章新政冷冻电镜构造及成像原理

近日，Structure在线发表了中国科学院生物物理研究所章新政课题组完成的研究论文(Addressing Compressive Deformation of Proteins Embedded in Crystalline Ice)。该研究发现了晶态冰包埋的冷冻电镜样品会产生收缩形变，且形变随降温速率的增加而减少，并从晶态冰形成的降温速率出发发展了新型的无收缩形变的立方晶系晶态冰样品制备方法。 　　该工作发现结构无损的立方晶系晶态冰样品不仅消除了电子束诱导的快速漂移现象，而且显示出明显优于普通冷冻电镜玻璃态冰样品的数据质量，进一步为冷冻电镜实现原子分辨率奠定了基础。 　　大量实验数据证明，低降温速率制备的冷冻电镜样品有助于恢复数据采集时样品的束诱导漂移，但降温速率过低经常导致晶态冰的形成。传统认为晶态冰在生物样品冷冻过程中会对其结构造成破坏，故在冷冻电镜样品制备过程中一直避免使用。晶态冰的形成具体对蛋白质产生了什么破坏尚不清楚。 　　课题组系统性地将蛋白质在不同条件下包埋在晶态冰中，并通过冷冻电镜技术解析了晶态冰中的蛋白质三维结构。研究发现，在低降温速率形成的晶态冰中，蛋白质结构会产生收缩形变(图a)，且收缩量和蛋白质本身性质相关，越为刚性的蛋白质收缩量越小。另外，在一些蛋白质柔性区域，低降温速率晶态冰中的蛋白质存在密度畸变的问题(图a)。同时，二者随着晶态冰降温速率的增加显著变小，甚至无法探测(图b)。基于上述发现，研究发展了结构无损的立方晶系晶态冰样品的制备方法。通过该方法制备得到的晶态冰样品，其三维重构和玻璃态冰样品一致，不会对蛋白质结构造成可检测的破坏，且成像质量显著提高，不仅没有束诱导漂移(图c)，而且显著提高蛋白样品的分辨率。同样条件下，B-因子反映了样品的信噪比(图d)，人源去铁-铁蛋白晶态冰样品的B因子显著好于玻璃态冰样品。此外，在醛缩酶和谷氨酸脱氢酶上B因子也获得显著提升。 　　研究工作得到国家自然科学基金、国家重点研发计划、中科院战略性先导科技专项(B类)和中科院前沿科学重点研究计划的支持。冷冻电镜晶态冰样品性质。a、与玻璃态病毒样颗粒(VLP)样品(粉色)相比晶态冰样品(绿色)产生收缩形变，且严重形变时密度图出现断裂。b、提高降温速率，晶态冰样品的收缩形变减弱。c、在人源去铁-铁蛋白，醛缩酶和谷氨酸脱氢酶上，晶态冰样品恢复束诱导的快速漂移，前几帧样品分辨率明显恢复。d、B因子曲线斜率越大代表数据质量越好。与玻璃态冰样品(蓝色)相比，人源去铁-铁蛋白晶态冰样品(红色)有更好的B因子，展现出更高的数据质量。

p 　　作者：黄岚青，刘海广(北京计算科学研究中心 复杂系统研究部) /p p 　　 span style=" background-color: rgb(112, 48, 160) color: rgb(255, 255, 255) " strong 1 引言 /strong /span /p p 　　在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术，就叫做冷冻电子显微镜技术，简称冷冻电镜(cryo-electron microscopy， cryo-EM)。冷冻电镜是重要的结构生物学研究方法，它与另外两种技术：X射线晶体学(X-ray crystallography)和核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)一起构成了高分辨率结构生物学研究的基础，在获得生物大分子的结构并揭示其功能方面极为重要。 /p p 　　电子显微三维重构技术起源于1968 年，D.J. De Rosier 和Aaron Klug 在Nature 上发表了一篇关于利用电子显微镜照片重构T4 噬菌体尾部三维结构的著名论文，提出并建立了电子显微三维重构的一般概念和方法。Aaron Klug 本人也因为这个开创性的工作获得了1982 年的诺贝尔化学奖。 /p p 　　为了降低高能电子对分子结构的损伤，Kenneth A. Taylor 和Robert M. Glaeser 于1974 年提出了冷冻电镜技术，并且用于实验研究。经过三十多年的发展，冷冻电镜技术已经成为研究生物大分子结构与功能的强有力手段。冷冻电镜本质上是电子散射机制，基本原理就是把样品冻起来然后保持低温放进显微镜里面，利用相干的电子作为光源对分子样品进行测量，透过样品和附近的冰层，透镜系统把散射信号转换为放大的图像在探测器上记录下来，最后进行信号处理，得到样品的三维结构。 /p p 　　在超低温的条件下，电子带来的辐射损伤被有效控制。即便如此，分子样品所能承受的辐射剂量也是非常低的，导致信噪比非常低。另外，随着观测的进行，额外的电子会累积而造成分子的移动，导致获得的图像变得模糊。这就好比用一个简单的傻瓜相机拍摄在雨中飞驰的子弹，得到的影像必然是模糊的并且充满噪音。因此，冷冻电镜的方法技术在很长时间内只能确定个头比较大的样品的结构，比如病毒颗粒的结构，而且通常分辨率都不高。然而随着工程技术和算法的不断发展，能够确定的分辨率也越来越高(图1(a))，2016 年发布的谷氨酸脱氢酶结构的分辨率甚至已经达到了1.8 Å 。与此同时，也有越来越多的通过冷冻电镜技术得到的研究成果发表在高水平的期刊上(图1(b))，冷冻电镜正备受科学界的关注。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/5b2ef847-cad0-4d88-b1ad-ebf14bd21e9c.jpg" title=" 1.jpg" / /p p 　　图1 冷冻电镜技术和单颗粒重构技术越来越备受关注(统计数据来源于EMDataBank )(a)不同年份中利用冷冻电镜单颗粒重构技术能够达到的最高分辨率 (b)通过冷冻电镜技术进行的研究成果在不同杂志上发表的论文数 /p p 　　在最近几年，冷冻电镜技术有了革命性的进步，主要得益于三个方面的突破。首先是样品制备，通过利用薄膜碳层甚至石墨烯可以用更薄的冰层包裹分子样品来提高信噪比。第二个突破是电子的探测技术，也就是电子探测器的发明。在300 keV 电子的轰击下，传统的器件都会被高能量打坏，因此在电子探测器出现之前，冷冻电镜中使用的CCD相机需要将电子打在探测器上变成光信号，再通过CCD 把光信号转成电信号后得到图像，“电光—光电”转换的过程降低了信噪比。而现在电子探测器能够直接探测电子数量，同时，互补型金属氧化物半导体(CMOS)感光元件的应用使得探测器支持电影模式(movie mode)，可以在一秒钟之内获得几十张投影图片。通过后期对样品进行漂移修正，再把这几十张图片叠加起来，从而大幅提高成像的信噪比。模糊的子弹一下子变得清晰，冷冻电镜的分辨率不断上升。第三个突破是计算能力的提高和软件算法的进步。冷冻电镜的模型重构通常需要对几万甚至几十万张投影图片进行分析、组装和优化。这需要先进的计算资源配合有效的算法才能实现。基于贝叶斯理论的模型重构框架解决了这个问题，我们在下文中详细介绍。综上所述，冷冻电镜技术不仅提高了空间分辨率，而且可以应用于很多以前不能解决的生物大分子的结构研究。 /p p 　　具有里程碑意义的成果是，2013 年加州大学旧金山分校(UCSF) 程亦凡和David Julius 的研究组首次得到膜蛋白TRPV1 的3.4 Å 近原子级别高分辨率三维结构，结果发表在Nature 上。我国在冷冻电镜的应用领域也有很大突破，代表性工作包括清华大学的施一公研究组和剑桥大学MRC 实验室Sjors H.W. Scheres 研究组合作在2015 年获得的γ 分泌酶复合物结构( 图2(c))， 以及2015 年清华大学高宁研究组和香港科技大学戴碧瓘研究组合作得到的3.8 Å 的真核生物MCM2-7 复合物结构 2015 年北京大学毛有东研究组、欧阳颀研究组与哈佛医学院吴皓研究组合作得到炎症复合体的高分辨率三维结构(图2(a)) 2014 年中国科学院生物物理研究所朱平研究组和李国红研究组合作得到的30 nm 染色质左手双螺旋高级结构(图2(b))以及2016 年中国科学院生物物理研究所柳振峰、李梅、章新政三个研究组合作得到3.2 Å 的捕光复合物II 型膜蛋白超级复合体结构。这些成果在结构生物领域得到巨大的反响，这也使得冷冻电镜高分辨率成像技术获得空前的关注。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/44d05be3-281b-4507-b0fc-9d200025422f.jpg" title=" 2.jpg" / /p p 　　图2 我国在冷冻电镜领域中获得高质量的研究成果(a)近原子分辨率的炎症复合体结构(图中NBD为核酸结合结构域，HD1 为螺旋结构域-1，WHD为翼螺旋结构域，HD2 为螺旋结构域-2，LRR为亮氨酸重复序列) (b)30 nm 染色质左手双螺旋高级结构 (c)3.4 Å 的人源γ 分泌酶复合物结构(图中NCT是一种I 型单次跨膜糖蛋白，APH-1 为前咽缺陷蛋白-1，PS1为早老素-1，PEN-2 为早老素增强子-2) /p p 　 strong span style=" background-color: rgb(112, 48, 160) color: rgb(255, 255, 255) " 　2 图像处理技术 /span /strong /p p 　　经过多年的发展，目前冷冻电镜的数据处理部分主要包含了以下的流程(图3)： /p p 　　(1) 衬度传递函数的修正(CTF correction) /p p 　　(2) 样品分子投影数据的筛选(particle selection) /p p 　　(3) 二维投影数据的分类和降噪(2D analysis) /p p 　　(4) 三维模型的重构和优化(3D reconstruction and refinement) /p p 　　(5) 多重构象的结构分析(heterogeneity analysis) /p p 　　(6) 对重建结构分辨率的分析(structure resolution assessment) /p p 　　(7) 结合生物化学原理和实验数据对三维结构的解读(model interpretation and validation) /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/ef81cf1e-580c-4eda-9e77-e2edc542f953.jpg" title=" 3.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　图3 冷冻电镜数据分析处理流程 /p p 　　图像处理软件的发展对冷冻电镜单颗粒重构技术极其重要，当前广泛使用的电镜分析软件系统主要包括SPIDER，EMAN2， FREALIGN，SPARX，RELION等。对于刚刚接触单颗粒重构技术的人来说，更偏好集成的软件套装来完成整个分析流程。我们在表1 中列出了大部分主流的综合冷冻电镜图像处理软件，以供参考。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/f4fafde5-da41-422a-acc4-bcd118be0c8e.jpg" title=" 4.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　表1 冷冻电镜中流行的图像处理软件 /p p 　　 strong 2.1 衬度传递函数估计与修正 /strong /p p 　　衬度传递函数(contrast transfer function，CTF)是在数学上描述通过透射电子显微镜得到样品图像上的像差变化。准确地判断衬度传递函数对于确认显微图像的质量以及后续的三维结构重建极为重要。常用的估算衬度传递函数的参数软件是CTFFIND4。确定了CTF 的参数以后，就可以对采集到的冷冻电镜图像进行修正。这个修正过程其实就是图像处理中的图像复原技术。 /p p 　　 strong 2.2 颗粒挑选 /strong /p p 　　接下来需要从原始数据中筛选出颗粒投影，也被称为“颗粒挑选”，颗粒挑选的好坏也将影响所有后续的分析和处理过程，是一个重要并且繁琐的步骤。颗粒挑选方式可以分为手动挑选、半自动挑选和完全自动挑选这几种。 /p p 　　在早期的分析中，对于结构的了解还非常少，优先考虑的都是人工挑选。但是自动的颗粒图像获取方法的出现使得在很短时间内可以收集数十万张颗粒图像，人工挑选大量的颗粒图像不太现实，并且人工的挑选通常会过于集中于某一类颗粒图像，导致遗漏和偏差。 /p p 　　 strong 半自动和全自动的方法主要有以下三类： /strong /p p 　　(1)通过例如降噪、反衬增强、边缘算子等图像形态学方法搜索区域，基于数字图像处理学的原理，将颗粒图像与背景分离开来。 /p p 　　(2)基于模板的方法，通过扫描数据图像和已知的模板比较来挑选出潜在的颗粒图像，模板的来源通常为手动选出的数据图像中较为清晰的颗粒图像，或者是已知结构的投影。 /p p 　　(3)结合无模板和有模板的方法，通过一些有监督的机器学习算法进行颗粒挑选。 /p p 　　随着图像识别领域中深度学习方法的流行，各类基于深度学习的颗粒识别框架也被引入到颗粒挑选的过程中。随着深度学习方法的发展，相信如何把深度学习方法应用到单颗粒冷冻电镜图像分析领域的研究将会越来越多。 /p p 　　 strong 2.3 二维图像分析——颗粒图像的匹配与分类 /strong /p p 　　二维颗粒图像的分类是获取三维结构过程的第一步。对二维图像的分析包括两部分：颗粒图像的匹配和颗粒图像的分类。 /p p 　　匹配的过程通常会对颗粒图像应用一些变换操作，通过关联函数去判断不同颗粒图像之间的相似程度。图像匹配的算法主要分为两种，即不依赖模型的方法和基于模型的方法，取决于是否存在利用样本先验信息得到的模板。 /p p 　　随着图像匹配的完成，颗粒图像需要进行分类。主要利用多元统计分析和主成分分析方法等算法，其他流行的二维颗粒分类技术还有神经网络分类，将图像在二维空间自组织映射(self-organising mapping，SOM)再进行分类和排序。 /p p 　　二维图像分析的目的是，首先通过图像匹配消除旋转和平移的误差，利用类内紧致、类间离散的原则进行图像分类，最终可以对类内颗粒图像进行平均，提高信噪比，从而实现对高分辨率三维结构的构建。 /p p 　　 strong 2.4 模型重构和优化 /strong /p p 　　模型三维重构的基础是中心截面定理，重构过程中的关键问题是如何确定每个颗粒图像的空间角(orientation determination)。大多数模型重构和优化算法都是基于投影匹配(projection matching)的迭代方法。简单说就是，先利用粗糙的三维结构模型，进行投影得到参考的图像，和实验颗粒图像进行比对，根据结果来更新空间方位参数，继而构造新的三维结构，对实验图像的空间方位修正，形成迭代的过程，直至收敛就获得了最终的三维模型。 /p p 　　 strong 2.5 分辨率的确定及二级结构的确定 /strong /p p 　　在模型优化的过程中，通常有很多指标给出结构的分辨率信息。目前一个较为广泛使用的分辨率信息参数是被称为傅里叶壳层关联函数(Fourier shell correlation，FSC)曲线，并通过在曲线上选取一个合适的阈值来判定分辨率。 /p p 　　在模型优化中经常伴随着过拟合的问题。过拟合的出现通常由于在优化过程时无法分辨“噪声”与“信号”。为了避免过拟合对分辨率的误判，最近一种被称为“黄金标准”(gold standard)的优化过程开始被广泛使用。 /p p 　　根据不同的分辨率，可以从结构中得到不同的信息量。按照分辨率数值大致分为三个范围： /p p 　　(1)结构分辨率大于10 Å 的生物大分子结构被视为低分辨率的结构，在低分辨率的结构范围内只观察得到一个大致的整体形状，以及有可能分辨出主要成分的相互位置关系。 /p p 　　(2)一个中等分辨率的生物大分子结构精度大约在4—10 Å 之间，在这个分辨率范围内的生物大分子结构已经可以得到一些二级结构的信息和分辨出大部分组成结构的相对位置关系。分子结构之间如果存在构象变化也可以分辨出来。 /p p 　　(3)高精度甚至是近原子级别的分子结构分辨率可以达到4 Å 以下。在高分辨率的三维结构中，可以准确地看见如α肽链等的二级蛋白质结构以及部分单独的残基，多肽链的结构变得清晰起来。同时高分辨率的分子结构可以描述精确的构象变化。 /p p 　　总之，FSC 曲线等标准提供的分辨率是一个有指导意义的数字，不可作为绝对参考来评价所获得的模型质量，需要批判地对待，尤其是要与生物分子系统的生物化学知识相结合。 /p p 　　 strong 2.6 三维结构的多构象性和动态分析 /strong /p p 　　生物大分子通常具有内禀的柔性，所以生物分子的动态结构变化以及结构的不均一性一直是结构生物学的研究重点之一。在晶体状态下，生物分子的结构变化被晶格约束，一般只提供一个静态的结构和有限的动力学参数。冷冻电镜相比晶体学方法的优势在于可以捕捉生物分子在溶液中的形态，并记录下不同构象下的投影。因此针对冷冻电镜的数据可以进行多构象的重构，现有的一些算法是通过聚类分析、最大似然法分析等对多构象进行分析，得到的生物大分子结构形态和构象差异还需要结合分子功能来检验分子结构的合理性。 /p p 　　 strong span style=" background-color: rgb(112, 48, 160) color: rgb(255, 255, 255) " 3 最新进展和突破 /span /strong /p p 　　 strong 3.1 最大似然估计理论 /strong /p p 　　近年来在单颗粒分析中取得重大突破的应当是最大似然估计(maximum likelihood)理论。最大似然估计的理论可以贯彻整个单颗粒技术图像分析的过程，在图像匹配，2D、3D分类 和模型优化上均可以应用，是一个强有力的理论工具。最大似然估计的算法已经在RELION、FREALIGN 等软件中实现，方便普通用户使用，这对于推动冷冻电镜成像技术的应用有重大意义，近三四年来有许多突破性的近原子级别分辨率的分子结构大多是由基于最大似然估计理论的分析软件得到。 /p p 　　3.1.1 减少计算需求 /p p 　　最大似然估计算法的计算量很大，如何降低计算量是一个重要问题。过多的计算资源消耗曾经阻碍这个方法在冷冻电镜单颗粒重构中的广泛应用。在减少最大似然算法在冷冻电镜应用中的计算需求方面，有两个重要的贡献是空间降维(domain reduction)算法和网格插值(grid interpolation)算法。 /p p 　　我们最近在研究一个新的方法来对旋转参数进行分步处理，初步的结果显示这种方法可以把计算复杂度降低一个维度，这个方法可很好地应用于高信噪比的数据处理，但对于低信噪比的数据分析还需要对该方法进行改进。 /p p 　　3.1.2 对最大似然方法的未来展望 /p p 　　在未来的研究中，关注点是减少计算的耗时和增加准确度。通用图形处理器(GPU)的应用和CUDA 编程框架已经显示出了在高性能计算领域的威力，研究表明GPU 技术可以显著减少计算时间，而RELION 也将发布支持GPU 计算的2.0 版本。 /p p 　　在加快计算速度的同时，提高模型的重构的准确性则更为重要。如何提高颗粒图像的准确性以及最大似然方法在这些方面的应用还有待深入探索。总而言之，最大似然方法独特的、可扩展的统计理论框架可以适用在冷冻电镜的各种问题上，如多构象、低噪声、信息缺失中均有很好的应用。 /p p 　　 strong 3.2 流形嵌入方法(Manifold Embedding) /strong /p p 　　自然界的分子过程通常是连续的，比如三磷酸腺苷(ATP)合成酶等分子结构的状态变化通常都是连续的。现有的方法只能得到有限的、若干个离散的构象变化，限制了我们对于分子结构的进一步观察。而流形嵌入法则是通过将颗粒图像映射到具有特定拓扑结构的参数空间(manifold space)，可以分辨出更为细致的动力学变化，进而实现对生物分子连续的结构变化过程的研究。Ali Dashti 等人已经利用这种方法成功刻画出核糖体的结构变化路径。 /p p 　　 strong 3.3 揭开表面看实质 /strong /p p 　　冷冻电镜对更为复杂的结构并没有很好的处理方式，在一些分子量比较大，包含多层的病毒结构研究中，一直没有高分辨率的三维模型，这也是由于病毒普遍具有对称失配的特性，基因结构被壳体完全覆盖，无法通过二维图形处理的方式对内部结构直接进行重构。刘红荣教授通过改进衬度分离方法展示出了解决该类问题的途径，其发展的新方法已经成功应用在一个多面体衣壳NCPV的病毒颗粒(图4)上，通过该重构方法，使得外部的衣壳结构(图4(a))和内部的基因组结构(图4(b))分离，成功得到包含在内部的dsRNA 近原子级高分辨率结构和分布。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/7ab0c5f3-c403-4231-924f-9900a3758eb7.jpg" title=" 5.jpg" / /p p 　　图4 利用衬度分离方法得到对称失配情形下的病毒颗粒结构(a)外部的衣壳结构 (b)内部的基因组结构 /p p 　　 strong 3.4 罗马不是一天建成的(Building Protein in One Day) /strong /p p 　　最近的研究成果显示，最大似然估计算法能够更好更快地完成三维重构，多伦多大学的Marcus A. Brubaker 教授针对最大似然估计算法提出了优化，有效地缩短了三维重构所需的时间。对传统迭代算法极度依赖于初始模型结构的缺点进行改进，同时通过采样优化的方式降低了计算量，减少计算时间，据称这些优化可以达到100000倍的加速，利用一台计算机工作站在一天内就能完成模型重构。 /p p 　 strong span style=" background-color: rgb(112, 48, 160) color: rgb(255, 255, 255) " 　4 展望与总结 /span /strong /p p 　　冷冻电子显微镜技术已经发展成为一个成熟的方法，应用于各种复杂的生物分子体系的高分辨结构研究。按照目前的发展势头，解决生物分子结构组(structural proteome)的问题已经不是遥不可及的了。在解决单一静态结构的基础上，冷冻电镜也展示了其研究多构象体系的潜力。下面对冷冻电镜在结构生物学研究领域的应用做一些大胆的展望，希望能抛砖引玉。 /p p 　　 strong 4.1 解决膜蛋白的结构 /strong /p p 　　由于膜蛋白是镶嵌在磷脂分子构成的细胞膜内，目前在冷冻电镜领域的样品制备还没有很好的处理方法，因此还很少见到对膜蛋白的结构解析。随着技术的发展，新的试剂分子或者纳米尺度的容器可以用来制备单一性很高的稳定的细胞膜以及镶嵌在内的膜蛋白。这样就可以利用冷冻电镜的方法对膜蛋白进行结构研究。目前在纳米盘(nanodiscs)的研究领域已经取得了一定的进展，对 /p p 　　冷冻电镜解析高精度的膜蛋白结构，我们拭目以待。 /p p 　 strong 　4.2 细胞内分子结构测定：从溶液内(in vitro)到细胞内(in situ) /strong /p p 　　当前的高分辨分子结构基本都是在溶液中提纯出来的分子样品，也就是通常所说的in vitro 实验。现在可以利用快速冷冻的方法把细胞固定，再用高能粒子枪对细胞进行高精度切片。在细胞的某些部位，常常有大量同类分子聚集，比如在内质网(endoplasmic reticulum，ER)部分有很多核糖体，在细胞骨架上会有大量的肌动蛋白(actin)分子。对这些切片进行成像研究可以获取这些分子在细胞环境的结构信息。 /p p 　 strong 　4.3 细胞结构和分子在细胞内的分布：从部分到整体 /strong /p p 　　电镜可以用来做断层成像(cryogenic computed tomography，cryo-CT)，应用于亚细胞层面的研究，比如细胞器的结构，蛋白质分子的分布，以及一些细胞骨架的构成。与超低温样品操作结合，cryo-CT 可以提供更高分辨率的信息，衔接分子层面和细胞层面的知识，对于了解细胞功能至关重要。在电镜成像研究领域，这将是一个有广阔前景的课题。 /p p 　 strong 　4.4 多构象的识别和自由能景观确定 /strong /p p 　　人们开始不满足于近原子级别分辨率能够提供的信息，想要进一步刻画分子结构连续变化的状态。得益于冷冻电镜的成像特性，相对其他技术而言，冷冻电镜技术在时间尺度的系综上具有优势。在冷冻电镜下分子结构的动力学研究中，有两个值得关注的趋势，分别是能够获取分子结构“ 慢” 反应过程(10—1000 ms) 时间分辨(time-resolved)的冷冻电镜技术，以及能够分析出连续构象变化的分类算法。获取短期反应过程(10—1000 ms)分子结构的基础是在准备样本过程中分子反应的速度慢于冷冻样本的时间，目前混合喷雾(mixing-spraying)等快速冷冻技术的实现使得一些较慢的反应过程可以看到动力学变化。而流形嵌入算法在分类过程中取得突破，在更好地利用冷冻电镜观察分子的平衡态结构动力学变化和展现自由能景观上取得了令人鼓舞的成果。 /p p 　 strong 　4.5 从静态结构到动态分子电影 /strong /p p 　　生物分子在室温下是活跃的，而且大多数的分子功能是通过结构的变化来实现的。基于X射线， 尤其是最近发展的X 射线自由电子激光(XFEL)的结构生物学的研究重点之一便是实现时间分辨的结构生物学研究(time-resolved structure determination)。到目前为止，基于X 射线的研究取得了很大的进展，但主要还是局限在对晶体的衍射方面，比如对光合作用过程中水分子分解的研究和光敏黄蛋白的光吸收过程的研究。三维冷冻电镜的单颗粒成像技术最有希望在单分子水平上实现对时间分辨的结构变化研究，同时，这对于样品制备和实验操作提出了非常高的要求。 /p p 　 strong 　5 结束语 /strong /p p 　　冷冻电镜的技术突破及其在生物分子结构领域的应用把我们对分子生物学的研究推进了一大步，开始探索未知的区域。立足于解决单一构象的基础，对多构象以及动力学过程和热力学的研究也需要展开，这需要对现有技术进行提升并与其他方法进行结合，计算建模和模拟的方法也需要紧密结合起来，实现对生物分子系统的集成研究。 /p p 　　致谢 感谢北京大学欧阳颀教授对文章写作提出的宝贵意见。 /p

