凝胶过滤

凝胶过滤色谱摘要：本文主要讲解了凝胶过滤色谱法（分子筛）在蛋白纯化实验中的应用，包括纯化原理、实验方案设计、技术操作以及相关案例介绍和问题分析。基本原理凝胶过滤色谱蛋白纯化法，又称为空间排阻色谱，分子筛等。其原理是应用蛋白质分子量或分子形状的差异来分离。当样品从色谱柱的顶端向下运动时，大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒从而被迅速洗脱；而较小的蛋白质分子能够进入凝胶颗粒中，且进入凝胶的蛋白在凝胶中保留时间也不同，分子量越大，流出时间就越早，最终分离分子大小不同的蛋白质。http://www.detaibio.com/assets/image/topics/gel-filtration-chromatography-theory.jpg通常，多数凝胶基质是化学交联的聚合物分子制备的，交联程度决定凝胶颗粒的孔径。常用的色谱基质有：葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）、聚丙烯酰氨凝胶（Bio-Gel P）等。高度交联的基质可用来分离蛋白质和其他分子量更小的分子，或是除去低分子量缓冲液成分和盐，而较大孔径的凝胶可用于蛋白质分子之间的分离。选用合适孔径的凝胶很大程度取决于目标蛋白的分子量和杂蛋白的分子量。实验方案设计凝胶介质的选择凝胶介质的选择主要是根据待分离的蛋白和杂蛋白的分子量选择具有相应分离范围的凝胶，同时还需要考虑到分辨率和稳定性的因素。比如，如果是要将目的蛋白和小分子物质分开，可以根据他们分配系数的差异，选用Sephadex G-25和 G-50；对于小肽和低分子量物质的脱盐，则可以选用Sephadex G-10、G-15以及Bio-Gel P-2或P-4；如果是分子量相近的蛋白质，一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。具体凝胶过滤色谱介质应用如下：常用凝胶过滤色谱介质的分离范围凝胶介质蛋白质的分离范围/103凝胶介质蛋白质的分离范围/103Sephadex G25Sephadex G50Sephadex G100Sephadex G200Sepharose 6BSepharose 4B1~51.5~304~1505~60010~400060~20000Sepharose 2BBio-Gel P-4Bio-Gel P-10Bio-Gel P-60Bio-Gel P-150Bio-Gel P-30070~400000.5~45~1730~7050~150100~400凝胶介质的预处理凝胶在使用前应用水充分溶胀（胶：水=1：10），自然溶胀的耗时较长，可采用加热的方法使溶胀加速，即在沸水浴中将凝胶升温至沸，1~2h即可达到溶胀。在烧杯中将干燥凝胶加水或缓冲液，搅拌，静置，倾去上层混悬液，除去上清液中的凝胶碎块，重复数次，直到上清澄清为止。色谱柱的选择色谱柱的体积和高径比与色谱分离效果密切相关，凝胶柱床的体积、柱长和柱的直径以及柱比的选择必须根据样品的数量，性质和分离目的进行确定。组别分离时，大多采用2~30cm长的色谱柱，柱床体积为样品溶液体积的5倍以上，柱比一般在5~10之间；而分级分离一般需要100cm左右的色谱柱，并要求柱床体积大于样品体积25倍以上，柱比在20~100之间。凝胶柱的填装凝胶色谱柱与其它色谱方法不同，溶质分子与固定相之间没有力的作用，样品组分的分离完全依赖于他们各自的流速差异。装住时关住柱子下口，在柱内加入约1/3柱床体积的水或缓冲液，然后沿着柱子一侧将缓冲液中的凝胶搅拌均匀，缓慢并连续的一次性注入柱内。待凝胶沉积约5厘米左右时，打开柱子下口，控制流速在1ml/min。样品的处理与上样根据样品的类型和纯化分析，需要选择合适的缓冲液，为了达到良好的分析效果，上样量必须保持在较小的体积，一般为柱床体积的1%~5%，蛋白质样品上样前应进行浓缩，使样品浓度不大于4%（样品浓度与分配系数无关），但需要注意的是，较大分子量的物质，溶液粘度会随浓度增加而增大，使分子运动受限，影响流速。上样前，样品要经滤膜过滤或离心，除去可能堵塞色谱柱的杂质。洗脱与收集凝胶过滤色谱的缓冲液用单一缓冲液或含盐缓冲液作为洗脱液即可，主要考虑俩个方面的原因：蛋白的溶解性和稳定性。所用的缓冲液要保证蛋白质样品在其中不会变性或沉淀，PH应选在样品较稳定、溶解性良好的范围之内，同时缓冲液中要含有一定的盐（NaCL），对蛋白质起稳定和保护作用。洗脱过程中始终保持一定的操作压，流速不可过高，保持在0.5~3.0mL/min即可。案列介绍AKTA凝胶过滤色谱分离蛋白质材料色谱介质：Sephacryl S-200，蛋白质分离范围（5~250）×103 色谱柱：XK16/60预装柱色谱设备：AKTA Explorer混合样品：含单克隆抗体，分子量180000；牛血清白蛋白（68000），溶菌酶（14000）NaOH 0.5 mol/LNaCl 200 mmol/LPB 20 mmol/LPH7.0 缓冲液方法凝胶除菌处理超纯水冲洗柱子后，用0.5mol/L NaOH正向冲洗柱，流速3mL/min，冲洗3柱体积平衡NaOH处理完毕后，用超纯水冲洗2柱体积，接着用含200mmol/L NaCl和20mmol/L PB的7.0PH缓冲液冲洗5~10倍柱体积上样平衡完毕后，选择样品泵进行上样，上样流速3mL/min，上样体积为1mL洗脱上样结束后，用平衡缓冲液进行洗脱清洗与保存纯化结束后，用0.5mol/L NaOH反向冲洗2柱体积，冲洗时间30~60min，冲洗结束后，用超纯水正向冲洗5柱体积，再用20%乙醇冲洗3柱体积，然后拆下柱子，俩端封死，低温保存。问题分析和解决方案色谱分离前如何净化样品在色谱分离前，对样品进行离心和过滤，离心能除去大部分块状物，如果离心后样品仍不清澈，可用滤膜过滤。由醋酸纤维薄膜或PVDF材料制成的滤膜能够非特异性的结合少量蛋白。溶液交换不彻底严格控制上样体积，上样体积不超过柱体积30%。若样品溶液体积较多，可以分多次上样，注意每次上样时间间隔，可根据电导色谱峰确定下一次上样时间。分辨率不高1)提高装柱质量，使色谱柱装填匀实； 2)提高柱床高度； 3)控制上样体积，最大上样体积不超过柱床体积5%； 4)控制样品黏度与洗脱溶液黏度保持一致； 5)根据样品特点选择合适的洗脱溶液，调节洗脱溶液的离子强度或亲水性； 6)选择合适的凝胶柱（如何选择请参照上文）色谱峰对称性差1)提高装柱质量，装柱匀实——若柱装的太松，容易引起拖尾，装的太紧，会引起前沿；2)柱较脏，再生色谱柱肩峰出现的原因及解决方法1)柱床松动，重新装柱或反向冲洗柱2)柱筛板堵塞，超声清洗筛板3)柱干裂，重新装柱

