质谱非标记定量

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Improved Label-Free Quantification of Intact Proteoforms Using Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry [1]，文章的通讯作者是美国俄克拉荷马大学的Luca Fornelli教授。完整proteoforms的非标记高通量定量方法的应用对象通常为从整个细胞或组织裂解物中提取的0 - 30 kDa质量范围内蛋白质。然而当前，即使通过高效液相色谱或毛细管电泳实现了proteoforms的高分辨率分离，可鉴定和定量的proteoforms的数量也不可避免地受到固有的样品复杂性的限制。近年来，随着质谱技术的发展，自上而下蛋白质组学质谱(top-down proteomics)研究中蛋白质的鉴定数量大大提升，生成了包含数万种proteoforms的数据集，但在proteoforms的量化能力方面并没有得到相应的性能提升。为克服这一问题，本文中作者通过应用场不对称离子迁移谱法(Field asymmetric ion mobility spectrometry, FAIMS)对大肠杆菌中的proteoforms进行了非标记定量。由此产生的改进允许在单次LC-MS实验中采用多个FAIMS补偿电压(Compensation voltages, C.V.)，而不会增加整个数据采集周期。与传统的非标记定量实验相比，FAIMS的应用在不影响定量准确性的情况下，大大增加了鉴定和定量的proteoforms数量。首先，作者优化了质谱stepped-C.V.数据采集方法对Orbitrap Eclipse性能的影响，并从中筛选出了最优条件(−40、−20、0 V组合)。所有最新的基于Orbitrap的质谱仪(包括Exploris platform和Orbitrap Ascend)都可以采用single time-domain transients(即单次微扫描)在top down FTMS实验中生成高质量的质谱图。作者认为这对于在单次LC - MS2运行期间应用多个C.V.值的采集策略特别有益。接下来，作者应用该方法对大肠杆菌中的蛋白质进行了检测，并与传统的LC - MS2 DDA采集方法进行了比较(图1)。如图所示，每个C.V.值下的总离子流图都不同，且这一额外的分离导致在LB(Luria broth)和M9(醋酸钠处理)样品中鉴定到的proteoforms的数量显著提升。　　图1. 样本制备方法和proteoforms鉴定结果总结虽然在LC-FAIMS和LC-only数据集中，大多数鉴定到的proteoforms质量都小于15 kDa，但其中约20%的质量大于18 kDa甚至高达33.3 kDa(图2)。对已鉴定的proteoforms列表的深入分析表明，达到鉴定低丰度proteoforms的关键参数之一是在串联质谱(MS2)中有足够的时间注入离子。　　图2. A. FAIMS和非FAIMS鉴定到的proteoforms的质量分布。B. 鉴定到的proteoforms与注射时间之间的关系。最后，作者采用ProSight PD v 4.2 (Proteineous, Inc)进行了基于MS1的非标定量，结果显示基于FAIMS的数据集在LB样品(蓝色)和M9样品中检测到的差异表达的proteoforms均有所增加(图3)。作者评估了两个数据集之间的差异(使用和不使用FAIMS采集数据)，以验证FAIMS的应用是否会对量化准确性产生不利影响，结果只有1个proteoform显示相互矛盾的丰度趋势。这种差异是由于该蛋白和一个共流出蛋白之间质谱峰几乎完全重叠造成的。它们具有非常接近的单同位素质量，这样高水平的信号干扰可以很容易地干扰基于MS1的量化。启用FAIMS可以使MS1谱图简化，因为两种proteoforms可以富集在两种不同的C.V. 值下。　　图3. 大肠杆菌proteoforms无标记定量结果分析。作者将LC - FAIMS - MS2数据集与通过BUP在类似样品上获得的非标定量结果进行比较，得出两个主要的结论:1. BUP仍然对蛋白质组提供了更深层次的定量表征 2. BUP提供了与单个基因相关的所有产物的整体丰度水平信息 而TDP方法表明，给定的UniProt accession可以由多个差异表达的proteoforms组成，可能具有不同的行为(即在给定条件下，一些被上调，另一些被下调)。这一额外的信息可能具有潜在的生物学意义，但在基于BUP的定量分析中可能会被遗漏。本文描述的基于FAIMS的定量数据采集方法与PEPPI(Passively eluting proteins from polyacrylamide gels as intact species)蛋白分离技术完全兼容，产生0 - 30 kDa的组分，并且可以方便地根据待分析蛋白的平均质量调整质谱参数(C.V.值)，未来在更大的蛋白质定量方面具有广阔的应用前景。　　撰稿：张颖　　编辑：李惠琳　　原文：Kline JT, Belford MW, Huang J, Greer JB, Bergen D, Fellers RT, Greer SM, Horn DM, Zabrouskov V, Huguet R, Boeser CL, Durbin KR, Fornelli L. Improved Label-Free Quantification of Intact Proteoforms Using Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry. Anal Chem. 2023 Jun 13 95(23):9090-9096.　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　1.Kline JT, Belford MW, Huang J, Greer JB, Bergen D, Fellers RT, Greer SM, Horn DM, Zabrouskov V, Huguet R, Boeser CL, Durbin KR, Fornelli L. Improved Label-Free Quantification of Intact Proteoforms Using Field Asymmetric Ion Mobility Spectrometry. Anal Chem. 2023 Jun 13 95(23):9090-9096.

生物分子间相互作用是所有生命现象发生的基础。研究分子互作可以阐明生物反应的机理，揭示生命现象的本质，同时也为新型生物药开发的靶点发现提供可靠依据。常见的分子互作分析技术依据样品处理方式可以分为“标记“技术和“非标记”技术，前者通常需要对其中一个结合分子进行酶、荧光、化学放光或同位素标记，且大部分标记方法仅能定性分析是否结合，无法准确测定结合亲和力大小。根据检测方式则可分为“终点法”和 “实时动力学”，“实时动力学”能够定量分析结合（kon）和解离（koff）过程，并提供完整动力学分析。随着科学研究的不断深入，实时、非标记的分子互作分析技术已成为中流砥柱。常见的分子互作分析技术及分类常用分子互作分析技术依据样品处理方式依据分析结果生物层干涉BLI非标记实时分析表面等离子共振SPR非标记实时分析等温滴定量热ITC非标记终点法微量热泳动MST标记终点法免疫共沉淀Co-IP标记终点法Pull Down标记终点法ELISA标记终点法等Octet®分子互作分析平台：精益求精，灵活多元Octet® 是将BLI技术应用于分子互作检测的开创者和引领者。自2005年上市至今，Octet®凭借快速、高通量、操作简便、应用广泛以及性能稳定等特点受到用户的青睐。2020年，Octet®正式成为赛多利斯旗下品牌，全新升级的Octet® R系列正式上市，除了秉承高性能、高灵敏的特点外，进一步增强仪器灵活性与用户友好性。同年，BLI技术被收录于美国药典（USP1108），作为药物结合活性分析的标准方法之一。BLI技术是一种非标记技术，通过监测生物传感器表面的生物分子结合所带来的生物层厚度变化来检测分子间相互作用的动力学变化或浓度数据。独特的”浸入即读”式的生物传感器设计，可对各种纯化及粗样品直接进行检测，无需对检测样品做任何标记，也不存在流路系统，从而实现更简便、更快速的定量分析。今年五月，赛多利斯全新推出基于表面等离子共振（SPR）技术的分子互作分析仪Octet® SF3。通过采用创新的梯度进样技术，提供了一个更加稳定、高通量、低维护成本的SPR分析方案。相比传统多浓度循环或单循环动力学分析具备诸多优势。该产品同样为用户进行高通量的药物筛选分析提供了非常好的工具。赛多利斯立足行业需求，全面打造多元化Octet®非标记分子互作分析平台，为科研人员提供更灵活、更简化、更综合的分子互作解决方案，迎合全球范围内对生物创新药研发的需求。截至目前，文献应用超过10,000篇，Cell、Nature及Science正刊超过300篇。比广泛更广泛的应用，是灵活的可开发性熟悉分子互作的朋友一定知道Octet®最大的特点就是灵活和多功能。Octet®不仅仅是一个分子互作检测工具，更是结合动力学、稳态亲和力、浓度定量和表位分析于一体的多功能蛋白分析平台，被广泛应用于细胞、病毒、抗体蛋白、多肽、小分子、核酸等各类生物分子的互作分析中。除了首屈一指的蛋白/抗体互作外，Octet®在诸多生命科学研究领域中表现优异，比如：■ 多分子蛋白功能调控■ 病毒学相关研究■ 化合物或天然产物筛选及验证■ 食品及微生物毒素检测（欧盟委员会条例519/2014/EC规定的真菌毒素筛选分析方法）■ 垂钓未知分子■ 血清、细胞上清、裂解液、组织液等粗样品直接检测■ 结构生物学■ 肿瘤机理及发病机制■ 医学与免疫学■ 植物生长调控，等等作为药物发现与开发的必备工具，Octet®提供贯穿生物药开发的全流程应用方案：从靶点发现，到先导化合物筛选与表征，再到 PK/PD/免疫原性及蛋白稳定性分析，以及工艺优化（如细胞株开发及残留物分析等），以至最终的QC放行。创新应用开发助力未来科研和下一代生物医药开发广泛的应用基于成熟的方法学，而最大的成就来自于用户源源不断的创新应用开发。这也让我们看到了Octet®在未来科研和下一代生物医药开发中应用的潜力。不久前，人工智能（AI）蛋白质设计大师David Baker教授开发出蛋白质复合结构预测工具RosettaFold，实现了从头设计功能性蛋白分子，为AI药物设计与开发带来新的革命。David Baker教授在多篇CNS文章中都用到Octet®检测体外设计蛋白的亲和力，其中包括最强的新冠病毒抑制剂设计。AI模拟可以大大增加效率并提高蛋白结构检测准确性，Octet®的易用性以及高通量可以作为有力的验证性工具助力AI药物研究。此外，Octet®在单抗，双特异性抗体，抗体偶联药物（ADC），小分子与多肽药物，疫苗开发等研究中都有诸多应用。目前已经有数十种药物采用Octet®相关数据进行药物申报，涵盖研发、筛选、质量属性表征、质控分析及定量等各个不同阶段。这极大地促进和推动了国内外相关生物制药和生物技术公司的成长和进步，以及药物商业化上市地步伐。此外，在药物研究方面，垂钓未知分子也是其独具特色的应用之一。如西南医科大学的研究人员将Octet®与高分辨质谱联合使用，以β-淀粉样蛋白（Aβ）作为诱饵来垂钓中药复方开心散（由远志、人参、茯苓和石菖蒲这4味中药组成）中可以与Aβ相互结合的潜在小分子抑制剂。将收集到的解离液应用高分辨质谱进行分析并鉴定，发现去氢土莫酸（DTA）、猪苓酸C（PPAC）和土莫酸（TA）三个化合物与Aβ有着最强的结合力。通过色谱分离制备出这三个化合物后，然后在阿尔茨海默病（AD）的细胞和线虫模型上对这些化合物的抑制Aβ纤维形成的活性进行了评价，最后确认这些化合物在体内外均有很好的抑制Aβ纤维形成的活性。Octet®的灵活性是其最大的特色，立足行业和客户需求打造多元化分子互作平台，开发创新性应用方案，旨在提供便捷、高效的研究工具以适应未来的研究挑战。最后，需要强调的是，经过多年来的积累和沉淀，赛多利斯Octet®团队已经成为行业内公认的技术标杆，可以为客户提供全面的、强有力的、高效的支持和服务，助力广大用户的基础研究和开发生产等工作。

microRNA是近年来发现的一种单链的短链RNA，长度约22个碱基，在动植物及人类中广泛存在，与发育、分化、凋亡、脂肪代谢、病毒感染和癌症等多种重要生物学过程有密切的联系，并显示出作为癌症、心血管等重大疾病等方面的新的分子标记物的巨大潜力，是近十年来的一个研究的热点。对microRNA表达谱进行高通量、低成本的检测对于该领域的发展具有重要的意义。 　　中科院苏州纳米技术与纳米仿生研究所李炯课题组与生物物理所阎锡蕴课题组合作，首次实现了高通量microRNA芯片的非标记检测，而其他芯片和测序技术需要数小时的手工操作才能完成标记，从而大幅度降低了检测的标记时间和成本。 　　与其他商业化microRNA芯片技术相比，该技术还具有如下独特的优势：1. 高灵敏度，由于减少了标记带来的损失，仅用100ng的总RNA就可以得到较好的结果 2. 完美识别前体microRNA，解决了芯片技术在这方面的缺陷，因此无需纯化小RNA，可以直接使用总RNA，减少了实验的操作步骤 3. 可以对microRNA链中的中间或者是两端的单碱基错配都能有效识别，这也是其他芯片技术无法实现的 4. 可应用于植物microRNA表达谱检测。植物microRNA在3'端普遍存在甲基化的问题，对于主流的酶标记方法来说效率很低(~10%)，因此多数芯片技术无法直接应用于植物microRNA表达谱的检测，测序技术在文库构建的时候也会受到类似的影响，少数公司则采用了非主流的化学标记的方法。而该技术基于核酸杂交，完全不受甲基化的影响。另外，该技术无需特殊设备，常规的芯片制作和扫描设备就可以应用，从而最大程度地减少了进入市场的难度。 　　即使与现在发展迅猛的测序技术相比，该技术对于microRNA表达谱检测在通量(大量样品)、成本、灵敏度以及后续的数据分析等方面仍然具有明显的优势。该工作近期发表于Nucleic Acid Research杂志上。(原文链接) 　　目前，研究人员正努力标准化该技术，为其尽早进入市场铺平道路。 　　此项工作得到中科院和国家自然科学基金委的大力支持。 　　图1. 高通量microRNA非标记检测原理示意图 　　图2. 选择性

赛多利斯全新推出Octet® SF3——Octet® 系列首个基于表面等离子共振（SPR）技术的分子互作分析仪。至此，Octet® 系列产品可以同时提供两种成熟的非标记分子互作分析技术：生物层干涉（BLI）和表面等离子共振（SPR），全面打造多元化非标记分子互作分析平台，提供更灵活、更简化、更综合的分子互作解决方案，迎合全球范围内对抗体片段表征、疫苗研究和药物发现的需求。作为新一代SPR分子互作分析仪，Octet® SF3从技术原理、仪器性能、操作便捷度等方面进行了全面升级优化。无论是分析小分子还是大分子，都具有出色的灵敏度、极低的基线噪音和漂移。并且采用创新的OneStep® 和NeXtStep™ 梯度进样技术，相比普通多循环或单循环动力学分析技术，用户能够在更短的时间内生成高质量的动力学和结合亲和力数据。搭配用户友好设计的软件，提供了一个稳定、高通量、低维护成本的SPR分析方案，能够快速表征多种生物分子的相互作用。Octet® SF3 关键优势稳定、维护成本低先进的流路系统和优化的电器设计显著降低了仪器故障和堵塞的可能性，大幅缩短仪器停机时间，从而提供可靠、高质量的数据。高通量在单次无人值守检测中为多达768 个样品生成完整的结合动力学和亲和力数据。可实现连续72h的无人值守分析，单次运行即可对数百个样品进行高通量采集和分析。OneStep® 进样技术无需制备多个稀释梯度，从而简化实验开发和操作。只需简单制备一份待分析样品溶液，即可自动为动力学和亲和力分析创建一个完整的浓度梯度。竞争分析使用NeXtStep™ 进样技术，从单一分析物浓度确定分析物在多个竞争分子存在的情况下的完整动力学和亲和力。应用广泛广泛的动力学速率常数范围，高精度数据分析使您能够自信地进行各类生物样品的高灵敏度相互作用检测。Octet® SF3 兼具创新与效率的进样设计OneStep® 进样技术两种标准进样模式：OneStep® 进样和标准多循环动力学 (MCK) 方法；无需配置多个分析物浓度梯度，可以节省时间、试剂和孔板空间；能够将单一浓度的分析物扩散到大量缓冲液中，自动产生三个数量级的分析物浓度梯度；能够使用单一浓度的分析物准确测定分子动力学和亲和力。NeXtStep™ 梯度进样通过单次进样测定分析物在竞争分子存在时的活性；在一次分析中评估多种分析物和竞争分子，且无需将竞争分子添加到流动缓冲液中；清楚确定完整结合动力学曲线、亲和力和位点特异性竞争，其中位点特异性竞争是指在竞争分子存在时对结合活性的影响。高通量样品采集在单次无人值守的分析中可生成 768 个样品的完整动力学和亲和力数据；OneStep® 进样技术：Octet® SF3 可实现连续72h无人值守分析，得益于独特的样品排列方式，能在一次分析中对数百个样品进行高通量采集和分析，非常适用于高通量文库筛选。Octet® SF3 优化升级的硬件设施1 更大的缓冲液体积- 可容纳三个 1 升试剂瓶，包括一条水线和两条缓冲液线；- 独立运行的缓冲液线，可在分析期间使用两种流动缓冲液；- 专用水线，避免缓冲液沉淀和堵塞风险。2 优化的液路系统- 全面优化设计的液路系统，消除堵塞风险；- 配置的除吸附、清洁和去污方案可确保最长的系统开机时间；- 新颖的流路设计造就了其强大、稳定、低维护特性。3 高效样品回收- 回收珍贵样品以作进一步分析，快速缩短工作流程时间 ；- 可使用预定义样品回收进样来回收结合的分析物；- 可以将此分析物再用于其他分析实验，确保数据一致性。4 热力学和生理学检测- 可在较大温度范围内研究相互作用，并且可在生理温度下快速评估治疗药物的动力学和亲和力；- 对缓冲液进行在线脱气可防止气泡产生；- 结合使用大容量注射器 (700 µL) 可准确计算解离速率常数。Octet® SF3 简便易用的软件使用Octet® SPR 分析软件可轻松分析系统上记录的高质量数据。1 便捷的实验设置直观的“拖- 放”展示简化实验设计。Octet® SPR Discovery 能够快速定义样品参数、创建通用或独立的样品流速、添加进样量和数据点，可最大限度地延长仪器的运行时间。2 快速的数据分析Octet® SPR Analysis 软件使用统一的方法筛选活性样品，并允许对不同日期和不同仪器的筛选数据进行标准化，可快速比较整个筛选活动。将后期处理时间从几天缩短至几秒钟。提供了结合动力学、亲和力、物质迁移校正以及多点结合的模型。初步筛选数据即可用于KD 分析，而无需执行费力、耗时且可能容易出错的二次筛选。3 轻松的系统维护Octet® SF3 的维护基本无需投入精力和时间，因而加速并简化数据集成和分析流程。总结在非标记蛋白分析领域，BLI和SPR技术作表征生物分子相互作用动力学的两种强大技术，一直占据主导地位。Octet® 非标记平台能够为用户提供基于BLI或者SPR技术的两种解决方案，简化分子互作分析流程，进一步巩固了赛多利斯在非标记生物分析领域的领域地位。

肿瘤细胞凋亡与癌症的发生、发展、死亡密切相关，对药物诱导的肿瘤细胞凋亡进行检测，可以作为药物筛选以及判定抗肿瘤药物治疗效果的依据，在肿瘤治疗中发挥着重要作用。细胞色素c(Cyt c)是细胞凋亡早期信号的重要标志物，在癌细胞的凋亡进程中起到关键作用。通过监测细胞凋亡进程中Cyt c的释放水平，有助于从细胞水平上了解相关疾病，并实现对抗癌药物的初步评价。荧光成像技术在生物活性物质的实时-动态-可视化检测等方面扮演着重要角色，被广泛应用于生物、医疗、临床诊断等诸多领域。然而，能够精准识别细胞内Cyt c释放水平的荧光成像分析方法目前还十分匮乏。　　近日，在国家自然科学基金项目(编号：21475142, 21675164, 21650110454)、甘肃省自然科学基金项目(编号：1506RJDA281, 17JR5RA311)和中科院“一三五”重点培育项目的资助下，中国科学院兰州化学物理研究所邱洪灯研究员带领的“百人计划”研究团队，利用Cyt c对氮掺杂碳量子点(N-doped CDs)的荧光淬灭效应，建立了一种简单、快速、灵敏的新型非标记Cyt c传感器(图1)。该探针可用于依托泊苷(市售抗癌药物)作用下HepG 2细胞内Cyt c释放含量的检测与成像，并首次实现了斑马鱼体内Cyt c的成像分析。图1. 肿瘤细胞内Cyt c的释放与检测原理示意图　　在此基础上，通过考察不同天然产物如紫草素(Shi)、藤黄酸(GA)、杨梅素(Myr)、二氢杨梅素(Dmy)和白皮杉醇(Pic)等作用后肿瘤细胞内Cyt c的释放水平，实现了对系列抗肿瘤药物先导分子的初步筛选(图2)。该研究表明，Shi和GA对HepG 2细胞具有较强的抗肿瘤活性，有望在肿瘤治疗中发挥作用。该研究工作为细胞凋亡早期信号的检测与抗肿瘤药物的筛选提供了新策略。相关工作发表在Nanoscale, 2018, 10, 5342-5349上。图2、不同天然产物作用下HepG 2细胞内Cyt c共聚焦显微荧光成像分析

