基因表达检测系统

在基因表达研究中，研究者比较注意选择合适的表达载体和宿主系统，而往往忽视基因本身是否与载体和宿主系统为最佳匹配这样一个实质性问题。基因的最佳化表达可以通过对基因的重新设计和合成来实现，如消除稀有密码子而利用最佳化密码子，二级结构最小化，调整GC含量等。以下就密码子最佳化、翻译终止效率和真核细胞中异源蛋白表达的问题加以说明。密码子最佳化（codon optimization）遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(optimal codons)，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子(rare or low-usage codons)。实际上用做蛋白表达或生产的每种生物（包括大肠杆菌，酵母 ，哺乳动物细胞，Pichia，植物细胞和昆虫细胞）都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。大肠杆菌、酵母 、果蝇、灵长类等每种生物都有独特的8个密码子极少被利用。有趣的是，灵长类和酵母 有6个同样的利用率低的密码子。大肠杆菌、酵母 和果蝇中编码丰度高的蛋白质的基因明显避免低利用率的密码子。因此，重组蛋白的表达可能受密码子利用的影响（尤其在异源表达系统中）的事实并不很奇怪。你的基因利用的密码子可能不是你正在利用的蛋白生产系统进行高水平表达所偏爱的密码子，这种情况是可能的。利用偏爱密码子(preferred codons)并避免利用率低的或稀有的密码子可以合成基因，基因的这种重新设计叫密码子最佳化。在同源表达系统中，同较低水平表达的基因相比，较高表达的基因可能有很不同的密码子偏爱。通过对密码子利用的归类分析，人们可以真正预测任何基因在酵母 中的表达水平。在诸如Zea mays的其他生物中，大量高表达基因强烈偏爱以G或C结尾的密码子。而且，在Dictyostelium中，同低水平表达的基因比较，高表达基因有较大数目的偏爱密码子。在大肠杆菌中表达哺乳动物基因是不可预测和具有挑战的。例如直到最近才实现了人血红蛋白的过表达。为了达到血红蛋白的好的表达水平，Alpha-球蛋白cDNA不得不用大肠杆菌偏爱的密码子进行重新合成。在异源宿主中实现象血红蛋白这样复杂的蛋白质的过表达可能需要最佳化密码子，这些研究者为此提供了令人信服的资料。成簇的低利用率的密码子抑制了核糖体的运动，这是基因不能以合适水平表达的一个明显机制。核糖体翻译由九个密码子组成的信使（含几个低利用率密码子或全部为低利用率密码子）时的运动速度要比翻译不含低利用率密码子的同样长的信使的速度慢。即使低利用率密码子簇位于3'端，信使最后也会被核糖体”拥挤”而损害，核糖体又回到5'端。3'端低利用率密码子簇的抑制效应可以和全部信使都由低利用率密码子组成的抑制效应一样大。如果低利用率密码子簇位于5'端，其效应是起始核糖体数目的全面减少，导致蛋白合成中信使的低效率。散在分布的稀有密码子对翻译的效应还未很好地研究，但是有证据表明这种情况的确对翻译效率有负面效应。其他因素也可以影响蛋白表达，包括使mRNA去稳定的序列。重新设计合成基因可以去除或改变这些序列，导致高水平表达。消除稀有密码子、去除任何去稳定序列和利用最佳密码子的基因的重新设计都可能增加蛋白产量，使的蛋白生产更有效和经济。翻译终止效率蛋白表达水平受许多不同因素和过程影响。蛋白稳定性、mRNA稳定性和翻译效率在蛋白生产和积累中起主要作用。翻译过程分为起始、延伸和终止三个期。对于翻译的起始，原核mRNA需要5'端非翻译前导序列中有一段叫Shine-Dalgarno序列的特异核糖体结合序列。在真核细胞，有效的起始依赖于围绕在起始密码子ATG上下游的一段叫Kozak序列的序列。密码子利用或偏爱对延伸有深刻的影响。例如，如果mRNA有很多成簇的稀有密码子，这可能对核糖体的运动速度造成负面影响，大大减低了蛋白表达水平。翻译终止是蛋白生产必须的一步，但其对蛋白表达水平的影响还没有被研究清楚。但是最近的科学研究表明终止对蛋白表达水平有很大的影响。总的来说，更有效的翻译终止导致更好的蛋白表达。绝大多数生物都有偏爱的围绕终止密码子的序列框架。酵母 和哺乳动物偏爱的终止密码子分别是UAA和UGA。单子叶植物最常利用UGA，而昆虫和大肠杆菌倾向于用UAA。翻译终止效率可能受紧接着终止密码子的下游碱基和紧靠终止密码子的上游序列影响。在酵母 中通过改变围绕终止密码子的局部序列框架，翻译终止效率可能被减低几个100倍。对于UGA和UAA，紧接着终止密码子的下游碱基对有效终止的影响力大小次序为GU，AC；对于UAG是U、ACG。对于大肠杆菌，翻译终止效率可因终止密码子及临近的下游碱基的不同而显著不同，从80%（UAAU）到7%（UGAC）。对于UAAN和UAGN系列，终止密码子下游碱基对翻译的有效终止的影响力大小次序为UGA、C。UAG极少被大肠杆菌利用，相比UAAN和UGAN，UAG表现了有效的终止，但其后的碱基对有效终止的影响力为GU，AC。对于哺乳动物，偏爱的终止密码子为UGA，其后的碱基可以对in vivo翻译终止有8倍的影响（A、GC、U）。对于UAAN系列，in vivo终止效率可以有70倍的差别，UGAN系列为8倍。如果终止密码子附近序列没有最佳化，可能发生明显增加的翻译通读，因此减少了蛋白表达。例如，在兔网状细胞无细胞翻译系统里，UGAC的翻译通读可以高达10%，而第四个碱基如果为A，G或C，翻译通读为1%。总的来说，翻译起始框架、翻译终止序列框架和密码子利用应该仔细选择，以利于蛋白的最高水平表达。翻译终止序列框架能几倍地改变蛋白生产水平。真核细胞中的异源蛋白表达异源蛋白质在细菌中表达是目前使用的主要的蛋白生产系统。大肠杆菌一直是最经济的系统之一。然而为了生产需要特异修饰、胞外分泌或有特异折叠需要的蛋白质，其他表达系统也是需要的。真核细胞在表达原核来源的基因、真核基因的cDNA拷贝或其他无内含子的基因时可能表现很多特异问题。富含AT的基因在很多真核细胞中表达时会遭遇很剧烈的障碍。主要的真核信号序列如 加poly-A的位点、酵母 转录终止位点和真核mRNA去稳定序列都是富含AT的。内含子序列也趋向于富含AT，尽管他们有参与剪切过程的很特异的识别序列。虽然绝大多数原核基因没有剪切或聚腺苷过程，但这些真核过程需要的保守序列可能存在于原核基因中，因此当这些基因在真核细胞中表达时可能引起特异的问题。而且诸如哺乳动物和单子叶植物细胞的特异真核表达系统可能不能有效地表达无内含子的基因。 真核mRNA在离开细胞核进而在胞浆的核糖体上被翻译前需要特异的处理和修饰。这些过程包括去除内含子、5'端甲基化帽子形成和3'端加poly-A。内含子去除需要5'剪切位点、G75/G100U100A65AG65U保守序列、3'剪切位点、富含密啶NC66A100G100/G56保守序列和C72T98R77A100Y75保守序列。有效的加poly-A和mRNA剪切需要一个由两个部分组成的信号：加poly-A保守序列AAUAAA和在切割位点内的50个碱基的富含GT的序列。酵母 真核转录终止序列（几个不同的富含AT序列,如含TTTTTATA，TATATA，TACATA，TAGTAGTA的一个38bp区域）被研究的最清楚。这些结果来自对酵母 突变体CYCI mRNA的mRNA水平和相对长度的确定的实验。近期用in vivo质粒稳定性分析的研究结果证明：TATATA似乎和原始的38bp野生型区域一样有效地终止转录，而TAGATATATATGTAA和TACATA效率差些，TTTTTTTATA几乎没有效率。所有这些序列在反方向时没有终止转录功能。不幸的是几乎没有其他真核表达系统转录终止序列方面的信息。内含子对几个哺乳动物基因的正常表达是必需的，包括Beta-球蛋白、SV40 late mRNA和二氢叶酸还原酶基因。单子叶植物细胞充分表达乙醇脱氢酶的cDNA拷贝、报告基因氯霉素乙酰转移酶、Beta葡萄糖苷酸酶和其他缺乏内含子的基因时也依赖内含子。转录区域内引入内含子可以通过未确定的转录后机制增强表达。（免疫球蛋白基因）内含子可能也包含转录增强子，因此通过转录机制增强表达。 总的来讲，如果存在某些DNA序列，真核异源蛋白表达可能是个难题。为避免剧烈的表达减少，需要对基因进行扫描，确认是否含上述提及的富含AT的序列。而且，在几个真核系统表达无内含子基因可能需要引入内含子以实现外源蛋白的充分表达。

待检测样品制备生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，必须将样品进行生物处理。从血液或活组织中获取的DNA/mRNA样品在标记成为探针以前必须扩增以提高阅读灵敏度，但这一过程操作起来却有一定的难度。比如在一个癌细胞中有成千上万个正常基因的干扰，杂合癌基因的检测和对它的高效、特异地扩增就不是一件容易的事。因为在一般溶液中PCR扩增时，靶片段太少且不易被凝胶分离，故存在其它不同的DNA片段与其竞争引物的情况。美国Mosaic Technology公司发展了一种固相PCR系统。此系统包含两套引物，每套都可以从靶基因两头延伸。当引物和DNA样品及PCR试剂相混时，如果样品包含靶序列，DNA就从引物两头开始合成，并在引物之间形成双链DNA环或“桥”。由于上述反应在固相中产生，因而避免了引物竞争现象，并可减少残留物污染和重复引发。根据样品来源、基因含量、检测方法和分析目的不同，采用的基因分离、扩增及标记方法各异。为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记。标记方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等。目前采用的最普遍的荧光标记方法与传统方法如体外转录、PCR、逆转录等原理上并无多大差异，只是采用的荧光素种类更多，这可以满足不同来源样品的平行分析。样品制备的常用试剂：对于检测表达的芯片，样品制备通常涉及mRNA的纯化，cDNA的合成，体外转录或者PCR，标记等步骤。而对于SNP或者突变检测，则往往涉及Genomic DNA纯化和PCR标记等步骤。1. RNA纯化：从样品中分离纯化高质量的RNA是非常重要的第一步。由于RNA样品中的DNA碎片会影响后继的PCR反应，所以要彻底除去样品中的DNA。通常用mRNA纯化的方法可以除去DNA片断，或者用RNase-Free的DNase处理RNA样品。在这里我们介绍一些常用的RNA纯化试剂盒，特别是由Affymetrix公司推荐的QIAGEN RNA纯化系列。* RNeasy Protect Kit：一旦生物样品被收集分离，它的RNA会立刻变得非常不稳定，极易被降解。由于特异及非特异的RNA降解，或者由于应激反应产生新的RNA都会引起RNA状态的改变。对于生物芯片、基因表达矩阵分析（Array Analysis）、定量RT-PCR等实验来说，采样后立即稳定样品里的RNA以保存当时RNA的表达状态，是精确/定量研究基因表达分析的重要前提。为了达到这个目的，往往需要将液氮或者干冰带到采样现场，采样后立即抽提RNA或者运回实验室保存。对于实验者来说非常不方便。著名的QIAGEN公司最近新推出一种RNA抽提试剂：RNeasy Protect Kit，提供一整套RNA保护和分离试剂，从样品的制备到RNA的抽提，只需一个试剂盒即可解决所有问题。保证样品的表达信息不受破坏，确保得到可信的基因表达分析结果。试剂盒里提供一种RNAlater RNA Stabilization Reagent，只要在采样后立即将新鲜样品浸入这种液体试剂，RNA保护剂可以迅速渗透到组织或其他生物样本中，稳定并保护RNA完整而不被降解，确保下游分析得到的数据真实反应样品的表达信息。保存在RNAlater中的样品RNA可以在37度下稳定保存1天，或者在18～25度保存7天，2～8度稳定4周，或者在-20度永久保存。这种技术为在不同温度下采样，运输和保存样品提供了极大的方便，特别适用于各种动物组织、培养细胞、细菌、白细胞，但必须说明的是它不适用于全血或体液中RNA的保存。RNAlater的用法非常简单，只要在采样后立即将样品完全浸入适量（10ul/1mg组织）的RNAlater中即可。取样的动作要尽量快速利索，组织样品的大小以不超过0.5公分厚为宜，对于一些小的组织如小鼠的脾、肾等器官则可以整个取出浸入溶液中，较大的则应切开为厚度小于0.5公分的小块，以确保RNAlater 能迅速扩散渗透入组织块中的所有细胞中。采样的容器应该足够大以容纳10倍于组织重量的溶液，避免组织块挤在一起，同时建议将溶液加满容器以避免在运输过程中组织块露出液面。注意本试剂只适用于新鲜样品，对于冷藏和包埋的样品直接抽提RNA即可。另外对于RNA已经降解的样品，RNAlater只能保护剩下的样品RNA，不能修复已破坏的RNA。保存后的样品可以直接用于RNA或者mRNA的抽提。RNAlater不会影响组织块的结构，可以在室温下切出适量的组织块用于称量和抽提RNA，剩下的部分可用于继续保存样品。-20度冻存的样品可以取出在室温下进行称量等操作而无需干冰。在-20度冻存的样品反复冻融20次RNA依然保持完好无损。RNAlater处理的样品比新鲜组织稍微硬一点，但不会影响匀浆过程。取出适量的样品即可开始加RLT缓冲液进行匀浆化。和传统的RNeasy Kit一样，RNeasy Protect Kits采用QIAGEN著名的硅胶膜纯化柱技术，迅速特异地吸附样品裂解液中的RNA，无需酚氯仿抽提，不用乙醇沉淀或LiCl沉淀，也不用CsCl超离，只要洗脱即可得到纯的RNA。通常情况下RNeasy的纯化技术足以除去绝大部分的DNA，而无需额外进行DNaes处理，但是对于一些对痕量DNA非常敏感的实验，用RNase-Free DNase Set（QIAGEN cat.no. 79254）可以直接在纯化柱上消化DNA残留，在随后的洗涤步骤中除去DNase，最后洗脱得到不含DNA的纯RNA。试剂盒具有以下优点：●迅速稳定并保护RNA，确保基因完整、基因表达信息可靠。 　　●由于RNA Stabilization试剂，您可以放心地在室温下操作，方便、安全——无须液氮和干冰。 　　●确保RNA不受降解——即使多次冻溶也不受影响。 　　●简单、快速和可靠RNA分离——使用于所有下游分析的即用型RNA。货号 品名（规格） 价格（RMB）74124 RNeasy Protect Mini Kit（50） 3181.00　　75152 RNeasy Protect Midi Kit（10） 1313.00　　75182 RNeasy Protect Maxi Kit（12） 4140.00　　76104 RNAlater RNA Stabilizationeagent 682.00http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/07/28/1216791379.gif

