(活体状态)对其功能进行动态观察。这就使得荧光成像技术成为了无可替代的，生物学家现今最为重要的技术手段之一。而随着近些年来各种新型的显微技术的出现，共聚焦显微镜(confocal microscopy)，相干拉曼成像(CARS)，超分辨率显微技术(super-resolution microscopy)，光片显微技术(lightsheet microscopy)等使得荧光显微镜的分辨率，速度，成像深度等进一步提高。 /p p 　　对于荧光成像技术在神经科学中应用，离不开双光子荧光显微镜(Two-photon Microscopy，简称TPM)1。目前，大多数细胞生物学，生理学研究主要还是在离体培养的细胞体系中研究。然而与细胞生物学研究有所不同的是，大脑的功能研究的整体性和原位性显得更加关键：仅研究分离的神经元无法解释神经系统的功能和规律。换句话说，必须要求神经元处在其正常生存的大脑环境中才能使其正常运转。然而，大脑是一个高度复杂的器官。即使是小鼠的大脑皮层也有将近1mm的厚度，海马，丘脑等深脑区核团更是深达3-5mm2，而且并不透明，充满了数以亿计的神经元胞体和突触，此外还有丰富的血管，粘膜(脑膜)，最外层还有厚厚的颅骨和头皮包裹。使用包括共聚焦显微镜在内的传统的荧光显微镜，由于被观测的信号会受到样本组织的散射和吸收，根本无法穿透如此深的组织进行成像。而双光子显微镜的发明，则为此类研究带来了希望。双光子显微镜特有的非线性光学特性，再加上其工作波长处在红外区域等特点，令其在生物体组织内的穿透深度大大提高3，使得双光子显微镜成为神经科学家进行活体神经成像最理想的工具。神经动作电位(action potential)本身很难被光学信号捕获，但是动作电位产生的去极化会引起神经元Ca2+浓度的变化(钙内流现象)。科学家已经开发出多种Ca离子浓度的荧光探针，进而通过这种钙离子浓度的变化引起的荧光信号的变化来反映出神经活动。于是，双光子显微镜与在体的神经元Ca离子浓度指示剂标记技术相结合，碰撞出了耀眼的火花: 使得人们可以研究处于生理状态时的动物大脑内的神经元活动4。 /p p 　　大脑的最重要功能是对生物体的行为活动进行调控，而反过来，最能反应大脑工作状态的同样是生物体的行为活动。所以说，为了了解大脑，研究者不仅要求在体状态下对神经元进行高分辨率观测，而且也希望生物体在被观测的阶段里，能够进行正常的行为活动。所以，在成像技术不断地提高分辨率和速度等性能的同时，科学家们也在积极开改进和革这些成像技术手段，使其进行成像时尽可能小的限制被观测对象的行为活动，以求得到最接近生理状态下的数据。但是这一目标始终存在诸多的技术瓶颈: 以啮齿类动物(大鼠或小鼠)神经元的双光子钙成像为例。早些年由于动物身体运动产生的晃动剧烈，而当时双光子显微镜成像速度又很低，所以科学家只能在麻醉状态下对头部固定的动物进行成像。后来随着成像速度的提高，并且对开颅手术技术的很大改进，使得科学家可以在清醒状态下对动物的神经活动进行观察(仍然需要头部固定)。近些年来，随着基因改造技术的突飞猛进，通过病毒转染和转基因技术，在神经元内源性表达“基因编码类钙指示剂(genetically encoded calcium indicator, 简称GECI)”成为神经元钙成像的大趋势4。这种由神经元自身产生钙指示剂的方法与之前的钙染料技术相比有着巨大的优势: 信噪比提升了一个数量级 对神经元特异性好，可以区分不同的神经元类型 并且可以在大脑神经元内持续表达数月(病毒转染)甚至整个生命历程(转基因动物)。于是，大概10年前开始，科学家就开始利用双光子成像结合GECI技术对神经元的活动和结构变化进行长期的观测和追踪，从而对记忆的形成，神经元病变等问题有了更深入的认识。其中，现在性能最好，使用最为广泛的GECI为绿色荧光钙调蛋白Gcamp家族4。目前已经改进到第六代，Gcamp6f，Gcamp6f已经成为神经成像里最受欢迎的指示剂之一。目前科学家最流行的对小动物行为过程中大脑活动进行成像的方法，是将虚拟现实与双光子成像相结合，在动物头部被固定的情况下，在其眼前制造影像，让动物认为自己处在”真实“的环境之中5。通过小鼠四肢在类似跑步机或者鼠标滚球上的运动来模拟其真实活动。以求达到研究神经元在动物行为中所起到的作用(如图1)。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201706/insimg/e167bfbc-be4e-4b26-aa38-6f15b1fdca08.jpg" title=" 1.png" width=" 600" height=" 429" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" style=" width: 600px height: 429px " / /p p style=" text-align: center " 图1 双光子成像结合虚拟现实场景，对头部固定，身体活动的动物进行研究。图片来自 sup 5 /sup /p p 　　然而，这种虚拟现实加头部固定成像的方法，已经遭到许多科学家的质疑。人们认为，头部固定的动物在实验期间一直处在物理约束和情绪压力下，因此无法证明神经元对外界的响应在虚拟现实和自由探索下是等价的。更重要的是，许多社会行为，比如亲子护理，交配和战斗，都不能用头部固定的实验来研究。如何在动物自由活动的时候，直接对其神经元进行成像，是神经科学家还未能得到解决终极的诉求。 /p p 　　一个理想的解决方案是开发微型荧光显微镜直接固定在自由活动的动物身上，让动物“带着显微镜跑”6。这种尝试大概从20年前开始。起初，科学家只是将一根或几根光纤插到小鼠头上，用以激光导入和荧光信号采集。然而，这种方式而只是记录某个区域内信号的总和，不具有空间分辨率，算不上真正意义上的成像。在最近的十几年里，由于光学，电子，材料技术的发展，人们开始尝试研制真正意义上的微型显微镜。其中，微型单光子宽场显微镜(miniature wide-field microscope)，由于其原理与结构相对简单，是目前人们主要尝试研制的微型显微镜技术。例如由Ghosh及其同事开发的显微镜，通过将小型LED光源，微型CCD和自聚焦透镜整合到一个小于25px3的框架之中，研制出了一个重量为1.9g的微型宽场显微镜。该技术被用于研究大脑海马区place cell等与记忆和本能相关的实验当中7。然而，宽场成像方式由于不能很好的对离焦区域的背景信号进行过滤，并且对光的散射敏感，所以其无法达到细胞分辨率。更难以对更精细的诸如树突，轴突，树突棘等结构进行观察。所以一直难以达到神经科学家满意。 /p p 　　于是，从大概15年前开始，世界上一些研究和开发双光子成像技术的研究组开始尝试将双光子显微镜这种在神经成像领域已经获得广泛应用的技术进行微型。然而，目前只有为数不多的几个课题组报道了他们在微型双光子显微镜研制方面的进展: 在2001年，Denk等的工作被认为是研制微型双光子显微镜的第一步8。然而，它仍然太过“巨大”(长7.5厘米，重25克)，而且成像速度很慢(2 Hz 128x128的尺寸下速度为2 Hz， 512x512的尺寸下为0.5 Hz，如图2a)。之后，其他一些课题组相继报道了不同的微型双光子系统。 Helmchen课题组在2008年报道了他们的微型双光子系统，仅重0.9克9。它实现了512X512幅面下的8 fps的成像速度速度，并展示了利用该系统实现的大鼠在体钙成像信号。然而，从展示的效果来看，其空间分辨率极低，而且并没有实现真正的自由运动下的成像(如图2b)。Mark Schnitzler课题组在2009年也发表了他们的微型双光子系统10。他们的系统首次使用了微机电扫描镜(MEMS)来进行扫描，并将Z聚焦模块集成在了探头之中(如图2c)。但是扫描频率仍然很低(400x135约为4Hz) 空间分辨率也远远达不到要求(横向1.29 μm，轴向10.3 μm)。这些方面限制了其在神经元细胞核亚细胞水平成像中的应用。 Kerr课题组在2009年展示了它们的系统11，跟之前的微型双光子显微镜相比较，由于应用了微型透镜组构成的微型物镜(NA达到了0.9)，这套系统的空间分辨率更高。然而，这套探头的重量也随之提高(5.5g)。此外，由于其仍然使用振动光纤的方式来进行扫描，所以其成像速度仍然比较慢。(对于64x64为10.9Hz，对于理论上的512x512为1.25Hz)(如图2d)。此外，还有一个之前所有的微型双光子系统都没有解决的问题。由于微型双光子显微镜一般需要利用光纤将飞秒激光导入到探头之中，而光纤由于存在诸如色散、截至模式、导通带宽等一系列限制，所以某一款光纤一般只允许一定带宽(一般为几十纳米)和特定中心波长的光传播。那就需要在制作微型显微镜的时候，结合使用的荧光指示剂所需要的激光波长对光纤进行选择。但是，目前商业化的，可以用来进行飞秒光传输的空心光子晶体光纤(hollow-core Photonic Crystal Fiber， HC-PCF)种类非常有限。例如，全球最大的光子晶体光纤生产商NKT公司仅提供中心波长为800nm，1030nm，1300nm和1550nm的HC-PCF。所有现有的微型双光子显微成像系统都是基于这几款光纤所限定的中心波长进行开发的。但是很遗憾的是，本文上述所提到的目前最广泛使用的GcamP指示剂需要920 nm的激光进行激发。所以先前的所有微型双光子都不能对Gcamp进行有效的成像。这限制了微型双光子显微镜的发展。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201706/insimg/4c1d7c1d-53eb-4a41-96d0-98ecb5ebda8d.jpg" title=" 2.png" / /p p style=" text-align: center " 图2 微型双光子发展史上的几个典型工作。a、b、c、d分别选自参考文献 sup 8、9、10 /sup 和 sup 11 /sup /p p 　　之所以这些早期的微型化双光子显微镜都无法得到真正的使用和推广，其原因在于，若要制造出具有实用价值的微型双光子显微镜，比研制单光子微型显微镜复杂和困难的多得多。微型双光子显微镜需要需要解决如下几个关键技术难题： /p p 　　1 如何将飞秒激光有效的导入微型显微镜 /p p 　　2 如何在微型显微镜内进行扫描/图像重建 /p p 　　3 如何在微型显微镜中进行高质量的激光汇聚，高效激发双光子信号。 /p p 　　4 如何有效的对荧光信号进行收集 /p p 　　5 如何使整个系统在动物剧烈运动时仍保持稳定 /p p 　　6 在满足前5项条件下，重量是否足够轻，以致尽量小地对动物的活动造成影响 /p p 　　本文作者所在的课题组，是由北京大学分子医学研究所、信息科学技术学院、动态成像中心、生命科学学院、工学院联合中国人民解放军军事医学科学院组成跨学科团队。我们在程和平院士的带领下，在国家自然科学基金委国家重大科研仪器研制专项《超高时空分辨微型化双光子在体显微成像系统》的支持下，历经三年多的协同奋战，成功研制了新一代高速高分辨微型双光子荧光显微镜，并将其取名为FHIRM-TPM。原始论文于5月29日在线发表于自然杂志子刊Nature Methods (IF 25.3)12。在这项成果中，我们解决了上文所提及的早先微型化双光子显微镜研制中存在的问题，获取了小鼠在自由行为过程中大脑神经元和神经突触活动清晰、稳定的图像。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201706/insimg/0418a0a6-f357-4e18-91b0-ef1c23d670bd.jpg" title=" 3.png" width=" 600" height=" 470" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" style=" width: 600px height: 470px " / /p p style=" text-align: center " 图3 FIRM-TPM示意图，来自 sup 12 /sup /p p 　　新一代微型双光子荧光显微镜体积小，重仅2.2克，适于佩戴在小型动物头部，通过颅窗实时记录数十个神经元、上千个神经突触的动态信号。在大型动物上，还可望实现多探头佩戴、多颅窗不同脑区的长时程观测。相比单光子激发，双光子激发具有良好的光学断层、更深的生物组织穿透等优势，所以成像质量远优于目前领域内主导的、美国脑科学计划核心团队所研发的微型化宽场显微镜。其横向分辨率达到0.65μm，与商品化大型台式双光子荧光显微镜可相媲美 采用双轴对称高速微机电系统转镜扫描技术，成像帧频已达40Hz(256*256像素)，同时具备多区域随机扫描和每秒1万线的线扫描能力。最为重要的是，FHIRM-TPM克服了先前限微型双光子显微镜应用的两个障碍。首先，我们定制设计的HC-PCF为 920纳米飞秒激光脉冲提供了无畸变传输，这种改进让有效的激发例如Thy1-GFP和GCaMP-6f等常用荧光指示剂成为可能。第二，由于双光子点扫描显微镜的高空间分辨率和层切能力，安装到动物头上的微型双光子显微镜非常容易受到运动伪影的影响。为了解决这个问题，我们对整个系统进行了充分的优化：(a)使用柔软的新型光纤束SFB来使得动物运动引起的扭矩和拉拽力最小化，并不降低光子收集效率 (b)采用独立的可旋转连接器来连接光学探头上的光纤和电线，以使动物在自由探索期间线的扭曲和缠绕最小化 (c)使用高速成像以减少运动引起的帧内模糊。此外，我们在实验之前预先训练动物适应安装在其头骨上的微型显微镜，并滴加1.5%低熔点琼脂糖使其充满物镜和脑组织之间，这些措施都显著降低了探头与大脑之间的相对运动，进而改善了实验短期和长期的稳定性，于是实现了在动物进行包含大量身体和头部运动的行为学试验中中进行高分辨率成像。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201706/insimg/0d8849db-62d7-4fdd-b7e0-4e572b3a1b03.jpg" title=" 4.png" width=" 600" height=" 437" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" style=" width: 600px height: 437px " / /p p style=" text-align: center " 图4 FIRM-TPM实物图，来自 sup 12 /sup /p p 　　树突棘活动是神经元信息处理的基本事件，利用台式双光子显微镜在头固定的动物上的研究表明单个神经细胞的不同树突棘可以被不同朝向的视觉刺激或不同强度频率的声音刺激所激活。FHIRM-TPM实现了与传统的大型的台式双光子显微镜相同的分辨率和光学层切能力。与微型宽场显微镜相比，FIRM-TPM的高空间分辨率，固有的光学切片能力和组织穿透能力以及相当的机械稳定性都是极有优势的。所以虽然通过微型宽场显微镜可以获得数百个神经元在细胞水平上的活动，但是我们的 FHIRM-TPM无疑提供了一个更加强大的工具，即在自由活动的动物中对更加基本的神经编码单位——树突棘的时空特性进行观测。它能够在对小鼠依次进行的行为学试验(例如悬尾，跳台，以及社交行为)的过程中长时间观察位大脑中的神经元胞体、树突和树突棘的活动。这些功能的展示充分证明了FHIRM-TPM具有良好的性能和稳定性。未来，与光遗传学技术的结合，可望在结构与功能成像的同时，精准地操控神经元和大脑神经回路的活动。微型双光子荧光显微镜整机性能十分稳定，可用于在动物觅食、跳台、打斗、嬉戏、睡眠等自然行为条件下，或者在学习前、学习中和学习后，长时程观察神经突触、神经元、神经网络、远程连接的脑区等多尺度、多层次动态变化。 /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201706/insimg/90a13003-d9fd-404d-8df3-64926f598012.jpg" title=" 5.png" width=" 600" height=" 283" border=" 0" hspace=" 0" vspace=" 0" style=" width: 600px height: 283px " / /p p style=" text-align: center " 图5 三种模式在结构学成像中的成像质量对比，来自 sup 12 /sup /p p style=" text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201706/insimg/44bc19d8-0a51-4583-8784-2f9240ac1cdd.jpg" title=" 6.png" / /p p style=" text-align: center " 图6 FHIRM-TPM在三种不同的行为学范例对小鼠大脑皮层神经元活动进行成像，来自 sup 12 /sup /p p 　　从2001年Denk发表第一篇微型双光子显微镜的原型机以来，微型双光子显微镜的发展已经走过了15年的时间。15年的发展历程，微型双光子显微镜从最开始的25克笨重的身躯，只能在分离的组织中进行验证性的实验8到如今重量仅两点几克重，可以对自由活动的小鼠神经元进行树突棘级别的成像，可以说取得了一定的进步。然而，在看到这个领域取得的成就的同时，也应看到，至今为止，微型双光子显微镜还未像共聚焦显微镜或者是荧光光片显微镜一样被生物学家广泛认可和应用。而后者(光片显微镜)的发展时间更短(2008年Science的一篇文献一般被认为是现代荧光光片显微镜镜的开端13)。究其原因，除了技术本身的限制以外，整个研究领域的气氛和投入，也是重要的影响因素之一。 /p p 　　纵观这15年来微型双光子显微镜的发展道路，开疆拓土者有之 改革创新者有之 另辟蹊径者有之 浑水摸鱼、指鹿为马者亦有之。然而遗憾的是，愿意心无旁骛、全情投入者鲜有之 有意愿和能力建立为这个研究的领域建立范式者亦鲜有之。而中国，在不久前在这个领域基本上属于完全的空白。更不要说什么领先世界。 /p p 　　然而令人十分兴奋的是，中国国家基金委国家重大科研仪器设备研制专项在2014年正式将“超高时空分辨微型双光子在体显微成像系统”立项。以5年七千两百万人民币的研究经费对这一项“世界上做的还并不怎么好，中国基本没人做过”的技术进行攻关研发。这样的大力投入无疑为这一领域注入了新鲜血液和十足动力。而我也有幸在博士五年期间全程参与了这个项目的工作。从2012年来到该项目首席负责人程和平院士和陈良怡研究员的联合课题组至今，我见证了这个项目从无到有，团队从幼小稚嫩到壮大成熟的整个过程。如今，我们有了初步的成果，不仅让我们这样一支完全由中国本国科研工作者建立的团队在世界上处在了较为领先的位置，同时也把这个领域向前推动了一些，我感到无比激动和自豪。 /p p 　　该成果在2016年底美国神经科学年会、2017年5月冷泉港亚洲脑科学专题会议上报告后，得到包括多位诺贝尔奖获得者在内的国内外神经科学家的高度赞誉。冷泉港亚洲脑科学专题会议主席、美国著名神经科学家加州大学洛杉矶分校的Alcino J Silva教授在评述中写道，“从任何一个标准来看，这款显微镜都代表了一项重大技术发明，必将改变我们在自由活动动物中观察细胞和亚细胞结构的方式。它所开启的大门，甚至超越了神经元和树突成像。系统神经生物学正在进入一个新的时代，即通过对细胞群体中可辨识的细胞和亚细胞结构的复杂生物学事件进行成像观测，从而更加深刻地理解进化所造就的大脑环路实现复杂行为的核心工程学原理。毫无疑问，这项非凡的发明让我们向着这一目标迈进了一步。” /p p 　　1. Denk, W., Strickler, J. & amp Webb, W.Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science248, 73-76(1990). /p p 　　2. Gewin, V. A goldenage of brain exploration. PLoS Biol3, e24 (2005). /p p 　　3. Zipfel, W.R.,Williams, R.M. & amp Webb, W.W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in thebiosciences.Nat Biotechnol21, 1369-1377 (2003). /p p 　　4. Chen, T.W. et al.Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature499, 295-300 (2013). /p p 　　5. Minderer, M.,Harvey, C.D., Donato, F. & amp Moser, E.I. Neuroscience: Virtual realityexplored. Nature533, 324-325 (2016). /p p 　　6. Hamel, E.J., Grewe,B.F., Parker, J.G. & amp Schnitzer, M.J. Cellular level brain imaging inbehaving mammals: an engineering approach. Neuron86, 140-159 (2015). /p p 　　7. Ghosh, K.K. et al.Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nat Methods8, 871-878(2011). /p p 　　8. Helmchen, F., Fee,M.S., Tank, D.W. & amp Denk, W. A Miniature Head-Mounted Two-Photon Microscope.Neuron31, 903-912 (2001). /p p 　　9. Engelbrecht, C.J.,Johnston, R.S., Seibel, E.J. & amp Helmchen, F. Ultra-compact fiber-optictwo-photon microscope for functional fluorescence imaging in vivo. Optics Express16, 5556 (2008). /p p 　　10. Piyawattanametha, W.et al. In vivo brain imaging using a portable 2.9 g two-photon microscope basedon a microelectromechanical systems scanning mirror. Optics Letters34, 2309(2009). /p p 　　11. Sawinski, J. et al.Visually evoked activity in cortical cells imaged in freely moving animals. Proceedings of the National Academy ofSciences106, 19557-19562(2009). /p p 　　12. Zong, W. et al. Fasthigh-resolution miniature two-photon microscopy for brain imaging in freelybehaving mice. Nat Methods (2017). /p p 　　13. Keller, P.J.,Schmidt, A.D., Wittbrodt, J. & amp Stelzer, E.H. Reconstruction of zebrafishearly embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science322, 1065-1069 (2008). /p

