合成梯度进样系统

求教各位，1液相中等度梯度和二元高压梯度系统是什么意思啊。详细一点 2还有紫外可见检测器中检测池体积是什么概念如果检测池体积是8微升是不是进样量不能超过8微升？ 3紫外可见检测器波长精度和波长重复性是什么概念？ 4.静态波长扫描是个什么意思是不是自动可以筛选波长

我们实验室的液相是四元梯压梯度系统，一般A通道是甲醇通道，B是水通道，C是乙腈通道，D是盐溶液通道。我要用CD两个通道测氨基酸含量，需要进行梯度洗脱，但是在工作站中梯度设置有个高压梯度和低压梯度设置，高压梯度设置里只有AB两个通道的设置（包括流速设置），低压梯度设置里有四个通道的设置，但没有流速的设置，我该如何进行设置，还有就是高压和低压梯度的区别是什么？请问哪位前辈有经验，能不能指导一下，感激不尽！

目前HPLC仪器制造厂家大都推出四元低压梯度（带在线脱气）系统，而在数年前大都是两元高压梯度，当然是用在梯度时。那么两元高压梯度和四元低压梯度（带在线脱气）系统比较一下，各有什么优缺点。讨论范围不仅是性能，还应考虑生产成本和销售利润。大家觉得如何。我目前还是觉得这是国外厂商的一种销售技巧，从目前的售价看，四元的比二元高压并低不了太多，但他们节约的成本是不少的。我认为高压梯度在作高精度分析时优势明显。

[size=4]合成色素的测定国标法中 -- 高效液相色谱法中梯度洗脱：甲醇 20-35%，3%/min 35-98%，9%/min: 98%继续6min每次梯度洗脱后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复初始状态。让10-30倍的柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。那我想请教一下大家：这里所说的初始状态是不是就是：甲醇 20%：乙酸铵80%啊？那这样的话，从甲醇98%：乙酸铵2% 到甲醇 20%：乙酸铵80%，乙酸铵会不会在甲醇中析出结晶，把色谱柱给堵了啊？？？[/size]

我们单位的仪器是HPLC-ICPMS 安捷伦7500 没有自动进样 有一个老师说不能梯度洗脱 原因是没有自动进样 是这样的吗？

我现在用的是自动进样，但是还是有些许偏差。那我进三针，取平均值还是直接就进一针得到曲线。不知道我说的大家明白不！做曲线的时候 你们是一个梯度进三次 还是进一次？

0.1%三氟乙酸乙腈-0.1%三氟乙酸水进行梯度洗脱，出现好几个系统峰，做杂质测定时要扣除，最近做的时候系统峰变大，不知道有什么原因引起的，如何消除系统峰

我想请教大家一个问题：二元高压梯度洗脱的程序控制问题，设定好的梯度时间程序必须是进样后才能开始运行，也就是说必须检测器有了采集信号才开始运行时间程序吗？也不知道大家明不明白我问的问题，就是如果我的进样装置是独立配置的，不受整个系统的控制，能进行梯度吗？

大家好！我做的一个实验是梯度的，30：70的乙腈和0.1%TFA，12Min变为85乙腈.以前都没出现什么问题，空白（进空针走流动相）一直都很好，很干净。这星期做突然在9min左右出现1个鬼峰。而且不管进多少针基本没有变化。不进样或者进空气基线都很干净。分别换了乙腈和水情况还是一样，没有变化。有哪位大虾出现过类似情况，帮助一下？

流动相预混合可以优化梯度洗脱条件，提高检测精度，下面有个这样的例子，但是我不明白，为什么为什么溶剂B的变化变为44%-65%，请老师帮忙解释下，谢谢！以下是例子：以一个分析分子量大约为1000Da合成肽的试样为例，经优化后，洗脱条件为：0.1%三氟乙酸水溶液为溶剂A，0.1%三氟乙酸的乙腈溶液为溶剂B，在1.5ml/min的流速下，30min内19%-24%B的线性梯度。因为梯度陡度只有5%B/30min,在此情况下，连续进样时保留时间的重现性不能达到低于0.25min，如果预混合溶剂，以10/90乙腈/0.1%三氟乙酸水为溶剂A，30/70乙腈/0.1%三氟乙酸水溶液为溶剂B，则相当的梯度约为在30min内44%-65%B的变化，由于梯度陡度的增加，梯度较少受仪器硬件的制约，保证了保留时间的重现性。

2005年版中国药典中规定用梯度洗脱测三七药材中的含量.我在做此试验时,条件都按药典规定的设置完后,开始做的空白梯度挺好.当进第一针对照后出来的三个色谱峰也不错.可连续进第二针对照后,最后一个峰却没有在同样的保留时间内走出来.接着我又进第三针对照,可是还没有出峰.为什么会这样?究竟是什么原因呢?我设置的时长是75分钟.最后一个峰在65分钟左右出峰.请高手们多多指教.