p style=" line-height: 1.75em text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201605/insimg/10b97d65-a440-46ce-8444-f08d5fcc0fd3.jpg" title=" QQ图片20160526093428.jpg" / /p p style=" line-height: 1.75em text-align: center " 章新政、李梅、柳振峰（由左至右）在中国科学院生物物理所的实验室内合影 /p p style=" line-height: 1.75em " & nbsp & nbsp & nbsp & nbsp 近日，中国科学院生物物理研究所柳振峰研究组、章新政研究组与常文瑞/李梅研究组通力合作，联合攻关，通过单颗粒冷冻电镜技术，在3.2埃分辨率下解析了高等植物(菠菜)光系统II-捕光复合物II超级膜蛋白复合体(PSII-LHCII supercomplex)的三维结构。该项研究工作于5月18日在《自然》(Nature)期刊作为长篇主题论文(Article)在线发表。 /p p style=" line-height: 1.75em text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201605/insimg/40e208d7-2d2e-41ef-b61d-30c43ddd32e7.jpg" title=" QQ图片20160526093928.jpg" / /p p style=" line-height: 1.75em text-align: center " 章新政在中国科学院生物物理所的实验室内展示冷冻电镜 /p p style=" line-height: 1.75em " 　　光合作用为地球上几乎所有生命体提供赖以生存的物质和能量，基于结构的光合作用机理研究不仅具有重要的理论意义，同时也将为解决能源、粮食、环境等问题提供具有启示性的方案。植物光合作用的原初反应是从光系统II开始的，光系统II是由25个以上蛋白质亚基以及众多色素和其它辅因子组成的超大膜蛋白-色素复合物。该复合物中包含了天线系统、反应中心系统以及一个能在常温常压下裂解水释放氧气的放氧中心。解析植物光系统II神秘而复杂的精细结构将有助于理解该超分子机器的工作原理，也是结构生物学研究领域中多年来一直追求的热点和难点课题，并且是光合作用研究领域中众所期盼的一个超大膜蛋白-色素复合体三维结构。 /p p style=" line-height: 1.75em " 　　在对高等植物光系统II超大膜蛋白复合物样品的分离制备和晶体学研究方法长期探索的基础上，该研究团队及时引进并应用单颗粒冷冻电镜技术，通过联合三个课题组的优势科研力量并发挥各自的特长，团结奋战，协作攻关，以最高的效率在较短的时期内取得了突破性进展，高质量完成了该项具有高度挑战性的国际前沿研究课题。 /p p style=" line-height: 1.75em " 　　此次所解析的菠菜PSII-LHCII超级复合物的总分子量约1.1兆道尔顿(megadalton)(1,100 kDa)，形成了一个同质二聚体的超分子体系。每个单体中包含了25个蛋白亚基、105个叶绿素分子、28个类胡萝卜素分子和众多的其它辅因子。研究结果首次揭示了这一高度复杂的超分子体系的总体结构特征和各亚基的排布规律。 /p p style=" line-height: 1.75em " 　　在每个菠菜PSII核心复合物的外周，结合了主要捕光复合物LHCII三聚体，以及分子量分别为29 kD和26 kD的次要捕光复合物CP29和CP26。该项工作首次解析了CP29的全长结构和CP26的结构，并发现了这三个不同外周捕光复合物与核心复合物之间相互装配和识别的机制和位点。在准确指认了外周捕光复合物与核心复合物界面上的三个小亚基的基础上，合理解释了它们在介导二者之间装配以及稳定超级复合物方面的作用。 /p p style=" line-height: 1.75em " 　　外周捕光复合物为光系统II核心复合物提供激发能，而二者之间的能量传递途径多年来一直未能得到精确解析。在对菠菜PSII-LHCII超级复合物内部高度复杂的色素网络进行深入分析的基础上，首次揭示了LHCII、CP29以及CP26向核心天线复合物CP43或CP47传递能量的途径。同时，还对在光保护过程中发挥作用的潜在能量淬灭位点进行了定位。研究结果对于进一步在分子水平理解PSII-LHCII超级复合物中的能量传递时间动力学和光保护机理具有重要意义。 /p p style=" line-height: 1.75em " 　　该工作由生物物理所三个课题组共同完成，博士研究生魏雪鹏和助理研究员苏小东为该项工作的共同第一作者。该研究工作得到了中科院B类先导“生物超大分子复合体的结构、功能与调控”专项、科技部“973”重大科学问题导向项目“光合作用与‘人工叶片’ ”和自然科学基金的共同资助，研究员柳振峰和章新政得到了国家“青年千人计划”的资助和支持。该项工作得到生物物理所生物成像中心、 国家蛋白质科学中心(上海)、生物物理所蛋白质科学研究平台等有关工作人员的大力支持和帮助。 /p p style=" line-height: 1.75em text-align: center " img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201605/insimg/f7e41d6a-ef3b-45c0-8e8a-a702c6a63549.jpg" title=" W020160523352780363591.jpg" / /p p style=" line-height: 1.75em text-align: center " 菠菜PSII-LHCII复合物整体结构（顶视图） /p p br/ /p

近年来，由于硬件和图像处理算法上的不断突破，冷冻电镜单颗粒技术已经成为研究生物大分子复合体三维结构的主要研究手段之一，并已经达到了原子分辨率的水平。冷冻电镜技术流程中的关键步骤包括了冷冻样品的制备，将生物大分子样品快速冷冻在玻璃态冰中，用于下一步的冷冻电镜成像。然而，在实际的研究工作中，人们经常遇到颗粒不进孔、分布不均匀、取向优势严重、蛋白质变性等问题，导致无法解析样品的高分辨率三维结构，成为利用冷冻电镜解析生物大分子复合体高分辨率三维结构的关键瓶颈之一。近年来的研究逐步明确了该瓶颈问题的微观机理是源于传统冷冻制样过程中的气液界面效应，中科院生物物理所生物大分子国家重点实验室章新政课题组近期对于该机理问题进行了深入的探讨（Journal of Structural Biology 213, 107783）。孙飞课题组与中科院生物物理所生物成像中心开展合作，多年来围绕冷冻电镜样品制备技术开展了研究和创新，先后开发了微孔阵列碳支持膜GiG（发明专利ZL201310489148.1）和微孔阵列非晶镍钛合金支持膜ANTA（发明专利CN201810326897.5 Progress in biophysics and molecular biology 160, 5-15），相关技术产品广泛用于我国冷冻电镜实际研究工作。近日，中科院生物物理所生物大分子国家重点实验室孙飞课题组与南开大学生命科学学院分子微生物学与微生物工程实验室乔明强课题组合作，在 Nature Communications 期刊上发表了题为 ：A cryo-electron microscopy support film formed by 2D crystals of hydrophobin HFBI 的研究论文。针对当前冷冻电镜样品制备过程中普遍存在的由于气液界面导致的样品变性、解聚和取向优势问题，研究团队报道了一种用基于真菌疏水蛋白HFBI薄膜的新型冷冻电镜支持膜技术，可以有效解决由于气液界面效应导致的样品变性、解聚和取向优势问题，提高利用冷冻电镜技术解析生物大分子复合物高分辨率三维结构的通量与效率。真菌疏水蛋白是一类由高等丝状真菌分泌的小分子量蛋白质（7-15kDa），可在菌丝和孢子表面自组装形成两亲性蛋白膜，在真菌不同发育阶段中起到关键作用。疏水蛋白作为两亲性蛋白质，其表面展现出明显的疏水和亲水性区域，使得疏水蛋白成为表面活性最强的蛋白质之一。良好的生物相容性、独特的自组装特性及高度的成膜稳定性使得疏水蛋白被广泛用于食品乳化、药物递送、生物材料修饰和生物传感器等领域研究。疏水蛋白HFBI是一类由瑞氏木霉生产的II型疏水蛋白，可以在气液界面处自组装成单层、高度有序的二维晶体结构（图1）。图1. 真菌疏水蛋白生理功能及HFBI结构示意图在本项研究中，研究人员利用疏水蛋白HFBI自组装形成的连续二维晶体薄膜来覆盖微孔阵列非晶镍钛合金膜载网（图2），用于冷冻电镜样品制备。该载网天然亲水，无需做辉光放电处理，通过静电相互作用吸附蛋白颗粒来克服样品与气液界面接触的问题。此外，该支持膜能够帮助形成更均匀更薄的玻璃态冰，背景衬度低，有利于高分辨率和高信噪比的冷冻电镜成像。在本项研究中，研究人员用该载网成功解析了6种蛋白质的高分辨率冷冻电镜结构（图3），其中包括两个在过去冷冻电镜实验中具有明显取向优势的蛋白质样品--过氧化氢酶catalase和流感病毒血凝素HA，分子量最小可达64 kDa。这些研究结果表明该新型冷冻电镜支持膜载网可以有效解决气液界面效应，对不同分子量的样品具有广泛的适用性。此外，在本项研究中，研究人员证明了该疏水蛋白膜是通过静电相互作用来吸附蛋白颗粒，这个相互作用可以改变样品溶液的pH值来进行调节，从而为后期人们使用该支持膜载网提供了明确的优化方向和手段。图2. 疏水蛋白支持膜载网的制备流程图图3. 利用疏水蛋白支持膜载网所解析的冷冻电镜结构该研究工作由中国科学院生物物理研究所和南开大学合作完成，通讯作者为生物大分子国家重点实验室孙飞研究员和南开大学生命科学学院乔明强教授。孙飞课题组博士生范宏成设计并制备了疏水蛋白支持膜载网，为本项工作的第一作者，南开大学乔明强研究组博士生王波制备了疏水蛋白样品，为本项工作的第二作者。孙飞研究组的张艳副研究员、朱赟副研究员和翟宇佳副研究员在数据处理、文章写作和专利申请方面给予了指导。南开大学乔明强研究组的徐海津副教授和博士生宋博参与了疏水蛋白样品的制备和性质检测。该项工作的所有电镜数据收集工作均在中科院生物物理所生物成像中心完成，感谢季刚博士、黄小俊博士、贾星博士、朱博玲博士、范德印等工程师的帮助。该项工作得到了科技部重点研发项目、科技部中国-瑞士科技合作项目、国家自然科学基金、中科院先导B项目和北京市科委的支持。最后，该项研究成果已经申请了中国发明专利（申请号CN202110576212.4）。文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-27596-8

12月14日，中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室孙飞课题组与南开大学生命科学学院分子微生物学与微生物工程实验室乔明强课题组合作，在Nature Communications上发表了题为A cryo-electron microscopy support film formed by 2D crystals of hydrophobin HFBI的研究成果。针对当前冷冻电镜样品制备过程中普遍存在的由于气液界面导致的样品变性、解聚和取向优势问题，该研究报道了一种用基于真菌疏水蛋白HFBI薄膜的新型冷冻电镜支持膜技术，为相关问题提出了有效的解决方案。　　近年来，由于硬件和图像处理算法上的不断突破，冷冻电镜单颗粒技术已成为研究生物大分子复合体三维结构的主要研究手段之一，并已达到原子分辨率的水平。冷冻电镜技术流程中的关键步骤包括冷冻样品的制备，将生物大分子样品快速冷冻在玻璃态冰中，用于下一步的冷冻电镜成像。然而，实际研究工作中存在颗粒不进孔、分布不均匀、取向优势严重、蛋白质变性等问题，导致无法解析样品的高分辨率三维结构，成为利用冷冻电镜解析生物大分子复合体高分辨率三维结构的瓶颈。近年来的研究逐步明确了该问题的微观机理是源于传统冷冻制样过程中的气液界面效应，生物物理所生物大分子国家重点实验室章新政课题组近期对于该机理问题开展了研究（Journal of Structural Biology 213, 107783）。孙飞课题组与生物物理所生物成像中心合作，围绕冷冻电镜样品制备技术，开发了微孔阵列碳支持膜GiG和微孔阵列非晶镍钛合金支持膜ANTA（Progress in biophysics and molecular biology 160, 5-15），相关技术产品用于冷冻电镜实际研究工作。在上述工作的基础上，孙飞课题组基于乔明强课题组制备的真菌疏水蛋白HFBI研发了全新的冷冻电镜支持膜HFBI-film，可有效解决由于气液界面效应导致的样品变性、解聚和取向优势问题，提高利用冷冻电镜技术解析生物大分子复合物高分辨率三维结构的通量与效率。　　真菌疏水蛋白是一类由高等丝状真菌分泌的小分子量蛋白质（7-15kDa），可在菌丝和孢子表面自组装形成两亲性蛋白膜，在真菌不同发育阶段中起到关键作用。疏水蛋白作为两亲性蛋白质，其表面展现出明显的疏水和亲水性区域，使疏水蛋白成为表面活性最强的蛋白质之一。良好的生物相容性、独特的自组装特性及高度的成膜稳定性使疏水蛋白被广泛用于食品乳化、药物递送、生物材料修饰和生物传感器等领域。疏水蛋白HFBI是一类由瑞氏木霉生产的II型疏水蛋白，可以在气液界面处自组装成单层、高度有序的二维晶体结构（图1）。　　本研究中，科研人员利用疏水蛋白HFBI自组装形成的连续二维晶体薄膜来覆盖微孔阵列非晶镍钛合金膜载网（图2），用于冷冻电镜样品制备。该载网天然亲水，无须做辉光放电处理，通过静电相互作用吸附蛋白颗粒来克服样品与气液界面接触的问题。该支持膜能够帮助形成更均匀更薄的玻璃态冰，背景衬度低，有利于高分辨率和高信噪比的冷冻电镜成像。研究人员用该载网解析了6种蛋白质的高分辨率冷冻电镜结构（图3），包括两个在冷冻电镜实验中具有明显取向优势的蛋白质样品——过氧化氢酶catalase和流感病毒血凝素HA，分子量最小可达64 kDa。结果表明，该新型冷冻电镜支持膜载网可以有效解决气液界面效应，对不同分子量的样品具有广泛的适用性。此外，研究人员证明了该疏水蛋白膜是通过静电相互作用来吸附蛋白颗粒，这一相互作用可以改变样品溶液的pH值来进行调节，从而为后期使用该支持膜载网提供了明确的优化方向和手段。　　研究工作得到国家重点研发计划、中国-瑞士科技合作项目、国家自然科学基金、中科院战略性先导科技专项（B类）和北京市科学技术委员会的支持。相关成果已申请中国发明专利。该工作的电镜数据收集工作均在生物物理所生物成像中心完成。　　论文链接

p 　　精确认识细胞当中的大分子结构对于理解它们的功能至关重要。Amunts等人利用冷冻电镜获得线粒体核糖体大亚基3.2埃的分辨率结构，还有最近利用冷冻电镜获取的其他一些高分辨率结构，这些成就预示着分子生物学研究的新时代，获取近原子分辨率的大分子结构将不再是X射线晶体学和核磁共振的特权。 /p p style=" text-align: center " img alt=" " src=" http://img1.17img.cn/17img/old/NewsImags/images/2014912171159.jpg" style=" width: 600px height: 350px " / /p p 　　图：利用冷冻电镜获得的近原子分辨率结构：(A)酵母线粒体核糖体大亚基，分辨率3.2 埃。(B) TRPV1离子通道，分辨率3.4 埃。(C)F sub 420 /sub -还原[NiFe]氢化酶，分辨率3.36埃。注：该图并不是按比例绘制的。 /p p 　　核糖体是古老的，大规模的蛋白RNA复合物，它将线性遗传密码翻译成三维蛋白质。线粒体——半自主细胞器，为细胞提供能量，拥有它们自己的核糖体，这一点和细菌非常类似。许多抗生素，如红霉素，通过阻止细菌的核糖体翻译机器来抑制细菌的生长。当设计新的抗生素，不能让他们同时阻断线粒体核糖体很重要。因此，认识这两种核糖体的详细结构是很有价值的。其他核糖体的结构已经通过X射线晶体学确定。Amunts等利用冷冻电镜确定了线粒体核糖体的高分辨率结构，这在不到一年前，很少有人会想到可能实现。 /p p 　　不用晶体而能够做到这一点无异于是一场革命。主要是因为采用了新的探测器——具有前所未有的速度和灵敏度的直接电子探测器。直接电子探测器能够直接检测电子，而不是需要先将它们转换成光子，然后再转化为光电子探测进行，目前广泛使用的CCD(电荷耦合器件)相机就是这样，但它们的分辨率不是很好。照相胶片从工作原理上来说，高分辨率成像效果应该更好，但它很难和越来越重要的快速读出电子速度及高数据吞吐量相兼容。 /p p 　　大约10年前，Henderson和Faruqi意识到，应该有可能设计出一种结合了CCD相机和胶片优点的直接探测电子的传感器。他们和两个竞争团队研发的探测器，采用了和大多数手机中的摄像头芯片基本相同的有源像素传感器技术。然而，手机的芯片不能用于电子显微镜，因为强烈的电子束会瞬间破坏它们。因此，首先探测器必须能够抗辐射。第二，探测器所需的像素要大很多，以防止富含能量的电子一次激发多个像素。第三，摄像头采用的芯片必须非常薄，完成每次读出电子160万像素，否则电子散射将会使图像模糊并降低分辨率。目前传感器的厚度大约是一张纸厚度的一半。 /p p 　　冷冻电镜只需要少量的样品，因此那些无法分离得到大量样品，利用X射线晶体学方法进行分析的物质，现在可以利用冷冻电镜得到高分辨率结构。这同样适用于不容易结晶的非均相样品或柔性复合物，因为不同颗粒或构象的物质的冷冻电镜图像在图像处理阶段很容易分离开。 /p p 　　新的检测器提供了另一种决定性的优势：当电子束撞击薄的、不支持冷冻的样品时，它们的快速读出能够补偿小的不可避免地移动。在新的相机问世前，由于电子束诱导移动引起的模糊是一个看似不可逾越的问题。现在，通过快速连续拍摄，可以得到一个区域的数十张图像，并且电子束诱导移动被检测到并反转在电脑上。这种去除模糊的影响戏剧性的和天文学哈勃望远镜相类似，尽管在这两种情况下引起模糊的原因是不同的。 /p p 　　新的相机也促使了低温电子断层扫描成像的重大突破，低温电子断层扫描能够得到全细胞、细胞片、或细胞区室的三维图像，如线粒体。利用断层成像识别分子特征，采用标准CCD相机甚至已达到亚纳米细节，新的探测器问世也必然给断层成像研究带来巨大的变化。 /p p 　　在新相机问世的同时，强大的极大似然图像处理程序也被开发出来。这些程序定义可靠客观的标准，来对几万或几十万个的单粒子图像进行平均处理，为的是要实现高分辨率。先进的检测器和软件相结合，获取的冷冻电镜结构，在相同的标称分辨率下，其清晰度和map definition比采用X射线晶体学解析的结构要好，因为在冷冻电镜图像中包含着高质量的相位信息。 /p p 　　冷冻电镜的分辨率革命是否意味着X射线蛋白质晶体学时代即将结束?当然不是。在可预见的将来，分子量小于100kD的小蛋白，分辨率达到2 Å 或更好将依然是X射线晶体学的领域。但是对于大的，易碎的，或者柔性结构蛋白(如膜蛋白复合物)，它们很难形成晶体，但却在生物医学中起着关键的作用，新技术将对此带来重大突破。在未来，对分子量大、已知的蛋白复合物，如核糖体，进行结晶将可能不再是必要的。相反，它们的结构可以从容并迅速的通过冷冻电镜来确定。这真是激动人心的时刻。（编译：秦丽娟） /p p & nbsp & nbsp 原文检索： a href=" http://www.sciencemag.org/content/343/6178/1443.short" http://www.sciencemag.org/content/343/6178/1443.short /a /p

中国科学技术大学、中国科学院深圳先进技术研究院双聘教授毕国强团队，与美国加州大学洛杉矶分校周正洪教授合作，开发了一套基于深度学习的cryoET数据处理算法和软件IsoNet,有效解决了cryoET成像中的缺失锥效应和低信噪比问题，相关研究成果以Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning为题于2022年10月29日发表在Nature communications.研究人员搭建了一套迭代优化的自监督深度学习人工网络算法，并以旋转处理后的cryoET断层三维重构数据自身为训练集，实现了对cryoET断层三维重构数据的缺失锥矫正。同时，在IsoNet算法的流程中，加入降噪过程，使得同一个人工神经网络可以同时对断层三维重构数据进行缺失信息补全和降噪处理。图1.基于深度学习进行cryoET成像数据缺失锥矫正与降噪的基本原理与流程利用IsoNet算法对模拟缺失锥的铁蛋白(apoferritin)与核糖体(ribosome)的三维结构分别进行处理，处理后的结果能够与低分辨的原子模型相媲美。同时对真实的HIV病毒粒子（immatureHIVcapsid）、副鞭毛杆（the paraflagellar rod）以及培养神经细胞中突触（neuronalsynapse）的断层三维重构数据进行处理，均得到了非常好的效果。尤其值得关注的是，在利用IsoNet算法对神经突触这种典型包含大量蛋白、膜性细胞器与细胞骨架等复杂结构的细胞水平厚样品的断层三维重构图像进行处理后，突触中囊泡、线粒体、微管、微丝、细胞膜以及蛋白复合物的三维结构信息均得到了很好的恢复。图2.利用IsoNet算法对神经突触cryoET三维重构数据进行处理前、后的效果，以及对IsoNet算法处理后神经突触中超微结构基于真实电子密度的三维可视化渲染IsoNet算法在预印本bioRxiv公布后，引起了领域内的广泛关注与深入讨论，其中一个重点是IsoNet算法是如何实现缺失锥矫正的？一种主要推测是，人工神经网络在训练过程中，能够学习到蛋白质等生物结构在三维空间中不同角度的结构特征，并将这些信息补充到缺失锥方向，类似于单颗粒冷冻电镜三维平均。因此通过不断优化人工神经网络架构、扩大训练样本集等手段，IsoNet算法将能够实现对细胞中每个蛋白分子的高分辨三维结构信息进行恢复，从而为真正实现可视化细胞原位每个蛋白分子的高分辨三维结构与组织分布奠定了基础。正如领域内专家Dimitry Tegunov等人在推特上评价认为，IsoNet算法的思路将是cryoET技术的未来发展方向。本论文的第一作者为中国科学技术大学博士生刘云涛（现美国加州大学洛杉矶分校博士后）和2018级本科生张恒（现北京大学研究生），通讯作者为毕国强教授和周正洪教授。中科院深圳先进技术研究院副研究员陶长路博士、美国加州大学洛杉矶分校博士生王辉也参与了本文的工作。该工作得到了科技部、国家自然科学基金委、中科院先导专项的资助。