分子诊断作为近几年的追捧热点快速发展，未来应用空间充满想象　　新技术的出现会带来革命性的变化，但目前依然以临床应用为主。2014年中国市场容量约19亿人民币，年复合增长率是IVD细分市场中增长最快的2011-2015年均复合增长率为30%。市场对于分子诊断的关注度，已远超临床应用现状，尤其是肿瘤早期筛查，个性化诊断等领域。我们认为能应用于临床的诊断产品，依然是近几年分子诊断的主题，但不可否认分子诊断未来的无限可能性。相关标的有：凯普生物，HPV龙头，是分子诊断目前应用最广的领域，期待未来其他产品线的不断补充。　　分子诊断的发展具有划时代的意义，但临床应用尚有局限　　分子诊断是指应用分子生物学技术对与疾病相关的结构蛋白质、酶、抗原抗体和各种免疫活性分子，以及编码这些分子的基因的检测。根据其检测技术的不同，主要可分为核酸杂交、PCR扩增、基因芯片、基因测序、质谱等。目前分子诊断已经广泛应用于传染病、血筛、 早期诊断、个性化治疗、遗传病、产前诊断、组织分型等领域。　　核酸杂交：具有互补碱基序列的DNA分子，可以通过碱基对之间形成氢键等，形成稳定的双链区，通过核素或者荧光来检测靶序列，由于核素污染，越来越多采用荧光标记，称为荧光原位杂交(FISH)。　　PCR扩增：PCR是模板DNA，引物和四种脱氧核糖核昔三磷酸(dNTP)在DNA聚合酶作用下发生酶促聚合反应，进行体外扩增，得到所需目的DNA，然后通过凝胶电泳或者荧光定量的方式来定性或者定量靶基因。这是分子诊断中目前应用最广泛的技术。　　基因芯片：一种杂交测序方法，在一块固相表面固定了序列已知的带荧光标记的靶核苷酸的探针，当样本中有与基因芯片上核酸探针互补的核酸时，即发生配对，通过检测荧光可重组出靶核酸的序列。　　基因测序：根据其原理平台，分为一代、二代和三代测序，其各自的优缺点如下表所示。　　目前应用最广泛的为二代测序，全球被Illumina和Life tech(后被Thermofisher收购)垄断(罗氏的焦磷酸测序仪454在2013年退出市场)，市面上基本没有国产仪器。三代测序由于测序准确度的问题还未广泛推广使用，多在研究阶段，但由于其无需PCR，避免了在分子扩增过程中由于扩增偏好性产生的错误，且成本低，通量高，真正做到了单分子测序，如能解决准确性和自动化的问题，在临床上具有广阔的应用前景。　　目前国内应用最广泛的应用平台是PCR技术，PCR仪器被外资垄断，由于开发周期长，技术门槛高，因此鲜有国内厂家开发仪器，国产厂家产品多为PCR试剂。国内分子诊断临床应用最广的是传染病，占整个分子诊断超过50%的份额。产前筛查是另外一块重要的市场，约占整个分子诊断市场的20%，伴随二胎政策放开，产筛未来会有较大的增长空间。分子诊断中空间最大的是肿瘤早筛，但是目前在临床的应用处于早期，与肿瘤早筛相关的标志物成百上千，特异性是制约该应用的最大因素。　　分子诊断广泛应用于传染病，血筛等领域，随着人们生活水平的提高，对分子诊断的认知和需求会越来越多，医疗卫生产业的发展不再局限于诊疗，而延伸到预防性医学。分子诊断在近几年也成为体各投资公司追捧的投资热点。随着人类基因图谱的破译，分子诊断在个体化精准治疗甚至大消费方面也有广阔的前景。　　分子诊断作为一个重要的诊断分支平台，在国内的发展速度很快，但是由于其市场和产品的特殊性，在临床的应用相对比较受限。其特点如下：　　1.分子诊断仪器平台集技术与资金为一体，由于其技术和监管门槛都相对较高，并且受到进口企业的专利限制，因此国内大多分子诊断厂家都是以试剂为主要产品，同时兼并部分服务，仪器市场主要还是被进口厂家垄断。　　2.分子诊断操作要求高，现有实验室认证要求高，对普及有制约，很多医院因为没有足够的房间满足实验室认证的要求，而不能开展，随着医院的发展能达要求的实验室增加。　　3.由于中国临床医生的知识结构，对分子诊断之类基础医学较强的项目接受度较慢，需要公司配合实验室进行主动的教育，这是目前国内欠缺的部分。　　分子诊断市场容量　　2014年中国市场容量约19亿人民币，年复合增长率是IVD细分市场中增长最快的2011-2015年均复合增长率为30%。分子国内客户多为三级医院及部分大型二甲医院检验科或病理科、独立医学实验室，血站，疾控中心等。　　　　分子诊断竞争格局　　国内分子诊断处于起步期，各国产厂家的销售额都不大，2014年销售额上亿的厂家较少，主要的分子诊断厂家多集中在HPV筛查和分型领域，其中达安基因、凯普、亚能(被复星收购)，安必平，相对市场份额较大，销售额在1亿以上。　　分子诊断的发展易受监管制度的制约，在摸索中逐步发展　　分子诊断市场的监管力度远高于其他细分市场，大部分产品属于三类产品，各细分领域的增长空间受政策影响较大，比如2010年国家卫计委颁布的血站的核酸筛查试点及推广工作，国家药监局基因诊断叫停等政策等，但整体趋势是监管保守，逐步放开，国家持积极推动态度。因此分子诊断细分领域的龙头公司，由于其产品成熟，渠道完善，具有技术和数据储备，将会是未来最大的受益者。　　分子诊断主板上市标的公司销售额过亿的只有达安基因，复星诊断，另外新三板的上市公司，潮州凯普和广州安必平值得关注，尤其是凯普(已主板转板中)，是HPV细分领域的龙头。　　分子诊断未来充满各种可能性，但要警惕精准诊疗的泡沫　　分子诊断作为一项前沿的技术，对医学诊断有很大贡献。对于一些窗口期的细菌和病毒感染，DNA检测是最有效的方法，比如HIV的检测。目前分子诊断在中国的主要应用是传染病的检测，比如HPV，HBV，HCV，HIV等。分子诊断在产前筛查中的应用也相对成熟，如华大基因，贝瑞和康等，胎儿外周血游离DNA检测已逐渐替代羊水穿刺技术。　　未来分子诊断在医学领域最大的市场是肿瘤早期筛查，目前在国内的应用还相对不成熟，只能作为辅助诊断参考，如果成本降低，肿瘤标志物的特异性可以满足要求，肿瘤早筛的市场将超百亿。除此以外，遗传病个体化诊断、疾病预测应用、大众消费基因服务等市场随着技术的发展，在逐步打开，随着技术成熟和成本的降低，分子、基因这些词与人民大众的生活会息息相关。　　分子诊断市场小结：分子诊断常常被捆绑于精准诊疗，但是目前无论是产品性能、收费标准、政策支持、海量数据分析等都还无法支持真正意义的精准诊疗，仍然处于概念大于市场的阶段。能广泛应用与临床的产品需要具备如下特点：1.临床意义清晰 2.操作自动化，傻瓜化 3.成本可被接受。对于目前国内的公司，PCR试剂盒依然是分子诊断这块蛋糕最实际的应用产品，而大消费，大数据还有很长的路要走。既追前沿，又接地气，清醒分析在分子领域的各种新技术，才能准确判断该技术真正的临床价值。　　POCT市场良莠不齐，亟待规范化和标准化　　市场份额分散，行业增速快，新技术层出不穷。2014年POCT市场容量48亿，2011-2015年POCT复合增长率在15-20% 之间。POCT市场尚未成熟，各厂家市场份额较小，整体处于量多质劣的阶段。由于检测平台方法差异较大，同一检测项目有多种方法，参考范围难以界定，测量结果准确度难以保证，行业也无相关质量控制标准，将会较长时间保持混沌分散的现状。参考POCT国际巨头Alere的发展史，行业内的并购整合是最高效的发展业务的方式。相关标的有：基蛋生物：心标物已是细分领域的龙头，产品口碑和性能都得到市场认可，目前重点关注POCT质量控制，有望成为行业标准制定者。　　POCT不是产品或项目的分类，而是检验的分类　　POCT是Point-of-Care Testing，中文一般译成“床边检测”。NACB( NationalAcademy of Clinical Biochemistry ，美国国家临床生化科学院)对POCT的定义是——在接近病人治疗处，由未接受临床实验室学科训练的专业临床人员(professional)或者病人(self)进行的临床检验，是在传统、核心或中心实验室以外进行的一切检验 　　理论上，POCT只是一种检测平台，目前所有的IVD项目都可以实现POCT检测，但比较常见的有血糖、血气、血凝、传染病(病毒和细菌)、肝功能、肾功能、心脏标记物、肿瘤标记物等 　　POCT产品种类繁多，可有不同的分类的方法。　　1. 根据原理和平台可分为如下几个平台：　　干化学：单层试纸、多层涂膜。　　免疫：胶体金+免疫层析/渗滤，荧光+免疫层析，免疫比浊。　　电化学：电流法、电位法、电阻法、酶电极。　　化学发光：小型化化学发光。　　色谱：高效液相色谱。　　新技术：微流控、生物芯片等。　　2. 根据检测的项目可以分为：　　临床生化(肝功能、肾功能、血气、离子)、临床免疫(心脏标记物、药物检测)、血液(血球、血凝)、微生物(传染病、分子诊断)等，基本和中心实验室(core-lab)的分类一致 　　3. 根据如有无仪器(或定性/定量)：分为试剂条(无仪器)和仪器/试剂条配套，前者多为定性、后者多为定量 　　4. 根据应用场景分为专业市场和家用市场(OTC)：家用市场主要包括血糖，血压，妊娠等产品。专业市场主要在医院的检验科，临床科室，急诊，ICU，手术室等使用的各类产品。除此之外，POCT还可以应用于救灾，军事，医疗服务站，现场监督执法，食品安全控制，移动医疗等场景，其形式比起大型诊断设备更加灵活多样。　　POCT作为一种补充诊断的方式具有其自己的优势和劣势，与大型检验设备的主要异同如下所示：　　POCT作为一个相对门槛较低的市场，竞争尤为激烈，同时由于POCT市场难以对其质量进行规范化，无相关行业标准，所以中国市场普遍呈现出“乱花渐欲迷人眼的”的量多质劣的局面。POCT市场主要有如下特点：　　1.市场集中度低：POCT在整个IVD细分市场中除生化试剂外最易切入的市场，国内厂家规模普遍偏小，相对而言市场份额较大的厂家大多都有其特色产品，是该细分领域的佼佼者，比如特种蛋白的深圳国赛，心肌标志物的南京基蛋等。　　2.行业无统一标准：欧美成熟市场对POCT有明确的监管法令、临床上也有明确的使用规范，但中国医疗机构和监督管理机构目前对POCT产品还没有统一的管理规范。生化、免疫、血球都有相应的溯源体系，可以溯源至国际参考方法和参考物质，保证其结果的准确度。中国每年都会由卫生部临检中心组织室间质评活动，来保证不同实验室间的结果准确和互认。POCT由于种类繁多，方法差异较大，因此暂无统一的质量控制体系，其结果难以保证准确。　　3.国内检验科对POCT态度不一：中国医疗资源匮乏，公立大医院处于强势地位，POCT的作用同欧美医疗发达地区的作用是不一致的。不同级别的医院对POCT的态度不同：　　1)二甲以上主流医疗机构，资金雄厚，检验科设备多为进口品牌，常规检测为主，不需要POCT。临床科室使用POCT，就会减少检验科的收入，冲击检验科的利益，因此限制了POCT的广泛使用。对于临床科室来说定量/半定量的POCT产品临床意义大，而且用量很大。如能采取更合理的利益分成方式，比如由检验科集中管理仪器，临床科室外借，可能会推动POCT的发展。　　2)二甲以下的基层医院，检验科样本量少，技术水平相对低，大型设备的实用性差。因此检验科通常使用POCT产品顶替传统检验方法来做诊断。由于检测量小，产品分散，这块市场相对不受国际厂家和国内一流公司重视。　　POCT市场容量　　2014年中国POCT市场(不含血糖)约48亿人民币，市场主要集中在心肌、感染、特种蛋白、妊娠等领域。其中炎症、心脏标记物、血气、糖化血红蛋白、电解质的检测主要是定量检测，传染病、毒品、妊娠等主要是定性检测。　　POCT竞争格局：竞争厂家众多，规模较小，市场分散程度高　　国内有规模的POCT厂家不多，市场集中度很低。最主要的细分领域是血气、电解质，炎症，心标，传染病，糖化血红蛋白，合计约占整个POCT市场90%的份额。　　这5个主要的细分领域中，技术平台、销售渠道、市场格局、经营状况都差异较大。血气电解质的检测主要用在各种紧急状态，临床风险极高，对产品要求极高，被进口产品垄断，基于电化学平台，和其他产品不同。　　炎症和心脏标志物比较类似，通常以定量半定量方法检测，临床上也有技术成熟的国产产品在使用。传染病主要是定性检测，国内厂家主导地位，价格低，利润薄。这三类方法学类似，国产厂家都以免疫层析技术为基础。　　糖化血红蛋白国际主流方法是高效液相法，同其他细分市场技术平台不同。　　POCT除了部分细分市场，整体处于发展早期，龙头尚未出现　　POCT是高度活跃的IVD市场，竞争格局不稳定，还没有一家独大的局面，国内目前的技术水平较低，且无核心技术和专利保护，因此造成低水平技术外流严重，市场产品同质化严重。虽然短期内受中国临床现状和国内公司技术水平的制约，但行业发展和市场前景长期看好。同时POCT也是医疗器械进入家用市场的必经途径，潜力巨大。　　国内上市的POCT公司有三诺，鱼跃，万孚，理邦，乐普等厂家，其他有规模的活跃的未上市公司约有20家，如南京基蛋(已IPO披露)，武汉明德，深圳瑞莱，深圳国赛，深圳普门，北京热景，石家庄禾柏等。　　POCT经历从定性到定量的发展，未来质量控制标准将规范目前百家争鸣的格局　　未来POCT的发展将从定性到定量，一些延展性好的技术平台，如免疫荧光、微流控、生物芯片等为将来的发展方向。技术的发展由单一领域向多领域突破。因此技术先进，结果准确并且能够多项目延伸和兼容的平台具有良好的应用前景。　　目前临床应用最大的限制是产品质量和结果的准确性，因此细分领域的龙头，其性能已经过市场考验，能以明星产品为辐射点，渗透其他产品。南京基蛋2014年心肌产品销售额1.5亿，占市场大盘超过20%的份额，具备一定的市场口碑，长期看好。　　POCT市场小结：POCT作为临床科室一种重要检测方法，在国外已经广泛应用，由于中国利益分配和国产品牌质量的问题，开展不够广泛。整体市场份额较为分散，细分领域龙头规模也较小，由于不同POCT其方法平台差异较大，产业并购将会是快速扩张的高效方法。　　体外诊断(IVD)行业投资策略　　近年来越来越多的企业开始转型涉足大健康领域，市场意识到生老病死相关的行业将成为固若汤金的抗风险行业，不易受到经济景气度的影响，没有明显的周期性，经济低迷，物价通胀也不影响病人看病吃药。作为门槛相对较低的体外诊断行业受到市场的疯狂热捧，企业如过江之鲫涌入体外诊断行业，不断加入的竞争者打乱了市场规则，拉低竞争价格，多数厂家集中在中低端市场进行恶性价格战，对于行业发展，以及病人的安全都是极为不利的。　　随着监管机构逐步收紧行业法规和政策，一些手工作坊式的厂家将逐渐退出竞争，给那些真正以产品质量为核心追求的厂家创造了良好的竞争环境。大量的研发投入在短期内并不能见到明显成效，公司的业绩也不会有明显提高，但是内涵式的技术积累和沉淀将为企业的发展壮大保驾护航，也是未来企业安身立命的根本。“通常我们认为技术是被高估了，但长远看来 ，技术总是被低估了的”。　　长期看好的细分市场的投资机会：生化、发光、POCT。　　1、临床生化：临床生化200生产厂家，随着CFDA加强监管，优秀的国产品牌会加速整合市场份额，保持超越大盘的增速。相关上市公司：迈克生物、西陇科学。　　2、化学发光：作为容量增速双高的细分市场，国产替代刚刚拉开帷幕。装机量是保证封闭系统增速的前提条件，明星套餐是进入终端的敲门砖和未来安身立命的根本。相关上市公司：郑州安图、迈克生物、新产业。　　3、POCT： POCT市场作为大型中心实验室检测的有效补充，其发展尚不成熟，行业无标准，持续关注细分领域龙头公司和未来技术发展方向。相关上市公司：理邦仪器，万孚生物，乐普医疗。　　风险提示　　行业整合进度低于预期 行业短期估值过高。（全文完）　　推荐阅读：　　体外诊断行业深度研究报告（一）——国家政策偏好与国产品牌　　体外诊断行业深度研究报告（二）——2015年体外诊断全球588亿美金　　体外诊断行业深度研究报告（三）——各细分市场容量与增速