赛多利斯Octet® 系列产品可以同时提供两种非标记分子互作分析技术：生物层干涉（BLI）和表面等离子共振（SPR）。§ 作为新一代基于SPR技术的分子互作分析仪，Octet® SF3从技术原理、仪器性能、操作便捷度等方面进行了全面升级优化，实现了更稳定、更高通量的生物分子互作分析，提高了自动化程度，并且降低了仪器维护和实验成本；§ 凭借独特的OneStep® 进样技术，不再需要手动配制浓度梯度。 生命科学集团赛多利斯正式推出全新的SPR分子互作分析仪Octet ® SF3，这是Octet® 旗下首个基于表面等离子共振（SPR）技术的分子互作分析系统。此前，Octet® 系列产品一直以其生物层干涉（BLI）分析系统被业界熟知，作为专业的无流路互作分析工具，Octet® BLI被广泛应用于实时、非标记的分子间相互作用分析。此次发布的Octet® SPR系统，使赛多利斯成为拥有两种非标记分子互作技术（BLI和SPR）的业界公认品牌。 "Octet® BLI和Octet® SPR分别具备独特优势，确保赛多利斯继续推动非标记蛋白分析市场的创新，"赛多利斯生物分析产品经理Darius Wilson博士说，“研究人员可以在他们熟悉和信任的品牌下灵活地选择两种成熟的技术。” 无论是分析小分子还是大分子，Octet® SF3都具有很强的灵敏度、非常低的基线噪音和漂移，并且其采用了新颖的OneStep® 和NeXtStep™ 梯度进样技术，相比普通多循环或单循环动力学分析技术，用户能够在更短的时间内生成高质量的动力学和结合亲和力数据。Octet® SF3与其数据分析软件搭配使用，提供了一个稳定、高通量、低维护成本的SPR解决方案，能够快速表征多种生物分子的相互作用。 “Octet® SF3为研究人员提供了一系列强大的硬件性能，包括高灵敏度、延长的解离时间以及超过72小时的无人值守，” Darius博士介绍到，"当然，Octet® SF3的能力不仅局限于个别硬件功能，多样化的进样方式满足所有类型的分子互作研究，这使其更具有魅力。" 从行业标准的多循环动力学，到 OneStep® 、OneStep® Two Comp、OneStep® Pulse和NeXtStep™ 梯度进样，Octet® SF3为所有研究应用和检测提供了动力和准备。OneStep® 进样技术消除了配制多个分析物浓度梯度的繁杂操作，只需准备一个分析物溶液就能自动创建一个完整的浓度梯度，简化动力学和亲和力分析。NeXtStep™ 进样技术可以用于竞争分析，通过单一的分析物浓度，用户即可轻松确定该分析物在多个竞争分子存在条件下的全部动力学和亲和力。 "所有化合物在特定的压力条件下都会有不同的表现。" Darius说：“因此，任何SPR平台都必须有能力以 简单和快捷的方式准确评估这些差异，Octet® SF3可以轻松做到这一点。“为了迎合全球范围内对抗体片段表征、疫苗研究和药物发现的需求，持续的技术突破至重要，它帮助我们将初始的数据转化为可行的研究见解。在非标记蛋白质分析领域，BLI和SPR技术作表征生物分子相互作用动力学的两种强大技术，一直占据重要地位。Octet® 非标记平台能够为用户提供基于BLI或者SPR技术的两种解决方案，简化分子互作分析流程，这进一步巩固了赛多利斯在非标记生物分析领域的地位。了解更多Octet® SF3的信息，请查看赛多利斯官方网站关于赛多利斯：赛多利斯集团是生命科学研究和生物制药行业的国际合作伙伴。该集团的实验室产品与服务板块提供创新型实验室仪器和耗材，致力于满足传统制药和生物制药公司以及学术科研机构旗下科研和质量控制实验室的需求。生物工艺解决方案板块拥有广泛的产品组合，专注于一次性解决方案，助力客户安全高效地制造生物技术药物和疫苗。集团保持两位数的年均增长速度，并积极收购互补技术，以扩展其产品组合。据初步数据，集团于2021财年实现了约34.5亿欧元销售收入。截至2021年底，赛多利斯约60个生产和销售基地总计雇佣近14,000名员工，为全球客户提供服务。

单克隆抗体(mAb)是制药行业增长最快的治疗方法之一，mAb的高阶结构(HOS)影响药物与靶标的结合特异性，从而影响治疗效果和副作用。若储存而导致HOS发生变化，例如蛋白质错误折叠和聚集，会导致稳定性降低、功效丧失或可能的免疫原性。因此，监测HOS对保证mAb疗法的有效性和安全性至关重要。X射线晶体学和核磁共振(NMR)光谱可以提供原子级分辨率，但存在费时费样品的缺点；生物物理技术，如差示扫描量热法(DSC)、动态光散射(DLS)、荧光光谱、红外(IR)光谱和圆二色(CD)光谱只能提供低分辨率的整体构象。焦碳酸二乙酯(DEPC)作为亲电子试剂能够修饰溶剂可接近的亲核侧链（Cys、His、Lys、Thr、Tyr、Ser）和蛋白质的N末端，这些残基产生的羧基化产物具有+72.021Da的质量转移，经过蛋白水解消化、液相色谱分离和串联质谱分析后，可以识别和半定量特定的蛋白质修饰位点。将一种条件（例如天然）与另一种条件（例如加热）进行比较时，特定残基处共价标记程度的变化可用于探测蛋白质的HOS变化（图1）。在这篇文章中，作者使用DEPC共价标记联用质谱，以利妥昔单抗作为单抗药物的模型，以期在远低于mAb治疗药物熔点的温度下能够特异性检测细微HOS变化，并通过活性测定进行验证。图1. DEPC 标记与质谱联用分析单抗药物结构的流程在通过共价标记研究热应力（heat stressed）利妥昔单抗之前，作者使用CD光谱、荧光光谱和动态光散射(DLS)来识别加热对蛋白质结构的干扰。发现当在低于其熔点的温度下加热利妥昔单抗4小时时，这三种技术在45°C或55°C时无法检测到显著的结构变化，而在65°C时仅显示出轻微的变化。随后作者团队使用DEPC CL-MS探测利妥昔单抗的细微结构变化。在45°C压力下的利妥昔单抗样品中发现DEPC标记水平的变化较少，大多数变化是由于蛋白质受热去折叠导致的标记增加（图2），且可变区的变化远少于恒定区。超过70%的标记变化发生在Tyr、Ser和Thr残基处，而发生在His和Lys残基处的标记变化始终小于20%。标记变化表明，45°C时的结构变化主要是局部微环境的变化，而非溶剂可及性差异显著的大结构变化，也就是说修饰位点分散在整个蛋白质结构中，而不是集中在蛋白质的某些区域。图2. 45°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。活性测定能反映一定程度的结构变化对利妥昔单抗活性的影响，从而验证DEPC标记结果。桥接ELISA的结果表明，在预热至45°C后，利妥昔单抗的Fc结合活性没有显著变化（图3a），Fc区域的CDC活性估计在45°C热应激后保持不变（图3b），利妥昔单抗的Fab结合活性估计与对照样品没有差异（图3c）。活性测定结果表明蛋白质在45°C时没有发生显著的结构变化。在Fab和Fc区域中标记变化的残基数量相对较少，主要标记对局部微环境变化更敏感的Tyr、Ser和Thr残基。修饰位点分散在整个蛋白质中，对Fab和Fc区域的构象几乎没有影响，与共价标记质谱联用的测定结果相吻合。图3.使用单抗活性测定验证CL-MS实验揭示的结构变化。Fc区的结构完整性通过(a)测量Fc与捕获抗体结合的利妥昔单抗桥接ELISA和(b)测量补体依赖性细胞毒性的Alamarblue测定来评估。Fab区域的结构完整性通过(c)Raji细胞下拉试验评估，测量Fab与B细胞CD20抗原的结合。55°C加热4h后利妥昔单抗所有结构域的残基修饰程度都发生了显著的变化，尤其是Fab区域的VH和VL结构域。（图4）加热至55°C时，His和Lys残基处发生的标记变化几乎是45°C的两倍，表明蛋白质在这些区域展开；Fab区域标记水平发生显著变化，特别是在VH、VL和CL域。这表明利妥昔单抗的Fab区域存在局部结构变化，据报道这也是IgG1分子中对热应激最敏感的区域。Fc区域中没有观察到类似的发生标记变化的残基聚集，Tyr、Ser和Thr处的大多数标记变化为中度或高度变化，这些结果表明蛋白质拓扑结构可能发生变化。图4. 55°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。尺寸排阻色谱(SEC)测量表明在65°C加热条件下存在高分子量物质。将DEPC CL-MS方法应用于65°C热应力的利妥昔单抗后，发现所有利妥昔单抗结构域的标记发生显著变化（图5），主要体现为标记的减少，这可能是因为蛋白质聚集。利妥昔单抗的Fab和Fc区均发现标记减少的残基簇，活性测定结果显示Fc结合和CDC活性的降低（图3），说明了Fc区特别是CH3结构域的标记变化，与DEPC标记结果一致。图5. 65°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。总结DEPC标记技术的结构分辨率和灵敏度足以探测细微的蛋白质构象变化，该技术与质谱联用可在低于Tm的温度下揭示利妥昔单抗中的细微HOS变化，与经典的生物物理技术互补。总体而言，鉴于CL-MS简便、灵敏的特点，该方法将适用其他抗体药物的结构研究。

沃特世公司（纽约证券交易所代码：WAT）近日在北京成功举办了以“质谱技术在蛋白表征及高级结构中应用”为主题的技术研讨会，吸引了60余位来自国家蛋白质组中心、中国食品药品检定研究院、中国科学院、清华大学、北京大学、军事医学科学院、中国农业科学院等知名高校、科研院所、分析测试平台及生物制药企业等相关领域的研究人员参加了会议。 研讨会的主旨为 “提升国内蛋白表征领域对蛋白高级结构研究的认知”，涵盖三大议题：蛋白药物深度结构表征所需要的质谱技术与生物信息学软件、氢氘交换（HDX）技术及IMS在结构生物学特别是表位学研究、蛋白质相互作用研究领域的最新进展及SONAR技术在蛋白质鉴定和非标记定量蛋白质组学研究中的进展。 会上国际知名学者、日本大阪大学副教授Susumu Uchiyama博士指出，氢氘交换质谱（HDX MS）逐渐成为蛋白质高级结构研究不可或缺的技术，并介绍了氢氘交换质谱技术及其在表位学和蛋白相互作用研究上的具体应用 。同时对其最近发表在Nature Communication上的题为《Haem-dependent dimerization of PGRMC1/sigma-2 receptor facilitates cancer proliferation and chemoresistance》论文的研究成果进行了汇报，获得了与会科研学者的一致高度评价。 日本大阪大学副教授Susumu Uchiyama博士做大会报告 沃特世（Waters® ）总部制药业务部高级市场拓展经理Asish Chakraborty博士对生物制药行业普遍关注的宿主蛋白残余测定进行了报告演讲，并介绍了使用通用型UPLC/MS分析对生物治疗性蛋白质中的HCP进行全面鉴定和定量。此分析方法采用在线二维液相色谱法分离多肽，然后利用高分辨率、高质量准确度的质谱仪进行蛋白质鉴定和定量。另外，Chakraborty博士对当前氢氘交换质谱方案的新进展也作了更新介绍。 沃特世公司总部Asish Chakraborty博士做大会报告 来自沃特世亚太区的高级科学家陈熙博士作了题为“非变性质谱技术及IMS行波离子淌度质谱技术在蛋白质高级结构研究上的应用进展”的精彩报告，介绍了行波离子淌度高分辨质谱技术在生物药分析上的最新应用进展，成熟的行波离子淌度分离技术为常规高分辨质谱增加了更多一个维度的分离能力，在蛋白质药物常规结构表征如二硫键错配、氢-氘交换质谱技术进行蛋白质药物高级结构和动态变化研究以及HCP(宿主细胞蛋白)残留的鉴定和定量上发挥着重要作用。 沃特世亚太区高级科学家陈熙博士做大会报告 沃特世中国应用科学家殷薛飞博士作了 “最新DIA质谱技术-SONAR在非标记定量蛋白质组学研究中的应用”的报告。殷博士介绍的 SONAR数据采集模式于今年9月发布，科学家们只需执行一次进样即可完成更准确的定性和定量分析，对复杂样品中脂质、代谢物和蛋白质的定量和鉴定，可免去采用MS/MS方法分析时通常需要额外进行方法开发的麻烦。 大会还邀请了来自美国Genentech的蛋白质化学部科学家甘雨田博士分享了她运用蛋白质组学思路进行生物药物研究开发的思路与实践，甘博士还介绍了她今年8月发表于Nature Biotechnology上的ISDetect快速自动蛋白末端质谱检测法，引起与会人员的强烈兴趣。 会议最后 ，沃特世中国生物制药高级经理宋兰坤女士作了“LC/MS平台化方案助力生物药研究开发”的报告，并对会议进行了总结。宋经理说：“质谱技术是蛋白质研究中不可取代的工具，其在蛋白质常规表征及高级结构研究中均有很好的应用方案及研究文献, 为揭示生命科学的奥秘发挥着越来越重要的作用。作为全球生物制药领域解决方案顶尖供应商，沃特世公司为生物药物产业界及蛋白质研究相关科学领域提供先进的仪器和技术。希望本次会议的议题可以激发与启迪科研工作者的思路，为生物药物产业的从业人员搭建一个学术讨论与经验分享的平台。 会议同期展出的蛋白科学研究先进生物技术墙报

仪器信息网讯 2010年11月5日，2010年全国有机质谱学术会议进入大会报告环节。大会邀请的10个大会报告涉及生命科学、食品、环境及能源等领域，其中6个报告关于蛋白质组学及磷酸化蛋白质组学研究，1个报告关于食品中外源性化学物质研究，1个报告关于新药早期临床研究，1个报告关于石油组学研究，1个报告关于MALDI质谱成像技术的新进展。 　　从大会报告分布的领域可以看出，蛋白质组学尤其是修饰蛋白质组学是目前有机质谱研究的热点及前沿 食品、药物等对于人们生命安全有重大影响的领域也是有机质谱的重要应用领域之一 而有机质谱最早应用的领域石油，在经历了数年的“沉寂”之后，再一次成为推动有机质谱技术发展的推动力。以下笔者对10个大会报告做简短的概述，以飨读者! 　　蛋白质组学及修饰蛋白质组学研究 厦门大学赵玉芬院士 　　如今，蛋白质组学研究在全世界各地如火如荼展开，但是据报道，在美国食品药品监督管理局(FDA)批准的蛋白质相关产品中尚无一例能够在临床上通过质谱方法检测蛋白质来诊断疾病的实例。中国科学院北京基因组研究所刘斯奇研究员(孙海丹博士代做报告)在报告中指出，为了使蛋白质组学真正应用到临床，随着质谱技术在扫描速度、质量精度、分辨率、裂解方式及定量动态范围等方面的改进，近几年来，蛋白质组学研究已有了如下改变：(1)从广谱蛋白质定性研究转向定量蛋白质研究 (2)从广谱研究转向以锁定特定目标物的蛋白质组学研究 (3)从蛋白质组研究转向转录后修饰蛋白质组研究。对于蛋白质的定量而言，有标记的定量方法和非标记的定量方法。标记的定量方法是指同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术 而无标记的定量方法则包括基于色谱峰面积定量方法、以及利用二级离子信号的强度进行的MRM(多反应监测)检测等。尤其是MRM检测以前在小分子方面应用很多，近几年也被广泛地应用于大分子检测上。去年在加拿大的HUPO会议上就是iTRAQ技术占主流，而在今年悉尼的HUPO会议上铺天盖地的都是MRM和SRM(选择反应监测)技术，由此也可以大家已经把蛋白质定量的焦点转移到MRM及SRM上来。此外，刘斯奇研究员的报告中还提及，目前，世界各地实验室存在同类蛋白质定量不一致的情况，是否是因为制备材料不同、方法不同、仪器不同等原因导致结果不一致?科学家们倡议不同实验室联合，对样品的制备及分析过程实现标准化，以便使得蛋白质研究真正走向临床。 中科院生物物理所杨福全研究员 中科院大连化物所邹汉法研究员 　　正如刘斯奇研究员报告中所介绍的，目前，修饰蛋白质研究成为蛋白质研究的又一重点。大会报告中5位专家的报告都涉及到磷酸化蛋白质的研究。中科院生物物理所杨福全研究员介绍了目前磷酸化蛋白组学研究进展，其指出，蛋白质磷酸化是一种蛋白质翻译后修饰，磷酸化蛋白质分析的最大挑战是其含量较低及其离子化效率相对低，因此磷酸化蛋白质富集策略在质谱分析中很重要。目前，用于磷酸化蛋白质的富集策略有固定化金属亲和色谱(IMAC)、金属氧化物亲和色谱(MOAC)、化学衍生富集(PAC)等，研究证明单一的富集方法效果不好，而几种富集方法的串联和并联使用的策略，以及色谱预分离-富集串联的策略则有比较好的效果。而在磷酸化蛋白质鉴定和修饰位点分析中，主要的技术手段包括MALDI-TOF-MS和ESI-MS-MS等 而定量磷酸化蛋白质组学技术包括基于质谱技术的定量策略和基于同位素标记的定量策略。 中国科学院北京基因组研究所孙海丹博士 Wisconsin –Madison大学的李灵军教授 　　厦门大学赵玉芬院士则介绍了基于稳定同位素质谱技术在磷酸化蛋白激酶的反应机理的研究 中科院大连化物所邹汉法研究员介绍其研究的两种磷酸化蛋白质富集材料磷酸酯锆和磷酸酯钛在提高磷酸化蛋白质富集效率方面的作用 Wisconsin –Madison大学的李灵军教授则介绍了通过标记和非标记蛋白质定量方法研究两种环境致病的疾病的研究 北京大学生命科学学院的纪建国教授则介绍了神经性疾病磷酸化蛋白质的动态表达的变化。 军事医学科学院的杨松成教授 北京大学生命科学学院的纪建国教授 　　在此大主题下，来自军事医学科学院的杨松成教授介绍了MALDI质谱成像的新进展。上个世纪80年代，基质辅助激光解析电离新型离子源发明，1997年，美国Vanderbilt大学Caprioli教授首次报道了利用MALDI质谱成像，直接从大鼠的脑下垂体和结肠组织获得了蛋白质和多肽的生物分子图像，开创了分子成像组织学的新领域。目前，这项技术先前主要应用在蛋白质、多肽研究，现在又扩展到小分子如脂质和药物研究。其与现在广泛使用的放射自显影技术相比，具有不需要标记和探针、质谱成像时非靶向的、质谱成像可检测代谢物与药物、可以对整体动物组织进行成像等优点，其将在生物医学的基础研究中发挥作用。杨松成教授还指出，质谱成像技术除了MDLAI外，还有DESI(解析电喷雾离子化)和SIMS(二次离子质谱)，未来质谱成像技术将在仪器和样品前处理技术上改进，并向三位图像发展。 　　新药早期临床研究 北京协和医院临床药理中心的江骥教授 　　药物研究一直以来都是质谱的重要应用领域，来自北京协和医院临床药理中心的江骥教授则从新药早期临床研究对质谱技术的需求角度进行了介绍。江骥教授表示，新药研发的成本越来越高，特别是在进入二期和三期临床研究中，费用更是惊人。如果能在一期临床或更早之前就能判断新药的安全性与有效性，则可以大大地节约新药开发成本。因此，“微剂量”或者“0周期临床试验”的临床研究方法被西方国家权威机构所采纳。这种方法的好处是在 不会导致太大安全性问题的前提下可以获得直接来自于人体内药物代谢试验的第一手信息。这对于了解药物在人体内的安全性、有效性以及药物代谢情况，提高研究效率，降低研究风险成本，缩短研究周期具有重大意义。在这种情况下，人们对微量药物探测技术提出了更高的要求，除了同位素标记的正电子发射断层(PET)技术外，高灵敏度的LC-MS/MS及AMS(加速器质谱)成为了必然采用的方法。此外，由于当前的新药开发除小分子化合物外还包括生物制剂和中药制剂，这些则需要用到特殊的电离技术、高分辨质谱技术以及对海量药物代谢数据的处理和分析能力。 　　食品中外源性化学物质研究 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所的杨敏莉博士 　　食品中外源性化学物质是指在农产品种植、养殖、加工等过程中加入的化学品，或因环境因素引入的有害化学物质，包括农药兽药残留、真菌毒素、包装材料中的有害化学物质、食品添加剂及重金属等。国际和我国对食品中外源性化学物质的限量日益严格，给检测提出了挑战。中国检验检疫科学研究院食品安全研究所的杨敏莉博士介绍了食品中外源性化学物残留确证技术研究、食品中未知添加物质的筛查技术研究、车载气相色谱/质谱仪应用研究、有机质谱痕量分析质量控制技术研究等四方面介绍了有机质谱在食品检测中 的应用。同时杨敏莉博士对应用于食品检测的质谱技术提出了需求展望：不同公司检测参数统一、数据库接口开放、更易于维护、电离效率改善、高选择性和灵敏度、复杂基质直接分析。 　　石油组学研究 中国石油大学(北京)重质石油国家重点实验室的史权教授 　　质谱技术发展与石油化学有着紧密的联系，1942年美国加州大西洋炼厂购买了一台美国联合电力公司的CEC-21-101型低分辨单聚焦质谱计，这是世界上第一台用于有机分析的商业质谱仪，因此可以说石油化学工业是有机质谱的最早用户。中国石油大学(北京)重质石油国家重点实验室的史权教授介绍到，据文献报道，上世纪八十年代，石油分析遇到的挑战——石油极性大分子的组成分析，当时的技术GC、LC、NMR、MS等技术都不能解决这个问题，石油分析的发展遇到了瓶颈，而此时生命科学研究兴起，同时石油公司也认为该做的研究工作都已完成，从而导致了一大批质谱学家转到了生命科学领域。 　　但是到了上世纪90年代， FT-ICR-MS(傅里叶变换-离子回旋共振质谱)的分辨率超过了磁质谱，于是有人尝试用该质谱技术用于石油重组分研究，但是在石油分析最关心的杂原子含S、N、O等杂原子烃类化合物的分析还是难有突破。2000年时，诺贝尔奖金获得者发现化石燃料可以在ESI电离源中电离，这给从事石油分析的研究人员带来了信心。随后，科学家们在此基础上，利用FT-ICR-MS做了大量的研究工作，提出石油组学的概念。2007-2009年，世界上各大石油公司如阿美石油、美孚、壳牌、中石化等相继购买了FT-ICR-MS进行石油组分分析。目前，我国最高端的FT-ICR-MS 是9.4T FT-ICR-MS。最后，史权教授认为，有机质谱技术将在有机地球化学(石油成因机理、成藏过程)、采油过程化学(石油开发过程中的界面化学)及石油转化化学(石油组学、分子炼油)等三方面发挥重要作用。 　　注：有关2010年全国有机质谱会的后续报道，敬请关注仪器信息网资讯栏目!