1．目的了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。2．原理外源基因克隆在含有lac启动子的表达系统中。先让宿主菌生长，lac I产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合抑制下游的外源基因转录。向培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代-b-D-半乳糖），解除抑制使外源基因大量表达。表达的蛋白可经SDS-PAGE或Western-blotting检测。3．器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50ml 微量离心管，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台，恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。4．试剂LB培养基（加抗菌素），100mg/ml IPTG，20%葡萄糖。5．实验准备无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），牙签（灭菌），摇菌管（灭菌），100mg/ml IPTG （过滤灭菌）（100ml分装，-20°C保存），100mg/ml氨苄青霉素（过滤灭菌）（100ml分装，-20°C保存），配制20%葡萄糖（8磅灭菌20分钟，添加至上述LB中，终浓度为0.2%）。6．操作步骤（1） 晚上9：00接种。在超净工作台中接种含有Pinpoint™xa-3-CHI重组载体的菌株，培养于两个三角烧瓶各20ml LB-葡萄糖培养基（含抗菌素Amp 120μg/ml）的摇菌管中，慢速70~90转/分钟30°C摇菌过夜。（2） 至第二天上午8：30 OD600约为0.5，加IPTG至 100μg/ml，150~170转/分钟37°C诱导1.5-3h。同时做不加IPTG诱导和非转化的空菌诱导的对照培养。（3） 4000rpm离心15min弃掉上清液，收获菌体，用SDS-PAGE电泳分析（表达蛋白分子量为30kDa）。菌体也可放在-20°C以下保存备用。（4） 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面。

远志系陕西道地药材，是“秦药”大宗道地药材品种之一[1]。《中国药典》2020年版所收载的远志为远志科（Polygalaceae）植物远志Polygala tenuifolia Willd.或卵叶远志P. sbirica L.的干燥根[2]，具有镇静安神、祛痰开窍、解毒消肿等功效[3]。现代研究表明，远志的主要活性成分有皂苷类、寡糖酯类、酮类等，具有抗记忆障碍、保护中枢神经系统、抗抑郁、抗心肌缺血和抗肿瘤等作用[4]。目前，关于远志的研究多集中于含量研究[5]、活性测定[6]、遗传多样性分析等[7]。随着分子生药学的发展，对药用植物相关活性成分生物合成途径相关调控基因、转录因子的挖掘已成为研究热点，基因组学、转录组学等技术在远志上的成功应用，也为远志基因家族的筛选、鉴定与分析提供了技术支撑和数据基础[8]。 碱性亮氨酸拉链（bZIP）基因家族作为真核生物中转录网络的重要开关，是植物中最大的转录因子家族之一。bZIP结构域由两个区域组成，即DNA结合基本区和亮氨酸拉链区[9]。bZIP基因家族成员通过差异基因网络或生物过程，在调节植物发育、生长以及盐胁迫响应等方面发挥着重要作用[10]。研究表明，拟南芥Arabidopsis thaliana L.、番茄Solanum lycopersicum L.、黄瓜Cucumis sativus L.、李子Prunus salicina L.和蓖麻Ricinus communisL.等多种植物中的bZIP参与调控组织分化、细胞生长、糖代谢、生物和非生物胁迫等多个生物学过程[11-12]。bZIP基因家族成员还参与多种药用植物次生代谢产物合成调控，如丹参Salvia miltiorrhiza Bunge.的SmbZIP1基因可抑制丹参酮的积累，大豆Glycine max (Linn.) Merr.的GmbZIP123基因则参与大豆种子脂质积累的调控[13]。同时，bZIP表达受外源激素和胁迫诱导，壳聚糖处理葡萄Vitis vinifera L.12 h下，其VvLysM8和VvLysM9基因表达量显著提高[14]，糜子Panicum miliaceum L.中的PmbZIP97不仅受到脱落酸（abscisic acid，ABA）、盐和干旱胁迫强烈诱导且参与调控萌发后的根系生长[15]。 本实验利用远志三代转录组数据，以bZIP基因家族为研究对象，对其基因家族进行成员鉴定和生物信息学分析，并确定其在远志中的结构特点与进化特征，进一步通过实时荧光定量分析其在不同组织、不同处理条件下的表达模式，为后续深入研究bZIP的生物学功能奠定基础，同时为bZIP家族可能参与远志次生代谢成分生物合成途径研究提供思路。 1 材料及仪器1.1 材料2021年10月于陕西中医药大学药用植物园（陕西咸阳）采集3年生远志Polygala tenuifolia Willd.及其成熟种子，经陕西中医药大学杨新杰副教授鉴定。选取5株三年生长势均匀的远志植株，将根、茎、叶等量混合后进行全长转录组测序分析。1.2 试剂及仪器ABA、壳聚糖（chitosan，CHT）均购自上海源叶生物科技有限公司，Trizol总RNA提取试剂盒、dd H2O均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，TB Green® Premix ExTaqTM Ⅱ （TliRNaseH Plus）、PrimeScriptTM Ⅱ 1st strand cDNA Synthesis Kit购自TaKaRa公司（日本），所用引物由武汉金开瑞生物公司合成。StepOnePlusTM Real-Time PCR（qPCR）仪（美国Applied Biosystems公司），NanoDropTM 2000分光光度计（美国Thermo-fisher公司），K5800自动检测超微量分光光度计（凯奥公司），?80 ℃超低温冰箱（中科美菱公司）。 2 方法2.1 样品的处理选择大小均一，颗粒饱满的远志种子，用自来水冲洗1 d，10%双氧水消毒，播种于装有泥炭土的花盆中，在光周期16/8 h，光照强度9 000 Lx条件培养[16]。选取长势均一的2月幼苗，喷200 μmol/L ABA、200 μmol/L CTS，干旱（10% PEG 6000）、盐（100 mmol/L NaCl）20 mL，以无菌水作为对照组；以0 h为空白对照，重复3次，6、12、24和48 h取样处理（3株），于?80 ℃冰箱储存，采用PacBio Seque Ⅲ进行上机测序，获得远志全长转录组学文库[17]。2.2 远志bZIP家族基因鉴定及理化性质分析基于远志转录组数据库，筛选出注释结果为bZIP的序列，将序列gene id对应的fasta结果输入editseq软件，进一步获得具有完整开放阅读框（open reading frame，ORF）的基因，通过NCBI中的BlastX进行比对与鉴定。Protparam分析目标蛋白的理化性质，ProtScale预测不同氨基酸中的蛋白亲疏水性[18]。2.3 远志bZIP家族基因二级结构、信号肽、跨膜结构及亚细胞定位分析用ExPASy分析基因编码蛋白质的结构域，CDD验证；ProtParam和SOPMA分析远志bZIP转录因子的二级结构；SignalP-5.0和TMHMM预测信号肽和跨膜区域；WoLF PSORT预测亚细胞定位[19]。2.4 远志bZIP家族基因进化树构建从Tair网站下载拟南芥蛋白序列，通过MEGA软件对远志、拟南芥bZIP氨基酸序列进行多序列比对，利用MEGA的最大自然法构建系统发育树，重复次数设置为1 000次[20]。2.5 远志bZIP家族基因密码子偏好性分析及蛋白互作预测分析采用CodonW、CUSP和Chips分析密码子偏好性。蛋白互作预测分析利用STRING进行，并以拟南芥筛选其同源基因后，通过Cytoscape 3.9.0软件作图。2.6 远志bZIP家族基因蛋白特征、保守基序分析及不同组织表达量热图通过chiplot分析bZIP蛋白的结构域，MEME获得bZIP蛋白的保守氨基酸基序，并用TBtools进行可视化，Weblogo分析蛋白序列位点。利用诺禾云平台将转录组数据库中27个PtbZIP基因在远志根、茎、叶3个部位的差异表达数据进行层级聚类分析。2.7 远志bZIP家族基因表达模式验证与分析Trizol法提取各样品总RNA，凝胶电泳检测后测定总RNA浓度。使用Prime Script TM II 1st strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，检测浓度后于?20 ℃保存备用。设计荧光定量引物，并送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（F：5’-ACAGCAACGTGCTTCTCACC-3’，R：5’-CCCTTCATCCACCACCGACTA-3’）为内参基因，验证PtbZIP26（F：5’-GCACTGATGG- GAAGGCTGAA-3’，R：5’-GATTGCCCAACAC- TTGAGGG-3’）、PtbZIP27（F：5’-GTCGGATGGT- AGTGAACGGG-3’，R：5’-CACCATTTCCCGAAC- CCTGA-3’）在不同部位样本中的表达量。选择表达量较高的PtbZIP26进行不同激素、胁迫处理下的表达量分析。qRT-PCR反应体系为TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（2×）5.0 μL；上下游引物各0.4 μL；50×ROX Reference Dye 0.2 μL，cDNA 1.0 μL；ddH2O 3.0 μL。PCR反应程序参照TB Green Premix Ex Taq Ⅱ试剂说明书进行，每个反应重复3次。基因相对表达量采用2?ΔΔCt法计算，SPSS 27.0统计分析。 3 结果与分析3.1 远志bZIP基因家族成员的鉴定和蛋白理化性质分析基于远志全长转录组数据库，共筛选得到63个注释为bZIP基因的序列ID，进一步分析后获得39个包含完整ORF的序列。整理ORF差异位点并合并重复，最终得到27个全长bZIP转录因子，编号PtbZIP1～PtbZIP27（表1）。该转录因子的氨基酸个数143～846，相对分子质量介于16 201.52～92 932.3，等电点4.59～9.69。除PtbZIP1和PtbZIP22的不稳定指数小于40，系稳定蛋白质外，其余PtbZIP均为不稳定蛋白。bZIP基因家族脂肪系数介于48.31～92.66，所有bZIP蛋白的平均亲水性数值是负值，为亲水性蛋白。图片3.2 远志bZIP基因家族成员的二级结构、信号肽、跨膜结构及亚细胞定位分析二级结构分析结果（表2）表明，远志bZIP家族蛋白均具有α螺旋、延伸链、β转角和无规卷曲，主要由α螺旋和无规卷曲构成，延伸链和β-折叠所占比例较小，散布于整个蛋白中。SignalP-5.0和TMHMM在线分析结果一致，所有远志bZIP蛋白信号肽分值都低于0.5，说明其均无信号肽，不属于分泌蛋白。跨膜结构域分析则显示，仅PtbZIP9和PtbZIP13有跨膜结构域。亚细胞定位结果表明，远志bZIP家族成员主要定位在细胞核。图片3.3 远志bZIP基因家族成员系统进化分析利用MEGA7.0构建远志与拟南芥bZIP转录因子家族系统进化树。结果表明，27个PtbZIP蛋白分为A、B、C、D、F、G、I、S 8个组，没有bZIP蛋白分到E和K组中。其中G是最大的1个亚组，含有PtbZIP家族成员共8个，占总数的29.63%；A、F、I和S组均含3个PtbZIP家族成员，B组含2个PtbZIP家族成员，C组含1个PtbZIP家族成员，D组含4个PtbZIP家族成员（图1）。图片3.4 远志bZIP基因家族成员蛋白结构域分析BRLZ、MFMR和DOG1为bZIP蛋白中的常见结构域，BRLZ参与调控果生炭疽菌的营养生长，MFMR涉及蛋白与蛋白之间的相互作用，DOG1则与种子休眠相关[21-22]。远志bZIP的结构域分析结果表明：10个蛋白存在BRLZ结构域，9个蛋白存在MFMR结构，6个蛋白存在DOG1结构域（图2）。PtbZIP3和PtbZIP13含有大小相近的CCDC 158 superfamily，PtbZIP26、PtbZIP21和PtbZIP5则均含有BRLZ、MFMR及homeobox结构，结合进化树结果可知PtbZIP3和PtbZIP13聚在一起，PtbZIP26、PtbZIP21和PtbZIP5三者亲缘关系较近。图片3.5 远志bZIP基因家族成员保守基序分析利用MEME对远志27个bZIP蛋白序列进行保守基序分析的结果显示，不同bZIP转录因子基因包含的保守元件数量及种类存在差异，其中bZIP14基因包含的保守元件数量最少（2个），bZIP18/25基因包含的保守元件数量最多（11个），说明bZIP成员具有功能冗余现象，也具有功能差异性（图3）。图片bZIP蛋白结合位点序列分析结果表明，bZIP转录因子的每个重复结构域约为65 aa，均含有1个保守的bZIP结构域，其中N端一般具有高度保守的N-X7-R蛋白基序和碱性亮氨酸区域（图4）。图片3.6 远志bZIP基因家族成员密码子偏好性分析密码子可用来推断基因组内部或基因组之间的进化关系，而不同种类或同一种类的基因对密码子使用有不同的偏好模式[23]。由bZIP基因家族中的27条核苷酸序列中密码子GC的总含量（GC）以及同义密码子第1位（GC1s）、第2位（GC2s）、第3位的（GC3s）的GC含量分析结果可知：27条PtbZIP基因序列的GC1s、GC2s和GC3s的均值分别为52.24%、44.90%和40.93%，不同位置的GC含量存在差异；它们的GC平均值为46.11%，小于50%，表明其更偏向于A或U结尾的密码子[24]（表3）。图片有效密码子（effective number of codon，ENC）反映了密码子偏离随机选择的结果，它是对同义密码子非均衡使用偏好程度的一个重要指标[25]，ENC数值一般在20～61范围内，当ENC＞35则表示密码子偏好性较弱。密码子适应指数（codon adaption index，CAI）是指编码该蛋白的所有密码子相对于这条基因都使用最优密码子的情况下的适应系数[24]。由表3可知，远志bZIP家族成员的ENC数值为43.088～57.195个，平均值为51.13个，密码子偏好性较弱。CBI值较低说明其外源基因在目的宿主中表达较弱。CAI值较低，则说明其适应性较弱。3.7 远志bZIP基因家族成员蛋白互作网络分析为深入了解远志bZIP蛋白的潜在功能和家族成员之间的相互作用，利用STRING软件，基于拟南芥数据库，对远志的27个bZIPs蛋白进行了互作网络分析。由图5可知，调控网络中共有27个节点（代表bZIPs蛋白），104条边（代表蛋白质之间的相互作用），表明远志的bZIPs蛋白存在多种互作现象，且26个bZIPs成员之间存在潜在的互作关系，为进一步验证远志bZIP的功能提供了重要依据。图片3.8 远志bZIP基因家族成员不同组织表达量热图和验证根据远志转录组数据，对27个PtbZIP基因在远志根、茎、叶中的FPKM差异表达数据进行了双向聚类分析。通过表达量热图分析可知，绝大部分基因的表达不恒定，在不同组织具有相对较高的表达量，根、茎和叶中表达量较高的基因数分别为23、2和2。PtbZIP4/15在叶中的表达量最高，茎和根次之；PtbZIP8/24在茎中的表达量最高，叶和根次之；剩下23个除PtbZIP1/17的表达量为根＞叶＞茎，其余表达模式为根＞茎＞叶（图6-A）。基于RT-qPCR验证转录组数据结果显示，PtbZIP26、PtbZIP27在根中的表达量最高，茎、叶次之，与转录组结果一致（图6-B）。图片3.9 PtbZIP26不同处理下的表达模式为了探究bZIP家族基因在远志不同处理条件下的表达模式，以PtbZIP26为代表，对其进行了激素和干旱、盐胁迫处理条件下的表达模式分析。结果发现，以0 h为空白对照（CK），PtbZIP26的表达量在ABA处理6 h内迅速上升，在24 h达到峰值；CTS处理分别持续上调至峰值为CK的5.3倍（24 h）后逐渐下调（图7-A）。PEG处理6 h迅速下降后又随着处理时间增加缓慢恢复上调，NaCl处理6 h后上调明显（图7-B）。 图片4 讨论bZIP基因家族在植物中广泛分布，参与植物的多个生长过程，如生长发育、应激反应以及次生代谢物的生物合成[26]。现阶段，bZIP基因家族已在多个物种有过相关的鉴定和研究，使得对bZIP的生物功能了解更透彻。本实验基于远志三代全长转录组数据库，找到39个bZIP isoforms，通过完整开放阅读框与BlastX分析找出具有完整ORF的基因，去除重复的isoforms，筛选并鉴定得到27个PtbZIP基因家族成员。理化性质分析显示，27个成员均为亲水性蛋白，且除PtbZIP1和PtbZIP22外均为不稳定蛋白；理论等电点小于7的蛋白有16个，属酸性蛋白，其余均为碱性蛋白。PtbZIP蛋白信号肽分值都低于0.5，说明其均无信号肽，信号肽是分泌蛋白的决定因子，推测PtbZIP蛋白不属于分泌蛋白。亚细胞定位结果显示，远志bZIP蛋白主要定位于细胞核，这与转录因子主要在细胞核中发挥作用一致。PtbZIP家族成员的蛋白二级结构也有明显的特点，主要有α-螺旋、无规卷曲。系统进化分析显示，27个PtbZIP蛋白分为A、B、C、D、F、G、I、S 8个组，其中含有8个PtbZIP家族成员的G亚组系最大亚组。PtbZIP11/18/25与拟南芥At1g32150.1、At2g35530.1高度同源，且包含的保守元件数量最多，推测PtbZIP11/18/25可能在远志干旱应答的分子机制中起重要作用[27]。研究表明，A类别的大多数功能信息提示在ABA或应激信号中的作用，PtbZIP6/12/16被分在A组，推测该基因可能参与到远志ABA信号转导途径[28]。S类别是拟南芥最大的bZIP类别之一，在胁迫处理后也被转录激活或在花的特定部分特异表达。研究证实，拟南芥bZIP家族中的S类别的基因在响应干旱有重要作用，本研究中共有3个PtbZIP基因被分到S类别下，其中PtbZIP15在叶中表达量高，PtbZIP24在茎中表达量高，可能参与调控远志对干旱的响应。同时，27个PtbZIP基因家族成员的蛋白二级结构预测结果十分相似，但序列间同源性相对较低，表明PtbZIP基因可能在远志生长发育方面发挥广泛的生物功能。表达模式分析发现，大部分PtbZIP在根中表达最高，qPCR结果验证与转录组数据一致，推测它们主要在远志地下部分发挥作用。植物中转录因子的表达与激素密切相关，研究发现葡萄VvLysM8和VvLysM9在壳聚糖处理12 h、脱落酸处理3 h时相对表达量最高[14]。马铃薯StHXK家族基因在ABA诱导下表达均显著上调，且在10%PEG胁迫处理下也呈不同程度的上调表达[29]。陆地棉GhKIN基因家族的鉴定和分析发现，干旱和盐胁迫处理后GhKIN14和GhKIN27表达出现下调，而GhKIN18等在一定时间点表现为表达上调[30]。本研究选择一个在根中高表达的PtbZIP26基因，通过不同激素、胁迫处理探讨了其是否受到相关激素和胁迫调控，结表明激素处理（ABA和CTS）远志幼苗后，PtbZIP26表达水平显著提高；同时，盐胁迫和干旱胁迫处理也可诱导PtbZIP26基因的表达发生改变且随胁迫时间的变化呈现出差异性，说明PtbZIP26可能通过不同信号通路参与远志应对逆境胁迫的表达，具体作用机制有待深入研究。本实验基于远志三代转录组数据，以远志bZIP基因家族为研究对象，对其家族成员进行鉴定和生物信息学预测分析，明确了相关结构特点与进化特征，进一步通过qPCR分析其在不同组织、不同处理下的表达模式，为探究PtbZIP参与生长发育、代谢过程及非生物胁迫的调控机制提供参考依据，为后期的基因功能研究奠定了基础。