一般的固液分离一般用抽滤的方法，但凝胶物却不宜用抽滤的方法。那么，凝胶该怎么清洗过滤其中的杂质？

向各位高手咨询下：想买一套分析多糖用的凝胶过滤色谱柱，市场上哪个牌子得质量信誉更好些呢？德国的PSS怎么样？

凝胶过滤填料的类型及性质 具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。层析用凝胶都是三维空间的网状高聚物，有一定的孔径和交联度。它们不溶于水，但在水中有较大的膨胀度，具有良好的分子筛功能。它们可分离的分子大小的范围广，相对分子质量在102～108范围之间。在柱层析分离中常用的凝胶有以下几类: 1.交联葡聚糖凝胶 交联葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，由葡聚糖和3-氯-1.2-环氧丙烷(交联剂)以醚键相互交联而形成具有三维空间多孔网状结构的高分子化合物。交联葡聚糖凝胶，按其交联度大小分成8种型号如表3所示。交联度越大，网状结构越紧密，孔径越小，吸水膨胀就愈小，故只能分离相对分子质量较小的物质；而交联度越小，孔径就越大，吸水膨胀大，则可分离相对分子质量较大的物质。各种型号是以其吸水量(每g干胶所吸收的水的质量)的10倍命名，如，Sephadex G–25表示该凝胶的吸水量为每g干胶能吸2.5克水。在SephadexG–25及G–50中分别引入羟丙基基团，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。 表3 Sephadex1的种类与特性型号分离范围（分子量）吸水量（ml/g）最小溶胀时（h）床体积（ml）/（mg）20℃～25℃100℃G10＜7001.0±0.1312～3G15＜1 5001.5±0.2312.5～3.5G25＜5 0002.5±0.2314～6G501500～20 0008.0±0.3319～11G753 000～70 0007.5±0.524112～15G1004 000～15 00010.0±1.072115～20G1505 000～800 00015.0±1.572120～30G2005 000～30 000020.0±2.072130～40 交联葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中较稳定，但当暴露于强酸或氧化剂溶液中，则易使糖甘键水解断裂。在中性条件下，交联葡聚糖凝胶悬浮液能耐高温，用120℃消毒10分钟而不改变其性质。如要在室温下长期保存，应加入适量防腐剂，如氯仿、叠氮钠等，以免微生物生长。 交联葡聚糖凝胶由于有羧基基团，故能与分离物质中的电荷基团(如碱性蛋白质)发生吸附作用，但可借助提高洗脱液的离子强度得以克服。因此在进行凝胶层析时，常用含有NaCl的缓冲溶液作洗脱液。交联葡聚糖凝胶可用于分离蛋白质、核酸、酶、多糖、多肽、氨基酸、抗菌素，也可用于高分子物质样品的脱盐及测定蛋白质的相对分子质量。 2.琼脂糖凝胶 琼脂糖的商品名称有Sepharose(瑞典)、Bio-gelA(美国)、Segavac(英国)、Gelarose(丹麦)等多种，因生产厂家不同名称各异。琼脂糖是由D-半乳糖和3，6位脱水的L-半乳糖连接构成的多糖链，在温度10O℃时呈液态，当下降至45℃以下时，它们之间相互连接成线性双链单环的琼脂糖；再凝聚即呈琼脂糖凝胶。商品除Segavac外，都制备成珠状琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶按其浓度不同，分为Sepharose 2B(浓度为2％)、4B(浓度为4％)及6B(浓度为6％)。Sepharose与1，3-二溴异丙醇在强碱条件下反应，即生成CL型交联琼脂糖，其热稳定性和化学稳定性均有所提高，可在广泛pH溶液(pH3～14)中使用。通常的Sepharose只能在pH4.5～9.0范围内使用。琼脂糖凝胶在干燥状态下保存易破裂，故一般均存放在含防腐剂的水溶液中。 琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性均优于交联葡聚糖凝胶。琼脂糖凝胶用于柱层析时，流速较快，因此是一种很好的凝胶层析载体。