近日，中国科学院深圳先进技术研究院司同课题组联合中国医学科学院杨兆勇课题组，在国际学术期刊 Chemical Science 在线发表了题为：Directed evolution of a cyclodipeptide synthase with new activities via label-free mass spectrometric screening 的研究论文。该研究依托深圳合成生物研究重大科技基础设施（简称为“合成生物大设施”），开发了无标记质谱筛选技术，应用于环二肽合酶的定向进化改造，快速得到了 F186L 突变体催化合成野生型天然酶无法产生的新二酮哌嗪分子。定向进化是酶工程的重要方法，需要开展反复多轮的突变文库构建和筛选。现有面向酶定向进化的高通量筛选方法，通常利用偶联反应、生物传感器等手段，将底物或产物浓度信息转化成光学、电化学等信号。开发筛选方法的过程不但费事费力，且通常需要使用衍生化、特殊标记底物等方法，不利于发现新的催化活性。另一方面，质谱分析基于离子的质荷比（m/z）对反应物进行定性与定量测定，具有更好的普适性。更为重要的是，基于无标记（label-free）原理，可以通过非靶向质谱方法识别新的酶促产物，从而发现对应的新催化活性。但质谱筛选的这一能力在酶定向进化中的应用还非常有限，主要限制因素是检测样品进入质谱仪之前通常需要经过耗时的样品制备和色谱分离步骤，限制了质谱筛选的通量该研究依托深圳合成生物大设施的机器人平台，针对酶突变文库构建和筛选过程中的不同环节，如分子克隆、微生物培养、产物乙酸乙酯萃取、MALDI-TOF 质谱分析、数据处理等，开发了对应的自动化流程和方法，实现了微生物发酵产物的无标记质谱筛选，通量为每样品5秒钟（图1）。图1：高通量、无标记质谱筛选用于酶新催化活性的定向进化研究文章以环二肽合酶（cyclodipeptide synthases, CDPSs）为研究对象，验证无标记质谱筛选在酶定向进化中的应用。环二肽合酶利用氨酰-tRNA底物可以合成二酮哌嗪（diketopiperazines, DKPs）骨架；含有这类骨架的天然产物可以通过肠屏障、血脑屏障，是重要的药物先导化合物。然而，基于蛋白质工程改造环二肽合酶的成功案例非常有限，部分原因在于缺乏高通量的产物分析方法，相关研究仅限于少数理性设计突变。研究团队以链霉菌（Streptomyces noursei）来源的 AlbC 作为研究模型，使用大肠杆菌底盘进行文库构建与筛选。重组表达野生型 AlbC 的大肠杆菌的主要环二肽产物为 cFL。作者首先利用半理性设计，选取底物结合口袋附近的10个位点及口袋外与 tRNA 密切作用的4个位点，构建和筛选了定点饱和突变（site-saturation mutagenesis，SSM），快速发现了多个产物谱发生明显变化的突变体。其中，有文献报道的8个突变体数据与本文实验结果相符，验证了方法的可行性与准确性；在此基础上，结合新的质谱筛选方法，本文首次对选取的14个位点的266个可能突变体中的238个进行了系统性表征，大大拓展了环二肽酶关键位点的突变效应数据。遗憾的是，从半理性设计文库中并未发现可以合成新产物的 AlbC 突变体。研究团队进一步利用易错 PCR 技术构建了 AlbC 随机突变文库，对4500个随机挑选的克隆开展无标记质谱分析，最终筛选得到3个突变体。与野生型相比，这3个突变体质谱谱图中出现了新的质荷比为247的离子峰，经高分辨质谱和二级质谱分析，新的产物鉴定为cFV，在表达野生型AlbC的菌株中未被检测到。并且，这3个突变体经 DNA 测序分析发现均只含有F186L单一突变（图2）。文章最后，作者利用分子动力模拟技术，对 F186L 突变效应的分子机制进行了推测。图2：无标记质谱方法筛选得到AlbC突变体生产新的环二肽产物cFV总的来说，该研究依托深圳合成生物大设施的机器人平台，开发了面向酶定向进化的无标记质谱筛选技术，在新催化活性发现这一工程目标方面进行了概念性验证。未来发展方向包括进一步提高筛选通量、扩大适用分子范围、对接不同类型质谱仪等。论文链接：https://doi.org/10.1039/D2SC01637K

近日，中国科学院深圳先进技术研究院司同课题组联合中国医学科学院杨兆勇课题组，在国际学术期刊 Chemical Science 在线发表了题为：Directed evolution of a cyclodipeptide synthase with new activities via label-free mass spectrometric screening 的研究论文。该研究依托深圳合成生物研究重大科技基础设施（简称为“合成生物大设施”），开发了无标记质谱筛选技术，应用于环二肽合酶的定向进化改造，快速得到了 F186L 突变体催化合成野生型天然酶无法产生的新二酮哌嗪分子。定向进化是酶工程的重要方法，需要开展反复多轮的突变文库构建和筛选。现有面向酶定向进化的高通量筛选方法，通常利用偶联反应、生物传感器等手段，将底物或产物浓度信息转化成光学、电化学等信号。开发筛选方法的过程不但费事费力，且通常需要使用衍生化、特殊标记底物等方法，不利于发现新的催化活性。另一方面，质谱分析基于离子的质荷比（m/z）对反应物进行定性与定量测定，具有更好的普适性。更为重要的是，基于无标记（label-free）原理，可以通过非靶向质谱方法识别新的酶促产物，从而发现对应的新催化活性。但质谱筛选的这一能力在酶定向进化中的应用还非常有限，主要限制因素是检测样品进入质谱仪之前通常需要经过耗时的样品制备和色谱分离步骤，限制了质谱筛选的通量。该研究依托深圳合成生物大设施的机器人平台，针对酶突变文库构建和筛选过程中的不同环节，如分子克隆、微生物培养、产物乙酸乙酯萃取、MALDI-TOF 质谱分析、数据处理等，开发了对应的自动化流程和方法，实现了微生物发酵产物的无标记质谱筛选，通量为每样品5秒钟（图1）。图1：高通量、无标记质谱筛选用于酶新催化活性的定向进化研究文章以环二肽合酶（cyclodipeptide synthases, CDPSs）为研究对象，验证无标记质谱筛选在酶定向进化中的应用。环二肽合酶利用氨酰-tRNA底物可以合成二酮哌嗪（diketopiperazines, DKPs）骨架；含有这类骨架的天然产物可以通过肠屏障、血脑屏障，是重要的药物先导化合物。然而，基于蛋白质工程改造环二肽合酶的成功案例非常有限，部分原因在于缺乏高通量的产物分析方法，相关研究仅限于少数理性设计突变。研究团队以链霉菌（Streptomyces noursei）来源的 AlbC 作为研究模型，使用大肠杆菌底盘进行文库构建与筛选。重组表达野生型 AlbC 的大肠杆菌的主要环二肽产物为 cFL。作者首先利用半理性设计，选取底物结合口袋附近的10个位点及口袋外与 tRNA 密切作用的4个位点，构建和筛选了定点饱和突变（site-saturation mutagenesis，SSM），快速发现了多个产物谱发生明显变化的突变体。其中，有文献报道的8个突变体数据与本文实验结果相符，验证了方法的可行性与准确性；在此基础上，结合新的质谱筛选方法，本文首次对选取的14个位点的266个可能突变体中的238个进行了系统性表征，大大拓展了环二肽酶关键位点的突变效应数据。遗憾的是，从半理性设计文库中并未发现可以合成新产物的 AlbC 突变体。研究团队进一步利用易错 PCR 技术构建了 AlbC 随机突变文库，对4500个随机挑选的克隆开展无标记质谱分析，最终筛选得到3个突变体。与野生型相比，这3个突变体质谱谱图中出现了新的质荷比为247的离子峰，经高分辨质谱和二级质谱分析，新的产物鉴定为cFV，在表达野生型AlbC的菌株中未被检测到。并且，这3个突变体经 DNA 测序分析发现均只含有F186L单一突变（图2）。文章最后，作者利用分子动力模拟技术，对 F186L 突变效应的分子机制进行了推测。图2：无标记质谱方法筛选得到AlbC突变体生产新的环二肽产物cFV总的来说，该研究依托深圳合成生物大设施的机器人平台，开发了面向酶定向进化的无标记质谱筛选技术，在新催化活性发现这一工程目标方面进行了概念性验证。未来发展方向包括进一步提高筛选通量、扩大适用分子范围、对接不同类型质谱仪等。

2014年6月16日，布鲁克在第62届美国ASMS质谱年会上宣布推出多款质谱产品，这些产品除了能在应用市场和工业化市场发挥作用外，还可应用于生命科学研究、蛋白质组学研究、临床研究等领域，另外，它还能为制药/生物制药/ CRO的客户提供服务。这些新的系统和解决方案性能显著提高、效率增强、通用性好，提供更为准确的分析结果。 　　布鲁克公司在ASMS 2014上的主要创新： 　　&bull 新型impact II&trade 系列超高分辨率QTOF质谱仪的性能进一步改进，并达到业界领先水平 　　&bull 将与美国国家高磁场实验室联合单独发布一个关于FTMS质谱描述的新闻稿 　　&bull 打开蛋白质组学的下一个篇章，独一无二的impact II系统能够在30min内实现大于1000个完整蛋白的分析 　　&bull 新型多功能OMICS平台，同时配置MaxQuant支持软件以及最新的Compass&trade PathwayScreener&trade 软件，使其具有更高的效率和通用性，并具有更深的生物学洞察力 　　&bull 新的ToxScreener&trade 解决方案将为法医毒理学综合研究开辟一片崭新的未知领域 　　&bull 在欧洲推出的toxtyper&trade 1.1系列新产品，准确性高且易操作，通常应用于法医和临床研究领域，该产品可通过一键操作快速实现约900种化合物的毒理学分析 　　&bull 首次亮相的新型autoflex&trade speed MALDI TOF(/TOF)系统配置了布鲁克公司2千赫smartbeam&trade -II激光器，提高了在蛋白分析、MALDI成像和MALDI Biotyper(高通量微生物鉴定系统)中的应用。 　　新品的详细信息如下： 　　impact&trade II质谱系统 　　新型impact II系统是布鲁克独一无二的UHR-QTOF质谱产品线的最新成员，具备业界领先的50,000全灵敏度分辨率(FSR)。在蛋白质组学、生物标志物研究、杂质的鉴定、以及残留物的筛选等领域，复杂的、高背景基质下的痕量分析是目前面临的一项巨大挑战，impact II系统能够进一步这些应用的分析性能水平，应对如上挑战。 新型impact II质谱系统 　　由于其行业领先的灵敏度，应用广泛的离子光学系统以及50 Gbit /秒快速的采样技术，使得该产品能在UHPLC分析速度下实现5个数量级的动态范围，并具有高达50Hz的谱图采集效率。impact II具有业界领先的同位素模式精度，针对纳升液相及UHPLC峰中的低丰度化合物可通过自动可靠的分子式进行确定。 　　新的UHR-QTOF增强的分析性能和功能使其在学术和工业领域的应用中，带来更高的质量精度和动态范围，从而大幅提高生产效率。包括： 　　&bull 亚单位单克隆抗体的快速成本效益分析，现在能够完全由同位素解决 　　&bull 能够持续的深度定量分析蛋白质组学样品，包括自下而上的蛋白质组学、糖组学以及修饰后鉴定分析 　　&bull 高通量筛选完整蛋白的同位素分辨率高达30kDa。这一独特的筛选方法使得UHPLC-UHR-QTOF系统能够在20-30min内实现1000个蛋白的分析。这一高通量的蛋白质组学研究方法，可加速生物标志物的鉴定和确证分析，同时提高临床蛋白的分析 　　&bull 通过使用ProfileAnalysis&trade 软件和新的Compass PathwayScreener软件这一完整的工作流程，能够深入洞察复杂代谢物组学样品的目标和非目标分析 　　&bull 布鲁克新的解决方案在法医毒理学领域具有更好的选择性和特异性。ToxScreener配备了与领先的法医毒理实验室共同开发的精确质量库 　　&bull 独特的Instant Expertise&trade 软件系统，能在不依赖样品数量和样品复杂程度的情况下，自动优化的MS / MS最优的实验条件。这些最优实验条件将首次实现更高生产力的转化，并将提供具有专家水准的检测结果。 　　这些特点保证了impact II能够最快速的为客户提供广泛的应用，从小分子鉴定和表征到食品安全、法医和毒物学筛查、代谢组学、药物和自下而上的蛋白质组学、蛋白筛查、抗体分析。 　　新一代多组学知识平台 　　布鲁克正在推动寻求对组学更深的了解，以及将&ldquo 组学&rdquo 知识的产生上升到新的高度，为自下而上蛋白质组学、糖组学、定量蛋白质组学、完整蛋白质分析、翻译后修饰和代谢组学等领域带来更高的生产效率。 　　&ldquo 我们使用Impact进行常规的鸟枪法字自下而上的蛋白质组学分析已经近一年。与CaptiveSpray nanoBooster组合使用，该仪器提供了一个很出色的一致性能水平，能够提供不变的性能超过6-8周。这对我们非标记的测量是极其重要的，&rdquo 来自法国斯特拉斯堡LSMBO的Alain Van Dorsselaer教授说。 　　为加强生物信息学平台，布鲁克与Matthias Mann教授的小组合作，将UHR-QTOF数据录入MaxQuant软件提供了支持，最先进的定量蛋白质组学软件MaxQuant是为大规模质谱分析数据专门设计。它是专门针对高分辨率质谱的数据，支持好几个标记技术以及非标记数据的处理工作流，此外MaxQuant软件能够使研究人员在多组学方法中利用质谱全部潜力推动蛋白质组学。 　　由于代谢组学对高效数据处理工具的需求日益增加，布鲁克加强其生物信息学研究工具，提供Compass&trade PathwayScreener软件，该软件给代谢物样品提供了一个新层次的视角。随着新的Compass&trade PathwayScreener软件的使用，用户可以得到两次结果，进行通路驱动，用于非目标数据挖掘时进行目标代谢物分析。该PathwayScreener工作流可以与布鲁克市场领先的多组学生物信息学平台ProfileAnalysis&trade 组合，进行非靶向代谢物和非标记蛋白质的研究。 　　德国Bielefeld生物技术中心的Jö rn Kalinowski教授说：&ldquo 我们使用Compass PathwayScreener能够阐明突变体在谷氨酸棒杆菌代谢中的新影响。&rdquo 　　此外，布鲁克与阿尔伯塔大学合作促进了高分辨率串联质谱库的发展，以改善代谢组学的工作流程。Liang Li教授解释道，&ldquo 作为人类代谢组数据库(HMDB)项目的负责人之一，我的实验室使用低分辨率的三重四极杆质谱已经产生了大约800人的代谢产物原始MS/ MS谱库。我们很高兴与布鲁克合作生产出一款具备更高数据质量的最新人类代谢物MS / MS谱库。这个谱库连同着一个自动化的采集和处理方案，让用户对快速鉴定代谢产物更有信心。&rdquo 　　布鲁克道尔顿公司生命科学与蛋白质组学事业部副总裁Ole Vorm博士评论道，&ldquo 这些新产品在一个非常方便且符合成本效益的平台上提供了优异且强大的性能。我们有意识的加强了UHF-QTOF和nano-ESI的分析性能，这样，我们使这个创新的技术更易用、更有效，也可以满足那些可能不是质谱专家的生物学家的需求。最后，我们的蛋白质组学客户对于我们的突破很兴奋，包括impact II快速蛋白筛查技术，以及在UHPLC快速分析及全灵敏度扫描的条件下，为自下而上的蛋白质组学研究提高了50%左右分辨率。&rdquo 　　ToxScreener&mdash 基于精确质量、高动态范围LC-MS/MS的法医毒理学解决方案 　　ToxScreener是一款基于布鲁克精确质量、高动态范围QTOF质谱系统的法医毒理学解决方案。采用更宽范围的bbCID采集技术为科学家带来了快速且可靠的分析方法，能够非常自信的筛查上百甚至上千已知或未知与法医相关的化合物，分析数据经得起法庭上的推敲。 　　ToxScreener解决方案能够使得法医毒理学家紧跟上&ldquo 传统已创建的&rdquo 滥用药物的检测和鉴定分析，同时还能检测全球最新出现的新药。ToxScreener解决方案的核心在于具备一个覆盖法医相关药物的精确质量数据库，相对于其它筛查技术，能够获得更为精确水平的鉴定结果。ToxScreener bbCID精确质量法医毒物数据库是与德国弗赖堡大学和芬兰赫尔辛基大学的毒物学专家紧密合作。 　　来自赫尔辛基大学法医毒理实验室的Ilkka Ojanperä 教授说到，&ldquo 自2010年我们便开始使用具备bbCID技术的布鲁克LC-TOF-MS进行尿液中普遍法医毒物的筛查分析。2013年，我们开始使用最新UHPLC-UHR-QTOF，从而获得更高灵敏度的滥用药物和法医药物的筛查分析方法，包括危险的低浓度含量化合物，包括THC酸、丁丙诺啡和合成大麻素。我们很多的用户都已经使用该分析方法，并且获得了超过他们预期的成功，我们实验室中也已经开始使用布鲁克 QTOF bbCID工作流程进行免疫学分析的研究。bbCID技术已经严格与谱库进行比较并获得确证，已被证明能够获得一致的分析准确性，同时还可获得更高的分析效率。我们的法医毒物筛查方法现已经获得芬兰认证服务的许可。&rdquo 　　高通量、强大的Toxtyper 1.1解决方案能够在12分钟内自动分析900个已知的毒理学目标化合物 　　新的Toxtyper1.1常规分析解决方案包括新颖的实验室鉴定算法库和一个超过900种目标化合物的高质量数据库。另外，Toxtyper1.1工作流程还带有一个针对滥用药物的子数据库。它具有强大而可靠的毒理学鉴定性能的关键技术，包括连续、零延迟正/负离子开关、高MS / MS的特异性和新颖性，以及即时的MS3确证功能。新的Toxtyper1.1搜索算法现在完全兼容最近推出的&ldquo Maurer/Wissenbach/Weber LC-MSn 药物、毒物及其代谢物的数据库&rdquo ，并且拥有超过1000种母体化合物和2700种代谢物离子阱数据库。 amaZon speed质谱仪 　　新的软件工具通过MSn分析，对自动分配的碎片离子结构提供了附加的代谢物鉴定和结构验证功能。Toxtyper1.1现在能够支持尿液和血清中药物的高灵敏度检测所需的样品制备标准操作流程。Toxtyper是一个目前仅在欧洲部分国家研究使用的解决方案。 　　配置2kH Smartbeam&trade 激光器的zautoflex&trade speed MALDI-TOF(/TOF) 在ASMS上首次亮相 　　更新后的autoflex speed质谱仪综合了众多的优势，包括进一步提高数据质量、采集速度快、杰出的质量动态范围和强大高效的性能。它进一步拓展了MALDI TOF / TOF在蛋白测序、生物标志物发现、聚合物分析、脂质和多糖分析、分子成像以及在高通量MALDI Biotyper微生物鉴定中的应用。autoflex speed采用了具有专利的smartbeam&trade -II激光技术，现在能够实现高达2 kHz的重复率和20微米真实像素的图像分辨率，其它增强的功能包括： zautoflex&trade speed MALDI-TOF(/TOF)质谱系统 　　&bull 独特的FAST-SRM模式能够实现单个反应监测组织中药物及其代谢产物成像 　　&bull 扩展了聚合物的高分辨率质量范围和自上向下完整的蛋白质测序的长序列读数 　　&bull Flash Detector&trade 技术提高了复杂样品的分辨率并避免信号饱和 　　&bull 自清洁离子源几分钟之内自动清洗，帮助用户在正常运行时达到最少的维护时间 　　&bull 提供了众多优化的软件应用包，如蛋白质、肽和聚合物的分析、MALDI成像、临床研究和MALDI Biotyper IVD-CE的工作流程。

王 芸 沃特世科技（上海）有限公司 蛋白质糖基化是生命系统非常重要的翻译后修饰之一，在免疫识别，蛋白分泌，信号转导等生命过程中发挥了重要作用。与蛋白相连的多聚糖是这些功能的重要载体，特别是对于单克隆抗体药物，多聚糖部分对药物的生物活性有着重要的影响。因此，发展分离效率高，检测灵敏度好的糖基化分析方法对单克隆抗体药物分析具有十分重要的意义。 针对糖基化分析中的种种困难，沃特世公司开发了亲水作用色谱法，以及荧光-质谱结合检测的分析方法。ACQUITY UPLC® 系统配合荧光检测器(FLR)以及多聚糖分析专用(GST )色谱柱，比HPLC方法有更高的分离度。多聚糖分析专用色谱柱装填了1.7&mu m的酰胺吸附剂，可在HILIC模式下有效分离荧光标记的多聚糖。UPLC® 配合荧光检测器分析多聚糖可以获得很高的分离度和定量准确性，特别是对于位置异构体以及有共流出的小峰分析；而质谱检测为糖链鉴定提供了更多的结构信息。通过与标准糖链保留时间的比较，该流程能实现高通量的多聚糖定性定量，满足药物分析的多种需求。 一、色谱条件与标记后的多聚糖样品的分离 可通过HILIC方法，有效分离2-AB标记的多聚糖混合物。对于方法优化，使用更缓的窄梯度，可有效提高保留时间上相临近的多聚糖峰之间的分离度；对于其它的参数，如流速、缓冲液浓度、流动相pH及柱温等，一般也需要进行优化。图1示例使用优化后的HILIC色谱条件后，复杂的2-AB标记的IgG多聚糖混合物得到了很好的分离，包括E1/ E2与F1/ F2。实验所用梯度洗脱时间为45分钟，包括色谱柱清洗和再平衡步骤。一般来说，一个样品的总分析时间在1小时内。因此，与使用3.0-&mu m填料的HPLC方法相比，使用1.7-&mu m填料的UPLC色谱方法，不但分离效果更好，而且运行时间更短。实验中使用2.1 x150 mm色谱柱。图1(B)中甘露糖5(峰C)与甘露糖6(峰H)可与邻近多聚糖峰成功分离，解决了共流出的问题。 二、2-AB标记的多聚糖定量及结构鉴定 由于多聚糖在HILIC 模式下能实现基线分离，各种异构体，例如末端唾液酸的位置异构，都能得到很好的分离。因此，在荧光检测器下的峰面积积分能对各种糖链进行定量分析。而从MS谱图来看，多聚糖样品中高甘露糖糖型所占比例较高，而复合型及杂合型糖链也都能够得到鉴定。各种带有神经氨酸的糖链也都能得到鉴定，表明该方法能够适合各种多聚糖复合物的分析。除了分子量，我们还能通过MS/MS谱图进一步确认多聚糖的结构。 2-AB标记的IgG多聚糖混合物的分析结果充分说明沃特世提供了成熟的聚糖分析方案，且相应色谱柱的质量控制采用了2-AB标记的IgG多聚糖混合物进行。ACQUITYUPLC系统显著缩短了分析时间，将常规HPLC上需要2个小时甚至3个小时的分离梯度缩短到1小时。 此外沃特世提供UPLC-FLR-MS的整体解决方案可以十分有效的对多聚糖进行分析，除提供分子量信息外，还可以进行糖结构推导，大大降低了生物药物研发工作中糖基化分析的难度。 实验流程： 一、2-AB 标记糖链 使用GlycoPro le试剂盒，Prozyme公司 使用试剂盒进行2-AB 标记糖链时，除以下步骤，按照该公司的说明操作即可。 1.使用50&mu l的标记反应液 2. 65度反应4-5小时 3.将样品按步骤4处理除掉过量的标记试剂 使用Sigma公司试剂 1. 配制3 0% 的醋酸D M S O 溶液（ 3 0 &mu l 冰醋酸，700ulDMSO） 2.按照20：1（v/w）的比例配制2-AB 溶液 （如需要20mg 2-AB，则用400&mu l 30% 的醋酸DMSO溶液配制） 3.以16.7：1（v/w）的比例将2-AB溶液与氰基硼氢化钠混合配制标记反应液 4.将所得糖链用50&mu l标记反应液溶解，65度震荡反映4-5小时 5 .将反应液按步骤4处理除去过量的标记试剂 二、使用MassPrep亲水作用样品处理板除去过量的标记试剂 所需溶液: MiniQ 纯水，90% 乙腈 ACN，10 mM 醋酸铵Tris，20% ACN 1.样品处理板活化，向样品处理板加入200&mu l MiniQ纯水，再加入 200&mu l 90% ACN，重复 90% ACN 2.吸取 50&mu l 标记溶液，加入 450&mu l ACN（ 如有沉淀，请勿离心，以免降低糖链回收率），由于板上每孔体积为200&mu l，可以将样品分为四份加入 3.将样品加入处理板，设定真空度为低（压力 250-500 mmHg），以保证样品与HILIC基质有充分时间相互作用；如果溶液在板上没有移动，可适当增加真空度 4.用 90% ACN清洗处理板两次 5.换用样品收集板，用200&mu l 10 mM 醋酸铵Tris， 20%ACN洗脱，洗脱液转移至1ml 离心管 6.冷冻干燥标记后糖链溶液冻干后的样品复溶于20&mu l50% ACN中，超声5 min 后转入UPLC采样瓶，进样5&mu l。 参考文献 (1) Martin Gilar, Ying-Qing Yu, Joomi Ahn, and Hongwei Xie.Analysis of Glycopeptide Glycoforms in Monoclonal Antibody TrypticDigest using a UPLC HILIC Column (2) Hongwei Xie, Weibin Chen, Martin Gilar, St John Skiltonand Jeffery R. Mazzeo. Separation and Characterization of N-linkedGlycopeptides on Hemagglutinins In A Recombinant Influenza Vaccine (3) Joomi Ahn，Ying Qing Yu and Martin Gila.r UPLC亲水相互作用色谱(HILIC)-荧光检测法分析2-AB标记的多聚糖

