流式细胞仪

流式细胞仪在生命科学领域尤其医学中应用非常广泛，是一种能够对细胞进行相关处理的仪器，并且能够对细胞进行必要的分析。小编为大家介绍一下流式细胞仪的概念、发展历史、特点、分类、基本原理以及应用。　　流式细胞术与流式细胞仪的概念　　流式细胞术(flow cytometry , FCM)：是一种定量分析技术，是指利用流式细胞仪检测细胞特异性标记荧光信号而测定细胞的多种生物物理性质的方法，同时也是一项可以把具有某相同荧光信号特性的某些细胞亚群从多细胞群体中分离和富集出来的细胞分析技术。点击查看更多细胞流式仪　　流式细胞仪(flow cytometer)：是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术和抗原抗体检测技术为一体的新型高科技仪器 是以激光为光源、检测生物学颗粒理化性质的仪器。　　流式细胞仪的发展历史　　1、1934年，Moldavan使悬浮的红细胞从一个毛细玻璃管中流过，每个通过的细胞可被一个光电装置记录下来。这就是流式细胞仪的雏形。　　2、1965年，Kamentsky用紫外吸收和可见光散射两个参数同时测量未染色细胞，给出细胞中核酸的含量和细胞大小。奠定了多参数流式细胞测量的基础。　　3、1967年，Van Dilla和Los Alamos采用了层流流动室和氩激光器，开发出了液流束、照明光轴、检测系统三者相互垂直的流式细胞仪。这成为目前各种流式细胞仪的基础。　　4、1969年，Fulwyler利用静电墨水喷射液滴偏转技术，建立了流式细胞分选术。Ehrlich和Wheeless利用飞点扫描技术和缝扫描技术使零分辨率的流式细胞仪变成了低分辨率的流式细胞仪。　　5、20世纪70年代，随着Kohler和Milstein成功提出了单克隆抗体技术和荧光标记技术，为特异研究和分析细胞奠定了良好的基础。　　6、1973年，美国BD公司和美国斯坦福大学合作，研制开发并生产了世界上第一台商用流式细胞仪FACS I。　　7、20世纪80年代，流式细胞仪的数据采集、存储、显示、分析日趋完善，随着样品制备方法的增加，新的荧光染料和细胞标记物的出现，使流式细胞仪的应用范围逐渐扩大。　　8、20世纪90年代，与之配套的标本制备仪和自动进样器的问世，以及适合临床应用的单克隆抗体的增加，使流式细胞仪逐渐从科研单位进入医院的中心实验室和检验科，成为现代化的临床检验仪器的一部分。　　流式细胞仪的特点　　1、高速度：每秒可检测1 000-5 000个细胞。　　2、高灵敏度：每个细胞只要带有1 000-3 000个荧光分子就能检出，两个细胞之间有5%的差别就可区分出来，光散射的灵敏度为0.3um。　　3、高精度：在细胞悬液中测量细胞，比其他分析技术的变异系数更小，分辨率高。　　4、高纯度：分选细胞的纯度可大于99%以上。　　5、多参数：可同时定量检测单个细胞的DNA等多个参数。　　流式细胞仪的分类　　1、根据功能不同，可分为临床型和综合型(科研型)。　　2、根据有无细胞分选功能，可分为流式细胞分析分选仪和流式细胞分析仪。　　3、根据结构不同，可分为一般流式细胞仪(零分辨率流式细胞仪)和狭缝扫描流式细胞仪(高分辨率流式细胞仪)。前者的激光光斑为椭圆形，光斑直径大于被检细胞体积。后者激光光束为一条线状扁平光斑，直径在3-5um。　　流式细胞仪的基本原理　　1、将悬浮分散的单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后，放入样品管。　　2、在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，流动室充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排列成单列由流动室的喷嘴喷出，成为细胞液柱。　　3、液柱与水平方向的入射激光束垂直相交，相交点称为测量区。通过测量区的细胞受激光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被成90℃角方向放置的光电倍增荧光检测器和前向角放置的光电二极管检测器接收，经过转换器转换为电子信号。　　