仪器信息网讯 2010年8月20-22日，由国家自然科学基金委员会化学科学部主办，北京大学、清华大学和中国科学院化学研究所共同承办的“第三届全国生命分析化学学术报告与研讨会”在北京大学召开。 　　大会同期举办了“生命分析基础理论”系列报告会，300余人参加了此会。会议由厦门大学江云宝教授、中国科学院长春应用化学研究所张柏林研究员、南京大学徐静娟教授和苏州大学屠一锋教授共同主持，16位来自科研院所和高校的专家学者做了精彩的报告，部分报告内容摘录如下。 　　湖南大学 杨荣华教授 　　几种提高核酸探针检测灵敏度的新方法 　　杨荣华教授课题组围绕核酸探针设计和传感机制做了一系列工作，发展了几种提高核酸探针检测灵敏度的新方法：(1)设计可控核酸二级结构，改变分子内信号报告基因之间距离，降低背景信号；(2)利用金纳米颗粒、碳纳米管等纳米材料的强荧光猝灭能力，基于纳米材料/单链DNA自组装原理设计单标记荧光传感平台，降低背景信号；(3)分离分子识别单元与信号转换单元，设计免标记核酸探针、利用滚环放大原理放大检测信号。 　　大连理工大学 袁景利教授 　　一种NO测定用新型铕配合物荧光探针的设计、合成与应用 　　以稀土配合物为荧光标记探针的高灵敏度时间分辨荧光生化分析技术已经在临床检测与生命科学领域得到了广泛的应用，但现有的生物标记用稀土配合物数量十分有限，极大的限制了时间分辨荧光生化分析技术的发展。袁景利教授在报告中介绍了他们课题组设计、合成的一种NO测定用新型铕配合物荧光探针，并探讨了其在生物标记及时间分辨荧光生物成像测定中的应用。 　　北京化工大学 杨屹教授 　　微波辅助合成在功能性毛细管制备中的应用 　　杨屹教授首先介绍了微波在化学中的作用，然后着重介绍了微波在开管毛细管柱制备和酶微反应器制备中的应用。她的课题组通过研究发现：微波辅助下，树枝状大分子的引入可扩大柱容量，并具有较好的生物相容性 微波辅助合成大大缩短了毛细管和毛细管酶微反应器的制备时间，有望应用于其他类型的毛细管内壁修饰或者整柱制备中。 　　湖南师范大学 谢青季教授 　　酶催化聚合法用于酶固定和生物传感的研究 　　谢青季教授介绍了他们课题组将酶催化聚合法用于酶固定和生物传感的研究：通过漆酶(Lac)催化聚合法，制备了儿茶酚胺类神经递质聚合物-酶-多壁碳纳米管复合酶膜，研制了安培酶生物传感器和生物燃料电池 采用紫外光谱、循环伏安法(CV)，石英晶体微天平等手段，考察了Lac对多巴胺(DA)、肾上腺素(EP)和去甲肾上腺素(NA)的催化氧化和聚合，发现中性水溶液中三者的聚合速率满足DANAEP。 　　同济大学 田阳教授 　　高选择性的细胞信号分子电化学分析 　　田阳教授的课题组围绕细胞的分子识别分析这一基础问题，进行了层层深入的探索和研究：首先，研究了蛋白质在纳米界面上电子传递的行为，通过纳米界面调控蛋白质电化学电位，提高了细胞信号分子电化学分析的选择性；其次，为了进一步提高其灵敏度，把等离子共振效应产生的电荷分离机理与蛋白质电化学和电化学分析相结合，在提高选择性的同时，提高了电化学分析的灵敏度；再者，为了提高传感器的稳定性和再现性，对仿生酶进行了功能化的设计、合成与表面组装；最后，在前述研究基础上，结合光电化学的微阵列技术，实现了细胞的阵列式培养、增殖与高选择性电化学分析的一体化。 　　中国科学院烟台海岸带研究所 秦伟研究员 　　聚合物膜离子选择性电极生物传感新方法 　　秦伟研究员课题组以酶、核酸适体、仿生分子印迹聚合物等作为分子识别材料，开展了电位型生物传感器的研究，主要内容如下：以可卡因、有机磷农药的靶标酶-胆碱酶为模型，基于电极膜相流向样品溶液相的离子通道，构建了丁酰胆碱聚合物离子选择电极；将聚合物膜离子选择性电极的电位信号传导和核酸适体的分子识别相结合，发展了一种免标记的电位型传感器；发展了一种通用的基于聚合物膜离子选择性电极技术检测电中性有机分子的新方法，拓宽了离子选择电极的应用范围。 　　中国科学院长春应用化学研究所 于聪研究员 　　核酸诱导的小分子探针的集聚及自组装 　　于聪研究员的课题组探索了核酸检测的新方法：利用核酸分子诱导的探针分子的聚集、自组装，和由此引发的探针分子的各种特性的改变，及相对应的分析手段的响应信号的改变，来检测核酸的存在；研究核酸分子间的相互作用，例如含多个鸟嘌呤核苷片段的单链DNA形成四连体结构；利用核酸适配体分子与被检测物之间的特异性相互作用检测蛋白质、小分子或金属离子等 并研究一些重要的生理过程，例如核酸酶活性的检测。 　　中南大学 王建秀教授 　　癌症抑制转录因子p53与DNA相互作用的研究 　　癌症抑制转录因子p53是一种隐性肿瘤抑制基因，p53蛋白质的突变水平与细胞的癌变程度有直接的关系，因此，检测p53蛋白质的突变水平对癌症的临床研究具有非常重要的意义。王建秀课题组采用电化学以及表面等离子体激元共振(SPR)技术研究了p53与DNA的相互作用过程，克服了传统的酶联免疫吸附分析操作步骤繁琐、且使用酶标抗体的缺陷。此外，采用荧光共振能量转移研究野生型p53蛋白质与一致性双链DNA的特异性相互作用，从而达到区分正常人细胞以及癌细胞的目的。 　　此外，在本次“生命分析理论基础”报告会上作报告的还有：(排名不分先后) 姓名 职称 单位 报告题目 欧阳津 教授 北京师范大学 基于量子点标记的蛋白质检测新方法 王雪梅 教授 东南大学 基于符合纳米界面的肿瘤细胞识别与检测 马宏伟 研究员 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 “零背景”免疫分析：基于抗蛋白质非特异性吸附的iPDMS的多指标蛋白质微阵列 曹成喜 教授 上海交通大学 基于移动反应界面的蛋白质组学研究关键聚焦分离技术的研究进展 罗红霞 副教授 中国人民大学 腺嘌呤/纳米金刚石修饰电极对NADH的传感作用 王振新 研究员 中国科学院长春应用化学研究所 基于凝集素修饰金纳米粒子的比色法研究抗生素与活细胞的相互作用 聂周 副教授 湖南大学 新型无标记功能酶分析方法 张鹏 博士 贝克曼库尔特公司市场部 无鞘液式毛细管电泳-质谱联用（HSPS CE-MS）技术

粮食真菌毒素检测仪采用荧光定量快速检测原理，主要应用于粮油、谷物、饲料等多种领域，对多种真菌毒素进行准确检测，为确保食品安全贡献力量。荧光定量快速检测原理即粮食真菌毒素检测仪通过特定的荧光信号，准确、快速地识别和测量样品中的真菌毒素含量。这项技术具有高效、灵敏度高、操作简便等特点，使得检测过程更加迅速和可靠。核心特性及优势全方位检测：涵盖多种真菌毒素，包括黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、玉米赤霉烯酮等，实现全面监测。任意样品数量：粮食真菌毒素检测仪允许用户既可单个或少量样本随到随检，也可大量样本同时检测。内置定量标准曲线：在检测过程中无需使用外部标准品进行校准，避免了操作人员与呕吐毒素直接接触的可能，从而提高了操作的安全性。随到随检：检测仪器的便携性使其适用于现场检测，无论是在生产线上、仓库中，还是在野外环境中，都能轻松进行检测操作。多领域应用：适用于粮库、谷物生产企业、饲料厂、畜牧养殖企业、食品加工厂、第三方检测机构等多个行业。应用场景保障粮库质量：对存储的粮食进行定期检测，预防真菌毒素污染。提升饲料质量：对饲料原料进行检测，确保畜牧养殖健康生长。食品生产控制：在食品生产过程中对油脂、面粉等原材料进行检测，确保成品质量。第三方检测服务：为各行业提供真菌毒素检测服务，为食品安全保驾护航。通过使用粮食真菌毒素检测仪，我们能够更全面地了解食品和饲料的安全状况，从而更好地保障我们的健康。

癌症导致的死亡中，大部分是由恶性肿瘤转移而引起的，在临床上仍然是一个挑战。转移性癌细胞通常与原发癌细胞相似，但它们可能会受到所转移器官附近环境的影响。本文揭示了结直肠癌(CRC)细胞在转移至肝脏(一个关键的代谢器官)后经历代谢的重组过程。特别是肝转移细胞通过GATA结合蛋白6抗体 (GATA6) 上调醛缩酶B (ALDOB)的表达，提高果糖代谢，为肿瘤细胞增殖过程中的主要中心碳代谢提供能量。靶向ALDOB或降低膳食果糖可显著降低肝转移性生长，但对原发肿瘤几乎没有影响。本文的研究结果表明，转移细胞可以在新的微环境中利用代谢重组，尤其是在代谢活跃的器官，如肝脏中，对相关通路的操纵可能会影响转移性生长的过程。原发性肿瘤逐渐累积遗传性改变，并受其肿瘤微环境的影响，直到获得能转移到远处器官的能力(Gupta和Massague, 2006 Valastyan和Weinberg, 2011)。这一过程的典型特征是，结直肠癌（CRC）经过腺瘤到癌的顺序发展，最终导致转移(Barker et al.， 2009)，(约70%的患者) 优先转移到肝脏这个部位 (Rothbarth和van de Velde, 2005) 。在这个阶段，该疾病变得很难治疗，并对大多数形式的联合治疗产生耐药性，使得结直肠癌（CRC）转移成为癌症相关死亡的主要原因。无法进行手术的肝转移患者对化疗干预治疗效果较差，中位生存期为6至9个月 (Alberts et al.， 2005) 。目前针对晚期结直肠癌的化疗并不针对肝转移。部分原因是由于观察到CRC转移与任何特定的基因突变并不一致 (Jones et al.， 2008) ，而且它们通常与原发肿瘤中的细胞相似。然而，新出现的证据表明，非遗传改变，如表观遗传和代谢重组，可能促进癌症转移。将这种机制作为研究的目标可能为开发结直肠癌转移的治疗方法提供新的途径。在本研究中，来自临床样本和经盲肠移植的体内CRC转移模型的数据表明，结直肠癌（CRC）肝转移瘤的特定代谢通路发生了改变。特别是，肝转移会上调ALDOB的水平，这是一种参与果糖代谢的酶。肝内植入表明肝环境导致CRC细胞上调ALDOB。代谢组学和13C标记的果糖追踪研究表明，ALDOB促进果糖代谢，促进糖酵解、糖异生和戊糖磷酸途径。降低ALDOB或限制饮食果糖会抑制CRC肝转移瘤的生长，但不抑制原发肿瘤或肺转移瘤的生长，这突出了肿瘤微环境的重要性。1、在结直肠癌CRC肝转移中BALDOB表达升高为了证实ALDOB在肝转移中的上调，作者将3株CRC细胞株：HCT116和2株肝转移患者来源的异种移植(PDX)细胞株CRC119和CRC57植入NOD/SCID小鼠的盲肠末端。细胞携带双标记报告基因结构，稳定表达荧光蛋白(mCherry或GFP) 和荧光素酶。在盲肠注射前，流式细胞分选(FACS)分析显示，这些CRC细胞株中KHK、ALDOB和HK表达均为单峰。注射盲肠后，CRC细胞在2周内首次形成原位肿瘤。随后，它们在5周内发生了CRC肝转移。收集原发性盲肠和肝转移肿瘤后，利用荧光流式细胞仪(FACS)分离CRC细胞。肝转移瘤的ALDOB水平明显高于原发性转移瘤，而KHK和HK水平基本保持不变(图3B-3D) 。20%至40%的小鼠也出现肺转移，尽管与原发性盲肠肿瘤相比，肺转移中ALDOB没有上调。Figure 3. 肝转移使体内ALDOB表达升高为了研究肝脏微环境是否引起CRC细胞中ALDOB的表达上调，本文将HCT116、CRC119和CRC57细胞同时直接注入小鼠肝脏和盲肠。CRC肿瘤迅速在肝脏和盲肠中形成，注射10天后，分别采集肿瘤。肿瘤经盲肠转移至肝脏之前，在盲肠注射模型中需要3~5周(图3E)。从采集的肿瘤细胞中，利用荧光流式细胞分选(FACS)分离出CRC细胞。Western blot检测证实，从肝脏分离的CRC细胞中ALDOB水平高于盲肠分离的细胞，而KHK和HK水平保持相似(图3F-3H)。另一方面，Transwell迁移实验中迁移和非迁移的CRC细胞表达了相似的ALDOB水平，这表明ALDOB与迁移能力的增强无关。此外，在体外培养后，肝脏和盲肠分离的肿瘤细胞表达相似的ALDOB水平。综上所述，这些数据表明肝脏微环境可导致CRC细胞上调ALDOB的表达。2、ALDOB促进CRC肝转移瘤的生长HCT116、CRC119和CRC57细胞中ALDOB 的表达下调（RNA干扰下调表达），不影响体外含葡萄糖或果糖培养基中培养的CRC细胞迁移 。尽管盲肠移植HCT116、CRC119或CRC57细胞与对照载体均可有效发展肝转移(3个细胞系的5只小鼠中有5只发生了转移) ，但在盲肠注射模型中，ALDOB下调表达可抑制CRC肝转移。经shRNA1干扰的ALDOB的HCT116、CRC119或CRC57细胞分别在5只小鼠中仅有2只、2只和2只出现可检测到的肝转移，而经shRNA2敲除的小鼠分别为2、1和2只(图5A-5E) 。此外，从ALDOB 下调表达细胞中的肝转移比对照细胞中的肝转移肿瘤少得多，且小得多。然后进行肝内注射，观察ALDOB是否促进肝内CRC的生长。对照载体的HCT116、CRC119和CRC57细胞在肝脏中生长明显大于ALDOB表达下调的细胞(图5F-5H) 。Figure 5. RNA干扰ALDOB表达可抑制CRC肝转移3、靶向果糖代谢抑制肝转移接下来考虑的是，果糖摄入量的水平是否会影响肿瘤的生长，尤其是在肝脏。注射CRC至盲肠后 (每组5只小鼠) ，高果糖饮食的小鼠显示CRC肝转移增加，而不含果糖饮食的小鼠相对于对照组显示肝转移减少(图6A-6D) 。随后将这两种治疗方法结合起来。对小鼠注射ALDOB基因敲除剂后，然后按规定对其喂食不含果糖的饮食。这正如预期的那样，抑制了CRC的肝转移(图6A-6D) 。将CT26细胞注射到具有免疫功能的BALB/c小鼠的盲肠中，在果糖饮食对肝转移瘤的影响方面也显示出类似的结果。一直以来，高果糖饮食降低了老鼠的存活率，而低果糖饮食和低碳水化合物能延长老鼠的存活率。用相同shRNA结构转染LV-HCT116细胞，下调ALDOB的表达。与盲肠注射模型一致，ALDOB下调表达和果糖限制饮食抑制了肝脏中CRC肿瘤。关于抑制肝脏LV-HCT116肿瘤，ALDOB下调和果糖限制似乎比5-氟尿嘧啶或奥沙利铂更有效，这两种药物都是晚期和转移性CRC的一线化疗。与ALDOB敲除或果糖限制饮食不同，5-氟尿嘧啶或奥沙利铂在肿瘤抑制或生存方面几乎没有益处。因此, 针对ALDOB和果糖代谢的调节可能会影响肝转移瘤的生长，并对目前的化疗作为一个补充策略。Figure 6. 饮食果糖限制抑制CRC肝转移关于珀金埃尔默：珀金埃尔默致力于为创建更健康的世界而持续创新。我们为诊断、生命科学、食品及应用市场推出独特的解决方案，助力科学家、研究人员和临床医生解决最棘手的科学和医疗难题。凭借深厚的市场了解和技术专长，我们助力客户更早地获得更准确的洞见。在全球，我们拥有12500名专业技术人员，服务于150多个国家，时刻专注于帮助客户打造更健康的家庭，改善人类生活质量。2018年，珀金埃尔默年营收达到约28亿美元，为标准普尔500指数中的一员，纽交所上市代号1-877-PKI-NYSE。了解更多有关珀金埃尔默的信息，请访问www.perkinelmer.com.cn