来自美国Scripps研究所的国际著名蛋白质组学专家 John R. Yates 教授应邀出席了近日召开的第五届亚洲与大洋洲质谱会议暨第33届中国质谱学会学术年会，并作大会报告。Yates 教授在他的报告的前半部分中详细介绍了蛋白质组学的发展历程和未来的发展方向。 Yates教授与本网宋苑苑博士在会议间隙合影留念 鸟枪法蛋白质组学的演变 提到蛋白质组学的发展，自然绕不开质谱技术的发展。在过去的100年里，质谱技术可以说是以指数级的速度迅猛发展。这种进步可以部分归功于机械、电子和计算机工业领域的创新。但一些偶然的颠覆性突破，可能才是质谱技术的发展在质上取得飞跃的根本原因。大规模蛋白分析或是蛋白组学之所以成为可能，正是由于这些颠覆性的突破而导致的。 当质谱具备分析有机分子的能力的时候，自然而然的，分析氨基酸和小肽就成为了下一个目标。由于这些两性和极性分子缺少挥发性以及早期质谱质量范围的限制，导致分析工作十分复杂。为了解决这个问题，人们巧妙地利用衍生化的办法来使这些被改性的氨基酸和小肽气化。同时利用EI源来碎片化这些分子，以实现肽段测序。随着高分辨率、精确质量仪器的出现，精确质量被作为一个工具用于小肽的测序。而对于小肽分析能力的获得使得我们可以利用酶解和酸解的办法对蛋白进行分析。通过产生重叠的肽碎片，蛋白的序列就可能被重建。很显然，这种策略将产生非常复杂的肽段混合物，从而对当时的分离技术（GC）提出了更高的要求。那时，最大的挑战来自于如何省去繁琐的衍生化步骤而实现肽的离子化，否则科学家的分析对象只能局限于那些高丰度蛋白。 一个颠覆性的突破发生在1981年，也就是快原子轰击（FAB）的发展。这是第一次使得人们可以无需对肽（其分子量可以达到 〉1-2KDa）进行改性就可以完成很稳定的离子化。而这也对质谱仪器的质量范围提出了更高的要求。很快，这种离子源技术就被Hunt等人整合到了串联质谱上，从而为肽段测序提供了一种稳定的方法。 尽管FAB-MS和FAB-MSMS对于肽和蛋白分析而言是一个巨大的突破，但它们最主要的缺陷是很难直接与液相分离连接。1989年Fenn等人验证了电喷雾离子化（ESI）技术在蛋白分析方面的应用。除了可以电离大分子蛋白以及进行准确的质荷比测量外，这个方法的另一个突出特点就是实现了在大气压下的电离。这就简化了液相分离与质谱之间的接口。而在ESI这一颠覆性的创新出现后的几年里，FAB就渐渐被边缘化了。尽管和基质辅助激光解吸附离子化（MALDI）技术类似，围绕着这项技术的最初热情是集中在完整的蛋白质量的测量上，但是ESI的一个明显优势是通过与色谱技术（如：NanoLC）联用来完成更高效率的肽和蛋白的测序。 仪器控制语言（ICL）是由Finnigan MAT最先开发出来的一项具有颠覆性的创新技术。它具有一个初级的“智能”水平，可以实现自动数据采集、数据交互和根据实时数据对仪器操作进行控制。ICL事后被证明可以提高MSMS和其他实验的效率，从而使得大规模蛋白组学成为可能。现在它已成为所有用于蛋白质组学的质谱仪器的一项标准技术。 “鸟枪法”应用于蛋白质组学是一个很重要的里程碑。在用鸟枪法为基因组测序的时候，先将基因组DNA打断，分段测序，然后利用计算机重组在一起，从而确定一个生物的基因组序列。鸟枪法在蛋白质组研究中的应用方式与此相类似。首先将蛋白质混合物降解成肽段的混合物，再送入质谱进行分析，从而得到各肽段的质量数。为了得到更丰富的序列信息，质谱仪会选取某些肽段进行再次破碎（即二级质谱），得到更小的氨基酸序列片段。检索软件根据二级质谱信息与相应的数据库匹配，可得到肽段的确切序列，进而拼接成混合物中各蛋白质的完整序列，从而鉴定各蛋白。因此可以说，串联质谱对于“鸟枪法”在蛋白组学中的应用是至关重要的，它们使得大规模、高通量的数据分析成为可能。这对于传统的蛋白分析方法而言，是颠覆性的。 大规模数据分析技术的发展使对蛋白混合物直接分析成为可能，人们可以即时收集和破译数以千计的串联质谱谱图。由于样品处理过程的简化，使得样品损失降到最低，从而可以达到一个很高的效率和灵敏度。这一点对于那些始终暴露于新的、活性表面的低丰度蛋白分析尤为重要，因为这种暴露会导致大量的样品损失。 随着分析蛋白复合物和亚细胞区室方法的建立，下一步的目标自然就对准了开发对完整细胞分析的方法。全细胞分析是一个很复杂的工作。开发全细胞分析方法的挑战主要来自于两个方面：首先,需要开发合适的消解蛋白混合物的策略；其次，要有好的方法来分离这些复杂的肽混合物。在全蛋白组分析中，对溶液中蛋白的初始消解是一个非常关键的起始点，因为高效且完全的消解对于获得高的蛋白组覆盖度至关重要。而蛋白组分离的目的则是为了尽可能在最短的时间里提高峰容量和分离效率。要实现这一个目标其实是很困难的。如果峰宽过窄，由于质谱仪扫描速度的限制，可能导致肽峰的丢失。因此，分离效率必须要和质谱仪器的扫描速度匹配。良好的分离对于降低离子抑制以及提高动态范围是很重要的，同时，它也推动了一次分析过程的蛋白序列覆盖度的不断提高。鉴定蛋白功能 蛋白组学的另一个重要任务是鉴定在一个基因序列里被编码的蛋白的功能和作用。鸟枪蛋白组技术使人们能够通过一些新的策略，而快速获取这些信息。这些策略包括：基于“牵连犯罪” 概念的方法；根据活性将蛋白富集再鉴定；全细胞或细胞器分析等。 定性蛋白组学的最终目的是完成对所有存在蛋白的全覆盖。要达到这个目的，所有的蛋白需要被适当地消解并可溶。使用多蛋白酶消解可以提高序列覆盖度。此外，像电子转移解离（ETD）这样的新方法可以使人们有效地碎片化更大尺寸的肽段。高的序列覆盖度有益于分辨蛋白的亚型。对于复杂的混合物，例如细胞或组织裂解液，离子抑制和动态范围是两个挑战。如果能够很好地降低或消除离子抑制，那么就可以更加均一地实现肽的离子化，从而改善定性和定量分析。动态范围方面的挑战除了与离子抑制有关外，主要是和质谱仪器的检出限有关。除了离子抑制和动态范围外，第三个问题是质谱的峰容量。针对这个问题，可采用的一个变通的策略就是所谓的“数据独立采集（DIA）”，它已成为一个商品化技术。随着质谱仪器扫描速度变得越来越快，采用DIA技术进行鉴别也就变得越发可行。我们可以看到，每一代串联质谱较之其上一代都会有显著的改进，这推动着鸟枪蛋白组学向获得一个完整蛋白组发展。不过，如何判定何时算是我们获得了一个完整蛋白组依然是很困难的。此外，获得一个完整蛋白组的关键是要有一个合理的实验策略，而非采用一个耗时的“蛮力搜索”策略。生物体系的调控 可用于修饰蛋白的分子结构非常之多。这些修饰有些是具有明显的调控功能的，有些则只是改变蛋白的化学特性，而没有明显的调控功能。具有调控功能的修饰通常是可逆的，一个例外是蛋白水解过程。 质谱在很久以前就被用于对蛋白修饰的分析。对于高度规则的分子（如蛋白）进行质量测量是鉴定那些意料之外的新增分子结构的一个很直接的方法。随着基因组测序开始出现以及蛋白鉴定方法的发展，修饰鉴定的基本思路开始有所变化。Yates等人证明了可以采用数据检索方法通过串联质谱数据来鉴定翻译后修饰。快速破译修饰蛋白或肽的串联质谱图和明确修饰位点的能力使人们可以进行相应的大规模分析工作，从而更好地了解修饰的生物学机理。此外，大规模修饰位点的分析已经拓展到包括所有可被富集的修饰，这也同时促进了新的富集方法的发展。蛋白定量 稳定同位素标签（SIL）的发明使人们产生了利用质谱数据进行分子定量的想法。再者，对于体内代谢研究而言（例如：确定氨基酸的重要性），SIL也是定量质谱的一个必要要素。 早期的蛋白质组定量涉及到双向凝胶电泳的使用，但这一方法对于蛋白染色有着很高的要求。而质谱技术与双向凝胶电泳的结合使得人们可以比较容易地对凝胶上的蛋白进行分析和鉴定，从而也使双向凝胶电泳在生物学研究中得到充分利用。基于质谱技术的蛋白鉴定方法大大减少了鉴定时间和工作量，同时也可以实现蛋白鉴别和定量的结合。 为了得到更加准确的定量方法，SIL方法与质谱被结合在一起，以用于完整蛋白的分析。一些采用稳定同位素代谢标记方法或使用含标签的试剂（如稳定同位素标记的氨基酸）进行共价标记的手段随之出现。1999年，Gygi等人提出了一种不同的方法，即同位素编码的亲和标签（ICAT）。尽管ICAT方法在概念上很完美，但在实际当中还是有不少缺陷，例如：其鉴别和定量常常是基于一个多肽/蛋白分子，从而导致统计学分析很受局限。此外，由于为了富集需要使用基于抗生素蛋白的体系，从而使多肽回收也很困难。体内标记整个动物 将稳定同位素标签引入到人体和动物体内是为了用于测量分子的最终代谢产物。代谢分析通过痕量同位素标记的氨基酸和诸如同位素比率质谱技术来实现。代谢稳定同位素标记对于研究动物生物学而言是个非常有力的方法。整体动物标记使研究课题可以涉及到较之细胞系更为复杂的体系，并可以更好地反映有机体生物学机理。动物体的稳定同位素标记使人们可以使用组织或器官进行疾病研究。此外，组织和器官实际上是许多不同细胞类型的集合，换句话说是系统的系统，所以最终，研究目的会指向理解这些细胞的合集是究竟如何发挥它们的功能的上来。定量与鉴别的悖论 对于鸟枪蛋白组学而言，定量与鉴别同时进行的策略会产生一个自相矛盾的悖论。在一个全模式下对一个复杂体系中的蛋白进行鉴别，这需要快速的扫描仪器和高效的色谱以实现MSMS峰容量的最大化。仪器应当能够快速地采集一个肽段的数据，然后移向下一个新的肽段。而肽段定量则需要采集到足够多的数据点，从而实现准确测量两个形态之间的差别。“明快”对“持久”，这两个相互矛盾的需求导致了人们会对用于定量的数据质量做出一定的妥协，原因在于针对肽段鉴别的检出限往往要超过定量限。另一个问题是在定量实验中，对于“存在或不存在”的测量。为了对一个测量结果进行后续计算，大多数软件工具要求被重和轻同位素标记的肽段均要存在。而当不同标记的肽段比例超过10:1时，定量效率就会开始下滑，一些大的变化可能会被漏掉。一些非标记方法，例如光谱计数，能够更好地测定一些大的变化，但是它们的准确度不如标记方法。未来展望 为了充分了解人体生物学，科学家们必须要开始了解蛋白的亚型和修饰的功能，这也对相应的分离和测量技术提出了更高的要求。为了满足这一需要，我们需要可靠的方法来实现对完整蛋白的分子量和序列的测试。“由上而下”的质谱技术目前仍然在发展当中，我们期待着未来能有突破性的创新出现，以降低质谱的成本和复杂性，从而能使更多的人使用它。而就当下的过渡阶段而言，在过去的几年里，针对5-10 KDa的肽段的测序和表征，质谱分析器已经有了长足的进步，不过能够将蛋白切到5-10 KDa肽段的蛋白酶剪切或化学剪切方法仍需进一步发展。更高分辨率的质谱结合ETD能够使得对于这些中等尺寸的多肽的表征更加容易。 蛋白复合体代表了细胞内的一个更高阶的结构。确定蛋白亚型或被修饰后的形态如何影响蛋白复合体的功能或活性将是下一步的工作。同时，我们也期待质谱仪器能够通过科技进步和激烈的商业竞争而继续以一个较快的速度发展。为了给蛋白质组学提供更好的工具，质谱仪器的扫描速度和灵敏度将会得到进一步提升。(主编当班) Acknowledgement To help us to finish this story, Prof. Yates kindly provided instrument.com.cn with his perspective article (2013) on which the first half of his presentation at the conference is based. We herein would like to appreciate Prof. Yates for his full support to our work.

新一代Orbitrap Exploris 240质谱仪赛默飞发布了新一代四极杆-静电场轨道阱台式质谱仪Orbitrap Exploris 240。该系统继续扩展新一代 Orbitrap Exploris系列产品，改善并提高了大量关键的光学离子部件和仪器设计解决方案，扩展了先前的 Thermo Scientific™ Q Exactive ™ 系列质谱仪的分析能力。新质谱仪操作简单，可智能获取高分辨率高质量精度数据，为各种技术水平的用户提供快速获得高质量结果的通道，应对各种应用范围内的分析挑战！1. 采用快速扫描的高场 Thermo Scientific™ Orbitrap™ 质量分析器，全新扫描速度最高可达22Hz，具有出色的定性和定量性能；2. 可与包括 Thermo Scientific™ FAIMS Pro™ 接口在内的 Thermo Scientific二代离子源兼容，进一步提升定量准确性和分析通量；3. 具有 Thermo Scientific™ AcquireX ™ 数据采集工作流程，可进行全面、自动化的样品分析；4. 内置Thermo Scientific™ EASY IC™ 离子源内标校正，单次校正后可提供至少五天的高质量精度！5. 具有全新的扫描方式选择，包括 TopN/TopSpeed DDA，DIA 和 MSX等模式；6. 全新一代四极杆Orbitrap 质谱仪均使用高场 Orbitrap 质量分析器。 Orbitrap 中心电极的尺寸与 Orbitrap 内部获得的超高真空相结合，可实现最高240,000的分辨率；7. 高质量的共轭双曲面四极杆与RF应用相结合，可在狭窄的隔离宽度下实现极高的离子传输效率，提供出色的选择性，同时降低灵敏度损失。 全新的设计带来优越的分析性能和体验1. 在定性和定量蛋白质组学实验中的优异表现——Orbitrap Exploris 240可与选配的FAIMS Pro 高场非对称离子迁移谱接口联用，可以无缝地添加到现有的无标记定量 (或同位素标记定量)多路复用的工作流程中，提高低丰度多肽的信噪比，从而提高灵敏度，并最小化共流出肽段的干扰，同时减少离线分馏的时间。该组合增加了蛋白质组的覆盖率，减少了干扰，提高了定量的可信度。2. TMT多路复用同位素标记中的卓越表现——更高分辨率的 MS/MS 扫描为 Thermo Scientific™ TMT 实验带来了更精确的比值测定。在单次 LC-MS 实验中， TMT 或 TMT pro 试剂允许同时分析最多11个或16个样本。当 Orbitrap Exploris 240 质谱与可选的 FAIMS Pro 接口结合使用时，可减少与TMT实验中共隔离的干扰带来的比值压缩问题。3. 代谢组学从发现到高通量研究的完整解决方案——Orbitrap Exploris 240 质谱仪利用 Thermo Scientific™ AcquireX ™ 智能数据采集来收集更有意义的数据，结合强大的Compound Discoverer软件工作流程和数据处理，具有轻度捕集模式，可以减少或消除化合物意外碎裂导致的错误注释。4. 通过简化的操作完成生物制药的多功能应用方向——新一代质谱仪Orbitrap Exploris 240可与Thermo Scientific™ BioPharma 选配项一起使用，该选项可将质量范围扩大至 m/z 8000 ,应对生物治疗大分子蛋白如单克隆抗体和抗体药物偶联物的非变性质谱分析的挑战！ Orbitrap Exploris 240 质谱仪在更小的仪器占用空间内实现了领先的性能，并通过 Thermo Scientific™ 数据采集软件实现了简单、一致的用户体验。 Orbitrap Exploris 240 质谱仪具有高可用性和稳健性，确保了通用性和正常运行时间。该新仪器在蛋白质鉴定、使用非标记 DDA 或 DIA 定量蛋白质组分析、多路复用 TMT 定量分析等方面表现出了优异的性能。Acquire X 软件可以让用户深入分析小分子化合物。此外，该系统能够利用肽图、自上向下、亚基和非变性分析方法对蛋白质和生物制药进行详细、全面的结构表征。Orbitrap Exploris 240系统拥有更小的体积，全新的设计，无与伦比的性能！创新点：• 最高240,000的分辨率让质荷比相差mDa级别的干扰物无处遁形；最快22Hz的扫描速度和1.4Hz的极性切换扫描速度保证化合物定性分析百无一漏 • 全新的离子路径设计，结合更加强悍的高场Orbitrap，带来前所未有的性能表现 • EASY-IC内标校正源，可实现连续5天质量偏移小于1ppm，仪器超强的质量稳定性表现、节省仪器维护成本与精力 • AcquireX智能化数据依赖型采集模式，自动实时更新方法的包含列表和排除列表，以获得更多低丰度化合物的二级碎片信息，实现复杂样品的深度分析 • 体积最小的Orbitrap高分辨质谱仪，体积约为QE系列的一半，为实验室节省更多空间 新一代Orbitrap Exploris 240质谱仪

第70届美国质谱年会（70th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics）于明尼苏达州（Minnesota）当地时间2022年6月5-9日（北京时间 2022年6月6-10日）举办，会议期间布鲁克公司推出新的 timsTOF HT 系统，进一步拓展了革命性的 4D-多组学 timsTOF 平台。timsTOF HT 采用新型第 4 代 TIMS（trapped ion mobility separation，捕集离子淌度分离）XR cell 和14 位 Digitizer，可实现更宽动态范围、更深的肽段覆盖率和更准确的定量分析。该系统在 4D 血浆、组织蛋白质组和表观蛋白质组学中表现出色。这些系统性能的提升不以牺牲超高灵敏度和高通量蛋白质组学分析（例如每天分析 50 个样本（SPD）或是高达 200 SPD 时的超高稳定性为代价，也不影响结果的可靠性（肽段和蛋白水平控制 1% FDR（错误发现率）），并且避免了靶向免疫识别方法中固有的抗原交叉反应性。利用 dia-PASEF 技术，timsTOF HT 质谱仪可以微克级样本中，在 60 分钟梯度内鉴定超过 100k 独特的肽段其定量分析 CV 值更是低于 5%。此外，timsTOF HT 还针对高通量、高深度和无偏血浆蛋白质组学和液体活检生物标记研究进行了优化。耶拿大学的 Florian Meier 教授说：“我们与布鲁克的合作实现了流程化组织蛋白质组学分析，这是临床蛋白质组学的一个关键领域。由于组织切片和活检常包含非常异质的细胞群，因此对他们的分析极具挑战性。timsTOF HT 系统的 dia-PASEF 采集模式可以在宽动态范围内对蛋白质进行定量分析，即使是在心脏组织等非常困难的样本中，也不会损失分析通量和灵敏度。”PrognomiQ 公司蛋白质组学部门副总裁 Bruce Wilcox 博士在胰腺癌研究中使用 Seer Proteograph 和 timsTOF Pro 2，在深度、无偏血浆蛋白质组学中对生物标志物进行探索研究。Wilcox 博士表示：“我们收集了 193 个胰腺癌患者和健康人群的样本，并采用 5 种 Seer 纳米颗粒处理样本，在这些样本中共检测到 3822 种蛋白质。通过使用多个 timsTOF 系统，约 2933 种蛋白质在至少 25% 的患者样本中被鉴定到。”在本届 ASMS 上布鲁克还宣布与 Scienion 达成协议，其具有极高灵敏度的 timsTOF SCP 系统与 CellenONE F1.4 单细胞 pico-分配器和新的 ProteoChip™ 进行共同销售，实现了由单一供应商提供的无偏、非标记单细胞蛋白质组学 (SCP) 解决方案。Scienion GmbH 首席执行官兼创始人 Holger Eickhoff 博士评论说：“我们很高兴与布鲁克一起提供完整的 SCP 解决方案。借助扩大合作关系，并通过结合我们 SCP 团队的专业知识来加速单细胞蛋白质组学解决方案的研究与开发，从而更好地满足单细胞蛋白质组学界的需求。”