[font=宋体]蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系，通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、宿主。表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同，适合表达蛋白的种类也不相同。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、载体。载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同，分为原核（细菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。通过载体介导，外源基因可以在宿主中表达。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、辅助成分。有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分。比如昆虫[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]杆状病毒表达体系中的杆状病毒。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]一、大肠杆菌表达系统[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是大肠杆菌表达系统，也是目前掌握最为成熟的表达系统。大肠杆菌表达系统以其细胞繁殖快速产量高、[/font][font=Calibri]IPTG[/font][font=宋体]诱导表达相对简便等优点成为生产重组蛋白的最常用的系统。目前最常用的大肠杆菌表达系统为[/font][font=Calibri]BL21-PET[/font][font=宋体]表达系统，此系统目前已经商业化，并且普遍应用于各大实验室和生物技术公司。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]对于表达不同的蛋白，需要采用不同的载体。目前已知的大肠杆菌的表达载体可分为非融合型表达载体和融合型表达载体两种。非融合表达是将外源基因插到表达载体强启动子和有效核糖体结合位点序列下游，以外源基因[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]的[/font][font=Calibri]AUG[/font][font=宋体]为起始翻译，表达产物在序列上与天然的目的蛋白一致。融合表达是将目的蛋白或多肽与另一个蛋白质或多肽片段的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]序列融合并在菌体内表达。融合型表达的载体包括分泌表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]优点：遗传背景清楚；繁殖快、成本低、抗污染能力强；表达量高、表达产物分离纯化相对简单、稳定性好；商品化的载体和菌株种类非常齐全、适用范围广等。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]缺点：[/font][font=宋体][font=宋体]① 没有真核转录后加工的功能，不能进行[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]的剪接，所以只能表达[/font][font=Calibri]cDNA[/font][font=宋体]而不能表达真核的基因组基因；[/font][/font][font=宋体]② 没有真核翻译后加工的功能，表达产生的蛋白质，不能进行糖基化、磷酸化等修饰，难以形成正确的二硫键配对和空间构像折叠，因而产生的蛋白质常没有足够的生物学活性；[/font][font=宋体][font=宋体]③ 表达的蛋白质经常是不溶的，会在细菌内聚集成包涵体，尤其当表达目的蛋白量超过细菌体总蛋白量[/font][font=Calibri]10%[/font][font=宋体]时，就很容易形成包涵体。生成包涵体的原因可能有是蛋白质合成快速太快，多肽链相互缠绕，缺乏使多肽链正确折叠的因素，导致疏水基因外露等。细菌裂解后，包涵体的离心后的沉淀中，虽然有利于目的蛋白的初步纯化，但无生物活性的不溶性蛋白，要经过复性，使其重新散开、重新折叠成具有天然蛋白构象和良好生物活性的蛋白质，常常是一件很困难的事情。也可以设计载体使大肠杆菌分泌表达出可溶性目的蛋白，但表达量往往不高。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]④ 可能会产生一些致热源[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]内毒素[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]，并且大肠杆菌本身含有内毒素和有毒蛋白，可能混杂在终产物里。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]二、酵母表达系统[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]酵母表达系统作为一种后起的外源蛋白表达系统，由于兼具原核以及真核表达系统的优点，正在基因工程领域中得到日益广泛的应用，应用此系统可高水平表达蛋白，且具有翻译后修饰功能，故被认可为一种表达大规模蛋白的强有力的工具。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]常用的酵母表达系统有酿酒酵母表达系统和甲醇营养型酵母表达系统。甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有汉森酵母属[/font][font=Calibri](Hansenula)[/font][font=宋体]，毕赤酵母属[/font][font=Calibri](Pichia)[/font][font=宋体]，球拟酵母属[/font][font=Calibri](Torulopsis)[/font][font=宋体]等，并以毕赤酵母属应用最多。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]优点[/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]生长方面：酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖快速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时有效降低了生产成本。毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏爱性，可进行细胞高密度培养，利于大规模工业化生产。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]安全性方面：酿酒酵母被认为是安全无毒的，有着数十年的大规模发酵研究基础。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]分子生物学操作方面：酿酒酵母在重组[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]中的广泛研究也是基于其己被人们掌握的大量分子生物学及生理学信息。外源基因一般和表达载体一起整合到了酵母染色体上，随染色体一起复制和遗传，不会发生外源基因的丢失现象。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]蛋白表达方面：可以进行蛋白的糖基化，而且还能分泌重组蛋白。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]5. [/font][font=宋体]蛋白分泌方面：由于毕赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白很少，因此纯化方便。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]缺点[/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]克隆基因的表达量低，发酵时间长，不正确的蛋白糖基化及抗细胞分裂。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]培养上清多糖浓度高，不利于纯化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]目前大肠杆菌蛋白表达系统是用最广泛，也是最经济实惠的蛋白表达系统。[/font][font=Calibri]E. coli[/font][font=宋体]具有遗传背景清楚、细胞增殖快、表达量高、稳定性好和抗污染能力强等特点，适用于多种属蛋白的表达，尤其对小分子蛋白的生产具有极大的优势，但也存在一些问题，如易形成包涵体和含有内毒素等。义翘神州提供从密码子优化到重组蛋白表达[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]纯化的一站式服务以及内毒素去除等附加服务，以满足不同的定制需求。我们拥有丰富的[/font][font=Calibri]E. coli [/font][font=宋体]可溶性蛋白表达[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]纯化及蛋白复性经验，拥有多种[/font][font=Calibri]E. coli[/font][font=宋体]细胞株和表达载体，可为客户提供优质的[url=https://cn.sinobiological.com/services/e-coli-protein-expression-service][b]原核蛋白表达服务[/b][/url]。更多关于[/font][font=宋体]大肠杆菌蛋白表达平台[/font][font=宋体]详情可以关注：[/font][/font][url=https://cn.sinobiological.com/services/platform/e-coli-protein-expression][u][font=宋体][color=#0000ff][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/platform/e-coli-protein-expression[/font][/color][/font][/u][/url][font=宋体] [/font]

[font=宋体][font=宋体]重组蛋白是利用[/font][font=Calibri]DNA(RNA)[/font][font=宋体]重组技术表达的蛋白重组。蛋白表达是将目的基因通过电转化或者热激等手段转入合适的宿主中，利用宿主的特定生理、生化和遗传特点进行目标蛋白大量表达及纯化的生物技术。目前，较为主流的表达宿主有大肠杆菌（[/font][font=Calibri]E.coli[/font][font=宋体]）、毕赤酵母（[/font][font=Calibri]P.pastoris[/font][font=宋体]）、昆虫[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]杆状病毒（[/font][font=Calibri]Bac-to-Bac[/font][font=宋体]系统）以及哺乳动物细胞系（[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]HEK293[/font][font=宋体]）等。鉴于目标蛋白的应用场景和自身理化性质的差异，选择合适的表达宿主尤为关键。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]大肠杆菌（[/font][font=Calibri]E.coli[/font][font=宋体]）：[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]表达系统：原核[/font][font=宋体]优势：经济、快速、高产量、应用广泛[/font][font=宋体]劣势：包涵体；无翻译后修饰；大分子蛋白表达困难[/font][font=宋体]推荐表达：细菌类蛋白；抗原类蛋白；细胞因子；酶类[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]酵母细胞：[/font][/b][font=宋体]表达系统：真核[/font][font=宋体]优势：经济、快速、高产量；部分翻译修饰[/font][font=宋体]劣势：非人源糖基化；高甘露糖修饰[/font][font=宋体]推荐表达：细胞因子；少分子量蛋白；酶类[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]杆状病毒[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]昆虫细胞：[/font][/font][/b][font=宋体]表达系统：真核[/font][font=宋体]优势：基因容量大；可溶蛋白；适合毒性蛋白；类似哺乳动物系统；翻译后修饰[/font][font=宋体]劣势：周期长；成本高；缺少部分糖基化[/font][font=宋体]推荐表达：细胞质蛋白；毒性蛋白；跨膜蛋白；分泌蛋白；激酶；[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]哺乳动物细胞[/font][font=宋体]表达[/font][font=宋体]：[/font][/b][font=宋体]表达系统：真核[/font][font=宋体]优势：可溶蛋白；更低内毒素；更好的活性；更好的翻译后修饰；可瞬时转染与稳定转染表达[/font][font=宋体]劣势：周期长；成本高；[/font][font=宋体]推荐表达：分泌蛋白；跨膜蛋白；重组抗体；抗体等[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州拥有原核细胞表达平台、哺乳动物瞬时表达平台、杆状病毒[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]昆虫蛋白表达平台，同时提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/e-coli-protein-expression-service][b]原核（[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/e-coli-protein-expression-service][b]E. coli[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/e-coli-protein-expression-service][b]）蛋白表达服务[/b][/url]……可实现重组蛋白和重组抗体的高通量和高产量表达，可为客户提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-antibody-production-service][b]重组表达服务[/b][/url]及一站式定制需求。详情可以关注 大肠杆菌蛋白表达平台：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/platform/e-coli-protein-expression[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font]

来自美国麻省理工学院怀海德研究所的研究人员报道，在当前许多各种不同的生物学研究中，用于产生和理解全局基因表达分析数据的常见假设能够导致关于基因活性和细胞行为方面严重缺陷性的结论。相关研究结果刊登在Cell期刊上。怀海德研究所研究员Richard Young说，“表达分析是当代生物学最经常用到的方法之一。因此，我们担心存在缺陷的假设可能影响对很多生物学研究的理解。”今天对基因表达数据的大多数理解都依赖于一种假设：用来分析的所有细胞拥有类似的mRNA总量，其中mRNA大约占细胞RNA中的10%，作为蛋白合成的蓝图发挥作用。然而，一些细胞，包括恶性癌细胞，要比其他细胞产生几倍多的mRNA。传统的全局基因表达分析通常忽略这些差别。Young实验室研究员和论文共同通讯作者Tony Lee说，“我们着重研究了基因表达分析的这种常见性的假设，它潜在影响了很多研究人员。我们提供一种具体的问题例子和一种研究人员能够执行的解决方法。”Young实验室的成员们最近在研究表达高水平c-Myc的癌细胞的基因表达时揭示出这种缺陷。已知c-My是一种基因调节物，在恶性癌细胞中高度表达。当比较表达高水平c-Myc的细胞和表达低水平c-Myc的细胞时，他们吃惊地发现不同的基因表达分析方法能够产生显著性的不同结果。进一步的研究揭示出在含有高水平c-Myc的和低水平c-Myc的细胞中存在显著性的不同，不过这些不同利用常见使用的实验方法和分析方法来掩盖掉。论文共同作者Jakob Lovén说，“我们从不同的基因表达分析方法中观察到的不同结果是令人震惊的，而且导致我们在几种平台上重新研究了这整个过程。我们然后意识到细胞含有类似mRNA水平的常见假设存在严重缺陷，能够导致严重性的误解，特别是对拥有非常不同RNA含量的癌细胞而言，尤其如此。”除了描绘出这种问题之外，研究人员也描述了一种补救方法。通过利用被称作RNA spike-in的人工合成mRNA作为标准对照，他们能够比较实验数据并且能够消除关于细胞RNA总量方面的假设。他们将这种补救方法应用到他们研究的所有三种基因表达分析平台。尽管研究人员相信使用RNA spike-in应当成为全局基因表达分析的新标准，但是理解很多之前的研究时产生的问题可能持续存在。(生物谷Bioon.com)http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/201210/2012102722451179.gifdoi: 10.1016/j.cell.2012.10.012PMC:PMID:Revisiting Global Gene Expression AnalysisJakob Lovén, David A. Orlando, Alla A. Sigova, Charles Y. Lin, Peter B. Rahl, Christopher B. Burge, David L. Levens, Tong Ihn Lee, Richard A. YoungGene expression analysis is a widely used and powerful method for investigating the transcriptional behavior of biological systems, for classifying cell states in disease, and for many other purposes. Recent studies indicate that common assumptions currently embedded in experimental and analytical practices can lead to misinterpretation of global gene expression data. We discuss these assumptions and describe solutions that should minimize erroneous interpretation of gene expression data from multiple analysis platforms.