酶标仪即酶联免疫检测仪，酶标仪检测技术是一种高通量微孔板检测技术，操作简便，被广泛应用于生命科学、生物制药、体外诊断、食品安全、环境科学等领域。传统酶标仪是指具备吸收光检测功能的酶联免疫检测仪，随着科学技术发展和市场需求不断丰富，如今酶标仪所具备的检测功能日益丰富，在吸收光检测(Abs)基础上增加了荧光强度(FI)、发光检测(Lum)、荧光偏振(FP)、时间分辨荧光(TRF)、匀相时间分辨荧光(HTRF)以及Alpha检测等多种检测技术。然而每一种技术都具有独特的应用价值和局限性，笔者将主流的酶标仪检测技术进行汇总，分为上、下两篇，以飨读者。1.吸收光检测（Absorbance,Abs）早期的酶标仪实际上是一台变相的专用光电比色计或分光光度计，其工作原理与主要结构和光电比色计基本相同，在特定波长下检测到的被测物的吸光值。光通过被检测物前后的能量差异即为被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系，即符合朗伯比尔定律。检测时，光波由光源灯发射并经过滤光片或单色器变成一束单色光，照射到微孔板中的待测样本，一部分光被样本吸收，另一部分则透过样本照射到光电检测器上，光电检测器将不同待测样本的强弱不同的光信号转换成相应电信号，再经信号处理后送入微处理器进行数据处理和计算，最后由显示器显示结果。光吸收酶标仪的技术原理示意图（图源网络）典型应用：核酸和蛋白质定量、ELISA、酶学检测、细菌生长OD600测定、LAL内毒素检测、MMT/CCK8等细胞活力分析。2.荧光强度（Fluorescence Intensity,FI）荧光是发光体分子中处于激发态的原子核外电子由高能级回到低能级所产生的辐射，因此是冷光。荧光的颜色多为蓝色、绿色、红色和黄色等。荧光强度即发射荧光的光量子数，荧光强度与溶液吸收光强度，荧光量子效率以及周围环境等因素有关。当其他因素保持不变，荧光强度与该物质溶液的浓度成正比，这也是荧光检测的定量依据。荧光酶标仪通常包含光源、用于选择激发光的光学系统（即滤光片和/或光栅）、用于选择发射光的第二光学系统以及检测器。检测时，采用特定波长激发光来激发样品孔内的荧光标志物，通过检测器检测荧光物质被激发产生的发生光。荧光检测系统光路示意图（图源网络）典型应用：核酸等生物大分子定量、酶活性分析、荧光免疫分析、细胞学分析（细胞增殖、细胞毒理、细胞吸附等）、胞内钙离子浓度的变化、荧光蛋白的报道基因分析 (GFP)、细胞凋亡等。3.发光检测（Luminescence,Lum）发光检测包括化学发光（Chemiluminescence）和生物发光(Bioluminescence)，是样本孔内发生的化学、生化或者酶反应发出的光信号。与吸收光和荧光检测不同的是，发光检测不需要激发光源，这就使得发光更敏感，更不容易引起背景噪音。化学发光是由化学反应引起的一种特殊的发光现象，即通过氧化还原反应释放的能量将体系中某一物质从基态跃迁至激发态，随后以辐射发光（紫外光、可见光或近红外光）的形式返回基态释放能量。化学发光由化学激发过程和发光过程两部分组成。根据能量作用过程，化学发光主要分为直接发光和间接发光两类。化学发光的两种类型（图源网络）生物发光是生物体内的发光蛋白通过消耗能量物质而产生的发光现象，其特点是只消耗能量物质,不消耗发光物质。生物发光属于冷光范畴,即发光不是由于发光体温度升高所致,发射波长也与其温度无关。目前被发现的生物发光底物有虫荧光素、腔肠素、虾素等。典型应用：单/双荧光素酶报告基因、BRET、细胞活力检测、细胞增殖检测、支原体检测、细胞毒性检测、ATP、dsDNA、水母发光蛋白Ca2+、基于化学发光的ELISA检测等。4.荧光偏振（Fluorescence polarization,FP）1926年，Perrin首先描述了荧光偏振理论，以单一波长偏振光照射溶液中的荧光物质，当荧光分子受平面偏振光激发时，如果分子在受激发时期（对于荧光素约持续4纳秒）保持静止，发射光将位于同样的偏振光平面；如果在受激发时期，分子旋转或翻转偏离这一平面，发射光将位于与激发光不同的偏振面，即荧光的去偏振现象。荧光偏振检测技术通过分析体系中荧光分子的偏振信号变化差异，实现对分子间相互作用的研究以及所选目标物的检测，其计算依据为荧光偏振光强度与待检测物质含量呈正相关性。检测时，荧光物质标记在特定物质上使原本微弱的反应信号转化成较强的荧光信号，起到信号增强的作用。与此同时，在检测系统中加上起偏器和检偏器，当从光源发出的一束光线经垂直起偏器后成为垂直偏振光，样品被垂直偏振光激发而产生偏振荧光，此荧光经检偏器后可测出与样品浓度有关的水平或垂直方向的荧光偏振光强度。荧光偏振信号测量原理（图源网络）典型应用：受体/配体研究（如激素/受体检测），蛋白质/多肽相互作用，DNA/蛋白质相互作用，酪氨酸激酶检测，竞争性免疫检测、单核苷酸多态性筛选、实时定量PCR-FP、体外细胞损失检测等。想要了解更多酶标仪品牌型号，尽在仪器信息网【仪器优选—酶标仪】栏目。它是科学仪器行业专业导购平台，旨在帮助仪器用户快速找到需要的仪器设备。酶标仪（点击进入）以上就是酶标仪吸收光检测(Abs)、荧光强度(FI)、发光检测(Lum)和荧光偏振(FP)检测技术盘点。下期，我们将为广大用户盘点荧光共振能量转移（FRET）、时间分辨荧光(TRF)、匀相时间分辨荧光(HTRF)以及Alpha检测等多种酶标仪检测技术。(点击查看)。参考资料：1.An Improved Automated High-Throughput Efficient Microplate Reader for Rapid Colorimetric Biosensing2.多功能分析仪技术研究3.Chemiluminescence for bioimaging and therapeutics: recent advances and challenges4.荧光偏振技术在生化分析检测中的研究进展希望本篇盘点对您有所帮助，如有技术干货、科研成果、酶标仪仪器使用心得、生命科学领域热点事件观点等内容，欢迎相关行业朋友投稿。投稿邮箱：zhaoyw@instrument.com.cn 。

近年来，光学成像技术如荧光分子成像、光声成像和生物发光成像等广泛应用于小动物活体成像。同时，多模态成像技术的兴起将多种成像技术结合，为小动物活体成像提供了更精确和信息丰富的工具。为帮助广大用户及时了解小动物活体成像前沿技术、产品与整体解决方案，仪器信息网特别制作【小动物活体成像技术创新突破进行时】专题（点击查看），并策划“小动物活体成像技术”主题征稿活动，以期进一步帮助广大用户从多维度深入了解小动物活体成像技术应用、主流品牌、市场动态以及相关内容。本期征稿来自上海勤翔科学仪器有限公司，就小动物光学成像系统检测原理以及就勤翔小动物活体成像系统技术发展历程进行回顾。——01——分子成像研究背景1999年，美国哈佛大学 Weissleder等人提出了分子影像学 （molecular imaging）的概念，即应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定量研究 。传统成像大多依赖于肉眼可见的身体、生理和代谢过程在疾病状态下的变化，而不是了解疾病的特异性 分子事件。分子成像则是利用特异性分子探针追踪靶目标并成像。这种从非特异性成像到特异性成像的变化，为疾病生物学、疾病早期检测、定性、评估和治疗带来了重大的影响。分子成像的主要优点如下：第一，分子成像能够反映细胞或基因表达 的空间和时间 分布，从而了解活体动物体内的相关生物学过程、特异性基因功能和相互作用。第二，由于可以对同一个研究个体进行长时间反复跟踪成像，既可以进步数据的可比性，避免个体差异对试验结果的可影响，又不需要杀死模式动物 ，节省了大笔科研用度。第三，尤其在药物开发方面，分子成像更是具有划时代的意义。根据统计结果，由于进临床研究的药物中大部分由于安全题目而终止，导致了在临床研究中大量的资金浪费，而分子成像技术的问世，为解决这一困难提供了广阔的空间，将使药物在临床前研究中通过利用分子成像的方法，获得更具体的分子或基因述水平的数据，这是用传统的方法无法了解的领域，所以分子成像将对新药研究的模式带来革命性变革。其次，在转基因动物 、动物基因打靶 或制药研究过程中，分子成像能对动物的性状进行跟踪检测，对表型进行直接观测和（定量）分析。——02——小动物活体成像系统分类及检测原理动物活体成像系统目前主要分为光学成像、核素成像（PET/SPECT）、核磁共振成像（MRI）、计算机断层摄影（CT）成像和超声（ultrasound）成像五大类。光学成像和核素成像适合研究分子、代谢和生理学事件，称为功能成像。超声成像和CT适合于解剖学成像，称为结构成像，MRI则介于两者之间。其中，光学成像是临床前小动物活体成像最常用的技术，主要包含生物发光法和荧光法两种。➤ 生物发光是利用荧光素酶基因标记细胞，通过基因表达产生的蛋白酶与相应底物发生化学反应产生光信号。➤ 荧光发光采用荧光物质或荧光物质标记的抗体、纳米材料、药物等导入到活体体内，通过外界激发光源激发获取成像。光学成像灵敏度高、快速且易于执行，与许多其他成像方式相比，相对便宜。其主要缺点是穿透深度，在可见染料的情况下，穿透深度只有几毫米。单一的成像模式往往只能提供有限的信息，当多种成像模式结合起来互补时，可以在解剖结构和定位的背景下提供分子特征、代谢和功能的信息，为科学研究提供了更加全面和详细的信息。——03——小动物活体光学成像系统检测原理勤翔小动物活体成像系统依靠搭载的高灵敏度制冷相机捕捉实验动物的光信号，成像原理主要包括生物发光（自发光）、荧光（需外源激发光照射）和X射线检测。生物发光是指通过转基因的方法，把荧光素酶报告基因导入到目的细胞中（比如肿瘤细胞），给实验动物接种该肿瘤细胞，在成像之前再给实验动物注射底物荧光素，荧光素酶可以使得底物荧光素氧化而发光，从而被相机检测到。荧光法是用荧光基团标记检测目标，这种荧光基团既可以是荧光染料（比如可以用cy5标记纳米载体），也可以是GFP报告基因（比如通过转基因的方式把GFP报告基因转入待检测的细胞）。每种荧光基团都有特定的激发波长和发射波长，成像时在特定激发波长的光（激发光）照射下，荧光基团会被激发而发射出另一种波长的光（发射光），可以用滤光片特异的捕捉发射光从而完成检测。名称优点缺点生物发光①特异性强②低背景，极高灵敏度③精确定量①标记手段和标记物单一②信号弱，对相机要求高③实验要求高④成本高荧光①信号强②标记物选择多，标记方式更灵活③成本低①背景高，灵敏度较低②荧光染料可能有毒性③较难精确定量——04——勤翔小动物活体成像系统的发展历程上海勤翔科学仪器有限公司成立于2006年，总部位于上海，是一家集研发、生产、销售、服务为一体的高新技术企业，致力于为生命科学领域提供专业的数字成像系统及图像分析解决方案。2011年，Clinx 勤翔在国内率先交付了第一台定制小动物活体成像系统，2024年，Clinx勤翔再攀高峰，推出全新8000X系列X光多模式小动物活体成像系统，从硬件上来说，不仅仪器外观做了重新设计，气体麻醉系统也做了整合，整体上更加时尚美观，而且从荧光光源布局到样品台材质等方方面面都做了优化升级。从功能上来说，新增了X射线检测功能，进一步丰富了小动物活体成像系统的应用。同时软件也做了较大的升级，能够支持生物发光、荧光、X光的多通道叠加显示，曝光方式更加智能，使用便利性大大增强。X射线的检测原理是利用了不同物质对于X射线的吸收率不同。当X射线穿过动物身体时，受到不同程度的吸收，如骨骼吸收的X射线比肌肉吸收的量要多。那么通过动物身体后，X射线量就不一样，这样便携带了动物身体各部密度分布的信息，接收器可以接收到这些信息并把它们转换成数字图像输出，主要应用于骨骼系统的检查。——05——颜值与实力并存：X光/荧光/生物发光合而为一勤翔小动物活体成像系统主推的型号是IVScope 8000X，它搭载高灵敏度制冷CCD相机和f0.8大光圈镜头，配备温控系统和麻醉系统，配合密闭暗箱，可以在动物正常生理状态下进行光信号检测。它除了可以满足传统生物发光和荧光检测之外，还支持X射线检测，可以对实验动物的骨骼进行成像观察。IVScope 8500X（主机+气麻）勤翔X光多模式小动物活体成像系统IVScope 8000X系列品牌：CLINX型号：IVScope8500X/8200X产品优势和核心竞争力包括：1、深度制冷CCD相机，峰值量子效率高达95%，系统拥有极高的灵敏度和信噪比2、系统除了支持传统的生物发光和荧光检测外，还可以同时对5只小鼠进行X射线检测，一台机器满足多种实验场景的需要3、软件全部自主研发，更加符合国人的操作习惯。除了常规的拍摄功能，还支持批量图像的定量分析、自动输出动力学曲线、自动生成视频、自动拼图、多通道叠加显示以及多账号多权限管理等功能。后期还可以免费升级。小鼠结肠癌不同治疗效果比对干细胞检测大鼠骨骼检测X光和多通道荧光的叠加显示2024年6月6日，在仪器信息网举办的“第一届小动物活体成像技术与前沿应用”主题网络研讨会（iSAI2024）上，勤翔应用支持袁亦晨讲师将在线全面讲解Clinx勤翔新品IVScope 8000X系列X光多模式小动物活体系统的技术特点和应用，可点击下方链接或扫描海报中二维码提前报名，直播间将送出勤翔定制的精美礼物。会议链接/扫码报名：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/sai240606.html——06——技术积淀+利好政策：国产高端制造业的崛起随着近几年国家政策的大力支持，高端科研设备的进口替代现象越来越明显，一方面节约了大量的科研经费，另一方面有力支持了国产高端制造业的崛起。正是因为前期大量的技术积累，勤翔的小动物活体成像系统越来越受到用户的欢迎，勤翔的小动物活体成像设备正在以下单位的科研一线发挥巨大作用。医院系统有：北京协和医院、四川大学华西医院、四川大学华西第二医院、上海长征医院、上海第七人民医院、南方医科大学顺德医院、广西医科大学第二附属医院、华中科技大学同济医学院附属梨园医院等。高校科研系统有：华南师法大学、广东工业大学、南华大学、辽宁中医药大学、枣庄学院、重庆医科大学、四川大学等。生物公司有：广东朝利良生物科技有限公司、北恒生物、万类生物、瑞吉生物、津科生物、福建安布瑞生物科技有限公司等。目前还有大量用户正在排队等待试用。勤翔典型用户迄今为止，勤翔小动物活体成像系统已支持客户发表多篇SCI文献，涉及的科研领域包括癌相关基因的靶点研究、干细胞治疗、化疗药物开发、骨质疏松治疗、脊髓修复等等，为科研转化提供了有力的理论依据。Clinx勤翔聚焦数字成像领域创新技术研发，致力于为科研人员提供全线自主研发的高性能数字成像产品和专业的技术服务。就在5月27日，Clinx勤翔宣布正式聘任英国帝国理工大学汤孟兴教授为首席科学顾问。汤孟兴教授在生物医学工程技术领域享有盛誉，组建了超声成像和传感实验室，主要研究方向包括医学超声超分辨率成像、造影成像、分子成像、声光成像以及生物电阻抗成像等各种成像技术等。至今在国际专业期刊上发表文章逾百篇，现担任包括医学超声杂志 IEEE T UFFC 和Ultrasound in Medicine and Biology 国际期刊的副主编和编辑顾问委员会委员。汤博士在生物医学及成像技术领域拥有资深的科研经验、广阔的视野和前沿的科学探索，他的加入将赋能勤翔研发团队完成更多更富挑战性的研究工作，从而为科研人员提供更多前沿科研工具，助力全球生命科学研究。小动物活体成像技术专题征稿进行中！为帮助广大用户及时了解小动物活体成像前沿技术、产品与整体解决方案，仪器信息网特别策划“小动物活体成像技术”主题征稿活动，以期进一步帮助广大用户从多维度深入了解小动物活体成像技术应用、主流品牌、市场动态以及相关内容。投稿邮箱：liuld@instrument.com.cn征稿提纲：https://www.instrument.com.cn/news/20230925/685455.shtml参考文献1、Rui Yan, Yujiao Guo, Xichao Wang, Guohai Liang, Anli Yang,and Jinming Li(2022).Near-Infrared Light-Controlled and Real-Time Detection of Osteogenic Diferentiation in Mesenchymal Stem Cells by Upconversion Nanoparticles for Osteoporosis Therapy.ACS Nano.DOI:10.1021/acsnano.2c029002、Yujiao Guo, Rui Yan, Xichao Wang, Guohai Liang, Anli Yang, and Jinming Li(2022).Near-Infrared Light-Controlled Activation of Adhesive Peptides Regulates Cell Adhesion and Multidifffferentiation in Mesenchymal Stem Cells on an Up-Conversion Substrate.Nano Lett.DOI:10.1021/acs.nanolett.1c045343、Wu, Yongquan Shi, Aiping Li, Yuanyan Zeng, Hong Chen, Xiaoyong Wu, Jie Fan, Xiaolin (2018). A Near-Infrared Xanthene Fluorescence Probe for Monitoring Peroxynitrite in Living Cells and Mouse Inflammation Model. The Analyst, doi:10.1039/C8AN01107A 4、Wu, Yongquan Shi, Aiping Zeng, Hong Li, Yuanyan Li, Huifang Chen, Xiaoyong Wong, Wai-Yeung Fan, Xiaolin (2019). Development of near-infrared xanthene fluorescence probe for the highly selective and sensitive detection of cysteine. Dyes and Pigments,doi:10.1016/j.dyepig.2019.107563 5、Yuanyan Li, Yongquan Wu, Luyan Chen, Hong Zeng, Xiaoyong Chen, Weican Lun, Xiaolin Fan and Wai-Yeung Wong(2019).A time-resolved near-infrared phosphorescent iridium(III) complex for fast and highly specific peroxynitrite detection and bioimaging applications.Journal of Materials Chemistry B,doi: 10.1039/c9tb01673b6、Wu, Yongquan Shi, Aiping Liu, Huiying Li, Yuanyan Lun, Weican Zeng, Hong Fan, Xiaolin (2020). A novel near-infrared xanthene-based fluorescent probe for detection of thiophenol in vitro and in vivo. New Journal of Chemistry, doi:10.1039/d0nj03370g7、Y. Li, Y. Wu, J. Wu,W. Lun, H. Zeng and X. Fan, A near-infrared phosphorescent iridium(III) complex for fast and time-resolved detection of cysteine and homocysteine,Analyst, 2020,doi: 10.1039/C9AN02469G8、Zihan Yang, Xichao Wang,Guohai Liang, Anli Yang and Jinming Li(2021).Photocontrolled chondrogenic difffferentiation and long-term tracking of mesenchymal stem cells in vivo by upconversion nanoparticles.J. Mater. Chem. B.DOI: 10.1039/d1tb02074a9、Yi Liu1, Yeying Wang, Bing Xiao1, Guoke Tang, Jiangming Yu, Weiheng Wang, Guohua Xu, and Xiaojian Ye(2021).pH-responsive delivery of H2 through ammonia borane-loaded mesoporous silica nanoparticles improves recovery after spinal cord injury by moderating oxidative stress and regulating microglial polarization.Regenerative Biomaterials.DOI:10.1093/rb/rbab05810、Qi M, Sun L-a, Zheng L-r, Zhang J,Han Y-l, Wu F, Zhao J, Niu W-h,Fei M-x, Jiang X-c and Zhou M-l (2022)Expression and potential role of FOSB in glioma.Front. Mol. Neurosci. 15:972615.doi: 10.3389/fnmol.2022.97261511、Chen L, Xu N, Wang P, et al.Nanoalbumin–prodrug conjugates prepared via a thiolation_x0002_and-conjugation method improve cancer chemotherapy and immune checkpoint blockade therapy by promoting CD8+T-cell infiltration. Bioeng Transl Med. 2023 8(1):e10377. doi:10.1002/btm2.1037712、Zixuan Zhou , Jingnan Xun, et al.Acceleration of burn wound healing by micronized amniotic membrane seeded with umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.Materials Today Bio.Volume 20, June 2023, 10068613、Li J, Wang F, et al. OpiCa1-PEG-PLGA nanomicelles antagonize acute heart failure induced by the cocktail of epinephrine and caffeine. Mater Today Bio. 2023 Nov 8 23:100859. doi: 10.1016/j.mtbio.2023.100859.