蛋白质凝胶过滤出的图谱不会分析，有没有什么图谱分析的资料啊，急，急啊

Sepax CNT SEC尺寸排阻色谱柱（凝胶过滤柱）的填料是一刚性的高纯度球型为基质，利用独特的表面修饰技术在表面通过共价化学键合致密均匀的亲水性基团而成，适用于高效分离纳米物质，如碳纳米管、纳米棒、纳米颗粒等。流动相不仅可以用缓冲溶液，也可以用有机溶剂，如乙腈、甲醇、四氢呋喃等。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=17465]用于分离纯化纳米物质的凝胶过滤色谱柱[/url]

[font=宋体]在生物科学领域，蛋白质纯化是一项关键的技术，它对于研究生物分子的结构和功能至关重要。凝胶过滤层析是一种常用的蛋白质纯化技术，它具有分辨率高、分离效果好的优点。本文将介绍用凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程，包括实验准备、样品处理、层析柱的制作和上样、洗脱和收集等步骤。通过学习本文，读者可以了解凝胶过滤层析在蛋白纯化中的应用及其优缺点，为后续的实验和研究提供参考。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]用凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程，主要分为以下步骤：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]准备凝胶柱：选择适当的凝胶材料和柱子，根据待纯化蛋白的分子大小选择合适的孔径。[/font][font=宋体]杂质去除：使用缓冲液预先洗脱凝胶，去除其中的杂质和阻塞物。[/font][font=宋体]样品加载：将待纯化的蛋白溶液加载到凝胶柱中，注意保持柱子的垂直姿势，防止样品泄漏。[/font][font=宋体]洗脱：使用缓冲液进行洗脱，以去除非目标蛋白和杂质。[/font][font=宋体]收集纯化蛋白：收集洗脱液，进行后续的分析或使用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]以上步骤只是粗略的概述，实际操作时还需要注意许多细节和技巧。例如，选择合适的凝胶类型和柱子对纯化效果有很大影响；样品加载时需要防止样品泄漏；洗脱时需要选择合适的缓冲液等。因此，建议在进行实验前仔细阅读相关文献和资料，并请教有经验的实验人员。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]凝胶过滤层析（[/font][font=Calibri]Gel Permeation Chromatography[/font][font=宋体]，[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]）具有以下优点：[/font][/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①操作条件温和：[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]不需要使用有机溶剂等强烈的条件，因此对样品的活性影响较小。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②高分离效果：[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]可以分离不同分子量的蛋白质，且分辨率较高，能够实现样品的较纯分离。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③重复性好：[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]的层析柱可以重复使用，分离效果稳定，有利于提高实验的可重复性和数据可靠性。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]④适用范围广：[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]可用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸等的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在应用方面，[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]被广泛应用于蛋白质和其他生物分子的分离纯化。例如，从混合物中分离纯化蛋白质、去除蛋白质中的盐和缓冲剂、脱去多糖和脂质等杂质、对蛋白质进行分子量测定等。此外，[/font][font=Calibri]GPC[/font][font=宋体]还可以用于分离合成多肽和基因克隆产物的纯度鉴定等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]总之，凝胶过滤层析具有温和的操作条件、高分离效果、重复性好等优点，被广泛应用于蛋白质和其他生物分子的分离纯化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]详情可以关注：义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification][b]蛋白层析纯化[/b][/url][/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/chromatography-purification[/font][/font]

Sepax Nanofilm SEC创新系列的尺寸排阻色谱柱的填料是以刚性的高纯度球型硅胶为基质，利用独特的表面修饰技术在表面通过共价化学键合亲水性基团而成。 Sepax Nanofilm SEC系列色谱柱的填料具有高性能尺寸排阻色谱所必需的性能，即低吸附性与均匀的孔径分布，批与批之间具有非常好的重现性，其pH适用范围为2-8.5，适用于分离蛋白质和多肽类生物大分子样品以及天然与合成高分子物质。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=19457]Sepax Nanofilm SEC凝胶过滤色谱柱(排阻色谱）[/url]

有三个样品要做凝胶过滤色谱，浙江省和上海市哪个单位可以做？如果有人知道什么单位在做也可以跟帖告诉我，谢谢^

20。但一般商用色谱空柱长100cm左右，最多可以装到90~95cm高左右，如果仍不能取得满意的分辨率，可以用两根相同的凝胶柱，用SRTC-2接头连接后，可以提高分辨率40%。分离度正比于柱长的平方根。b、样品浓度，在蛋白浓度小于50mg/ml并且粘度小于5cP（厘泊）的条件下，样品浓度对于分辨率影响较小。c、上样体积：上样体积越小分辨越好，不同的凝胶具有不同的推荐上样体积，如下表：凝胶类型 推荐上样体积（%Vt）Sephadex 2-5%Sepharose 2-5%Sephacryl HR 1-2%Superdex PG 1-2%Superose PG 1-2%Superdex 0.5%Superose 0.5%对于利用Sephadex G25进行蛋白质脱盐的特殊情形，样品量达到柱体积的25%仍可以保证蛋白与盐分开。d、洗脱流速：一般较低的流速下（5~10cm/h）分辨率较高，但Superdex PG，Sepharose FF等新型凝胶可以在较高的流速下分离而不致损失分离度。