由中国生物物理学会、中科院生物物理研究所、清华大学和FEI 公司联合主办的第一次中国结构生物学冷冻电镜培训班(Get acquainted with Cryo-Electron Microscopy：First Chinese Workshop for Structural Biologists)于2015 年5 月29 日-6 月3 日在北京顺利举行。本次培训班主任由中科院生物物理所孙飞研究员、清华大学王宏伟教授和美国FEI公司Marc Storms博士担任，讲授队伍来自中科院生物物理所、清华大学、北京大学、中科院上海生化细胞所、中国科技大学、英国剑桥大学LMB实验室和FEI公司等工作在冷冻电镜一线的教授和工程师们，并精心地为学员们准备了包括讲义、课件、学习资料、实习材料和数据在内的教学材料。本次培训班得到了FEI公司的独家赞助和大力支持。 　　作为生物大分子结构研究的手段之一，冷冻电子显微镜三维重构技术，尤其是单颗粒三维重构技术(SPA)，近期取得了非常瞩目的成果。近两年来，利用SPA技术解析的重要生物大分子复合体层出不穷，分辨率也日益提高。在此契机下，中国生物物理学会生物超微结构显微成像专业委员会与FEI公司进行合作，利用中科院生物物理研究所和清华大学生命科学学院在国际上领先的冷冻电子显微平台，联合发起了此次培训班，旨在为零基础学员提供全面了解和学习电镜三维重构理论和技术的机会，系统地将冷冻电镜前沿技术带给国内的相关研究人员，特别是X射线晶体学、NMR等非电镜领域的专家学者和学生们。这无疑将极大地推动我国冷冻电镜和结构生物学领域的发展。 　　培训班为期四天，包括上午讲座报告、下午实际操作和上机实习、以及晚上的答疑讨论会。来自全国百余学员参加了此次培训活动。5月30日上午，北京大学的尹长城教授对冷冻电镜的发展历史、现状进行总结并对未来的发展进行展望，提出电镜技术已经进入&ldquo 黄金时代&rdquo 。随后，清华大学的王宏伟教授和中国科技大学的蔡刚教授分别对负染色和冷冻两种电镜制样方法进行了非常详尽的介绍。5月31日上午，清华大学的雷建林教授详细讲解了透射电子显微镜(TEM)的光学系统、成像原理等关键理论，FEI公司的应用工程师王庆博士则介绍了如何操作电镜，如何进行拍照成像等具体的工作流程。6月1日上午，清华大学的高宁教授介绍了如何评估电镜数据质量，李雪明教授介绍了目前最前沿的直接电子探测相机技术及其相关的motion 校准技术，英国MRC的白晓晨博士分享了解析高分辨率电镜结构涉及到从前期制样到后期图像处理的大量技术细节。利用前三天下午的实习操作时间，学员们不仅零距离看到工程师们现场演示制作电镜样品和电镜操作，而且还亲自练习制样方法并实际操作电镜。6月2日，中科院生物物理所的孙飞研究员、中科院上海生化细胞所的丛尧教授介绍了单颗粒三维重构的基础知识和原理，中科院生物物理所的朱平研究员系统讲解了如何对重构结果进行分析和展示。2日下午学员们在老师们的指导下上机练习了两个冷冻电镜三维重构软件EMAN2和Relion，对三维重构的流程有了更加直观的认识。除此之外，每天晚上的讨论会，学员们都带着问题来的，互动交流的主动性很高，积极发言，深入讨论，将白天所学知识消化掌握，反响很好。 　　(中国结构生物学冷冻电镜培训班) 　　国际冷冻电子显微镜高级图像处理研讨会(International Workshop of Advanced Image Processing of Cryo-Electron Microscopy 2015)由清华大学隋森芳教授担任组委会主席，由清华大学王宏伟教授、中科院生物物理所孙飞研究员共同担任执行主席，于2015 年6月3日-6 月7日在北京顺利举行。教师队伍来自MRC分子生物学实验室(英国)、Brandeis University(美国)、University of Colorado Boulder(美国)、脑科学MPI 研究所(德国)、University of Basel(瑞士)等多所国外大学与研究机构。研讨会为期五天，包括上午讲座报告、下午软件操作与上机实习、及晚上的答疑讨论会，围绕近原子分辨率单颗粒重构技术、三维模型建立与精修、电子断层扫描与sub-tomo平均计算等主要议题，分别就DED图像的信息分析与处理方法、单颗粒锐化及电子密度图校正、低分辨率冷冻电镜图像的模型建立与验证、冷冻电镜图谱原子模型的搭建、近原子分辨率冷冻电镜图谱的结构细化与验证、电子断层扫描技术的理论与原理、电子断层扫描数据采集与处理中重要影响因素、sub-tomo平均计算的流程与应用、及其理论、方法与前景等多项话题展开深入的交流与细节探讨。来自日本、印度、美国等多个国家一百四十余名学员参加了本次研讨会，反响热烈。 　　(国际冷冻电子显微镜高级图像处理研讨会) 　　作为生物大分子结构研究的重要手段之一，冷冻电子显微镜技术近年来取得了非常瞩目的成果，分辨率获得极大提高。在此契机下，中国生物物理学会生物超微结构显微成像专业委员会与FEI等公司进行合作，利用中科院生物物理研究所与清华大学生命科学学院在国际上领先的冷冻电子显微镜平台，联合发起中国结构生物学冷冻电镜培训班与国际冷冻电子显微镜高级图像处理研讨会，不仅为零基础学员提供全面了解和学习电镜三维重构理论与技术的机会，同时为电镜结构生物学领域青年科学家们系统地介绍冷冻电镜前沿技术与图像处理最新研究方法与进展，积极促进国际交流与合作，极大的推动我国冷冻电子显微镜和结构生物学领域的进步与发展。

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近日，《Science》杂志以封面专题的形式发表了 5 篇论文，共同展现了通过 AI 技术来揭示人类和非洲爪蟾的核孔复合体（NPC）结构。开始正文之前，我们先来看一张图片，在下图中，很明显可以看出，图的右半部分所代表的信息更加丰富，结构也更清晰。而左半部分 2016 年的图，则结构较为单一，代表的信息比较少：其实上面展示的是核孔复合体（NPC）图像。核孔复合体，由约 1000 个蛋白质亚基组成，担负着真核生物细胞核与细胞质之间繁忙的运输大分子的任务，也是其连接胞质和细胞核的唯一双向通道。除了协调运输外，NPC 还组织必要的转录、mRNA 成熟、剪接体和核糖体组装等重要生命活动。NPC 强大的作用，已然成为疾病突变和宿主 - 病原体相互作用的关键点。得益于低分辨率下全核孔结构以及高分辨率下核孔组成结构技术的发展，细胞核孔受到越来越多的关注。然而，利用这些信息正确组装 30 多种不同蛋白质副本，并构建高分辨率的三维结构，一直是一项艰巨的挑战。近日，《Science》杂志以封面专题形式发表了 5 篇论文，其中 3 篇论文共同揭开了人类核孔复合体的近原子分辨率冷冻电镜结构，另外两项研究通过非洲爪蟾呈现了脊椎动物核孔复合体的单颗粒冷冻电镜图像。这篇封面文章将多项研究成果拼接在一起，形成的人类 NPC 图像接近原子级。论文地址：https://www.science.org/doi/pdf/10.1126/science.add2210这一研究成果建立在多项研究之上，包括数十年的生物化学重建、X 射线晶体学、质谱学、诱变和细胞生物学等。使用大幅度改进的冷冻电子断层扫描重建人类 NPC，并用人工智能技术精确建模组件。还有其他研究提高了单粒子冷冻电镜的分辨率，使脊椎动物 NPC 的二级结构元素和残基水平细节的可视化成为可能。分子组合丰富了我们对脊椎动物和人类 NPC 构建的理解——从旧的核支架到将各个部分连接在一起的连接蛋白，以及从核膜锚定到中央运输通道上方的细胞质丝。这里报告的研究成果，代表了实验结构生物学与人工智能的合作共赢，是人类探索生物微观世界的又一次胜利。另外，也证明了正在进行的分辨率革命，在我们寻求了解大分子组件的构造和设计原理方面，具有不可替代地作用。下图为 2022 年人类核孔复合体的横截面视图，新解析的成分包括对称核心（橙色）和细胞质细丝（黄色）：五篇研究论文论文 1：《Architecture of the cytoplasmic face of the nuclear pore》论文地址：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abm9129核孔复合体（NPC）是核质转运的唯一双向通道。尽管最近在阐明 NPC 对称核心结构方面取得了一些进展，但对于 mRNA 输出和核孔蛋白相关疾病的热点来说，不对称分布的细胞质表面仍然难以捉摸。加州理工学院等机构的研究者报告了通过结合生化重建、晶体结构测定、冷冻电子断层扫描重建和生理验证而获得的人类细胞质面的复合结构。虽然物种特异性基序在中央转运通道上方锚定了一个进化上保守、约 540 千道尔顿（kilodalton）异六聚体细胞质细丝核孔蛋白复合体，但 NUP358 五聚体束的附着取决于外套核孔蛋白复合体的双环排列。他们揭示的复合结构及其预测能力为阐明 mRNA 输出和核孔蛋白疾病的分子基提供了丰富的基础。人类 NPC 的细胞质面论文 2：《Architecture of the linker-scaffold in the nuclear pore》论文地址：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abm9798尽管人们已经可以确定 NPC 对称核心中结构化支架核孔蛋白的排列，但它们通过多价非结构化接头核孔蛋白的内聚性仍然难以捉摸。通过结合生化重建、高分辨率结构测定、冷冻电子断层扫描重建和生理验证，加州理工学院的研究者阐明了进化上保守的接头支架结构，产生了人类 NPC 的约 64 兆道尔顿（megadalton）对称的近原子复合结构核。虽然接头通常起刚性作用，但 NPC 的接头支架为其中央转运通道的可逆收缩和扩张以及横向通道的出现提供了必要的可塑性和稳健性。他们的结果大大推进了 NPC 对称核心的结构表征，为未来的功能研究打下了基础。人类 NPC 对称核心的接头支架结构。论文 3：《AI-based structure prediction empowers integrative structural analysis of human nuclear pores》论文地址：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abm9506虽然核孔复合体（NPC）介导核质转运，它们错综复杂的 120 兆道尔顿架构仍未完全得到了解。马克斯 普朗克生物物理研究所等机构的研究者报告了具有显式膜和多构象状态的人类 NPC 支架的 70 兆道尔顿模型。他们将基于 AI 的结构预测与原位和细胞冷冻电子断层扫描、综合建模相结合。结果表明，接头核孔蛋白在亚复合体内和亚复合体之间组织支架，以建立高阶结构。微秒长的分子动力学模拟表明，支架不需要稳定内外核膜融合，而是扩大中心孔。他们举例阐释了如何将基于 AI 的建模与原位结构生物学相结合，以了解跨空间组织级别的亚细胞结构。人类 NPC 支架架构的 70 兆道尔顿模型。论文 4：《Structure of the cytoplasmic ring of the Xenopus laevis nuclear pore complex》论文地址：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abl8280西湖大学和清华大学以 3.7-4.7 埃（angstrom）的分辨率对非洲爪蟾 NPC 的细胞质环亚基进行单粒子冷冻电子显微镜重建。其中，Nup358 的氨基末端域的结构被解析为 3.0 埃，这有助于识别每个细胞质环亚基中的五个 Nup358 分子。研究者最终的细胞质环亚基模型包括五个 Nup358、两个 Nup205 和两个 Nup93 分子，以及两个先前表征的 Y 复合体。Nup160 的羧基末端片段充当每个 Y 复合体顶点的组织中心。结构分析揭示了 Nup93、Nup205 和 Nup358 如何促进和加强主要由两层 Y 复合体形成的细胞质环支架的组装。非洲爪蟾 NPC 双层细胞质环的 Cryo-EM 结构。论文 5：《Structure of cytoplasmic ring of nuclear pore complex by integrative cryo-EM and AlphaFold》论文地址：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abm9326哈佛医学院等机构的研究者使用单粒子冷冻电子显微镜和 AlphaFold 预测，从非洲爪蟾卵母细胞中确定了近乎完整的 NPC 细胞质环结构。具体地，他们使用 AlphaFold 预测核孔蛋白的结构，并使用突出的二级结构密度作为指导来适应中等分辨率的地图。此外，某些分子相互作用通过使用 AlphaFold 的复杂预测进一步得到建立或确认。研究者确定了五份 Nup358 的结合模式，它是最大的 NPC 亚基，具有用于转运的 Phe-Gly 重复序列。他们预测 Nup358 包含一个卷曲螺旋结构域，可以提供活性以帮助它在一定条件下作为 NPC 形成的成核中心。非洲爪蟾 NPC 细胞质环的 Cryo-EM 结构。

俄勒冈州希尔斯伯勒市，2022年8月1日讯。赛默飞世尔科技推出了Thermo Scientific Arctis冷冻等离子体聚焦离子束电镜（Cryo-PFIB），这是一款全新的自动化显微镜，经过设计可用于加快冷冻电子断层成像（Cryo-ET）研究的步伐。冷冻电子断层成像（Cryo-ET）技术使得细胞生理环境中的蛋白质研究和其他分子的运行机制研究成为可能，与其他显微镜技术相比，其分辨率达到了前所未有的水平，而且可以在细胞生物学研究方面发挥巨大的潜力，包括传染性疾病、神经退行性疾病和其他具有全球影响力的结构生物学应用。然而，为冷冻电子断层成像技术制备最佳样品的过程仍然耗时且复杂。Arctis Cryo-PFIB通过为用户提供先进的自动化和全新的连接解决方案能力，可以解决工作流程中的多种挑战，与其他的解决方案相比，Arctis Cryo-PFIB极大地提高了通量，可以快速、持续制备适用于冷冻电子断层成像技术的样品。该系统旨在提供厚度均一的高质量样品，同时最大限度地降低样品污染风险。用户可以享受到内置一体化光电联用显微技术、专用等离子体FIB技术、先进的自动化和全新的连接功能，包括简化上样和样品转移功能。亮点包括：1、一体化光电联用显微镜技术（CLEM）：用于快速定位感兴趣的区域。2、等离子体FIB技术：用于快速减薄大块样品并快速定位到感兴趣的区域。3、自动化功能：可简化样品制备并实现远程操作，与当前基于镓的冷冻FIB解决方案相比，可实现长时间的自动化运行、可重复的结果和更高的通量。4、工作流程中的连通性：可简化将样品转移到Thermo Scientific Krios或Glacios冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）的过程。Arctis Cryo-PFIB 配备了赛默飞世尔科技推出的行业领先的自动上样系统（Autoloader），可自动装载多达12个载网。全新的专用TomoGrid可以确保减薄后的样品与透射电子显微镜倾斜轴实现最佳对齐。如要报名参加9月21日的全球新品发布网络研讨会，请扫描下方二维码注册研讨会。