美科学家发现“持家基因”并非协同表达 美国耶什华大学阿尔伯特·爱因斯坦医学院的研究人员近日意外发现一种特定基因的激活方式，该发现或将从根本上改变以往科学家对细胞同步协作方式的看法。研究结果在线发表在12月5日的Nature Structural & Molecular Biology 上。长期以来，科学家认为在蛋白复合物结构的形成中，基因的激活是通过一种高度协调的方式进行的。不同的基因各自负责编码一种蛋白，然后一同构成含有多种蛋白的蛋白复合物。“我们的这项发现很让人惊讶，”论文的通讯作者Robert Singer教授说，“那些促使核糖体以及其他蛋白复合物中蛋白质部分构成的基因，其表达过程完全不是协调进行的，实际上，这些基因各自之间没有任何联系，因此我们称这些基因为‘无痕’基因。”而这种“无痕”基因也被人们俗称为持家基因（housekeeping genes)。为了评估基因的协同表达，Singer与同事使用特定基因转录合成信使RNA分子，并对信使RNA分子进行了定量检测，发现与通过所有不相关基因转录合成的信使RNA分子一样，由持家基因转录合成的信使RNA分子也不具有协同性。通常情况下，基因会“保持沉默”，只有在特殊环境下才能被诱导激活，而持家基因由于使命特殊则必须24小时“待命”。研究人员通过实验还发现，其他被激活的基因协同性很好，而“无痕”持家基因则相反。“这项研究证明，对像持家基因这样的一类主要基因而言，细胞对其协同表达的需求比先前认为的要小得多，”论文第一作者Saumil Gandhi表示，“这些基因的活跃具有随意性，一个基因在编码的同时，你完全不知道同组的另一个基因在干嘛。而细胞以某种方式克服了这种随意性，使得蛋白复合物组装成功。”

[font=宋体]蛋白表达系统指宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系，通过这个体系可以实现外源基因顺利的实现在宿主中表达。[b]蛋白表达体系通常由以下几部分组成：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]宿主：用来表达的生物体，可以为细菌（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种宿主生物本身的特性多种多样，因此采用的表达体系也不相同[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]载体：载体的选择需要根据宿主而定，根据宿主不同，分为原核（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中还有外源基因片段，外源基因通过载体介导，可以在宿主中表达。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]辅助成分：有的表达系统中还包括了协助载体进入宿主的辅助成分，比如：昆虫[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]杆状病毒表达系统中的杆状病毒。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]重组蛋白表达的三个主要系统是细菌表达系统（例如乳酸乳球菌和大肠杆菌）、酵母和杆状病毒以及哺乳动物细胞介导的蛋白表达。[/font] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]应用：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]表达后的蛋白常应用于：[/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）作为抗原制备抗体；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）参与细胞实验与动物实验；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）测定蛋白酶活；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]）研究蛋白相互作用；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]）研究蛋白结晶结构；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]）免疫组化实验；[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]7[/font][font=宋体]）药物蛋白研究、生产等。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]影响蛋白表达的因素有：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1.[/font][font=宋体]蛋白本身的特性：蛋白分子量大小、蛋白来源[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]物种、是否为毒性蛋白，蛋白翻译后修饰程度、蛋白自身结构的复杂程度[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2.[/font][font=宋体]宿主的选择：宿主本身的特性、蛋白表达需求等都影响着蛋白表达[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3.[/font][font=宋体]蛋白需求量：蛋白应用范围对应的需求量不同，所以要根据需求量确定表达系统[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4.[/font][font=宋体]质粒载体的选择：载体是携带外源基因的工具，要根据系统选择合适的载体才能使蛋白更好的表达[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5.[/font][font=宋体]融合标签的选择：蛋白重组表达过程中采用亲和标签融合表达有两方面的作用：一方面是为了使蛋白纯化过程变得更加容易；另一方面是为了促进某些不溶性蛋白可溶[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6.[/font][font=宋体]蛋白表达系统的优化：重组蛋白的表达往往不像理论那样一帆风顺，在实际的表达过程中有可能产生各种各样的问题，因此表达系统的优化很重要。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]如何选择合适的表达系统[/font][/b][font=宋体]没有一个表达系统是完美的，要针对每个重组蛋白来评估哪种系统最有效。每个蛋白表达系统的生产速度、成本、糖基化和折叠等特性都各不相同，且跨度很大。如下图：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-production-systems][b]蛋白表达系统[/b][/url][/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-production-systems[/font][/font]

[font=宋体]在现代生命科学研究中，[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-production][b]重组蛋白表达技术[/b][/url]扮演着至关重要的角色。通过将外源基因导入宿主细胞，并使其表达特定蛋白，我们能够获取大量高纯度的重组蛋白，为疾病治疗、药物研发和生物工程等领域提供了强有力的支持。本文将介绍重组蛋白表达的原理、表达系统、生产步骤以及应用前景。[/font][font=宋体][b]一、重组蛋白表达的原理[/b][/font][font=宋体][font=宋体]重组蛋白表达是利用[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]重组技术，将目标基因（外源基因）导入宿主细胞中，并通过宿主细胞的生物机制使其表达出特定蛋白。其主要步骤包括：[/font][/font][font=宋体][font=宋体]基因克隆：将目标基因经过[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]扩增后，与表达载体连接，形成重组质粒。[/font][/font][font=宋体]转染或转化：将重组质粒导入宿主细胞中，可以使用化学方法、电穿孔或者嗜热菌等方式进行转染或转化。[/font][font=宋体]表达蛋白：重组质粒进入宿主细胞后，融合到宿主细胞的染色体中，随后遵循细胞的转录和翻译机制，表达出目标蛋白。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]二、常见的重组蛋白表达系统[/font][/b][font=宋体]大肠杆菌表达系统：大肠杆菌是常用的重组蛋白表达宿主细胞之一。其优点在于生长快速、易于培养，并且能够产生大量的蛋白。此外，大肠杆菌的遗传工具和代谢途径也被广泛研究，提供了便利。[/font][font=宋体]酵母表达系统：酵母表达系统包括酿酒酵母和毕赤酵母。这些酵母细胞具有真核细胞的特点，能够进行正确的蛋白折叠和修饰。同时，酵母细胞也可以进行大规模培养和高表达，适用于一些复杂蛋白的表达。[/font][font=宋体]昆虫细胞表达系统：昆虫细胞表达系统常用于大规模蛋白表达。昆虫细胞具有真核细胞的优势，能够对蛋白进行正确的折叠和修饰，适合于表达大量需求复杂结构的重组蛋白。[/font][font=宋体]哺乳动物细胞表达系统：哺乳动物细胞的表达系统可用于高效表达复杂蛋白和进行蛋白质研究。哺乳动物细胞具有真核细胞特点，能够进行正确的蛋白质修饰和折叠，并且在一些特殊情况下需要考虑到人类蛋白的免疫原性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]三、重组蛋白生产步骤[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]细胞中有两个蛋白生产阶段：转录和翻译，被称为分子生物学的中心法则。换言之，转录和翻译步骤属于重组蛋白表达步骤。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]为了生产重组蛋白，基因被分离并克隆到表达载体中。重组蛋白的生产需要蛋白表达系统、蛋白纯化系统和蛋白识别系统。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]获取重组蛋白的基本步骤：[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1.[/font][font=宋体]目标基因的扩增。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2.[/font][font=宋体]插入克隆载体。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3.[/font][font=宋体]亚克隆到表达载体中。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4.[/font][font=宋体]转化到蛋白表达宿主中[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]细菌[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]大肠杆菌[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]、酵母细胞、哺乳动物细胞或杆状病毒[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]昆虫细胞系统[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]5.[/font][font=宋体]重组蛋白鉴定试验[/font][font=Calibri](Western blot[/font][font=宋体]或荧光[/font][font=Calibri])[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]6.[/font][font=宋体]大规模生产。[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]大规模发酵[/font][font=Calibri])[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]7.[/font][font=宋体]分离和纯化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]需要考虑多种因素：[/font][font=宋体][font=Calibri]1.[/font][font=宋体]选择哪个宿主系统？[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2.[/font][font=宋体]如何分离和纯化重组蛋白？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]选择适当的表达宿主或使用正确的纯化方法并不容易，应考虑目标重组蛋白的性质。下面列出了一些重要因素：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]? 膜结合[/font][font=宋体]? 溶解度[/font][font=宋体]? 单或多结构域[/font][font=宋体][font=宋体]? 大小[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]分子量[/font][font=Calibri])[/font][/font][font=宋体]? 表达位置[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]对于大多数没有足够经验来表达和分离重组蛋白的人来说，重组蛋白的生产是非常耗时的。许多生物公司为各种不同规模的重组蛋白表达提供良好的服务：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service[/font][font=宋体]，例如义翘神州[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]四、重组蛋白表达技术的应用前景[/b][/font][font=宋体]药物研发：重组蛋白表达技术被广泛应用于药物研发领域，用于生产重组蛋白药物。这些药物包括多肽类、蛋白类和抗体类药物，如生长因子、抗体药物和血液制剂等。通过重组蛋白表达技术，我们可以获得高效纯度的药物，满足临床上的需求。[/font][font=宋体]生物工程：重组蛋白表达技术被广泛应用于生物工程领域，用于生产特定的蛋白产品。这些产品可以应用于食品、化妆品、工业发酵等领域，如酶制剂、生物染料和生物材料等。[/font][font=宋体]疾病治疗：通过重组蛋白表达技术，我们能够合成特定的蛋白，用于疾病的治疗和诊断。例如，利用重组抗体技术，可以开发出用于癌症治疗和免疫治疗的抗体药物。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-production[/font][/font]

METHODS 25, 402–408 (2001)Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2－△△CT MethodKenneth J. Livak* and Thomas D. Schmittgen¶,1*Applied Biosystems, Foster City, California 94404; and ¶ Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,Washington State University, Pullman, Washington 99164-6534原文下载摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法则是比较经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2－△△CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导，假设及其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种2－△△CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量 实时PCR Taqman反转录 PCR （RT-PCR ）是基因表达定量非常有用的一种方法（1 - 3 ）。实时PCR 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术（4 ,5 ）。实时定量 PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法则是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进行绝对定量已有多篇报道（6 - 9 ），包括已发表的两篇研究论文（10,11 ）。在有些情况下，并不需要对转录本进行绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从1000 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。用实时PCR 对基因表达进行相对定量分析需要特殊的公式、假设以及对这些假设的验证。2－△△CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2－△△CT公式的推导，以及实验设计，有效性评估在Applied Biosystems User Bulletin No.2（P/N4303859）中有介绍。用2－△△CT方法分析基因表达数据在文献中也有报道（5,6）。本文介绍了该方法的推导、假设以及应用。另外，本文还介绍了2－△△CT两种衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR 数据分析中都可能被用到。1. 2－△△CT方法1.1. 2－△△CT方法的推导PCR 指数扩增的公式是：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054042.jpg这里，Xn 是第 n 个循环後目标分子数，X0 是初始目标分子数，Ex 是目标分子扩增效率，n 是循环数，C T 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。因此：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054008.jpgX T 是目标分子达到设定的阈值时的分子数。C T,X 是目标分子扩增达到阈值时的循环数。Kx 是一个常数。对于内参反应而言，也有同样的公式：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054009.jpg用XT 除以RT 得到：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054010.jpg对于使用 Taqman 探针的实时扩增而言， XT 和 RT 的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。因此常数K 并不一定等于1 。假设目标序列与内参序列扩增效率相同：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054011.jpg http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054018.jpg或：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054019.jpgXN 代表经过均一化处理过的初始目标分子量；△CT表示目标基因和内标基因CT值的差异（CT,X－CT,R ）整理上式得：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054020.jpg最后用任一样本q 的XN 除以参照因子（calibrator, cb）的XN得到：http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054021.jpg在这里http://www.biomart.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054023.jpg对于一个少于150bp 的扩增片断而言，如果 Mg2+ 浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于1 。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是http://tong.dxy.cn/upload/asset/2008/11/10/1226054022.jpg

我们实验室主要是做microRNA的，所以必须提取RNA检测基因表达水平的改变。这里我就说说几点我自己的个人感受：一、关于组织标本的收集：听隔壁实验室说他们提取的RNA经常降解，他们认为主要原因就是标本的收集过程不够严格（由于客观原因，他们往往都是在标本离体一个多小时后才能收集到标本，对此他们也很无奈）。我们实验室每周都会派一名研究生去手术室收集标本。我们的要求是在组织离体30分钟内就放入液氮中，然后回实验室-80°长期保存。由于标本量大，我们基本上都会选择近半个月收集的标本来提取RNA,所以貌似到目前为止还没有出现过RNA降解的情况。二、关于RNA酶的失活：网上看过很多别人的经验，大多数意见是：RNA酶是导致RNA降解的罪魁祸首。我个人认为到不必如此，因为一个酶要发挥作用需要特定的温度和一定的时间。现在用试剂盒提取RNA也就半小时左右，而且还是冰上操作，因此还没有等RNA酶来得及发挥作用就全部操作完成了。但是对于预防RNA酶还是需要的。最开始我们选择用DEPC水来浸泡枪头和EP管，这确实是吃力不讨好的工作：DEPC对人体有毒而且易挥发；DEPC比较难于溶于水需要加温搅拌过夜才能完全溶解；DEPC如果不去除干净（主要是通过高压灭菌失活）会影响提取的RNA的质量。所以后来我们基本上抛弃这种方法了。现在我们采用的方法是：用XYGEN盒装的枪头（外面带包装好的塑料薄膜）和袋装的EP管，使用之前灭菌一遍即可。若暂时没有盒装的枪头，我们就用蛋白酶K溶液浸泡枪头和EP管15分钟，然后高压灭菌。个人觉得效果都很好。三、关于RNA提取的操作：组织的匀浆比较重要。貌似现在还是有不少实验室采用匀浆器研磨组织。我也试过，很累而且效果一般。我们现在用的是MP的匀浆仪，自动匀浆45秒钟即可，若觉得一次匀浆不够充分可以在冰上放置2分钟后再次匀浆45秒，匀浆效果非常好，但是费用比较贵：一个带有陶珠的匀浆管大约需要45RMB（一个管只能匀浆一个标本而且是一次性的）。后续的提取我们都是采用试剂盒的，方便且快捷。国产试剂盒50次的大约400多元。四、关于RT-PCR：其余不说，单独谈谈内参的选择。我们主要是做荧光定量PCR，RT做的不多。由于要通过内参来比较不同组织中某个基因的表达是否改变，所以我认为内参的选择相当关键。绝大多数文章都用GAPDH或者β-actin来做内参，但是不知道大家思考过没有：他们为什么这么选择，依据是什么，别人选择的内参是否也适合你自己的实验呢？答案是否。举一个我自己的例子。我是研究肾癌的，刚开始我选择用GAPDH作内参，得出的结果和且他文章上的不一致。当时我比较困惑：莫非别人都错了，就我是对的？（呵呵，自己都知道是不可能滴）后来经过查阅文献发现有人明确指出GAPDH不适合在肾组织中用作内参（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17559644?dopt=Citation）。换了一个文献中推荐的内参后，实验结果终于和别人一致了。其实随着实验经验的增长，RNA水平的操作相对于蛋白水平的操作（western-blot、免疫组化）要简单一些。我相信只要大家能多实践、多交流（尤其是上论坛看看别人的经验），做出漂亮的实验只是时间问题而已！附一张我们实验室MP匀浆仪的图片，推荐如果经费充足可以采购试试。 0 http://img.dxycdn.com/upload/2010/08/04/36174374.snap.jpg