4、电子信号经模/数转换输入计算机。计算机通过相应的软件储存、计算、分析，就可以得到细胞的大小和活性、核酸含量等理化指标。　　流式细胞仪的应用　　1、DNA倍体分析　　DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用最广检测项目。由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同，存在异倍体细胞，所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系。DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息，这在细胞生物学中运用很广泛。特别地，它可表示出细胞毒性药物对细胞作用过程。这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行，这样在细胞混合培养中，可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况。所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光，常用的染料为PI，DAPI。　　在该领域Partec公司的 CyFlow PA是一枝独秀。　　2、细胞生存能力实验　　使用Heochest 33342染料与DNA特异性结合，后因细胞活力不同染料的结合程度也各异，故可评估细胞的活性度。　　3、计数外周血中检测网织红细胞　　使用TO染料能够特异性地与RNA结合，结合系数高达3000，故具有很好的性价比。　　4、外周血、骨髓采集物中CD34阳性干细胞计数，临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定。使用标准ISHAG方案，需要DNA或其他核染料占用FITC通道，PE标记CD34抗体，PE-CY5标记CD45抗体。　　5、交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验　　检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有着重要临床意义，因为这种反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症。流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结合的人免疫球蛋白。FITC标记人免疫球蛋白抗体、PE标记粒细胞表面标志物、PE-CY5标记HLA抗体。　　6、血小板自身抗体检测　　血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关症状，如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别血小板抗体。　　7、移植交叉配型　　原细胞毒实验，主要用于避免移植物超急性排拆反应。流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击，作为HLA配型前的预实验。流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准。FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别T细胞CD3或B细胞CD29抗体。　　8、检测细胞经抗原或细胞有丝分裂刺激后活化效应淋巴细胞早期活化指标CD69可用来检测免疫治疗效果。流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化情况：FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD8抗体、PE-CY5标记的CD69抗体。　　9、细胞增殖状态检测　　核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量细胞增殖分裂状况，在评估肿瘤预后有重要意义。