手谱柱柱效测试

不同的色谱柱有着不同的柱效测试报告，这是一份安捷伦色谱柱性能测试报告，在这个报告中明确的表明了测试条件和柱效参数。有几个问题需要讨论一下，请各位盆友给予更多的关注：1：不同的色谱柱性能测试有什么不同，其他的色谱柱性能测试条件怎样？2：性能测试报告的意义何在？3：色谱柱性能测试都需要做哪几部分的内容？具体的试剂都是什么4：新启用的色谱柱，为了延长它的使用寿命，在使用之前该怎样进行预处理？5：对于色谱柱的使用与保养未免也给一些好的建议，谢谢！ http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/04/201504051843_540773_2960432_3.png翻译成中文意思大概是这样的：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/04/201504051843_540774_2960432_3.pngAgilent TC-C18(2)Agilent TC-C18(2)详细介绍对于复杂的天然产物提取物、中药或环境样品，或者任何您需要分析的极性和非极性化合物混合样品，包括强碱性化合物，安捷伦TC-C18(2)都是理想的选择。• 碳载量较低-12%• 适用于极性化合物及以低比例的有机相开始或有机相变化范围大的梯度分离• 适用于多数常用的流动相，包括甲酸、乙酸、三氟乙酸和磷酸盐缓冲液，以及作为有机改性剂的乙腈和甲醇• 在pH 2-8 范围内分离性能优异附：柱效的测试方法http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/04/201504061800_540798_2960432_3.pnghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/04/201504061800_540799_2960432_3.pnghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/04/201504061810_540800_2960432_3.png

最近因为测试新柱的柱效引发了柱效测试的思考，与售后工程师进行了相应的交流，结合一些资料和自己的感悟写下此篇文章，希望能给大家在实际工作提供一些有益的东西。 1941年，马丁与詹姆斯提出了塔板理论。 1950年，诺贝尔化学奖颁发给他们两位以表彰他们在气液分离过程理论方面的突出贡献。当然，我们现在也知道塔板理论也是适用于液液分离机理阐述的。 自从有了塔板理论，以理论塔板数为代表的色谱柱柱效评估就引起了人们的关注。我们知道在色谱柱柱长一定的情况下，色谱柱的理论塔板数与理论塔板高度成反比。组分在一个塔板高度内完成一个分配平衡过程（或者吸附平衡），这种平衡是动态的，但是不断的平衡过程导致组分之间差异得到体现，最终引起了不同性质组分之间的分离。 必须指出的是，虽然组分间存在差异，但是差异需要多次的平衡才能最终达到我们想要的分离效果，平衡的次数的多少就由理论塔板数来体现。 1956年，荷兰人范得梅特对塔板理论做出了修正，提出了速率理论。速率理论的公式如下： [img=,414,97]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/12/201712112037_01_3332275_3.jpg!w414x97.jpg[/img] 其中，A项为涡流扩散项，B项为纵向分子扩散项，C项为传质阻力项。它们每一项都会对色谱柱的理论塔板高度，乃至进一步对色谱柱的理论塔板数产生影响。在这里，我们重点关注一下A项，即涡流扩散项，也可以表述为多路径效应。A项的产生源于填充色谱柱内的填料粒径大小及其分布所引起相同组分不同分子在色谱柱内产生了不同的分离路径导致的平衡延缓。A项的存在是导致填充柱与毛细管柱柱效差别的主要原因之一。对于填充柱来说，如何改善A项呢？粒径越小，分布越均匀的色谱柱，其A项的值也越小。在其它条件相同的前提下，对应的色谱柱理论塔板高度越低，理论塔板数越高。所以我们可以看到的是，这些年随着工艺水平的提升，色谱柱的粒径已经能够做到越来越小，粒径普遍在2μm以下的超高效液相色谱UPLC（Ultra Performance Liquid Chromatography）已经越来越多的取代了粒径普遍在5μm左右的高效液相色谱HPLC（High Performance Liquid Chromatography）系统进入各类大型的制药食品类企业及它们的上游包装厂家或者第三方检测实验室中。 我们必须意识到的是，随着色谱柱填料的粒径越来越小，在更短的色谱柱上就可以达到以前较长的色谱柱才能达到的色谱柱柱效，但是伴随而生是柱外效应的影响变得愈发重要。各类管路接头、色谱柱阀切换部件、扩充定量环等等的使用虽然方便了实验的运行，使得液相操作人员的操作更加简单，但是一定程度上影响到我们测试的色谱柱柱效。 色谱柱厂家测试色谱柱柱效往往在十分理想的情况下，各种柱外可能的展宽因素都降到了最低，而对于一个特定的检测室特定的液相仪器而言，是无法达到此种理想情况，因此即使是新柱，可能首次测试的色谱柱柱效也较出厂报告的中色谱柱柱效报告相差较大。以W家2.5μm粒径的实心核颗粒柱为例，利用二氢苊丙酮溶液进行色谱柱柱效测试，即使完全按照色谱柱出厂测试条件进行柱效测试，一般能有出厂报告柱效的70%就是比较好的情况了，而我们实验室的Arc仪器上面实测新柱只有出厂报告的55%。这一方面是由于我们的仪器上加装了许多的部件，色谱柱阀、扩充定量环以及因此增加的接口，这些是否都有意无意的增加了柱外展宽可能的诱因，导致实测的色谱柱柱效偏低；另一方面，实验室的除色谱柱外仪器的当时状态是否也有一些诱导实测柱效较低的因素存在呢，这都是我们可以深刻考虑的。 当然，最终要说的是，即使我们的实测柱效较出厂报告相差较多，如果可以分离我们想要分离的组分，并且对称性优良，仍旧不失为一个好的色谱柱。我们需要记录第一次测试的柱效报告上面的参数，这里面包含理论塔板数、保留时间、拖尾因子等，然后留待以后出现分离问题时利用相同浓度的色谱柱测试标准液进行柱效测试并与首次测试的值相对比。 一切都是为了实验，从实验出发，回到实验中去。 作者写本文是为了更好的理解色谱柱的柱效以及更好的指导工作，写作过程受认知的限制可能存在一些纰漏或者错误，望大家能够批评指正。