[align=center] [/align] [font=Tahoma, Helvetica, SimSun, sans-serif][size=18px][color=#444444]众所周知，超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]系统的流路设计质量对色谱分离的外观和重现性有重大影响，这一点也适用于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-质谱联用（以下简称 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]）应用中的梯度洗脱。不过，在 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url] 的情况下，洗脱条件通常更多地是：根据离子源的要求而非最佳色谱分离的要求进行调整；不过，这使得某些效果比传统的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]独立应用更为明显，下文将详细讨论。 存在的挑战 在实际样品的 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url] 分析中，一个特殊的挑战是:样品溶剂与分离起始梯度溶剂强度之间的差异，即所谓的溶剂不匹配。许多样品制备方法最终会将分析物置于有机物比例较高的溶剂中，例如从食品中萃取农药的 QuEChERS 萃取法，通常会将分析物浓缩在纯乙腈中作为进样溶剂。但在反相色谱中，乙腈的溶剂强度较高，因此溶解在纯乙腈中的样品很难保留在反相色谱柱上；这主要影响极性化合物。如果进样体积段在从进样器到色谱柱的过程中没有被流动相充分稀释，那么分析物到达柱头时就会处于非常非极性的环境中，从而导致柱头保留不足或根本无法保留。 这种影响在专为超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]和 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url] 分离而设计的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱仪[/color][/url]中尤为明显，因为这些系统经过优化，可将柱外扩散降至最低，以尽量减少色谱峰展宽，尤其是在使用相当小的色谱柱内径和低流速时。样品在进样器和柱头之间的低扩散性正好与样品溶剂与流动相的强混合性相反。这就会对早期洗脱的化合物产生各种影响，包括色谱峰变宽和扭曲（前沿），保留时间不稳定，甚至出现色谱峰分裂。 不过，这种影响可以通过各种方法来解决。最简单的方法是：减小进样体积。较小体积的色谱段更容易与毛细管中直至柱头的流动相混合，从而改善保留和峰形。这种方法还可用于检测所观察到的峰形扭曲是否是由溶剂不匹配引起的。其明显的缺点是，由于进样量减少，注入色谱柱的物质减少，从而降低了检测器信号的强度。 另一种方法是，在进行 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url] 分析之前，用水等弱溶剂稀释样品溶液。这一方面降低了溶剂强度，另一方面也降低了样品浓度，从而对信号强度和浓度敏感型检测器的检测限产生负面影响。此外，这还增加了样品制备的步骤，而且根据分析物的特性，如果样品溶剂的极性增加，降低了非极性物质的溶解度，还可能导致样品成分的部分沉淀。 为了在不对检测产生负面影响的情况下改善进入色谱柱过程中的体积混合，在进样器和色谱柱之间安装一个额外的混合元件是非常有用的。即使是一个仅含过滤片的过滤器，也能使流动相与样品体积段发生额外的混合，从而显著改善峰形，使保留时间更加稳定。 可能出现的任何额外的谱带展宽，大部分都会通过分析物在初始流动相组成中的柱头处重新聚焦（也称为色谱峰压缩）来补偿。在这里，只有混合体积对梯度延迟体积的贡献可被称为副作用。 然而，在 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url] 典型流速为 200-600 μl/min 时，10 至 30 μl 的混合体积对梯度延迟的影响微乎其微。一个技术上复杂得多的解决方案是将流动相的总流量分成两部分，并使用第二个泵或切换阀将总流量的较大部分输入进样器后面的流路系统。因此，样品量仅以总流量的一小部分进入进样器，然后将流量较大的部分加入进样器和分离柱之间。这一过程可有效稀释流动相中的样品。这种设计避免了梯度的额外延迟，但比之前的方法更昂贵，而且只适用于自动进样器中体积相对较小的管路。 此外，流量输送和梯度混合的精度也会对 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url] 的应用产生显著影响。究其原因，质谱仪通常无法以最高性能覆盖整个测量范围。与光学物镜类似，质谱仪要么扫描整个质荷比（m/z）检测范围，但这样就失去了细节的"聚焦深度"。或者，对可用 m/z 区域的个别部分进行高分辨率测量，但代价是忽略了全局。 