细胞里面的生命活动井然有序，每一个部分都有其特定的结构，承担不同的功能。生物大分子则是一切生命活动的最终执行者，它们主要是核酸和蛋白。核酸携带了生命体的遗传信息，而蛋白是生命活动的主要执行者。自现代分子生物学诞生以来的半个世纪里，解析和分析生物大分子的结构、进而阐释其功能机制一直都是现代生命科学的核心问题之一。　　事实上，一切自然科学都涉及物质结构及结构间的相互作用为核心的研究方向，天文学研究宇宙、星体等的结构及其相互作用，粒子物理研究物质世界的基本粒子的结构和相互作用，甚至包括应用性很强的材料科学都是以研究新型材料的结构和性质等为核心。结构生物学研究的直接目的是弄清楚生命大分子结构，从而更好地理解生命，理解这个自然界中“逆热力学第二定律”而诞生的奇迹 最终目标是公众通常关心的实用价值。　　像数学物理公式不会直接造出飞机、导弹、计算机一样，蛋白质结构这样的基础研究不会直接转化为人们生产生活的必须物品。比较具体的应用，如药物设计、疫苗开发、医疗诊断和蛋白质分子性能改造(如科学实验或工业生产中酶活性稳定性优化)等是蛋白质结构研究比较容易被大众所理解的一个方向，但却只是其研究价值的一个侧面而已。　　蛋白质结构如同生命科学里的数学公式和物理定律，甚至在以后会充当生命科学里面的“化学元素周期表”，除了帮助发现或设计新药等，它更重要的价值是作为最基础最上游的研究之一，通过影响一切与其密切相关的下游科学和技术，从而改变我们的世界。　　结构生物学最早诞生于上个世纪中叶，它是一门通过研究生物大分子的结构与运动来阐明生命现象的学科，在其发展史上有两个里程碑式的事件，一个是 DNA双螺旋结构的发现，另一个肌红蛋白(Myglobin)晶体结构的解析，这两个事件都是上个世纪最重要的革命性科学进展，均在剑桥MRC分子生物学实验室完成，并且都于1962年获得了诺贝尔奖(一个生理学或医学奖，一个化学奖)。同时它们都是最早使用X射线的方法来解析生物大分子结构，而这个方法在过去半个世纪里，一直占据结构生物学的统治地位。　　在当今结构生物学研究中普遍使用的冷冻电镜，是上个世纪七八十年代开始出现、近两年飞速发展的革命性技术，它可以快速、简易、高效、高分辨率解析高度复杂的超大生物分子结构(主要是蛋白质和核酸)，在很大程度上取代并且大大超越了传统的X射线晶体学方法。　　革命性的冷冻电镜技术　　冷冻电镜并不是这两年才建立的。在蛋白质X射线晶体学诞生大约10多年以后的1968年， 作为里程碑式的电镜三维重构方法，同样在剑桥MRC 分子生物学实验室诞生，Aron Klug教授因此获得了1982年的诺贝尔化学奖。另一些突破性的技术在上世纪70年代和80年代中叶诞生，主要是冷冻成像和蛋白快速冷冻技术。这里面的代表科学家有Ken Taylor, Robert Glaeser和Jacques Dubochet等。　　快速冷冻可以使蛋白质和所在的水溶液环境迅速从溶液态转变为玻璃态，玻璃态能使蛋白质结构保持其天然结构状态，如果以缓慢温和的方式冷冻，这个过程会形成晶体冰，生物分子的结构将被晶格力彻底损坏。低剂量冷冻成像能够保存样品的高分辨率结构信息，确保了从电镜图形中解析蛋白质结构的可能性。与此同时Joachim Frank等则在电镜图像处理算法方面奠定和发展了这项技术的理论基础。由此冷冻电镜的雏形基本建立，总的思路为：　　1)样品冷冻(保持蛋白溶液态结构) 　　2)冷冻成像(获取二维投影图像) 　　3)三维重构(从二维图像通过计算得到三维密度图)。　　该方法为生物大分子结构研究提供了一个和X射线晶体学完全不一样的、全新的思路。但是由于技术方法的瓶颈，在此后30多年的时间里只能做一些相对低分辨率的结构解析工作，在分辨率上一直不能和X射线晶体学比较，甚至一度被嘲笑为”blob-ology“(英文讽刺语，“一坨轮廓的技术”)。冷冻电镜三维重构得到的电子云密度图和原子模型(局部)。张凯供图　　但对于冷冻电镜来说，技术难点远非单纯冷冻。冷冻成像和图像处理算法一直都是瓶颈。从冷冻电镜技术诞生以来的近30年时间里，其一直都有进展，只是相对比较缓慢。　　最重要的革命性事件大约发生在两三年前：一个是直接电子探测器的发明，另一个是高分辨率图像处理算法的改进。MRC分子生物学实验室的两位科学家Richard Henderson和Sjors Scheres在这次革命中起了关键作用(作者注：现代科技革命往往是诸多研究机构若干团队共同参与，此处仅列举关键代表，并且仅从技术角度讨论，不涉及生物学应用)。　　Richard Henderson是探测器方面的先驱，而Sjors Scheres则因他设计的Relion程序而名声大噪，他们由此当选为《自然》杂志2014年“十大科学进展年度人物”。两位科学家一个从硬件，一个从软件将冷冻电镜技术推向了巅峰，将冷冻电镜技术的分辨率推向了新高度。(作者注: Henderson教授的贡献远非探测器一个方面，包括冷冻电镜理论基础、算法、软件，重要生物大分子应用，如曾首次解析视紫红质跨膜螺旋等等方面 早在20多年前，他就通过一系列理论分析，预言了冷冻电镜研究的尺度、分辨率极限、技术瓶颈等等，并且断言：冷冻电镜将超越其它一切技术方法，成为蛋白质结构研究的主导工具，如今这些预言全部应验。)　　和此前使用的CCD相比，新发展的直接电子探测器不仅在电镜图形质量上有了质的飞跃，同时在速度上大幅提高，还可以以电影的形式快速记录电镜图像。这些特性同时也伴随着电镜图像处理方面的重大变革，电镜技术此前在分辨率上的一个主要瓶颈是电子束击打生物样品造成的图像漂移和辐射损伤。有了快速电影记录，我们就可以追踪图像漂移轨迹而对图像做运动矫正和辐射损伤矫正，大大提高数据质量。　　尽管如此，电镜图像处理一直都是一项极具挑战性的任务，主要的问题是冷冻电镜的图像噪音极高、信号极低，而我们的目标是从中提取近原子分辨率的结构信息，这就像在一个机器轰鸣的工厂里监测一只蚂蚁爬行的声音。冷冻电镜科学家就是要完成这项艰巨的任务，并且真的做到了。有了硬件和软件方面的双重提高，冷冻电镜的分辨率目前已得到了极大的提高，可以和晶体学相媲美 并且在其它方面已经大大超越了晶体学。　　主要体现在下面几个方面：　　第一，不需要结晶，研究对象范围大大扩展，研究速度大大提高。对于小分子，比方说无机盐矿物质等自发就能长出晶体，小而且稳定的蛋白质目前来说结晶并不困难，但是这类意义重大的蛋白几乎都已经解析完了，在科学上没有任何重大意义 当今时代，小蛋白已经完全不能满足科学家们强烈的探索欲望，结构生物学研究的对象越来越大，体系越来越复杂，结晶几乎成为不可能的事情，即使能结晶，也不一定衍射，有衍射也不一定能得到原子分辨率结构。　　很多年前，许多蛋白质晶体科学家为了完成一项艰巨的任务，一个课题少则5到10年，多则20年，核糖体从上世纪80年代初首次长出晶体到 2000年左右最终拿到原子分辨率结构整整经历了20年 线粒体呼吸链复合物I从上世纪90年代初研究，第一次报道完整晶体结构大约是20年以后。　　而冷冻电镜方法跳过超大分子复合物结晶难的这层技术屏障，以直接解析复合物的溶液状态的结构为目标。　　现在利用这项技术，在MRC-LMB一周时间就可以解析一个新的核糖体结构 英国皇家学会主席、MRC-LMB结构中心主任 Venki Ramakrishnan 教授，因为核糖体的晶体结构研究而获得2009年诺贝尔化学奖。他的实验室在2014年发表了最后一篇晶体结构文章，此后的文章全部以冷冻电镜为主。哥伦比亚大学有一个非常执着的博士后，研究兰尼碱受体(Ryanodine Receptor)晶体结构长达十年之久，最后放弃了晶体，转向了冷冻电镜技术，同时与清华大学教授颜宁和LMB的Scheres研究组合作，几个月就解决了这个难题，并且达到近原子分辨率。　　第二，样品需求量小，样品制备快，可重复性高。重要生物样品都是非常珍贵的，总体来说是以微克或者最多以毫克来计量，即使得到这点样品，也要花费生物学家几周、几个月甚至更长的时间(大多数时候都需要摸索各种条件使样品处于相对稳定的状态，以便做进一步结构研究)。　　蛋白质晶体一般要求高浓度大体积，没有量变就没有质变。而同样量的蛋白可以稀释以后制备若干冷冻电镜样品，每个样品有成百上千的区域，每个区域有几百个小孔，每一个小孔甚至可以收集多张照片。解析一般蛋白的原子结构需要几万个颗粒，而对于高对称性的样品几千个颗粒就足够。　　第三，可以研究天然的、动态的结构。X射线晶体学研究生物大分子结构的一个主要弱点是无法拿到天然的动态的结构，这是因为研究人员无论如何也无法绕开结晶这个过程。冷冻电镜就是要做这件事情：直接解析天然的、溶液态的、动态的(dynamic)，甚至原位(in situ)的结构，从而理解生命分子如何在空间和时间两个尺度上以活的动态的方式发挥功能。　　晶体学只能尝试不同的条件获得生物大分子某个或者某些固定的状态，而且容易出现晶体堆积引起的不真实相互作用方式。形象地说，冷冻电镜可以制作完整的高清电影，晶体学只能从电影里截屏。　　第四，技术革命还将开启巨大的潜在医疗价值。冷冻电镜技术方法在时间和精度方面的大幅度提高有时会导致不可预测的重大科学和应用价值。比如，活体病毒结构分析如果可以在分钟级别完成，这将有可能转化为潜在的医疗检测手段：从病人体内抽取血样或感染组织细胞，几分钟以后，非常清晰明了地展现病人在细胞内部结构层面的异常状况，甚至给出局部的原子结构图，从而给出精准的治疗方案。这个想法现在可能听起来有点像笑话，或许再过若干年人们就不这样认为了。　　当然冷冻电镜的革命性不仅仅体现在上述四方面，在此就不一一列举。有关冷冻电镜更加详细的介绍，可参见笔者等2010年的中文综述(《生物物理学报》，2010年7月，第26卷，第7期: 533-559)。文章中对未来几年的发展趋势所做的展望，如直接电子探测器的普及、非对称性蛋白复合物近原子分辨率结构解析、冷冻电镜相关计算性能的大规模提升等等，目前绝大多数都在过去的两三年内得以实现并飞速发展。　　华人学者在冷冻电镜领域的贡献　　在冷冻电镜的这场技术革命中，华人科学家功不可没，在某些方面甚至独领风骚，做出了诸多重大成果。　　加州大学旧金山分校(UCSF)的华人科学家程亦凡教授在2013年底，首次利用冷冻电镜技术解析近原子分辨率膜蛋白结构，这项成果在业界引起了巨大轰动。原因在于当所有电镜结构生物学家还在讨论膜蛋白到底能不能利用冷冻电镜技术看到二级结构，也是通常我们认为的中等分辨率水平的时候，程亦凡教授研究组直接解析了TRPV1 这个膜蛋白3.3埃近原子分辨率的结构(Nature，504：107–112)。　　笔者曾在该文章发表的半年前在一次国际会议上和冷冻电镜领域顶级学者深入讨论过如何获得清晰的膜蛋白α -螺旋结构，对方给出了悲观的结论：“恐怕不太可能，至少最近两年不可能”。　　事实上，此前蛋白质晶体学家已经有所耳闻“冷冻电镜可能在未来几年会超越并且取代晶体学”，但是谁也没想到会是以这样快速和震撼的方式登场，这在某种程度上引发了不少蛋白质晶体学家的“职业恐慌感”。这项成果的两个共同第一作者廖茂福、曹尔虎也都是非常杰出的青年华人科学家。　　加州大学洛杉矶分校的周正洪教授早在2008年到2010年左右，在这场电镜技术革命来临之前，在各项技术条件尚未成熟的情况下解析了一系列近原子分辨率病毒结构。当时采用的是传统胶片来成像，任务非常艰巨，连他还在上学的儿子也都帮忙一起洗胶片。张兴博士在这一系列稍早的重要成果中充当了先锋。早在2008年，第一个近原子分辨率的冷冻结构，也即3.8埃轮状病毒就是张兴博士作为第一作者完成的(PNAS, 105(6): 1867-1872)。从1968年Aaron Klug创立电镜三维重构理论，到2008年人们首次看到通过冷冻电镜获得近原子分辨率结构，整整用了40年。　　在国内，清华大学的隋森芳院士是我国冷冻电镜领域的先驱，不仅德高望重，还培养了一大批优秀的青年科学家，包括清华大学的王宏伟教授以及 MRC-LMB的白晓晨和畅磊福博士等等。王宏伟早年在隋老师实验室做研究生的时候，在我国研究设备和条件全面落后于国外的情况下依旧做出了许多非常出色的工作。　　MRC-LMB的多位青年华人研究人员对冷冻电镜发展都做出了重要贡献。白晓晨博士在MRC-LMB首次使用直接电子探测设备Falcon I 和Sjors Scheres博士的新程序Relion，获得了第一个不对称样品核糖体的近原子分辨率冷冻电镜结构，打响了冷冻电镜革命的第一枪，随后解析了一系列核糖体和蛋白复合物结构。畅磊福博士在LMB首次获得非核糖体不对称蛋白样品APC复合物的近原子分辨率结构，阐明了蛋白质泛素化的重要机理。笔者主要在LMB的Andrew Carter博士实验室从事动力蛋白结构和功能研究，并成功解析动力蛋白激活因子Dynactin结构，提出了目前为止动力蛋白最详尽可靠的运动和激活机制(Science, 347(6229):1441-1446. 封面文章)，同时独立发展冷冻电镜技术方法。　　1953年4月25日，MRC沃森和克里克在《自然》杂志发表DNA双螺旋结构，61年后的同一天，我国科学家、中科院生物物理研究所的朱平和李国红研究员在《科学》杂志以长文形式发表了30nm染色质冷冻电镜结构(DNA双螺旋之双螺旋)(Science , 344(6182): 376-380)。这项工作是冷冻电镜在核心生命科学问题中的成功应用，冷冻电镜部分的工作主要是笔者在生物物理所的同学宋峰博士完成的。　　生物物理所的程凌鹏博士(当前单位为清华大学)获得国内本土第一个原子分辨率的冷冻电镜结构，构建了蚕多角体病毒(CPV)的完整三维原子模型(PNAS，108(4)：1373-1378)。笔者也参与了部分工作, 被其高质量、干净的电子密度图震撼。近期程凌鹏与刘红荣博士合作，在国际上首次发表了CPV完整基因组和RNA聚合酶“原位三维结构” (Science, 2015, 349(6254):1347-50), 引起了很大轰动，这项成果是我国本土冷冻电镜技术和生物学应用的双重突破，被多名同行科学家称赞为”里程牌式发现“。　　我国著名科学家施一公最近发表了一系列重大蛋白复合物的冷冻电镜结构，包括γ -secretase、spliceosome等，被誉为过去几十年我国科学家对基础生物学领域的最大贡献。　　另外，在欧美和中国本土还有一大批华人学者在冷冻电镜或密切相关领域(cryoET等)做出诸多突破性成果，例如匹兹堡大学的张佩君教授(艾滋病毒结构研究)，德克萨斯大学的刘俊教授(细菌运动，噬菌体结构等研究)等，由于时间和篇幅问题，无法一一介绍。　　冷冻电镜的未来展望　　冷冻电镜技术目前仍然在快速发展中，未来冷冻电镜能做什么取决于这项技术能发展到什么程度。现代科学技术革命的一个最大特点是发展速度极其迅速，谁也不知道明天会发生什么，当然也不能十分准确的预知一个领域的发展方向。即便如此，笔者还是对这个领域有一些预测或期待(仅技术角度，不涉及具体生物学研究)。　　1)超大规模、超快速度数据采集和处理。和晶体学相比，冷冻电镜的效率在某些方面已经异常惊人。比如笔者近期与牛津大学王祥喜博士合作，在几个小时以内就可以拿到完整甲肝病毒原子结构，而此前王祥喜博士花费近一年时间结晶才最终拿到原子结构。但是科学技术发展是永无止境的̷̷　　但目前来说，结构生物学的巨大转型必须建立在速度和效率的双重前提下。这需要硬件、软件以及其它交叉学科等多方面的共同发展。　　除了生物学研究应用，笔者一直致力于冷冻电镜技术的发展，最近在提高电镜数据处理结果可靠性和分辨率前提下，上千倍地提高了其中几个环节，过去几百到上千CPU小时的事情，现在几分钟到几十分钟就完成了。但是这只是部分环节，在其它方面依旧非常耗时，整个技术的各个环节如何全面高效高速地完成还需要更多的优秀人才参与。对硬件的发展方面笔者并不是很熟悉，预计在未来会出现超高速度的电子显微镜，大幅度提高电镜原始数据的数量和质量。　　2)大尺度、高分辨率、高动态的生物大分子结构解析。理论上，冷冻电镜可像高清数码摄像机拍电影一样对生物大分子成像和重现其动态结构，研究深层机理。就目前而言，这一方面在技术上远未成熟。大尺度、高分辨率、高动态这几点拆解开来，每一个都不算太难，但是同时满足这几项需求几乎成为不可能的事情。但是这是未来结构生物学的方向，我们不仅仅要看简单的几张静态照片，我们还想看高清电影。　　关于这一点，笔者需要强调一下结构生物学和动力学模拟的区别。结构生物学的动态结构目的是以实验手段完整复原自然状态的动态结构，理解其中机理，是从实验数据出发“重现大自然原貌”的过程，是完完全全可靠的实验结果。而动力学模拟是从已有的理论或经验性的物理学规律出发预测一个生物大分子的动态特性，存在巨大的不确定性，其结果可靠性较差。期待在未来的某个时刻，两者会像上个世纪的理论物理和实验物理一样完美地结合，相互促进。　　大尺度复杂生物系统的高分辨率、动态机理研究涉及诸多学科，不是冷冻电镜一项技术就可以完成的，需要多学科科学家共同参与完成。　　3)高分辨单分子及原位结构研究。目前的结构生物学，无论晶体学、冷冻电镜还是核磁共振主要还是在研究“群体”结构。冷冻电镜相对晶体学在这一方面已经有了大幅度提高，可以通过分类的方法研究群体结构中的每一类结构。但实际上每个分子在时间和空间上除了共性，也必然有特性，如果一种方法强大到可以测得单个分子的高分辨率结构，这必然导致巨大革命，使得人们发现许许多多在群体结构研究层次上无法发现也无法理解的大量规律。　　注意这里强调的是单分子“高分辨率”结构，而不仅仅是单分子结构。单分子结构我们目前可以使用比如冷冻断层成像(cryoET)的手段获得，但是分辨率非常低，在如此低分辨率情况下，别说个体差异，很多群体结构差异都值得严重质疑。或许冷冻电镜技术若干年以后会实现这个目标，或许永远都不可能，或许这个目标被另外一个全新的技术彻底取代，冷冻电镜从此退出历史舞台。　　冷冻电镜：一个高度交叉的学科　　冷冻电镜领域一直是多学科高度交叉和相互促进才诞生的一个奇迹。数学、物理、化学、材料、计算机、软件、机械及自动化、精密仪器仪表等等缺一不可，当然最终的核心是生命科学(作者注：此处仅从结构生物学角度分析，并非泛指一般意义上生命科学是一切学科的核心)。生命科学提出问题，其它所有学科相互结合产生更好的解决方案。通过这些解决方案，发现更多神秘的生命现象，从而提出新的问题，诞生新的技术。　　举个例子，冷冻电镜图像信噪比极低，没有科学家的雄心勃勃，没有大批信号分析、图像处理甚至数学家的参与是不可能完成这样艰巨的任务。同时冷冻电镜领域的一些发现或需求，也为其它领域的科学家提供灵感来源和新的研究思路。MRC-LMB作为现代分子生物学的发源地和近两年来飞速发展的冷冻电镜技术核心研究机构，其一大特点就是多学科“零距离交叉”。从半个世纪前的DNA双螺旋模型、肌红蛋白晶体结构等到近两年冷冻电镜技术革命，一直将这一理念体现得淋漓尽致。技术的发展和重大科学问题的解决几乎都是同时进行的，当然科学问题或应用价值始终是核心和最终驱动力，脱离科学和应用需求的技术发展是没有意义的。　　另外一个比较具体的例子是笔者此前思考过的一个问题。在电镜领域出现直接电子探测设备之后，MRC-LMB的两台高端电镜，每天产生5到10T 的数据量，近期正在调试第三台，也许不久的将来，超大数据、超快速度电镜就会投入生产，这些将会导致全世界各个研究机构普遍出现一个严重的技术问题，就是如何高效、无损、快速地进行数据压缩存储和数据处理，当然这里的无损是相对特定生物样品和特定目标分辨率而言。这或许会引起一些信号处理和图像压缩方面的研究人员的兴趣。　　随着冷冻电镜对生物大分子复合物高分辨率结构研究趋于成熟，更加复杂的动态机理研究是必然趋势，这是冷冻电镜技术发展的一个潜在可能性。但是复杂生物体系的深入研究需要解决一系列数学理论、物理、计算难题，有的可能甚至超出了这些学科目前的研究范畴。近些年比较现实可行的是通过冷冻电镜手段，对特定蛋白复合物非随机情况下的高分辨连续动态构象进行分析。笔者认为，专业数学家的参与会大大加速冷冻电镜技术在这些方面的发展。　　生命体高度复杂，充满很多未知的和未被阐述清楚的规律，这里面有成千上万的生物大分子复合物，每一个复合物又与其它若干分子或复合物相互作用、相互影响，深入再深入地理解生命本质一直都会是冷冻电镜的重要方向。冷冻电镜是强大的基础研究手段，它通过解析高度复杂的生物大分子结构，帮助人们更好地理解生命规律，从而影响生命科学相关的一切下游学科和技术，当然也包括更好的发现和设计药物、医疗诊断等具体应用。我们期待在不久的将来，冷冻电镜技术会对科学研究和社会发展等方方面面都产生巨大影响。

仪器信息网讯 2014年7月28日-30日，&ldquo 2014冷冻电镜三维分子成像国际研讨会&rdquo 在中国科学院上海生科院生化与细胞所/国家蛋白质科学中心&bull 上海(筹)召开。 　　冷冻电镜三维分子成像国际研讨会源起于2008年由郭可信先生的学生组织发起的&ldquo 郭可信电子显微学和晶体学暑期学校&rdquo 。当时我国在电子显微学领域的研究实力非常强，但主要体现在材料物理方面，在生物领域的研究应用还基本处于空白状态。会议的组织者希望能通过举办这样的会议将国内生物电镜的应用带动起来。第一届主要以培训的形式为主，到2010年第二届会议时，组织者提出了在培训同时举行冷冻电镜三维分子成像国际研讨会，以促进冷冻电镜前沿研究的交流。 　　本次大会主席由海外华人学者加州大学旧金山分校副教授程亦凡、美国纽约州立大学石溪分校教授李慧林，联合中科院上海生化细胞所/国家蛋白质科学中心&bull 上海(筹)的丛尧、何勇宁研究员四位专家构成主席团。 　　会议参会人员近300人，远远超过了原计划的150人的预期。主办方邀请了来自世界各地的30余位杰出的电子显微学家作大会报告及培训指导，如美国贝勒医学院教授、美国科学院院士Wah Chiu (赵华)，美国加州大学旧金山分校教授、美国科学院院士David Agard，美国加州理工学院教授、霍华德休斯研究员Grant Jensen，美国加州大学洛杉矶分校教授、纳米机器电子成像中心主任Z. Hong Zhou (周正洪)、中国科学院院士隋森芳等。 　　冷冻电镜技术发展迎来新纪元 　　2014年年初，冷冻电镜曾被《Nature Methods》杂志评选为&ldquo 2014年最受关注的技术&rdquo 。从此次会议的盛况来看，这一称号冷冻电镜可以说&ldquo 当之无愧&rdquo ，会议甚至吸引了此前一直利用X射线晶体学进行结构生物学研究的清华大学教授施一公前来参加。 　　冷冻电镜突然之间如此备受关注，和去年年底华人学者程亦凡发表的一项成果有着莫大的关系。2013年12月5日，程亦凡与同事David Julius两个实验室合作，以近原子分辨率(3.4 埃)，确定了在疼痛和热知觉中起中心作用的一种蛋白质TRPV1的结构。这项成果可以说是冷冻电镜应用研究的一个分水岭，因为在此之前结构生物学研究主要依赖X射线晶体学，也可用核磁共振(NMR)来研究部分小分子的结构。人们认为冷冻电镜的分辨率不够高，如果研究分子量较大的病毒、核糖体等还可以，而研究小分子量的蛋白质则无法实现。 　　另外，由于TRPV1属于膜蛋白，膜蛋白是重要的药物作用靶点及细胞信号传导通道，所以自1997年它被发现以来，许多研究者都希望能够解析它的结构。但这类蛋白嵌在细胞膜中，很难得到蛋白结晶，因而很难利用X射线晶体学方法对其进行解析。而如今，冷冻电镜以接近X射线晶体学的分辨率成功解析了TRPV1膜蛋白质的结构，可以说是结构生物学研究的一个里程碑事件。程亦凡认为将来会有不少从事X射线晶体学研究的结构生物学家将冷冻电镜作为自己的重要研究工具。 　　李慧林表示：&ldquo 亦凡的工作可以说为冷冻电镜的应用打开了一个新的局面。膜蛋白是重要的药物靶点，因此会有越来越多的制药公司关注这一技术。而现在的制药公司会做很多X射线晶体学的研究工作，以后他们可以有新的选择了。&rdquo 　　我国冷冻电镜技术研究渐入佳境 　　冷冻电镜技术最先由欧美国家在上世纪70、80年代开发并应用，我国科学家在90年代开始冷冻电镜技术的研究，起步比较晚，但近年来伴随海外华人学者的大力帮助，以及近十年来一批优秀的科学家学成回国，我国在这一领域的研究开始蓬勃发展。 　　今年是该会议第四次举办，程亦凡参加了每一届会议，在他看来这四届会议可以说很好的见证了国内冷冻电镜的发展历程。他说：&ldquo 2008年、2010年两届会议我们所有的报告人都来自海外，而到了2012年就有不少国内的学者带来精彩的报告，今年无论是报告人还是参会人数又达到了一个新的高度。&rdquo 　　李慧林则表示：&ldquo 2008年国内当时只有一两个课题组从事冷冻电镜应用研究，而到今年粗略估计已有近20个课题组。清华大学、生物物理所、国家蛋白质科学中心、中科大、中山大学、厦门大学、兰州大学等都有老师在做这方面的研究。&rdquo 　　此外，为了推动我国生物学的快速发展，政府对于这一领域的研究也投入了大量的财力。Wah Chiu在参观了本次大会举办地国家蛋白质科学中心&bull 上海(筹)后感叹地说：&ldquo 我在美国从来没有看到像这样完备的蛋白质研究平台，这为中国和世界上的科学家的提供了非常好研究条件。&rdquo 　　政府科研投入的增加也在一定程度上推动了我国冷冻电镜的技术研究。程亦凡说：&ldquo 2008年时国内还只有清华大学订购了一台300kV的Titan Krios冷冻电镜，到2010年生物物理所和清华大学各有一台，2012年国家蛋白质科学中心&bull 上海开始筹建，订购了3台冷冻电镜，包括一台Titan Krios，今年我们看到这些仪器都已到位，另外浙江大学也开始筹建冷冻电镜实验室，计划采购两台冷冻电镜。&rdquo 　　经过各方面的努力，当前我国的冷冻电镜研究已经取得了一定的成绩，与国际先进水平的差距逐渐缩小。就在今年，生物物理所李国红与朱平研究员合作在《Science》杂志上发表了冷冻电镜30纳米染色质高级结构解析 清华大学施一公院士与剑桥生物医学院Sjors H. W. Scheres教授合作在《Nature》杂志上发表了利用冷冻电镜技术解析人类&gamma -分泌酶(&gamma -secretase)的三维结构。 　　另外，据介绍生物物理所研究员孙飞已经在开始做冷冻电镜技术开发方面的工作。程亦凡说：&ldquo 我觉得他们的工作非常有意义，我们不能只是用别人的技术来做我们的研究，而是不仅要会用这一技术，还要尽力去发展完善这一技术，这样才能有更好的成就。&rdquo 　　冷冻电镜发展前景广阔 人才需求缺口大 　　随着冷冻电镜技术的发展，对于人才的需求也越来越大。我国在冷冻电镜人才培养方面，经过几年时间的积累，也有一些优秀的青年人才成长起来，这其中郭可信电子显微学和晶体学暑期学校发挥了重要作用。丛尧说：&ldquo 我们希望通过暑期学校能培训一批高技术冷冻电镜人才，为冷冻电镜技术在我国的后续发展打下坚实基础。&rdquo 　　程亦凡介绍说：&ldquo 我们现在培养的学生在海外很受欢迎。像隋森芳院士培养的学生很轻松就能拿到几个国际顶级科研机构的博士后offer。&rdquo 　　但是现在对于冷冻电镜人才的需求非常大，我们培养的学生数量还远远不够。程亦凡说：&ldquo 虽然目前冷冻电镜的研究很活跃，但是这一技术还非常不完善，所以有许多的工作要做，需要很多人力。同时，对于一个电镜实验室，往往需要从实验员、到中级管理人员、高级管理人员等各个层次的人才。另外，随着冷冻电镜技术的发展，如果从事X射线晶体学研究的课题组要进入这一领域，最快捷的方法就是招聘从电镜实验室毕业的学生。&rdquo 　　&ldquo 不过在中国，好在我们有一个优势，就是我们的材料电镜非常强，培养的人才已趋于饱和。材料电镜领域的学生他们虽然不懂生物学，但是有着非常强的电镜技术背景，如果他们当中有人愿意转向生物学应用方向，一定会有非常好的发展前景。可以说今后5-10年电镜实验室培养的学生都不愁找工作。我们希望能够吸纳更多的优秀人才从事冷冻电镜的研究，推动这一技术的快速发展。&rdquo 程亦凡说道。(撰稿：秦丽娟) 2014冷冻电镜三维分子成像国际研讨会与会人员合影 　　附录： 　　第七届郭可信电子显微学和晶体学暑期学校举办 　　http://www.instrument.com.cn/news/20140728/137553.shtml 　　国家蛋白质科学中心&bull 上海(筹) 　　http://www.sibcb-ncpss.org/ （原标题：2014冷冻电镜三维分子成像国际研讨会召开）

p 　　在深圳市的大力支持下，南方科技大学冷冻电镜实验室即将在南科大校园内落成，并投入使用。 /p center img alt=" " src=" http://www.sustc.edu.cn/upload/images/news/%E7%A7%91%E7%A0%94%E6%96%B0%E9%97%BB/1.gif" height=" 282" width=" 500" / /center p /p p 　　2017年10月4日三位科学家因为开发并发展了冷冻电镜技术而获得诺贝尔化学奖。南科大在学校发展的战略布局上充分展现了前瞻性，早在2017年6月 10日，冷冻电镜项目就已正式立项，并邀请我国目前最优秀的青年结构生物学家之一杨茂君教授主持。“栽下一棵梧桐树，凤凰就来了”，南科大冷冻电镜实验室主任王培毅教授这样形容实验室对海内外人才强大的吸附力。自项目启动以来，实验室已吸引了来自海内外诸多青年才俊和重量级专家学者的加入。其中包括行业内唯一的中科院院士、我国最早使用冷冻电镜开展生物大分子研究工作的隋森芳院士。今年7月，2017年诺贝尔化学奖的三位得主之一、美国哥伦比亚大学 Joachim Frank教授将应我校陈十一校长邀请到访南科大，探讨开展进一步合作。 /p center img alt=" " src=" http://www.sustc.edu.cn/upload/images/news/%E7%A7%91%E7%A0%94%E6%96%B0%E9%97%BB/%E5%86%B7%E5%86%BB%E7%94%B5%E9%95%9C2%201.gif" height=" 282" width=" 500" / /center p /p p 　　南方科技大学冷冻电镜实验室拟于今年年底正式挂牌成立，届时将同时举办国际研讨会，几乎所有在冷冻电镜方面的国际著名科学家都将出席，包括另一位2017年诺贝尔化学奖得主、剑桥大学MRC-LMB的Richard Henderson教授。 /p p 　　冷冻电镜技术改变了许多生物领域的研究方式，使得诸多研究能够快速取得重大突破。冷冻电镜技术已成为结构生物学研究的利器，这项技术克服了生物分子结构解析中的许多难点，被诺贝尔奖官方称为“使得生物化学进入一个新时代”。图像是我们理解一切事物的关键所在，将那些人眼不可见的物体成功地可视化，通常是科研产生突破的基础。 长久以来，人们认为电子显微镜只能用于非活性生物样品的成像，因为电子显微镜的高强度电子束会严重损伤生物样品，是冷冻电子显微技术改变了这一切。现在，研究人员可以将具有活性的生物大分子快速冷冻到液氮温度(-196度)，并在此温度下保持和转移，使样品最大限度保持原来形态。并将那些以前无法看见的生物变化的动态过程实现可视化——这对我们从原子尺度了解生命过程，以及研发药物带来决定性的影响。 /p center img alt=" " src=" http://www.sustc.edu.cn/upload/images/news/%E7%A7%91%E7%A0%94%E6%96%B0%E9%97%BB/%E5%86%B7%E5%86%BB%E7%94%B5%E9%95%9C3%201.gif" height=" 282" width=" 500" / /center p /p p 　　南方科技大学冷冻电镜实验室拟安装300千伏冷冻电镜6台，200千伏冷冻电镜2台，120千伏电镜2台，共计10台冷冻透射电子显微镜及其它71台/套相关辅助仪器和样品制备设备，全部建成后，将是我国配套最齐全、最先进的冷冻电镜实验室。目前，两台300千伏冷冻电镜已完成安装，进入电镜性能综合调试阶段，预计将于8月开始试运行。一台120千伏电镜将于7月上旬投入使用。据悉，有关冷冻电镜的配置，我校前期作了大量调研工作，包括与实验室科学顾问委员会成员Richard Henderson教授进行了深入探讨，以保证每台冷冻电镜除了拥有一般共性之外，在配置上同时各具不同特性，以适应与支持南科大冷冻电镜实验室在接下来即将开展的一系列世界前沿性基础及应用研究。此外，实验室将积极开展多学科交叉研究，力争在冷冻电镜的软、硬件技术，设备和应用方面取得新的突破，克服冷冻电镜目前操作复杂、控制程序繁琐及应用成本较高的缺陷，实现冷冻电镜的常规应用。并与学校已经建成的X射线晶体学平台、生物质谱蛋白质组学分析平台形成互补，开展国际上最前沿的蛋白质科学研究，为结构生物学、细胞生物学、神经科学，化学、材料科学等领域搭建交叉学科平台。 /p center img alt=" " src=" http://www.sustc.edu.cn/upload/images/news/%E7%A7%91%E7%A0%94%E6%96%B0%E9%97%BB/%E5%86%B7%E5%86%BB%E7%94%B5%E9%95%9C4%201.gif" height=" 282" width=" 500" / /center p /p p 　　地处粤港澳大湾区核心的深圳是一座新兴科技产业云集的城市，也被人们誉为中国最具有硅谷气质的城市。今年5月26日在深圳举行的“未来论坛X深圳峰会” 上，我校校长陈十一曾指出：和硅谷相比，深圳欠缺的还是基础研究能力，也包括应用基础研究，产业和研究的对接。南方科技大学建设的世界一流冷冻电镜实验室，旨在通过利用这一国际最先进的科学技术之一，大力发展基础科学研究，聚焦重大疾病诊断、新药开发、精准医疗、功能材料研发和基础学科建设等领域，促进深圳新材料、医疗卫生、健康产业和高等教育的发展。同时积极服务于国家战略需求，造福14亿中国人。 /p center img alt=" " src=" http://www.sustc.edu.cn/upload/images/news/%E7%A7%91%E7%A0%94%E6%96%B0%E9%97%BB/%E5%86%B7%E5%86%BB%E7%94%B5%E9%95%9C5%201.gif" height=" 282" width=" 500" / /center p /p p 　　在新一轮科技革命和产业变革中，中国将创新作为引领发展的第一动力，把科技创新摆在国家发展全局的核心地位，大力实施创新驱动发展战略。在国家重大需求的牵引和顶层设计的指导下，利用冷冻电镜的技术优势，在核心技术和关键领域实现重大突破，对产业升级、经济转型发展产生巨大推力，正是南方科技大学冷冻电镜实验室建立的初衷和目标。 /p p style=" text-align: right " 　　文字：任亦 /p p style=" text-align: right " 　　视频制作：李艺松 /p p style=" text-align: right " 　　摄像：蔡秉伦 黄立斌 /p

