数字层析显微镜

最近，加州大学伯克利分校的Jay Groves及其团队开发出了一种新型层析技术用于研究细胞膜。 　　Groves解释说：&ldquo 我们开发出的是一种嵌于细胞膜的纳米点阵列平台，当其在一个活细胞的细胞膜中运作时，它将提供一种用于探测和操纵细胞膜组件的物理手段，包括信号簇。 　　截至目前为止，科学家主要通过各种显微镜研究细胞膜。受限于光的衍射作用，常规的显微技术很难观察比250nm更小尺寸的结构，然而，大部分细胞膜的成分，如蛋白质受体都比250nm要小。近年来，一些可以突破衍射障碍的超高分辨率显微技术问世，但这些技术更适合观察个体的静态图像，不能成为探测不断移动和变化中的细胞膜的理想技术。因此，科学家们需要一种用于细胞膜研究的全新技术。 基于尺寸的新型层析技术并首次用于研究活细胞 　　由Groves及其团队开发的这种技术，首先需要创建一种含有蛋白质的人工脂质膜，在金纳米颗粒阵列沉积在细胞膜表面之前，这些人工膜将在细胞表面与受体结合。下一步，对细胞表面的受体进行荧光标记，然后让该细胞无限靠近人工膜，这使得人工膜中的蛋白质和细胞膜中的受体彼此捆绑结合。 　　通常情况下，受体在细胞膜的周围不断移动。但现在它们与人工膜中的蛋白质结合，其运动是受金纳米颗粒阵列约束的。只有当受体比金纳米颗粒之间的间隙更小时，他们才能够移动，而荧光标记物将显示出任何的移动轨迹。通过改变金纳米颗粒之间的距离，Groves及其团队可以测定受体的尺寸和研究影响受体功能的运动。 　　这是一种基于尺寸的新型层析技术并首次用于研究活细胞，Groves及其团队通过该方法研究免疫系统中T细胞表面的受体。这些T细胞受体(TCRs)包括聚集的蛋白质团簇，当遇到蛋白质抗原时，它们可以捆绑结合。通过人工膜以附着不同浓度的抗原，改变金纳米颗粒之间的距离，Groves及其团队发现，团簇的大小取决于抗原浓度，浓度越高越利于形成更大的团簇。 Jay Groves 　　&ldquo T细胞受体微簇信号系统已经借助传统的光学显微镜有了很充分研究，但这部分是我们过去所不了解的。&rdquo Groves 表示：&ldquo 这是一种原理性的证据，它表明通过合成材料连接活细胞是实现细胞的分子级控制的另一个步骤。&rdquo （编译：刘玉兰）

近年来，以光场显微镜为代表的一系列计算成像技术，因其低光毒性、快速三维成像能力等优势备受注目，在活体显微成像领域取得了突破性的成果【1】。由于光场成像技术可以在单次拍摄下获取样本的高维信息，在长时动态观测方面具有独特的优势，例如观测血流、大规模神经活动、细胞内以及细胞间长期相互作用等等。而在复杂的活体成像环境下，光场系统采集的高维目标信号与无序散射光以及高强度背景光深度杂糅，极大限制了穿透深度与信号的定量程度。近日，清华大学的研究团队提出了一种基于非相干散射理论的多尺度量化模型（QLFM），可通过充分挖掘光场数据的高维特性和准确的物理建模，从而实现计算光学层析能力。该研究显著减少了背景荧光与散射光子的影响，同时也提升了单光子成像在复杂活体环境下的穿透深度，推动光场显微技术进入定量荧光显微时代。相关研究成果于 2021 年 11 月 4 日在线发表在 Nature Communications 杂志，题为：Computational optical sectioning with an incoherent multiscale scattering model for light-field microscopy。在复杂的成像环境下，由于背景光、散射光以及系统像差等多种因素的干扰，传统的光场成像模型无准确求解成像反问题。这一特性极大限制了光场显微成像技术在活体观测中的应用。在此基础上，QLFM提出了多尺度精确量化模型，在完备空间下剥离信号光、背景光以及散射光分量，实现了光学计算层析，显著提升了成像穿透深度。