一个国际研究小组利用来自两名男性捐献的全部大脑和来自第三名男性的单个脑半球构建出高分辨率的人类大脑三维基因表达图谱。相关研究结果于2012年9月19日在线刊登在《自然》期刊上。在美国西雅图市艾伦脑科学研究所(Allen Institute for Brain Science)研究员Michael Hawrylycz的领导下，研究人员将来自大约900个精确切割的大脑切片的转录数据---利用基因芯片技术收集到的---组装在一起，然后将转录数据与在切片之前对捐献的大脑的核磁共振成像扫描结果进行叠加，从而构建出人大脑三维基因表达图谱。这些图谱是免费向公众提供的，详情可参见网址：http://www.brain-map.org/，而且能够有助于科学家们测试关于大脑功能、疾病和进化方面的假设。艾伦脑科学研究所神经科学家Ed Lein说，“这些数据本身并不提供理解大脑如何工作方面的所有答案。然而，我们希望它们促进人类大脑研究以便理解大脑的复杂化学性质和细胞组成。”比如，研究特定疾病的科学家们能够利用成像技术，如功能性核磁共振成像，来评估相关的大脑区域，然后查询这些新的图谱来鉴定在这些区域表达的基因，而这可以通过一种简单的颜色编码的手册来显示基因表达的相对水平来实现。当前，研究人员还是依赖于对小鼠大脑的零碎研究。

我是做生物实验室仪器销售的，正在做各个实验室构建的方案，附件里面是基因表达平台的构建方案。里面分了基因表达的各个步骤，每个步骤所用的不同方法，每种方法所需要的仪器，每种仪器国内及国外的品牌，当然品牌是我比较熟悉的一些。希望相关人士能够提供一些建议，包括缺少的步骤，其他的方法，方法还需要的仪器，还有您觉得用的比较好的仪器的品牌，或者对附件中某些品牌评价，这些对我都有很大的帮助。欢迎批评指正。

[font=宋体]无细胞表达系统是一种在生物制药和基因疗法领域广泛应用的生物技术。尽管它带来了许多优势，如高表达水平和翻译后修饰，但无细胞表达系统也存在一些常见问题和挑战。本文将详细解答这些问题，并提供相应的解决方案。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q1:[/font][font=宋体]无细胞合成（[/font][font=Calibri]CFPS[/font][font=宋体]）体系相对于细胞体系有哪些优势？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]A1: [/font][font=宋体]无细胞表达系统的优势主要体现在：[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 可自动化操作简便、快捷——成本低（无需培养细胞和细菌相关的场地设施）、表达时间短（[/font][font=Calibri]3h[/font][font=宋体]）、单位表达量高。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 蛋白表达工程化（[/font][font=Calibri]Cell-free protein engineering[/font][font=宋体]）——无细胞合成系统作为一个开放式的系统，可以向体系中自由添加所需的成分以调控蛋白的正确合成。例如可以向系统中加入[/font][font=Calibri]Fe2+[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Mn2+[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]Cu2+[/font][font=宋体]等金属离子促进含有对应离子蛋白的正确合成；可以有效表达抗菌肽等毒性蛋白并实现规模化目的蛋白的生产。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]? 适合原型研究（[/font][font=Calibri]cell-free prototyping[/font][font=宋体]），整体原料均为外加，活性物质之间发生的化学酶促反应使整个过程相对可控。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q2:[/font][font=宋体]真核来源的蛋白是否必须用真核表达系统？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]A2:[/font][font=宋体]并非如此，真核来源的蛋白除了传统的哺乳动物表达系统，还可以利用无细胞蛋白合成。无细胞系统是一套酶促级联反应，可以添加很多其他组分甚至是真核来源的提取物来实现真核蛋白的表达。如果某些目标蛋白（比如抗体功能性片段[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]VHH[/font][font=宋体]）的功能不依赖翻译后修饰，在这种情况下，不管是无细胞系统还是[/font][font=Calibri]HEK293[/font][font=宋体]系统，两者表达的活性无明显差异。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q3:[/font][font=宋体]无细胞合成系统是否适用于高通量，表达量如何？少量蛋白的检测是否也适用？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]A3:[/font][font=宋体]无细胞表达系统非常适合高通量表达，其产量最高可到 [/font][font=Calibri]mg/mL [/font][font=宋体]级别，抗体和抗体功能性片段是 [/font][font=Calibri]100 [/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g/mL [/font][font=宋体]级别。对于少量蛋白的检测需要建立相应的检测方法，如您想进一步了解，我们可以协助进行方法学的设计。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q4:[/font][font=宋体]对于原核体系难以表达的真核来源蛋白，无细胞表达体系有什么优势吗？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]A4:[/font][font=宋体]因为其开放式系统可以添加很多其他组分甚至是真核来源的提取物来实现真核蛋白的正确合成。例如我们聚焦的[/font][font=Calibri]VHH[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]VHH-Fc[/font][font=宋体]等都可以实现无细胞系统中上清表达，但是这些蛋白在原核表达中往往以错误的形式存在。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q5: [/font][font=宋体]我在无细胞表达系统中进行表达，但蛋白总是以低表达水平出现，如何解决？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]A5: [/font][font=宋体]低表达可能是由于反应条件不当或蛋白的折叠不完整。您可以尝试优化反应条件，如调整温度、[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值和反应时间，以提高蛋白的表达水平。同时，添加适当的蛋白辅助因子或分子伴侣，有助于促进蛋白的正确折叠和表达。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q6: [/font][font=宋体]以不溶性形式表达，该怎么解决？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]A6: [/font][font=宋体]蛋白不溶性表达可能是由于蛋白的折叠不正确或缺乏正确的蛋白折叠因子。您可以尝试添加蛋白折叠辅助因子，如小麦胚芽提取物，有助于促进蛋白的正确折叠和溶解性。此外，优化反应条件和表达条件，如调整温度和反应时间，也可能有助于提高蛋白的溶解性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q7: [/font][font=宋体]形成夹杂物，导致纯化困难，有什么解决办法？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]A7: [/font][font=宋体]夹杂物的产生可能是由于蛋白的折叠不正确或反应条件不适合。您可以尝试添加蛋白辅助因子或分子伴侣，如[/font][font=Calibri]chaperonin[/font][font=宋体]，来帮助蛋白的正确折叠和防止夹杂物的形成。同时，优化反应条件和表达条件，如调整温度和反应时间，也可能有助于减少夹杂物的产生。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q8: [/font][font=宋体]出现部分降解，如何解决？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]A8: [/font][font=宋体]蛋白降解可能是由于蛋白的不稳定性或存在蛋白酶的活性。您可以尝试添加蛋白酶抑制剂，如苯甲酸，来减少蛋白的降解。同时，优化反应条件和表达条件，如调整温度和反应时间，也可能有助于提高蛋白的稳定性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q9: [/font][font=宋体]出现异常修饰，如何解决这个问题？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]A9: [/font][font=宋体]蛋白异常修饰可能是由于无细胞表达系统中存在的特定修饰酶。您可以尝试选择不同的表达系统或添加特定的修饰酶抑制剂，来减少蛋白的异常修饰。同时，优化反应条件和表达条件，如调整温度和反应时间，也可能有助于减少蛋白的异常修饰。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]Q10: [/font][font=宋体]形成聚集体，导致纯化困难，如何解决？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]A10: [/font][font=宋体]蛋白聚集体的形成可能是由于蛋白的折叠不正确或反应条件不合适。您可以尝试添加蛋白折叠辅助因子或分子伴侣，如小麦胚芽提取物，有助于促进蛋白的正确折叠和防止聚集体的形成。同时，优化反应条件和表达条件，如调整温度和反应时间，也可能有助于减少聚集体的产生。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]A10: [/font][font=宋体]高背景信号可能是由于蛋白的非特异性结合或存在夹杂物。您可以尝试优化反应条件和表达条件，如调整温度和反应时间，来减少非特异性结合。同时，使用适当的纯化方法，如亲和层析或凝胶过滤，可以帮助减少背景信号。另外，您还可以使用合适的对照实验来验证蛋白的特异性结合，以确保蛋白表达的准确性和可靠性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州自主研发的[url=https://cn.sinobiological.com/services/cell-free-protein-synthesis-service][b]无细胞表达系统[/b][/url]，经过充分验证，可为您提供优质的[/font][font=Calibri]VHH[/font][font=宋体]及[/font][font=Calibri]scFv[/font][font=宋体]快速表达服务，加速您的研发进程。有需求可以来义翘神州网咨询详情[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/cell-free-protein-synthesis-service[/font][/font]

区别呢 原核表达载体 在原核生物表达 ，真核的在真核表达 很像废话 呵呵呵呵。。。。 就是 原核载体可以将真核基因表达，但是表达出来的蛋白是没有活性的，因为缺少翻译后修饰系统。。。真核的表达载体呢 由于比较大 不适合大量快速扩增，所以要在其载体上构建可以在原核生物 如大肠杆菌中复制的所需的复制原件 。。。。综上 在应用的时候 要构建 穿梭质粒 可以穿梭于 原核和 真核 呵呵 还有就是 原核表达载体的基本元件和真核的有不同的地方 。。。。。总觉得不够正确答案 。。。。。有些人缘的蛋白在原核里没有蛋白翻译后修饰，表达后没有活性，这时候就得在真核里表达了原核表达做抗体，真核表达做功能研究。（1）原核载体，将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。 你可以就其在蛋白纯化等方面的作用进一步进行说明。（2）真核载体，要表达真核生物的蛋白质，采用真核表达系统自然应比原核系统优越，常用的酵母、昆虫、动物和哺乳类细胞等表达系统。真核表达载体的应用比较广，通过真核表达，可以研究某一基因的功能，比如把载有目标基因的载体导入到特定的哺乳动物细胞中以后，如果该基因发挥着某种功能，则可以通过其引起细胞的变化来说明问题等等。你可以搜索一下，这方面还是很多的。

一、原理1、E .coli 表达系统E .coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E .coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。二、材料1、诱导表达材料(1 )LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏 (Yeast extract)5g 蛋白胨 (Peptone)10gNaCl10g 琼脂 (Agar)1-2%蒸馏水 (Distilled water)1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌(2 )IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 ml 蒸馏水中，0 .22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 ml /份，－20 ℃ 保存。(3 )l× 凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI (pH 6 .8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 % 溴酚蓝10 % 甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI (pH 8 .0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。（3）10 mg / ml 溶菌酶。（4）脱氧胆酸。（5）1 mg / ml DNase I。2 ）超声破碎法(1 )TE 缓冲液。(2 )2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI (pH 8 .0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 % 溴酚蓝20 % 甘油

我是做生物实验室仪器销售的，正在做各个实验室构建的方案，附件里面是基因表达平台的构建方案。里面分了基因表达的各个步骤，每个步骤所用的不同方法，每种方法所需要的仪器，每种仪器国内及国外的品牌，当然品牌是我比较熟悉的一些。希望相关的认识能够提供一些建议，包括缺少的步骤，其他的方法，方法还需要的仪器，还有您觉得用的比较好的仪器的品牌，或者对附件中某些品牌评价，这些对我都有很大的帮助。欢迎批评指正。

[b][font=宋体]前言[/font][/b][font=宋体]杆状病毒载体表达系统（[/font][font=Calibri]Baculovirus [/font][font=宋体][font=Calibri]e[/font][/font][font=Calibri]xpression [/font][font=宋体][font=Calibri]vector system, BEVS[/font][font=宋体]）自[/font][font=Calibri]1983[/font][font=宋体]年问世以来，已广泛应用于疫苗生产、基因治疗等领域。目前已有多种[/font][font=Calibri]BEVS[/font][font=宋体]衍生产品获批使用，如[/font][font=Calibri]HPV[/font][font=宋体]疫苗、流感疫苗和几款兽用疫苗等。[/font][font=Calibri]BEVS[/font][font=宋体]具有安全性高、操作简单、可以无血清培养等优点，但同时也面临表达不稳定和蛋白质糖基化水平低等挑战。本文总结了[/font][font=Calibri]BEVS[/font][font=宋体]的优势和局限性。[/font][/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]杆状病毒载体表达系统的优势[/font][font=Calibri] [/font][/b][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、安全性高：杆状病毒仅感染昆虫细胞，不感染其他脊椎动物，对人类健康没有不良影响。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、高效的蛋白质表达：[/font][font=Calibri]BEVS[/font][font=宋体]能够表达复杂或难以表达的蛋白质，例如各种酶类、寄生虫蛋白、糖蛋白等，并且能进行正确的蛋白质折叠和翻译后修饰。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、易于大规模生产：昆虫细胞可以在无血清的培养基中生长，并且易于扩大生产规模。此外，[/font][font=Calibri]BEVS[/font][font=宋体]不需要处理活病毒或潜在危险的病原体，降低了生产成本。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、应用广泛：广泛用于功能、晶体学和药物发现研究。[/font][/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]杆状病毒载体表达系统的局限性：[/font][/b][font=Calibri] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、表达不稳定：由于病毒的细胞毒性作用导致宿主细胞裂解，这可能影响最终的产物产量和蛋白质的稳定性。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、糖基化水平较低：昆虫细胞所产生的异源蛋白质的[/font][font=Calibri]N-[/font][font=宋体]糖基化图谱与哺乳动物细胞产生的不同，这可能影响蛋白质的稳定性、生物活性或免疫原性。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、潜在的免疫反应：[/font][font=Calibri]BEVS[/font][font=宋体]诱导的免疫反应可能产生炎症细胞因子和趋化因子，并激活补体途径，这也可能对蛋白质表达产生负面影响。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、基因组不稳定性：杆状病毒基因组可能存在不稳定性，影响长期表达和生产稳定性。[/font][/font][font=Calibri] [/font][font=宋体][font=宋体]尽管存在一些挑战，但[/font][font=Calibri]BEVS[/font][font=宋体]平台近年来已经得到了显著改进，包括病毒载体的优化、病毒基因组的修饰和宿主细胞的广泛应用，这些分子进步有助于增强[/font][font=Calibri]BEVS[/font][font=宋体]平台的多样性和应用潜力。[/font][/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]义翘神州提供[/font][url=https://www.sinobiological.com/services/baculovirus-insect-protein-expression-service][u][font=宋体][color=#0026e5][font=宋体]杆状病毒[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]昆虫蛋白表达的一站式服务[/font][/color][/font][/u][/url][font=宋体][font=宋体]。凭借优化的表达载体和更高滴度的病毒包装技术，义翘神州在杆状病毒[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]昆虫细胞蛋白表达方面具有丰富的经验，特别是针对序列较长的蛋白、病毒类蛋白、激酶、胞内蛋白以及膜蛋白等。[/font][/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]参考文献：[/font][font=Calibri]Hong M, Li T, Xue W, et al. Genetic engineering of baculovirus-insect cell system to improve protein production. Front Bioeng Biotechnol. 2022 10:994743. Published 2022 Sep 20. doi:10.3389/fbioe.2022.994743[/font][font=Calibri] [/font]