为些标志物的检测一般同细胞表面标志物同时检测。FITC标记PCNA或Ki67或BrdUrd，PE或(并)PE-CY5标记细胞表面标志物。　　10、染色体分析　　流式细胞仪染色分析运用两种特异性染料：Hoechest33258与核苷酸AT结合 Chromomycin A3与GC相结合。从而在双参数坐标上根据染色体ATCG含量的不同识别各种染色体。平时进行的染色体分析耗时且需要操作者极具经验，而用流式细胞仪时可快速地识别出异常染色体，如加配分选系统可将这些异常染色体分选出来作进一步分析。　　以上，就是小编为您介绍的流式细胞仪的概念、发展历史、特点、分类、基本原理以及应用。如今医疗的进步离不开医疗设备的发展与进步，流式细胞仪就是集中于测量发育异常的细胞遗传物质的数量变化，该设备的鉴定对种质资源、物种进化、物种分类、生态学研究、倍体育种等方面具有重要意义。

本文介绍流式细胞仪进口国内收货人资质|进口流式细胞仪报关注意事项|进口流式细胞仪清关单证|进口流式细胞仪报关流程手续|进口流式细胞仪海运清关换单要求。进口流式细胞仪报关代理手续下面我们来简单分析下上海港进口流式细胞仪的大致通关流程：一般进口流式细胞仪远洋线的靠上海洋山港，近洋线的靠上海外高桥港。目前海运的货物有舱单后可以提前申报清关。进口流式细胞仪一般需要收货人需要以下资质：A.进出口权（对外贸易经营者备案表）B.海关注册登记证C.用电子口岸法人卡签约通关无纸化进口流式细胞仪申报一般需要提供以下文件：A、海运提单B、INVIOCEC、装箱单D、贸易合同E、申报要素F、协定产地证（如享受协定税率）G、其他需要的文件（具体货物具体分析）进口流式细胞仪报关代理手续进口流式细胞仪海运换单一般所需资料如下：①海运提单（如电放则电放提单打印）盖章②电放保函（如提单为电放，有些船公司有固定格式，需要提前落实）③对外贸易经营者备案表（提单上的收货人英文名称与对外贸易经营者备案表上保持一致）④国外收货人章+国内通知人章（如提单收货人显示为TO ORDER）⑤其他所需文件海运进口流式细胞仪清关的一般流程：落实国外资料——查询是否有舱单——进口申报缴税——查验（如发生）——进口换单——送货——目的地查验（如有）【知识拓展】国际海运中集装箱拼箱运费的一般计算方式LCL运费计算主要采用“W/M”方式。通常货物运费吨分重量吨(W)和尺码吨(M)。按商品的毛重以1000千克为1重量吨 以1立方米为1尺码吨 计费标准“W/M”是指按商品的重量吨和尺码吨二者择大计费。在理论上一般默认单位费率是固定的，求解时更多只考虑运费吨单个变量的比较。但在实际业务中，不同货代给出的拼箱费率按重量吨和尺码吨往往是不相同的，在这种情况下就要考虑双重变量，根据不同费率、运费吨组合计算后再行比较。比如说，某商品重量5吨、体积8立方米，“W/M”费率是USD100/60，那么最后的运费总额就不能只看W和M的比较，而是5×100和8×60的比较，最后按总额高者重量吨的标准收取500美元。在计算FCL包厢费率时，要根据体积大小按照(40尺-20尺-拼箱)的先后比较顺序。同时有两方面一定要注意：一是涉及到LCL时，要注意“W/M”是将运费吨和费率的乘积进行比较，按拼箱运费高者计价 二是总运费计算时，不管是FCL还是FCL+LCL，一定要按总运费最低价来核算。低硫附加费LSS的含义低硫附加费（Low Sulphur Fuel Surcharge，缩写为LSS）是众多航运附加费中的一种，是指为弥补在新的硫氧化物排放控制区域航行船舶使用低硫燃油所增加的成本而收取的附加费。为支持全球节能减排，国际航运业、国际海事组织等先后出台船舶排放标准，要求在排放控制区严格控制船舶燃油排放物中硫化物的含量。航运中常规燃油为重质燃油，硫含量通常高于前述标准。为符合排放控制区含硫量要求，航运公司必须使用不同类型纯度更高的燃料，往往就多出的这部分额外成本向收货人征收低硫附加费。