p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/56726cd4-dd5e-45c4-a263-71b5603f050c.jpg" title=" 1.jpg" alt=" 1.jpg" style=" width: 300px height: 179px " width=" 300" vspace=" 0" height=" 179" border=" 0" / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 科研人员在读取数据　　 /span /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/36e4eddb-047d-49db-b3d1-d74e9393cc11.jpg" title=" 2.jpg" alt=" 2.jpg" style=" width: 300px height: 488px " width=" 300" vspace=" 0" height=" 488" border=" 0" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(0, 176, 240) " /span span style=" color: rgb(0, 176, 240) " 科研人员将样品放进冷冻电镜设备中 /span /p p 　　一个“显微镜”有多贵?答案是千万或者上亿元。 /p p 　　在南方科技大学冷冻电镜中心一栋普通科研楼里，就藏着这些身价惊人的“大家伙”。这些“宝贝”被精心呵护，娇贵得甚至容不下一点噪音。与此同时，科学家通过它们，不停地读取着生命科学、新材料、新能源研究领域中不可或缺的重要密码。 /p p 　　2018年11月19日，南科大冷冻电镜中心正式揭牌。全部建成后，这将是我国配套最齐全、最先进的冷冻电镜实验室，同时规模也将跻身世界前三。近日，深圳商报记者走进这里，探访这些表面低调却内有乾坤的“大显微镜”。 /p p 　 strong 　6台机器世界先进，还有“独家定制” /strong /p p 　　南科大冷冻电镜中心是深圳市政府出资、南科大牵头建设的重大基础科学设施平台，旨在支撑深圳市、粤港澳大湾区及中国南方在生物医药、精准医疗、新能源、新材料方面的科学研究及产业升级。 /p p 　　南科大冷冻电镜实验室拟安装300千伏冷冻电镜6台及其它71台/套相关辅助仪器和样品制备设备。目前，项目一期的2台300千伏冷冻电子显微镜已经完成安装调试，投入使用。据南科大冷冻电镜实验室主任王培毅教授介绍，这6台设备都是世界上最先进的，其中还有一台是南科大冷冻电镜中心根据需求“独家定制”的，可以说是“世界唯一”。 /p p 　　 strong 2017年诺贝尔化学奖得主理查德· 亨德森曾预言，这里将会成为全球最大的三个冷冻电镜中心之一，未来的研究能力将会达到全球的前5%。 /strong /p p 　　在全球范围，冷冻电镜近几年热度飙升，成为科学界“兵家必争之地”。2017年诺贝尔化学奖颁给了在这个领域做出贡献的三位科学家，更是说明冷冻电镜炙手可热。那么，究竟什么是冷冻电镜?王培毅教授告诉记者，冷冻电镜是电子显微镜的一种，它的工作原理和光学显微镜类似，也是通过光与样品的相互作用而成像。只是冷冻电镜所用的光源不是人们平时见到的可见光，而是电子。由于波长的限制，可见光的分辨率一般是1500倍以下，而电子的波长非常短，大约是普通光波长的十万分之一左右，因此冷冻电镜的分辨率可以达到更高的程度，能够直接观测到蛋白质分子一类的生物大分子的精细结构。 /p p 　　以生物医药领域的应用为例，冷冻电镜技术就是“把组成动、植物的蛋白用生物学的方法取出后，以快速冷冻的方式冷冻到液氮温度(-196度)，这样可以保持蛋白的活性。在这种状态下用冷冻电镜观察活蛋白，可以达到零点几纳米的分辨率，由此准确判断药物靶标的位置，并根据药物靶标来开发新药。”因为可以“看”得更精细，所以冷冻电镜技术在很多领域都被广泛应用，被视做是材料科学、生命科学等学科基础研究的利器。 /p p 　　“目前，全国购置的冷冻电镜有27台，主要集中在北京、上海等地。我们购买的冷冻电镜，根据研究的领域不同有所侧重，有些偏重于材料科学，有些偏重于生命科学。我们定制的那一台‘世界唯一’的冷冻电镜，就是希望它能够在重大疾病的诊断方面发挥作用。”王培毅教授告诉记者，2019年将是南科大冷冻电镜中心非常重要的一年，除了定制的那一台冷冻电镜外，其他购置的电镜将陆续到位，安装、调试后，电镜中心的工作将在2020年迈上新台阶。 /p p 　　 strong “大家伙”很娇贵也很辛苦 /strong /p p 　　隔着玻璃，记者顺着王培毅教授的指引，看到了目前已经使用的两台冷冻电子显微镜静静矗立。但是，近300平方米的机房内，却没有工作人员忙碌的身影。 /p p 　　这是为什么?“首先，我们的机房内一般是没有人的，工作人员的工作都通过计算机远程操控完成，只在装样品的时候才进入十几分钟。另一个原因是，今天实验室内有施工，考虑到施工带来的噪音会影响电镜工作，所以今天我们不提取数据。”王培毅教授的解释让记者大吃一惊——这些“身材魁梧”的“大家伙”，原来是一点噪音都会受影响的“娇小姐”! /p p 　　因为冷冻电镜十分精密，所以对环境的要求很严苛。据王培毅教授介绍，为了减少振动带来的影响，机房的地面厚度约1米，且是独立建设的，跟周围建筑物完全分离，甚至连空调的风速都必须严格监控。机房内必须经过严格的消磁，在里面是没有手机信号的。机房内的温度、湿度都恒定，温度变化每小时不超过0.2℃。还有一个房间专门用来制作样品，房间内的湿度保持在20%，因为只有在这样相对干燥的环境里才能保证样品的质量。如此小心翼翼地“伺候”，就是为了让冷冻电镜更好地运转、工作。要知道，除了每个月两天的维护、保养时间外，冷冻电镜可是24小时连轴转的。 /p p 　　“冷冻电镜与普通材料电镜最大的不同在于，冷冻电镜的结果是统计结果，需要大数据。普通的材料电镜，拍一张照片就有结果，但冷冻电镜需要拍成千上万的照片，然后用统计学的方法把结果算出来。这也就说明了，为什么一般机构购置冷冻电镜都需要两台以上，因为它要解析一个样品，需要几十个小时甚至更长的电镜时间。”冷冻电镜的相机灵敏度有多高?王培毅教授打了一个比方——相当于在几万公里的高空可以看到桌子上的一瓶水。这些高精度的照片存储量惊人，“一台电镜一天就能采集2T以上的数据量”，而后的数据分析和解读无疑也是一项巨大的工程。 /p p 　　 strong 期待中国原创靶向药从这里走出 /strong /p p strong 　　这几台世界先进的“大家伙”，究竟能为老百姓带来什么? /strong /p p 　　王培毅表示，在生活水平日益提高的情况下，健康成为人人关心的焦点。对于深圳而言，下一阶段的城市发展，生物医药和健康产业将是巨大的“增长点”。南科大建设世界一流的冷冻电镜中心，目的就是通过利用国际最先进的科学技术，发展基础科学研究，聚焦重大疾病诊断、新药开发、精准医疗、功能材料研发和基础学科建设等领域，促进深圳新材料、医疗卫生、健康产业和高等教育的发展，同时积极服务于国家战略需求，造福百姓。 /p p 　　尽管冷冻电镜未来在许多领域都有很大的应用空间，但在王培毅心目中，冷冻电镜研究的终极目标还是为了人类的健康事业。“想要解决重大的疑难疾病的治疗问题，就必须要研发药物，然而药物的研发过程极其漫长，从研发到上市一般需要历经十年。治疗白血病的药物研发前后则是经历了近100年。而冷冻电镜可以通过低温冷冻技术，观察活的原始样本，进而用于研究致病机理，例如发现癌症的致病机理，从而推动癌症等重大疾病的诊断和治疗，极大地缩短制药的时间。”王培毅教授说，自己的最大心愿就是缩短靶向药物的研发时间，助力中国研发自己的原创药。 /p p 　　除了生命科学领域的课题外，目前南科大冷冻电镜中心的研究重点还有新能源和新型化合物。此外，实验室还将积极开展多学科交叉研究，并与学校已经建成的X射线晶体学平台、生物质谱蛋白质组学分析平台形成互补，开展国际上最前沿的蛋白质科学研究，为结构生物学、细胞生物学、神经科学，化学、材料科学等领域搭建交叉学科平台。 /p p 　　“各个学科对于冷冻电镜的需求是十分巨大的。目前我们还未全面对外开放，但排队的样品已经排到了春节以后。”这个春节，王培毅教授和他的团队将在忙碌中度过了?? /p p 　　 strong 小资料 /strong /p p strong 　　冷冻电镜 /strong /p p 　　2017年诺贝尔化学奖，授予了瑞士科学家雅克· 杜博歇、美国科学家约阿希姆· 弗兰克以及英国科学家理查德· 亨德森，以表彰他们在冷冻显微术领域的贡献。 /p p 　　理查德· 亨德森上世纪90年代改进了传统电子显微镜，取得了原子级分辨率的图像 约阿希姆· 弗兰克在上世纪七八十年代开发了一种图像合成算法，能将电子显微镜模糊的二维图像合成清晰的三维图像 雅克· 杜博歇发明了迅速将液体水冷冻成玻璃态以使生物分子保持自然形态的技术。这些发明使低温冷冻电子显微镜的各部件得到优化。 /p p 　　2013年以来，低温冷冻电子显微镜日渐成熟并获得广泛应用。如今研究者可以在生物分子的生命周期内对其进行冷冻和成像，将以往不为人知的分子生命状态呈现出来。 /p p style=" text-align: center " img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/c2a4b517-02a9-4da8-b95a-a30a0276234b.jpg" title=" 00.jpg.png" alt=" 00.jpg.png" style=" width: 300px height: 267px " width=" 300" vspace=" 0" height=" 267" border=" 0" / /p

p strong 仪器信息网讯 /strong 　第六届全国冷冻电子显微学与结构生物学专题研讨会在北京隆重召开，研讨会由中国生物物理学会冷冻电子显微学分会(以下简称：中国冷冻电镜分会)主办，北京大学承办，中国电子显微镜学会低温电镜专业委员会协办。18日下午和19日上午，生物大分子复合物的高分辨率动态结构专题报告会作为大会三大专题之一，在清华大学朱平、中科院生物物理所章新政研究员和湖南师范大学刘红荣教授联合主持下，顺利召开。会议围绕“蛋白质分子机器人、病毒”共安排了18个专题报告，吸引了来自海内外400多名代表与会。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/fc4338f0-f4f5-4c91-8c2f-2160ca857703.jpg" title=" 全景小.jpg" alt=" 全景小.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　研讨会现场 /p p 　　上海科技大学沈庆涛教授作《Structural mapping on nucleoproteins of non-segmented negative-sense RNA viruses》报告。沈庆涛使用冷冻电子显微镜，确定并分辨了NDV N形成4.8Å 分辨率的蛤形结构，其中两个单匝螺旋以背对背的方式包装，这在以前没有报道过。沈庆涛还发现，这种蛤形结构可以作为种子组装成双头长丝，里面有两个独立的RNA。通过环界面上的转换突变(残基114-120)破坏蛤形结构产生单头细丝并将RNA 5& #39 末端暴露于核酸酶，这导致在小基因组分析中废除病毒基因组复制。研究数据显示了一种自我涂层机制，通过该机制，蛤形结构形成保护NDV病毒基因组的双头细丝。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 283px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/a854569e-c1c5-4594-805b-c40da7c64e89.jpg" title=" 沈庆涛.jpg" alt=" 沈庆涛.jpg" width=" 450" vspace=" 0" height=" 283" border=" 0" / /p p style=" text-align: center " 　　沈庆涛作《Structural mapping on nucleoproteins of non-segmented negative-sense RNA viruses》报告 /p p 　　中国科学院生物物理研究所王祥喜研究员作《Mechanisms of Herpesvirus capsid assembly and maturation》报告。使用优化的重建策略，王祥喜获得了3.1Å 的HSV-2 B-衣壳和3.75Å 的C-衣壳的结构，其中包括不对称单元中的28,138个残基，属于4种衣壳蛋白的46种不同构象异构体(VP5，VP23，VP19C，VP26)组成4种类型的壳聚糖(C-Hex，E-Hex，P-Hex，Pen)和三链体。王祥喜还提出了C-衣壳蛋白(VP5，VP23，VP19C和VP26)和CVSC的多种构象异构体的原子模型。 通过HSV-2同源物的比较，获得了关于三种疱疹病毒亚家族之间的结构相似性和差异的信息，并且确定了α-疱疹病毒特异性结构特征。由UL17单体、UL25二聚体和UL36二聚体组成的杂五聚体CVSC与五螺旋束紧密结合，所述五螺旋束与周围衣壳蛋白形成广泛的亚基接触网络，这增强了衣壳稳定性。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 283px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/3ff235b0-5d4f-4ed2-bf95-9d715c9a8577.jpg" title=" 王祥喜.jpg" alt=" 王祥喜.jpg" width=" 450" vspace=" 0" height=" 283" border=" 0" / /p p style=" text-align: center " 　　王祥喜作《Mechanisms of Herpesvirus capsid assembly and maturation》报告 /p p 　　装有球差校正器的透射电镜在物理、材料科学等学科已经得到广泛的应用，成为 /p p 　　获得高分辨像不可或缺的重要技术方法。色差校正器也突破了技术瓶颈，稳定性得到显著改善并开始实际应用。冷冻透射电镜在使用校正器上，由于生物样品等原因，还没有得到广泛的应用。南方科技大学王培毅教授的《透镜校正器在冷冻透射电镜的应用》报告试图从生命科学的实际应用出发，讨论球差、色差校正器在冷冻透射电镜上应用前景和可能的发展。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 283px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/fd53b340-2b2c-4e73-9e09-d3fb48f173d3.jpg" title=" 王培毅.jpg" alt=" 王培毅.jpg" width=" 450" vspace=" 0" height=" 283" border=" 0" / /p p style=" text-align: center " 　　王培毅作《透镜校正器在冷冻透射电镜的应用》报告 /p p 　　在适应性免疫中，生物体产生中和抗体(nAbs)以消除入侵的病原体。厦门大学李少伟教授《Viral neutralization by antibody-imposed physical disruption》报告探讨了是否可以通过nAb结合时病毒的物理破坏来实现病毒中和。报告展现了nAb 8C11对抗戊型肝炎病毒(HEV)的中和机制，8C11结合侧翼HEV病毒样颗粒(VLP)的突出尖峰，并导致抗体和衣壳之间的巨大物理碰撞，在2小时内将VLP解离成同型二聚体。较早(15分钟)阶段的解离中间体的Cryo-EM重建揭示了涂抹的突起尖峰和二十面体对称性的丧失，衣壳核心保持不变。李少伟从概念上讲提出了一种策略，即在相邻空间无法容纳抗体的位置，针对在整个病原体的背景下具有特征的单个穗部分来提高碰撞诱导nAb。该基本原理可以促进独特的疫苗开发和抗微生物抗体设计。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 283px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/829f6e5a-25c0-44ff-b236-3c6a7fbb7ba6.jpg" title=" 李少伟.jpg" alt=" 李少伟.jpg" width=" 450" vspace=" 0" height=" 283" border=" 0" / /p p style=" text-align: center " 　　李少伟作《Viral neutralization by antibody-imposed physical disruption》报告 /p p 　　ORC与DNA结合标记了真核生物中复制起始的位点，尽管真核生物中蛋白质序列中ORC具有高度保守性，但其对复制子的选择性因物种而异。 人们对ORC在原点选择性上分歧的潜在分子机制仍然知之甚少。香港大学翟元梁助理教授《Cryo-EM structure of the origin recognition complex bound to the essential elements of ARS DNA》报告对这一问题开展研究。从报告中看，翟元梁获得了酿酒酵母ORC的一系列Cryo-EM结构，其与含有ARS共有序列(ACS)和B1元件的起源DNA序列结合。在结构中，ORC通过与磷酸骨架和碱基的广泛相互作用包围DNA。ACS中胸腺嘧啶残基的特异性识别是通过小沟中Orc1的保守碱性氨基酸基序和大沟中Orc4-HI基序进行的。有趣的是，Orc4-HI基序仅在酵母物种中保守，但在高等真核生物中完全不存在，表明了该基序在起源选择性中的独特作用。研究结果确定了ORC在调节DNA结构中的保守作用，以促进真核生物中的起源选择和解旋酶加载。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 450px height: 283px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/87a3b3a4-5a9b-4dbd-8431-ba984ee25dc4.jpg" title=" 翟元梁.jpg" alt=" 翟元梁.jpg" width=" 450" vspace=" 0" height=" 283" border=" 0" / /p p style=" text-align: center " 　　翟元梁作《Cryo-EM structure of the origin recognition complex bound to the essential elements of ARS DNA》报告 /p p 　　中国科学院上海生化细胞所丛尧教授、中国科学院生物物理研究所周政研究员等其他10位专家带来更多精彩学术报告。日本电子Isamu Ishikawa、Dell何睿、上海知楚仪器有限公司等6家赞助企业也带来了《CFEG application in Cryo TEM》、《冷冻电镜配套IT 系统的介绍与探讨》、《不一样的中国制造》等精彩内容。 /p p br/ /p

冷冻电镜（cryo-EM）解析了一种帮助调节血压的蛋白质，即血管紧张素转换酶（ACE）的详细结构。这些结构提供了迄今为止对ACE的最全面的看法，将有助于改善心脏病的药物设计。这项工作是由开普敦大学（UCT）的研究人员与英国同步辐射光源"DIAMOND"的电子生物成像中心（eBIC）合作完成的。研究人员在《EMBO Journal》上发表了他们的研究结果（"冷冻电镜揭示了血管紧张素I转化酶的异构化和二聚化机制"）。ACE会产生激素血管紧张素II，使血管收缩并提高血压。高血压是心脏病和中风的主要风险因素。与以前的方法相比，冷冻电镜使研究人员能够在更多的功能相关状态下观察到ACE。他们的工作为其生物功能和潜在的药物结合特性提供了关键性的见解。ACE蛋白的一个副本（即单体形式）是由两个结构相似但功能不同的结构域连接而成的。二聚体化（即两个ACE单体的相互作用）发生在一个小的表面空腔附近，改变了对ACE功能至关重要的核心氨基酸的构象。研究人员提出，这种二聚体化可能像一个 "关闭开关"，触发蛋白质核心的变化，并可能抑制它。如果能设计出一种类似药物的分子在腔内结合并引起同样的效果，它就能提供一种新的手段来使该酶失活。目前，许多ACE抑制剂在临床上可用于治疗高血压。但这些抑制剂非选择性地针对两个ACE结构域，并因此会在一些患者中引发副作用。开普敦大学教授、该研究的主要研究者Edward Sturrock博士解释说:“了解这些新发现的ACE结构和动态至关重要，这可能针对结构域选择性抑制剂的设计提供新的结合位点，进而规避副作用。”ACE蛋白在Sturrock的实验室生产，在UCT的电子显微镜单元（EMU）进行成像前的准备，并在之后转运到eBIC，在Titan Krios上进行冷冻电镜成像。图像处理在南非的CSIR高性能计算中心（CHPC）和EMU进行。“即使有高分辨率的成像，ACE的独特形状、小分子量和高度动态等特征也带来了许多挑战。"该研究的共同作者之一Jeremy Woodward博士解释道。该研究的第一作者Lizelle Lubbe博士解释说："最近开发的冷冻电镜图像处理方法对解析这些结构至关重要。"我们必须通过广泛的分类来计算分离图像，这一过程相当于' 数字纯化' ，因为生化方法无法分离ACE的单体和二聚体形式。然后，我们可以将三维细化的重点依次放在结构的不同部分，从而解析这两种ACE结构"。该研究的发现独特地揭示了ACE的高度动态特征，以及其不同结构域之间发生二聚体化和交流的机制--这可能启发治疗心脏病的新药。DIAMOND科学组组长克里斯-尼克林博士说：“我们对非洲的杰出科学家团队利用eBIC先进的冷冻电镜取得的这项研究结果感到高兴。世界迫切需要针对致命的心脏病和其他慢性健康状况的可持续解决方案。我们非常高兴的是，这项研究的结构见解可以为改进抗高血压药物设计铺平道路。”相关文献：Cryo-EM Structures of a Key Hypertension Protein to Aid Drug DesignCryo-EM揭示了血管紧张素I转化酶的异构化和二聚化的机制高血压（高血压）是心血管疾病的一个主要风险因素，而心血管疾病是全世界死亡的主要原因。血管紧张素I转化酶（sACE）的体细胞异构体在血压调节中起着关键作用，因此ACE抑制剂被广泛用于治疗高血压和心血管疾病。我们目前对sACE结构、动力学、功能和抑制作用的理解是有限的，因为截短的、最小的糖基化形式的sACE通常被用于X射线晶体学和分子动力学模拟。在这里，我们首次报告了全长的、糖基化的、可溶性的sACE（sACES1211）的冷冻电镜结构。这个高度灵活的apo酶的单体和二聚体形式都是由一个数据集重建的。单体sACES1211的N端和C端结构分别在3.7和4.1Å被解析，而负责二聚体形成的相互作用的N端结构则在3.8Å被解析。此外，观察到两个结构域都处于开放构象，这对设计sACE调节剂有意义。参考资料："Cryo-EM reveals mechanisms of angiotensin I-converting enzyme allostery and dimerization"

