细胞培养优化系统

人类诱导多能干细胞 (hiPSC) 是一类通过基因编辑技术（如 CRISPR-Cas9）对已经高度分化的人体细胞重新逆分化得到的多能性干细胞。hiPSC的出现为科学家构建复杂的疾病模型和推进药物发现提供了有利的工具。 然而，传统的hiPSC细胞系的构建与培养过程往往操作复杂且耗时耗力。特别是从异质编辑细胞池中构建的克隆hiPSC系的培养受到了传统细胞培养方法的桎梏，很难构建一个高效的hiPSC构建与培养工作流程。此外，现有的单细胞分离和培养方法通常对细胞的处理条件苛刻，操作步骤繁琐，不能充分保证单克隆性。 为应对hiPSC细胞系构建与培养过程中的诸多挑战，IotaSicences公司采用了以GRID技术为核心的高度自动化的单细胞可视化分选培养系统isoCell来构建 hiPSC系的分选与培养平台，并在不同培养基条件下对hiPSC进行了单细胞分选与培养研究。图1 单细胞可视化分选培养系统isoCell实物图 以isoCell为核心的hiPSC细胞分选与培养平台 isoCell是一款基于GRID技术的高度自动化细胞分选与培养平台。GRID是指在细胞培养基上采用FC40液体分隔出的网格小室，体积小，光学透明度高，可以容纳细胞在内生长，且各个小室之间物质不流通。isoCell系统配备了荧光和成像系统，用于在整个克隆工作流程中记录 GRID 小室的图像（见下图）。isoCell 可自动执行所有液体处理步骤，包括构建 GRID、将单细胞注射到GRID小室中以及交换培养基和收获单克隆集落。并且，isoCell可在整个工作流程中自动检测每一个 GRID 小室，并确保每一个单克隆hiPSC细胞系来源于单个细胞。 图2 GRID实物图 材料与方法 在分别铺了Laminin-521、Vitronectin-N和iMatrix 细胞培养基质的60毫米培养皿上制备的GRID网格以待使用。制备hiPSC的单细胞悬浮液，并使用 isoCell全自动地将细胞铺在GRID上（种植）。 使用isoCell自带的显微镜鉴定每个GRID室并标记每个包含单个细胞（第 0 天）的室，将该培养皿放入培养箱培养。在第3天，将标记的含有单个细胞的GRID小室加满600 nl培养基。从第5天开始，每天观察标记单细胞的GRID小室，并对选中的GRID小室补充培养基。最后，使用isoCell观察并标记构成了hiPSC单细胞群落的GRID小室，使用isoCell全自动收获标记的GRID小室中的hiPSC细胞（通常在 6-8 天之间）。 图3 以isoCell为核心的hiPSC细胞分选与培养平台工作流程图 高效的hiPSCS细胞分选与培养平台 按照上述的工作流程，利用三种不同的培养基质（包括 VTN-N、LMN-521 和 iMatrix）构建并培养了两个独立的hiPSC细胞系，并评估所得细胞的克隆效率。如图4所示，两个不同的hiPSC测试系在不同培养基质条件下，均在GRID室中显示出非常高的克隆效率，这表明采用GRID小室低容量培养方法和细胞的自动化温和处理可产生非常适合单细胞高效生长的培养环境。 图4 GRID中的单细胞 hiPSC 克隆效率（克隆效率表示培养第5天时单细胞长成细胞群落数占第0天单细胞数的百分比） 结论 以isoCell构建的hiPSC细胞分选与培养平台可以对hiPSC细胞进行全自动化且温和地单细胞分选与培养。通过isoCell特有的GRID小室网格技术与可视化分选相结合，可以确保每一个单克隆hiPSC细胞系均来自单个细胞，且isoCell的分选与培养条件温和，hiPSC单克隆细胞系成活率高。 单细胞可视化分选系统isoCell的优势：- 全自动化流程- 操作条件温和，对单细胞无损伤- 全培养、分析流程可追踪- 单细胞分离效率高达100%- 单克隆细胞系构建成活率高- 直接转移到PCR管或96孔板- 结构紧凑，体积小 单细胞可视化分选培养系统-isoCell已在Cell、Advanced Science、Small Methods、Nature Communications等知名期刊发表多篇文章，如下摘引了近年五篇具有代表性的文献和大家分享。 Soitu C, Stovall‐Kurtz N, Deroy C, et al. Jet‐Printing Microfluidic Devices on Demand[J]. Advanced Science, 2020, 7(23): 2001854.Gangoso E, Southgate B, Bradley L, et al. Glioblastomas acquire myeloid-affiliated transcriptional programs via epigenetic immunoediting to elicit immune evasion[J]. Cell, 2021, 184(9): 2454-2470. e26.Deroy C, Nebuloni F, Cook P R, et al. Microfluidics on Standard Petri Dishes