流式细胞仪与其他细胞剖析仪器比较，具有突出的技能特征，这些技能特征的不断改善就大致地代表了流式细胞仪的技能发展过程。 1、高速度: 剖析速度以每秒可剖析的细胞数来表明。流式细胞仪是以高速度的数据处理电子体系信号，合作GX的液流控制体系，有力地保证了流式细胞仪的检测功能。 流式细胞仪对细胞的检测速度一般为1000——5000个/s 而到现在为止，对细胞的规范剖析速度已到达了2×104个/s，Zda剖析速度可到达6×104个/s。 2、高灵敏度: 灵敏度的高低是衡量流式细胞仪检测弱小荧光信号的重要目标，一般是以能检测到单个微球上Z少标记有异硫氢酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)荧光分子数目来表明。 曾经，每个细胞要带有1000——3000个FITC分子才能在流式细胞仪上丈量出来 现在，一个细胞上只要带600个荧光分子，乃至带100个FITC分子，即可以被检测和分选出来。 3、高准确度: 曾经，在两个细胞间待测细胞成分存在5%以上的差异时，流式细胞仪才能检测出来 现在，两个待测细胞间细胞成分仅相差1%左右时，流式细胞仪便可检测出来。例如，在检测男人和女性外周血淋巴细胞DNA含量时，仅仅是X染色体和Y染色体DNA含量之间有所区别(大约相差约占整个细胞的2%左右)，使用流式细胞仪便可以轻而易举地把男人和女性的淋巴细胞区别隔并分选出来。 4、高精度: 分辨率是衡量流式细胞仪丈量精确度的目标，通常用变异系数(CV)值来表明。用流式细胞仪检测某种细胞成分时，比用其他剖析细胞学技能的CV值都要小得多，分辨率要高得多。众所周知，用某种仪器剖析细胞时，其CV值越大，剖析结果越不精确。 曾经的流式细胞仪，在剖析细胞样品时，CV值只能到达5%——7%左右，前向角散射光分辨率仅为0.3μm。流式细胞仪前向角散射光的分辨率已到达0.02μm。流式细胞仪的电信号脉冲通道，从最初的128道→256道→1024道，直到现在一般已到达40%道，有的乃至还可以到达5120道。 信号脉冲通道数散布越多，对细胞的分辨率就越高，对细胞的剖析就越精确。例如，现在，各流式细胞仪生产厂家生产的流式细胞仪，都能以高精确度来剖析人类染色体的畸变，经过二维图显现扩展集体散布，极大地进步了流式细胞仪的分辨率。别的，经过对脉冲体系功能的改善，也进步了细胞参数剖析的质量。 5、多参数: 流式细胞仪剖析细胞时，可以从一个细胞中一起获得多种细胞信息。因为流式细胞仪选用的光源不断改善从开端的单一的激光器或紫外光器，至现在发展为选用2-3个激光器，或再加一个紫外光器。 有的选用立体空间激光体系，实现多荧光道剖析，Zda程度地削减荧光信号之间的补偿，进步检测的灵敏度，所以，利用空间立体激起的多激光体系可以进步多参数的剖析质量。 现在的单激光四色剖析或双激光四色剖析的流式细胞仪，488nm激光器激宣布的4种不同荧光光谱之间常有堆叠，做4色剖析时，难以避免荧光过多堆叠而导致的补偿困难。利用该体系对488nm激光发生的3色荧光与635nm激起而发生的第4种荧光分成两种信号，能Zda程度地削减补偿，使4色荧光到达Zwan美的效果。 因而在一个细胞中，除剖析前向角和侧向角的散射光参数外，还可以检测到3种、4种、6种，乃至到8种荧光参数，这明显增加了流式细胞仪的信息量，进步了工作效率和科学性。 6、高纯度: 流式细胞仪的重要功能之一是能分选出实验者所需要的任何细胞。其分选目标首要包含:分选速度、分选纯度和细胞回收率。这些目标均随流式细胞仪的技能发展而逐步得到改善和进步。 现在流式细胞仪分选细胞速度已到达6×104——1×105个/s，分选纯度为99.9%以上，分选回收率也达90%以上。 7、其他几方面的技能改善: ①荧光信号从线性丈量到对数丈量的改善，因为对数丈量可以放大电信号，使之对弱荧光和某些药物自发荧光标本检测才得到满意的结果 ②光谱堆叠的校对，经过补偿润饰软件的开发使用，从而保证了各种不同激起荧光检测剖析的质量 ③DNA含量剖析时，经过剖析脉冲的面积、宽度，区别实体瘤组织标本中的粘连细胞集体，剔除DNA检测中的二联体细胞，Zda程度地削减假阳性，从而处理了实体瘤DNA剖析时长期存在的关键性的难题 ④曩昔选用激光的一种波长(如488nm)的发射光仅能激起样品中一种波长的继发光，因而，只能检测细胞中一种细胞成分。现在流式细胞仪选用一种488nm激起波长的发射光，可以一起激起样品中三种或四种不同波长的继发光，这便可用于同一细胞不同成分的同步剖析。