[b]1.凝胶的预处理[/b] 交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5～10倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。表 凝胶型号和层析柱大小与规格及凝胶用量[table][tr][td=3,1,236]层析柱规格[/td][td=4,1,285]凝胶的规格和用量（g）[/td][/tr][tr][td=1,1,70]直径（cm）[/td][td=1,1,70]高（cm）[/td][td=1,1,97]容量（ml）[/td][td=1,1,52]G[sub]25[/sub][/td][td=1,1,78]G[sub]50[/sub][/td][td=1,1,78]G[sub]100[/sub][/td][td=1,1,77]G[sub]200[/sub][/td][/tr][tr][td=1,1,70]0.9[/td][td=1,1,70]15[/td][td=1,1,97]9.5[/td][td=1,1,52]2.5[/td][td=1,1,78]1[/td][td=1,1,78]0.6[/td][td=1,1,77]0.3[/td][/tr][tr][td=1,1,70]0.9[/td][td=1,1,70]30[/td][td=1,1,97]19[/td][td=1,1,52]5[/td][td=1,1,78]2[/td][td=1,1,78]1.2[/td][td=1,1,77]0.6[/td][/tr][tr][td=1,1,70]0.9[/td][td=1,1,70]60[/td][td=1,1,97]38[/td][td=1,1,52]10[/td][td=1,1,78]4[/td][td=1,1,78]2.5[/td][td=1,1,77]1.2[/td][/tr][tr][td=1,1,70]1.6[/td][td=1,1,70]20[/td][td=1,1,97]40[/td][td=1,1,52]10[/td][td=1,1,78]4[/td][td=1,1,78]2.5[/td][td=1,1,77]1.2[/td][/tr][tr][td=1,1,70]1.6[/td][td=1,1,70]40[/td][td=1,1,97]80[/td][td=1,1,52]20[/td][td=1,1,78]8[/td][td=1,1,78]5.0[/td][td=1,1,77]2.4[/td][/tr][tr][td=1,1,70]1.6[/td][td=1,1,70]70[/td][td=1,1,97]140[/td][td=1,1,52]35[/td][td=1,1,78]14[/td][td=1,1,78]9.0[/td][td=1,1,77]4.4[/td][/tr][tr][td=1,1,70]1.6[/td][td=1,1,70]100[/td][td=1,1,97]200[/td][td=1,1,52]50[/td][td=1,1,78]20[/td][td=1,1,78]12.5[/td][td=1,1,77]6[/td][/tr][tr][td=1,1,70]2.6[/td][td=1,1,70]40[/td][td=1,1,97]210[/td][td=1,1,52]50[/td][td=1,1,78]20[/td][td=1,1,78]12[/td][td=1,1,77]7[/td][/tr][tr][td=1,1,70]2.6[/td][td=1,1,70]70[/td][td=1,1,97]370[/td][td=1,1,52]90[/td][td=1,1,78]35[/td][td=1,1,78]20[/td][td=1,1,77]12[/td][/tr][tr][td=1,1,70]2.6[/td][td=1,1,70]100[/td][td=1,1,97]530[/td][td=1,1,52]130[/td][td=1,1,78]50[/td][td=1,1,78]30[/td][td=1,1,77]17[/td][/tr][/table][b]2.装柱[/b] 层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去除盐及游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。 凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离子交换柱的制备相同。一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后，将带色的兰葡聚糖–2000、细胞色素，或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱，观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。

（一）原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。所以，要根据具体情况选择使用。前实验中样品体积较小，凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。（二）试剂与器材（1）Sephadex G-25。（2）0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液。（3）奈氏（Nessler）试剂：于500ml锥形瓶内加入碘化钾150g，碘110g，汞150g及蒸馏水100ml。用力振荡7～15min，至碘的棕色开始转变时，混合液温度升高，将此瓶浸于冷水内继续振荡，直到棕色的碘转变为带绿色的碘化钾汞液为止。将上清液倾入2000ml量筒内，加蒸馏水至2000ml，混匀备用。（4）20%（W/V）磺基水杨酸溶液。（5）1.5cm×20cm层析柱。（6）黑、白比色磁盘。

(1)异常峰形在进行凝胶色谱实验的时候经常会碰到一些峰形异常情况，这些异常峰形究竟如何引起，如何解决这些峰形异常情况并使实验顺利进行，是摆在每个实验者面前的一个问题。通过多年的实验积累，我们掌握了一些关于这些异常峰形出现的规律，找到了一些解决方法，并汇总理论上 ， 凝胶色谱实验中的样品在填料上是完全没有保 留的， 可实际上样品和填料之间可能会存在一些相互作用 ， 这就要求我们在使用不同凝胶色谱柱时不仅要注意流动相的应用范围， 还要注意填料对样 品的吸附。一旦填料对样品有吸附， 就超出了凝胶色谱的分离机理的范畴。 一般的凝胶色谱冲洗的方法： 所有凝胶色谱柱的清洗方法是将凝胶色谱柱的进口和出口反接， 用与分析时相同的流动相 以试验流速的 8 0 ％的流量进行冲洗。这个方法可 以将一部分吸附在柱子里 的杂质 冲洗掉， 但不能保证百分之百的冲洗干净。 对流动相的要求 采用有机相做流动相时， 要求最好使用分析纯的有机试剂， 一般情况下用 0.22um的过滤器过滤一下就可 以。对于水相 GP C， 要求使用二次重蒸水 ，0.22um的滤膜过滤。