通过此方式，科学家在400μm的成像深度下，将图像的信背比 (signal-to-background ratio, SBR) 提升了20dB。该方法被用于观测等斑马鱼脑、果蝇脑、果蝇卵、小鼠脑等多种活体生物样本，并在多种成像环境下成功解析了高SBR的三维动态信息。此外，由于不需要额外的硬件支撑，该方法广泛适用于各种相空间成像系统。图1 | QLFM 概念与原理示意在传统的光场成像模型中，大量的背景光极易将目标荧光信号淹没，极大制约了成像深度。QLFM首先提供了一种多尺度的完备空间模型，利用光场不同角分量下点扩散函数 (point spread function, PSF) 的不同特征，分离出大尺度范围内的背景光分量，并将其在成像反问题求解过程中剔除。另外，为了提升计算效率，QLFM提供了一个基于非均一分辨率的多尺度采样机制。这种采样方式极大的节约了计算成本，将重建速度提升了两个数量级，为长时间活体三维观测提供了基础。图2 | 在斑马鱼心脏成像实验中，QLFM 与传统模型的对比除了背景光，杂乱无序的散射光也是一个需要考虑的因素。在传统成像模式下，由于散射光与信号光深度杂糅，不能通过常规的光学层析将散射光剔除。但在光场成像模式下，相空间分量准确描述了目标的高维光场分布，这为解析散射光提供了可能。基于上述理论，QLFM还提出了一种相空间下非相干散射传播模型，对目标体中的散射光进行逐层建模，并将此模型融合到相空间成像反问题求解算法中，通过反复优化迭代，最终获得分离的散射光和信号光分量。另外，系统畸变造成高维PSF畸变也是导致成像质量下降的一个因素。QLFM提供了一个基于向相位恢复算法的PSF矫正模型，通过反复迭代拟合，使得仿真PSF的强度分布收敛到与实采PSF一致，同时又保证了更高的信噪比。使用矫正后的PSF进行反问题求解可以显著缓解近焦面的伪影，同时在整个成像范围内都提升了空间分辨率。QLFM 利用精确数学建模获得了光学计算层析能力，极大程度削弱了背景光的干扰，剔除了活体样本中散射光的影响并消除由系统像差引入的畸变，由此从高维光场信号中准确求解复杂成像反问题，显著提升了光场显微系统的实用性与在活体环境下的定量荧光观测能力。同时QLFM也进一步提示了复杂物理模型在反问题求解过程中的重要性。如何准确地从数据中可解释地挖掘出真实世界的定量本真信息将是未来发展的一个重要趋势。清华大学自动化系博士生张亿、卢志、清华大学自动化系助理教授吴嘉敏为该论文的共同第一作者，清华大学自动化系、脑与认知科学研究院、北京科学信息与技术国家研究中心戴琼海教授、季向阳教授、吴嘉敏助理教授为论文共同通讯作者。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-021-26730-w

X射线三维成像可以实现物体内部的无损检测。但是对于大尺寸的板状样品的三维成像一直是业界的难题，层析成像技术是目前解决这一难题的最佳方法。一、 什么是层析成像？目前比较被大众熟知的Computed Tomography（CT）通常被翻译为计算机断层成像。最早的实验室CT扫描机由英国Godfrey Hounsfield于1967年建成，第一台可供临床应用的CT设备于1971年安装在医院。CT自发明以来，经历了多代发展，这里就不再赘述。简单理解，CT就是求解一个线性方程组，最终得到的结果就是CT图像。CT扫描就是构造方程组的过程，每一条被探测器接收的射线就代表了一个方程。对二维断层成像而言，要想得到好的求解结果，需要平面内任意方向的射线。这也是要求射线源-探测器组合相对于成像目标旋转360度的原因（出于严谨考虑，这里声明不考虑短扫描等情形）。层析成像技术，早在1921年就已经出现。这个时期的层析成像可以称之为传统层析成像。由于信息交流的不便，多个国家的研究者分别独立提出了层析成像的方法，并且给予了不同的命名。