这一事实背后的秘密在于，当今几乎所有常见的质量分析器都是作为质量过滤器工作的，它们按顺序扫描可用的测量范围，然后根据单个扫描结果重构整体图像。为了确保已知分析物的最低检测限（定量分析），定量分析的主要目的是将尽可能多的数据采集时间（驻留时间）专门用于目标化合物的质荷比（m/z）。在这种情况下，色谱分离的时间窗口会被细分为若干段，这些段落围绕相关化合物的保留时间进行分组，在这些时间窗口内，质谱仪仅以适用于目标分析物的质量滤波设置获取数据。根据仪器制造商的不同，这种操作模式被称为分段 SRM 或分段 MRM，广泛应用于串联 MS/MS 设备中食品安全污染物的痕量分析，例如水果、蔬菜或谷物中农药的测定。 实际上，在确定 SRM (MRM) 时间段的宽度以测量目标分析物的质荷比时，超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]系统的精密度现在发挥着经常被监督的作用。为了准确无误地测定色谱峰中的分析物浓度，色谱峰至少要有 10-15 个数据点。由于色谱柱内外的扩散效应，化合物区越宽，色谱图中的峰越多，洗脱物质的保留时间精度越差，因此必须选择更宽的 SRM 时间窗口来检测相关化合物。举例来说，最先进的低扩散超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]系统可提供低至 0.01% RSD 或更低的高精度保留时间，从而使定时 SRM 时间窗从传统 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url] 分析的 30 秒缩短到 10 秒以内，这对每种物质的数据点数量产生了积极影响。 然而，理论上听起来微不足道的问题，在实践中却对超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]泵的设计和操作提出了复杂的挑战。要在从每分钟几十微升到每分钟几毫升的宽流量范围内提供总流量以及保留时间精度为百分之几百的流动相成分，需要复杂的仪器和控制技术，其数据处理速率要达到千赫兹范围，以处理泵流路中压力条件的传感器值，活塞驱动装置中的精密机械可以在纳升范围内精确调整活塞的位置。 因此，目前的超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱仪[/color][/url]是真正的高科技仪器，其精密度远远超过著名的瑞士钟表。不过，尽管这类[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]系统的设计声称尽善尽美，但仍有两个未知变量有可能严重干扰这种微妙平衡的精密度，它们就是制造公差和不可避免的元件磨损。传统的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]分离通常以每分钟数百微升到数毫升的流速进行，这些干扰几乎不明显。但在[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-质谱分离中，总流量通常远小于 500uL/min，梯度仅从一种流动相组分的百分之几开始，并且/或者梯度斜率非常平缓，因此影响的大小会发生显著变化。 案例说明 让我们看一个实际例子来更好地理解这一点。无论制造商是谁，每个超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]泵的磨损部件都是：入口和出口单向阀以及密封环，它们将活塞和泵头密封起来，使其免受环境影响。明确地说：尽管制造商在市场营销中作出了各种美丽的承诺，但每台超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]泵都会泄漏。单向阀在微观层面上的密封性永远不会达到 100%。优秀阀门的典型泄漏率为每分钟几纳升，而磨损阀门的泄漏率则可达 400-500 nl/min。 活塞密封件也是如此，活塞密封件会随着时间的推移而磨损，磨损的原因是活塞摩擦力和充填时的机械变形；因此，活塞密封件的泄漏率显然也不是一个常数，而是会随着时间的推移而增加。因此，在泵送活塞腔的压缩物质时，并非所有的液体都会被推向色谱柱；有一小部分液体会通过泄漏回到溶剂管路或后密封清洗系统中，从而导致总流量不足。虽然对分离的影响因超高压[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]泵的设计原理而异。 二元高压梯度泵 (HPG) 通过两个泵头的相对流速来控制总流量和流动相成分。进出口阀门或活塞密封件上的微泄漏会导致总流量和所需溶剂成分偏离额定值。相反，四元低压梯度泵（LPG）只要其配比阀没有受到微泄漏的影响，则主要表现为总流量误差。在二元高压梯度系统上使用填料颗粒小于 2μm 的分离柱进行经典超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]分离时，这些微泄漏在实践中几乎没有影响。