for Bioscientists[J]. Small Methods, 2021, 5(11): 2100724.Deroy C, Wheeler J H R, Rumianek A N, et al. Reconfigurable microfluidic circuits for isolating and retrieving cells of interest[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2022, 14(22): 25209-25219.Oliveira N M, Wheeler J H R, Deroy C, et al. Suicidal chemotaxis in bacteria[J]. Nature Communications, 2022, 13(1): 7608. 样机体验 为更好地服务中国科研工作者，Quantum Design 中国也建立了样机演示实验室，将为大家提供为专业的售前、销售、售后技术支持，欢迎各位老师垂询！ 用户名单 用户评价 路易莎埃姆斯，研究科学家：The Native Antigen Company（LGC 临床诊断集团旗下公司） “使用 isoCell 进行单细胞克隆工作从一开始就简单可靠，并且已无缝地融入我们的流程中。 该程序对细胞很温和，我们看到非常好的存活率，可以筛选大量克隆。 我们收到的客户服务是优质的。”

茂默科学以客户为本、合作共赢的理念，致力于帮忙客户提供整体实验方案。力求解决行业内客户对科学仪器选型难、维护难的处境。通过不断优化公司运作和提升服务质量，目前已赢得业内人士和广大客户广泛认可，拥有广泛而稳固的合作伙伴和客户群体。茂默科学现介绍细胞培养实验室设备配置及用途，想要了解更多仪器、实验室仪器选配、实验室整体打包方案制定，敬请咨询~1. 超净工作台实验室设备目前绝大部分细胞实验室使用超净工作台实现无菌操作，具有操作简单、安装方便、占用空间小且净化效果很好。安徽人和净化为您介绍两种主要超净工作台-侧流式（垂直式）和外流式（水平层流式）。工作原理一般是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器精滤，由此送出的洁净气流以一定的均匀的断面风速通过无菌区，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。（1） 侧流式工作台：空气净化后的气流由左或右侧通过工作台面流向对侧，也有从上向下或从下向上流向对侧，形成气流屏障保持工作区无菌，工作台结构为封闭式；（2） 外流式工作台：净化后的空气面向操作者流动，因而外方气流不致混入操作，工作台结构为开放式，但进行有害物质实验操作对操作者不利。 超净工作台应需要定期请有关部门检查洁净度，符合要求的超净工作台其洁净度应达到100级，用尘埃粒子计数仪检测粒径≤5μm的尘埃粒子数量不应超过3.5个/L；空气流量应控制在0.75-1.0m3/s；细菌菌落数平均 2. 显微镜倒置式显微镜是细胞培养实验室日常工作常规必备设备，主要用于日常了解细胞的生长情况并观察有无污染发生。如资金允许，建议选用配置有照相系统的高品质相差显微镜、解剖显微镜、荧光显微镜、录像系统或缩时电影拍摄装置等，可随时拍摄并记录细胞生长情况。3. 培养箱体外培养的细胞和体内细胞一样，需要在恒定的温度下生存，一般适生长温度为37℃，温差变化不应超过±0.5℃。温度升高2℃时，变不利于细胞生存，温度达到40℃以上细胞将很快死亡。因此，可精确控温的恒温培养箱、CO2培养箱是、佳选择。（1） 恒温培养箱：应选隔水式或晶体管式自控温培养箱，此类培养箱灵敏度高，温度控制较稳定。一般的恒温培养箱价格较便宜，其缺点是只宜于作密闭式培养。（2） CO2培养箱：目前多数的细胞培养室已广泛使用。CO2培养箱的优点是能够提供进行细胞培养时所需要的一定量的CO2（常用浓度为5％），易于稳定培养液pH，适用于开放或半开放培养。使用培养瓶时，为使培养瓶内与外界保持通气状态，可将瓶盖略微旋松，为避免细胞被污染，使用这种培养方式时，培养箱内空气必须保持清洁，需定期用紫外线照射或酒精消毒，同时培养箱内应放置盛有无菌蒸馏水的水槽，防止培养液蒸发，保持箱内相对湿度。（3） 细胞培养耗材：培养细胞的器皿可用培养皿、培养板或培养瓶。4. 烘箱（干燥箱）用于细胞培养的一些器械、器皿必须烘干后才能使用，玻璃器皿等须干热消毒。干热消毒时，烘箱内温度一般要达到160℃以上，通常使用鼓风式烘箱。其优点是温度均匀、效果较好，缺点是升温过程较慢。升温时不能先升温后鼓风而应鼓风与升温同时开始，至100℃时，停止鼓风。需注意避免包裹器皿的纸或棉花烧焦，烧焦的碎屑可影响细胞的生长。消毒后不能立即打开箱门，以免骤冷导致玻璃器皿破裂，应等温度自然下降至100℃以下后可开门。5. 水纯化装置细胞培养对水的质量要求较高，细胞培养、细胞培养相关液体的配制用水以及清洗细胞培养器皿用水都必须事先经过严格的纯化处理。