有时候接到客户电话咨询，我现在分离某某化合物分离效果不好了，原来分得挺好的，现在咋就分不了了，是色谱柱污染还是仪器问题呢？遇到这种情况，我们首先对色谱柱进行柱效测试，不同品牌色谱柱对柱效测试的方面略有不同，下面以Dikma色谱柱测柱效为例来说明如何测柱效：分别精密称取下列标准品，溶解在15ml乙腈：水=65：35的溶液中。1、尿嘧啶：0.0015g2、苯甲酸甲酯：30ul3、甲苯：200ul4、萘：0.025g然后，按照以下色谱条件进行HPLC分析色谱柱如图所示规格250 × 4.6 mm流动相乙腈: 水 = 65:35流速1.0 mL/min柱温30 oC检测器UV 254 nm进样量2.0 μL样品1. 尿嘧啶2. 苯甲酸甲酯3. 甲苯4. 萘http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/05/201505211453_546927_2452211_3.png

测试凝胶色谱柱的柱效的重要性就不详细说啦，例如：购买新的柱子时自己验证柱效是否合格？柱子的分离度下降时是否应该更换新柱子？尤其是串联几根的凝胶色谱柱，学会测试每一根的柱子的柱效以决定应该更换哪一根等等。 一般我们购买新的凝胶色谱柱时都会有一份合格证书，上面有柱效的测试结果，但是也有一些事没有证书的，例如我们用开的HR0.5等。对于有证书的柱子来说，可以参照证书上用的标准品，例如丙酮等。但是由于我们目前使用较多的是紫外检测器，因此我选用的测试柱效的试剂是丙基苯，每一根柱子单独测试。 第一步，把串联起来的整套柱子拆开，单独接到仪器上，断开检测器，以1ml/min的流速冲洗40分钟，然后接上检测器，开始走基线。 第二步，按照配溶液的步骤，配制1mg/ml的浓度，0.4μm的的滤网过滤备用。等仪器平衡好后，进样，出来的谱图如下：http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/09/201509012132_564024_2614953_3.png 第三步，建立自定义字段。我们用的是W家的仪器，使用的软件是Empower，但是没有安装系统适应性，因此需要通过自定义字段输入公式。进入Empower pro的界面，进去项目，然后点击自定义字段，建立一个新的自定义字段。名称输入“半峰宽”，字段类型选择“峰”，数据类型选择“实数”，数据来源选择“计算”，，公式输入“1.175*拐点处宽度”，宽度输入“12”，精度输入“6”，最后点击“确定”。重复半峰宽的自定义字段的建立方法，名称输入“半峰宽法柱效”，字段类型选择“峰”，数据类型选择“实数”，数据来源选择“计算”，，公式输入“5.54*（60*保留时间/半峰宽）**2”，宽度输入“12”，精度输入“6”，最后点击“确定”。 第四步，打开谱图，依照说明书建立柱效测试的积分方法，把积分算法由“传统”改为“Apextrack”，其余参照处理数据的步骤建立积分方法，启动积分即可得到柱效的结果。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/09/201509012134_564026_2614953_3.bmp