大家好，本周为大家分享一篇发表在Anal Chem.上的文章，Distinguishing Histidine Tautomers in Proteins Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry [1]。该文章的通讯作者是来自马萨诸塞大学阿默斯特分校的Richard W. Vachet教授。组氨酸是人体蛋白质结构中的重要组成氨基酸，研究发现，组氨酸具有Nδ-H和Nε-H两种互变异构体，通过两种互变异构体的转换，可以在蛋白质中介导质子转移。目前常使用2D NMR技术进行区分，但操作相对繁复。共价标记质谱是一种研究蛋白质结构的有力方法，具有操作简单，灵敏度高，结构分辨率高等优点。在本文中，作者尝试以焦碳酸二乙酯（DEPC）为标记试剂，采用共价标记质谱区分组氨酸互变异构体。组氨酸侧链的咪唑上具有两个氮原子，其中一个氮上的孤电子对参与芳香环π键的组成，而另一个氮原子仍保留孤对电子，更容易与DEPC等亲电子试剂反应。而组氨酸的两个互变异构体中都只有一个保留孤对电子的氮原子，且该氮原子位置不同，Nδ-H互变异构体中的Nε2与DEPC反应，而Nε-H互变异构体中的为Nδ1。因此以DEPC标记组氨酸以区分两个互变异构体的方法是可行的（图1）。图1. DEPC 结构及其与两种不同组氨酸互变异构体的反应 为了测试DEPC 标记区分两种互变异构体的能力，作者以几种含组氨酸的肽，在确保DEPC仅标记组氨酸条件下进行实验。以Fmoc-DGHGG-NH2为例子，该肽在N端包括一个Fmoc基团以确保仅标记组氨酸。采用等度洗脱来最大限度地利用LC分离两种异构体，并确保流动相组成不影响肽段电离效率，从而可以更好地量化每个互变异构体的比率。结果发现，在11.4和13.6分钟洗脱的峰具有相同的m/z值（图2）。根据串联MS数据，发现这两个峰代表着组氨酸上成功标记DEPC的单一物质（图3）。并且，这些同量异位离子的串联质谱不同，表明这两种物质为带有不同组氨酸互变异构体的物质。作者将先洗脱出的物质命名为修饰物质1，后洗脱出的为修饰物质2。根据MS/MS数据，两者的主要区别为修饰物质2具有更加丰富的羧基化a3离子（a3*）。图2. 未标记（蓝色迹线）和 DEPC 标记（红色迹线）肽 Fmoc-DGHGG-NH 2的提取离子色谱图。DEPC浓度比肽浓度高10倍，反应1分钟图3. 两种修饰的His异构体的串联质谱。(a)来自图2中的色谱图的修饰物质 1 的串联质谱。(b)来自图2中的色谱图的修饰物质2的串联质谱。标有星号 (*) 的产物离子包含羧基化产物此外，在重复实验中，作者发现物质2与物质1的丰度比为3.9± 0.2。而研究发现，在中性pH条件下，游离氨基酸Nε-H 互变异构体与 Nδ-H 互变异构体的比接近于4:1。因此，两物质的峰面积比表明物质1可能为 Nδ-H 互变异构体，而物质2可能为 Nε-H 互变异构体。结合以上发现，并考虑肽解离途径等因素，作者对两物质质谱图谱差异做出推测。当物质2为Nε-H互变异构体侧链时，DEPC 标记在Nδ1上，有利于肽通过bx-yz途径解离，随后通过bx-ax途径损失CO，因此物质2富含a3*离子。当物质1为Nδ-H 互变异构体时，DEPC 标记在Nε2上，肽通过组氨酸途径解离，并形成了稳定五元环，因此优先形成更稳定的b3*离子（图4）。以上发现进一步证明了Fmoc-DGHGG-NH2中物质1为 Nδ-H 互变异构体，物质2为 Nε-H 互变异构体。根据丰度比以及肽解离途径不同，作者在其他模型肽标记实验中也成功区分两互变异构体。由于组氨酸的pKa在一定程度上会影响互变异构体的比例，因此两互变异构体的丰度比可能会略有变化。总之，以上结果表明，DEPC共价标记质谱可以识别两个组氨酸互变异构体。图4. DEPC 标记的含组氨酸肽 CID 过程中两种异构体的肽片段化途径。左侧通路为物质1（Nδ-H互变异构体），右侧通路为物质2（Nε-H互变异构体）之后，作者还进一步研究了不同DEPC浓度对实验的影响。结果发现，在 DEPC 浓度范围超过一个数量级时，Fmoc-DGHGG-NH2的两种修饰形式的比率基本在4左右保持恒定，其他模型肽的比率略有不同（图5），但随着 DEPC 浓度的增加，给定肽的标记比率保持不变。在质谱可以确认互变异构体结构的肽中，Nε-H互变异构体总是丰度相对更高，洗脱相对较晚。此外，作者发现当组氨酸不是位于N末端残基时，Nε-H 互变异构体的an */bn *比率总是比Nδ -H 互变异构体的更高。但是，若组氨酸残基位于肽的N末端时，在质谱中观察不到b1和a1离子，将对结果造成影响。图 5. 在 DEPC 浓度增加时选择肽的两种修饰形式的标记比率。(a) Fmoc-DGHGG-NH2；(b) Ac-IQVYSRHPAENGK(Ac)；(c) Ac-VEADIAGHGQEVLIR；(d) Ac-LFTGHPETLEK(Ac)。MS/MS 用于通过测量an /bn离子的比率来确认每个互变异构体总而言之，作者成功使用DEPC共价标记质谱区分肽与蛋白质中的组氨酸互变异构体，利用丰度比与洗脱时间，以及CID期间的肽解离模式，区分两种互变异构体。利用该方法，作者团队已经确定了几种蛋白质组氨酸互变异构体比率，并且相对于2D NMR方法，该方法更简单、更快、更精确，有利于探索蛋白质中组氨酸残基周围的局部结构，提供高分辨率的结构信息。[1]Pan X, Kirsch ZJ, Vachet RW. Distinguishing Histidine Tautomers in Proteins Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Anal Chem. 2022 Jan 18 94(2):1003-1010.

圣地亚哥，加利福尼亚州，美国-2018年6月3日，布鲁克于第66届ASMS大会上隆重发布创新质谱产品和多个突破性的生命科学研究工作流程，涵盖临床表型组学和蛋白质组学研究和大规模样本验证、生物制药应用、应用毒理学和法医学。布鲁克总裁兼首席执行官Frank H. Laukien博士表示：“在本届ASMS上，我们推出的新的质谱产品和工作流程将从根本上推动生命科学研究的发展。全新scimaX系统是拥有极限分辨率的磁共振质谱仪，专为高通量表型组学研究而设计。创新性的timsTOF™ Pro捕集离子淌度质谱系统配有在线平行累积连续碎裂（Parallel Accumulation Serial Fragmentation，PASEF）技术，已经在超高灵敏度和超高通量蛋白组学研究上开启了新的研究视野。我相信这两项技术将在临床表型组学和临床蛋白学上发挥重要作用，并且随着时间的推移，未来也将会在新一代测序等医学实践中发挥重要影响。” 1.表型组学和蛋白质组学创新布鲁克推出改变游戏规则的scimaX™ 磁共振质谱仪（MRMS）。scimaX MRMS以更小的占地面积提供超过两千万（R 20,000,000）的行业领先质量分辨率，无需任何液态致冷剂。布鲁克的新型超导冷却Maxwell™ 磁体技术实质上使磁体“缩水”，并允许在标准质谱实验室中使用最高性能的MRMS。这种极端的MRMS分辨率允许同位素精细结构（IFS）分析，轻松确定复杂混合物中精确的元素组成，无需任何色谱分析。利用这种独特的功能，scimaX实现了全分子组成的流动注射分析（FIA-MRMS）的新型工作流程，每天可完成多达200个样本的高通量表型研究。生物制药用户可以使用MRMS进行高级天然蛋白质和基于片段的药物发现研究，MRMS在最近的科学文献中被称为天然蛋白质分析的“写实”平台。凭借可选的MALDI源，制药客户已经证明了MRMS用于药物开发中PK / PD研究的无标记质谱成像的卓越功能。威尔康奈尔医学院教授Steve Gross说：“布鲁克的新型scimaX MRMS系统改变了超高分辨率质谱仪的游戏规则。由于不再使用液体制冷剂降低了运行成本负担，仪器安装不再受场地限制而要求对实验室改造，scimaX可用于任何需要最高质量分辨率的质谱实验室来解决高影响力的科学问题。”布鲁克timsTOF™ Pro，是专为下一代蛋白质组学设计的创新性的质谱产品，这套独一无二的nLC-TIMS-MS/MS系统具有四维分离（4D）特性。它将布鲁克专利的捕集离子淌度谱（Trapped Ion Mobility Spectrometry, TIMS）与在线平行累积连续碎裂（Parallel Accumulation Serial Fragmentation, PASEF）采集方法相结合，可显著提高蛋白组学分析的通量和灵敏度。 MaxQuant v1.6.2.0和PEAKS Studio v8.5现已经可以处理timsTOF Pro产生的蛋白组学数据，用于蛋白质鉴定（ID），非标记定量（LFQ）和串联质量标签（ TMT）定量工作流程。得益于布鲁克开放的文件格式，第三方软件合作者可以快速地进行配套软件开发以兼容timsTOF Pro的数据，目前有多个团队已经在增强他们的软件套件功能以兼容timsTOF Pro的数据。此外，在布鲁克还将Evosep One（www.evosep.com）与布鲁克LC/MS控制软件Hystar 进行整合用于高通量临床蛋白组学，此分析方案每天可以分析多达200个样品。这种全新的组合可带来极高的灵敏度和超高的通量，进样50 ng HeLa细胞蛋白酶解液，仅在5分钟有效梯度内就可以对1200个蛋白质进行非标记定量分析。日本生物流体生物标志物中心（BBC）主任、新泻大学名誉教授Tadashi Yamamoto博士说：“我对timsTOF Pro PASEF工作流的高灵敏度印象非常深刻，它可以使对尿液中的低水平C肽的检测成为一个常规测试，而其它质谱厂商要鉴定到如此低水平C肽不容易。高灵敏度这一关键优势是我决定在实验室中引进这项新技术的主要因素。”布鲁克蛋白质组学副总裁Gary Kruppa博士补充道：“我们非常高兴，PASEF工作流程的高灵敏度得到了我们蛋白质组学客户的验证。同时高灵敏度可用于生物制药中HCP（Host Cell Protein宿主残留蛋白）的表征分析，因为更高的灵敏度可以鉴定到更多先前未鉴定到的蛋白质。考虑到其正交源和双TIMS漏斗的业界领先的稳定性，timsTOF Pro有可能成为生物制药中高灵敏度HCP表征的首选仪器。” 布鲁克在ASMS 2018上还推出了LC-MALDI自动点靶仪spotON，全新的自动点靶仪具有向导驱动式工作流程，可以自动化完成样品点靶，柱后基质添加，支持nano LC和Capillary LC。 spotON LC-MALDI自动点靶仪能让基于MALDI技术的生物制药表征方法变的更简单，比如可用于非常规酶解后的蛋白测序，二硫键测定，糖肽鉴定，膜蛋白的Top-down测序，以及蛋白N端和C端测序测定。为了防止一些敏感的样品在液相分离过程中发生氧化，spotON具有一个氮气罩选项，通入的氮气可以保证点样过程在一个空气隔离的环境中进行。2. 生命科学和转化质谱成像布鲁克推出了2019版SCiLS Lab，其最大特色是为质谱成像（MSI）工作流程添加了定量模块。与其它大家熟悉的定量方法相比，MSI具有无标记和空间分辨的优点。在药物开发和毒理学研究中，依托于全新的、用户友好的SCiLS Lab软件MSI定量工作流程，研究人员能够轻松地从组织中直接量化目标分子。法国雷恩大学IRSET研究主任兼Protim核心设施负责人Charles Pineau博士评论道：“我们在睾丸病理生理学和生殖毒理学领域使用MALDI成像来研究环境毒物对男性生殖器球体的作用机制，或者鉴定在精子生成和成熟过程中起关键作用的蛋白质。我的实验室多年来一直在使用SCiLS Lab进行差异分析。新的定量模块使我们在毒理学研究中能够对目标分子进行定量分析，从而了解它们在组织上的渗透。”集成于SCiLS Cloud的SCiLS Lab，适用于来自不同学科分布式团队的工作流程，以便他们在相同的数据上进行无缝协作。由于可以在MALDI测量后对同一块组织切片进行染色，因此MALDI成像和组织学完全兼容并且可以轻松叠加。SCiLS Cloud的分子组织学工作流程允许与临床合作伙伴实现数据共享，将MSI成像数据和组织染色数据有机整合，获取病理组织全面的组织学注释。这个创新协作平台背后的引擎是SCiLS Lab，全球领先的质谱成像数据分析软件，适用于来自所有主要质谱厂商的数据，包括布鲁克的FLEX系列和MRMS。 3. 用于生命科学和转化医学研究的代谢组学分析 布鲁克推出了用于代谢组学和脂质组学研究的第四代软件MetaboScape® 4.0，支持MRMS aXelerate™ 工作流程。该工作流程在对化合物分子式进行推导时，采用3层置信工具进行确认，以得到准确的分子式结果。 这个新版本软件支持处理大于1000个样本量的大型表型组学研究。 基于scimaX MRMS无与伦比的超高分辨率，aXelerate工作流程突破了传统LC分析通量、复杂性和稳定性上的限制，每天可分析大约200个样品。 T-ReX 4D算法可以处理4D TIMS分离的LC-MS / MS数据并可以显示化合物准确的碰撞截面（CCS）值，从而实现对timsTOF的支持。注释质量评分体系将化合物的CCS也包含进来，这一扩展可以进一步提高化合物鉴定结果的可信度，另外通过复杂的机器学习算法计算脂质的理论CCS，并将其与测量值进行比较，可以增加脂质鉴定的可信度。 密苏里州哥伦比亚大学Lloyd Sumner教授说：“timsTOF Pro的创新技术使我们能够自建许多植物代谢物的CCS值库。 使用者可以搜索这些额外的CCS信息，从而最终提高对代谢物鉴定的信心。“ 此外，布鲁克还推出了非靶向代谢组学分析的解决方案，布鲁克称为T-ReX LC-QTOF。 这套完整的解决方案包括UHR-QTOF，Elute UHPLC，T-ReX代谢组学色谱柱应用包（RP），软件（MetaboScape 4.0与TASQ 2.0）和高质量内容（样品制备的标准操作流程和方法设置，以及更新的布鲁克HMDB代谢物谱库2.0，包括保留时间信息）。 加拿大埃德蒙顿阿尔伯塔大学Liang Li教授评论道：“我们很高兴能与布鲁克合作开发全面的“T-ReX LC-QTOF解决方案”。 这一完整的开箱即用解决方案为相关已知内源代谢物的高置信度鉴定奠定了基础，并可通过代谢通路分析将其转化为生物学信息。 对于像尿液或血浆等样品的非靶向代谢组学的研究而言，这一解决方案可以让研究人员快人一步。” 4. 应用毒理学和法医学布鲁克宣布发布筛查方案增强版本TargetScreener HR 3.1，数据库中共有超过2,800种化合物，其中新增包括兽药、新型精神类药物和农药在内的600种化合物。TargetScreener的所有版本均包含TASQ™ （目标物筛查和定量分析）软件，为法医、食品和环境安全市场中的自动筛查和定量应用提供统一的平台。TASQ使用独特的方法从高度精确的数据库中获得鉴定结果，从而将假阳性和假阴性率降至最低，筛查同时进行无缝定量分析。德国弗赖堡大学法医研究所法医毒理学系VolkerAuw?rter教授和Laura Huppertz博士评论道：“由于TASQ的自动化和直观性，TargetScreener已被证明对提高我们的生产力非常重要。该方法将Impact QTOF仪器的高质量准确度与先进的鉴定和确认标准相结合，从而将假阳性率降至最低。仪器的灵敏度能确保检测到包括头发在内的人类样品中与高浓度组分共流出的微量成分。此外，仪器的动态范围允许我们同时进行浓度的实际估算。对于我们必须解决的案例以及有限的样本量，特别是涉及新型精神类药物的案例，追溯性数据评估对我们具有很大的价值。”位于田纳西州布伦特伍德的美国成瘾实验室目录的HowardTaylor博士说：“我们的实验室购买了14台布鲁克Compact QTOF，因为它们的可靠性和简单易用。 TASQ软件特别直观，非常方便用户使用。定量分析具有极大的灵活性，用户可以快速识别异常值。此外TASQ软件可以很容易地添加新的分析物用于新型药物的追溯性搜索。” 关于布鲁克公司（纳斯达克股票代码：BRKR）布鲁克正在帮助科学家们取得突破性发现并开发新的应用来提高人类生活质量。布鲁克的高性能科学仪器和高价值分析及诊断解决方案使科学家能够在分子、细胞和微观层面探索生命和材料。在与客户的密切合作下，布鲁克致力于在生命科学分子研究、应用市场和制药应用、显微镜和纳米分析、工业应用、细胞生物学、临床前成像、临床表型组学和蛋白质组学研究以及临床微生物学。 欲了解更多信息，请访问布鲁克官网。