目前有多种纯化方法相结合，可使普通水纯化为纯水和超纯水的纯水装置使用非常灵活方便，可挂壁式、台式、可配储水箱、也可直接用分液枪、还可根据各类实验用水要求选择配置杀菌功能，有效去除DNA酶、RNA酶、蛋白酶等，更有可有效去除掉热源、内毒素的超滤型纯水装置。6. 冰箱细胞培养实验室必备设备，应专用，不得存放易挥发、易燃烧等对细胞有害的物质，且应保持清洁。一般包括普通冰箱、低温冰箱和超低温冰箱。普通冰箱：储存培养液、生理盐水、Hanks液试剂等培养用的物品，可短期保存组织样本。-20℃低温冰箱、超低温冰箱：用于储存需要冷冻以保持生物活性以及需长时期存放的制剂，如酶、血清等。7. 细胞冷冻储存器储存器常用的液氮容器，根据使用需要分为不同类型和规格。选择液氮容器时需要考虑三个因素：容积大小、取放使用方便、液氮挥发量。液氮容器的大小一般在25-500L，可以储存1ml的冻存管250-15000个左右。液氮温度、低温度可达-196℃，使用时应注意避免冻伤。由于液氮易挥发，需注意观察剩余液氮量，及时补充，避免液氮不足使细胞受损或死亡。目前有许多智能型细胞冷冻储存器可供选择，可配置有电子控制器的液氮储存器，实现冻存自动化；并可监测液氮水平和样品温度，确保样品温度始终处于设定温度点；可配置报警系统，设置液氮液面、温度、电池、电压、电源等失常情况下报警；同时具备热气体旁路系统，防止高于-130℃的暖空气进入液氮罐，从而更有效地保护样品，防止容器内升温。另外，可选择液氮供应罐通过连接管给储存罐补充液氮，保证样品安全。8. 离心机细胞培养时，通常使用离心机制备细胞悬液、调整细胞密度、洗涤和收集细胞。一般常规配置4000rpm台式离心机；若要做细胞沉降，需要使用80-100G离心力，因为离心力过大会损伤细胞。根据不同要求，有大容量、可调温度离心机、高速离心机和低温冷冻离心机等更多功能离心机可选择。9. 天平常用的有精密天平和分析天平。 分析天平的精确度一般为0.1mg、0.01mg和0.001mg。一般根据取样量量和精度要求选择合适的天平：取样量大于100mg宜选用精确度0.1mg的天平；取样量100-10mg，选用精确度0.01mg的天平；取样量10mg宜选用精确度0.001mg的天平。天平需要定期校准，可选择有自动校准功能的天平，方便维护。天平使用需要注意清洁，避免腐蚀性粉末、液体直接接触称量台。

现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的。正在倍受重视的基因治疗、细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了关键的核心作用。开发合适的培养基配方与优化细胞培养条件是保证产品质量、产量以及批次之间一致性的重要因素，尤其是抗体药物偶联物、双靶点/特异抗体类药物、抗体片段融合蛋白等相对分子量大、结构复杂的抗体类药物，对其重要性不言而喻。而对于生物类似药的研发与质量控制来说，尽可能通过优化工艺缩小差异，更有利于生物类似药与原研参比品的质量对比研究，提高生物类似药的质量研究结果与参比品之间的相似性，从而使各项质量属性达到预先设置的可接受范围。目前生物制品公司的生物过程工艺开发与优化偏重于监测常规的温度、搅拌、溶解气体、OD值等理化条件和少数培养基成分与代谢物等的变化，缺乏对于细胞培养上清液组分直接、全面且快速的客观动态数据分析，因此无法精准优化细胞培养工艺条件，甚至影响抗体类药物等的产品品质；而培养基生产商为了开发高效低成本培养基配方，并且要保证批次间一致性，则需要投入大量的人力物力，配备不同检测功能的仪器来实现培养基成分的全方位检测。 为满足快速全面分析细胞培养上清液组分和培养基组分，将基础碳源、氮源、核酸、维生素和其他主要代谢物同时检测分析的需求，我们开发出“细胞培养上清液方法包”。该技术平台采用超快速三重四极杆液质联用仪，仅需17分钟，即可同时监测95种细胞培养上清液营养成份和代谢物等的相对丰度变化 。无需用户自行开发方法，即装即用。所有目标化合物信息与实验方法全内置，且根据需要可增加，可拓展。为增进用户对“细胞培养上清液方法包”的深入了解和方便使用，岛津企业管理（中国）有限公司分析中心整理编写了本册《细胞培养上清液及培养基组分分析应用文集》。本册文集介绍了“细胞培养上清液方法包”在不同培养基组分分析以及细胞培养过程监控中的应用，共收录应用文章 10 篇，为相关领域的客户使用该系统提供参考。 关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司，在中国全境拥有13个分公司，事业规模不断扩大。其下设有北京、上海、广州、沈阳、成都分析中心，并拥有覆盖全国30个省的销售代理商网络以及60多个技术服务站，已构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。本公司以“为了人类和地球的健康”为经营理念，始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务，为中国社会的进步贡献力量。