图中展示的就是构成酵母线粒体大核糖体亚单位(yeast mitochondrial large ribosomal subunit)的各个组成蛋白质。Amunts等人根据利用低温冷冻电镜技术获得的酵母线粒体大核糖体亚单位及完整核糖体的结构图谱，一个个地合成出了上述这些组分蛋白。这个经过不断完善的结果与根据X线晶体成像技术获得的原子模型非常吻合。 　　先进的低温冷冻电镜(cryo&ndash electron microscopy)技术让我们获得了大量高分辨率的蛋白质结构图。 　　结构生物学(structural biology)研究的主要目的就是获得用于构成活体细胞的各种各样大分子(macro-molecules)生物组件的高分辨率图像信息。该研究主要依赖的技术手段就是X线晶体照相术(x-ray crystallography)以及核磁共振光谱分析检测技术(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR spectroscopy)。不过这两种技术都有各自的局限性，比如X线晶体照相术只能够对生长得极为有序的三维结晶进行观察，而核磁共振光谱分析检测技术则要求被检测样品的纯度非常高，不能够有重叠峰出现。有很多生物大分子相互结合、组装之后形成的都是非常大的，或者非常不稳定、比较罕见的结构，都不太适合用上述这两种技术进行分析和检测。单粒子电子显微镜技术(Single-particle electron microscopy, EM)则能够观察少量非结晶样品，获得高分辨率的结构图谱。 　　使用单粒子电子显微镜技术可以获得任意排列方向的分子复合体( molecular complexes)的结构图像。该技术会从每一幅图像中选出单个的复合体(粒子)，然后借助计算机来判断它们的排列方向。最后将各个不同视角的图像组合在一起，得到该分子的三维立体图像。不过由于高能电子束会对生物大分子起到破坏作用，打断分子内的共价键(covalent bonds)，并且诱发一系列级联式的有害化学反应，所以这种放射性损伤效应给单粒子电子显微镜技术带来了极大的局限性，在实验时用来记录影像的电子束的能量受到了非常大的约束。 　　20世纪80年代，Dubochet等人报道了一种单粒子电子显微镜技术革新成果，将该技术引向了高分辨率成像之路。他们在低温条件(cryogenic conditions)下将待检样品放在一层薄薄的、透明的冰上用单粒子电子显微镜进行成像观察。这种方法就是所谓的&ldquo 低温冷冻电镜技术(cryo&ndash electron microscopy, cryo-EM)&rdquo ，他能够对含水的粒子(hydrated particles)进行直接成像。低温除了具有这些优势之外，还能够减少电子束对样品产生的放射性损害。不过电子束的照射量还是不能够太大，只有这样才能够清晰地反映出分子结构的细节，获得高质量的、低信噪比(signal-to-noise ratio, SNR)的三维结构图像。由于将每个分子的多张图像信息组合在一起能够更进一步地降低图像的信噪比，所以，对数万、乃至数百万个蛋白质复合体进行分析就会产生数十万张图像。 　　不过依靠低温冷冻电镜图像来判断生物大分子的结构给计算机处理分析工作带来了一大挑战。在借助多图像组合平均手段来改善信噪比时，必须知道每一颗粒子的方向，但是由于信噪比太低，我们对这些粒子方向的判断又明显感觉准确性不够，这就形成了一个矛盾。要解决这个问题，最成功的方法就是&ldquo 重复(iterative)&rdquo ，质量高的图像能够给出更准确的方向信息，而这些方向信息又可以帮助我们获得更高质量的图像。 　　直到最近这一段时间，绝大部分单粒子低温冷冻电镜图片的分辨率都非常低，连10埃都达不到，所以很多人都将这种技术嘲笑为 &ldquo 一团浆糊学(blob-ology)&rdquo 。蛋白质二级结构中的&alpha 螺旋(&alpha helices)结构只有在分辨率达到9~10埃，甚至更高分辨率的情况下才能够看清 而另外一种二级结构，&beta 折叠(&beta strands)结构则只有在分辨率达到4.8埃以上时才能够看清。达到3.5埃的分辨率，就可以为蛋白质或核酸等生物大分子构建原子模型(atomic models)，将各种目前已知的核酸结构或氨基酸结构填入其中了。如果要了解蛋白质复合体形成时发生的各种化学变化，就必须获得原子级别分辨率的细节信息。低分辨率的结构信息也不是一无是处，当在与高分辨率结晶图像相互配合、印证，用来判断组成复合体的各种不同组分时更加有意义。因此，即便分辨率较低，低温冷冻电镜技术也还是帮助科学家们解决了很多生物学难题，比如解析出了与其他辅因子共同结合的核糖体的结构问题，以及构象只能够维持片刻时间的核糖体瞬时结构等问题。 　　在过去的三十年，低温冷冻电镜设备取得了长足的进展，在样品制备、成像、计算机处理等实验技术方面有了一定的提升，这些使低温冷冻电镜成像技术的分辨率有了极大的提高。高度连贯的场发射电子枪(Highly coherent feld-emission electron guns)也使保留焦点以外的图像的高分辨率信息成为可能，这对于单粒子低温冷冻电镜非常有帮助。这种技术创新帮助科研人员获得了20面体病毒粒子(icosahedral virus particles)的图像，而且清楚地看到了其中的&alpha 螺旋结构。由于这种病毒是高度对称的，所以比较容易生成高质量的、最佳分辨率的低温冷冻电镜图像。 　　随着研究人员不断地开发出更稳定的载物台、更好的显微镜抽真空技术，以及自动化的数据采集系统，这一切的技术进步都让我们能够获得更多、质量更好的电镜图像，因此才能够得到高质量的、能够对其中的氨基酸侧链进行解析的二十面体病毒粒子三维结构图像，以及分辨率达到5埃的核糖体结构图像。不过在对更小一点的非对称粒子的解析工作中还是很难解析到&alpha 螺旋结构。 　　最近在低温冷冻电镜设备领域取得的最大进展就是引入了直接检测设备(direct detector device, DDD)照相机。这种DDD设备能够直接在传感器上记录图像，从而绕过了传统的、需要闪烁设备和光纤的电荷耦合装置(charge-coupled device, CCD)探测器，以及其他一些在用摄影胶片(photographic film)记录图像时必须要经过的繁杂的处理过程。因此，图像的信噪比也得到了极大的提升。在分辨率方面的提升也与之前的一些革新手段相当。在使用了DDD设备之后，还有可能在电镜图像中直接构建原子模型，甚至能够在最具挑战性的检测工作中进行&alpha 螺旋和&beta 折叠的解析工作。 　　DDD设备的引入还在另外一个方面对低温冷冻电镜的图像起到了改善作用，凭借的就是该设备极快的读出速度(readout rate)，该读出速度能够发现被冰包裹的被观测粒子在电子束中的运动情况。使用DDD设备不仅能够发现这种问题，还能够解决这种问题，因为现在的电镜就好像是一台摄像机，可以拍摄一段录影，记录整个过程，而不再像以前那样，只是一台照相机，只能够拍摄出一张张固定的图像。 　　有了高质量的图像，又有可以借助计算机对因为电子束而移位的粒子进行矫正的工具，我们就可以获得大量高质量的低温冷冻电镜图像，比如本文开头展示的那张分辨率高达3.2埃的线粒体核糖体亚单位图像，以及下图那张分辨率达到3.3埃的20S蛋白酶体图像和哺乳动物感受器通道TRPV1的图像。 TRPV1的图像尤其值得一提，因为TRPV1蛋白是一种膜蛋白，只有四级对称性(four-fold symmetry)，比核糖体要小一个数量级。所以之前大家一直都认为很难用低温冷冻电镜对该蛋白进行结构解析的研究工作。有了 DDD成像技术、更好的计算机辅助和生物化学技术之后，Liao等人终于在某些区域获得了分辨率高达3.4埃的图像，从而有机会开展原子建模工作，在整个结构生物学(structural biology)发展历史上写下了重重的一笔。 　　单粒子低温冷冻电镜结构解析图。左图展示的是随机排列的蛋白质粒子在电镜下的图像，这些图像经过计算机处理之后可以用来计算大分子复合物的三维立体结构图像。由于有了DDD技术，左边的这些图像信息就可以构建出右图中展示的原子模型。图中展示的就是20S蛋白酶体的结构图。 　　乍一看上去，这些成果都好像是特例。比如核糖体里由于含有大量的RNA，所以是一幅高度紧缩的图像，非常紧密，不太容易受到辐射的损失。而20S蛋白酶体拥有14级对称性，所以也非常适于进行低温冷冻电镜成像操作。即便是TRPV1通道蛋白也都拥有一定的内部对称性。但是最近刚刚成功获得的一幅电镜图像就完全不具备上述这些&ldquo 先天优势&rdquo ，这就是分辨率达到4.5埃的人&gamma 分泌酶复合物(&gamma -secretase)的结构图。人&gamma 分泌酶复合物是一种更小的膜蛋白复合体，完全没有对称性。该成果说明，只要待测样品能够准备得恰当，尽可能减少其在结构上的异质性，我们就完全有可能利用低温冷冻电镜技术获得各种蛋白质的三维立体结构图。 　　这些科研新进展恰好出现在低温冷冻电镜技术的低谷期。最近刚刚获得的HIV-1病毒糖蛋白三聚体结构模型就引起了极大的争议，因为多位电镜专家都坚持认为，这个结构模型不仅在结构上不准确，就连用来进行分析的原始图像也都没有真实地反映该三聚体的真实信息。这场争论也让我们意识到，我们目前的确没有太多的手段对低温冷冻电镜图像的质量进行验证，虽然有一些手段，但是都没有得到广泛的推广和应用，另外也缺乏一套规范，图像的信号非常差，所以也很难判断最终得出的结构图是否就是被测样品的结构。这是一个非常值得关注的问题，不仅仅是因为这次的HIV-1病毒糖蛋白三聚体结构模型具有重大的科研价值，比如在HIV疫苗的开发工作中会起到非常重要的指导作用等。 　　在结构解析方面还有大量的工作需要我们去完善：方便使用的显微镜相板(phase plates)有助于更好地聚焦，获得高对比度的图像，就好像相衬光学显微镜(phasecontrast light microscopy)那样，这能够让对图像进行信息采集的工作更加简便，而且质量更高。另外在探测器方面也可以进一步提高图像的质量。即便是最先进的探测器也达不到符合理论要求的表现。各种用来进行图像分析的计算机软件，比如用来矫正电子束相关移位的软件，或者对各种粒子进行分类、解读的软件也将会变得越来越强大。新型的样品承载系统会进一步减少电子束对样品的位移作用。更加可靠的、更加强大的验证工具可以让我们更有信心，保证不会纳入质量不高的原始图片素材。虽然现在还不知道低温冷冻电镜技术未来会走向何方，但是有一点是可以肯定的，那就是低温冷冻电镜图像绝对不再是一团浆糊了。 　　原文检索： 　　Martin T. J. Smith, John L. Rubinstein. Beyond blob-ology. Science 8 August 2014 DOI: 10.1126/science.1256358

p style=" text-indent: 2em text-align: left " 高端冷冻电镜系统冷冻电镜技术的发展直接带动了生命科学领域的发展。清华大学近日发布公开招标采购高端冷冻电镜系统的信息，将应用于冷冻电镜三维重构技术对细胞、亚细胞器、生物大分子及复合体等在多个尺度上进行三维结构分析，开展单颗粒分析、电子断层成像和电子晶体学等方面的研究。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: left " 根据《中华人民共和国政府采购法》等有关规定，现对清华大学高端冷冻电镜系统采购项目进行公开招标，欢迎合格的供应商前来投标。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: left " & nbsp 项目名称：清华大学高端冷冻电镜系统采购项目 /p p style=" text-indent: 2em text-align: left " 项目编号：清设招第2018198号 /p p style=" text-indent: 2em text-align: left " 预算金额：8352万元 /p p style=" text-indent: 2em text-align: left " 项目联系方式： /p p style=" text-indent: 2em text-align: left " 项目联系人：王慧 /p p style=" text-indent: 2em text-align: left " 项目联系电话：62785713 /p p style=" text-indent: 2em text-align: left " 投标截止时间：2018年12月07日 09:00 /p p style=" text-indent: 2em text-align: left " 开标时间：2018年12月07日 09:00 /p p style=" text-indent: 2em text-align: left " 详情如下： /p p style=" text-align: center " img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/bbb55b8e-064b-4a18-873f-601055973710.jpg" title=" 屏幕快照 2018-11-19 上午9.03.07.png" alt=" 屏幕快照 2018-11-19 上午9.03.07.png" / /p

p style=" TEXT-ALIGN: center" strong 第二届电镜网络会议(iCEM 2016)特邀报告 /strong /p p style=" TEXT-ALIGN: center" strong 生物冷冻电镜大数据中的高效处理方法 /strong /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 张法-CCF.jpg" style=" HEIGHT: 267px WIDTH: 200px" border=" 0" hspace=" 0" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201609/insimg/dc7fdb41-74c6-43cb-b460-d66b7a4118a0.jpg" width=" 200" height=" 267" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" strong 张法 副研究员 /strong /p p style=" TEXT-ALIGN: center" strong 中国科学院计算技术研究所 /strong /p p strong 报告摘要： /strong /p p 　　近年来，随着成像设备和处理方法的飞速发展，冷冻电镜三维重构技术已成为确定生物大分子三维结构的第一选择，生物学家利用冷冻电镜解析了大量生物大分子的高分辨率三维结构。我国已具有全世界最先进和最大规模的冷冻电镜硬件实施，这些设施每天都在产生海量的生物大数据。如何对冷冻电镜大数据进行高效处理已成为计算科学所面临的关键科学问题。本报告将从科学计算的角度讨论冷冻电镜数据处理中的科学问题，并介绍本领域最近的研究成果。 /p p strong 报告人简介： /strong /p p 　　张法，博士，中国科学院计算技术研究所副研究员，博士生导师。CCF生物信息学专业组委员，秘书长。中国生物物理学会冷冻电镜显微学分会理事。2002-2005年，作为国际交换学生在美国俄亥俄州立大学(Ohio State University)客座访问，2009-2010年，在西班牙胡安卡洛斯国王大学(Universidad Rey Juan Carlos)进行客座访问。 /p p 　　长期从事生物信息学和高性能计算方面的研究，目前主要从事生物大分子冷冻电镜三维重构方面的研究。作为项目负责人和主要参与人主持和参与了多项国家自然科学基金重点项目、国际合作重大项目、中科院知识创新重大项目、中科院战略性先导项目(B类)等多项国家项目，作为第一作者或通信作者在国内外著名期刊和国际会议上发表论文60余篇。开发完成了国内首款冷冻电镜三维重构系统AuTOM，其中电子断层数据对位软件Markerauto 和三维重构软件ICON已成为本领域知名软件，帮助生物学家取得了重要的生物学发现。 /p p strong 报告时间： /strong 2016年10月26日下午 /p p span style=" COLOR: #ff0000" strong 报名链接： /strong strong a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/webinar/icem2016/index2016.html" target=" _blank" http://www.instrument.com.cn/webinar/icem2016/index2016.html /a /strong /span /p p a title=" " href=" http://www.instrument.com.cn/webinar/icem2016/index2016.html" target=" _self" img src=" http://www.instrument.com.cn/edm/pic/wljt2220161009174035342.gif" width=" 600" height=" 152" / /a /p

p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 2018年11月19日，南方科技大学冷冻电镜中心揭牌仪式在南科大生物楼举行。2017年诺贝尔化学奖获得者、冷冻电镜技术开创者之一Richard& nbsp Hendersen，深圳市发改委副主任蔡羽，南方科技大学校长陈十一，中国科学院院士隋森芳等出席仪式。 /p p style=" text-align:center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/b83644de-356d-4e5f-9341-72a1a5e4725a.jpg" title=" 1.png" alt=" 1.png" / /p p style=" text-indent: 2em text-align: center " 揭牌仪式现场 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 南科大冷冻电镜中心是深圳市政府出资、我校牵头建设的重大基础科学设施平台，旨在支撑深圳市、粤港澳大湾区及中国南方在生物医药、精准医学、新能源新材料方面的科学研究及产业升级。南科大冷冻电镜实验室拟安装300千伏冷冻电镜6台，200千伏冷冻电镜2台，120千伏电镜2台，共计10台冷冻透射电子显微镜及其它71台/套相关辅助仪器和样品制备设备，全部建成后，将是我国配套最齐全、最先进的冷冻电镜实验室。经过一年多的前期准备工作，目前项目一期的2台300kv冷冻电子显微镜已经完成安装调试，投入使用。冷冻电镜技术改变了许多生物领域的研究方式，使得诸多研究能够快速取得重大突破。冷冻电镜技术已成为结构生物学研究的利器，这项技术克服了生物分子结构解析中的许多难点，被诺贝尔奖官方称为“使得生物化学进入一个新时代”。 /p p style=" text-align:center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/7a1b61e0-a88d-4542-9e00-fb3cdc96a122.jpg" title=" 2.jpg" alt=" 2.jpg" / /p p style=" text-indent: 2em text-align: center " 陈十一致辞 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 陈十一在仪式上致辞，他代表南科大对与会嘉宾的到来表示欢迎，对深圳市委市政府对南方科技大学冷冻电镜中心的支持表示感谢，同时也对冷冻电镜中心负责人王培毅和工作人员前期的辛勤工作表示肯定。他表示，未来几年，冷冻电镜中心将致力于把基础知识和药物开发结合起来，在深圳的工业发展中扮演重要角色。南科大将以此为契机，秉承和发扬“敢闯敢试、求真务实、改革创新、追求卓越”的创校精神，为深圳市社会和经济的发展继续贡献力量。 /p p style=" text-align:center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/17b55b90-20aa-4b77-85b2-0fddf9d79466.jpg" title=" 3.jpg" alt=" 3.jpg" / /p p style=" text-indent: 2em text-align: center " Richard& nbsp Henderson致辞 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " Richard& nbsp Henderson在致辞中对南科大冷冻电镜中心的落成表示祝贺，并表示为这个优秀的冷冻电镜中心的建立感到由衷高兴。他指出，南科大冷冻电镜中心落成之后，将会成为全球最大的三个冷冻电镜中心之一，另外两个分别在美国和英国。目前，世界上大概有100个类似的研究机构，南科大冷冻电镜中心落成之后，其研究能力将会达到全球的前5%，对相关科研领域的研究产生更大的影响。 /p p style=" text-align:center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/524b4e7f-e049-43a5-8cb4-e08283ee6ed4.jpg" title=" 4.jpg" alt=" 4.jpg" / /p p style=" text-indent: 2em text-align: center " 蔡羽致辞 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 蔡羽表示，南科大冷冻电镜中心是生命科学、新材料、新能源领域基础性、关键性的重大科研设施，填补了深圳市、广东省、中国南方地区在该领域的空白，为我市及地区相关领域内的科学研究及产业升级转型提供了支撑平台，希望冷冻电镜中心为深圳市、粤港澳大湾区的产业升级及进一步经济社会全面发展提供新的动力源泉。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 随后，冷冻电镜中心负责人王培毅、Richard Henderson、蔡羽、隋森芳共同为南方科技大学冷冻电镜中心揭牌。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " Thermofisher Scientific亚太区材料与科学事业部总经理Marc Peeters、Thermofisher Scientific公司代表Jonathan Jing、中国航天科工深圳航天工业技术研究院董事长崔玉平、中国国际金融集团董事总经理陈十游也在仪式上致辞。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 南方科技大学第二附属医院、深圳市第三人民医院院长刘磊，加州大学洛杉矶分校教授周正洪，加州大学旧金山分校教授程亦凡，牛津大学教授章佩君等参加了揭牌仪式。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: left " 冷冻电镜发展国际研讨会也于同日在南科大图书馆111报告厅举行。 /p

7月4日，清华大学-北京大学生命科学联合中心青山湖平台挂牌暨2022年暑期学校启动及水木未来冷冻电镜项目投用仪式在青山湖科技城举行。清华大学校长助理、清华大学-北京大学生命科学联合中心主任王宏伟，西湖大学校长助理王廷亮，北京大学生命科学学院副院长、教授高宁，清华大学生命科学学院副院长欧光朔，杭州城西科创大走廊党工委委员、管委会副主任施黄凯，临安区领导杨泽伟、陈立群、蔡萌、裘凯，以及临安区有关部门、清华大学、北京大学、浙江大学等高校师生参加活动。活动现场青山湖科技城是浙江建设科技强省和创新型省份的重大工程，也是杭州城西科创大走廊的重要一极。自成立之初起，青山湖科技城就高度重视科技创新，集聚了36家科研院所，拥有众多共享仪器设备和研发平台；近年来，更是聚焦高端装备制造、未来微电子、新材料等领域，打造成为城西科创大走廊“硬科技”创新策源地。水木未来冷冻电镜项目投用仪式在杭州市临安区政府推动下，水木未来“全球冷冻电镜与人工智能药物创新中心”设立于青山湖科技城，旨在建立全球最大的冷冻电镜平台和生物大分子高精度结构数据库，面向全球科研机构和创新药企提供服务和创新疗法共同开发；与清华大学和国内外顶级科研机构合作，提升基础科研水平，整合基础研究、技术开发和成果转化，打造全球化结构与AI药物创新发现基地。水木未来源自清华，是一家基于冷冻电镜和AI的精准创新药和疗法研发企业，拥有亚太区第一个商业化冷冻电镜服务平台，在小分子、抗体药、RNA药物、蛋白降解、基因治疗等领域，助力全球创新药企药物研发。经过一年的紧张筹备，水木未来“全球冷冻电镜与人工智能药物创新中心”在青山湖科技城投用。参观水木未来冷冻电镜实验室目前，6台300kV高配电镜已就位，结合自主研发的AI驱动的新一代电镜结构解析和建模软件平台、GraFuture™ 石墨烯载网冷冻制样技术，水木未来青山湖基地在推动冷冻电镜效率、分辨率和产业化方面，又向前迈出一大步。据青山湖科技城管委会相关负责人介绍，该项目的投用，将有力提升科技城乃至临安、城西科创大走廊的生物医药创新研发水平，并加快生物医疗领域产业集聚，助力城西科创大走廊打造生命健康产业创新策源地，以“结构+计算”助力加速全球创新药物发现。会议期间，与会人员参观了水木未来冷冻电镜项目实验室、青山湖科技城规划展览馆，并举行了政校深化合作座谈。笔者注：据了解，此次在青山湖科技城投用的水木未来冷冻电镜研发平台，规划了20台高规格300KV冷冻电镜，不久的未来还将引入用于原位高分辨解析的新型高端电镜。水木未来“全球冷冻电镜与人工智能药物创新中心”一期正在装机6台300KV新型高端冷冻电镜、2台200KV冷冻电镜，旨在建立全球最大的冷冻电镜平台和生物大分子高精度结构数据库，推动新一代AI精准化药物和疗法的源头创新。据悉，电镜平台综合实验室由上海音宁电子科技有限公司设计施工一体化建设。有关负责人透露，全球已有多家顶尖实验室表达合作意愿。

核糖体是由RNA和大量蛋白质构成的大型分子机器，负责地球上所有生物的蛋白质合成。在真核生物中，核糖体组装是个非常复杂的过程。核糖体在成熟过程中需要和大量的组装因子暂时结合，形成了一系列核糖体前体复合物。小亚基核糖体在组装过程中形成两个主要的中间体：早期的90S和晚期的pre-40S前体。90S前体是个巨大的复合物，除了含有核糖体RNA和蛋白质组分，还含有约50个非核糖体蛋白质和U3 snoRNA，分子量高达5百万道尔顿。　　中国科学院生物物理研究所叶克穷实验室利用冷冻电镜和单颗粒重构技术获得了出芽酵母90S核糖体前体的3个电子密度图，其中最好的密度图的整体分辨率达到4.5埃。研究人员利用已知的晶体结构、从头建模和化学交联质谱数据构建了接近完整的90S结构模型。　　90S的结构显示新生核糖体小亚基折叠形成多个分离的亚结构，并和大量组装因子结合。核糖体前体RNA的5' 间隔区域、U3 snoRNA和大量组装因子形成巨大的基座，支撑新生核糖体的结构。结构还揭示了U3 snoRNA和核糖体前体RNA结合的新颖方式。该结构对理解核糖体小亚基的早期组装原理和组装因子的功能具有里程碑的意义。　　报道该工作的论文Molecular architecture of the 90S small subunit pre-ribosome 于2月28日在eLife 杂志在线发表。　　叶克穷是该论文的通信作者，孙奇、朱星、奇佳和安卫东是共同第一作者。合作者董梦秋和谭丹以及叶克穷课题组多位研究人员对该研究也有重要的贡献。中科院生物成像中心为该研究提供关键的冷冻电镜研究设备和技术支持。该研究得到了国家自然科学基金委、中科院战略性先导科技专项(B类)、科技部和北京市政府的资助。　　文章链接 90S核糖体前体的冷冻电镜结构