目前流传下来比较被大家接受的是Tomosynthesis和Laminography。现在用于乳腺癌筛查的钼靶成像（只是用了钼靶射线源而已），严格讲应该叫作数字乳腺层析成像（Digital Breast Tomosynthesis，简称为DBT）。而工业上比较习惯于用Laminography，我们延续了这种用法。在进行中文翻译的时候为了跟计算机断层成像区分，我们将Tomosynthesis和Laminography都翻译为层析成像。CL全称即Computed Laminography。二、 传统层析成像 CL与CT到底有什么区别？在前面我们已经提到CT成像一般需要射线绕物体一周。而在有些时候这是无法实现的。比如，现场条件受限或者物体在某些角度太长，射线无法穿透。比如大尺寸的板状物体。对于下图接近一米长的PCB，如果采用显微CT扫描，只能采用先切割的破坏性方法。如果非得用一个简单粗暴的标准区分CT和CL：画一个过物体的平面，如果射线源和探测器的运动轨迹不跨越这个平面，就可以认为这是CL。可以通过下图了解传统层析成像的原理。通过采集不同角度的投影数据（那时还只有胶片），将胶片简单叠加在一起，其中一层的数据会被增强（这一层称为焦平面）。下图中Plane 2的数据（以圆形代表其细节）就被增强了。传统层析成像，每次只能增强一个焦平面内的结构，而其它层的图像仍然是模糊的。三、 现代层析成像我们所说的层析成像一般都是指现代层析成像。这里的现代是相对于上面的传统而言的。现代层析成像是指采用了数字探测器和图像重建算法的层析成像。其成像结果中每一层都得到增强。虽然与CT相比，由于其数据缺失，会造成层间混叠（后面我们会着重介绍）。但在很多应用场景，这是能得到的最好的结果。下图是几种常见的层析成像结构。如果将有限角CT也称作CL的话，可以认为是第5种结构。这里我们对各种成像结构的成像能力进行简单的分析。（I）结构简单，但数据缺失过于严重（扫描的角度等于射线的张角）；（II）仅能扫描中心区域；（III）(IV)相似，可以扫描任意区域，但在探测器的运动细节上有差异。其机械实现和数据处理上的差异过于专业，我们在这里就不再展开讨论。四、 层间混叠这是CL避免不了的问题。首先通过下图来了解一下层间混叠是什么样子。其表现就是横向的边缘被弱化了。为什么会出现这个问题呢？这得从傅里叶中心切片定理讲起，还是算了吧，简单点理解就是缺少了横向穿过物体的射线。为什么会缺少？因为这个方向射线穿不透啊，回忆一下前面一米长的PCB。如果你对上面的图像不满意，不如换个方向看看。是不是感觉好了很多。有没有办法彻底解决这个问题？针对特定的扫描对象，使用复杂的模型，效果会有所提高，但离实用还有很长的距离。 五、 CL的优点 谈完缺点再来聊聊优点。首先，就像前面提到的，这是现有条件下能得到的最好的结果。CL可以对大尺寸的板状物体得到非常高的分辨率。目前，射线源的焦点尺寸可以小到几百纳米。要想实现高分辨成像，需要射线源尽可能靠近物体，而CL这种扫描方式可以很容易的实现这一点。采用光学放大透镜的探测器的显微CT，样品可以不靠近射线源，但是由于射线的利用率底，扫描的时间会很长，难以满足快速检测的需求，且同样无法解决射线在有些角度下无法穿透的问题。下面再来聊聊CL另外一个优点。CT和CL图像最终表示的是物质对射线的线衰减系数（与射线能量、物质原子序数、物质密度等有关系）。一般趋势，线衰减系数随射线能量的增加而减小，简单点理解就是能量越高的射线越不容易被物质吸收。不同材料衰减系数的差异也随射线能量的增加而减小。由于CL始终沿着容易穿透的方向照射物体，可以使用较低能量的射线，因此能够获得较高的密度分辨能力。六、 国内CL研究进展与国外相比，国内对于CL技术的研究起步较晚。北京航空航天大学、中国科学院高能物理研究所等单位是国内最早开展CL成像研究的机构。