《自然—方法学》特写：无需标记的激光特技 　　非线性光学显微术帮助科学家看到活体细胞和组织中化学组成　　 　　哈佛大学的Brian Saar，Gary Holtom和谢晓亮教授(从左至右)发展了非线性显微成像技术和应用。　　 　　一个富含蛋白质的毛发及其周围的富含脂肪的皮脂腺。该图像是通过受激拉曼散射方法采集的，绿色为脂肪，蓝色为蛋白质。 　　最近出版的《自然—方法学》刊登特写文章——《无需标记的激光特技》(Laser tricks without labels)，称非线性光学显微术可帮助科学家看到活体细胞和组织中的化学组成。文章内容如下： 　　两年前，Annika Enejder在她关于线虫的脂肪贮存研究中，遇到一个令人困惑的结果。荧光显微图像非常清晰地表明，在用他汀类药物处理这些蛔虫时，来自脂肪粒的信号将降低。他汀类药物是一类被广泛用于降低胆固醇的药物。然而，在同时进行的另一种显微实验中，直接观察脂肪颗粒却看不到这样的变化。实际上，相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)显微技术能够识别出脂肪颗粒，而荧光显微技术做不到。 　　其实是这么回事，用常用的Nile red荧光染料饲喂的线虫把这种染料当作毒物处理了：染料被隔离到脂肪粒周围的肠类溶酶体颗粒中，而不是脂肪粒中。实际上，这种染料还在别的方面具有误导性：他汀类本身似乎会影响它的染色或者荧光。“在使用荧光基团的时候，有很多假象要考虑到。” 来自位于瑞典查尔姆斯理工大学的Enejder说。 　　没人能够否定荧光探针和分子染色在细胞内行为探测上的实力，但是这种标记办法仍然有诸多问题。如何标记是一个问题，尤其是对整个有机体而言。有些标记只能在已死亡的细胞内有作用 其他的标记标记方法则会损伤细胞，或者干扰所研究的生物过程。非标记的显微技术提供了一种能够大幅度降低人为干扰的活体观察技术。虽然有些技术仍然依赖内源性荧光基团，不过它们基本上可以摒弃荧光技术，也就避免遇到光漂白这个常见问题。这些新技术探测的是光在通过生物样品时被吸收或者改变时发生的微小变化，而不是探测被激发荧光基团的光子。这种办法依赖在高光功率密度下观察到的非线性光学过程。一言以蔽之，激光脉冲可以被用来“看”化学组成：脂质里面的C-H键，蛋白质里的酰胺键，还原态或者氧化态的生物分子，胶凝蛋白或者微管里面有规律地重复的单元。 　　当然，这样的技术也自有其局限性：与荧光标记能够识别单分子相比，非标记技术的灵敏度和特异性都要弱一些。只有特别常见的基团才不会淹没在一些丰富样品产生的信号当中。“这种技术的好处是，你不需要任何标记，你只需要去成像就行了”，荷兰癌症研究所(Netherlands Cancer Institute)的生物物理学家Kees Jalink解释道，“但是不好的地方是，信号太弱了，你需要大量能量来照射一个细胞，而可能仅仅得到一些粗枝大叶的细节。 　　非线性的众多模式 　　除CARS以外，其他可用的非标记手段包括双光子吸收，二次谐波产生(SHG)以及受激拉曼散射，每一种都有自己的配置需求和优势。然而，这些手段并没有在生物学家中间闪电般地传播开。昂贵的激光需要被耦合进显微镜 光的短脉冲需要精确的瞄准、调整和整形 探测器必须被优化，从而能够拾取信号，舍去背景。“组装这些仪器需要丰富的专业经验 这些仪器都要求苛刻”，供职于加拿大不列颠哥伦• 比亚大学化学与工程系的Robin F.B. Turner这样评价。而仅仅搭建仪器是不够的。“你得根据每天的情况重新校准”，Turner补充道。 　　Turner说，他有充分的理由跟踪这些技术：他想知道干细胞在分化成其它细胞的时候，其中的组分如何变化，而且再也没有比这个更好的办法能够研究这个问题了。“我们之所以选择拉曼和CARS，是因为它们能够做这种研究而不损伤细胞”，他说。其它研究手段都会毁损细胞，得到的仅仅是在某个时间点上的一个瞬间状况 这样的数据对于包含自发分裂细胞的异质性细胞培养并不是十分有用，Turner补充道，“我们想追踪细胞的生长”。 　　同样的优势在组织层次的研究上也很突出。比如，哈佛大学的Gary Ruvkun通过对线虫诱导RNA干扰筛选来研究上千个基因在脂质生成中的角色，同时通过一种叫做受激拉曼散射(SRS)的技术来监视这些结果。 　　Ruvkun的合作者谢晓亮教授也来自哈佛大学。大约十年前，谢晓亮因为发布了CARS显微术而引发了巨大轰动。这种技术通过一种叫做自发拉曼散射的现象来增强信号。在自发拉曼散射中，样品内的化学键能够改变通过其中的光的波长。更早使用的拉曼散射显微术要求的激光功率很高，而且有时候需要曝光时间长达一天。谢晓亮和他的同事证明，CARS可以用于活细胞研究。通过使用两束激光，它们的频率差等于需要成像化学键的振动频率，细胞产生的微弱的拉曼信号能够被不断放大。“它的灵敏度比自发拉曼散射的灵敏度高了好几个数量级”，谢晓亮说。但是CARS也有缺陷。在同一时间里，它只集中在很宽的拉曼谱中很短的一段，限制了所能采集的信号的数量 同时还带来了很高的背景信号。从实用的角度讲，这些限制意味着如果要应用CARS技术，大部分时间要基于对脂质的探测，因为碳氢键的大量富集能够产生很强的特征信号。 　　谢晓亮的兴趣已经转移到了SRS，这是他和他的组员闵玮、Christian Freudiger共同发展出来的技术，相关论文于2008年发表。“在CARS里面，信号峰位发生了移动，”谢晓亮解释道，“这意味这我们不能使用现有的、数量巨大的拉曼谱数据进行化学鉴定。”他还讲到，与此相比，SRS能够通过对激光异常迅速和精确地调制来去除背景噪音。这样一来，不仅能够得到与传统拉曼光谱一样的谱图，而且信号强度高了几个数量级，采集时间也远低于未经放大的拉曼信号。谢晓亮说，更妙的是，SRS产生的信号与振动化学键的数量是线性关系，这使得SRS能够进行定量分析。SRS技术可以应用于实时观测：比如在在药物和化妆品研究领域，观察维生素A酸是如何被皮肤吸收的。SRS技术还可以用于观测酸或者酶是如何从植物细胞壁表面去除木质素，从而提高生物燃料的生产效率。 　　谢晓亮最早是通过与Pfizer以及哈佛研究者的合作研究获得对该技术的原理的证据的。谢晓亮甚至预言，SRS技术有一天会取代CARS技术，然而其他研究人员对此有所保留。SRS需要对多个光源的信号进行混合和解读，而谱的叠加也会使去卷积变得困难。Turner说，他曾经尝试用SRS观察溶液中的核酸，最后还是决定继续使用原来的老技术。利用那些老技术，就可以从细胞的DNA里分辨出RNA。他说，尽管拉曼显微镜可能慢一些，“但是应用SRS技术来扩展我们的知识也挺费劲的，跟使用传统拉曼技术差不多。” 　　采购与分享 　　谢晓亮预计，一旦SRS被植入商用系统，很快就会传播开来，他认为早在今年底之前就会取得这样的进展 据报道，蔡司和徕卡已经于去年获得这项技术的授权。然而，就像荧光显微镜的前车之鉴，技术的传播可能相当缓慢。第一台商用多光子显微镜于1996年发布 而2003年的一项调查发现，66%使用多光子显微镜的生物学研究仍然使用定制系统。现在，商用多光子显微镜则相当普遍。 　　2009年10月，适逢谢晓亮的文章发表十年，奥林巴斯宣布要提供可以安装在多光子显微镜系统上的femtoCARS模块。2010年1月，Newport公司展示了可以附接到激光和多光子显微镜上的波长扩展单元，用以支持CARS、SHG以及其他成像方式。据悉，徕卡也将于下半年推出自己的产品。奥林巴斯的产品经理YiWei(Kevin)Jia宣称，早在飞秒femtoCARS模块发布之前，他已经在帮助各个研究组着手搭建CARS系统 而这个用来探测脂肪的模块能够让起步更加容易。他说，如果CARS的商业化产品推广像多光子显微镜一样，那么销售则能在数年之内有一个大的飞跃。不过目前大多数应用CARS显微技术的主要还是物理实验室，而且使用的是自己搭建的系统。 　　不过，这些研究人员已经开始和生物学家们合作。在普渡大学，生物医学工程教授程继新利用CARS在细胞中迅速地寻找脂肪体，然后使用同样的光源，切换到共聚焦拉曼来做同一个区域更详细的化学成分分析。新近关于人类前列腺肿瘤细胞的研究发现，先前被认为由脂肪组成的区域，实际上是被氧化的脂肪酸。下一步是考察这种脂肪酸会否可以用于标记前列腺癌的严重性。在别的项目中，程继新已经发展了一个平台，可自动收集CARS信号的来观测脂肪，还利用一种叫做和频产生的技术看到特定的蛋白纤维。有了这种技术，程继新及其合作者们可以研究富脂免疫细胞如何将自己嵌入到血管壁的胶原蛋白基质中去的——这类观测可以揭示动脉粥样硬化中的血块是如何形成的。程继新和他的同事还独立监测了多发性硬化症的老鼠模型中的神经元髓鞘，并且精确地指出是轴突的某个地方出现了损伤。他说，“以前在活体组织中对髓鞘的监测是没有办法达到单细胞水平的。” 　　Jalink说，髓鞘因为紧密堆积了大量脂质，特别适合用CARS成像。非标记显微技术在其他方面的应用则可能没那么容易。他说经常使用激光器的研究人员很可能会想办法采用这样的技术，他补充道，“技术上讲，这是完全可行的，但是如果我能用另一种方式来获得同样的信息，我为什么要采用这个多少有些复杂而且昂贵的技术呢?” 　　技术一旦发展起来，研究人员就能把它们应用到新的方面。哥伦比亚大学的Rafael Yuste利用光学手段来测量神经电位。二次谐波发生(SHG)成像技术依赖于排列非常规则的分子产生的超散射光。这些分子具有极强的诱导偶极矩，或者特定的电荷分布。Yuste对位于神经元细胞膜这类分子非常感兴趣——因为电场贯穿其中。由于二次谐波信号和电场强度直接成比例，因而可以自动获得电压信号。 　　问题在于，能够很好地实现这一目标的分子非常少。为了达到好的效果，Yuste说，“你需要非常仔细地去扫描全谱，来寻找潜在的内源性二次谐波发色基团。”他说，发展这种技术需要依赖学科交叉，需要研究人员在他们研究领域的边缘工作。但是在现实中，这种工作往往在研究者们自己的系里得不到足够的资金和支持，这也是为什么能够实现这一目标的分子资源较少的原因。 　　Enejder等人相信，学科交叉能够帮助人们解决大量只能由非标记的非线性显微技术来观测的问题。虽然Enejder的背景的是物理学，她还是转到了生物系。因为在那里可以更容易的了解生物学家们在成像上到底遇到了什么问题，非线性光学如何才能帮得上忙。她说，那些把自己的眼光牢牢地局限在物理系内部的人可以继续优化技术，但是他们或许不了解生物学家到底希望看到什么：“我就完全没有这个问题。在我眼里，应用随处可见。” 　　当这样的交流变得日益重要的时候，对新实验的大胆尝试也变得重要起来——而这些实验与物理学家们以往的经验可能截然不同。在一项旨在制造弹性血管的生物工程项目中，Enejder和同事们想要监测植入纤维素基质的肌肉细胞的生长。与CARS一起，Enedjer和同事们利用SHG观察了植入的细胞。他们很高兴地发现，自己可以监测到被植入细胞是如何与纤维素网进行接触，开始生成胶原蛋白纤维的。在组织工程研究中，这种方法可以大大帮助确定最优参数。尽管纸张中的植物纤维素SHG成像看不到，但是细菌分泌的植物纤维素确实拥有一种有规律的模式，能够产生SHG信号，Enejder解释说，“仅仅依赖别人文章里说的哪些可以观测是不行的，你得自己去试才行。”

糖是组成生命体的四大类重要分子之一，糖蛋白质是由糖链与肽链中的特定氨基酸残基以糖苷键共价连接而成的蛋白质。糖蛋白质普遍存在于生物体内，在很多生命过程中起着重要作用，如蛋白质的折叠、细胞之间的相互识别、炎症反应等。同时，糖基化修饰在疾病中，特别是肿瘤的发生、发展和转移过程中也起到重要作用，许多疾病诊断标志物及治疗的靶标都是糖蛋白质。糖蛋白质组学和糖组学的研究具有重要的科学意义。以基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)和电喷雾质谱(ESI-MS)为代表的生物质谱技术，因具有快速、灵敏、可提供结构信息等优点，已成为糖蛋白质组和糖组分析的重要工具。　　由复旦大学杨芃原教授团队撰写的综述文章“质谱技术在糖蛋白质组学与糖组学方面的研究进展”发表于2016年第3期的《国家科学评论》。这篇综述论文系统介绍了近年来以质谱为核心的糖蛋白质组和糖组的研究策略和方法，以及该领域重要的生物和临床发现。重点讨论了国内糖蛋白质组学和糖组学研究团队在糖蛋白质和糖链的分离富集、糖链的衍生，糖链和糖蛋白质的质谱碎裂技术，糖链及糖蛋白质序列组成分析的软件技术等方面的进展，并分析了基于质谱技术的糖蛋白质组和糖组研究的关键问题，展望了该领域未来的发展趋势。　　杨芃原教授团队在基于质谱的糖蛋白质组学和糖组学方面展开了系统的研究。他们发展了一系列糖蛋白质/糖链富集和质谱定性的新方法，建立了基于复合纳米材料的富集新方法，基于新的共价反应的富集新策略，以及基于协同富集思路的富集新流程 建立了一系列糖蛋白质/糖链的质谱定量新方法，提出了酶促去糖链过程中的标记定量新方法和糖蛋白质组在蛋白质水平、糖基化程度水平及糖链水平的同时定量新方法等 开发了高通量糖蛋白质质谱检索的新算法等。这些工作提升了中国糖蛋白质组学和糖组学的研究水平，为糖蛋白质组学和糖组学研究提供了新的研究方法。

p strong 仪器信息网讯 /strong 6月30日至7月1日，由中国分析测试协会标记免疫分析专业委员会主办，解放军总医院承办，绍兴市生物医学工程学会协办的“标记免疫分析专业委员会2017年学术峰会”在美丽的水乡绍兴落下帷幕。本次会议紧扣“跨界”主题，不仅跨专业、跨学科，而且跨领域、跨机构。来自政、商、产、学、研各个领域的专家学者齐聚一堂，就创新技术、政策解读、人才培养、经验分享、行业现状、投资热点等话题作广泛交流和探讨，给标记免疫分析领域带来全新视野和深刻启发。 /p p style=" text-align: center" img title=" 1.png" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/633b012c-2fdc-42bc-b307-dbcf7ac50d21.jpg" / /p p style=" text-align: center " 大会现场 /p p 　　 strong 创新技术 /strong /p p 　　为期两天的大会，精彩报告层出不穷，创新技术不断涌现，令人振奋不已。 /p p 　　在题为《深度覆盖的蛋白质组定性定量分析新方法》的报告中，中国科学院院士、中国科学院大连化学物理研究所研究员张玉奎介绍了他们课题组基于不同原子的质量亏损值不同的现象，设计完成了准等重标记蛋白质组定量方法体系，实现了蛋白质组样品的化学标记和代谢标记。该方法体系的特点突出：由于轻重标记肽段在一级质谱上准等重而不增加谱图的复杂性 在二级质谱上，Orbitrap等高分辨质谱将存在的微小差异的碎片离子分辨产生成对的离子，进而实现蛋白质组的高准确度，高精密度和宽动态范围的定量分析。此外，张玉奎课题组针对膜蛋白溶解低等问题，发展了基于离子液体-氯化-1-十二烷基-3-甲基咪唑的膜蛋白样品预处理新技术，应用于HeLa细胞全蛋白组的分析 鉴定到的蛋白质和膜蛋白数目明显优于目前报道的结果，且显著提高了分析通量。 /p p style=" text-align: center" img title=" 2.png" style=" width: 400px height: 400px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/1a2ab6a9-683a-4be3-bdc4-72f27543579e.jpg" height=" 400" hspace=" 0" border=" 0" vspace=" 0" width=" 400" / /p p style=" text-align: center " span style=" text-align: center " 中国科学院院士、中国科学院大连化学物理研究所研究员 张玉奎 /span /p p 　　军事医学科学研究院放射与辐射医学研究所研究员王升启在题为《表面增强拉曼光谱检测新技术及其在生物诊断中的应用》的报告中介绍，表面增强拉曼散射是一种新兴的光谱检测技术，具有灵敏度高、可非标记检测等特点，适用于复杂环境中低浓度生物样品的检测。高性能拉曼基底材料是限制表面增强拉曼散射技术实现超灵敏、现场检测的瓶颈问题。针对该问题，王升启课题组发明了一类新型表面增强拉曼光谱检测纳米材料，基于该材料建立的高灵敏表面增强拉曼散射检测新技术，使现场检测的灵敏度提升10倍以上 为便于推广应用，该课题组还发明了一种集成化拉曼快速检测仪器，显著提高了表面增强拉曼散射现场检测的实用性和自动化程度。该项工作目前已发表SCI论文17篇，申请发明专利6项。 /p p style=" text-align: center" img title=" 3.png" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/67185d02-120a-4513-9fe1-543f7fb43eab.jpg" / /p p style=" text-align: center " 军事医学科学研究院放射与辐射医学研究所研究员 王升启 /p p 　　清华大学化学系教授林金明在题为《化学发光免疫分析》的报告中介绍，化学发光免疫分析既具备化学发光反应的高灵敏性，又具有免疫体系的高特异性。该技术因具有分析速度快、线性范围宽、无散射光干扰、无放射性污染、仪器设备简单等优势，在临床诊断、生命分析、环境科学等领域得到了广泛应用。特别是最近几年，随着一些新技术、新材料的发展成熟，化学发光免疫分析与各种新型材料(纳米材料、量子点、磁性材料等)及新技术(免疫层析、微流控芯片等)的融合促进了化学发光免疫分析突破性的发展。目前对于化学发光免疫分析研究的焦点：一方面增强发光效率，提高检测的灵敏度 另一方面与各种分析技术相结合，探索新的化学发光免疫分析检测方法。 /p p style=" text-align: center" img title=" 4.png" style=" width: 400px height: 400px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/13d5e5c6-69ad-4ea1-9d40-19a3bc84421c.jpg" height=" 400" hspace=" 0" border=" 0" vspace=" 0" width=" 400" / /p p style=" text-align: center " 清华大学化学系教授 林金明 /p p 　　国家纳米科学中心研究员蒋兴宇在题为《针对医学检测的微流控芯片/纳米技术》的报告中讲到，微流控芯片在分析检测领域有诸多潜在应用。微流控芯片可以精确操纵微量液体，在检测各种小分子、蛋白质、核酸等物质有一系列优势，例如高通量、集成化等。在一些蛋白质生物标志物的检测中，微流控芯片可以在便携式系统中完全实现定量免疫检测。微流控芯片还可以用于精确操作细胞，并建立体外的组织和体外的模型，用于更好的分析细胞内信号转导并促进新的治疗方式(药物、医疗器械)的研发。 /p p style=" text-align: center" img title=" 5.png" style=" width: 400px height: 400px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/0bf38030-51a2-4a28-927b-abba30001bb6.jpg" height=" 400" hspace=" 0" border=" 0" vspace=" 0" width=" 400" / /p p style=" text-align: center " 国家纳米科学中心研究员 蒋兴宇 /p p 　　北京大学化工与分子工程学院教授赵美萍在题为《血管加压素的均相免疫荧光分析方法》的报告中介绍了他们课题组以血管加压素为例，发展了均相免疫荧光分析方法的工作。该均相竞争免疫荧光分析方法无需多步洗涤操作步骤，响应快，为进一步开发清醒动物脑区神经短肽含量变化的在线连续实时监测方法奠定了重要基础，对阐明思维和情感的分子机制、延缓衰老和防治精神疾病等都将具有重要意义。另外，报告还简要介绍了ATP和APEI两种物质的快速高通量荧光分析方法，并看好其与临床检测相结合，提供更高效的临床检测手段的前景。 /p p style=" text-align: center" img title=" 6.png" style=" width: 400px height: 400px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/719e0151-ea0b-4491-9a34-a4c0aeb2a34e.jpg" height=" 400" hspace=" 0" border=" 0" vspace=" 0" width=" 400" / /p p style=" text-align: center " 北京大学化工与分子工程学院教授 赵美萍 /p p 　　 strong 政策解读 /strong /p p 　　国家食品药品监督管理总局医疗器械注册管理司注册一处主任科员、副高级工程师赵阳在题为《体外诊断试剂注册相关法规介绍》的报告中向与会者介绍了体外诊断试剂注册相关法规要求，2014版体外诊断试剂注册办法及相关法规主要特点，体外诊断试剂注册管理办法修正案、体外诊断试剂临床豁免目录与体外诊断试剂注册管理新变化等内容。 /p p style=" text-align: center" img title=" 7.png" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/87505d4b-339c-4d57-bb23-35e0f8b6d322.jpg" / /p p style=" text-align: center " 国家食品药品监督管理总局副高级工程师 赵阳 /p p 　　 strong 经验分享 /strong /p p 　　原卫生部临检中心教授杨振华主讲了题为《生化测量溯源的经验》的报告，向与会者分享了一些当代检验医学特别是临床化学溯源工作中的一些经验。他讲到，与一般测量不同，在溯源中增加次级参考测量方法和次级参考物质的层次，次级参考物质应有与被测物质应有与被测样本相同的基质并具有换性，实践证明，患者的自然样本(库)是次级参考物质的较好来源。以雌三醇为例，中国多个参考实验室正在进行未结合雌三醇的协同研究，给次级参考物质赋值，并尝试传递到以抗原抗体反应为基础的测量方法。杨振华指出，如果上述工作遇到困难，可以考虑用“一致化”而非标准化的方法来解决以抗原抗体方法反应为基础的测量未结合雌三醇结果的一致化。也可考虑用质谱技术直接测量未结合雌三醇。 /p p style=" text-align: center" img title=" 8.png" style=" width: 400px height: 400px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/41f00ad4-ff3f-4713-8674-6ced8c720120.jpg" height=" 400" hspace=" 0" border=" 0" vspace=" 0" width=" 400" / /p p style=" text-align: center " 原卫生部临检中心教授 杨振华 /p p 　　 strong 人才培养 /strong /p p 　　浙江大学附属邵逸夫医院副院长兼检验科主任、浙江大学教授谢鑫友在题为《检验与临床——检验医师的培养与前景》报告中介绍了检验医师的重要性、检验专科医师的培训、国内外检验医师制度的比较及我国检验医师规范化培训内容与标准(试行)培训细则、专科基地建设的内容等情况。 /p p style=" text-align: center" img title=" 9.png" style=" width: 400px height: 400px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/0b3891bf-71d1-42a8-8747-700a3e2c5b0d.jpg" height=" 400" hspace=" 0" border=" 0" vspace=" 0" width=" 400" / /p p style=" text-align: center " 浙江大学附属邵逸夫医院副院长兼检验科主任、浙江大学教授 谢鑫友 /p p 　　 strong 行业现状 /strong /p p 　　北京协和医院研究员李永哲在题为《自身免疫病实验诊断技术临床应用现状和发展趋势》的报告中介绍，自身免疫疾病(AID)约影响到世界人口的5%，我国患者也已达到5000万人以上。目前，50%以上的疑难杂症与自身免疫病有关，对自身免疫病临床实验诊断技术需求广泛而迫切，在早期诊断、鉴别诊断、分层、分型、病情评估、预警、预后判断、个性化诊疗方面具有重要临床价值。李永哲指出，目前中国自身免疫病实验诊断核心技术缺乏创新性 产品多追逐短期效益，导致同质化严重，缺乏竞争力 产品质量、通量尚需磨合，以满足临床需求 未来产品形态趋向特性化、小型化、集成化、信息化。 /p p style=" text-align: center" img title=" 10.png" style=" width: 400px height: 400px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/1ebd7b77-4c77-4135-a49f-0775cb4fc987.jpg" height=" 400" hspace=" 0" border=" 0" vspace=" 0" width=" 400" / /p p style=" text-align: center " 北京协和医院研究员 李永哲 /p p 　　 strong 投资热点 /strong /p p 　　盛世景资产管理集团股份有限公司高级投资经理崔辰向与会者介绍了国内IVD市场竞争格局、市场份额占比、产业链及产业增长驱动因素。他指出，国内第三方医学检验室市场完成率仅为5%，市场潜力巨大，前景广阔 POCT市场近几年保持8%的复合增长率，2015年我国POCT市场规模约约70-80亿元人民币 分子诊断是所有IVD细分市场中增长最快的，2011-2015年均复合增长率为30% 液体活检2017-2023年均复合增长率将达28.9%。 /p p style=" text-align: center" img title=" 11.png" style=" width: 400px height: 400px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/75ba968f-cdfa-4c3b-8c74-20b599acd5b7.jpg" height=" 400" hspace=" 0" border=" 0" vspace=" 0" width=" 400" / /p p style=" text-align: center " 盛世景资产管理集团股份有限公司高级投资经理 崔辰 /p p 　　大会最后一个报告由中国分析测试协会技术部主任汪正范主讲，他向与会者介绍了中国分析测试协会2017年下半年的工作安排，并对现行的团体标准进行了解读。 /p p style=" text-align: center" img title=" 12.png" style=" width: 400px height: 400px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/2a0d064e-7394-41b7-9031-8ed49e6540c6.jpg" height=" 400" hspace=" 0" border=" 0" vspace=" 0" width=" 400" / /p p style=" text-align: center " 中国分析测试协会技术部主任 汪正范 /p p 　　本次大会还特别增设了主题讨论环节，就IVD等热门话题，邀请多位嘉宾参与讨论。 /p p style=" text-align: center" img title=" 13.png" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/a9020e40-e0a4-4fb6-b1a5-5333f9e48e03.jpg" / /p p style=" text-align: center " 主题讨论一 /p p style=" text-align: center" img title=" 14.png" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/daabd29c-05f1-480f-a561-142f7cc18671.jpg" / /p p style=" text-align: center " 主题讨论二 /p p 　　本次大会气氛热烈，回响不绝，共有50位专家学者作主题报告，除主会场外，还特别开设了4个主题分会场，分别聚焦标记免疫标准化和自动化、标记免疫临床评价与液态活检、免疫诊断新技术、标记免疫分析基础研究与临床 另有罗氏诊断、雅培、上海透景、烟台澳斯邦生物、山东新华医疗器械5场企业卫星会，与主会场交相辉映。 /p p style=" text-align: center" img title=" 15.png" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201707/insimg/5f804fa0-0b9d-4687-a4b0-6b3355a261d3.jpg" / /p p style=" text-align: center " 大会合影 /p