丙烯酸酯类共聚物（超高分子量）用凝胶色谱仪测量应该选择什么样的溶剂，什么样的浓度？用氯仿和THF效果都不是很好，溶液澄清但是用一次性样品过滤器比较难过滤，而且手动进样进样针很难排出气泡！

凝胶色谱法GPC[b]分析原理：[/b]样品通过凝胶柱时，按分子的流体力学体积不同进行分离，大分子先流出[b]谱图的表示方法：[/b]柱后流出物浓度随保留值的变化[b]提供的信息：[/b]高聚物的平均分子量及其分布根据所用凝胶的性质，可以分为使用水溶液的凝胶过滤色谱法(GFC)和使用有机溶剂的凝胶渗透色谱法(GPC)。

丙烯酸酯类共聚物（超高分子量）用凝胶色谱仪测量应该选择什么样的溶剂，什么样的浓度？用氯仿和THF效果都不是很好，溶液澄清但是用一次性样品过滤器比较难过滤，而且手动进样进样针很难排出气泡！

[font=微软雅黑, &][color=#1f1f1f]凝胶色谱仪的主要结构部分包括以下几个部分： 1. 溶剂贮存器：用于贮存一定体积的流动相，一般由玻璃、不锈钢或聚四氟乙烯等耐腐蚀材料制成。 过滤脱气装置：进样前，一般采用0.22um或0.45um的微孔过滤膜过滤 2. 流动相溶剂，去除其中的杂质颗粒，并使用真空泵抽吸脱气，以去除溶剂 中的气体。 3. 高压输液泵：凝胶色谱仪的关键部件之一，能够连续、稳定地将流动相溶剂以高压的形式送入色谱系统。这一部件要求溶剂能以较快的速度通过分 离效率很高的柱子，通常具备宽范围内连续可调、脉冲小等特点。 进样装置：采用自动进样系统，保证进样的准确性和可重复性。 4. 色谱柱：凝胶色谱仪的核心部件，将多孔氧化铝、多孔玻璃、多孔硅球等。 5. 材料作为填料，制成一定相对分子质量分离范围和渗透极限的色谱柱。 6. 检测器和数据处理系统：凝胶色谱仪一般配备有多种检测器，例如示差折光仪检测器、紫外吸收检测器等，用于对分离后的组分进行定性和定量分 析。数据处理系统则负责记录并处理实验数据。[/color][/font]

1、 溶胀商品凝胶是干燥的颗粒，通常以40~63um的使用最多。凝胶使用前需要在洗脱液中充分溶涨一至数天，如在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温到近沸，则溶涨时间可以缩短到1~2小时。凝胶的溶涨一定要完全，否则会导致色谱柱的不均匀。热溶涨法还可以杀死凝胶中产生的细菌、脱掉凝胶中的气泡。2、 装柱由于凝胶的分离是靠筛分作用，所以凝胶的填充要求很高，必须要使整个填充柱非常均匀，否则必须重填。凝胶在装柱前，可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质，并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱，在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。将柱垂直固定，加入少量流动相以排除柱中底端的气泡，在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。柱顶部连接一个漏斗，颈直径约为柱颈的一半，然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，维持适当的流速，凝胶颗粒将逐层水平式上升，在柱中均匀地沉积，直到所需高度位置。最后拆除漏斗，用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面，再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。3、 柱均匀性检查凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀，在对样品进行分离之前，对色谱柱必须进行是否均匀的检查。由于凝胶在色谱柱中是半透明的，检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯，用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离范围，如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整，即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。4、 上样凝胶柱装好后，一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理，才能上样。凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样品过滤或离心。样品溶液的浓度应该尽可能的大一些，但如果样品的溶解度与温度有关时，必须将样品适当稀释，并使样品温度与色谱柱的温度一致。当一切都准备好后，这时可打开色谱柱的活塞，让流动相与凝胶床刚好平行，关闭出口。用滴管吸取样品溶液沿柱壁轻轻地加入到色谱柱中，打开流出口，使样品液渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面平时，再次加入少量的洗脱剂冲洗管壁。重复上述操作及此，每一次的关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶床面干燥而发生裂缝。随后可慢慢地逐步加大洗脱剂的量进行洗脱。整个过程一定要仔细，避免破坏凝胶柱的床层。