基于结构的药物发现(Structure-based drug discovery, SBDD)是设计和优化创新药的必要方法。本篇综述将深入探讨冷冻电镜(cryo-EM)在SBDD领域中的快速崛起及它的主要作用，以及阐释它如何为高价值药理学靶点提供丰富的全新结构信息。冷冻电镜技术相比X射线晶体学的主要优势在于，它可以跳过繁琐的结晶步骤，从而直接对玻璃化的生物大分子进行成像；冷冻电镜也可以提供更多维度的信息，包括异质性和动态性。此外，本综述还将讨论冷冻电镜近期和未来的发展，并探讨该技术将在SBDD的管线中产生何种广泛的影响。冷冻电镜时代的SBDDSBDD是一种基于靶点的原子级结构基础信息，针对该靶点进行理性药物设计的研发方法。20世纪80年代，随着Captopril卡托普利和多佐胺Dorzolamide等酶靶向药物获批上市，SBDD方法初露锋芒。这一批由FDA批准的药物结合了晶体结构模型与计算机辅助分子建模这两大新兴技术，并成功解决了传统湿实验室的高通量筛选方法(HTS)所面临的昂贵、耗时及低回报率等问题。此后，随着计算技术的不断革新，大量药物靶点的晶体结构得以解析，SBDD方法进入了飞速发展阶段。从1999年到2013年，在113个获批的first-in-class药物中，有78个是基于SBDD方法发现的。尽管SBDD的发展足够迅速，但学界及制药行业内对它的期望显然更高。SBDD方法往往能另辟蹊径，对过往认为不可成药的靶点进行验证，并进一步开发新药。如K-Ras(G12C)靶点，它利用晶体学结构确定了一个以前未知的结合口袋，以避免与皮摩尔亲和力的GDP/GTP竞争。由于靶点验证是发现和开发工作中的主要难题之一，first-in-class药物分子可以为靶点的有效性和疾病应用提供新的见解，例如bromodomain溴结构域抑制剂(+)-JQ-1和I-BET762，这些化合物被成功用于表征和验证溴结构域在各种疾病中的重要性，并催生了大量的临床候选药物。即使是FDA批准的已知药物靶点，临床上也常常需要进一步的SBDD，比如有些药物需要进行更好的选择性的优化设计。厄菲替尼(erdafitinib)在经过针对性的设计改造后，表现出了相对于原先药物对成纤维生长因子受体更高的选择。此外，有一些药物可能需要优化效力或疗效，或提供特定受体亚型的选择性，如改善鞘氨醇-1-磷酸(S1P)抑制剂西波尼莫德(siponimod)对S1P1而非对S1P3的选择性，是提高其在疗效和安全性上优于非选择性S1P抑制剂的关键。该药物靶向S1P1，而非S1P3，此外，许多抗病毒、抗菌和抗癌药物正面临着抗药性问题，SBDD方法能够基于产生耐药性的靶点结构，对药物进行持续改进。SBDD工作的瓶颈在于获取高分辨率的生物靶点结构信息。虽然一些小而有序的生物分子满足X射线晶体学的研究范畴，但大部分已知靶点中的蛋白质，例如跨膜受体或动态复合物，都难以结晶，导致这些靶点蛋白无法利用晶体手段进行高分辨率结构解析。此外，X射线晶体学往往会对靶点蛋白进行改造，如进行截短体设计、引入热稳定性突变或插入一段外源的结构域，从而影响后续的SBDD结构信息分析。还需要考虑的一个关键因素是，大量的靶点蛋白性质上达不到结晶的条件要求。不过，上述的这些难点正被冷冻电镜技术逐一攻克。冷冻电镜技术的分辨率已足够高，其产生的大量数据也可用于计算辅助药物设计(CADD)方法，这也是本综述的核心议题。与X射线晶体学不同的是，冷冻电镜无需对目标靶点进行结晶：纯化过的靶点生物大分子会被瞬间冻结在一层薄薄的非结晶玻璃体冰中，再经由透射电镜成像以记录下几十万到几百万个冷冻电镜颗粒数据，用于重构三维静电势图并对大分子进行精确建模。因此，这种技术很适合于蛋白质复合物、热稳定性较低和动态运动较高的蛋白质以及脂质胶束中的跨膜蛋白质的结构测定。随着分辨率的不断提高，冷冻电镜已经成为药物设计的强大工具。冷冻电镜与药物发现在2014年之前，冷冻电镜几乎无法解析出优于4.0Å分辨率的结构，这直接导致它无法对SBDD工作提供有效的数据支持。然而，在过去的几年里，冷冻电镜方法的爆炸性突破产出了大量高分辨率的结构数据，这在以前是无法实现的。这一质的飞跃要归功于许多技术革新，如用于记录图像的直接电子探测器、改进的计算方法和处理大型数据集的硬件集群，这些技术的飞跃在其他文献内有详细回顾。此外，作为一种直接可视化的技术，冷冻电镜能够快速判断样品的聚集性和稳定性等问题，从而通过遗传和生物化学手段，用互作因子稳定蛋白、或通过优化去垢剂从细胞膜环境中提取膜蛋白等方法来快速改善样品质量。综合以上，在PDB中的分辨率为4.0Å或更高的冷冻电镜结构的数量已经从2014年之前的合计16个增长到仅2020年一年提交1753个新结构的规模(图1, A)。在新上传的结构中，分辨率高于4.0和3.5 Å的比例分别从2015年的36%和12%增加到2020年的75%和50%。更振奋人心的是，截止2020年，分辨率高于3.0Å和2.5Å的冷冻电镜结构比例，分别达到了18%和3%，实现了冷冻电镜结构解析前所未来的突破(图1, B)。为了系统评估冷冻电镜对SBDD领域的影响，我们(作者)调查了2018年美国200种最常用处方药的靶点相关结构数据。72%的靶点在PDB数据库中含有结构信息。细分而言，这些结构信息是通过X射线晶体学技术(42%)、冷冻电镜技术(15%)或两者结合(15%)而确定的(图1, C)。通过冷冻电镜技术解析的靶点涵盖了许多跨膜蛋白，如离子通道(GABAA、CaV、NaV和KATP)、激活态的G蛋白偶联受体(GPCRs)和转运体蛋白(5-羟色胺转运体、NaCl转运体)。图1.冷冻电镜分辨率的提高及其对蛋白质药物结构表征的贡献。(A) PDB中上传的低于特定分辨率的冷冻电镜结构的绝对数量；(B) PDB中上传的低于特定分辨率的冷冻电镜结构的百分比的。(C)2018年200个热门处方药的靶点图，按靶点的结构特征分类；(D)44个热门GPCRs处方药的靶点图，按结构特征分类；(E)2018年200个销量最高的药物的靶点图(作为新药的代表)，按靶点的结构特征分类。2020年的数据是由Njardarson实验室公示的2018年200种最受欢迎的处方药和200种销量最高的药物的蛋白质靶点(如果适用)，然后在PDB中确定相关结构，进行人工筛选。在200多种最常见的处方药中，GPCRs占据了44种，这些药物包括靶向GPCRs的激动剂、拮抗剂和反向激动剂(图1, D；注意，拮抗剂和反激动剂在药理学上不同，但在这里我们(作者)把它们统一归为拮抗剂)。这些GPCRs中的32个(73%)已经进行了某种形式的结构解析，包括与拮抗剂(44%)或激动剂(7%)结合的晶体结构，与激动剂(9%)结合的冷冻电镜结构，或由X射线晶体学和冷冻电镜手段共同进行的结构解析(20%)。值得注意的是，GPCR的高度动态结构使其难以获得高质量的晶体，因此大多数的GPCR晶体结构都是与拮抗剂结合后才得以进行结构解析的。综上所述，冷冻电镜技术在针对市场上已经存在多年的处方药中中具有深刻影响。为了更加深入了解冷冻电镜技术在未来药物发现中的作用，我们(作者)还调查了2018年取得最高利润的200种药物，以代表那些市面上新进发现的药物(图1, E)，我们简称新药。这批新药和之前提到的那些最常用的药物之间存在明显的差异。相当一部分新药已经用晶体学进行了表征，反映了结构数据在当今药物研发工作中的重要性：即便不是由结构驱动的，也很少有不追求结构的情况，因为结构信息可以为先导化合物的优化和进一步发现提供关键数据。此外，考虑到漫长的药物开发时间，冷冻电镜这一最近几年才崛起的新技术在这份名单中的占比虽小，但贡献仍相当可观。这些药物和靶点包括生物制药、离子通道和GPCRs，以及其他不适合结晶的高活性大分子。冷冻电镜对SBDD的贡献解析新型结构虽然有许多FDA批准的药物靶点结构可被X射线晶体学解析，冷冻电镜正在为越来越多的难结晶、甚至不可结晶的靶点打开大门，如分子量更大、更动态的蛋白质和蛋白质复合物。冷冻电镜也显著降低了对细胞内复合体的研究难度，如病原体的核糖体、染色质修饰复合体和转录机器。例如冷冻电镜技术近期解析了一种与线粒体体RNA聚合酶复合体相关的first-in-class 抑制剂的结构。值得注意的是，在膜蛋白领域，冷冻电镜的贡献无可比拟。不管是传统的药物，还是新型处方药，很多药物靶向针对GPCRs、离子通道和转运体蛋白。然而，利用X射线晶体学手段来解析膜蛋白的结构非常困难。尽管脂质立方结晶在GPCR领域取得了一些进展，但在结晶过程中，GPCR蛋白通常需要进行热稳定突变，或融合其他蛋白进行改造，以促进晶体的形成。并且，为了获取某种改造后的稳定的构象，还需要对克隆构建、实验方法及条件进行大量繁琐复杂的筛选。相比之下，冷冻电镜结构可以直接用来解析经过去污剂或纳米盘处理后的在生化上性质稳定的膜蛋白，并获得处于或者接近生理状态的蛋白的结构。冷冻电镜的在解析庞杂的膜蛋白的结构中能力势不可挡，并且已有大量的高分辨率结构被成功解析。长久以来膜蛋白一直都是获批药物的热门靶点，它们的结构也只是近期才被冷冻电镜揭示(图2)。图2. G蛋白偶联受体、转运体(上排)和离子通道(下排)，每个受体有相应的FDA批准的配体分子(蓝框)。利用冷冻电镜解析膜蛋白结构的突出进展，部分原因受益于新试剂的设计和使用。这些试剂可以在体外纯化过程中维持跨膜蛋白的结构，在冷冻制样过程中保护蛋白，并为高分辨率的结构解析提供均质样品。去垢剂如正十二烷基β-D-麦芽糖苷(DDM)和月桂基麦芽糖新戊二醇(LMNG)，可以有效地从细胞膜上溶解跨膜蛋白，并维持蛋白质的生理状态构象。去垢剂的使用也会产生一些问题，如去垢剂形成的空胶束和与包裹蛋白质的去垢剂同时存在存在会引起样品的不均一，对后期的数据处理处理产生影响；也可能会导致冷冻样品制备时的气液界面收到破坏，产生一些不好的结果。脂质纳米盘是去垢剂的一种替代品，原则上可以为结构和生物物理研究提供接近胜利状态的脂质双分子层。脂质纳米盘在膜蛋白药物靶点上的应用已经非常关键和广泛。举例而言，将纳米盘与冷冻电镜技术相结合，成功阐明了TRPV1和TRPV5离子通道(在TRPV1的情况下，脂质对抑制剂的结合至关重要)、GABAA配体门控离子通道、人类P-糖蛋白以及GPCR-β-arrestin复合物的高分辨率结构和机制。关于纳米盘的进一步介绍可查阅。冷冻电镜还可以用来解析嵌入脂质体中的蛋白质的结构，允许在更接近生理状态的的电化学梯度中对离子通道以及孔蛋白进行可视化研究。在过去的几年中，冷冻电镜也在生物制药领域产生了巨大影响。在较新的药物中，生物制药的占比正越来越高。如果仅将目光聚焦于药物靶点识别这一领域，生物制药的结晶技术确实称得上有所改善。然而，冷冻电镜已经为一些关键的生药物研发提供了基于全长蛋白的结构信细节息胰岛素受体一种二聚化的酪氨酸激酶受体蛋白，在调节人体的葡萄糖平衡方面起着关键作用。胰岛素受体信号通路的失调会引起一些疾病，如II型糖尿病，全球约有9.3%(4.63亿人)受到影响两个独立的研究小组利用冷冻电镜在胰岛素受体结构解析方面取得了突破进展；第一个小组以4.3Å和7.2Å的分辨率分别解析了与一个或两个胰岛素分子结合的胰岛素受体胞外结构域结构，第二个小组以3.1Å的分辨率获得了与四个胰岛素分子结合的胰岛素受体胞外结构域结构(图3, A)。这些结构解释了胰岛素受体结合胰岛素的不同结合位点，以及激活这一关键药物靶点所进行的构象变化。类似的例子比比皆是：从HER2-trastuzamab-pertuzumab复合物到SARS-CoV-2和中和抗体的结构解析，冷冻电镜为生物治疗的新老靶点提供了新的视点，为进一步发现和开发仿制药和first-in-class药物铺平了道路。另一个值得注意的例子是B淋巴细胞抗原CD20，它是治疗白血病和自身免疫性疾病的一个重要的治疗靶点，尽管其功能作用仍不清楚。尽管CD20的分子量较小，只要35kDa左右，但分别与单克隆抗体利妥昔单抗(rituximab)、奥法图单抗(ofatumumab)和奥比努单抗(obinutuzumab)的Fab结合形成复合物后，都解析获得分辨率较高的CD20复合物结构(图3, B)。负染结果显示，利妥昔单抗与CD20结合后，可诱导形成高度有序的高级结构，这一发现对激活先天免疫的补体系统提供了全新见解。由于复合物中的高度动态和跨膜结构域的存在，利用结晶手段结构解析几乎不可能实现，冷冻电镜技术的应用实现了这一可能。图3.冷冻电镜(cryo-EM)在小分子和生物制药发现方面的效用。(A)与胰岛素结合的胰岛素受体(PDB ID 6PXV)和(B)CD20与利妥昔单抗复合物(PDB ID 6VJA)冷冻电镜密度图。(C)使用GemSpot(PDB ID 6CVM)将小分子PETG精确地建模到β-半乳糖苷酶的冷冻电镜图像中。(D)基于片段的PKM2的发现，冷冻电镜密度允许正确识别和放置发现片段(PDB ID：6TTF)尽管冷冻电镜在膜蛋白结构测定领域已经迈出了一大步，但短板仍然存在。其中一个短板是解析小于50-70kDa的没有明显的胞内或胞外结构域的单体膜蛋白，由于几乎没有胞外结构域特征，因此难以对去垢剂胶束或脂质纳米盘进行降噪处理，以这种方式收集到的数据难以产出高分辨率结构，比如解析没有上下游偶联蛋白的处于非活性状态的的GPCR结构。然而，大量的蛋白质属于这一类型，解析这一类型的的膜蛋白因此也成为了一个重要的研究领域。目前，有一些解决方案正处于研究阶段，且已经取得了一定程度的成功，如前文所述的CD20。随着利用增加融合蛋白、抗体片段、纳米抗体、纳米抗体衍生物或其他支架蛋白以增加靶点蛋白的分子量等方法的应用，预计冷冻电镜在膜蛋白结构测定方面会有更多进展。计算赋能冷冻电镜冷冻电镜单颗粒技术利用数百万个颗粒的可视化投影来重建静电势图，这通常涉及数十万亿字节的原始数据。因此，该方法从计算方法的快速发展中获益匪浅，这些计算方法同时满足了对更高的分辨率的需求并加深了对粒子动力学的理解。然而，与X射线晶体学相比，冷冻电镜在获取配体-靶点复合物的高可信度模型时仍然面临着一些难题。其中一个难题是冷冻电镜难以解析得到高于2.5Å的蛋白结构，而这通常是建模人员能够精确放置配体并解析出结合位点处水分子的最低分辨率。此外，冷冻电镜的结构建模流程与晶体学完全不同：在晶体学中，模型和密度图之间有一套严格而完善的统计测量方法，该方法能够提供和模型精度相关的关键信息。而在冷冻电镜方法中，基于密度图的建模是一个完全独立的过程，仅适用收集的电镜投影来进行密度图重构，然后基于密度图进行结构建模和实空间下的微调。该过程的独立性使得模型的精度被降低了。这一问题在最近已得到改善。此外，两种方法之间还存在一些物理上的差异，如晶体学依赖电子密度图，而冷冻电镜依赖静电势图。这些差异加在一起，使得晶体学的模型验证工具无法应用于冷冻电镜模型。因此，我们可能需要为精确性开发一些新的指标。一种解决方案是使用强大的计算技术和精确的分子力场对大分子及其配体在冷冻电镜结构中的相互作用进行模拟。比如PHENIX软件包结合实空间和傅里叶空间微调和OPLS3e力场的分子动力学模型，从而生成生物分子和小分子的几何统计精修模型。OPLS3e微调工具已经被整合进到我们(作者)的自研软件GemSpot，它将各种计算方法整合为一个工作流程，从而提高冷冻电镜密度图中配体位置的准确性(图3C)。新的计算工具也推动冷冻电镜在基于片段的药物发现(Fragment-based drug discovery)中发挥作用，其中高溶解度的小片段化合物被浸泡在由多个不同结构的化合物组成的生物分子靶点中。解析复合体的结构可以解释配体与结合口袋之间关键位点的相互作用，然后可以将其组合成一个先导化合物。然而，这种方法要求配体密度质量高、分辨率高，才能正确区分配体的姿态和原子类型，目前对于冷冻电镜来说还是一个难题。最近，Saur等人在高度棘手的β-半乳糖苷酶和颇具治疗意义和挑战性的激酶PKM2的场景中成功地将冷冻电镜用于FBDD。尽管他们为了将配体置放于密度图中，而不得不将干法和湿法实验结合，但他们成功地建立了一个与β-半乳糖苷酶结合的大约150kDa的精准片段模型。更令人印象深刻的是，他们能够从四种化合物的鸡尾酒中确定哪些片段与PKM2结合(图3, D)。因此，不断发展的计算方法为冷冻电镜密度图的构建提供了一个强大的平台，可以在高分辨率下对大分子复合物进行建模。冷冻电镜的快速发展可及性与通量的提升冷冻电镜是极为精密且昂贵的仪器，需要大量的费用和人力成本来搭建、维护与操作。这一特性在很大程度上限制了冷冻电镜的发展，并将冷冻电镜的机时资源集中在了那些受政府资金扶持的大型机构上。因此，在科研界中，冷冻电镜资源的获取门槛极高。然而，这一门槛正在被逐渐降低：许多国家级设施都启动了冷冻电镜人才培养计划，以降低冷冻电镜运维的人力成本。一些大型制药公司也开始进行内部投资，设立最先进的冷冻电镜设施。此外，冷冻电镜设施的可复制性远超晶体学极其昂贵的同步加速器和线性加速器，使得该技术更有发展前景。随着100kV电子束技术的发展，未来可能会出现性价比极高的冷冻电镜，增加其在药物发现领域中的应用场景。鉴于2018年FDA批准的药物中有49%来源于中小型公司，降低冷冻电镜的成本将使冷冻电镜技术得到更广泛的应用。最近对SARS-CoV-2相关蛋白的结构表征证明了冷冻电镜的无限潜力。在病毒爆发后的几个月内，科学家们利用冷冻电镜，以极快的速度解析了新冠病毒刺突蛋白的几种构象，以及它与人源血管紧张素转换酶或许多中和人源抗体片段的复合物的结构。最近获得FDA批准的用于治疗COVID-19的再利用药物瑞德西韦(Remdesivir)与SARS-CoV-2 RNA聚合酶结合的结构也已被冷冻电镜解析。鉴于X射线晶体学一直是病毒RNA聚合酶结构测定的传统方法，对新冠病毒的冷冻电镜结构解析是一个颠覆性的创新，凸显了冷冻电镜的高时效性特点在快速反应研究中的应用。此外，冷冻电镜的分辨率仍在大幅提高，最近的一份报告指出，作为冷冻电镜的代表性复合物结构，去铁蛋白apoferritin的分辨率达到了1.25Å，该分辨率足以对单个原子进行精准定位，在某些情况下甚至可以解析氢原子和质子化态。毋庸置疑，在样品制备良好的情况下，冷冻电镜的不断改进将持续打破结构解析的分辨率记录。冷冻电镜在药物发现和开发方面的应用将进一步受益于该技术的全面自动化。在载网准备方面，一些自动化工具正在出现，以解决不可重复性和样品浪费的难题。这些技术的改进不仅会提高自动化的程度和可及性，还可能解决冷冻电镜载网制备中的其他难题，如减少颗粒在空气及水中的暴露程度。此外，机器学习方法和深度神经网络也是提高颗粒筛选速度和准确性的关键。这些自动化方法甚至有望在未来成为冷冻电镜的核心技术，从而推动冷冻电镜在药物发现领域的发展。主流硬件和软件的改进也有望提高冷冻电镜在SBDD领域的可及性。例如，更高效的检测设备能显著提高冷冻电镜的产能。在一个标准的数据收集过程中，老式的检测器相机可以每次收集1个影像，每小时产生50个影像，而较新的检测器可以每次收集9-16个影像，每小时可以产生超过200个影像，进而转化为每24小时收集的数百万颗粒投影数据。此外，虽然今天许多最高分辨率的结构是用300kV冷冻电镜获得的，但这些机器非常庞大，且前期和维护成本昂贵。在许多情况下，对于单颗粒分析中使用的薄样品，200kV的显微镜可能就足够了，甚至100kV的显微镜也可以用来获得分辨率高达3.4 Å的结构。分子动力学的新窗口结合硬件和数据处理方面的改进，冷冻电镜的潜力将进一步被释放。当X射线晶体学受限于结晶条件而无法解析时，冷冻电镜的低样品需求大幅降低了数据收集的门槛，使我们得以看到样品的构象连续体或一系列不同的能量最低状态，为大分子动力学提供了新的窗口。图4.单一的冷冻电镜数据集，投影的三维分类显示了两种不同的构象，代表了两种不同的G蛋白偶联受体-G蛋白相互作用的状态，代表了两种热力学上可比较的构象。在典型状态下(左边，PDB ID 6OS9)，受体以典型的方式与G蛋白结合，其中核苷酸结合口袋为GTP结合做准备。在非经典状态下(右图，PDB ID 6OSA)，G蛋白异源三聚体与经典状态相比旋转了45°，代表了沿G蛋白偶联途径的中间配体结合受体状态。缩写：α-N=G蛋白的N端α螺旋；cryo-EM=冷冻电镜；TM=跨膜螺旋。一些计算工具，例如二维和三维分类以及子区域的重点细化，能够利用数据集内颗粒的异质性来模拟大分子活性成分的运动。在我们(作者)小组最近的一个例子中，对神经紧张素1受体的冷冻电镜单颗粒分析结果揭示了先前识别的G蛋白、激动剂结合状态和G蛋白偶联通路上的一个新的中间状态(图4)。最近，我们(作者)还将AI深度学习网络应用于冷冻电镜数据集，揭示了26S蛋白酶体的构象动态，使解析出的结构细节达到了前所未有的原子级水平。随着分辨率和分类工具的不断改进，我们将获得更精细的构象变化。有了以上这些技术，再加上分子动力学模拟和机器学习方法等计算技术，我们将得以对配体结合的复杂过程进行更精确的建模，从而揭示全新的、可成药的中间状态。结语尽管冷冻电镜已经在SBDD领域取得了飞跃性的进展，但它的潜力远不止于此。在三维分析重构及深度学习算法等领域，若能将计算工具与更大、更高质量的数据集结合并进行训练，我们将能够描述蛋白质甚至其配体的更小幅度、更高分辨率的动态运动。我们还期望冷冻电镜在时间维度上的结构解析方法将使人们对大分子复合物的结合和解离过程有更深了解，为靶向药物的研发提供更多思路和机会。目前晶体学和大多数冷冻电镜结构所提供的只是能量最小值的瞬间结构，但对于开发新的药物作用模式而言，对机制和中间状态的理解至关重要，所以我们若能获取构象的动态信息，则对理性药物设计具有突破性意义。在综合了冷冻电镜的软硬件及方法的快速发展之后，我们可以得出结论：冷冻电镜有望为药物发现和人类健康做出巨大贡献。词表：1. 激动剂一种通过增加受体活性以产生生物反应的物质。2. 拮抗剂(也称中性拮抗剂)一种能阻断激动剂或反向激动剂的物质，在不存在激动剂或反向激动剂的情况下便没有活性