近日，两台Newton 7.0 Bio植物活体成像陆续抵达长沙，分别落户国家杂交水稻工程技术研究中心以及国家油料改良中心湖南分中心，已安调成功，将助力袁隆平院士及官春云院士两大团队进行水稻和油料作物研究。 新款的Newton 7.0 Bio植物成像系统增加了箱体顶部中心的高度，具有更大的成像视野。且CCD相机和样品台均可Z轴升降，除了便于调整植株高度外，也方便植株焦点的选择而无需进行相机对焦。双样品台设计，30°旋转的载物台适用于盆栽植物，而样品板则适用于叶片成像。 采用独特的镀膜技术，GFP，RFP等专用的窄波发射滤光片可有效分离信号荧光和叶绿素自发荧光，从而避免了自发荧光的干扰（如下图，油料改良中心及杂交水稻研究中心的实验结果，GFP及mCherry标记）。深度制冷，高灵敏度的CCD相机，尤其适用于LUC报告基因的检测；多通道扫描式荧光光源，涵盖400~800nm，激发均一性≥99%，除用于GFP外，还可以满足YFP，RFP等多种报告基因检测；搭载功能强大的图像获取及分析软件，使得Newton 7.0 Bio在植物基因表达调控，转基因鉴定，植物逆境胁迫，突变体筛选，微生物侵染，植物生物节律等领域都能展现出无与伦比的性能。Newton 7.0 Bio将会是植物研究领域科研人员的得力助手！END昊诺斯生物更专业 更优质 更贴心与实验室相伴

来自上海交通大学系统生物医学院的吴强教授近期在复杂基因簇研究方面又取得新的原创性成果，相关文章发表在PLoS One上。 　　尿苷二磷酸葡醛酸转移酶(UGT)基因簇和原钙粘蛋白基因簇具有相似的基因组结构，都具有可变区和恒定区，类似于生物抗体的基因结构，通过可变剪接可以产生非常多的蛋白质分子多样性。UGT蛋白家族在生物体化学防御和药物代谢系统中具有重要科学意义。例如，UGT蛋白家族在直肠癌药物伊利替康的肝脏代谢中起着举足轻重的作用。因此，研究UGT基因家族对研究药物在肝脏中的代谢机制，以及指导临床个性化药物治疗和合理用药、预测药物相互作用、减少药物不良反应、预防人类疾病都具有重要意义。但是，UGT分子多样性的产生机理还不清楚。 　　此项成果是在吴强实验室UGT基因簇长期研究的基础上，运用系统生物学的方法，通过分子克隆和基因组结构分析，发现斑马鱼模式生物UGT全基因谱系共45个新基因，系统地比较了脊椎动物UGT全基因谱系，揭示了UGT基因谱系的选择进化及亚型分类，阐明了UGT基因在进化过程中的分子多样性机理。该研究得到了科技部、国家自然科学基金和浦江人才基金等基金的资助。 　　吴强实验室在2009年5月曾在原钙粘蛋白功能研究上取得新进展，相关成果公布在《Molecular and Cellular Biology》((2009，29: 3045-3061)上。 　　我们的大脑包含超过一千亿个神经元细胞，这些细胞形成约一百五十万亿个特异性的突触连接。阐明人类脑神经复杂连接的发育机理和大脑学习记忆的认知功能是生命科学的巨大挑战。原钙粘蛋白家族是大脑神经元细胞膜上具有细胞特异性表达模式的细胞粘连分子。原钙粘蛋白有非常复杂的分子多样性，可能在脑发育和脑功能方面起到重要作用。 　　该研究通过对基因打靶小鼠的表型分析，利用绿色荧光蛋白作为报告基因敲入原钙粘蛋白位点，发现一个原钙粘蛋白基因在大脑皮层发育过程中的中间神经元切线状和放射状迁移中起到重要作用。

荧光定量PCR技术是将常规的PCR和荧光检测技术相结合，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，以此实现对初始模板的定量分析。荧光定量PCR技术作为当今生物学研究的重要手段之一，在基础科学、生物技术、医学研究、法医学、诊断学等多方面具有广泛的应用前景。说到荧光定量PCR技术，我们经常会问类似于“你的实验是染料法还是探针法”，“你用的探针是什么类型”等之类的问题，这其实是对荧光标记的选择。根据荧光标记的不同，可以将荧光定量PCR实验分为探针法和染料法两大类。染料法染料法利用能与DNA双链结合的染料来实现，如SYBR Green I。该染料在游离状态下呈现微弱的荧光，一旦与双链DNA的双螺旋小沟结合，其绿色荧光增强约1000倍。因此其总的荧光强度与双链DNA含量成正比，利用这一关系可以反映生成的PCR产物的量（图 1）。SYBR Green I的最大吸收约在497 nm，发射波长最大约在520 nm，与FAM荧光分子的光谱性质类似，因此在所有的荧光定量PCR设备中都是第一通道检测，即“FAM/SYBR Green I”通道。▲ 图1 染料法原理图理论上，所有能与双链DNA结合的染料都可以用于qPCR检测，如溴化乙锭EtBr，碘化丙啶PI，吖啶橙、Cy3等。而选择用于qPCR反应的染料通常会从信号强度、生物安全性、检测简便性和经济适用性这几个因素考虑。例如EtBr可能存在潜在的致癌性。综合考虑下来，SYBR Green I成了比较理想的选择。目前，使用Evagreen的实验者也越来越多，Evagreen作为一种新型的染料，其光谱性质与SYBR Green I类似，其优势在于：▶ 对PCR反应的抑制程度小。高浓度SYBR Green I会强烈抑制PCR反应，因此要控制其使用浓度，一定程度上降低了DNA检测的灵敏度。▶ 与DNA结合密度高。单位长度的DNA双链上Evagreen的密度更高，为饱和型染料，消除了SYBR Green I存在的“染料重分布”的缺陷，提高检测灵敏度的同时也可用于高分辨率溶解曲线HRM。▶ 化学性质更稳定，适合长期保存。TaqMan 探针TaqMan 探针基本可以满足60%以上的qPCR实验，如常规的基因表达和拷贝数变异CNV实验。TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5' 末端，而淬灭剂则在3' 末端（图2）。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收 PCR扩增时, Tag酶的5' -3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。▲ 图2 Taqman探针MGB探针对于要分辨单碱基差异的SNP实验，采用对碱基错配容忍度更低的MGB探针，在淬灭基团后加入了DPI3基团（图3），从而提高了与靶标结合的亲和力；而且可以对靶点碱基进行化学修饰，如PeptideNucleic Acid和Locked Nucleic Acid。▲ 图3 MGB探针双杂交探针Taqman探针对探针的长度有比较严格的要求，双杂交探针则消除了这一“缺陷”。双杂交探针是由两条寡核苷酸单链组成，一条的3’端带有供体荧光分子，另一条的5’端带有受体荧光分子（图4）。游离状态下荧光供体会发出荧光，但当两条单链都匹配到模板链上时，就会发生荧光共振能量转移FRET，受体荧光分子就可以发出荧光，其荧光强度与生成的产物的量成正比。双杂交探针的优势有两点：摆脱了探针长度的限制，较长的探针可以提高与模板匹配的成功率；只有上下游两条探针都正确匹配后才能检测到受体荧光分子发出的荧光，特异性有所提高。▲ 图4 双杂交探针分子信标探针游离状态下，分子信标探针是一种茎环结构，其环状部分的15-30个碱基可以与靶标区域相结合匹配，下端的配对区域（左右一般各5-6个碱基）则由重复的GC组成，从而将5’的荧光分子和3’的淬灭基团紧紧聚在一起，荧光发生淬灭；当退火时，分子信标探针解开环并与模板靶标杂交，这样荧光分子和淬灭基团的物理距离就变大了，荧光淬灭的前提就打破了（图5）。除了MGB探针，分子信标探针也非常适合用于SNP检测。▲ 图5 分子信标探针除了上述几种类型的探针之外，还有尝试将引物和探针功能相结合的技术，如Amplifluor、LUX等，在设计难度上有所提高，但使用时更简便。各有其应用的侧重点和设计上的利弊，在此不多赘述。那么在荧光定量PCR实验中，我们应该如何进行选择呢？在这里，给大家总结了一些两种方法的区别，供大家参考。表1 染料法和探针法的区别

实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。qPCR 原理将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。那在我们了解了qPCR的原理之后，我们接下来就要了解一下这几个我们在做实时荧光定量PCR的实验时，一定要清楚的知道的几个概念：CT值、扩增曲线、基线、荧光阈值和阈值循环数01Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。02扩增曲线（amplification curve）是在实时荧光定量PCR中监测到的荧光信号随着循环数变化而绘制的一条曲线。在进行PCR反应过程中，通过检测系统对PCR管内的样品进行实时检测，最后将荧光信号值通过成像技术显现在计算机上。正常的扩增曲线包括四个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。03基线（baseline）是背景曲线的一段，在扩增反应的最初数个循环里荧光信号变化不大，接近一条直线。04荧光阈值（threshold）是在荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准）。荧光阈值可以设定在PCR扩增的指数期。05阈值循环数表示每个PCR反应管内荧光信号达到设定的荧光阈值所经历的循环数，研究表明，各模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，即起始拷贝数越多，CT值越小 起始拷贝数越少,CT值越大。我们利用已知起始拷贝数的标准品可做出以起始拷贝数的对数为横坐标,CT值为纵坐标的一条标准曲线。只要获得未知模板的CT值,即从标准曲线上计算出该模板的起始拷贝数。06荧光化学目前，实时荧光定量PCR技术主要通过两种方式——荧光染料或者荧光标记的探针对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，并结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。那我们要如何选择qPCR的检测方法呢？下面我就列出他们各自的优缺点，大家可以参考一下！ qPCR和常规PCR的区别实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测敏感性高需要样品少特异性高精确定量qPCR常见问题分析1.无Ct值出现检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。2. Ct值出现过晚（Ct38）扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。3. 标准曲线线性关系不佳加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。模板中存在抑制物，或模板浓度过高4. 负对照有信号引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。5. 扩增效率低反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。6. 溶解曲线不止一个主峰引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的 mix 试剂盒。模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线，如何判断？判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。8. 扩增曲线的异常？比如“S”型曲线？参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)模板的浓度太高或者降解荧光染料的降解

什么是实时荧光定量PCR（qPCR）?在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过Cq值和标准曲线对起始模板进行定量分析的方法。一．使DNA产物发出荧光的常用标记方法① 非特异性荧光染料—SYBR Green荧光染料也称DNA结合染料，SYBR Green 是一种结合于所有DNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。游离的SYBR Green几乎没有荧光信号，但结合双链DNA后，其荧光信号可呈数百倍的增加。随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大，其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。▲ 图1. SYBR Green染料法发光原理② 特异性荧光探针—TaqMan探针qPCR中最常用的荧光探针为TaqMan探针，其基本原理是依据目的基因设计合成一个能够与之特异性杂交的探针，该探针的5' 端标记荧光基团，3' 端标记淬灭基团。完整的探针，两个基团的空间距离很近，淬灭基团的靠近会通过空间上的荧光共振能力转移（FRET）而显著降低由荧光基团发射的荧光。PCR扩增时，探针一般先于引物结合到目的基因序列上，结合位点位于其中一个引物结合位点的下游。随着引物的延伸通过Taq DNA聚合酶的5' 外切酶活性，探针发生水解，荧光基团和淬灭基团进行分离，从而增强了荧光基团的信号。每经过一个PCR循环，就会有更多的荧光基因从探针上脱离，荧光强度会随着PCR产物的增加而增加。因此，根据PCR反应体系中的荧光强度即可得出初始DNA模板的数量。▲ 图2. TaqMan探针法发光原理二．荧光定量PCR系统如何记录荧光信号所有的实时荧光定量PCR系统都有三个共同的组成部分：温控系统，光源系统和检测系统。温控系统用于PCR扩增，执行高温变性，低温退火和中温延伸的步骤；光源系统用于激发荧光染料或荧光基团，使其发出信号；检测系统采集荧光信号。温控系统每完成一个循环，光源和检测系统则先后进行激发和采集，从而实时记录每一个循环荧光信号的变化。随着PCR反应的进行，产物逐渐积累，荧光信号逐渐增强。▲ 图3. 实时荧光定量PCR系统检测原理那么Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统，采用了高能LED作为光源系统，可保证光源强度高，光源一致性好；高品质的帕尔贴温度模块作为温控系统，升降温速率快，可设置12列跨度30°C的温度梯度；卓越的CMOS拍照+光纤信号传输作为检测系统，CMOS检测灵敏度高，光纤传输速度快，无光损失和噪音干扰，无需ROX校准。Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统的高配置保证为您的科学研究提供高精准度、高灵敏度和高可靠性的实验结果。▲ 图4. Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统三．如何根据荧光信号得出初始模板量实时荧光定量PCR系统所监测到的所有循环的荧光信号可以绘制成一条曲线，即为荧光扩增曲线。扩增曲线一般分为基线期、指数期、线性期和平台期。指数期内，每个循环PCR产物量大约增加1倍（假定100%反应效率），该阶段的扩增反应具有高度特异性和精确度，所以重复性好。▲ 图5. 扩增曲线qPCR软件会在指数期划定一个阈值线，阈值线对应一个荧光强度值，即阈值。在qPCR过程中，各扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时，所经过的扩增循环数即是Cq值。Cq值与初始模板量的对数成线性关系。样本初始模板量越多，荧光信号达到阈值所经历的循环数越少，即Cq值越小。▲ 图6. Cq值与初始模板量的关系

作为一项新兴的分子、基因表达的分析检测技术，在体生物光学成像已成功应用于生命科学、生物医学、分子生物学和药物研发等领域，取得了大量研究成果，主要包括： 在体监测肿瘤的生长和转移、基因治疗中的基因表达、机体的生理病理改变过程以及进行药物的筛选和评价等。 1、在体监测肿瘤的生长和转移 利用在体生物光学成像技术，通过荧光素酶或绿色荧光蛋白标记肿瘤细胞，可以实时监测被标记肿瘤细胞在生物体内生长、转移、对药物的反应等生理和病理活动，揭示肿瘤发生发展的细胞和分子机制。Contag 等[1] 将荧光素酶和绿色荧光蛋白作为报告基因，对肿瘤细胞进行活体成像，探讨了使用报告基因在细胞分子水平研究肿瘤的前景，并指出在体生物光学成像技术具有较高的灵敏度，尤其在监测肿瘤细胞的生长方面具有较大优势。Yang等[2,3] 首先利用光学成像系统对表达绿色荧光蛋白的肿瘤实现了实时非侵入性成像，记录了肿瘤的转移过程，开辟了在整体水平上无创、在体、实时跟踪肿瘤发生、发展和转移等生物学行为的崭新领域。Jenkins 等[4] 将标记了荧光素酶基因的人类前列腺癌细胞注射到小鼠体内，利用在体生物光学成像系统，实时、在体监测了前列腺癌细胞化疗后的复发和转移情况。基于绿色荧光蛋白的在体生物光学成像也在肺癌、大肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、脑胶质瘤和乳腺癌等多种肿瘤的生长转移等研究中得到了越来越广泛的应用[2,3,5,6]。 2、在体监测基因治疗中的基因表达 随着后基因组时代的到来和人们对疾病发生发展机制的深入了解，在基因水平上治疗肿瘤、心血管疾病、AIDS 和分子遗传病等恶性疾病已经得到国内外研究人员越来越广泛的关注。如何客观地检测基因治疗的临床疗效判断终点，有效监测转基因在生物体内的传送，并定量检测基因治疗的转基因表达，已经成为基因治疗应用的关键所在。通过荧光素酶或绿色荧光蛋白等报告基因，在体生物光学成像技术能够进行基因表达的准确定位和定量分析，在整体水平上无创、实时、定量地检测转基因的时空表达[7]。McCaffrey 等[8] 将荧光素酶标记在靶基因上，应用siRNA 及shRNA 减弱了小鼠转染的荧光素酶的表达，在活体动物体内首次实时观察到siRNA 对特异靶基因表达的阻断作用。以病毒[9，10](如腺病毒及腺相关病毒等) 作载体，将荧光素酶基因或绿色荧光蛋白等作为报告基因加入载体，采用在体生物光学成像，能够实时观察病毒在动物体内的侵染活动，获取病毒侵染部位等相关信息。 3、揭示机体的生理病理改变过程 目前，在体生物光学成像技术已成功应用于干细胞移植、肿瘤免疫、毒血症、风湿性关节炎、皮炎等发病机制的研究中，可以实时监测生物机体的生理病理改变过程，具有重要的临床意义。应用转基因鼠，Wang等[11] 将荧光素酶基因转导于人类造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSC) 中，并将其植入脾及骨髓，利用在体生物光学成像技术，揭示了HSC 在小鼠骨髓腔中植活、增殖等动态信息，实时监测HSC 的后代在小鼠体内的生长等。Kim等[12] 将荧光素酶基因转染于神经前体细胞(Neuralprogenitor cell，NPC)，并注射入小鼠脑梗模型中，在体生物光学成像系统显示神经前体细胞迅速游走聚集至梗塞病灶处。风湿性关节炎和类风湿性关节炎的动物模型研究表明： 荧光报告基因在患关节炎的关节局部产生荧光信号，在健康组织周围未见荧光信号，能够动态观测关节炎的发生和发展，对关节炎疾病的治疗具有重要意义。另外，在体生物光学成像技术在生物大分子间相互作用及细胞凋亡的研究中也取得了一定进展。Paulmurugan 等[13] 将胰岛素样生长因子与胰岛素样生长因子结合蛋白分别用绿色荧光蛋白及Renilla 荧光素酶基因融合，研究它们之间在活体小动物体内的相互作用。 4、药物的筛选和评价 目前，转基因动物模型已大量应用于病理研究、药物研发、药物筛选和药物评价等领域。 通过体外基因转染或直接注射等手段，将荧光素酶或绿色荧光蛋白等报告基因标记在生物体内的任何细胞(如肿瘤细胞、造血细胞等) 上，采用在体生物光学成像技术对其示踪，了解细胞在生物体内的转移规律，不仅能够检测转基因动物体内的基因表达或内源性基因的活性和功能，而且能够对药物筛选及疗效进行评价。Zhang 等[14] 利用转基因鼠，研究可诱导的NO 合成酶在急慢性免疫反应中的作用，并以此对多种化合物进行抗免疫反应的测试和筛选。肺癌、前列腺癌、黑色素瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌和脑癌的原位GFP 肿瘤的整体荧光成像模型已经建立[15]，利用转移鼠和血管鼠实现了抗肿瘤生长转移和血管生成的在体药物筛选和评价(http：//www.metamouse.com)。基于绿色荧光蛋白的在体荧光成像揭示了肿瘤发生发展的细胞和分子机制，非侵入性在体评价抗肿瘤药物的疗效[1]。 参考文献 1、 Contag C H，Jenkins D，Contag P R，Negrin R S. Use of reporter genes for optical measurements of neoplastic disease in vivo. Neoplasia，2000，2(1-2)： 41~52 2、 Yang M，Baranov E，Jiang P，Sun F X，Li X M，Li L. Whole-body optical imaging of green fluorescent protein expressing tumors and metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2000，97(3)： 1206~1211 3、 Yang M，Baranov E，Wang J W，Jiang P，Wang X，Sun F X. Direct external imaging of nascent cancer，tumor progression，angiogenesis，and metastasis on internal organs in the fluorescent orthotopic model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2002，99(6)： 3824~3829 4、 Jenkins D E，Yu S F，Hornig Y S，Purchio T，Contag P R. In vivo monitoring of tumor relapse and metastasis using bioluminescent PC-3M-luc-C6 cells in murine models of human prostate cancer. Clinical and Experimental Metastasis,2003，20(8)： 745~756 5、 Hasegawa S，Yang M，Chishima T，Miyagi Y，Shimada H，Moossa A R. In vivo tumor delivery of the green fluorescent protein gene to report future occurrence of metastasis. Cancer Gene Therapy，2000，7(10)： 1336~1340 6、 Bouvet M，Wang J W，Nardin S R，Yang M，Baranov E,Jiang P. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pan creatic cancer orthotopic model. Cancer Research，2002，62(5)： 1534~1540 7、 Vassaux G，Groot-Wassink T. In vivo noninvasive imaging for gene therapy. Journal of Biomedicine and Biotechnology，2003，2003(2)： 92~101 8、 McCaffrey A P，Meuse L，Pham T T，Conklin D S，Hannon G J，Kay M A. RNA interference in adult mice. Nature，2002，418(6893)： 38~39 9、 Sato M，Johnson M，Zhang L Q，Zhang B，Le K，Gambhir S S. Optimization of adenoviral vectors to direct highly amplied prostate-specificexpression for imaging and genetherapy. Molecular Therapy，2003，8(5)： 726~737 10、 Tseng J C，Levin B，Hunado A，Yee H，de Castro I P,Jimenez M. Systemic tumor targeting and killing by Sindbis viral vectors. Nature Biotechnology，2004，22(1)： 70~77 11、 Wang X，Rosol M，Ge S，Peterson D，McNamara G，Pollack H. Dynamic tracking of human hematopoietic stem cell engraftment using in vivo bioluminescence imaging. Blood，2003，102(10)： 3478~3482 12、 Kim D E，Schellingerhout D，Ishii K，Shah K，Weissleder R. Imaging of stem cell recruitment to ischemic infarcts in a murine model. Stroke，2004，35(4)： 952~957 13、 Paulmurugan R，Gambhir S S. Monitoring protein-protein interactions using split synthetic renilla luciferase protein-fragment-assisted complementation. Analytical Chemistry，2003，75(7)： l584~1589 14、 Zhang N，Weber A，Li B，Lyons R，Contag P R，Purchio A F. An inducible nitric oxide synthase-luciferase reporter system for in vivo testing of anti-inflammatory compounds in transgenic mice. The Journal of Immunology，2003，170(12)：6307~6319 15、 Hoffman R M. Green fluorescent protein imaging of tumour growth，metastasis，and angiogenesis in mouse models. The Lancet Oncology，2002，3(9)： 546~556