问题1：JJG705-2014《液相色谱仪》规定：反相色谱柱测试用的标准溶液为 1X10-4 g/mL 尿嘧啶、 1X10-5 g/mL 联苯和蒽(荼)的甲醇溶液。蒽的浓度没有明确，是否为1X10-5 g/mL？问题2：柱效计算公式中的色谱峰保留时间与色谱峰的半高峰宽是指哪种物质的指标？在色谱峰对称性检测项提到：被测峰(蒽)的不对称因子 As 一般在O.8--1.6 范围内。不对称因子计算需要用到峰高等指标，那么柱效计算也是取蒽的数据吗？其它两种物质的数据有何用处呢？http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/06/201506241606_551350_1627156_3.jpg

[b][font='Times New Roman'][font=宋体]解答：[/font][/font][/b][font='Times New Roman']JJG 705-2014[font=宋体]《液相色谱仪检定规程》中规定了液相色谱柱柱效的测试方法，具体测试方法如下：[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font]1[font=宋体]）[/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]测试用标准溶液：反相色谱柱测试用的标准溶液为[/font]1×10[/font][sup][font='Times New Roman']-4[/font][/sup][font='Times New Roman']g/mL[font=宋体]尿嘧啶、 [/font][font=Times New Roman]1×10[/font][/font][sup][font='Times New Roman']-5[/font][/sup][font='Times New Roman']g/mL[font=宋体]联苯和蒽[/font][/font][font=宋体]（[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]荼[/font][/font][font=宋体]）[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]的甲醇溶液；正相色谱柱测试用的标准溶液为[/font]1×10[/font][sup][font='Times New Roman']-2[/font][/sup][font='Times New Roman']mL/mL[font=宋体]甲苯和[/font][font=Times New Roman]1×10[/font][/font][sup][font='Times New Roman']-4[/font][/sup][font='Times New Roman'] mL/mL[font=宋体]硝基苯的正己烷溶液。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font]2[font=宋体]）[/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]将被测试的色谱柱接到检定合格的液相色谱仪器上，反相柱用甲醇[/font]+[font=宋体]水[/font][/font][font=宋体]（[/font][font='Times New Roman']85%+15%[/font][font=宋体]）[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]为流动相，正相柱用正己烷[/font]+[font=宋体]异丙醇[/font][/font][font=宋体]（[/font][font='Times New Roman']99.5%+0.5%[/font][font=宋体]）[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]为流动相，流速为[/font]1mm/s [/font][font=宋体]（[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]内径为[/font]4.6 mm[font=宋体]色谱柱，流量为[/font][font=Times New Roman]1.0mL/min[/font][/font][font=宋体]）[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]，紫外检测器波长为[/font]254 nm[font=宋体]，灵敏度选择适中。仪器稳定后，从进样口注入[/font][font=Times New Roman]10μL[/font][font=宋体]对应的色谱柱测试标准溶液，记录色谱图。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]（[/font]3[font=宋体]）[/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]柱效（理论塔板数）和色谱峰对称性的计算[/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]由式[/font] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font]2-1[font=宋体]）[/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]计算液相色谱柱柱效理论塔板数，重复测量[/font]3[font=宋体]次，取平均值。[/font][/font][font=宋体][img=,321,93]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/03/202103182240263364_1649_3389662_3.jpg!w321x93.jpg[/img] [/font][font=宋体]（[/font][font=宋体]2-1[/font][font=宋体]）[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]式中[/font][/font][font=宋体]，[/font][i][font='Times New Roman']n[/font][/i][font=宋体]为[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]理论塔板数[/font][/font][font=宋体]；[/font][i][font='Times New Roman']t[/font][/i][sub][font=宋体]R[/font][/sub][font=宋体]为[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]色谱峰的保留时间，时间测量需精确到[/font]0.02min[/font][font=宋体]；[/font][font=宋体][img=,43,47]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/03/202103182241049856_7500_3389662_3.jpg!w43x47.jpg[/img]为[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]色谱峰半高峰宽[/font][/font][font=宋体]；[/font][i][font=宋体]L[/font][/i][font=宋体]为[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]色谱柱长[/font][/font][font=宋体]。[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]按照上述条件测得的色谱图中，按式[/font][/font][font=宋体]2-2[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]计算色谱峰的不对称因子[/font][/font][i][font='Times New Roman']A[/font][sub][font='Times New Roman']s[/font][/sub][/i][font=宋体]。[/font][i][font='Times New Roman']A[/font][sub][font='Times New Roman']s[/font][/sub][/i][font='Times New Roman'] =[/font][i][font='Times New Roman']b/α[/font][/i][font='Times New Roman'] [/font][font=宋体] [font=宋体]（[/font]2-[/font][font='Times New Roman']2[/font][font=宋体]）[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]式中[/font][/font][font=宋体]，[/font][i][font=宋体]a[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]，[/font]b[/font][/i][font='Times New Roman'][font=宋体]分别为通过[img=,34,58]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/03/202103182241458314_1702_3389662_3.jpg!w34x58.jpg[/img][/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]峰高处、平行于峰底的直线被峰两侧及峰高截取的两线段的长度[/font][/font][font=宋体]。[/font][font=宋体][font=宋体]（[/font]4[font=宋体]）[/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]液相色谱柱性能要求[/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]柱效：反相色谱柱的理论塔板数一般在[/font]3~4[/font][font='Times New Roman']×10[/font][sup][font='Times New Roman']4[/font][/sup][font='Times New Roman']m[/font][sup][font='Times New Roman']-1[/font][/sup][font='Times New Roman'][font=宋体]范围内，正相色谱柱的理论塔板数在[/font]4~5[/font][font='Times New Roman']×10[/font][sup][font='Times New Roman']4[/font][/sup][font='Times New Roman']m[/font][sup][font='Times New Roman']-1[/font][/sup][font='Times New Roman'][font=宋体]范围内。[/font][/font][font='Times New Roman'][font=宋体]色谱峰对称性：被测峰[/font][/font][font=宋体]（[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]蒽[/font][/font][font=宋体]）[/font][font='Times New Roman'][font=宋体]的不对称因子[/font][/font][i][font='Times New Roman']A[/font][sub][font='Times New Roman']s[/font][/sub][/i][font='Times New Roman'][font=宋体]一般在[/font][/font][font=宋体]0.8[/font][font='Times New Roman']~1.6[font=宋体]范围内。[/font][/font][font=微软雅黑][font=微软雅黑]领取更多《实战宝典》请进：[/font][/font][url=http://instrument-vip.mikecrm.com/2bbmrpI][u][font=微软雅黑][color=#0000ff]http://instrument-vip.mikecrm.com/2bbmrpI[/color][/font][/u][/url][font=微软雅黑] [/font]

