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什么是高效液相色谱法?它指一种用液体为流动相的色谱分离分析的方法。它在经典色谱的理论的基础上,采用的是高压泵、化学键和固定相高效的分离柱、高灵敏专用检测器。液相色谱法与气相色谱法区别在哪里呢? 液相色谱仪与气相色谱仪的区别在于: 1.分析对象的区别 GC:适于能气化、热稳定性好、且沸点比较低的样品;但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品,尤其对大多数的生化样品的不可检测占有机物的20%。 HPLC:适用于溶解后能制成溶液的样品(包括有机介质溶),不受样品挥发性和热稳定性的限制,对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测用途广泛,占有机物的80% 2.流动相差别的区别 GC:流动相为惰性,气体组分与流动相无亲合作用力,只与固定相有相互作用。 HPLC:流动相为液体,流动相与组分间有亲合作用力,能提高柱的选择性、改善分离度,对分离起正向作用。且流动相种类较多,选择余地广,改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用,当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。 3.操作条件差别 GC:加温操作。 HPLC:室温;高压(液体粘度大,峰展宽小)
乙腈(100%); 总体而言,使用乙腈时,色谱柱的背压低于甲醇,原因是乙腈的黏度低于甲醇(25 ℃时,乙腈0.37cp,甲醇0.60cp)。该指标,乙腈占优。综上所述,反相色谱法中乙腈的效果优于甲醇。(不考虑价格)2.离子抑制色谱法该选何种试剂?离子抑制就是向流动相中加入酸或碱,使弱酸或弱碱以单纯的未解离形式存在,既能增大其在反相柱上的保留又能得到更完美的峰形。该方法主要用于弱酸分析(碱性化合物通常不采用离子抑制法)。常用的酸性添加物为磷酸、醋酸、甲酸等。对比三者的吸光值,磷酸是最小的(254 nm下约为0.04),乙酸和甲酸相差不大(254 nm下均略低于1.0),这一事实会导致一个问题——在低波长(254 nm以下)下,添加乙酸和甲酸会引起更高的噪声,这就影响了分析的灵敏度,另外由于磷酸酸性强,达到同一pH值用量更少,所以使用磷酸时噪声会更低。而在使用缓冲溶液和甲醇或乙腈进行梯度分析时,乙酸或甲酸的存在可能会对乙腈、甲醇的基线漂移起到一定的抵消作用,当然这只是猜测,还有待验证。3.上样前样品溶剂的选择。最好的溶剂是流动相。上面这句话可能很多人都知道,但至于为什么要这样可能不清楚。原因:(1)流动相作溶剂不会出现溶剂峰。在药物QC、化学品QC中,主成分和杂质定量是通过归一化法进行的,溶剂峰的出现会使主成分测定值偏离实际值,所以溶剂峰是必须要消除的,唯一的办法就是以与流动相组成严格一致的溶剂溶解样品。如果这样做还是会出峰,那可能就是不被保留的化合物了;(2)反相分析中,如果采用洗脱强度明显高于流动相的溶剂或溶液进行溶解,往往会导致柱效下降、峰前沿、峰前分叉峰,这种影响对洗脱较快的化合物影响更甚,并且进样量越大影响越严重。原因在于强洗脱样品溶剂的加入局部增大了流动相的洗脱强度,使单种组分的前部分与后部分的保留性不一致(前部分移动快、后部分移动慢),进而导致区域展宽。我举两个例子:我分析氯霉素时,流动相为甲醇:水=40:60,氯霉素是用甲醇溶解的,结果塔板数不足32000/m,后来改用流动相溶解,塔板数升到了90000/m;还有一次,我分离磺胺类药物,用的梯度(起点乙腈:乙酸水溶液=12:88),溶剂为甲醇,结果第一个峰分叉了,其余正常。要知道,如果是色谱柱损坏,那么所有的峰形均应分叉。后来改用流动相溶解,一切问题迎刃而解。我的结论:溶剂的洗脱强度等于流动相,峰形和色谱图会很完美;若稍低于流动相,也许会有溶剂峰,但峰形会是完美的,切勿使溶剂的洗脱强度明显高于流动相。期待其他朋友也讲讲自己积累的经验,供大家分享。
一. 色谱法 色谱法:根据各物质在两相中的分配系数(表示溶解 或 吸附的能力)不同而进行分离、分析的方法。 各组分被分离后,可进一步进行定性和定量分析: 经典:分离过程和其含量测定过程是离线的,即不能连续进行 现代:分离过程和其含量测定过程是在线的,即 能连续进行 经典色谱法:将潮湿的碳酸钙挤出玻璃管,用刀将各色带切下,用适宜的方法进行分析; 现代色谱法:当一个两组分(A和B)的混合物样品在时间t1从柱头加入,随着流动相不断加入,洗脱作用连续进行,直至A和B组分先后流出柱子而进入检测 器,从而使各组分浓度转变成电信号后在荧光屏上显示出来。 根据峰的位置(出峰时间 t ) ——定性 根据峰的面积 A (或峰高h) ——定量 二. 色谱法分类 (一)按两相物理状态分 1. [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]法 (gas chromatography 简称 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url])用气体作流动相的色谱法。 2. 液相色谱法 (liquid chromatography 简称 LC)用液体作流动相的色谱法。 3. 超临界流体色谱法 (SFC) 用超临界状态的流体作流动相的色谱法。 超临界状态的流体不是一般的气体或流体 , 而是临界压力和临界温度以上高度压缩的气体 , 其密度比一般气体大得多而与液体相似 , 故又称为 “ 高密度[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]法 ” (二)按分离原理分 1. 吸附色谱法( adsorption chromatography ): 根据吸附剂表面对不同组分物理吸附能力的强弱差异进行分离的方法。 如:气一固色谱法、液-固色谱法——吸附色谱 2. 分配色谱法 (partition chromatography ): 根据不同组分在固定相中的溶解能力和在两相间分配系数的差异进行分离的方法。 如:气-液色谱法、液-液色谱法——分配色谱 3. 离子交换色谱法(ion exchange chromatography ) 根据不同组分离子对固定相亲和力的差异进行分离的方法。 4. 排阻色谱法( size exclusion chromatography): 又称凝胶色谱法 (gel chromatography ), 根据不同组分的分子体积大小的差异进行分离的方法。 其中:以水溶液作流动相的称为凝胶过滤色谱法 ;以有机溶剂作流动相的称为凝胶渗透色谱法。 5. 亲合色谱法 (affinity chromatography) 利用不同组分与固定相共价键合的高专属反应进行分离的方法。 (三)按固定相的形式 1. 柱色谱法(column chromatography ): 固定相装在柱中 , 试样沿着一个方向移动而进行分离。 包括 填充柱色谱法:固定相填充满玻璃管和金属管中 开管柱色谱法:固定相固定在细管内壁(毛细管柱色谱法) 2. 平板色谱法 (planer chromatography ): 固定相呈平面状的色谱法。 包括 纸色谱法: 以吸附水分的滤纸作固定相; 薄层色谱法:以涂敷在玻璃板上的吸附剂作固定相。