实时荧光PCR (rtPCR) 是目前应用最广的核酸检测技术，检测模式采用闭管检测，相对于开管检测而言，rtPCR极大降低了扩增产物的污染机会，节省了时间和人力，便于实现自动化，更可以利用阈循环数（Cq值）支持定量检测。然而，rtPCR的一个很大局限在于单个反应所能检测的靶基因数目有限。根据目前主流荧光PCR仪器检测通道数目，单个反应所能检测的靶基因数目很难超过4-6个，限制了该技术在涉及多靶点的复杂疾病上的应用。在PCR反应后添加熔解分析步骤，可在一定程度上增加可检测靶基因数目，但是，伴随荧光探针类型的增加，荧光背景及检测成本也随之升高，尤其是，探针结合区任何核酸变异都可能引起熔点偏移，导致结果误判，使得该法对于靶标数目的提升依然受限。与那些广受瞩目的高通量检测技术相比，已有30年历史的rtPCR似乎正成为一种“低阶”核酸检测技术。在2022年2月24日在线发表于《美国国家科学院院刊》（PNAS）的一项研究中，厦门大学生命科学学院李庆阁团队报道了一种称为“MeltArray”的荧光PCR新技术，一举将荧光PCR的单管检测能力提高到一个数量级以上，并通过多个临床应用场景，系统展示了该技术强大而灵活的检测能力。“MeltArray”巧妙地利用了Taq DNA聚合酶的5' -瓣状内切酶活性，在PCR反应中，该活性将位于引物下游的“媒介探针”切割，生成“媒介引物”，“媒介引物”进而与分子信标报告探针结合，在Taq酶聚合活性作用下，沿着分子信标延伸生成具有特定熔点的荧光双链，最终使媒介探针特异识别的靶标获得一个包括荧光类型和熔点值的“二维”标记。由于每个分子信标可以允许多个媒介引物形成一系列具有不同熔点的荧光双链，单个MeltArray多重荧光PCR反应可检测的总靶基因数目就等于反应中分子信标数目乘以其所容纳的媒介引物数目。作者在文中展示了单个荧光通道可检测12个靶标，6个荧光通道的仪器可以检测多达72个靶标！这是单个闭管PCR一步法迄今所能检测的最大靶基因数目。该技术实现的关键是获取一种具有“多泊位”的报告探针，以容纳众多的媒介引物。研究人员首先比较了线性探针和分子信标分别用作报告探针的优劣，分子信标因具有清晰的背景而胜出。接着，作者考察了分子信标的“多泊位”能力。他们小心翼翼地从两重PCR开始，首先证明一个分子信标可以允许两个“媒介引物”停泊；又通过一个四重PCR，证明了一个分子信标可以允许四个“媒介引物”叠加式停泊，由此，提出了一个分子信标可以容纳任意多个媒介引物的假设。根据目前荧光PCR仪器的熔点分辨率，利用两个分子信标，实验验证了单个荧光通道即可检测12个靶基因。最后研究人员构建了一个阵列式结构的“媒介子”库及其对应的分子信标报告探针，以实现检测的标准化。为降低多重PCR中多对引物并存可能产生的引物二聚体干扰，研究人员又引入了“PCR抑制”概念，至此提出了MeltArray的完整技术原理（图1）。图1 MeltArray的技术原理为验证MeltArray的多重检测能力，作者首先设计了一个20重PCR的 MelArray检测体系，覆盖人类Y染色体无精子因子区域 (AZFa、AZFb、AZFc和AZFd)的18个序列标签位点和2个参照基因（SRY基因和ZFX/Y基因）。在正常男性样本，20个位点全部存在，即均有熔解峰，而患者男性则会出现1个或多个熔解峰的缺失——该实验是一个典型的多靶标同时出现的例子（图2）。实验结果表明，该MelArray体系仅利用三个荧光通道，就实现了20个靶标的同时检出。为评估模板量对MeltArray检测能力的影响，作者考察了从100 ng到100 pg的健康男性和女性的基因组DNA，在该范围内，所有模板均被稳定检出。随着DNA模板量的逐渐降低，熔解峰高度有所下降，但20个峰的熔点值均未发生变化。最后，作者通过对757份样本的双盲检测，证实了MeltArray体系的准确性。图2 MeltArray技术应用于20重人类Y染色体微缺失的检测受以上结果鼓舞，作者开始挑战更多的靶标数目。这次，他们使用六个荧光通道设计了一个62重PCR的MeltArray检测体系（图3），用于识别61种O抗原合成基因及1个大肠杆菌管家基因yccT。我们看一下此时每个通道的检测数目，按照荧光波长从低到高的次序，六个荧光通道检测的靶标数目分别是11、9、12、12、8和10个！各个通道的重复实验结果采用3倍标准偏差显示，每一个靶标对应的熔点值均稳定且能明确区分。最后，作者利用该体系鉴定了167株大肠杆菌培养株的血清型，除了覆盖范围之外的4株，检测结果与全基因组测序结果完全一致，而且比传统抗血清法多鉴定出11株，还另外纠正了其鉴定错误的1株。图3 MeltArray技术用于61种大肠杆菌O血清型分型上述两个例子均为定性检测，那么，MeltArray可否另外进行定量检测呢？为回答这一问题，研究团队设计了一个24重PCR的呼吸道病原体检测体系（图4），他们将其中的19种非定植菌/病毒和1个内控基因设置为熔解分析模式，即定性检测；另外4种细菌设置为实时PCR检测模式——即TaqMan探针模式，即定量检测。需要指出的是，作者选择变性阶段进行实时荧光检测。他们相信，实时检测的对象是探针酶切后积累的荧光信号，无论变性阶段还是延伸阶段，检测结果应该一致。在变形阶段，任何报告探针产生的荧光都会趋于一致，而不影响实时检测结果。事实证明了作者的这一设想。该体系在定性检测19种靶基因的同时，成功实现了4种靶基因的定量检测。24重PCR的MeltArray检测体系分析灵敏度达10 copies/μl。通过对67份肺炎或呼吸道感染患者的肺泡灌洗液样本的验证，证实了检测结果的可靠性。图4 实时PCR和熔解曲线分析同时应用于呼吸道病原体的定性和定量检测突变分析是核酸检测另一重要应用领域，为考察MeltArray可否用于突变分析，研究团队以KRAS突变为例，设计了一个称为“微测序”的突变鉴定体系，即在单个反应管内一一鉴定出发生在KRAS基因密码子12和密码子13上的9种类型的突变（图5）。在这里，作者利用了探针杂交的特异性，利用10条媒介探针，对上述9种突变类型和野生型分别加以二维标记。实验表明，该体系具有极佳的突变检测特异性，可耐受高达500 ng的野生型基因组DNA，可检测的突变等位基因频率达到5%-10%，优于Sanger测序——其最低突变等位基因频率在10%-20%之间，检测限低至30个拷贝每反应。最后作者利用该体系检测了167份结直肠癌组织样本的KRAS突变类型，获得了与Cosmic数据库一致的突变频率分布，同时也表明，MeltArray比Sanger测序具有更灵敏的突变检测能力。图5 MeltArray技术用于KRAS突变的微测序MeltArray的以上四个应用场景，实际上对应了分子诊断的三大应用领域，即遗传病、传染病（又分别涉及到病原体鉴定及病原体定性、定量检测这些细分领域）和肿瘤的分子诊断，显示出MeltArray做为通用核酸检测技术的典型特征。当前，实现类似靶标数目的检测均需“开管检测”技术，如芯片、质谱、微球、电泳等，然而这些技术普遍存在设备昂贵，操作复杂、周转时间长等缺点，且国产化率低，在国内外市场上不温不火，长期进展缓慢。相对而言，MeltArray采用广泛可及且已国产化的荧光PCR仪器，具有明显的成本低、操作简便、自动化程度高、周转时间短等诸多优势，结合本文所展现的强大而灵活的技术优势，不仅成功推动荧光PCR这一“老技术”再上“新台阶”，也完美填补了长期存在于低阶PCR和高通量检测二者之间的技术空白！厦门大学生命科学学院黄秋英助理教授、博士生陈冬梅、杜琛为共同第一作者，李庆阁教授、廖逸群副教授为共同通讯作者，共同作者包括厦门大学硕士生刘巧巧、林素、梁兰兰、许晔副教授。该研究得到了国家科技重大专项（No. 2017ZX10302301 & No. 2017ZX10303406）、国家自然科学基金（No. 81672110）、福建省社会发展高校产学合作项目（No. 2019Y4002）、厦门市科技计划项目（No. 3502Z201830070 & No. 3502Z20183013）的资助。本文所描述的MeltArray技术已在中国、美国、欧洲、日本、韩国获得专利授权，并向澳大利亚等国递交了专利申请。李庆阁团队长期从事荧光PCR尤其是多重荧光技术平台研究，2001年报告一种新的寡核苷酸杂交反应模式（Nucleic Acids Research），发明置换探针和置换引物（中、美、日、澳及欧洲专利授权）；2004年提出置换探针基因分型技术（Nucleic Acids Research）；2006年发明探针编码实时PCR（Clinical Chemistry，中国发明专利授权）；2011提出自淬灭探针的多色探针熔解曲线变异分析技术（Journalof Molecular Diagnostics，中、美专利授权），2013年提出基于连接反应的“荧光—熔点”二维标记技术（Nucleic Acids Research, 中、美、欧洲专利授权）。声明：仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，会及时更正，谢谢！

酶标仪问世之初，是酶联免疫吸附试验(ELISA)的专用检测仪器。随着科学技术发展和市场需求演变，酶标仪被赋予的功能日益丰富。由最初的吸收光(Abs)检测，到荧光强度(FI)、发光检测(Lum)，再到荧光偏振(FP)、时间分辨荧光(TRF)等检测技术，酶标仪早已突破了ELISA的范畴，在追“光”道路驰而不息。为帮助广大用户及时了解酶标仪前沿技术、主流品牌与创新产品、市场动态以及相关活动，仪器信息网特别策划了《从光吸收到多功能，酶标仪的“逐光”之路》专题（点击查看）。本期，我们特别邀请到美谷分子产品市场经理尹迪谈一谈美谷分子酶标仪创新检测技术及他对酶标仪应用及未来市场的看法。仪器信息网：请介绍当前中国酶标仪市场规模及现状。过去三年最强劲的市场需求来自哪些领域？尹迪：近年来，在市场需求刺激和国家相关政策扶持背景下，中国生命科学领域研究呈现高速发展态势，生命科学仪器产业也随之迅速发展。酶标仪作为传统生命科学仪器之一，其市场需求也在稳步增长。尤其过去三年，在全球新冠疫情影响下，酶标仪市场迎来一波短暂采购热潮，其中生物制药领域需求最明显。据调研报告显示，去年全球酶标仪的市场规模约6亿美元，增长率维持在5%-7%。作为发展中国家，去年中国酶标仪市场规模约1.2亿美元，占全球总份额1/5，增长率维持在9%-11%。这充分表明中国酶标仪市场充满活力与机遇，美谷分子将继续加码中国市场，深耕本土化进程，持续不断为用户提供创新解决方案和全方位服务。鉴于新冠疫情、“贴息贷款”相关政策等多重因素影响，未来中国酶标仪市场的高增长态势不再持续，即将迎来修复行情。但相较全球酶标仪市场，中国市场的自然增长率仍会处于首位。仪器信息网：请点评吸光度(Abs)、荧光强度(FI)、时间分辨荧光(TRF)、荧光偏振(FP)和化学发光(Lum)等不同酶标仪检测方法的优劣势？尹迪：随着科学技术发展和应用场景不断拓展，如今酶标仪搭载检测功能日益丰富，各种检测技术相辅相成。若按综合应用划分，酶标仪检测技术中光吸收(Abs)应用范围最广；荧光和发光等功能的使用频率约占30%，随着相关试剂开发，未来荧光检测应用会更加成熟；由于实验操作复杂、试剂价格较高及使用场景受限，时间分辨荧光(TRF)和荧光偏振(FP)的应用尚未全面普及。针对特殊应用领域的用户，美谷分子也积极开发相关创新解决方案和配套试剂，比如细胞内的钙离子检测和离子通道检测等。仪器信息网：请谈谈酶标仪未来技术发展趋势？尹迪：技术革新和市场需求对酶标仪的未来发展将会产生直接影响。个人预测酶标仪将由常规仪器演变成高端仪器，多功能酶标仪将抢占单功能酶标仪的市场份额。就技术而言，鉴于当代物理化学检测技术短时间难以实现颠覆性突破，未来酶标仪在现有的功能基础上，一方面可能增加类似Label-Free的技术，帮助用户解决更多前沿科学难题；另一方面，通过模块化设计，分别实现对温度、湿度和氧气等环境因素的独立控制，从而最终实现应用场景模块化。就市场而言，未来酶标仪需求变化将集中在低端市场。随着消费升级和入门级多功能酶标仪产品增多，多功能酶标仪将逐渐抢占单功能酶标仪的市场份额。仪器信息网：未来最看好哪些应用细分？尹迪：首先看好生物制药领域，其次是细胞与基因治疗领域，环境监测也将重点关注。随着抗体药物进入黄金发展时代，新药审批速度和数量将越来越快，其数据完整性、安全性的合规性愈发严格。未来，美谷分子将更关注生物制药企业的合规体系建立。例如针对生物制品GMP\GLP 的相应要求，美谷分子推出了目前最新版SoftMax Pro 7.2 GxP合规软件。另外，随着细胞与基因治疗领域蓬勃发展，国内生物医药产业的整体创新能力和前沿领域影响力将进一步提升。美谷分子将借助丹纳赫集团生命科学平台，为用户提供在生命科学研究、制药及生物治疗开发等领域蛋白和细胞生物学的创新性生物分析解决方案。环境监测方面，未来酶标仪也具有广阔的应用前景。进入“十四五”时期以来，生态环境质量改善进入了由量变到质变的关键时期，生态环境监测网络建设也正在进一步巩固。多污染物全要素监测需求推动着环境监测新技术不断革新，创新应用模式，延伸应用场景，同时也对酶标仪带来了新的机遇与挑战。仪器信息网：贵司目前主推的酶标仪产品是什么？请您谈谈该产品的核心竞争力。尹迪：美谷分子公司始创于上世纪80年代美国硅谷。作为全球高通量仪器设备的优秀品牌，美谷分子酶标仪可满足众多生命科学研究需求。在硬件方面具备高稳定性，例如两次进入太空和一次到达南极科考站，分别经历失重、高辐射以及低温等恶劣环境考验仍保持出色状态；在软件方面，美谷分子的酶标仪不仅具有出色的处理模型，可以满足用户个性化多样化需求，而且具备合规性，符合美国行业规则的要求。针对复杂多变的酶标仪市场，美谷分子公司统筹规划、广泛布局，分别推出高中低端系列产品，包括FlexStation 3多功能酶标仪、SpectraMax iD3/iD5多功能酶标仪和SpectraMax M多功能酶标仪等20多款产品。FlexStation 3 多功能酶标仪FlexStation 3是一款基于光栅的多功能酶标仪，具备出众的光路及全自动加样方式，可大批量地读数并应用均相和非均相的生化和细胞微孔板检测，最大支持1536孔板。兼具吸收光(紫外-可见)、荧光强度、化学发光、荧光偏振和时间分辨荧光五大检测功能，能够满足目前实验室各种检测功能需求。其主机搭载8道或16道的移液系统，可快速、精确地将不同种类和浓度的液体加入至检测微孔板中，适用于快速反应体系的检测，保证动力学数据的准确性和重复性。此外，毫秒级别的快速读板功能使其对钙流、膜电位、心肌细胞跳动检测以及闪光型双报告基因等快速动力学检测等具有显著优势。SpectraMax iD5多功能酶标仪SpectraMax iD5多功能酶标仪不仅具有光吸收、荧光、化学发光、时间分辨荧光和荧光偏振检测功能，还能扩展运行荧光共振能量转移、均相时间分辨荧光、使用注射器的双荧光素酶报告基因检测以及蛋白免疫印迹等功能。其采用新型-5℃超冷型光电倍增管（PMT），不仅有效降低背景噪音，而且扩宽检测动态学范围，从而能够提供更高的检测灵敏度。同时，主机内置光栅和滤光片双光路系统，创新性地实现了高灵活性和高灵敏度的精确结合，可随意组合进行检测优化，提高研究能力。SpectraMax iD5正面嵌入式高分辨率的触摸屏显示器能够节省宝贵的实验室空间，搭配近场通讯功能(NFC)能够快速识别并找出专属数据、模板，进而操作更加简便。另外，温度控制更加灵活、宽泛，可达室温至66℃，满足绝大多数实验需求。仪器信息网：贵公司酶标仪主要应用哪些领域的哪些实验环节？有哪些代表性用户单位？尹迪：随着技术的不断进步，当前的生命科学研究和新药研发对于高通量、精准检测及分析有着迫切需求，以微孔板为样品载体的酶标仪因其较高的自动化程度被广大科研工作者青睐。美谷分子酶标仪凭借功能创新、检测灵敏、性能可靠及完善的售后服务深受中国众多用户认可与喜爱。根据近年采购用户的单位分布，美谷分子酶标仪的工业用户群体多达60%，主要包括制药和生物公司。其中生物制药企业占据工业用户的半壁江山以上，采购部门主要是R&D部门和QC部门。R&D部门对酶标仪检测功能多样性有更高追求，而QC部门更注重酶标仪的检测性能稳定性和数据重现性。典型用户单位包括康龙化成、药明康德等国内知名药企。生物公司包括细胞治疗、基因治疗、试剂盒研发等中小型企业，受限于检测项目和公司规模，主要采购中低端酶标仪进行相关研究实验。其余40%的用户来自于科研，包括高校、科研院所、医院和政府机关等单位。仪器信息网：请介绍贵公司酶标仪发展历程中里程碑事件。尹迪：美谷分子创立于1983年的美国硅谷，创始人是来自哈佛大学的Harden McDonnel教授。公司成立之初，Harden McDonnel教授为满足自身实验需求设计研发出第一台酶标仪，并于1987年成功推向市场。2003年至2008年，公司相继推出了M2、M5/M5e等系列产品。其中M5是一台拥有多功能检测(光吸收，荧光，化学发光)、可做荧光偏振、时间分辨荧光的酶标仪。M5拥有多项特色技术，包括双套"滤片+光栅“光路设计和PATHCHECK光径传感器技术。2011年3月，M5e多功能读板机被选为可以登上美国国家航空和宇宙航行局(NASA)国际空间站的酶标仪，并于2016年再度进入太空。2013年3月，美谷分子推出可做细胞成像和Western Blot的SpectraMax i3多功能酶标仪，并于2015年推出升级款SpectraMax i3x多功能酶标仪，加入冷PMT检测器，能够有效降低背景信号、提升检测灵敏度，即使在极低光能量下也可以下获得最宽动态检测范围。美谷分子在2017年和2018年先后推出了SpectraMax iD3/iD5多功能酶标仪，在灵敏性的基础上兼容灵活性，用户可升级模块化设计，极大地拓展整个系统的检测能力。既能满足有多功能检测需求的工业用户，也能满足对数据质量有高要求的科研用户。2022年，美谷分子又推出了紧凑、便捷、灵活的SpectraMax Mini多功能酶标仪，为预算有限但需求丰富的用户提供解决方案。美谷分子产品市场经理 尹迪曾就读于第二军医大学微生物实验室，毕业后曾就职于北京保诺公司，参与 ConditionallyActive Biologics （CAB）微环境特异性药物平台的开发，此平台基础之上进行肿瘤单抗体开发，现任美谷分子产品市场经理，对酶标仪的应用、技术、数据分析有着丰富的经验。如有技术干货、科研成果、酶标仪使用心得等内容，欢迎投稿，投稿文章将在《从光吸收到多功能，酶标仪的“逐光”之路》专题（点击查看）展示并在仪器信息网相关渠道推广。投稿邮箱：zhaoyw@instrument.com.cn，关于征稿内容要求也可邮件咨询或电话联系：13331136682（同微信）。