使用凝胶色谱仪的一些注意事项：　　溶剂准备：使用HPLC纯溶剂，如有必要，进行过滤。保证溶剂的相溶性，避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。　　溶剂脱气：超声脱气。　　样品准备：过滤样品，确保样品中不含固体颗粒，用流动相溶解样品。　　色谱柱的保护：　　(1) 防止气体进入色谱柱。凝胶柱是不允许气泡进入的，否则将会使柱效降低甚至形成微小的难以驱除的气室。因此，为了防止气泡进入色谱柱，一定要使用经过脱气的流动相，并且要严格按照下列步骤来安装色谱柱。a.拆卸下色谱柱入口处的密封螺丝，观察是否有溶剂渗出；b.如有溶剂渗出，即可将色谱柱接到管路上，以避免气泡的进入；c.如无溶剂渗出时，表明色谱柱的此端已经进去空气了，此时，可将色谱柱的出口端接到进样阀上，以流动相来反方向冲洗色谱柱，以便将柱内的空气排除。最好以0.2ml/min的小流量来冲色谱柱，如果溶剂的流速太快或者是压力突然的上升都将会导致柱性能的降低；d.如果流出的溶剂里不含有气泡，说明柱内的气体已经被排出了，再将色谱柱以正确的方向接好，这样气泡就进不到色谱柱里面了。　　(2) 色谱柱的清洗。为了不使被测物质和杂质停留在色谱柱中，在每次的样品分析工作完成之后，都应及时地清洗色谱柱。首先要用对被测样品洗脱能力强的溶剂来洗脱色谱柱，以分析工作中常用的反相色谱分析法为例，因其先流出的物质是极性大的物质，此时应用100%的甲醇或使用异丙纯、四氢呋喃等极性稍弱的溶剂将吸附在柱内的极性小的物质洗脱下来，洗脱液的用量一般为柱体积的20倍即可。如果流动相是缓冲溶液，则应先用蒸馏水来冲洗色谱柱，以冲掉柱内的盐，然后再用合适的溶剂来冲洗。　　凝胶滤过色谱法(Gel Filtration Chromatography)中所使用的凝胶柱常用缓冲溶液做流动相，用完之后当然要用蒸馏水来冲洗。如果是连续操作，可以将缓冲溶液置于柱内过夜，但最好是维持小流速(＜0.5ml/min)以防止缓冲盐的析出，如果流动相中含有卤化物，即使是停一夜，也必须要用蒸馏水将色谱柱冲洗干净，以防止它们对柱体的腐蚀。　　(3) 色谱柱的存放。如果色谱柱暂时不用，存放时要注意以下几点：a.几天之内的短期放置，凝胶柱则用蒸馏水来冲洗，再把色谱柱的两头用密封螺丝密封好即可。b.如果色谱柱长期不用，仅用上述方法来处理就不行了，这时应使用色谱柱使用说明书中所指明的溶剂来充满色谱柱，凝胶柱则不能用水了，因柱内如果有微生物的生长则会使柱效降低，此时应用0.05%的NaNs水溶液(防腐剂)来冲洗色谱柱，再将色谱柱封严。色谱柱长期放置时，一定要将色谱柱的两端封严，以防止由于溶剂挥发而造成的柱填料干缩现象，因这可导致柱效的严重降低。c.色谱柱应贮存在室温下，如果放置于0℃以下的环境里，柱内就会结冰，这也将导致柱效的降低。　　(4)不要高温使用。　　(5)不要高压冲洗柱子　　对仪器的维护和保养进行记录。

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[转贴]凝胶层析法技术简介凝胶层析法技术凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。　　1. 凝胶的选择 根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用Sephadex G-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。　　2. 柱的直径与长度 根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。　　3. 凝胶柱的制备 凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。　　凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。　　4. 加样和洗脱 凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5％-10％。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2。样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。　　5. 凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存 一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02％的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。　　如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。　　6. 凝胶层析的应用　　⑴ 脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。　　⑵ 用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。　　⑶ 测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。⑷ 高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。

5009.19第一法做有机氯净化是用凝胶色谱净化，我们没有全自动凝胶渗透色谱系统，选择手动的话问题就来了，Bio-Beads S-X3聚苯乙烯凝胶100g大概三千块钱，按标准要求装一个要多少克凝胶？装的凝胶色谱柱过完一个样还可以继续过另外的样品吗？自己装的凝胶色谱柱可以用多久？麻烦做过的前辈给点指导····

[font=宋体]链接：[/font]https://bbs.instrument.com.cn/topic/7685771问题描述：[font=宋体]凝胶色谱使用注意事项有哪些？[/font]解答：[font=宋体]使用凝胶色谱仪的一些注意事项：[/font]a)[font=宋体]溶剂准备：使用[/font]HPLC[font=宋体]纯溶剂，如有必要，进行过滤。保证溶剂的相溶性，避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。[/font]b)[font=宋体]溶剂脱气：超声脱气。[/font]c)[font=宋体]样品准备：过滤样品，确保样品中不含固体颗粒，用流动相溶解样品。[/font]d)[font=宋体]色谱柱的保护：[/font]（1）[font=宋体]防止气体进入色谱柱。凝胶柱是不允许气泡进入的，否则将会使柱效降低甚至形成微小的难以驱除的气室。[/font][font=宋体]（[/font]2[font=宋体]）色谱柱的清洗。为了不使被测物质和杂质停留在色谱柱中，在每次的样品分析工作完成之后，都应及时地清洗色谱柱。[/font][font=宋体]（[/font]3[font=宋体]）色谱柱的存放。如果色谱柱暂时不用，存放时要注意以下几点：短期放置，凝胶柱则用蒸馏水来冲洗，再把色谱柱的两头用密封螺丝密封好即可；长期不用时，应使用色谱柱使用说明书中所指明的溶剂来充满色谱柱。[/font][font=宋体]（[/font]4[font=宋体]）不要高温使用。[/font][font=宋体]（[/font]5[font=宋体]）不要高压冲洗柱子。[/font]以上内容来自仪器信息网《样品前处理实战宝典》