在科技部重大科学仪器设备开发项目支持下，2015年，由中国科学院高能物理研究所和古脊椎动物与古人类研究所共同成功研发专用于“板状化石”的显微CL仪器，并在2016年中安装到中科院脊椎动物演化与人类起源重点实验室高精度CT中心，该仪器同时服务其他科研院所，中国科学院南京地质古生物研究所、中国地质科学院地质研究所、北京自然博物馆、安徽博物院、广西自然博物馆、北京大学，云南大学、西北大学、首都师范大学等，累计检测化石750余件。为板状化石的三维无损检测提供了全新工具，起到了不可替代的作用。该仪器的实验结果，助力研究人员在《Nature》、《Science》等期刊上发表论文20余篇，其中五项成果分别入选并领衔2018年、2019年、2020年和2021年中国古生物学十大进展。专用于“板状化石”的显微CL设备及其应用集成电路和电力电子领域也存在大量的板状产品。随着封装集成度和密度不断提高，对其内部结构缺陷检测要求空间分辨率达到微米甚至亚微米级。2019年，在科技部重大科学仪器设备开发项目支持下，中国科学院高能物理研究所针对电子器件封装检测需求，研制了具有亚微米级缺陷检测能力的X射线三维分层成像仪，关键指标达到国际先进水平。为了更好的进行X射线精密检测设备的推广，中国科学院高能物理研究所在2021年成立了锐影检测科技（济南）有限公司。X射线三维分层成像仪及其应用2021年，锐影检测科技（济南）有限公司成功研发了用于绝缘栅双极型晶体管（IGBT）焊接缺陷检测的专用CL设备。彻底解决了超声法和X射线DR成像无法检测带散热柱的IGBT模块的问题。设备实现了大视野快速成像，可以自动定位DBC焊接区域，自动进行气孔缺陷的识别，计算气孔率、最大气孔率、最大气孔尺寸，适用于在线检测。技术指标达到国际领先水平。IGBT焊接缺陷检测专用CLCL与DR方法对于IGBT基板焊料层气孔检测效果的比较总结随着科研及制造业的升级，对CL检测设备的精度、检测速度和智能化水平提出了更高的要求。新型CL设备的研发将是科研机构及X射线无损检测公司面临的挑战和历史机遇。 参考文献：【1】 Jiang Hsieh, Computed Tomography Principles, Design, Artifacts, and Recent Advances 3rd edition, SPIE PRESS.【2】 Buzug, Thorsten M. Computed tomography: from photon statistics to modern cone-beam CT. Springer, 2008.【3】 Zenghui Wei, Lulu Yuan, Baodong Liu, Cunfeng Wei, Cuili Sun, Pengfei Yin, and Long Wei, A micro-CL system and its applications. Review of Scientific Instruments, 88, 115107, 2017.【4】 Zuber M, Laaß M, Hamann E, Kretschmer S, Hauschke N, van de Kamp T, Baumbach T, Koenig T. Augmented laminography, a correlative 3D imaging method for revealing the inner structure of compressed fossils. Sci Rep. 2017 Jan 27 7:41413. doi: 10.1038/srep41413. PMID: 28128302 PMCID: PMC5269749.【5】 https://mp.weixin.qq.com/s/_SyUUlHpJNXrLxHFKYwydw本文作者：锐影检测科技（济南）有限公司