酶标仪问世之初，是酶联免疫吸附试验(ELISA)的专用检测仪器。随着科学技术发展和市场需求演变，酶标仪被赋予的功能日益丰富。由最初的吸收光(Abs)检测，到荧光强度(FI)、发光检测(Lum)，再到荧光偏振(FP)、时间分辨荧光(TRF)等检测技术，酶标仪早已突破了ELISA的范畴，在追“光”道路驰而不息。为帮助广大用户及时了解酶标仪前沿技术、主流品牌与创新产品、市场动态以及相关活动，仪器信息网特别策划了《从光吸收到多功能，酶标仪的“逐光”之路》专题（点击查看）。本期，我们特别邀请到美谷分子产品市场经理尹迪谈一谈美谷分子酶标仪创新检测技术及他对酶标仪应用及未来市场的看法。仪器信息网：请介绍当前中国酶标仪市场规模及现状。过去三年最强劲的市场需求来自哪些领域？尹迪：近年来，在市场需求刺激和国家相关政策扶持背景下，中国生命科学领域研究呈现高速发展态势，生命科学仪器产业也随之迅速发展。酶标仪作为传统生命科学仪器之一，其市场需求也在稳步增长。尤其过去三年，在全球新冠疫情影响下，酶标仪市场迎来一波短暂采购热潮，其中生物制药领域需求最明显。据调研报告显示，去年全球酶标仪的市场规模约6亿美元，增长率维持在5%-7%。作为发展中国家，去年中国酶标仪市场规模约1.2亿美元，占全球总份额1/5，增长率维持在9%-11%。这充分表明中国酶标仪市场充满活力与机遇，美谷分子将继续加码中国市场，深耕本土化进程，持续不断为用户提供创新解决方案和全方位服务。鉴于新冠疫情、“贴息贷款”相关政策等多重因素影响，未来中国酶标仪市场的高增长态势不再持续，即将迎来修复行情。但相较全球酶标仪市场，中国市场的自然增长率仍会处于首位。仪器信息网：请点评吸光度(Abs)、荧光强度(FI)、时间分辨荧光(TRF)、荧光偏振(FP)和化学发光(Lum)等不同酶标仪检测方法的优劣势？尹迪：随着科学技术发展和应用场景不断拓展，如今酶标仪搭载检测功能日益丰富，各种检测技术相辅相成。若按综合应用划分，酶标仪检测技术中光吸收(Abs)应用范围最广；荧光和发光等功能的使用频率约占30%，随着相关试剂开发，未来荧光检测应用会更加成熟；由于实验操作复杂、试剂价格较高及使用场景受限，时间分辨荧光(TRF)和荧光偏振(FP)的应用尚未全面普及。针对特殊应用领域的用户，美谷分子也积极开发相关创新解决方案和配套试剂，比如细胞内的钙离子检测和离子通道检测等。仪器信息网：请谈谈酶标仪未来技术发展趋势？尹迪：技术革新和市场需求对酶标仪的未来发展将会产生直接影响。个人预测酶标仪将由常规仪器演变成高端仪器，多功能酶标仪将抢占单功能酶标仪的市场份额。就技术而言，鉴于当代物理化学检测技术短时间难以实现颠覆性突破，未来酶标仪在现有的功能基础上，一方面可能增加类似Label-Free的技术，帮助用户解决更多前沿科学难题；另一方面，通过模块化设计，分别实现对温度、湿度和氧气等环境因素的独立控制，从而最终实现应用场景模块化。就市场而言，未来酶标仪需求变化将集中在低端市场。随着消费升级和入门级多功能酶标仪产品增多，多功能酶标仪将逐渐抢占单功能酶标仪的市场份额。仪器信息网：未来最看好哪些应用细分？尹迪：首先看好生物制药领域，其次是细胞与基因治疗领域，环境监测也将重点关注。随着抗体药物进入黄金发展时代，新药审批速度和数量将越来越快，其数据完整性、安全性的合规性愈发严格。未来，美谷分子将更关注生物制药企业的合规体系建立。例如针对生物制品GMP\GLP 的相应要求，美谷分子推出了目前最新版SoftMax Pro 7.2 GxP合规软件。另外，随着细胞与基因治疗领域蓬勃发展，国内生物医药产业的整体创新能力和前沿领域影响力将进一步提升。美谷分子将借助丹纳赫集团生命科学平台，为用户提供在生命科学研究、制药及生物治疗开发等领域蛋白和细胞生物学的创新性生物分析解决方案。环境监测方面，未来酶标仪也具有广阔的应用前景。进入“十四五”时期以来，生态环境质量改善进入了由量变到质变的关键时期，生态环境监测网络建设也正在进一步巩固。多污染物全要素监测需求推动着环境监测新技术不断革新，创新应用模式，延伸应用场景，同时也对酶标仪带来了新的机遇与挑战。仪器信息网：贵司目前主推的酶标仪产品是什么？请您谈谈该产品的核心竞争力。尹迪：美谷分子公司始创于上世纪80年代美国硅谷。作为全球高通量仪器设备的优秀品牌，美谷分子酶标仪可满足众多生命科学研究需求。在硬件方面具备高稳定性，例如两次进入太空和一次到达南极科考站，分别经历失重、高辐射以及低温等恶劣环境考验仍保持出色状态；在软件方面，美谷分子的酶标仪不仅具有出色的处理模型，可以满足用户个性化多样化需求，而且具备合规性，符合美国行业规则的要求。针对复杂多变的酶标仪市场，美谷分子公司统筹规划、广泛布局，分别推出高中低端系列产品，包括FlexStation 3多功能酶标仪、SpectraMax iD3/iD5多功能酶标仪和SpectraMax M多功能酶标仪等20多款产品。FlexStation 3 多功能酶标仪FlexStation 3是一款基于光栅的多功能酶标仪，具备出众的光路及全自动加样方式，可大批量地读数并应用均相和非均相的生化和细胞微孔板检测，最大支持1536孔板。兼具吸收光(紫外-可见)、荧光强度、化学发光、荧光偏振和时间分辨荧光五大检测功能，能够满足目前实验室各种检测功能需求。其主机搭载8道或16道的移液系统，可快速、精确地将不同种类和浓度的液体加入至检测微孔板中，适用于快速反应体系的检测，保证动力学数据的准确性和重复性。此外，毫秒级别的快速读板功能使其对钙流、膜电位、心肌细胞跳动检测以及闪光型双报告基因等快速动力学检测等具有显著优势。SpectraMax iD5多功能酶标仪SpectraMax iD5多功能酶标仪不仅具有光吸收、荧光、化学发光、时间分辨荧光和荧光偏振检测功能，还能扩展运行荧光共振能量转移、均相时间分辨荧光、使用注射器的双荧光素酶报告基因检测以及蛋白免疫印迹等功能。其采用新型-5℃超冷型光电倍增管（PMT），不仅有效降低背景噪音，而且扩宽检测动态学范围，从而能够提供更高的检测灵敏度。同时，主机内置光栅和滤光片双光路系统，创新性地实现了高灵活性和高灵敏度的精确结合，可随意组合进行检测优化，提高研究能力。SpectraMax iD5正面嵌入式高分辨率的触摸屏显示器能够节省宝贵的实验室空间，搭配近场通讯功能(NFC)能够快速识别并找出专属数据、模板，进而操作更加简便。另外，温度控制更加灵活、宽泛，可达室温至66℃，满足绝大多数实验需求。仪器信息网：贵公司酶标仪主要应用哪些领域的哪些实验环节？有哪些代表性用户单位？尹迪：随着技术的不断进步，当前的生命科学研究和新药研发对于高通量、精准检测及分析有着迫切需求，以微孔板为样品载体的酶标仪因其较高的自动化程度被广大科研工作者青睐。美谷分子酶标仪凭借功能创新、检测灵敏、性能可靠及完善的售后服务深受中国众多用户认可与喜爱。根据近年采购用户的单位分布，美谷分子酶标仪的工业用户群体多达60%，主要包括制药和生物公司。其中生物制药企业占据工业用户的半壁江山以上，采购部门主要是R&D部门和QC部门。R&D部门对酶标仪检测功能多样性有更高追求，而QC部门更注重酶标仪的检测性能稳定性和数据重现性。典型用户单位包括康龙化成、药明康德等国内知名药企。生物公司包括细胞治疗、基因治疗、试剂盒研发等中小型企业，受限于检测项目和公司规模，主要采购中低端酶标仪进行相关研究实验。其余40%的用户来自于科研，包括高校、科研院所、医院和政府机关等单位。仪器信息网：请介绍贵公司酶标仪发展历程中里程碑事件。尹迪：美谷分子创立于1983年的美国硅谷，创始人是来自哈佛大学的Harden McDonnel教授。公司成立之初，Harden McDonnel教授为满足自身实验需求设计研发出第一台酶标仪，并于1987年成功推向市场。2003年至2008年，公司相继推出了M2、M5/M5e等系列产品。其中M5是一台拥有多功能检测(光吸收，荧光，化学发光)、可做荧光偏振、时间分辨荧光的酶标仪。M5拥有多项特色技术，包括双套"滤片+光栅“光路设计和PATHCHECK光径传感器技术。2011年3月，M5e多功能读板机被选为可以登上美国国家航空和宇宙航行局(NASA)国际空间站的酶标仪，并于2016年再度进入太空。2013年3月，美谷分子推出可做细胞成像和Western Blot的SpectraMax i3多功能酶标仪，并于2015年推出升级款SpectraMax i3x多功能酶标仪，加入冷PMT检测器，能够有效降低背景信号、提升检测灵敏度，即使在极低光能量下也可以下获得最宽动态检测范围。美谷分子在2017年和2018年先后推出了SpectraMax iD3/iD5多功能酶标仪，在灵敏性的基础上兼容灵活性，用户可升级模块化设计，极大地拓展整个系统的检测能力。既能满足有多功能检测需求的工业用户，也能满足对数据质量有高要求的科研用户。2022年，美谷分子又推出了紧凑、便捷、灵活的SpectraMax Mini多功能酶标仪，为预算有限但需求丰富的用户提供解决方案。美谷分子产品市场经理 尹迪曾就读于第二军医大学微生物实验室，毕业后曾就职于北京保诺公司，参与 Conditionally Active Biologics （CAB）微环境特异性药物平台的开发，此平台基础之上进行肿瘤单抗体开发，现任美谷分子产品市场经理，对酶标仪的应用、技术、数据分析有着丰富的经验。

p style=" text-align: center " strong img title=" p.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/5577f8c8-ef1f-4941-92ee-b2474ab836e3.jpg" / /strong /p p strong 　　PCR概念 /strong /p p 　　聚合酶链反应(基因扩增)：基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。 /p p strong 　　PCR的应用领域 /strong /p p 　　1、遗传病和某些疑难病的诊断 /p p 　　2、病原体的检测。某些恶性疾病一般用微生物学、生化和免疫 学技术无法查出病原体时，可用PCR来检查。 /p p 　　3、法医和刑侦鉴定。 /p p 　　4、癌基因的检查。 /p p 　　5、基因探针的制备。 /p p 　　6、基因组测序、染色体巡视。 /p p 　　7、cDNA库的构建。 /p p 　　8、基因突变的分析和定位诱变。 /p p 　　9、DNA重组。 /p p 　　10、基因的分享和克隆。 /p p strong 　　标准的PCR过程分为三步 /strong /p p 　　DNA变性 /p p 　　(90℃-96℃)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA /p p 　　退火 /p p 　　(60℃-65℃)：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。 /p p 　　延伸 /p p 　　(70℃-75℃)：在Taq酶(在72℃左右，活性最佳)的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′??′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。 /p p style=" text-align: center " img title=" PCR.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/36e74db3-e7e6-4a0a-a433-e0fb226f297f.jpg" / /p p 　 strong 　PCR仪的分类 /strong /p p 　　根据DNA扩增的目的和检测的标准可以将PCR仪分为普通PCR仪，梯度PCR仪，原位PCR，实时荧光定量PCR仪等几类。 /p p strong 　　普通PCR仪 /strong /p p 　　一般把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，称之为普通PCR仪。如果要用它做不同的退火温度则需要多次运行。主要是用作简单的，对目的基因退火温度的扩增。 /p p 　 strong 　梯度PCR仪 /strong /p p 　　一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件(通常12种温度梯度)的称之为梯度PCR仪。因为被扩增的不同的DNA片段其最适合的退火温度不同，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样既节约时间，也节约经费。在不设置梯度的情况下亦可当做普通的PCR用。 /p p strong 　　原位PCR仪 /strong /p p 　　是用于从细胞内靶DNA的定位分析的细胞内基因扩增仪。如病原基因在细胞的位置或目的基因在细胞内的作用位置等。可保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置进行基因扩增。不但可以检测到靶DNA，还能标出靶序列在细胞内的位置。于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转变有着重大的实用价值。 /p p strong 　　实时荧光定量PCR仪 /strong /p p 　　在普通PCR仪基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，就成了荧光定量PCR。其PCR扩增原理和普通PCR扩增原理相同，只是在PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统，得出量化的实时结果输出。 /p p 　　荧光定量PCR仪有单通道，双通道和多通道之分。当只用一种荧光探针标记的时候，选用单通道 有多种荧光标记的时候使用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记和目的基因表达产物，因为一次只能检测一种目的基因的扩增量，需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。 /p p strong 　　PCR的各个品牌 /strong /p p strong 　　国产品牌 /strong /p p 　　上海领成、西安天隆、杭州郎基、珠海黑马、杭州博日、上海宏石、厦门安普利、杭州晶格、北京亚力恩、北京东胜、上海枫岭。 /p p 　　目前国内市场主要被：上海领成，西安天隆，杭州郞基，珠海黑马，杭州博日五大品牌所占有。 /p p 　　普通PCR仪价格在18000-20000元左右，梯度PCR仪价格在26000-28000元左右，实时荧光定量PCR仪价格在130000-150000元左右。 /p p strong 　　进口品牌 /strong /p p 　　美国ABI、美国Labnet莱伯特、美国Bio-rad伯乐、英国Genetech、英国Techne、德国Eppendorf艾本德、新加坡Esco艺思高、日本TaKaRa、日本ASTEC、澳大利亚Corbett柯柏特、德国Jena耶拿、德国biometra、德国BOECO、英国CLEAVER科丽沃、瑞士ROCHE罗氏、英国Quanta、德国PEQLAB、荷兰Creacon、美国Cepheid、美国Thermo热电。 /p p 　　目前进口品牌中美国ABI，美国labnet，美国Bio-rad，日本TaKaRa，英国Techne，德国Eppendorf六大品牌占有率比较高。 /p p 　　根据近年来销量分析，其中美国ABI除了9700型普通PCR基因扩增仪和2720型基因扩增仪外，新推出的高精确性的Veriti梯度PCR仪，也是所有进口品牌梯度PCR仪中最受客户认可的一款，是近两年来销量较高一款PCR仪 /p p 　　其次是美国Bio-rad /p p 　　日本TaKaRa和美国Labnet梯度PCR仪，价格相对进口品牌中比较便宜，质量和性能也比较稳定，从而深广大客户的认可，他们的销售成交价在45000-50000左右，而其它同性能价格的仪器价格在，60000-80000元，所以近年来市场的占有率呈上升的趋势 /p p 　　德国Eppendorf和美国Bio-rad是以直销的模式销售，因其垄断直销方式，外面的经销商或者当地的经销商无法进去竞争，所以相同性能的产品价格相对其他品牌要高很多，成交价格一般在7-9万元左右，市场占有率相对有所下降 /p p 　　英国Techne在国内生产，价格相对进口品牌中要低很多，销量有所上升，市场占有率也上升，价格在35000-40000元左右。 /p p & nbsp /p