基因芯片技术对于疾病耐药性检测可从两个方面加以实现：1.在肿瘤中，通过检测肿瘤耐药基因的表达变化来分析对药物的抗性；2.在感染性疾病中，病原体的耐药性检测可通两种方式：表达谱芯片检测药物诱导的表达改变来分析其耐药性；寡核苷酸芯片检测基因组序列的亚型或突变位点从而分析其耐药性。一、多药耐药基因的表达检测肿瘤治疗中对细胞毒素药物的抗性是引起治疗失败的重要原因，是限制化疗的重要因素。机制是复杂的，由肿瘤的综合特征决定，如存活细胞的比例、血液的供给是否充分、特殊的细胞机制及多药耐药表型，多药耐药是指当肿瘤细胞暴露在某一化学治疗药物后会产生对此药及其他结构上没有联系的药物的交叉抗性，可由不同的机制引起，如MDR1、MRP、LRP等基因的过度表达，拓扑异构酶II和谷胱甘肽代谢的改变等，另外，其他促进DNA修复和抑制细胞凋亡的基因表达改变也可能导致多药耐药。检测多药耐药基因表达的变化不但可以研究恶性肿瘤的不同耐药机制，还可以用于临床诊断，以指导制定治疗方案。目前已建立了几种多药耐药检测方法，在RNA水平上有：Northern blot、Slot blot、RT-PCR、Rnase protection assay和原位杂交，从蛋白水平上的检测方法有免疫组化、Western blot及流式细胞仪等。这些方法一次只能对一个基因进行研究，效率低，难以定量检测耐药基因表达增加的幅度。基因表达谱芯片可同时对成千上万的基因表达进行检测，可以大大加速这方面的研究，在设计芯片时，可以将已知肿瘤相关基因及标记基因都点到芯片上，同时，芯片上还包含目前所有报导过的耐药基因。这样可以同时得到肿瘤的各个方面的信息。另外基因芯片还可以帮助发现新的耐药基因。二、病原体耐药性检测细菌对三种以上不同类抗菌药物耐药者即可称为多重耐药菌（multi-drug resistant bacteria, MDR）。MDR感染在全球的状况十分严重，对婴幼儿、免疫缺陷者和老年人的威胁巨大，1992年美国疾病控制中心（CDC）的资料表明，有13300例住院患者，是因为对所使用的抗菌药物耐药，细菌感染得不到控制而死亡。MDR感染已成为治疗上的难点和研究上的热点。MDR大多为条件致病菌，革兰阴性杆菌（GNR）占较大比例，如肠杆菌科中的肺炎杆菌、大肠杆菌、阴沟杆菌、粘质沙雷菌、枸橼酸菌属、志贺菌属、沙门菌属等，以及绿脓杆菌、不动杆菌属、流感杆菌等。革兰阳性菌中有甲氧西林耐药葡萄球菌（MRS），尤以MRSA和MRSE为多；万古霉素耐药肠球菌（VRE），近年来在重症监护室（ICU）中的发病率有明显增高；青霉素耐药肺炎链球菌（PRSP），常引起肺炎、脑膜炎、菌血症和中耳炎，人结核分支菌等。此外尚有淋球菌、脑膜炎球菌、霍乱弧菌等。耐药性又称抗药性，一般是指病原体的药物反应性降低的一种状态。这是由于长期应用抗菌药，病原体通过产生使药物失活的酶、改变原有代谢过程，而产生的一种使药物效果降低的反应，因而作用的剂量要不断增加。细菌对抗菌药物的耐药机制可有多种，最重要者为灭活酶的产生，如β-内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶等；其次为靶位改变如青霉素结合蛋白（PBPs）的改变等；其他尚有胞膜通透性改变，影响药物的进入；细菌泵出系统增多、增强，以排出已进入细菌内的药物；以及胞膜主动转运减少、建立新代谢途径、增加拮抗药物等，两种以上的机制常可同时启动。耐药菌及MDR的发生和发展是抗菌药物广泛应用，特别是无指征滥用的后果。找到耐药菌的耐药基因，从而根据这些耐药基因设计新型抗生素，或将耐药菌分成不同的亚型，针对不同的亚型在临床上使用相应的抗生素，达到改善治疗效果的目的。国外采用基因芯片技术，检测耐药菌基因的改变，即检测耐药基因。如Michael Wilson就曾使用此方法检测到肺结核杆菌中脂肪酸合成酶II、fbpC、efpA、fadE23、fadE24和ahpC基因发生改变与耐药性有关。提供了新药物作用的靶目标，并指导抑制这些靶目标试剂和药物的合成。在感染性疾病中，病原体的耐药性检测可通过两种方式：1.表达谱芯片检测药物诱导的基因表达改变来分析其耐药性；2.寡核苷酸芯片检测基因组序列的亚型或突变位点从而分析其耐药性。用基因芯片不仅可以同时检测耐药菌的多个耐药基因，还可以同时对多个耐药菌的多个耐药基因进行检测。对临床上用药和新药物的合成均具有指导作用。

[font=宋体][font=Calibri]E. coli[/font][font=宋体]具有遗传背景清楚、细胞增殖快、表达量高、稳定性好和抗污染能力强等特点，适用于多种属蛋白的表达，尤其对小分子蛋白的生产具有极大的优势，但也存在一些问题，如易形成包涵体和含有内毒素等。义翘神州提供从密码子优化到重组蛋白表达[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]纯化的一站式服务以及内毒素去除等附加服务，以满足不同的定制需求。我们拥有丰富的[/font][font=Calibri]E. coli [/font][font=宋体]可溶性蛋白表达[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]纯化及蛋白复性经验，拥有多种[/font][font=Calibri]E. coli[/font][font=宋体]细胞株和表达载体，可为客户提供优质的[url=https://cn.sinobiological.com/services/e-coli-protein-expression-service][b]原核蛋白表达服务[/b][/url]。下面是在原核蛋白表达实验中常遇见的几大问题，为大家一一讲解：详情关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/e-coli-protein-expression-service[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、我不知道我的蛋白它有什么特性及其结构？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]首先，你要确定一件事，那就是这几个蛋白质有人研究过没有？还是最新发现的蛋白质？如果没有人研究过，那就得用先测部分氨基酸，然后设计引物克隆了。如果有人研究过，那就好了可以根据软件来预测。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]如有[/font][font=Calibri]swiss[/font][font=宋体]—[/font][font=Calibri]pdb[/font][font=宋体]软件，但这个是要有氨基酸序列，知道基因序列，可以在[/font][font=Calibri]ncbi[/font][font=宋体]上进行[/font][font=Calibri]blastx[/font][font=宋体]，得到蛋白。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、如何选择蛋白表达宿主菌？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]原核系统和真核细胞偏爱的密码子有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]原核表达现象：[/font][font=宋体]一、蛋白不表达[/font][font=宋体]①蛋白为毒蛋白[/font][font=宋体]②序列含有稀有密码子[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二、蛋白表达不理想[/font][font=宋体]①蛋白明显降解[/font][font=宋体]②蛋白表达为包涵体[/font][font=宋体]③二硫键错误折叠[/font][font=宋体]④过高的本底表达[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、质粒测序正确，蛋白无法表达怎么办？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①分析一下稀有密码子，如果比较多，可以尝试[/font][font=Calibri]rosetta[/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]DE3[/font][font=宋体]）；[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②可能是基因本身的问题。[/font][font=Calibri]RNA3[/font][font=宋体]’的特殊结构可能导致转录出现问题，这种情况可以尝试融合表达，譬如[/font][font=Calibri]pET-32a[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③也许是表达量太低，也可以试一下[/font][font=Calibri]westernblot[/font][font=宋体]，定性的检测一下。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、如果[/font][font=Calibri]IPTG[/font][font=宋体]诱导后细胞停止了生长，是不是表示细胞死了？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]T7RNA[/font][font=宋体]聚合酶非常活跃，[/font][font=Calibri]T7[/font][font=宋体]转录和翻译信号极强，因此，一旦诱导，细胞的主要生理活动都向着目的蛋白表达的方面转化。在通常情况下，细胞将停止生长，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。菌落形成试验可以用来检测表达系统的性能。也有一些例外情况，例如特别的目的基因以及一些极为严紧的载体[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]宿主菌组合（比如含有[/font][font=Calibri]pLysE[/font][font=宋体]的宿主菌）等，这时在诱导后菌落还是会继续生长。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、如何提高重组蛋白在原核细胞里的表达水平，特别是可溶性表达？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]这个问题是最困扰做原核蛋白表达纯化的人的。比如大肠杆菌表达蛋白本身表达量就大，但是表达的大都是包涵体，想要获得可溶性蛋白，就需要做复性，或是再设计实验时就想办法让其在上清中表达。一般就要通过基因优化，载体宿主优化筛选，表达条件优化，诱导条件优化等等。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①降低重组蛋白合成的速率[/font][font=宋体]可溶性蛋白的产率取决于蛋白的合成速率，蛋白的折叠速率，以及聚集的速率。高水平表达时，肽链聚集的速率一旦超过折叠速率，就会形成包涵体。因此，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②密码子优化[/font][font=宋体][font=宋体]密码子优化就是根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选。经过优化的基因序列往往能提高[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]二级结构的稳定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]③表达温度的选择大肠杆菌的最适生长温度在[/font][font=Calibri]37[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]39[/font][font=宋体]℃之间，但此温度下极易生成包涵体蛋白，降低可溶性蛋白的表达，而低温培养条件下表达外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]④诱导条件优化[/font][font=宋体]摇瓶培养时，应选用低菌体浓度诱导，因为在低菌浓度下菌体处于对数生长期，生长活跃，有利于表达可溶性蛋白。然而，如果能保证合理的补料与充分的通气，在较高菌浓度下诱导也同样可能获得可溶蛋白的高效表达。在某些情况下，诱导剂的流加能显著提高可溶蛋白的表达水平。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、义翘神州提供标签去除服务吗？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]是的。我们构建载体时可以在标签蛋白和目的蛋白之间加上蛋白酶的酶切位点，这样纯化后就可以利用蛋白酶去除标签，得到完整的目的蛋白。蛋白酶的切割效率受目的蛋白的影响，具体由实验结果而定。[/font][font=Calibri] [/font]