2011年3月11日，Pittcon 2011在美国亚特兰大召开，仪器信息网编辑参加了此次展会并在期间先后走访了5家美国著名仪器制造商：麦克仪器公司、AB SCIEX公司、沃特世公司、戴安公司和赛默飞世尔科技公司。 　　这5家仪器厂商都具有至少几十年的相关仪器制造经验，并且都很早就进入了中国市场。此次我们参观的生产工厂和应用中心均是每个仪器厂商重点保护的“核心区域”，在征得各厂商相关负责人的同意后，现将仪器信息网编辑的采访见闻展现给国内用户，以飨读者。 　　美国圣何赛2011年3月21日上午，仪器信息网编辑如约来到了位于美国硅谷的赛默飞世尔科技(Thermo Fisher)色谱、质谱工厂进行参观访问。 　　赛默飞世尔科技媒体沟通负责人Stephanie Kubina女士，策略与市场部经理黄莹莹博士、科学仪器部蛋白质组市场总监Andreas FR Huhmer先生、生命科学质谱部副总裁Iain Mylchreest先生等与我们进行了深入的沟通和交流，详细耐心地回答我们提出的一些问题。 　　赛默飞世尔科技可以称作仪器领域的航空母舰，目前已经至少进行了超过250起并购，经过整合目前拥有Thermo Scientific 和 Fisher Scientific 两个首要品牌。赛默飞世尔科技2010年销售额接近 110 亿美元，在全球拥有37000名员工，在中国约有1500名员工，也许只有赛默飞世尔科技自己才知道在全球有多少工厂，我们此次参观拜访的是位于美国硅谷的赛默飞世尔科技色谱和有机质谱装配工厂。 　　一、与赛默飞世尔科技质谱专家探讨质谱技术发展趋势 赛默飞世尔科技科学仪器部蛋白质组市场总监Andreas FR Huhmer先生(左)，媒体沟通负责人Stephanie Kubina女士(中)与我们进行交流 　　据Andreas FR Huhmer先生介绍，赛默飞世尔科技Orbitrap技术的发明是质谱领域的一次革命性突破，它带来的最大好处就是可以让用户获得接近FT-MS分辨率的同时，只需付出普通质谱所需要的维护费用。赛默飞世尔科技将这一技术进一步提升，将LTQ的高速度和高灵敏度与Orbitrap精确质量鉴定能力、高分辨能力(100000)很好地结合在一起，完全可以满足低丰度蛋白质测定要求，支持所有同位素标记的和非标记的(label-free)蛋白定量方法。Andreas FR Huhmer先生还与我们探讨了他对于Q-TOF以及便携式质谱的一些看法。 赛默飞世尔科技生命科学质谱部副总裁Iain Mylchreest先生(左)，媒体沟通负责人Stephanie Kubina女士(中)与我们进行交流 　　Iain Mylchreest先生在谈话中提到一个非常重要的概念就是“Workflow”。Workflow是以客户的应用为终极目标，开发完整的样品处理、样品分析、数据处理和管理的工作流程，建立研究领域样品分析的SOP，使得客户端的分析工作大大简化，从而提高工作效率。 　　蛋白组学研究是生命科学中的一个重要领域，赛默飞世尔科技目前可提供的Workflow有蛋白质表达谱、翻译后修饰、生物标志物发现、目标蛋白定量，每个Workflow包括了从样品前处理、样品制备、仪器分析、数据处理的所需的消耗品、仪器、软件和方法，因而复杂的蛋白质分析得以实现高通量和高质量。 　　在制药领域，赛默飞世尔科技同样可以提供在药物发现和临床试验阶段完整的Workflow。 　　二、参观赛默飞世尔液相色谱、三重四极杆、LTQ Obitrap装配车间，零配件从世界各地采购 　　我们此次主要参观了赛默飞世尔科技这个工厂的三个部分：液相色谱区域、三重四极杆质谱区域和LTQ Obitrap区域。每种产品都有一个系统集成区域和产品测试区域。 通往工厂走廊的墙壁上绘制了赛默飞世尔科技的发展简史，最早可以追溯到1910年 专利证书挂满了整个墙壁 　　(1) 色谱装配区 赛默飞世尔科技的HPLC系统集成区域，这里的零配件从世界各地采购，据介绍有相当一部分零配件来自中国 HPLC系统集成区很重要的一部分就是泵组装区域 　　赛默飞世尔科技今年在液相色谱泵性能方面进行了很大的提升，Accela 1250的液相泵最高操作压力可达1250 bar，最高流速可达2mL/min，而延迟体积只有70μL。传感器不会由于接触流动相而产生响应波动。压力反馈控制技术确保Accela 液相泵在没有脉冲阻尼器的情况下也能提供精确的梯度。 HPLC系统成品测试区域 　　这个工厂所有的单元按照地上各种颜色的划线进行整齐摆放，严格注意细节才能保证质量。 　　(2)质谱装配区 数十台LTQ Velos双压线性离子阱质谱系统正在进行最后的测试 　　这种测试非常严格，各种指标测试完毕通常要2个月。双压线性离子阱质谱系统是赛默飞世尔2009年推出的新产品，该产品的推出弥补了单压离子阱的不足，高压单元能够将离子捕获能力提高90%，将碎裂时间缩短到原来的1/3 而低压单元能够将扫描速度提高2倍，同时提高质谱分辨率至0.1 μ FWHM，可以与超高压液相色谱兼容，并同时快速分析大量低丰度含量成份。 正在进行测试的LTQ Orbitrap Velos 　　这是一台组合质谱，将LTQ的高速度和高灵敏度与Orbitrap精确质量鉴定能力、高分辨能力很好地结合在一起，LTQ Orbitrap Velos是赛默飞世尔独有的产品。 4套LC与一台MS组成一套系统 　　这个是很有意思的一套系统，可以把4套LC连接到一台MS上组成一套系统。我们之前在AB SCIEX、Waters都看到了一台质谱服务于多台色谱，看来这将成为一种技术趋势。 物流仓库 　　这是一个非常先进物流仓库，货架上装备有电脑控制的自动传送带上，可以自动分检和传输。　　 这个区域摆放的是完成测试准备交付用户的质谱仪器 　　编者后记 　　赛默飞世尔科技的发展速度惊人，其通过收购和兼并迅速获得相关领域的核心技术和市场的方式堪称是业内典范，而质谱领域又是其重中之重。目前，赛默飞世尔科技在有机质谱领域布局了三大系列产品：离子阱、三重四极杆质谱和Orbitrap，另外还有由这三个系列延伸出的组合产品，如LTQ Orbitrap Velos等。赛默飞世尔科技收购戴安的程序正在进行中，如果成功将大大加强其在液相色谱领域的竞争力，对这一领域的格局将产生重要影响。 　　撰稿编辑：刘向东

传统医学模式正进入到代谢组学、基因组学、蛋白质组学等多组学整合分析的精准诊断时代。以高性能质谱为核心的多组学研究已成为各类疾病筛查、早期诊断、治疗监测和预后评估的生物标志物创新发现的关键技术平台。近年来，慢病的发病率和死亡率持续走高。利用慢病大规模人群队列，结合质谱检测技术发现新型生物标记物，可以为慢病的防治提供新的线索和手段。为促进相关人员深入了解质谱技术与慢病标记物研究进展，掌握相关应用知识，仪器信息网将于2022年7月15日召开“质谱技术与慢病标记物研究”网络会议，邀请业内专家和仪器厂商，聚焦慢病队列、质谱检测技术和生物标记物发现等热点研究领域分享报告。会议日程7月15日下午 质谱技术与慢病标记物时间报告主题报告嘉宾14:00-14:30代谢异常与肿瘤发生常江 华中科技大学 教授14:30-15:00基于高精度质谱技术的蛋白质修饰解析刘小云 北京大学 研究员15:00-15:30安捷伦整合生物学解决方案-基于靶标代谢组学与代谢流技术用于临床疾病表型研究詹舜安 安捷伦科技（中国） 大中华资深液质应用专家15:30-16:00因果推断及在医学研究中的应用余勇夫 复旦大学 研究员16:00-16:30代谢组学驱动的代谢性疾病早期标记物发现房中则 天津医科大学 教授报告嘉宾（按报告时间顺序）参会方式（手机电脑均可） 1、官网免费报名（点击此处链接或扫描下方二维码，报名听会）； 2、报名成功，通过审核后您将收到通知； 3、会议当天您将收到短信提醒。点击短信链接，输入报名手机号，即可参会。扫一扫，进入会议页面免费报名听会

荧光定量PCR技术是将常规的PCR和荧光检测技术相结合，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，以此实现对初始模板的定量分析。荧光定量PCR技术作为当今生物学研究的重要手段之一，在基础科学、生物技术、医学研究、法医学、诊断学等多方面具有广泛的应用前景。说到荧光定量PCR技术，我们经常会问类似于“你的实验是染料法还是探针法”，“你用的探针是什么类型”等之类的问题，这其实是对荧光标记的选择。根据荧光标记的不同，可以将荧光定量PCR实验分为探针法和染料法两大类。染料法染料法利用能与DNA双链结合的染料来实现，如SYBR Green I。该染料在游离状态下呈现微弱的荧光，一旦与双链DNA的双螺旋小沟结合，其绿色荧光增强约1000倍。因此其总的荧光强度与双链DNA含量成正比，利用这一关系可以反映生成的PCR产物的量（图 1）。SYBR Green I的最大吸收约在497 nm，发射波长最大约在520 nm，与FAM荧光分子的光谱性质类似，因此在所有的荧光定量PCR设备中都是第一通道检测，即“FAM/SYBR Green I”通道。▲ 图1 染料法原理图理论上，所有能与双链DNA结合的染料都可以用于qPCR检测，如溴化乙锭EtBr，碘化丙啶PI，吖啶橙、Cy3等。而选择用于qPCR反应的染料通常会从信号强度、生物安全性、检测简便性和经济适用性这几个因素考虑。例如EtBr可能存在潜在的致癌性。综合考虑下来，SYBR Green I成了比较理想的选择。目前，使用Evagreen的实验者也越来越多，Evagreen作为一种新型的染料，其光谱性质与SYBR Green I类似，其优势在于：▶ 对PCR反应的抑制程度小。高浓度SYBR Green I会强烈抑制PCR反应，因此要控制其使用浓度，一定程度上降低了DNA检测的灵敏度。▶ 与DNA结合密度高。单位长度的DNA双链上Evagreen的密度更高，为饱和型染料，消除了SYBR Green I存在的“染料重分布”的缺陷，提高检测灵敏度的同时也可用于高分辨率溶解曲线HRM。▶ 化学性质更稳定，适合长期保存。TaqMan 探针TaqMan 探针基本可以满足60%以上的qPCR实验，如常规的基因表达和拷贝数变异CNV实验。TaqMan 荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5' 末端，而淬灭剂则在3' 末端（图2）。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收 PCR扩增时, Tag酶的5' -3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。▲ 图2 Taqman探针MGB探针对于要分辨单碱基差异的SNP实验，采用对碱基错配容忍度更低的MGB探针，在淬灭基团后加入了DPI3基团（图3），从而提高了与靶标结合的亲和力；而且可以对靶点碱基进行化学修饰，如PeptideNucleic Acid和Locked Nucleic Acid。▲ 图3 MGB探针双杂交探针Taqman探针对探针的长度有比较严格的要求，双杂交探针则消除了这一“缺陷”。双杂交探针是由两条寡核苷酸单链组成，一条的3’端带有供体荧光分子，另一条的5’端带有受体荧光分子（图4）。游离状态下荧光供体会发出荧光，但当两条单链都匹配到模板链上时，就会发生荧光共振能量转移FRET，受体荧光分子就可以发出荧光，其荧光强度与生成的产物的量成正比。双杂交探针的优势有两点：摆脱了探针长度的限制，较长的探针可以提高与模板匹配的成功率；只有上下游两条探针都正确匹配后才能检测到受体荧光分子发出的荧光，特异性有所提高。▲ 图4 双杂交探针分子信标探针游离状态下，分子信标探针是一种茎环结构，其环状部分的15-30个碱基可以与靶标区域相结合匹配，下端的配对区域（左右一般各5-6个碱基）则由重复的GC组成，从而将5’的荧光分子和3’的淬灭基团紧紧聚在一起，荧光发生淬灭；当退火时，分子信标探针解开环并与模板靶标杂交，这样荧光分子和淬灭基团的物理距离就变大了，荧光淬灭的前提就打破了（图5）。除了MGB探针，分子信标探针也非常适合用于SNP检测。▲ 图5 分子信标探针除了上述几种类型的探针之外，还有尝试将引物和探针功能相结合的技术，如Amplifluor、LUX等，在设计难度上有所提高，但使用时更简便。各有其应用的侧重点和设计上的利弊，在此不多赘述。那么在荧光定量PCR实验中，我们应该如何进行选择呢？在这里，给大家总结了一些两种方法的区别，供大家参考。表1 染料法和探针法的区别

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Zero-Degree Celsius Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization for Hydrogen Exchange Mass Spectrometry1，文章的通讯作者为乌普萨拉大学的Erik T. Jansson博士。　　氢氘交换质谱(HDX-MS)适用于研究蛋白质在溶液中的动力学和相互作用，其能够快速分析非变性蛋白中位于蛋白表面的氨基酸序列，广泛应用于蛋白动态表位、活性位点的表征。HDX-MS平台通过低温UPLC分离提供自动化、在线的样品处理和分析。目前，HDX-MS装置的工作流程主要基于Peltier冷却的超高效液相色谱(UPLC)模块的LC-MS方法，但该系统价格昂贵，成本较高，并且在低温条件下，流动相粘度增加导致高背压(可达-20,000 psi)，降低了LC的分离效率。而毛细管电泳(CE)在HDX领域有着更好的应用潜力。CE是一种成熟的分离多种类型分子的方法，在蛋白质组学研究中具有独特的价值。CE基于分析物在电场中的不同迁移率进行分离，分离速度取决于分析物的尺寸和电荷。20世纪90年代初，CE-MS开始应用于肽段水平的蛋白质和蛋白质复合物的分析。自此，CE-MS在多肽和蛋白异质体的检测中就显示出比反相LC-MS高10~100倍的灵敏度。近年来，HDX-MS领域的研究人员也聚焦于探究CE用于HDX-MS工作中的潜在优势。本文利用熔融硅毛细管电泳在零摄氏度下完成了氘代肽段和蛋白的淬灭、酶切和分离，该平台具有较好的成本效益，易于装配于任何MS。　　CE装置的主要配件包括丙烯酸气密匣(图1A)、毛细管液相分离装置(图1C)和P-727聚醚醚酮三通组件(图1D)。丙烯酸气密匣用于接收N2，内部放有一个不锈钢小瓶装纳氘代背景电解液，能够允许高电压传导到分离毛细管。P-727聚醚醚酮三通组件联通高压电源和N2源，提供分离电压和N2，在毛细管出口产生离子。　　图1.Peltier冷却CE外壳+进样槽的结构。(A) 丙烯酸气密匣。(B) Peltier冷却单元所粘附的铝壳体的截面。(C) 毛细管液相分离装置。(D) 同轴三通阀nano电喷雾针。　　完成该毛细管平台(图1)的加工和组装后，作者评估了其性能，并将其与先前在微芯片电泳装置上发表的报道进行了比较。首先是峰值容量的评估。使用血管紧张素II(ATII)和甲硫啡肽(ME)作为分离标记的淬灭肽标准品，在0 ℃下，以1 % FA、25% ACN (BFS毛细管)和10% HAc(LPA毛细管)组成的氘代背景电解液(BGE)计算峰容量。与BFS毛细管相比，LPA毛细管除了峰容量值增加外，其序列覆盖率也明显增加。作者比较了0 ℃ CE到0 ℃ LC和微芯片电泳的峰容量值。结果显示，CE的上峰容量虽小于微芯片电泳方法，但序列覆盖率更高。而与LC相比，CE的峰值容量大大提高。　　氘质子在淬灭时和分析时中的回交(BE)也是HDX实验重点考察的因素之一。作者使用缓激肽(BK)、ATII和ME作为肽标准品对BE进行了评估。在0 ℃、20 kV的条件下对BFS毛细管和LPA毛细管分别进行测试。结果表明，ATII在BFS和LPA毛细血管上的BE分别为20 %和34 %。ATII在LPA毛细管上的BE值与已报道的商业和实验室改装的UPLC平台的数据(28~36 %)相似，而在BFS毛细管上则接近直接进样完全氘代标准品达到的BE水平。此外，由于注入到毛细管中的样品量与LC所使用的样品量相比很低，在检测的质谱中没有出现任何残留的迹象。　　作者对溶液中牛血红蛋白(Hb)进行了HDX，随后又进行了淬灭、胃蛋白酶酶切、低温毛细管电泳分离与质谱(MS)检测。图2显示了根据Kyte-Doolittle疏水性指数选择的6个肽段在不同分离条件下相应的电泳图谱和氘代速率。从图中可以看出，LPA毛细管上分离的肽段峰形更对称，信号强度比BFS毛细管上高一个数量级左右。与BFS毛细管相比，LPA涂层的毛细管整体的氘标记保留绝对值较低，但氘代速率没有检测到差异。虽然BFS毛细管迁移时间更快，但由于BFS毛细管在样品进样之间需要更多的冲洗步骤，因此分析时间比使用LPA毛细管要长。　　图2.强度归一化的提取离子电泳图谱，显示了BFS和LPA毛细血管之间迁移时间的差异，以及标记Hb的消化性中的6个代表性肽的HDX动力学图。橙色的迹线显示了使用BFS毛细管分离的结果，紫色的迹线显示了使用LPA涂层毛细管分离的结果。肽段序列的注释及其对应的Kyte-Doolittle疏水性指数显示在右方。(左)在500 s标记时间点显示了代表性的峰形和迁移时间。(右)BFS毛细管中的氘代保留更高。误差棒表示一个标准差，每个时间点n = 3。有些多肽在所有孵育时间内只存在于LPA涂层中，因此上述六个面板其中的两个面板没有在BFS毛细管中的痕迹。α 136 - 141在BFS毛细管上分离的特定样品在500 s时间点显示，但在以后的时间点没有足够的质量，从最终的数据集中省略，因此HDX动力学图不包括该肽段。β 35 - 40没有被检测到，也未被包括在HDX动力学图中。　　最后，本文研究了HDX CE-MS平台在表征结构相关信息方面的作用。作者比较了非变性条件下的Hb样品与用6 M尿素置于变性条件下的Hb样品的相对氘代值。研究发现，在非变性状态下更容易受到HDX保护的位点与Hb亚基的相互作用位点相吻合。具体来说，α-Hb上的R32-Y43和L92-D127以及β- Hb上的R29-E42和D98-Q130与这两个单体相互结合的位置相吻合。数据显示(图3)，与局部区域的尿素暴露状态相比，Hb的非变性状态对HDX的敏感度降低。这一发现验证了该方法可作为结构蛋白质组学研究的潜在工具——能够表征分子结合和构象动力学，如蛋白质-配体相互作用中遇到的问题。　　图3. Hb的HDX数据在PDB 1FSX上的映射。在非变性条件下用D2O标记的Hb与用6 M尿素变性后标记的Hb进行比较。颜色刻度表示50,000 s氘掺入后，天然/尿素D吸收量的比值。　　总的来说，本研究提供了低温CE - MS应用于溶液内标记HDX的理论证明。尽管BFS毛细管提供了快速的肽段分离和标记肽段的最小氘损失，但研究结果表明LPA涂层的毛细管在HDX CE - MS中更有优势。有很多途径能够实现该平台的进一步优化，包括但不限于BGE优化(pH、有机质含量、浓度)、浓缩/脱盐步骤、固定化/嵌入式蛋白酶消化、升级Peltier元件以实现更低温的分离、集成无鞘电喷雾界面、交替毛细管涂层和评估更长或更短的毛细管。进一步研究蛋白质化学中常见的盐和溶质分离的耐受性也将是未来优化的一个重点。　　撰稿：陈凤平　　编辑：李惠琳，罗宇翔　　文章引用：Zero-Degree Celsius Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization for Hydrogen Exchange Mass Spectrometry　　参考文献　　1. Aerts, J. T. Andren, P. E. Jansson, E. T., Zero-Degree Celsius Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization for Hydrogen Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2022.

p style=" text-align: justify " 　　 span style=" color: rgb(0, 32, 96) " strong 背景介绍 /strong /span /p p style=" text-align: justify " 　　健康的身体是人人都想一直保持的，但是伴随着人的衰老，一些疾病的得病率也在不断攀升，例如：糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病等。脂质作为人体需要的重要营养素之一，在许多生物过程中都扮演着重要的角色，是人体细胞组织的组成成分，为机体供给所需的能量，以及协助细胞信号传导等。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " & nbsp SCIEX公司于2011年美国质谱年会(American Society of Mass & nbsp Spectrometry，ASMS)会议上展示了最新的SelexIONTM & nbsp 技术。该技术是首个获得高重现性、耐用性及易用性的离子淌度差分质谱分离技术(Differential mobility & nbsp Spectrometry,DMS),同时还可为高灵敏度的定量与定性分析提供更多的选择性。 /p p style=" text-align: justify " 　　近年来，随着科研人员对脂质研究的深入，发现疾病的发生通常伴随着体内脂质水平的紊乱，因此，将脂质作为疾病的生物标志物的研究也越来越火热，而如何全面检测并定量分析人体内的脂质含量成为了研究重点。 /p p style=" text-align: justify " 　 span style=" color: rgb(0, 32, 96) " strong 　那么如何全面检测并定量分析人体内的脂质? /strong /span /p p style=" text-align: justify " 　　在最新的一篇研究衰老的文献 “Cross-Platform Comparison of Untargeted and Targeted Lipidomics Approaches on Aging Mouse Plasma” 中，同时采用 strong 非靶向脂质组学与靶向脂质组学方法(LipidyzerTM) /strong 研究衰老老鼠血浆中脂质的差异变化。在该文章中，非靶向脂质组学与靶向脂质组学方法工作流程如图1所示，非靶向脂质组学方法采用LC-HRMS技术，利用反相色谱方法分离脂质，数据分析采用传统的分析方法，进行峰提取、峰对齐、峰鉴定、归一化、峰定量、手动确证。靶向脂质组方法采用SCIEX公司LipidyzerTM平台，相比非靶向脂质组方法，LipidyzerTM采用 strong 差向离子淌度分离技术(DMS) /strong 对脂质进行分离，因无需色谱分离，故采集时间更短 LipidyzerTM采用的是MRM 方法靶向分析脂质，故在数据分析过程中，仅需要3步(鉴定、归一化、定量)即可得到准确的定量结果。 /p p 引用文献： a href=" https://www.nature.com/articles/s41598-018-35807-4" https://www.nature.com/articles/s41598-018-35807-4 /a /p p style=" text-align: center " img title=" 640.webp.jpg" alt=" 640.webp.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/036d08a3-9fa8-473f-b1f5-595ab3341d09.jpg" / /p p style=" line-height: 16px " img style=" margin-right: 2px vertical-align: middle " src=" /admincms/ueditor1/dialogs/attachment/fileTypeImages/icon_pdf.gif" / a title=" Cross-Platform Comparison.pdf" href=" https://img1.17img.cn/17img/files/201901/attachment/bbe0fd7c-0aa9-44d4-9532-98d0ce313dc2.pdf" target=" _blank" textvalue=" Cross-Platform Comparison of Untargeted and Targeted Lipidomics Approaches on Aging Mouse Plasma.pdf" Cross-Platform Comparison of Untargeted and Targeted Lipidomics Approaches on Aging Mouse Plasma.pdf /a /p p style=" text-align: center " img title=" 图1.webp.jpg" alt=" 图1.webp.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/39c82326-fe5a-435a-8d92-c482ab684e96.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　图1. 靶向和非靶向工作流程 /p p style=" text-align: justify " 　　文章结果表明，LipidyzerTM方法在检测的脂质种类与数量上与传统非靶向脂质组学是相当的(图2)，且都具有很好的定量准确度。研究者利用LipidyzerTM方法对衰老老鼠血浆的脂质差异性分析中发现 strong 甘油三脂TAG /strong 在衰老过程中变化差异最大，说明TAG代谢在衰老过程中最为敏感，为未来走向临床提供了可靠的生物标记物。 /p p style=" text-align: center " img title=" 图2.webp.jpg" alt=" 图2.webp.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/8a2de8e9-45b3-4c4f-98dd-033dd963924f.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　图2. LipidyzerTM检测出衰老过程中变化的脂质 /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" color: rgb(0, 32, 96) " strong LipidyzeTM提供高通量大规模脂质绝对定量“一站式”方案 /strong /span /p p style=" text-align: justify " 　　SCIEX对于脂质的检测分析也推出了相应的解决方案——LipidyzerTM，能够实现13大类，1000多种脂质的绝对定量分析。该平台(图3)提供了一套完整的靶向脂质组学解决方案，包含样品前处理，数据采集，以及数据分析。 /p p style=" text-align: center " img title=" 图3.webp.jpg" alt=" 图3.webp.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/dcbbf113-2f59-435f-86ca-9ab372659d13.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　图3. LipidyzerTM平台 /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" color: rgb(0, 32, 96) " strong 多重技术优势适用临床样本分析，助力精准脂质代谢与健康研究 /strong /span /p p style=" text-align: justify " 　　LipidyzerTM利用离子淌度技术(DMS)实现不同脂类的完全分离，具有极强的特异性 方法内包含 strong 13类脂质 /strong ， strong 50多个同位素内标脂质 /strong ，覆盖了复杂的脂质代谢通路 通过内标的添加，实现每类脂质的绝对定量分析(图4)。该技术平台已在人血清和血浆分析中得到验证，成为临床脂质组分析的“即得”利器。 /p p style=" text-align: center " img title=" 图4.webp.jpg" alt=" 图4.webp.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/ffc841ad-1c91-458d-b348-ef1b81e03916.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　图4. LipidyzerTM的优势 /p p & nbsp /p p br/ /p