仪器信息网讯 6月3日晚，&ldquo 国际冷冻电镜图像处理技术培训班&rdquo 在清华大学正式开讲。当晚国际著名结构生物学家Sjors Scheres博士(被《科学》杂志评为2014年度十大科技人物之一)通过视频直播做了关于单颗粒冷冻电镜技术最新进展及展望的报告。虽然是晚上，会场里依然挤满了人，报告结束后，学员们向Sjors Scheres博士提问交流了许多问题，会议直到很晚才结束。 　　本次培训班将一直持续到6月7日，每天的培训从早晨8:30分开始，上午举行培训报告、下午进行实际操作、晚上是讨论环节，直到晚上9点一天的培训才结束。如此紧凑的培训安排，学员们依然精神饱满，每次培训现场都是人员爆满，经常能看到大家向前来授课的专家请教，或是相互间讨论学习，现场气氛十分热烈。 　　看到这样的情景，本次大会的执行主席清华大学王宏伟教授和中科院生物物理所孙飞研究员颇感欣慰。一直以来，他们希望通过这个培训班，能够让大家更好地学习和掌握最前沿的冷冻电镜领域技术，从而推动我国冷冻电镜技术的创新发展。 国际冷冻电镜图像处理技术培训班讲座现场 　　立足国际前沿，培养高层次冷冻电镜人才 　　2012年，孙飞去瑞士参加Gordon Research Conference，会议上关于冷冻电镜图像处理算法的讨论特别多。而当时国内对于这方面的了解还很少，这让他深深地体会到国内的相关研究已经有些落后了。所以回国后，他就和王宏伟讨论决定举办培训班来加强和推进我国在这方面的研究工作，他们的想法得到了隋森芳院士的肯定和支持。2013年在中科院生物物理所举办了第一届培训班。今年在清华大学举办的是第二届。 　　由于冷冻电镜图像处理技术涉及很多理论和实践细节，为了保证培训班的效果，孙飞和王宏伟也是花费了不少心思&mdash &mdash 早在半年前他们就开始了本次培训班的筹备工作。他们邀请了这个领域里顶尖的冷冻电镜图像处理技术专家和软件作者前来授课。对于培训的主题，经过与报告人的多次沟通交流和细化，最终确定大家最感兴趣的前沿和热门技术领域。 　　&ldquo 这让我们能够比较快地跟上国际步伐，站到技术发展的最前沿。比如本期培训班，我们根据冷冻电镜技术的发展方向，有倾向性地选择了培训的内容，除了单颗粒蛋白质结构解析之外，还增加了针对细胞结构解析的培训内容，如Tomography、Sub-Tomogram Averaging等，还有建立高分辨率原子模型的技术等。&rdquo 王宏伟说道。 　　另外，培训班还设置了充分的时间来进行实际操作和讨论。王宏伟说：&ldquo 操作和讨论是培训非常重要的环节。如果只有报告，那就成为国际会议了。而安排实际操作确实是非常不容易，它要求我们要有相应配套的硬件设施，要有足够的计算机终端，把所有的软件都事先安装调试好。因此我们也不得不筛选和控制学员人数，确保来学习的人能有最大的收获。&rdquo 国际冷冻电镜图像处理技术培训班实际操作现场 　　晚上的讨论环节在目前国内的培训班中还是很少见的。对此，孙飞说道：&ldquo 其实经过白天的讲座和实际操作，大家肯定会有很多问题，晚上的讨论环节能够很好地及时帮助大家解决问题，更好地巩固学到的知识。另外，在培训班举行之前，许多培训材料就已经上传到网上，供大家下载预习，这对于提高学习效果也很重要。看看我们的安排，就知道大家在培训期间根本没有时间出去放松，必须将所有的精力都聚焦在培训上。&rdquo 　　在精心的组织安排下，培训班取得了非常好的效果。王宏伟介绍说：&ldquo 第一届培训班之后，许多学生都成长起来了，有一些到了国外很快就掌握了相关技术并做出了突出成绩，有些学生甚至都已经参与到图像处理新方法的开发中了。&rdquo 　　开展基础培训，让更多人了解冷冻电镜技术 　　就在本次国际冷冻电镜图像处理技术培训班举行之前，孙飞和王宏伟负责组织的另外一个培训班&mdash &mdash &ldquo 2015年度国内首届冷冻电镜成像技术培训班&rdquo 刚刚结束。据介绍，和图像处理技术培训班针对已经有一定冷冻电镜基础的人员不同，这个培训班主要是为了满足其他非电镜领域研究人员的需求，以介绍基础概念、理论和操作为主。 国内首届冷冻电镜成像技术培训班实际操作现场 　　孙飞介绍说：&ldquo 随着冷冻电镜技术的飞速发展，很多以前从事结构生物学研究的人，特别是利用X射线晶体学技术和核磁共振技术的研究人员，对冷冻电镜技术充满了兴趣。但是该技术门槛比较高，需要专门的培训才能掌握。我们和国内的冷冻电镜专家还有电镜厂商交流过，他们都非常愿意参与这个培训班的教学工作并贡献自己的力量。所以我们就组织了这样一个培训班，结果也是报名人数非常多，我们最后不得不筛选并控制人数。&rdquo 　　近年来，国家对于电镜平台的建设非常支持，尤其在冷冻电镜技术领域国内先后有多家科研院所建立了相应的研究平台。但是正如孙飞所言，仪器设备可以买、软件可以买，但是要真正用好这些仪器和软件、掌握好关键技术，我们还需要优秀的人才，要通过不断积累并逐步开展方法学研究，将来做一些由我们自己引领的研究。相信通过这一系列的培训班，会有越来越多的人了解冷冻电镜，越多越多的人成长起来，成为我国在该技术领域强有力的新生力量，未来为我国冷冻电镜技术的发展贡献自己的力量。 　　撰稿：秦丽娟

应用专家 肖丽国 期待已久的华东电镜会于10月24日在美丽的宜兴东氿湖畔落下帷幕，徕卡显微系统分别在材料分会与生命科学分会两个分会场进行专题报道，为大家介绍Leica在不同研究领域中的电镜制样解决方案。 生命科学专场中UM应用专家肖丽国在大家的心头种了一把草，通过介绍Leica在Cryo TEM与Cryo SEM方向的解决方案和多个应用实例，为大家安利了一套全新的电镜制样设备。图1 生命科学分会场专题报道自2017年的诺贝尔化学奖颁布，冷冻电镜技术就以不可阻挡的态势走进大家的视野。Leica作为专业的电镜制样设备专家，在冷冻电镜制样上有着全流程的解决方案。 Cryo TEM在Cryo TEM方向，想要实现在黑白成像的冷冻透射电镜中快速找到目标小样品，以前是非常困难的，耗时又费力。Leica结合自身的光学成像优势，推出了一套冷冻光电联用系统Thunder Imager EM Cryo CLEM，能够实现低温光学荧光成像。通过与各类电镜进行软件和硬件上的联用，利用荧光与电镜位置叠加，实现在电镜下快速寻找和成像，极大地提高了工作效率。图2 Thunder Imager EM Cryo CLEM 图3 样品展示Cryo SEM在Cryo SEM方向，Leica拥有真正的真空冷冻传输系统EM VCT500，在对低温样品进行安全传输和转移的同时，可以将常温SEM升级为冷冻SEM，实现冷冻扫描观察。当然，扫描不仅可以观察表面，Leica冷冻断裂镀膜系统EM ACE600可以实现冷冻断裂，将低温样品敲断后镀膜，通过EM VCT500即可转移至Cryo SEM中进行冷冻断面观察，实现立体断裂成像，极大扩宽了应用范围。图4 Cryo VCT500制样技术解决方案 图5 样品展示如需了解更多内容，请返回点击右下角联系我们吧！

p 　　日前，湖北大学发布冷冻电镜进口产品专家论证公示，内容显示湖北大学为了满足教学、科研的需求，拟需采购一台进口设备，预算金额为7500万元。 /p p 　　项目名称：湖北大学 2019 年生科院冷冻电镜采购项目 /p p 　　对于此采购项目，专家给出了如下论证意见： /p p 　　湖北大学“省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室”，是湖北大学第一个国家级重点实验室。根据《省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室建设运行实施方案》，实验室将紧紧围绕“生物催化与酶工程”主题，针对我国生物制造产品生产中所存在的共性基础理论与重大、关键性技术问题，特别是在蛋白的结构研究领域，开展生物制造领域的前瞻性和基础性研究，提升酶及蛋白质复合物结构分析方面的能力，建设湖北省一流的蛋白质结构中心。冷冻电镜将促进国重实验室在酶晶体结构解析、酶复合体和高分子量酶合成过程及复杂酶蛋白分子空间三维结构分析等方面的研究，对建立蛋白晶体结构解析平台和高分辨生物成像平台、解决蛋白质研究领域的关键技术问题具有重要意义。故购置冷冻电镜符合实验室发展目标和平台建设需求。 /p p 　　购置冷冻电镜将促进实验室在酶晶体结构解析、酶复合体和高分子量酶合成过程及复杂酶蛋白分子空间三维结构分析等方面的研究，对建立蛋白晶体结构解析平台和高分辨生物成像平台、解决蛋白质研究领域的关键技术问题具有重要意义。建议引进冷冻电镜专业采购小组，根据使用规则兼顾设备选型、配置等。在明确关键性技术指标的基础上，综合考虑性价比，提供有利于形成公开竞争的建设方案。专家组一致认为，购买目的合理，所购进口产品投向符合国家政策法规。建议尽快实施购置该进口设备。 /p p 　　采购人联系方式： /p p 　　采购人：湖北大学 /p p 　　地址：湖北省武汉市武昌友谊大道 368 号 /p p 　　联系人：郭老师 /p p 　　电话： 027-88662913 /p

4月25日，Science杂志以长幅研究论文(Research Article)形式发表了中科院生物物理所朱平研究组和李国红研究组合作利用冷冻电镜三维重构技术解析的30nm染色质左手双螺旋高清晰三维结构这一重要研究成果。 　　在这项研究当中，朱平研究员长期从事冷冻电镜三维重构应用研究，李国红研究员长期从事30nm染色质及表观遗传调控研究，他们二人通过多年的紧密合作，发挥各自专长和优势，在国际上率先解析了30nm染色质的高清晰三维结构，使我国在相关领域的研究处于世界前列。 　　日前，仪器信息网编辑特别采访了从事冷冻电镜(注：下文提到的冷冻电镜特指300kV和200kV场发射冷冻透射电子显微镜)应用研究的朱平研究员，请他为我们介绍了自己与冷冻电镜结缘的故事，以及冷冻电镜的特点和应用情况，希望使广大网友能对冷冻电镜有更多的了解。 中国科学院生物物理所朱平研究员 　　因对三维重构技术的喜爱，与冷冻电镜结缘 　　Instrument：朱老师，您好!首先请您为我们介绍一下您和冷冻电镜结缘的故事。 　　朱平：其实我并不是生物专业出身，我的本科是在浙江大学学习金属材料热处理，1990年毕业后，我被保送到西安交通大学断裂疲劳国家重点实验室读硕士研究生，博士研究生期间又到清华大学机械系开始学习焊接专业，研究焊接接头断口分析，当时有一个很热门的研究方向是断裂表面的分形研究，断裂表面的分形维数和断裂性能被认为是密切相关的。开始我们只是做断口轮廓线的分形研究，但发现由于断裂表面不是各向同性的，不同的方向可能会对应不同的分形维数，所以我们就尝试利用扫描电镜立体对照相方法将断裂表面三维形貌重构出来，来研究断裂面的二维分形维数。 　　博士毕业后我在清华做了一年讲师，由于对电镜三维重构比较感兴趣，我就据此联系国外的进一步研究机会。恰好这时美国佛罗里达州立大学一个研究艾滋病毒结构的实验室需要做电镜三维重构的人员，于是我就将在材料研究中积累的关于电镜和三维重构的知识转到了对生物样品的研究，从而有机会开始接触冷冻电镜。 　　Instrument：到美国佛罗里达州立大学后，您主要开展了哪些方面的研究工作? 　　朱平：当时，我所在的实验室是比较早开始艾滋病毒表面包膜蛋白结构重构研究的单位。开始我们只是想通过电镜技术来研究艾滋病毒表面很重要的一个包膜蛋白gp120的结构。后来，研究者发现虽然不同的艾滋病毒抗体具有毒株特异性，但有几种抗体它们对于多种艾滋病毒都有中和活性，所以我们也开始研究这些广谱中和抗体的结构特点。 　　在最初的研究中，我们主要利用普通电镜，通过负染色方法研究表达纯化出来的艾滋病毒表面包膜蛋白gp120以及它们与不同的中和抗体形成的复合物的结构。后来我们的研究发现这些包膜蛋白在真实病毒表面的三维结构及分布对艾滋病毒的感染非常重要，所以就转向研究整个艾滋病毒颗粒及表面蛋白的三维结构。我们是最早将电子断层成像方法应用于艾滋病毒三维结构重构的研究组，并利用负染色电子断层成像方法获得了艾滋病毒表面的包膜蛋白的一个高清晰三聚体结构和分布图，发在美国科学院院刊上。由于负染色法对病毒结构影响很大，虽然观察到了艾滋病毒表面的gp120蛋白的结构为三聚体，但同时结构信息损失也很多。所以之后我们逐渐开始采用冷冻电镜电子断层成像法来开展研究，并做出了一个艾滋病毒冷冻电镜三维重构图像，于2006年在Nature上发表了一篇文章，也产生了较大影响。 　　Instrument：2008年您以&ldquo 百人计划&rdquo 身份加入到生物物理所生物大分子国家重点实验室，请问促使您回国发展以及加入生物物理所的原因主要有哪些?　　朱平：在美国待了几年后，我也有了回国工作的念头，于是就开始和国内的相关研究单位联系。结构生物学研究是生物物理所的传统优势研究学科，所里也非常看好冷冻电镜在结构生物学研究方面的发展前景，已经在采购相应的设备，可以说这里有一个非常好的平台。 　　回国后，我们依然做一些艾滋病毒及疫苗的研究工作，同时也开展一些其他病毒的研究，如高对称性病毒的高分辨结构解析等。 　　另外，回国后我参加了以&ldquo 千人计划&rdquo 身份回国的许瑞明老师主持的科技部的一个&ldquo 973&rdquo 项目，其中我负责的一个课题就是利用冷冻电镜研究染色质的结构。后来，李国红老师回国，我们一起开始做染色质的冷冻电镜三维重构研究。 　　冷冻电镜是结构生物学研究的重要手段，但入门和上手都有一定难度 　　Instrument：请问和普通电镜技术相比，冷冻电镜在生物研究当中有哪些特点和优势? 　　朱平：普通电镜主要用于观察样品形貌，要看到原子分辨率的细节很难做到 另外制样方法如染色、固定等对样品的结构破坏很严重。而冷冻电镜可以将样品瞬间冻成玻璃态，冷冻速度平均可达以几万摄氏度每秒，这样样品所有的结构细节则都被保留下来。但是由于没有经过染色，直接观察样品的衬度就会差很多，所以需要三维重构来慢慢挖掘它的结构信息。 　　另外，结构生物学研究当中最常用的方法蛋白质晶体学的一个很大的瓶颈就是样品结晶，如将蛋白质产生结晶，需要各种各样的条件 此外在生物体中蛋白质往往不是单独起作用，而是多个蛋白质结合到一起的超大分子复合体，这样的超大分子复合物要长晶体就更难。但冷冻电镜不需要长晶体，直接将样品冰冻即可进行分析。 300kV Titan Krios场发射冷冻透射电子显微镜 　　Instrument：目前，国际上冷冻电镜研究的热点主要集中在哪些方面? 　　朱平：这两年冷冻电镜的应用主要集中在结构生物学研究，分析的样品类型从病毒、核糖体扩展到了其它蛋白。冷冻电镜三维重构早期比较多的应用是病毒分析，因为病毒结构比较对称，可以得到比较高的分辨率。近年来，随着仪器硬件及软件性能的提升，冷冻电镜结构解析的分辨率越来越高，现在我们可以做到近原子级别的分辨率。对于一些不对称的样品也能获得比较高的分辨率，所以冷冻电镜三维重构在其它蛋白质的结构分析研究上也比较热。 　　Instrument：冷冻电镜技术应用的难点有哪些?要让冷冻电镜更好的在科学研究当中发挥作用，需要哪些积累? 　　朱平：冷冻电镜的操作程序比较多，入门和上手都有一定的难度。先从制样来说，单冷冻这一步，就有许多的玄机在其中。冻的冰层太厚，电子束穿不过去，冰层太薄又会被完全蒸发 而冷冻的速度如果慢了就会形成冰晶，冰晶遇到电子束发生衍射，我们就无法观察到样品 此外，环境的变化，如空气的温度和湿度变化，甚至每次使用的滤纸如果不同都会对制样效果有影响。 　　在照片的拍摄中，要调节好电镜的状态，掌握照相的细节，这样才能拿出一张好的二维冷冻电镜照片。如，电子束照射在样品表面时，如果调节不好很可能就把样品轰坏了。所以需要调焦，找准位置，然后慢慢放大。得到好的二维照片后，接着还有一大堆的图像处理工作。 　　当然现在软件自动化程度更高了，仪器的操作也比以前容易了。比如制样，有专门的制样设备，通过计算机控制温度、湿度、滤纸吸收的时间长短，使制样的可重复性高了很多。不过要使用好电镜，还是有许多的经验在其中。北京大学丁明孝老师正在组织国内优秀的专家撰写一部电镜实验操作手册，虽然这本书以普通电镜为主，但其中至少会有一章来介绍冷冻电镜的基本情况，以及如何使用好冷冻电镜，希望更多的人了解这一技术。 　　Instrument：请问目前我国冷冻电镜的研究和应用水平怎么样? 　　朱平：近年来，为推动我国生物学快速发展，国家不断加大投资力度。一方面引进了不少人才，另外在仪器配置方面，我国不少单位已经或将要建设国际一流的冷冻电镜设备平台，如清华大学、生物物理所、北京大学、上海生命科学研究院等。 　　其实十几年前，我们就有很多优秀的电镜人才，只是国家没有这么大的投入。就是在&ldquo 小米加步枪&rdquo 的条件下，他们也做的非常好。现在我们的高端电镜配置已在世界前列，但人才依然是最重要的，目前国内在冷冻电镜研究方面确实也没有那么多的人才，希望有更多的年轻人被培养出来。 　　科学的竞争也很残酷，团队合作才能走得更快更远 　　Instrument：最后，请问对于在高水平期刊上发表文章，您有哪些心得体会，以及团队合作在科学研究当中的重要性。 　　朱平：一是要有好的项目，好的科学问题 二要有好的设备 三要有好的团队 最后还要坚持。首先要敢于挑战科学难题，另外也要敢于面对挑战中的困难，要耐得住性子去做，要有长时间做不出来的准备。我们这个项目，前后花了5年时间，期间遇到了很多的困难。 　　在30nm染色质结构解析研究中，不同的研究组分工合作，发挥各自的特长也是我们这个项目的重要特点。在我们的研究当中，染色质样品的组装非常重要，我们需要均一的样品，否则电镜状态再好，再会调节操作和计算处理，也无法获取样品真正的结构信息。 　　我对组装染色质样品没有太多的经验，而李国红老师长期从事30nm染色质及表观遗传调控方面的研究，但冷冻电镜三维重构也需要一个较为长期的积累和经验，面对30nm染色质这么一个复杂的超大分子复合体，其结构解析有很多技术上的困难和挑战，若要让李老师重头来学电镜也不是很容易的事。还有许瑞明老师参加了我们很多的项目讨论，给了我们很多的鼓励，这也很重要。 　　科学的竞争也很残酷，我们知道世界上还有其他的团队也在做同样的研究，而我们能够先做出来，一个重要的因素就是我们是几个团队一起在做。 采访编辑：秦丽娟 　　附录：朱平研究员个人简历 　　1986.9-1990.6 浙江大学 学士 　　1990.9-1993.6 西安交通大学 硕士 　　1993.9-1997.6 清华大学 博士 　　1997.7-1998.12清华大学 讲师 　　1999.3-2008.5 美国佛罗里达州立大学生物系 博士后、助理研究员、副研究员(Non tenure-track faculty系列) 　　2008.6-至今　 中国科学院生物物理研究所课题组长、&ldquo 百人计划&rdquo 研究员

美国《国家科学院院刊》(Proceedings of the National Academy of Science, USA)1月10日在线发表了中国科学院生物物理研究所朱平研究组程凌鹏副研究员等人的研究论文——Atomic model of a cypovirus built from cryo-EM structure provides insight into the mechanism of mRNA capping。该发现对研究dsRNA病毒的mRNA加帽(Capping)机制有重要意义。这是我国首次利用冷冻电镜技术解析的生物大分子原子结构模型，也是目前已报道的国内最高分辨率的冷冻电镜三维重构结果。同时，这是世界上首次利用冷冻电镜的CCD图像(电荷耦合器件图像传感器，可将图像资料由光信号转换成电信号)获得的生物大分子复合体的全原子模型。 　　本工作是完全基于生物物理所生物成像技术实验室2010年4月建成并试运行的Titan Krios电镜及其附属设备完成的，用单颗粒图像处理技术获得了呼肠孤病毒科的质型多角体病毒近原子分辨率的三维结构(3.9埃)，并独立构建了全原子模型。呼肠孤病毒科病毒是一类重要的双链RNA病毒，其感染宿主包括植物、无脊椎动物、脊椎动物和人类，其中的质型多角体病毒是其两个亚科之一。该研究解析了呼肠孤病毒科质型多角体病毒的近原子分辨率三维结构并构建了完整原子模型，确认了该病毒新生mRNA的流出通道，对研究双链RNA病毒的RNA加帽机制，新生mRNA的释放过程，以及呼肠孤病毒的蛋白衣壳的稳定性和进化具有重要意义。 　　中国科学院生物物理研究所在中国科学院蛋白质科学研究平台二期建设当中重点发展了生物大分子冷冻电镜三维重构研究平台，已经建成了具有世界先进水平的生物成像技术实验室，拥有目前最先进的300千伏Titan Krios场发射冷冻透射电子显微镜。该成果表明：我国独立开展的生物大分子冷冻电镜高分辨率研究工作达到了该领域的先进水平 和2010年10月孙飞研究组以封面形式发表于Structure的分子伴侣素结构等系列成果表明：中国科学院蛋白质科学研究平台生物成像技术实验室的成功建立，为进一步开展冷冻电子显微前沿研究奠定了坚实的基础，生物物理所生物成像技术实验室已跻身于达到近原子分辨率三维重构水平的极少数实验室行列。 　　本工作得到基金委国家自然科学基金、科技部国家重点基础研究973计划、以及中国科学院百人计划等项目资助，该文章链接为http://www.pnas.org/content/early/2011/01/05/1014995108。 　　该研究由中国科学院生物物理研究所生物大分子国家重点实验室朱平研究组和孙飞研究组、华南农业大学孙京臣副教授和中山大学张景强教授等合作完成。其中，生物物理研究所朱平研究组程凌鹏副研究员完成了冷冻电镜成像和结构解析等工作，黄晓星助理研究员协助完成了病毒纯化工作，孙飞研究组研究生张凯协助完成了原子模型构建工作，生物成像中心电子显微镜平台高级工程师季刚博士提供了电镜成像技术支持。 　　 　　图片说明：质多角体病毒CPV的冷冻电镜图像(左上)和质型多角体病毒衣壳三维重构(中)。重构结果中彩色部分为组成该病毒的最基本的非对称结构单元。右图展示该非对称单元的放大图(右上)以及构建的原子模型(右下)。左下图展示的是部分氨基酸的三维重构电子密度图以及构建的原子模型，可以很清楚地看见氨基酸侧链。

日前，4台高端冷冻电镜顺利进驻无锡佰翱得生物科学有限公司。至此，江阴企业佰翱得坐拥8台冷冻电镜，其中包括3台国际最先进的第四代冷冻电镜Titan Krios，一举成为全球最大商业冷冻电镜服务供应商。图自佰翱得冷冻电镜国际创新中心（笔者注：佰翱得早在2012年，就拥有当时最完善的室内晶体衍射平台。为适应全球结构解析需求，2018年，采购了一台200kv的TF20冷冻电镜，大大提高了样品优化的效率。 在2020年，为进一步整合上下游能力加速研发，采购了最新一代的300kv的冷冻电子显微镜，此时，平台的冷冻电镜数量为4台。日前，二期佰翱得冷冻电镜平台的4台冷冻电镜（2台Krios G4、1台Glacios、1台120Kv冷冻透射电镜）顺利入驻，平台冷冻电镜数量达到8台）冷冻电镜技术于2017年摘得诺贝尔化学奖，是指不需要晶体就能在原子分辨率水平上解析药靶结构的新崛起技术。经过4年沉淀，佰翱得成功把冷冻电镜SPA和MicroED两大技术应用到新药研发过程中，可为国内外生物医药企业提供药靶蛋白制备、生物分析与化合物筛选、复合物晶体结构与冷冻电镜结构解析，以及结构模拟、三维结构计算、化合物虚拟筛选等计算结构生物学技术服务，大幅加速“源头创新”新药研发进程。据了解，由于拥有国际领先的蛋白制备平台，佰翱得冷冻电镜技术具备得天独厚的技术优势，促使该企业实现了多项行业领先：2017年在国内率先筹建商业化冷冻电镜平台；2018年引进国际顶尖的冷冻电镜专家，打造国际领先科学团队；2019年装备了中国生物医药工业界第一台冷冻电镜设备，成为全球首家推出从基因到冷冻电镜结构一体化服务的标杆企业。无锡佰翱得生物科学有限公司由双良集团与多名拥有国际药企工作经历的海归科学家联合创立，截至目前已为近200家国内外客户的超过3000个新药研发项目提供服务。