[font=宋体][font=宋体]原核表达系统作为现代生物技术中的关键工具，广泛应用于蛋白质工程、药物研发等多个领域。然而，在实际应用中，科研工作者常会遇到诸多疑问和挑战。本文旨在解析原核表达系统中最常见的[/font][font=Calibri]10[/font][font=宋体]个问题，帮助读者更全面地理解其工作原理，掌握关键技术要点，从而在实际操作中更加得心应手。通过探索这些问题，我们将共同迈向更深入的科学探索之旅。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、如何选择蛋白表达宿主菌？[/font][/font][font=宋体]原核系统和真核细胞偏爱的密码子有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、质粒测序正确，蛋白无法表达[/font][/font][font=宋体][font=宋体]①分析一下稀有密码子，如果比较多，可以尝试[/font][font=Calibri]rosetta[/font][font=宋体]（[/font][font=Calibri]DE3[/font][font=宋体]）[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②可能是基因本身的问题。[/font][font=Calibri]RNA3[/font][font=宋体]’的特殊结构可能导致转录出现问题，这种情况可以尝试融合表达，譬如[/font][font=Calibri]pET-32a[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③也许是表达量太低，也可以试一下[/font][font=Calibri]western blot[/font][font=宋体]，定性的检测一下。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、如果[/font][font=Calibri]IPTG[/font][font=宋体]诱导后细胞停止了生长，是不是表示细胞死了？[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]T7 RNA[/font][font=宋体]聚合酶非常活跃，[/font][font=Calibri]T7[/font][font=宋体]转录和翻译信号极强，因此，一旦诱导，细胞的主要生理活动都向着目的蛋白表达的方面转化。在通常情况下，细胞将停止生长，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。菌落形成试验可以用来检测表达系统的性能。也有一些例外情况，例如特别的目的基因以及一些极为严紧的载体[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]宿主菌组合 （比如含有[/font][font=Calibri]pLysE[/font][font=宋体]的宿主菌）等，这时在诱导后菌落还是会继续生长。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、如何提高重组蛋白在原核细胞里的表达水平，特别是可溶性表达？[/font][/font][font=宋体]这个问题是最困扰做原核蛋白表达纯化的人的。比如大肠杆菌表达蛋白本身表达量就大，但是表达的大都是包涵体，想要获得可溶性蛋白，就需要做复性，或是再设计实验时就想办法让其在上清中表达。一般就要通过基因优化，载体宿主优化筛选，表达条件优化，诱导条件优化等等。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①降低重组蛋白合成的速率[/font][font=宋体]可溶性蛋白的产率取决于蛋白的合成速率，蛋白的折叠速率，以及聚集的速率。高水平表达时，肽链聚集的速率一旦超过折叠速率，就会形成包涵体。因此，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。[/font][font=宋体]②密码子优化[/font][font=宋体][font=宋体]密码子优化就是根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选。经过优化的基因序列往往能提高[/font][font=Calibri]mRNA[/font][font=宋体]二级结构的稳定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。。[/font][/font][font=宋体]③表达温度的选择[/font][font=宋体][font=宋体]大肠杆菌的最适生长温度在[/font][font=Calibri]37[/font][font=宋体]～[/font][font=Calibri]39[/font][font=宋体]℃之间，但此温度下极易生成包涵体蛋白，降低可溶性蛋白的表达，而低温培养条件下表达外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例。[/font][/font][font=宋体]④诱导条件优化[/font][font=宋体]摇瓶培养时，应选用低菌体浓度诱导，因为在低菌浓度下菌体处于对数生长期，生长活跃，有利于表达可溶性蛋白。然而，如果能保证合理的补料与充分的通气，在较高菌浓度下诱导也同样可能获得可溶蛋白的高效表达。在某些情况下，诱导剂的流加能显著提高可溶蛋白的表达水平。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、目的蛋白总是以不可溶的形式出现[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的[/font][font=Calibri]50%[/font][font=宋体]以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达[/font][font=Calibri]95%[/font][font=宋体]（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实践中，有很多实验室采取降低诱导温度，例如[/font][font=Calibri]25[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]30[/font][font=宋体]°[/font][font=Calibri]C[/font][font=宋体]，或降低[/font][font=Calibri]IPTG[/font][font=宋体]浓度[/font][font=Calibri](0.01[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]0.1mM)[/font][font=宋体]并延长诱导时间，还有采用特别的培养基等方法获得更多的可溶蛋白。然而，让目的蛋白以包涵体形式聚集也并非总是坏事。不溶态在某些情况下非常有利：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①形成包涵体是目的蛋白表达量很高的表现。[/font][font=宋体][font=宋体]②作为初步分离，将目的蛋白的包涵体纯化出来非常简便。用核酸酶处理，并经简单洗涤，通常可以获得纯度达[/font][font=Calibri]75[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]95%[/font][font=宋体]的目的蛋白。[/font][/font][font=宋体]③存在于包涵体中的目的蛋白通常可以免于蛋白酶的水解破坏作用。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]研究者采用下述方法加强蛋白重折叠的效果，并在很多蛋白上取得了好结果，可以尝试以下：当蛋白还结合在树脂上时，使用[/font][font=Calibri]6M[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]8M[/font][font=宋体]梯度盐酸胍、[/font][font=Calibri]1mM[/font][font=宋体]还原型及[/font][font=Calibri]0.2mM[/font][font=宋体]氧化型谷胱甘肽处理，继而用咪唑正常洗脱。有些实验室在透析去除变性剂的过程中加入底物或类似物，也有帮助酶折叠的效果。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、我要的是全长蛋白，怎么还有截短的产物，这是怎么回事？[/font][/font][font=宋体]①一个最直接原因就是蛋白水解了。[/font][font=宋体][font=宋体]②然而第二点翻译起始也非常有可能。起始密码子[/font][font=Calibri]AUG (Met) [/font][font=宋体]的上游在[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]编码区有类似于核糖体结合位点序列[/font][font=Calibri](AAGGAGG)[/font][font=宋体]的间隔序列[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]通常是[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]–[/font][font=Calibri]13[/font][font=宋体]个核苷酸[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]时，容易出现这种问题。截短蛋白在纯化全长蛋白的操作时往往造成麻烦。解决途径之一即是选用两端都带有融合标签的[/font][font=Calibri]pET[/font][font=宋体]载体，例如[/font][font=Calibri]pET-28[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]pET-30[/font][font=宋体]系列载体在[/font][font=Calibri]N-[/font][font=宋体]端和[/font][font=Calibri]C-[/font][font=宋体]端都有[/font][font=Calibri]His-Tag[/font][font=宋体]。这样，全长蛋白就可以通过提高咪唑浓度，在洗脱时将截短蛋白与全长蛋白区分开。[/font][font=Calibri]pET-29[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]pET-30[/font][font=宋体]系列载体在[/font][font=Calibri]N-[/font][font=宋体]端融合有[/font][font=Calibri]HiS-Tag[/font][font=宋体]序列而[/font][font=Calibri]C-[/font][font=宋体]有[/font][font=Calibri]His-Tag[/font][font=宋体]，因此可以先后用固定化[/font][font=Calibri]S-[/font][font=宋体]蛋白和[/font][font=Calibri]His- Bind[/font][font=宋体]树脂亲和纯化以获取全长蛋白。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]7[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]His[/font][font=宋体]标签包在蛋白质结构内部还能用蛋白酶切除吗？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]一般重组蛋白纯化标签被包在内部，可以增加所提的蛋白质样品的溶解度，比如适量增加变性试剂浓度或类型使得蛋白质的肽链松散开暴露出（组氨酸）[/font][font=Calibri]6[/font][font=宋体]标签。另外，还可以加大离子型、非离子型或两性离子表面活性剂的浓度或类型，加大[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]浓度（[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]浓度[/font][font=Calibri]1mmol/L[/font][font=宋体]，否则[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]会与[/font][font=Calibri]Ni2+[/font][font=宋体]结合），适当调整调高盐浓度（氯化钠溶液低于[/font][font=Calibri]2mol/L[/font][font=宋体]，从低浓度到高浓度逐渐分梯度上升），总之，作用就是增加蛋白质的可溶性，因为[/font][font=Calibri]his6[/font][font=宋体]的亲水性较强，增加可溶性之后[/font][font=Calibri]his6[/font][font=宋体]容易暴露在水相。加大[/font][font=Calibri]DTT[/font][font=宋体]浓度也可以切断二硫键使得蛋白质的肽链松散，进而使[/font][font=Calibri]his6[/font][font=宋体]容易暴露在水相，从而方便纯化和酶切。再者重新构建，不加[/font][font=Calibri]His-tag[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]8[/font][font=宋体]、目的蛋白大于[/font][font=Calibri]100kd[/font][font=宋体]或含有多个亚基，是否可以用原核表达系统？[/font][/font][font=宋体]在细菌中已经非常成功底表达了很多大蛋白。多亚基复合物则可以通过分别表达各亚基，然后在有尿素的溶液中，将各组分以适当比例混和，再透析除去变性剂。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]9[/font][font=宋体]、是否所有的位点特异性蛋白酶都有一样的酶切特性，只是识别位点不同？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]位点特异性蛋白酶[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]例如凝血酶、肠激酶和[/font][font=Calibri]Xa[/font][font=宋体]因子[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]通常被用来切割融合蛋白。这些酶的活性和第二点酶切倾向性很不相同。凝血酶在这三种中是特异性活性最高的，能够有效切质量比仅为[/font][font=Calibri]1:2000[/font][font=宋体]的蛋白。[/font][font=Calibri]Xa[/font][font=宋体]因子似乎对于切点周围的序列很敏感，经常会出现特异性位点切割不理想却发生别的位点被切割的情况。肠激酶的专一性是上述三种中最好的，但由于切割效率低（通常要求质量比达到[/font][font=Calibri]1:10[/font][font=宋体]）而显得比较昂贵。另一个需要考虑的问题是：切割完成之后，是否需要去除蛋白酶。在质量比比较高的酶切反应进行完后，通常要通过色谱法处理。比较方便可行的方法是采用生物素化凝血酶结合链亲和素琼脂糖一起使用。尽管没有一种蛋白酶完美无缺，凝血酶还算的上是活性高、专一性好的典型。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]10[/font][font=宋体]、如果去除信号肽，会不会影响蛋白本身的表达？[/font][/font][font=宋体]蛋白表达强度不受信号肽调控，所以去除信号肽不会影响蛋白质表达。但是信号肽一方面参与蛋白质折叠成特定空间结构，另一方面其还决定蛋白最终被定位到特定的亚细胞区，一般蛋白只有在特定亚细胞区才能发挥其功能，所以信号肽对蛋白最终活性还是有很大影响的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-expression][b]蛋白表达[/b][/url]详情可以查看义翘神州网：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-expression[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font]

[font=宋体][font=宋体]在生物技术的广阔天地中，杆状病毒昆虫细胞表达系统以其独特的魅力和广泛的应用前景，正逐渐受到研究者们的青睐。这一系统巧妙地利用经过改造的杆状病毒基因组，在大肠杆菌中高效复制，并通过精密的转座过程将目的基因精准地插入到[/font][font=Calibri]bacmid[/font][font=宋体]的特定位点。这一过程不仅展示了生物技术的精巧与奇妙，更为科研工作者提供了强大的工具，用以探索和研究蛋白质的功能与结构。然而，任何技术在实际应用中总会遇到一些问题和挑战。为了帮助大家更好地掌握和运用这一系统，本文将深入探讨其原理，并分享在实际操作中可能遇到的常见问题及其解决方案，以期为大家的科研工作提供有益的参考和指导。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]杆状病毒昆虫细胞表达系统原理：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]经过精心改造的病毒基因组（即杆状病毒穿梭载体[/font][font=Calibri]Bacmid[/font][font=宋体]）在此系统中展现了非凡的复制能力。它们能在大肠杆菌如[/font][font=Calibri]DH10Bac[/font][font=宋体]菌株中自如地繁衍。这一复制过程得益于供体质粒中目的基因两侧所锚定的[/font][font=Calibri]Tn7[/font][font=宋体]转座原件。这些原件与[/font][font=Calibri]DH10Bac[/font][font=宋体]菌株中的[/font][font=Calibri]helper[/font][font=宋体]质粒所编码的转座酶活性相互作用，将目的基因精准地转座到[/font][font=Calibri]bacmid[/font][font=宋体]的特定位点上。当目的基因成功插入后，会导致[/font][font=Calibri]bacmid[/font][font=宋体]上的[/font][font=Calibri]LacZ[/font][font=宋体]基因发生移码，进而通过蓝白斑筛选法轻松鉴定出阳性重组[/font][font=Calibri]bacmid[/font][font=宋体]。经过提取后，这些[/font][font=Calibri]bacmid[/font][font=宋体]便能转染昆虫细胞，开启其在昆虫细胞中的高效表达之旅。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]昆虫[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]杆状病毒表达平台的常见问题解答[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、[/font][/font][font=宋体]义翘神州是否接受已构建的表达载体进行[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-expression][b]蛋白表达[/b][/url]？[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]对于众多常规蛋白表达项目，义翘神州确实欢迎并接受客户直接提供的表达载体，如[/font][font=Calibri]pFastBac[/font][font=宋体]等，进行专业的蛋白表达。我们深知每个蛋白的特性独一无二，因此，我们始终致力于与客户保持紧密的沟通，共同探讨并确定最佳的纯化方案，确保最终交付的产品符合客户的期望和需求。我们承诺，通过我们的专业知识和丰富经验，将客户的表达载体转化为高质量的蛋白产品。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、[/font][/font][font=宋体]义翘神州是否接受包被好的杆状病毒直接进行蛋白表达？[/font][font=宋体]对于一些常规蛋白表达项目我们同样也可以直接使用客户制备好的杆状病毒进行蛋白表达，我们也会根据蛋白的实际特性与客户沟通交流纯化方案和最终交付形式。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、[/font][/font][font=宋体][font=宋体]哪些类型的蛋白适合杆状病毒[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]昆虫细胞表达系统进行制备？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]杆状病毒[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]昆虫细胞表达系统适用于多种类型的蛋白表达，鉴于昆虫细胞可实现高密度培养的特性以及相对原核系统较为完备的后修饰和蛋白折叠机制，杆状病毒[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]昆虫细胞表达系统通常被较多的用于胞内定位蛋白的表达，并且其在表达一些稳定性相对较差的蛋白，比如转录因子等方面也有一定的优势。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、[/font][/font][font=宋体]杆状病毒表达系统有哪些优势？[/font][font=宋体][font=宋体]杆状病毒表达系统是属于真核表达系统，在蛋白质表达方面具有许多优势，比如可容纳大量[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]插入片段、相对较高的表达水平以及类似于哺乳动物细胞的真核蛋白质修饰等。 杆状病毒表达系统是结构分析中最常用的表达系统。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、[/font][/font][font=宋体]在表达后的修饰中，昆虫系统出现多条带，不同的修饰在活性上有区别吗？[/font][font=宋体]重组表达的后修饰会出现不均一的情况，但不是所有的后修饰都会对蛋白活性有影响，所以需要结合该蛋白的修饰位点在功能上的作用进行分析，不同的修饰不一定在活性上有差异。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、[/font][/font][font=宋体]目的蛋白表达后会和病毒一起释放到胞外吗？[/font][font=宋体]需要确定目的蛋白是分泌表达还是胞内表达。分泌表达的蛋白会释放到胞外，因此纯化的时候选用培养上清。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州为客户提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/platform/baculovirus-insect-protein-expression][b]杆状病毒[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/platform/baculovirus-insect-protein-expression][b]-[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/platform/baculovirus-insect-protein-expression][b]昆虫表达平台[/b][/url]，在[url=https://cn.sinobiological.com/services/baculovirus-insect-protein-expression-service][b]杆状病毒[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/baculovirus-insect-protein-expression-service][b]-[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/baculovirus-insect-protein-expression-service][b]昆虫细胞蛋白表达服务[/b][/url]方面具有丰富的经验，特别是针对序列较长的蛋白、病毒类蛋白、激酶、胞内蛋白以及膜蛋白等。义翘神州拥有多种常用昆虫细胞系（[/font][font=Calibri]Sf9, Sf21, High-Five[/font][font=宋体]），一般来说，[/font][font=Calibri]Sf9[/font][font=宋体]更利于病毒扩增，[/font][font=Calibri]Hi5[/font][font=宋体]更利于蛋白表达。义翘采用的是[/font][font=Calibri]Sf9[/font][font=宋体]扩增病毒，[/font][font=Calibri]Hi5[/font][font=宋体]重组表达，并且凭借优化的表达载体和更高滴度的病毒包装技术，有效提高蛋白表达量，交付高活性蛋白。[/font][/font][font=宋体]详情可查看：[/font][font=宋体][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/platform/baculovirus-insect-protein-expression[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b][font=宋体] [/font]

节食行为会导致压力相关基因表达的长期变化 忽胖忽瘦的老鼠：科学家可能找到了节食减肥失败的关键因素——至少是在啮齿动物身上。好好放松可能才是你减掉感恩节增加的体重的关键。一项新的研究表明，节食会使得大脑对压力和高脂肪、高卡路里的食物奖励更加敏感。大脑的这种变化一直会持续到节食结束，并刺激健康人在压力下暴饮暴食。大多数从事减肥研究的科学家都把注意力放在如何调整人的饮食规律上——比如帮助他们吃得更少，饱得更快，食欲减退等。但问题是，当我们的体重下降后，如何保持身材却变成了一个难题。就算是通过手术减肥，也无法百分之百保证人们能始终维持苗条的身材。美国宾夕法尼亚大学的神经科学家Tracy Bale认为，这种现象可能跟压力有关。压力会使得人体释放一种叫做皮质醇的激素，这种激素会以糖的形式向血液中提供能量，以保护人免受潜在威胁的侵害。如果人长期处于压力状态，体内的皮质醇水平就会一直处在一个比较高的状态，这就会使得人的胃口大开，体重增加。Bale和她的同事认为，节食使得人们更容易感知日常生活中的压力。在这种慢性压力的影响下，就算是意志最坚定的节食者，也会抵抗不住冰淇淋和比萨饼的诱惑。尽管偶尔吃一个香甜的圣代冰淇淋不会引起体重的增加，但如果长此以往，人们之前的减肥成效就会功亏一篑。

[font=宋体][font=宋体]真核蛋白表达系统是一种广泛应用的蛋白表达方式，通常利用酵母、昆虫或哺乳动物细胞作为宿主。这种表达系统所生成的蛋白与目标[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]具有极高的相似性，能诱导高效蛋白表达。那么，在实施真核蛋白表达时，有哪些关键的纯化步骤呢？接下来，我们将详细解析这一过程。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]首先，我们要明确真核蛋白表达的纯化步骤是至关重要的环节。这些步骤不仅关系到最终产品的纯度和产量，还直接影响其生物活性和应用价值。因此，选择合适的纯化方法对于整个实验的成功至关重要。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]真核蛋白表达及纯化步骤主要有以下几个方面：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、重组质粒构建：将目的基因克隆进表达载体，常见的方法包括限制性切酶切割，基因合成等，根据连接酶说明，进行线性载体和目的基因片段的酶联，最后对质粒测序做好验证；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、蛋白诱导表达：普适条件下查看蛋白是否表达，若不表达，更换载体，表达菌株等方法查看是否表达，如果表达，继续实验；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、蛋白表达部位分析：分析蛋白是可溶性还是不溶性的表达，即在超声后上清表达还是沉淀表达；是否与你的目标蛋白表达部位相同，相同进行后续蛋白表达条件优化；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、蛋白表达优化：优化诱导[/font][font=Calibri]IPTG[/font][font=宋体]浓度、诱导温度，进行放大培养；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、蛋白纯化：根据目标蛋白的性质进行样本处理，然后进行亲和纯化，获取目的蛋白。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]真核表达系统的选择与应用[/b][/font][font=宋体]酵母蛋白表达系统[/font][font=宋体]酵母真核蛋白表达系统有甲醇酵母表达系统，酿酒酵母表达系统，裂殖酵母表达系统以及克鲁维酸酵母表达系统等，其中最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，但现在运用最广泛的酵母表达系统还是甲醇酵母表达系统中的毕赤酵母真核蛋白表达系统。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]哺乳动物细胞表达系统[/font][font=宋体][font=宋体]哺乳动物细胞表达系统是真核表达系统中唯一可以表达复杂蛋白的系统，它能够指导真核表达蛋白进行正确折叠，提供复杂的[/font][font=Calibri]N[/font][font=宋体]型糖基化和准确的[/font][font=Calibri]O[/font][font=宋体]型糖基化等多种翻译后加工功能，所以它和昆虫酵母系统比较更具有发展潜力，哺乳动物细胞真核表达的蛋白与天然真核表达蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]但成本较高也一定程度上减缓了它的发展速度。哺乳动物细胞表达系统主要是通过改造宿主细胞来提高外源蛋白的表达效率，常用的宿主细胞有[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]COS[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]BHK[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]SP2 /0N[/font][font=宋体]等，哺乳动物转染方法[/font][font=Calibri]*[/font][font=宋体]有脂质体转染法，电穿孔法以及病毒转染等。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-techniques][b]蛋白纯化技术[/b][/url]：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-techniques[/font][/font][font=Calibri] [/font]