背景知识：凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。一、基本理论（一）分子筛效益　　一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。具有多孔的凝胶就是分子筛。各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队，凝胶表现分子筛效应。（二）色谱柱的重要参数⑴柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因引柱体积又称“床”体积，常用Vt 表示。⑵外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用Vo表示。⑶内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示。 不包括固体支持物的体积（Vg）。⑷峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液有体积，常用Ve 表示。当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。 当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。二、凝胶的种类及性质 （一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）⑴Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物， 能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。（二）琼脂糖凝胶：　　商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。（三）聚丙烯酰胺凝胶：　　是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位， 由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。（四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel ， 具有大网孔结构， 可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。三、实验技术（一）层析柱 层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外， 直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。分族分离时用短柱，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比较5:1─10:1，凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。 分级分离时柱高与直径之线为20:1─100:1，常用凝胶柱有50×25厘米，10×25厘米。层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。（二）凝胶的选择根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。 一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如Sephadex G-20的吸水量为20，1 克Sephadex G─200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的Sephadex G-200效果好， 脱盐用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。（三）凝胶的制备商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时， 自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。（四）样品溶液的处理 样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过Sephadex G-15短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白为超过4％，粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4％（一般约0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10％，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30％。 分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。（五）防止微生物的污染 交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有:⑴叠氨钠（NaN3）在凝胶层析中只要用0.02％叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶一水，在20℃时约为40％；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。⑵可乐酮在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02％。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。⑶乙基汞代巯基水杨酸钠 在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0. 01％。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。⑷苯基汞代盐 在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01％。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。原理：选填项目主体内容：一、 实验室要求：凝胶色谱仪所使用流动相多为有毒的有机性试剂，实验室要保持良好的通风条件，试剂需专柜保存。实验室温度需保持在10℃~35℃，湿度小于80%。周围无腐蚀性气体，无尘土飞扬。二、实验台要求：实验台要求通水电良好，电源为220V±20 V，电源频率为50Hz±0.5 Hz，无剧烈震动。三、仪器摆放要求：仪器放在无阳光直射的地方，不要放在靠门、窗的地方，以减少空气、阳光对仪器带来的影响。四、仪器操作规范： 样品经充分溶解后，再用过滤器过滤后才可使用；流动相也需现配后，再过滤使用；所有选用试剂均需选用色谱纯试剂。新色谱柱初次使用流速设置为0.2ml/min，冲洗1小时后再接检测器

凝胶渗透色谱(Gel Permeation Chromatography、GPC)) 　 http://chemlab.gzhu.edu.cn/gzhugfz/fenxishouduan/4.jpg　1964年，由J.C.Moore首先研究成功。不仅可用于小分子物质的分离和鉴定，而且可以用来分析化学性质相同分子体积不同的高分子同系物。(聚合物在分离柱上按分子流体力学体积大小被分离开）　1.基本原理1.1.分离原理：让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径有粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。当聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子被排除在粒子的小孔之外，只能从粒子间的间隙通过，速率较快；而较小的分子可以进入粒子中的小孔，通过的速率要慢得多。经过一定长度的色谱柱，分子根据相对分子质量被分开，相对分子质量大的在前面（即淋洗时间短），相对分子质量小的在后面（即淋洗时间长）。自试样进柱到被淋洗出来，所接受到的淋出液总体积称为该试样的淋出体积。 当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分子量有关，分子量愈大，其淋出体积愈小。（1） 体积排除 （2） 限性扩散 （3） 流动分离 1.2.校正原理：用已知相对分子质量的单分散标准聚合物预先做一条淋洗体积或淋洗时间和相对分子质量对应关系曲线，该线称为“校正曲线”。聚合物中几乎找不到单分散的标准样，一般用窄分布的试样代替。在相同的测试条件下，做一系列的GPC标准谱图，对应不同相对分子质量样品的保留时间，以lgM对t作图，所得曲线即为“校正曲线”。通过校正曲线，就能从GPC谱图上计算各种所需相对分子质量与相对分子质量分布的信息。聚合物中能够制得标准样的聚合物种类并不多，没有标准样的聚合物就不可能有校正曲线，使用GPC方法也不可能得到聚合物的相对分子质量和相对分子质量分布。对于这种可以使用普适校正原理。1.2.1.普适校正原理:由于GPC对聚合物的分离是基于分子流体力学体积，即对于相同的分子流体力学体积，在同一个保留时间流出，即流体力学体积相同。两种柔性链的流体力学体积相同： 1M1=2M2k1M1α1+1=k1M2α2+1　两边取对数：lgk1+(α1+1)lgM1=lgk2+(α2+1)lgM2即如果已知标准样和被测高聚物的k、α值，就可以由已知相对分子质量的标准样品M1标定待测样品的相对分子质量M2。　2.实验部分直接法：在测定淋出液浓度的同时测定其粘度或光散射，从而求出其分子量。间接法：用一组分子量不等的、单分散的试样为标准样品，分别测定它们的淋出体积和分子量，则可确定二者之间的关系。2.1.仪器：GPC仪的组成：泵系统、（自动）进样系统、凝胶色谱柱、检测系统和数据采集与处理系统。1.1.泵系统：包括一个溶剂储存器、一套脱气装置和一个高压泵。它的工作是使流动相（溶剂）以恒定的流速流入色谱柱。泵的工作状况好坏直接影响着最终数据的准确性。越是精密的仪器，要求泵的工作状态越稳定。要求流量的误差应该低于0.01mL/min。 2.1.2.色谱柱：GPC仪分离的核心部件。是在一根不锈钢空心细管中加入孔径不同的微粒作为填料。每根色谱柱都有一定的相对分子质量分离范围和渗透极限，色谱柱有使用的上限和下限。色谱柱的使用上限是当聚合物最小的分子的尺寸比色谱柱中最大的凝胶的尺寸还大，这时高聚物进入不了凝胶颗粒孔径，全部从凝胶颗粒外部流过，这就没有达到分离不同相对分子质量的高聚物的目的。而且还有堵塞凝胶孔的可能，影响色谱柱的分离效果，降低其使用寿命。色谱柱的使用下限就是当聚合物中最大尺寸的分子链比凝胶孔的最小孔径还要小，这时也没有达到分离不同相对分子质量的目的。所以在使用凝胶色谱仪测定相对分子质量时，必须首先选择好与聚合物相对分子质量范围相配的色谱柱。2.1.3.填料（根据所使用的溶剂选择填料，对填料最基本的要求是填料不能被溶剂溶解）：交联聚苯乙烯凝胶（适用于有机溶剂，可耐高温）、交联聚乙酸乙烯酯凝胶（最高100℃，适用于乙醇、丙酮一类极性溶剂）多孔硅球（适用于水和有机溶剂）、多孔玻璃、多孔氧化铝（适用于水和有机溶剂) 2.1.4.柱子：玻璃、不锈钢2.1.5.检测系统：通用型检测器：适用于所有高聚物和有机化合物的检测。有示差折光仪检测器、紫外吸收检测器、粘度检测器。2.1.6.示差折光仪检测器：溶剂的折光指数与被测样品的折光指数有尽可能大的区别。2.1.7.紫外吸收检测器：在溶质的特征吸波长附近溶剂没有强烈的吸收。2.1.8.选择型检测器：适用于对该检测器有特殊响应的高聚物和有机化合物。有紫外、红外、荧光、电导检测器等。2.2.操作：2.2.1.溶剂的选择： 能溶解多种聚合物；不能腐蚀仪器部件；与检测器相匹配。2.2.2.把激光光散射与凝胶色谱仪联用，在得到浓度谱图的同时，还可得到散射光强对淋出体积的谱图，从而计算出分子量分布曲线和整个试样的各种平均分子量2.2.3.激光光散射实验中必须对样品严格除尘，溶液中的灰尘会产生强烈的光散射，严重干扰聚合物溶液光散射的测量。溶液除尘是光散射成败的关键。首先是溶剂除尘，配置测试样品的溶剂应进行精馏，并经过0.2μm超滤膜过滤后方可使用。配好的溶液也要用0.2μm的超滤膜过滤。另外，测试中所用的器械，如：注射器等，使用前要用洗液浸泡，清水强力冲洗