随着纳米技术的快速发展，越来越多的新型纳米材料不断出现并迅速应用在实际生活中。因此，发展快速、高通量的生物检测手段对纳米毒性的快速安全评估极为重要。流式细胞术是毒理学检测的常用技术，具有高通量、快速、准确的特点。但由于团聚的纳米材料在尺寸上同细菌相近，严重干扰检测结果，使得流式细胞术难以运用于纳米材料对细菌的毒性评估。　　近期，中国科学院合肥物质科学研究院技术生物与农业工程研究所吴李君、陈少鹏课题组建立了基于PI-GFP双荧光标记的纳米材料细菌毒性检测方法：GFP绿色荧光表征细菌的生长，碘化丙啶PI红色荧光标记区分死、活细胞，在流式细胞仪上准确区分细菌与纳米材料，通过绿色荧光和红色荧光细胞的相对比例，反应纳米材料的毒性。对比单荧光标记，双荧光标记可以更准确地检测纳米材料的毒性。运用上述建立的双荧光报告系统，他们研究了水环境中金属离子及表面活性剂对纳米银毒性的影响，揭示了不同环境因子对纳米银细菌毒性的影响和机制。结果表明，双荧光报告检测系统可以较准确地反应纳米材料的毒性，适用于环境纳米材料生物学效应的评估。该研究成果已被国际毒理学期刊Cheomsphere (DOI: 10.1016/j.chemosphere.2016.04.074)接收。　　该研究受到国家重大研究计划、中科院先导专项B、国家自然科学基金以及研究院院长基金资助。　　双荧光报告基因系统检测纳米银生物毒性

覆盖可能会影响拷贝数变异（CNV）检测。此外，在WES诊断中，其他结构变体（SV）如倒位或调节区或内含子区域的变体通常会被遗漏。考虑到这些局限性，在所有疾病实体中，有5-50%的患者可以检测到潜在的疾病变体。WGS原则上允许检测外显子组以外的疾病相关基因组变体，如DNA结构改变、内含子变体、非编码区变体或重复扩增。诊断NGS代表了一种新颖、独特的诊断工具，它以基因为目标，超越编码区，并允许阐明已建立和新的非编码基因组疾病。近日，在European Jounal of human genetics杂志上发表了一篇题为“Recommendations for whole genome sequencing in diagnostics for rare diseases”的文章，文章指出，在WGS工作中审查了2016年NGS应用指南中的所有38项声明，并进行了更新。更新后的建议现在由44份原始、更新和新的声明组成。这些建议涵盖了从评估和建立诊断性NGS应用的基本原理到NGS结果报告的各个方面，包括实验室程序和生物信息学管道不同方面的质量控制、变体解释和数据库。提供NGS诊断的必要条件当然是其临床实用性、使用最先进的测序技术、诊断路线（即在实验室中针对特定疾病进行基因测试的路线）和变异分析，以及在诊断环境中生成报告。一般性建议WGS技术和应用在不断变化，并且仍在改进。这不应妨碍在诊断中实施WGS，然而，在临床诊断环境中实施之前，该测试需要充分验证。●建议1：建议在诊断环境中引入WGS分析，以提高质量、效率和/或诊断产量。●建议2：罕见疾病和癌症的诊断工作组（以及其他基因检测方法）只能在经认可的实验室进行。●建议3：未经可接受的试验验证，不应将NGS转移到临床实践中。●建议4：向患者确认、解释和传达在研究环境中获得的结果前，应该在诊断实验室对（最好）独立样本进行重新测试。诊断路线一般来说，诊断路线应选择最有效诊断策略来实现分子诊断（时间和成本）。虽然WGS（和WES）越来越多地被作为一级诊断测试来实施，但临床医生应该意识到可能有更有效的特定疾病诊断测试。●建议5：实验室应向临床医生提供信息，以确认基因测试的变异类型。●建议6：应考虑WGS的局限性，并将其告知临床医生。●建议7：出于诊断目的，应仅报告与疾病明确相关的基因。一份独立的研究报告可能会列出功能未知的基因变体。●建议8：诊断测试应针对回答临床问题。建议最好分析一个（或多个）基因面板，并使用过滤策略，并对经常由从头变异引起的疾病使用三组。●建议9：对于导致单基因疾病的基因变体的解释，应使用“5层分类系统”。●建议10：大型CNV应使用包括细胞基因组畸变在内的数据库进行解释。●建议11：建议仅当外显子组外的变异（可能）具有致病性时，才分析和报告这些变异。如果后续研究可以提供更多致病性信息，才需报告VUS（variants of uncertain significance）。●建议12：对于变异的解释，有必要拥有患者的临床信息，最好是以标准化的术语，如HPO。●建议13：诊断实验室必须实施/使用结构化数据库为所有分类变体进行最新注释。。●建议14：报告的变异应通过将其提交给联邦、区域、国家和/或国际数据库来共享，实验室遗传学家和研究人员可以访问这些数据库。生物信息学生物信息学管道被定义为从原始数据分析到变体注释所使用的所有软件。还对数据格式、存储和验证程序提出了建议。●建议15：建议使用最新注释的参考基因组版本。●建议16：应使用标准数据格式。●建议17：生物信息学管道必须针对所使用的技术平台进行定制。●建议18：建议制定和定义一个协议，以使用于变体识别和变体注释的生物信息学工具保持最新。●建议19：参考样品应用于生物信息学工具的验证和标准化。●建议20：诊断实验室必须定期使用标准数据集验证生物信息学管道的所有部分（公共领域工具或商业软件包），并在实施相关变更（新版本）时进行验证。●建议21：应采用质量参数来监测分析过程（过程控制）和测量所用技术的性能。对于编码区域，一般数据质量应至少与WES数据的质量相似。应准确描述诊断程序中使用的所有NGS质量指标，最好将其存储在数据库中。●建议22：生物信息学管道应针对所有可报告的变异类型进行验证，至少包括SNV、小型插入缺失和CNV。●建议23：应对所有WGS变体进行注释。●建议24：建议在内部数据库中记录变体频率。●建议25：诊断实验室应实施长期存储所有相关数据集的协议。质量评估内部验证和测试性能比较旨在确保产品的结果满足用户的操作需求。它是关于测试/方法的性能和使用，不应与变体的验证/确认混淆。●建议26：应报告的范围，即可以生成可靠识别的临床目标部分，必须在测试开发期间定义，并应提供给临床医生。●建议27：如果对来自不同组织类型（如血液和唾液）的DNA进行诊断性测试，则应分别对每种组织类型的湿和干实验室程序进行验证。●建议28：每当对试验进行重大更改时，必须检查质量参数，并且必须重新运行一组验证样品，作为验证的一部分。●建议29：应在分析评估期间处理样品跟踪和安装barcode以识别样品，并将其纳入平台验证。● 建议30：符合预定义质量指标的变体不需要第二种技术进行确认。伦理考虑WGS的实施增加了检测到除初始临床问题外的易感疾病变体的可能性。●建议31：实验室应该有一个明确定义的协议，用于在启动测试之前处理未经请求的发现。●建议32：临床医生应在临床WGS之前提供遗传咨询并获得知情同意。●建议33：实验室应预测因传播未经请求的调查结果而可能进行的后续研究。●建议34：除非明确要求或为质量保证活动，否则实验室不会系统地重新分析数据并报告新发现。●建议35：诊断测试的结果，特别是通过分析整个基因组的结果，可能不是决定性的，但可能会产生假设。●建议36：只有在获得充分知情同意的情况下，WGS数据才能用于研究目的。报告基因检测报告应为临床问题提供清晰、简洁、准确、充分解释和权威的答案。●建议37：对于每个NGS试验，实验室必须提供以下内容：诊断策略、检测到的遗传变异类型、其可报告范围、分析灵敏度和精密度。●建议38：NGS分析报告应在一页上总结患者的身份和转诊原因、测试的简要描述、结果摘要和主要发现。●建议39：每份报告中均应提及参考基因组构建和基因参考转录本版本（如适用）。●声明40：如果可用，应报告OMIM参考(https://www.omim.org/).●建议41：在提供这类分析之前，实验室应根据国际建议制定报告基因组变异的地方政策并记录在案。●建议42：只有当与相应（疾病）基因相关的表型与患者的临床特征相匹配，并且可以进行后续研究以获得有关变体致病性的更多信息时，才应报告VUS。●建议43：应报告超出临床诊断确认或排除范围的探索性发现。●建议44：WGS报告应提交给转诊医生。报告中必须包括告知患者及其家人接受遗传咨询的建议。总结与讨论随着WGS的实施，诊断产品的范围已大大扩大，应对与给定表型相关的所有已知基因组改变进行全面诊断分析和解释。此外，在这些建议中，WGS数据中线粒体DNA（mtDNA）变体或体细胞变体的解释有意未被提及，主要是因为当前WGS技术的技术限制。短读测序技术的一个限制是，它不能直接捕获表观遗传DNA修饰，从而无法捕获相关表观遗传表型的标记。这部分诊断谱在这些建议中没有具体说明。未来，长读（单分子）测序和DNA修饰鉴定技术将是诊断工具箱中可预见的附加组件。这将需要开发额外的诊断（软件）工具，以提高诊断工作组的分辨率、实用性和价值。精彩会议预告：点击图片免费报名参加“第五届基因测序网络大会”

在合成生物学与生物技术中，定制基因序列的可靠性和成本效益对于相关应用是至关重要的。尽管脱氧核糖核酸(DNA)微阵列对于基因合成的短寡核苷酸池也是一个划算的来源，但是这些复杂混合物必须经过放大和正确的组装。一项最近的研究描述了一种方法，即将30个基因(或基因变异池)合成在一个单芯片上。美国科学家报告说，一轮的合成与选择能够成功鉴别出那些具有人们所渴望的属性的基因变异，例如最佳的表达水平。 　　在这项新的研究中，美国北卡罗来纳州杜克大学的Jiayuan Quan和同事进行了等温的基因巧合以及链置换扩增反应，以同时扩大和释放60-mer的寡核苷酸，随后他们利用聚合酶循环组装在0.5kb～1kb的基因中建立了重叠产物。为了方便，这些反应都在芯片上以及相同的反应混合物中进行 假性的寡核苷酸杂化通过将芯片细分为针对每个基因的单独的阱而得到最小化。其产物随后通过芯片外聚合酶链反应(PCR)而进一步被放大。 　　研究人员还开发出了一种质量控制程序，从而使错误合成基因(在一次变性复性循环后形成错配的双链单位)的亚族群能够被错配特定内切酶所分开。然而，由于变异的错配可能性，这一程序的一个局限在于它只适用于合成单一基因，而不是一组密切相关的基因变异的混合库。 　　这种基因合成方法随后被应用到优化转基因表达，除了强启动子序列外，这还要求适当的密码子使用。研究人员生成了lacZα基因片断的一个同义“密码子变异”库，并在大肠杆菌细胞中表达了它们。当在包含半乳糖苷的琼脂中生长时，克隆被选择用来使基于其蓝色色度的lacZα表达最大化。相对于野生型序列而言，在这些克隆中，lacZα序列被发现极大提高了lacZα的表达。 　　在一个类似但更有价值的应用中，研究人员生成并测试了74个黑腹果蝇转录因子的密码子变异库。高度表达的变异需要抗体的产生，并且根据绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白标记物的荧光强度，这些变异被成功鉴别出来。 　　研究人员在最近出版的《自然—生物技术》杂志上报告了这一研究成果。 　　研究人员指出，搞清这些光学基因序列是否为基于一些属性，例如mRNA结构和稳定性的功能性选择，以及这种方法是否是更长基因合成的最佳延伸，将令人关注。

Ca2+作为普遍的第二信使在细胞信号转导过程中起着非常重要的作用，是单个细胞生存和死亡的信号。它参与了神经传导、血液凝固、肌肉收缩、心脏收缩、大脑功能、酶功能以及内分泌腺的激素分泌等各种生理机能。而人们对Ca2+在信号转导中作用的认识，则很大程度上取决于Ca2+测定技术。目前常用的Ca2+检测方法主要有：Ca2+选择性微电极测定法、同位素示踪法、核磁共振法和水母发光蛋白检测法等。01Ca2+选择性微电极测定法:Ca2+选择性微电极一种电化学敏感器。利用内充液和组织或细胞之间产生电位差，理想情况下，该电位差是Ca2+对数的线性函数，遵循Nernst方程。优点：直接、敏感地测定组织或细胞内的Ca2+，不需使用指示剂，不影响结合钙和游离钙的平衡。缺点：反应速度慢而无法测定Ca2+的快速变化，而且穿刺损伤细胞可引起渗漏，且不适用于太小的细胞。02同位素示踪法：用放射性核素45Ca2+对Ca2+进行示踪，可测量出通过细胞膜转运到细胞内Ca2+增加的速度及浓度的大小，揭示Ca2+泵的作用，目前主要用于测定跨膜Ca2+的流动。优点：测量方法简单易行，比普通化学分析法的灵敏度高。确定放射性示踪剂在组织器官内的定量分布，可以达到细胞、亚细胞乃至分子水平。缺点：静态效果差，需要特定的同位素测定仪，并且要注意示踪剂的同位素效应和放射效应问题。03核磁共振法：是一种新的、非光学技术的Ca2+检测方法。由于正常生物体内氟含量很少，为了得到足够的响应，在检测时需要使用含氟指示剂。该指示剂经过化学修饰后进入细胞，进而被水解成游离状态，然后与Ca2+结合，根据获得的波谱图计算出Ca2+的浓度。优点：具有非破坏性和无损伤性，能够在接近生物样本生理状态下连续动态地进行检测，准确反应Ca2+浓度。缺点：需要核磁共振仪，成本较高。04荧光探针法：目前常用的Ca2+荧光探针有Fluo-3、Fluo-4、Fluo-８等。这类探针本身无法进入细胞，但它的亲脂性衍生物却可以透过细胞膜进入细胞。一旦进入细胞，这类亲脂性衍生物的亲脂性封闭基团在细胞非特异性酯酶的作用下被分裂除去，在细胞内便会形成一种带负电荷的荧光染料。与胞内Ca2+结合时，其荧光强度显著增加。优点：指示剂易导入细胞，空间分辨率高，反应速度快，而且可同时检测多重离子。缺点：需要有荧光显微镜或激光共聚焦显微镜，成本较高。05水母发光蛋白检测法:最近十几年来，水母发光蛋白(Aequorin)很受人们的关注。水母发光蛋白由189个氨基酸组成，具有3个Ca2+结合的EFhand结构，所以水母发光蛋白可作为检测Ca2+的新型探针。优点：Ca2+/水母蛋白复合物能检测~0.1μm到＞100μm范围内的钙离子浓度，且复合物不会从细胞内泄露出来，可检测几小时至数十天内Ca2+浓度的变化。比荧光探针法的背景低，样本本身不会发生自荧光。腔肠素的性质腔肠素(Coelenterazine)作为海洋动物体内贮存光能的分子，它广泛存在于海洋生物体内，比如海肾、海蜇、水螅等。腔肠素是天然荧光素中最普遍的，它可作为很多荧光素酶的底物。目前研究得最透彻的以腔肠素为底物的荧光素酶来源于海肾（Renilla），即海肾荧光素酶（Renilla reniformis，简称Rluc）。腔肠素的工作原理腔肠荧光素是一个分子量约400 Da 的疏水基团，它可以自由穿越细胞膜。在一个以荧光素/荧光素酶为基础的系统中，腔肠素作为以水母发光蛋白为代表的海洋发光蛋白的辅助因子，与水母发光蛋白进行稳定的结合，引起脱辅基水母发光蛋白和腔肠荧光素之间的共价键破裂，腔肠荧光素(Coelenterazine)被氧化脱羧，形成腔肠酰胺（Coelenteramide），释放出CO2，同时发出波长为469nm的蓝色生物荧光，该荧光可用博鹭腾高灵敏度管式/板式发光检测仪进行测定。图1.腔肠素/水母发光蛋白检测Ca2+机制水母发光蛋白一旦和Ca2+反应即丧失发光功能，因此当一部分水母发光蛋白与Ca2+反应时，被消耗水母发光蛋白的发光强度能反映出Ca2+浓度变化，而且被消耗的水母发光蛋白的发光强度与Ca2+浓度之间存在线形关系。如同萤火虫荧光素酶，海肾荧光素酶的活性也不需要翻译后修饰，一旦翻译完成即可行使遗传报告基因的功能。但是与萤火虫荧光素酶又有差异，即腔肠素/荧光素酶系统不需要三磷酸腺苷（ATP），因此更利于生物荧光的研究。技术小结由于Ca2+在生命活动的各种生理生化反应、疾病的发生和发展中都扮演着极其重要的角色，而游离的Ca2+浓度变化又与细胞的功能、信号转导乃至细胞的凋亡有密不可分的联系，因此，研究如何检测细胞内游离Ca2+浓度显得尤为重要。Ca2+选择性微电极测定法不需要使用指示剂，但是穿刺过程会损伤细胞，进而引起渗漏。同位素示踪法简单，但是静态效果差，还需要注意同位素效应和放射效应问题。核磁共振法和荧光探针法都需要特定的仪器，成本较高。水母发光蛋白检测法不需要激发光源，因而消除了细胞自发荧光的干扰，背景荧光远低于使用钙离子指示剂的荧光。另外腔肠素具有疏水性，易于通过细胞膜，适于全细胞的研究。 腔肠素/水母发光蛋白的生物荧光反应对Ca2+浓度的变化非常敏感，但是这种发光相对较弱，因此需要使用高灵敏度的发光检测仪进行检测。