如果靶基因亚克隆在含有T7启动子的表达载体（如质粒载体pET-22b和pET-15b等）上，那么重组质粒应转化入λDE3溶源菌菌株 中，以进行靶基因的表达。 （一） 溶菌酶-DNase I-反复冻融裂解菌体法1. 单菌落接入4ml LB培养液中，过夜培养。再以1:20转接至2管4 ml LB培养液中，当OD600为0.6-0.8时，一管加IPTG诱导，另一管不加IPTG作对照。2. 离心收集菌体，每管加Binding buffer 100 μl，DNase I (2,000 u/ml) 10 μl，溶菌酶 (2 mg/ml) 5 μl。菌体充分悬浮后，在-20℃放置20分钟，室温融化，如此反复冻融8-10次。3. 吸取20 μl加入一洁净的EP管中，12,000 rpm离心10分钟，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，以判断靶蛋白质主要以溶解形式还是以包涵体形式存在。 （二） 超声波裂解菌体法1. 单菌落接入4 ml LB培养液中，过夜培养。其中2 ml过夜培养物用于菌种保存和DNA测序，另

事件一：7月4日，俄罗斯总统普京签署法令，禁止在俄境内种植转基因作物、养殖转基因动物、生产转基因食品，并禁止俄罗斯进口转基因食品，违者将处以罚款。=======================================================================事件二：7月29日，美国总统奥巴马签署了一项有关转基因食品销售的法律，要求生产商在食品包装上标注其是否含有转基因成分，从而让消费者“买得明白”。======================================================================= 美俄两个超级大国在转基因领域的大动作，代表着一个趋势，那就是政府部门对转基因食品的监管会越来越严格，立法越来越完善，因此对检测的技术要求也会越来越高。那么目前国内转基因发展现状，转基因成分的检测技术都有哪些，依据什么原理，准确度怎么样呢，就由小编为大家简单介绍一下。~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~据国际农业生物技术应用服务组织（ISAAA）统计报道，目前国内共批准60项转基因作物事件，分别为转基因玉米17项、转基因阿根廷油菜12项、转基因大豆10项、转基因棉花10项、转基因西红柿3项、转基因水稻2项、转基因杨树2项及转基因甜椒、转基因甜菜、转基因矮牵牛花和转基因木瓜各1项。转基因技术的核心是对物种遗传物质进行人为改造，导入外源基因，从而获得预期的目的性状。因此可以通过检测材料中是否含有外源启动子、终止子、标记基因、目的基因(抗虫、抗除草剂、抗病和抗逆等基因)及其表达产物来判断是否含有转基因成分。目前国内外对转基因成分的检测从原理上可以分为两类，基于外源蛋白靶标检测和基于外源核酸成分检测。基于外源蛋白靶标的检测技术主要是以免疫分析技术为基础，利用转基因作物产生的特定的外源蛋白与抗体的特异性识别进行检测和定量的技术。常见的基于外源蛋白靶标的转基因检测技术包括酶联免疫吸附技术（ELISA）、蛋白印迹（Western blot）检测技术、免疫层析试纸条技术及蛋白质芯片技术（Protein chip）等。ELISA方法和免疫层析试纸条法快速准确，但仅可检测一种目标蛋白，而蛋白质芯片可通过设计不同的探针阵列和特定的检测方法，使一次反应同时检测多个蛋白，具有通量高、微型且自动化等优点，但背景信号高、蛋白质活性难以长久保持。蛋白质检测方法往往不能检测加工食品，而且受目的蛋白质在转基因作物中的表达部位、表达时间及环境等的影响，限制了其应用。而核酸成分，尤其是DNA，因其稳定性好，在加工过程中不易降解，被广泛用于转基因检测中。基于外源核酸成分的检测方法主要包括 PCR 技术、恒温扩增技术、基因芯片技术等。PCR技术已经成为转基因作物及产品日常检测工作中应用最广泛的技术，国内以及国际发布的食品和饲料中转基因产品的检测标准方法大都采用的PCR技术原理，应用普通PCR方法或实时荧光定量PCR可以对检测样品进行定性和定量检测。在此基础上，新的PCR技术如巢式和半巢式 PCR、多重 PCR、PCR-免疫层析等技术也成功应用于转基因成分的检测中。同 PCR 检测技术相比，恒温扩增技术具有特异性强、等温高效、操作简单、耗时较短、产物易检测及设备要求低等优势, 在快速检测中具有良好的前景。基因芯片综合了 PCR 技术和分子杂交的优点，可用于一种转基因作物中多个基因的平行检测或对多种转基因作物进行同时检测，其快速简便、自动化、微型化、高通量、准确度高等优点，使其在转基因作物检测方面具有广阔的应用前景。数字 PCR 是一种基于单分子 PCR 的对DNA分子直接计数的绝对定量方法，不需要标准品作为参考，融合了定量 PCR的准确性及基因芯片的高通量，因此有望成为绝对定量新标准，也有潜力解决转基因检测通量和劳力成本的问题。目前, 国内外针对转基因成分的检测主要以DNA为检测对象的核酸扩增检测技术为主，但是却面临着两大挑战：1、Talen和CRISPR等基因组编辑技术在转基因研发中的应用；2、加工技术水平和加工精度的提高, 导致DNA的提取难度加大，提取质量下降。但是我们相信，正是在这些挑战的激励下，我们的检测技术会不断地发展，检测人员的水平也会不断地提高。行路难！行路难！多歧路，今安在？长风破浪会有时，直挂云帆济沧海。

在原核蛋白表达体系中，如E.coli（大肠埃希菌）系统，外源基因通常需要诱导剂的诱导才能进行表达，本文详细讲述了常用诱导剂IPTG 对外源蛋白诱导表达的原理以及实验步骤。

GeneChip System ([url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url]S) 3000Dx v.2基因[b][url=http://hplc17.com]芯片扫描系统[/url][/b]是最可靠的临床研究平台,也是唯一被FDA批准/ SFDA,试管和CE标志芯片系统,适用于临床检测基于RNA和DNA。　　[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url]S 3000 dx v . 2是扩大Affymetrix临床的基础装备,装备还包括FDA批准,试管和CE标志Affymetrix基因分析试剂和人类基因组U133 v2.0芯片,即利用人类基因组U133 v2.0 cGMP制造芯片的版本。　　Affymetrix的临床工具包提供了一种进入市场的有效方法，使测试开发人员能够节省时间、金钱和监管风险。　　Affymetrix的基因芯片技术已经得到了成千上万的研究人员的信任，在芯片应用中产生了高度可重复的结果。[img=GeneChip® System ([url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url]S) 3000Dx v.2基因芯片扫描系统1]http://17wab.cn/uploads/allimg/180726/1-1PH6102HW11.jpg[/img]　　[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url]S 3000Dx v.2 基因[b][url=http://hplc17.com]芯片扫描系统[/url][/b]适用于：　　[b]科研[/b] 自信地分析或研究宝贵的人类样品　　[b]诊断检测的开发[/b] Affymetrix合作伙伴已经开发并商业化了一些获得FDA批准的体外诊断和符合CE-IVD的诊断检测　　[b]常规检测[/b] 一个系统，多种应用[img=GeneChip® System ([url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url]S) 3000Dx v.2基因芯片扫描系统2]http://17wab.cn/uploads/allimg/180726/1-1PH6102JYW.jpg[/img]　　[b]功能/应用范围：[/b]　　1.基因功能研究 　　2.基因表达谱分析、基因诊断、序列分析 　　3.药物筛选与新药开发 　　4.基因多态位点及基因突变检测 　　5.其他方面的应用，如环境保护、农业和蓄牧业等领域的应用。　　[b]主要附件：[/b]　　专用芯片杂交箱640 全自动洗涤工作站 电脑　　[b]主要技术指标：[/b]　　扫描分辨率2.5微米，存储16bit图象，固态绿色激光器，检测波长570纳米。　　[b]技术特色：[/b]　　一、　　1.强大的类比性 　　2.巨大的信息产出率 　　3.高度敏感性和专一性 　　4.高度重复性 　　5.微型化、自动化 　　6.哺育新的实验方法。　　二、全基因组表达谱，基因组SNP检测。

很多朋友问这样一个问题：为什么毕赤酵母表达困难?他们自己也很纳闷，重组酵母pcr检测也证明目的基因重组了，但是诱导之后就是在表达上清中检测不到目的蛋白，仔细研究操作手册后仍然不知道原因。本人，根据自己的经验，采用倒推的方法，按实验过程从后向前分析，供大家参考：1、诱导之后表达上清中检测不到目的蛋白：分析1：检测的方法是否有问题，要考虑是不是蛋白表达量低而没有检测到? 如果是蛋白表达低，可以选择浓缩蛋白，具体的方法很多，有TCA、丙酮、浓缩柱等等方法，之前在本版已经发过帖，在此不赘述。 2、如果蛋白浓缩N倍之后仍然检测不到，那基本可以确证蛋白并不在上清中。那么蛋白到哪里去了，考虑是否没有分泌出来，而是在胞内，那就需要通过裂解酵母来检 测胞内蛋白，具体的方法很多，在此也不赘述，曾整理过相关破碎的帖子。 3、如果胞内也没有目的蛋白表达，那么基本可以确定蛋白并没有表达。 4、为什么没有表达呢?倒推回来就是诱导的过程了，诱导体系是什么?甲醇浓度是多少?培养问题是多少，转速是多少?这些都要注意。甲醇一般是0.5%-1.0%，本人用的 是0.5%，也有很多人也用1.0%，曾见过一个帖子，说超过1.5%反而会抑制表达，没有验证过，供大家参考。培养问题28-30度比较合适，转速250rpm比较合适，诱导 体系没有固定的体系，说明书上推荐的是BMGY到OD600 2~6，换到BMMY中OD600 为1左右。 5、如果诱导的过程也没有问题，那问题就复杂了，特别是重组酵母PCR检测证明目的基因确实已经发生了重组。这个时候是最郁闷的了，但是郁闷怎么办，还是要找原 因，在此我给的建议是先做RT-PCR证明mRNA水平的情况，也就是说有没有转录。如果转录了，后续的操作也没有问题(本帖的1、2、3、4项)，那么只有重新设计实 验，比如换酵母株，有文章上说：用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。 6、有个帖子说的很好，在此和大家分享一下。 1、 菌株：用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。 2、温度：　在28度和室温下诱导表达，表达水平可能都不低。 3、pH：手册上用6.0，pH提高到6.8，不表达的蛋白可能就表达出来。BMMY的pH7.0-7.5比较合适。国内外做的最好的rHSA，最适pH大概5-6左右。pH3的时 候yeast和peptone好像会沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氢钾调，具体比例自己去试试。 4、偏爱密码子： codon bias一般不是主要的问题，你要表达的蛋白特性才是主要问题，酵母对分子量大(30KD以上)，结构复杂(如一些蛋白酶)，二硫键含量多的 蛋白往往不能有效表达，尤其是分泌表达。密码子改造对一些较小的而且结构简单的蛋白表达量的提高可能有一些作用。比如一位战友用Pichia酵母表达一个单链 抗体，29KD，含有2对二硫键，表达量约几毫克每升，选用酵母偏好密码子全基因合成后，表达量没有什么提高。 5、表达时间与空质粒转化对照：诱导时间长了以后，是会有很多蛋白分泌出来的，时间越长杂蛋白就越多，且分子量都比较大。最好做一个空质粒转化的对照， 这样就会比较肯定到底是不是自身的蛋白分泌的结果。 6、污染：每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌(30ml玻璃管，比LB管大一点)，纱布一般用8层，一天左右看着比较浑离心，留样1ml，余 1ml换2ml BMMY诱导表达，3,4层纱布足够了。 污染一般都是跟瓶口覆盖有关的原因造成的，只盖纱布肯定会污染。加盖报纸后，就再没遇到过污染。如果只用6层纱布，污染的可能当然很大，100ml三角瓶， 装量10ml培养液，用橡筋把8层纱布和2层报纸拴紧封口，空气浴摇床。 7、不表达：蛋白有没有表达就要看你的运气了，一般重复2-3次实验都没有表达菌株，这个蛋白就放弃表达了。 8、表达量： 30KD,10mg/L表达量已经很高，最直接的方法是发酵，一般提高5-10倍。大肠杆菌一样出现大团的超表达蛋白。 9、糖基化：酵母分泌表达的N糖基化是可以预测的，有如下序列：N X S/T就是潜在的糖基化位点，X为任意氨基酸，1个糖基化位点会加上1-3KD左右的糖基。另外可 能还有O糖基化话，但是无法预测其位点，不过很少听说表达蛋白有O糖基化的。如果胞内表达，不存在糖基化的问题。 10、表型与表达：重组SalI和BglII酶切产生单交换和双交换，结果就是产生Mut+和Muts表型的菌株;前者在甲醇诱导表达时生长快，消耗的甲醇多，后者生长慢，消耗 的甲醇少，所以诱导表达时Muts表型要求更高的菌体浓度。一般用Mut+表型的较多，但是对某些蛋白Muts菌株可能表达的更好，只有试试才知道你的蛋白用那种菌 株表达较好。 11、培养基 YPD：最基本的培养用;BMGY：诱导表达前培养用;BMMY：诱导表达用;MD：电转化后筛选his+用。 YEPD是不能代替BMGY的，因为有葡萄糖，这样残留的葡萄糖会影响下一步的诱导表达。不过有一种方法是可行的，就是用YPG培养基代替，只是把YEPD中的葡萄糖 用3%的甘油代替，也可以降低成本。摇瓶毕竟不能和发酵罐比，甘油残余会抑制甲醇利用。 BMGY、BMMY灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。配制BMMY时也没必要用5%过滤除菌的甲醇，在灭菌后使用前加100%甲醇至你要的浓度。 YNB可以高压灭菌，没问题的，也可以0.22um过滤处理，天冬氨酸和苏氨酸要待培养基高压灭菌后加入;配YPD时可以加入YPD一起灭菌，但时间不能太长，温度不能 太高，一般121-125度12-15分钟足够了。若时间过长，温度过高，可能导致YPD焦化。glucose和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。 颜色很深的话，基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培养基108度35min高压灭菌。 小量发酵其实可以把培养基成分中的YNB和生物素去除，培养基价格便宜，操作又方便，可以直接灭菌，效果也很好(效果不比含YNB的差)。 如果是用自己配置的培养基，如玉米浸提液、麦芽浸提液、麦麸浸提液等等，可以不用换液，采取添料来维持酵母对培养基的营养需要。 用无机盐进行大规模发酵，更省钱。更多有关蛋白表达纯化的相关资料，请点击：资料专区