就我所知的内容进行简单的介绍：目前我所了解的凝胶色谱柱主要都是进口的柱子，对国内的凝胶柱情况不是很了解。进口柱有：TSK, Agilent, Waters, PL 等。[b]色谱柱类型[/b]：我主要对油性 的色谱柱了解多一些。色谱柱覆盖范围（分子量）从100到107。（不同厂家可能会有不同。）标准样品一般为PS.[b]填料[/b]：凝胶柱的填料应该都是些低膨胀系数，高孔体积，高机械稳定性的刚性PS/DVB填料，了解不多欢迎大家补充。凝胶色谱柱信息一般包括：凝胶柱类型，孔径（pore size），分子量范围， 柱子规格和编号。柱[b]类型[/b]又有混合柱与精细柱之分。[b]混合柱[/b]一根柱可以覆盖所有的分子量范围（也有人称之为通柱），[b]精细柱[/b]一般需要几根色谱柱串联，且分子量范围要相互重叠。因此色谱柱的配置会有不同的组合。色谱柱的串联方式一般按照pore size 的不同从大到小连接。保护柱是位于分析柱之前，其填料规格等与分析柱相同，当样品中含有对色谱柱有害的物质时可以起到保护分析柱的作用。另一种为柱前保护，是一种过滤头。[b]使用注意事项[/b]：色谱柱在使用过程中主要应该注意的是：1、每根色谱柱都有一定的压力范围（说明书有说明），一般要在合适的压力下进行分析使用。2、色谱柱在制作过程中是在一定的压力下按一定的方向添装 的，因此要求在使用时要按照规定的方向进行连接。如果不小心装反了也不用着急，一般没有超压使用应该影响不是很大。但如果一直使用了很长时间如半年或1-2年，建议你就一直这样使用下去。3、分析样品和流动相一定要过滤干净，不要让对柱有害的物质通过色谱柱。4、增加一根保护柱或柱前保护对分析柱是有好处的。5、色谱柱能不能反冲，在第2中提到了一点，一般咨询厂家时都会告诉你不能反冲，主要是担心反冲会使柱中的填料松散，那样整根柱子就报废了。这一点应该很好理解，就是在一定压力一定方向将填料填充压紧，如果反向冲操作不当很容易就会使原来压紧的填料松散开，这是无法弥补的损坏。但在具体使用中，就我所知可以在压力低一些，也就是流量小一些的条件下进行反冲，只要没有影响到柱内的填料，将堵塞的物质冲出可以有效降低系统压力，改善柱效。[b]应用[/b]：凝胶色谱柱主要进行大分子样品分子量与分子量分布的检测，如果样品分子量差异较大，应该也可以进行分离。这类样品可以作为宽标的标准样品进行标准曲线的建立。另外，凝胶色谱柱检测的样品有油性的高分子物质，如树脂类等，还有水溶性的高分子物质如糖类等。对于不同厂家的色谱柱要说好坏之分，我认为和以上很多内容都有关系，样品是否干净，流动相是否干净，人员有没有误操作，有没有保护柱，每天工作量大小等很多影响因素。总体来说应该差不多。