关于Diamonsil Plus的寿命，帖子：迪马又出新品啦：超强性能色谱柱Diamonsil Plus（怎样强大法呢？见内文）与大家分享了两个测试色谱柱寿命的实验室，第一个寿命测试是：使用人血浆在甲醇蛋白质沉淀，简单处理后，直接进样Diamonsil Plus C18 色谱柱，经过200次进样后，Diamonsil Plus C18 柱性能几乎没有减弱。第二个寿命测试是：为进一步考察色谱柱的寿命，我们同时在高pH的条件下（pH 10.0） 分析β - 阻断剂，连续进样2000 针后，色谱图没有发生明显变化，色谱柱依然保持良好的分离性能。～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～可是，咱们实验室的同志们，对于第二个寿命测试仍不罢休，后面有继续进了3000针，加起来也就5000针了。而且还是抗生素类的物质，这类物质是相当滴伤柱子，看来咱实验室的同事不把柱子折腾坏，还不罢休～～～幸好，Diamonsil Plus 同志经得起严刑酷打的考验，5000针后，依旧峰形完美～～～色谱柱如图所示规格：150 x 4.6 mm 流动相：甲醇: 5 mM 碳酸氢铵 (pH 10.0) = 65:35 流速：1.0 mL/min 柱温：室温 检测器：UV 220 nm样品1. 吲哚洛尔 2. 美托洛尔 3. 比索洛尔 4. 普萘洛尔 5. 阿普洛尔http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/03/201503181714_538755_2452211_3.pnghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/03/201503181714_538756_2452211_3.png下面在看看进样第1针和第5000针后，Diamonsil Plus 同志的柱效（N）和对称因子（As）变化情况：Diamonsil Plus 5 μm C18：第1次进样后N(萘)=13389，As(萘)=1.149；第5000针后N(萘)=13667，As(萘)=1.075当然，没有比较就没有鉴别，任何真理都是在对比情况下，才越发可贵～～。下面实验室，在同样的条件下，对比了Agilent的色谱柱的图片和变化情况，（咋没有打击Agilent的意思哈～～，我们也一直非常认可Agilent的色谱柱品质）http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/03/201503181723_538758_2452211_3.pnghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/03/201503181723_538759_2452211_3.pngAgilent 5 μm TC-C18：第1次进样后N(萘)=13878，As(萘)=1.042；第2730针后N(萘)=7624，As(萘)=1.616