p 　　近日，中国科学院合肥物质科学研究院技术生物与农业工程研究所研究员黄青课题组，利用表面增强拉曼光谱(SERS)技术，实现了对水体中汞离子的选择性、免标记、半定量的检测。该项成果对实现实际水样中重金属离子的高选择性及准确检测具有一定的科学意义和实用价值，相关成果在线发表在Sensors and Actuators B: Chemical上。 /p p 　　表面增强拉曼光谱(SERS：surface enhanced Raman spectroscopy)作为一种正在快速发展的技术，因其快速、无损和痕量检测等特点，得到广泛关注并开始走向实际应用。汞是一种毒性极强的重金属，对人体及生物体有很大危害。Hg(II)作为汞在环境中的一种常见的存在形式，对其进行快速、可靠、有效测量具有必要性和迫切性，但基于SERS技术对其特异性和相对定量检测存在一定难度。为此，黄青等设计了能够有效的捕捉水样中的汞离子并产生拉曼散射增强效应的纳米粒子——适配体复合检测体系。研究人员在SiO2@Au纳米粒子表面修饰上能有效捕获汞离子的DNA适配体，利用DNA分子中T碱基和Hg(II)形成T-Hg2+-T结构的特性，能够高效捕获Hg2+，并产生SERS信号改变。实验结果表明，在加入Hg(II)后，设计DNA分子中的腺嘌呤(A)产生736cm-1SERS信号与鸟嘌呤(G)产生的位于660cm-1的SERS信号的峰强的比值会随检测Hg(II)浓度增加而减小，并出现一些特征新峰，如550cm-1。计算表明，它来源于汞离子取代了T上的H在两个DNA分子间形成N-Hg-N结构而发生的伸缩振动。利用这些变化，可以对Hg(II)的进行快速、特异性和半定量的痕量检测。 /p p 　　研究工作得到国家自然科学基金、国家重点基础研究发展计划等的支持。 /p p 　　论文题目：A label-free SERS approach to quantitative and selective detection of mercury (II) based on DNA aptamer-modified SiO2@Au core/shell nanoparticles /p p style=" text-align: center " img title=" 001.png" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201712/insimg/ca52438b-c746-4230-bd80-e8cad9d9affa.jpg" / /p p style=" text-align: center " strong 合肥研究院实现对水体中Hg(II)高选择性、免标记的定量检测 /strong /p p & nbsp /p

仪器信息网讯 2014年4月26-27日，由中国化学会、国家自然科学基金委员会主办，中国化学会质谱分析专业委员会(以下简称为：质谱分析专业委员会)、清华大学化学系/分析中心承办的&ldquo 中国化学会首届全国质谱分析学术研讨会&rdquo 在北京西郊宾馆召开，来自全国各地79个单位的代表约420人参加了此次会议，汇集了院士、杰青、千人、百人等一批优秀人才。 会议现场 清华大学林金明教授主持开幕式 　　研讨会由质谱分析专业委员会秘书长、清华大学林金明教授主持。质谱分析专业委员会主任、南京大学陈洪渊院士，国家自然科学基金委化学部分析化学学科主任庄乾坤教授分别致开幕辞。 质谱分析专业委员会主任、南京大学陈洪渊院士 国家自然科学基金委化学部 分析化学学科主任庄乾坤教授 　　据陈洪渊院士介绍，随着质谱的快速发展和普及，中国化学会2013年批准成立质谱分析专业委员会，而此次研讨会是专业委员会成立后举办的首个全国性学术活动。为了迎接本次会议的召开，质谱分析专业委员会与《中国科学· 化学》共同推出了质谱分析专刊，专刊共收录22篇评述报告，集中展示中国学者在质谱分析领域的研究进展。 　　本次研讨会设大会报告、分会报告、墙报展，并由岛津公司赞助了优秀论文奖，内容涵盖质谱仪器研制与新技术、新方法，以及质谱在环境、食品、生命科学、医药等领域的应用。 　　从15个大会报告内容来看，生命科学研究仍然是中国学者研究的重点，15个大会报告中8个与生命科学有关，蛋白质组学更是热点，有4个报告涉及此。 中科院大连化物所张玉奎院士 复旦大学杨芃原教授 　　据中科院大连化物所张玉奎院士介绍，其所在的中科院分离分析化学重点实验室拥有各类质谱仪器76台套。复旦大学杨芃原教授也在报告中表示，中国用于蛋白质研究的质谱数量很大，如：蛋白质科学基础设施(北京)质谱规模在50台，蛋白质科学基础设施(上海)30台，华大基因(深圳)100台，复旦大学生物医学研究院30台。可见，对于蛋白质组学研究，质谱已经成为不可或缺的工具。 军事医学科学院钱小红研究员 中科院大连化物所叶明亮研究员 　　凭借先进高端的质谱设备，蛋白质组学的研究已经有了飞速的发展，目前中国科学家鉴定到的蛋白质数量已达到12000个左右，但专家们也提出，蛋白质组学研究仍然面临巨大挑战。人类蛋白质丰度范围很广，目前可鉴定到的蛋白大多数为高丰度蛋白，对于低丰度蛋白的鉴定还缺乏有效的方法。此外，对于蛋白质大规模、非标记的绝对定量也是难题。在本次研讨会上，张玉奎院士、杨芃原教授、中科院大连化物所叶明亮研究员、军事医学科学院钱小红研究员分别介绍了应对上述挑战的一些新方法和新技术，如改变样品前处理的方式，使用新的富集及分离材料 使用新的质谱数据处理方法，以及搭建集成化的蛋白质质谱分析平台等。 中科院高能物理研究所柴之芳院士 清华大学张新荣教授 安捷伦公司杜伟博士 　　此外，中科院高能物理研究所柴之芳院士介绍了利用质谱研究金属组学和金属蛋白质组学，并将此方法用于阿尔茨海默病的病因研究。清华大学张新荣教授介绍了&ldquo 单细胞质谱分析&rdquo ，据其介绍，2014年，美国《科学》杂志将单细胞生物学列为值得特别关注的领域，单细胞质谱分析可以给科学家提供许多新的生物学信息，不仅可以验证过去的经典方法的结论，而且可以发现许多未曾意料或被掩盖的规律，质谱工作者应该关注，可以将其作为一个新的研究方向。安捷伦公司杜伟博士介绍了安捷伦在系统生物学中的最新技术及应用。 北京大学刘虎威教授 中国医学科学院药物研究所再帕尔· 阿不力孜研究员 岛津公司端裕树博士 中科院化学所陈义研究员 　　质谱离子化新方法研究则是大会报告中居于第二热度的内容，15个报告中有5个报告与此相关。敞开式离子源(AIM)是2004年才出现的一种新型的离子源，其具有快速、可直接分析等优势，由此也得到了科学家们的亲睐。北京大学刘虎威教授介绍实时直接分析离子源DART离子化的新技术&mdash &mdash 等离子体辅助激光解吸附离子化及敞开式表面辅助解吸附离子化，以提高DART的灵敏度。中国医学科学院药物研究所再帕尔· 阿不力孜研究员介绍了其课题组研制的敞开式质谱分子成像装置及应用，据其介绍，相比于现有的质谱成像技术，空气动力辅助离子化质谱成像技术(AFAI-MSI)可适用于大体积样品，可远距离检测，并可兼容多种质谱仪，可获得更丰富更全面的信息，AFAI-IMS在药物及其代谢物研究方面有很大优势。岛津公司端裕树博士介绍了岛津公司最新研制的敞开式离子源解析电晕束离子源(DCBI)及应用。中科院化学所陈义研究员介绍了其课题组进行的质谱离子化新方法探索，研制了位置可调的双枪离子化方法，并用运载离子化、镀金光子晶体离子化等方法提高测定的灵敏度。 中科院生态环境研究中心江桂斌院士 　　此外，在大会报告环节，中科院生态环境研究中心江桂斌院士介绍了&ldquo 色谱质谱在新污染物发现中的应用&rdquo ，据其介绍目前环境污染物中，PFOS含量在ppt级，并呈下降趋势 PBDEs在ppb级，也呈下降趋势 SCCPs在ppm级，呈现上升趋势。除了现有已知的污染物外，江桂斌课题组还利用MC-ICP-MS、 FT-ICR-MS等技术用于新污染物发现研究。 浙江大学潘远江教授 　　清华大学林金明则介绍了液滴形成与质谱联用，其主要研究了两种不同的液滴混合的方式，并通过质谱分析两种不同种类液滴混合后发生的反应。浙江大学潘远江教授则介绍了电喷雾质谱中苄基迁移反应的机理。 现场展示 　　本次研讨会还设立了仪器展示，岛津、安捷伦、赛默飞、天瑞仪器、威思曼、迪马、瑞达、磐合、兰博、正红塑料等进行了现场展示。 　　据悉，2015年秋天，中国化学会第二届全国质谱分析学术研讨会将在美丽的杭州召开，由浙江大学承办。(撰稿：杨娟)

布鲁克在今年ASMS中发布了多种用于高灵敏度和高通量分析的新产品，包括世界上首个商品化的后电离MALDI离子源（MALDI-2）；新的基于捕集离子淌度（TIMS）和平行累积连续碎裂（PASEF）技术的4D-蛋白质组学方法：高通量dia-PASEF和prm-PASEF；凭借碰撞截面积（CCS）精确测定，进一步提高timsTOF Pro在大队列样本检测和实时数据分析方面的性能。近日， 布鲁克 . 道尔顿生命科学质谱执行副总裁Rohan Thakur博士接受了媒体专访，讨论了布鲁克于ASMS 2020发布的最新质谱技术的相关细节，以及其在临床研究中的应用前景。Q1您能谈谈过去一年timsTOF Pro的表现吗？有哪些出色的研究项目采用了这项技术？Rohan Thakur: 过去的一年里，各个研究团体对timsTOF质谱平台（timsTOF Pro和timsTOF fleX）的接受度超过我们预期，因为使用者们也意识到TIMS技术带来的优势，比如TIMS在时间和空间的聚焦带来更高的灵敏度，离子淌度补偿质量对齐（MOMA，Mobility Offset Mass Alignment）无损性能并实现蛋白深度覆盖。timsTOF Pro另一个主要的优势是能使用短梯度实现深度覆盖，这让转化蛋白组学研究成为现实。在timsTOF Pro推出前，大部分蛋白质组学实验室只能在“覆盖深度”和“分析时间”中选择其一，而在timsTOF Pro上，即使采用短色谱梯度也能实现蛋白深度覆盖，分析通量从10样本/天提高升100样本/天。让研究者最满意的地方是timsTOF Pro具有出色的稳定性，能可靠的用于大队列研究中珍贵的样本分析，并持续保证高灵敏度和扫描速度，这正是做转化蛋白组学所需要的。在上一代的质谱上，要实现这些性能的融合是不可能的。牛津大学Roman Fischer博士在timsTOF Pro上进行败血症研究，采用100样本/天的分析通量，完成了将近5000血浆样本的分析。北京大学精准医学多组学研究中心Catherine Wong博士在timsTOF Pro上进行COVID-19相关的大队列研究，这些都是timsTOF Pro用于转化医学研究很好的例子。Matthias Mann教授团队也在timsTOF Pro上进行了一些开创性的研究，他们使用深度机器学习技术，采用上百万个学习样本预测多肽CCS值，以此来进一步将离子淌度这个关键的第四维信息用于蛋白质组学研究，这也是另一个正在timsTOF Pro上做非常出色的项目。Q2您能详细解释一下将PASEF与平行反应监测（PRM）进行联合的优势吗？Rohan Thakur: TIMS是利用气相进行多肽分离，这能为PRM实验带来极大的益处，因为TIMS既可以做为基于CCS值的离子选择器（从而分离同分异构和降低化学噪音），也可以做为灵敏度放大器（时间聚焦增强PASEF扫描功能），并且帮助四极杆优化母离子的选择。现在，您可以将四极杆隔离与独特的CCS值和m/z进行同步关联，从而进行更准确、更高选择性的非标记定量分析。Q3您刚才提到了研究者利用深度机器学习网络来准确的预测CCS值，这听起来是一个非常令人激动的领域，有希望利用这个技术来发现一些新的分子并鉴定，您能谈timsTOF Pro是怎样帮助这项工作的吗？Rohan Thakur: 离子淌度技术已经有接近15年的历史，但基于TIMS的CCS值测定技术的出现，让每一个离子都能被检测，这推动了深度机器学习技术能够深入理解离子在气相中的属性，从而更深入挖掘信息。得益于TIMS装置对CCS值高度重复和稳定的测定，数据科学家可以非常自信的采用TIMS测定的CCS值开发深度机器学习的算法，以达到准确预测CCS值的目的。在蛋白组学实验中，将多肽CCS值的实验值与上百万个峰的预测值进行参比有很多好处，最基本的好处是在做翻译后修饰研究中可以提高MS/MS采集中母离子选择性，从而提高翻译后修饰的鉴定率。目前看来，它的应用前景是具有无限可能的。Q4请谈谈开发MALDI-2的驱动力来自何处，以及如何提高灵敏度？ Rohan Thakur：第一个驱动力来自客户的实验室研究，他们希望看到MALDI能够分析更多种类的分子，以及对MALDI获得的目标区域或空间组学（SpatialOMx）的相关分子灵敏度的整体提高，在这些区域中，像代谢物、脂类和聚糖等特征内源性分子可以更深入的了解组织；第二个驱动力是可以通过LC-MS对划分出的组织区域进行进一步的组学分析。这两个因素与药物研究尤其相关，例如和癌症研究关联。灵敏度提高是通过向第一个激光器（常规MALDI）电离的分子离子云中发射第二束激光（MALDI-2 PI），在那里额外的能量导致发生电荷转移反应，从而提高了电离效率。这个过程需要MALDI操作在一定的气压环境下进行，因此可以在双离子源（ESI/MALDI）timsTOF fleX平台上完美地实现。Q5您认为配备了MALDI-2后的timsTOF fleX的灵敏度提升将如何促进小分子和脂质在辅助疾病的诊断和治疗的研究？Rohan Thakur：侧重于癌症的药物研发将受益于MALDI-2 后电离技术（PI），因为它将允许科学家把转录组的变化与SpatialOMx联系起来。这里的关键是对特定细胞群的识别定位，这些细胞群可以通过组织成像发现在肿瘤内、肿瘤边界和肿瘤远端的脂质或细胞表面聚糖的变化，再进行蛋白质组学、脂类组学和代谢组学的深度分析。这样的研究在过去是不曾有的，timsTOF fleX可以让你在一台仪器上进行所有这些实验。除此之外，包含TIMS新维度的MALDI实验使每个像素包含的有价值信息的大大增加；并且以10KHz的激光速度和10um的空间分辨率进行这项工作是首创。你可以在不同的组织切片中使用外源分子或内源分子的碰撞截面（CCS）值，然后在同一仪器上进行LC-MS分析时使用相同的CCS值。由于其多功能性，timsTOF fleX以极大地提高研究实验室的工作效率。Q6考虑到药物化合物的药代动力学和药效学分析能力的高要求，这些新技术在定量质量成像（qMSI）方面会对药物开发时间表产生什么影响？Rohan Thakur：在药物开发过程中，尽早获得关键信息是这些技术的重要优势，因为它可以提高整个过程的效率。由于信息的高度真实性，例如药物是否在正确的组织中击中了正确的靶点，你可以推进有前途的新化学实体（NCE）或者停止出现早期毒性的NCE的后续开发。这会导致更多的NCE在这个过程中向前推进，从而增加你找到具有正确疗效的候选药物的机会，同时最大程度减少了无效药物的投入消耗。对药物开发时间表的影响是一个方面，而获得有效药物是另一方面，这将加速更安全的药物推向市场的过程。

p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " 相对于数据依赖质谱（Data-dependent& nbsp acquisition，DDA）技术，在数据非依赖质谱（Data-independent& nbsp acquisition，DIA）采集中，预先设定好的离子采集范围将被切分为若干小窗口，质谱仪可匀速、高频地对每个窗口中的的母、子离子进行选择、碎裂和记录，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息。这样，在前端色谱分离度良好的情况下，便无需使用理化性质相同的同位素标记物作为内标进行定量（Label-free），极大的拓宽了定量灵活度，可以节约成本、减少定量环节，理论上也可以减少结果的不确定度。比较形象的描述是：DIA就像地毯式轰炸，无遗漏地打击全部目标。2015年，《Nature Method》将DIA技术评为未来几年中最值得期待的方法之一[1]。 /p p style=" text-align: center margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-indent: 0em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 588px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202010/uepic/7e2121df-7505-45b8-9462-425f5998dce0.jpg" title=" 图片1.png" alt=" 图片1.png" width=" 600" height=" 588" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-indent: 0em " 图1& nbsp DDA与DIA技术的应用对比示意图[2] /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " B型利钠肽（B-type& nbsp natriuretic& nbsp peptide，BNP）是心衰临床检测和治疗过程中极为重要的多肽分子，其含量水平将直接作为心衰患者心肌功能的分级依据。因此，建立高准确度定量分析方法，研制量值准确可靠的标准物质，为临床检测进行量值传递和校准，不但符合ISO17511的要求，也是目前临床化学界的共识。尽管化学合成多肽已经广泛用于临床诊断、药物研发、化学检测等领域，但其中所含结构类似肽的分离、分析，一直是行业内关注的焦点。因为杂质肽往往与主成分的活性不一致，其他理化性质也存在一定差异。尤其在药物和临床诊断研究中，各国药典、诊疗指南、专家共识等，对结构类似杂质肽的含量及检出能力均有明确要求。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " 中国计量科学研究院李红梅团队采用DIA技术，建立了内标肽辅助的MS2-High3定量策略，对化学合成B型利钠肽中的杂质肽进行了定量分析。由于作者在待测BNP样本中加入了已知量的内标肽，且该内标肽的量值可溯源至氨基酸国家标准物质，因此，后续的杂质肽定量结果同样具备计量学溯源性。该方法的最大特点是分析高效与准确，在2小时内，可对合成BNP中的10种含量较高的杂质肽进行平行定量，非常适合对BNP药物（奈西利肽）、标准物质、校准品等开展质量控制与分析。目前，该研究已被“欧洲临床化学与检验医学联合会”的官方期刊《Clinical& nbsp Chemistry& nbsp and& nbsp Laboratory& nbsp Medicine》接收并先期在线发表（图2）。 /p p style=" text-align: center text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " & nbsp /p p style=" text-align: center margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-indent: 0em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 195px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202010/uepic/e325ef64-df1b-4118-8d4a-7c778606669c.jpg" title=" 图片2.png" alt=" 图片2.png" width=" 600" height=" 195" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em text-indent: 0em text-align: center " 图2& nbsp 基于Label-free& nbsp DIA质谱技术分析BNP中杂质肽 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " & nbsp /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " 参考文献 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " [1] Allison Doerr,& nbsp DIA mass spectrometry. Nature Methods,& nbsp 2015 (12): 35. /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " [2] Jarrett D Egertson, Brendan MacLean, Richard Johnson, Yue Xuan, Michael J MacCoss, Multiplexed peptide analysis using data-independent acquisition and Skyline. Nature Protocols, 2015 (10): 887-903. /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " & nbsp /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " 2020年11月10-12日，中国计量科学研究院和国际计量局拟联合举办 span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 第三届 “药物及诊断试剂研发与质控——测量与标准，质量与安全（TD-MSQS 2020）” /strong /span 国际研讨会，以期进一步促进该领域的学术交流和技术发展，提升企业的研发水平和产品质量。本次会议将在南京市政府的支持下，在江苏省南京市举行。 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " 本次会议可通过官方网站http://tdmsqs.ncrm.org.cn注册或扫描二维码注册，注册成功后请填写参会回执发送至会议邮箱pptd@nim.ac.cn。 span style=" text-align: center text-indent: 0em " & nbsp /span /p p style=" text-align: center text-indent: 0em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202010/uepic/ccf4bd70-dddd-45f4-ba22-f780937c770b.jpg" title=" 图片3.png" alt=" 图片3.png" / /p p style=" text-align: center text-indent: 0em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " strong 欢迎各位专家、同仁报名参会！ /strong /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " 更多信息请关注会议官方网站： a href=" http://tdmsqs.ncrm.org.cn。" _src=" http://tdmsqs.ncrm.org.cn。" http://tdmsqs.ncrm.org.cn。 /a /p p style=" text-indent: 2em text-align: right margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " 供稿：中国计量科学研究院化学所 /p p style=" text-indent: 2em text-align: right margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " 肖鹏 宋德伟 李红梅 /p p style=" text-indent: 2em margin-top: 10px margin-bottom: 10px line-height: 1.75em " & nbsp /p