如果色谱柱在最佳工作点甚至更高点运行，这种分离的总流速可达 2 ml/min，甚至更高。在这种情况下，要产生 90:10(v:v) 的流动相成分，则泵 A 的流速为 1.8 ml/min，而泵 B 的流速为 200 μl/min。由于入口或出口阀门的轻微泄漏，两个泵之一的泄漏率为 100 nl/min，因此会产生 0.006% 的流量误差（如果微泄漏发生在泵 A）或 0.05% 的流量误差（如果发生在泵 B），这完全不会影响色谱结果。然而，更具挑战性的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-质谱分离可能需要以 200 μl/min 的总流量运行，并从梯度组成开始，有时两种流动相中一种成分的含量会低于 1%。在这种情况下，如果在泵 B 的入口阀门处出现 500 nl/min 的过高泄漏率，例如由于未充分净化的溶剂颗粒进入泵内，则 B 的流量误差已经达到 25%，这意味着泵实际上输送的流动相成分不是 99:1 (v :v)，而是 99.25 : 0.75。 因此，不仅测得的保留时间与参考值有差异。由于与磨损有关的泄漏率会随时间而变化，因此不仅保留时间与参考值的系统偏移令人担忧，保留时间的稳定性也会受到漂移的负面影响。特别是反相色谱中的强极性分析物（通常只在有机相比例极低的情况下保留）以及蛋白质或肽对超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]泵流量输送的微小波动非常敏感。超缓梯度斜率也是如此。有些蛋白质或肽类物质只需改变 0.1% B/min的流动相成分就能实现成功的色谱分离。 在我们的数字示例中，这意味着流动相的组成在 10 分钟内从 99 : 1 变为 98 : 2，这意味着两个泵头中每个泵头的流速变化为 200 nl/min2 ，总流量为 200 μl/min。由于单向阀密封不严或活塞密封件磨损，泵头中每增加一个数量级的微泄漏，都会对保留时间精度产生显著的负面影响。 与低压梯度泵相比，高压梯度泵由于其设计原理，受高压阀和密封件的微泄漏影响更大。然而，后者由于梯度延迟体积大等其他缺点，在 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LCMS[/color][/url] 分析中的应用非常有限，因此这里重点讨论二元 HPG。需要注意的是，如果错误仅发生在两个泵中的一个，则一系列色谱图的质量会受到更严重的影响。 简单地说：如果其中一个泵单向阀的泄漏率过高，而其他泵单向阀的微泄漏率非常接近，则会立即导致保留时间精度降低。如果所有阀门的微泄漏率相当接近，即使比通常情况下的泄漏率要大，保留时间的精度仍然会很高。只有相同型号的两个超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]系统之间的时间比较才会显示出系统误差，因为一个系统的微泄漏率一致较高，会导致总流量减少，从而分别导致保留时间延后。 那么，应对这些挑战的技术解决方案是怎样的，才能在总流量较低的情况下，满足缓梯度斜坡和极端混合的苛刻要求，实现所需的保留时间精度呢？ 事实上，有多种可行或不可行的方案可供选择。最简单的解决方案是：在超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]系统的制造和装配过程中就尽可能排除微泄漏。遗憾的是，这在实践中并不可行。每个单向阀、每个活塞密封件在制造过程中都会因材料特性和制造工艺而产生一定的尺寸公差。从尺寸的角度来看，每分钟几十或几百纳升的泄漏率变化与表面不规则或球阀理想球形的偏差在几百纳米的范围内有关。如果只安装完美密封的部件，任何超高压[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]系统都将难以承受，因为阀门和密封件的生产浪费以及测量和测试工作都将是巨大的。 另一种方法是对阀门和密封件等关键部件进行严格、密集的测试工作和过程控制；然后在每个泵中只安装微泄漏程度相似的部件。这同样会导致制造成本增加，令人无法接受。与其将仪器制造精度提高到不经济的水平，还不如接受不可避免的微泄漏这一事实，并通过适当的超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]泵和系统控制算法将泄漏的影响降至最低。 一种精细但合理且昂贵的设计方法是使用合适的传感器测量流体中的泄漏流量，并通过泵头中适当的流量输送修正来补偿由此产生的流量误差。一种相当简单、因此也很普遍的解决方案是，将泵工作活塞的位置与进样阀的进样时间同步，从一个[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff] LC [/color][/url]分离到下一个[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff] LC [/color][/url]分离。这种方法可确保泵在每次注入样品时始终处于相同的机械初始状态。从那时起，所有已知干扰都会对溶剂混合和总流量产生影响，从而在相同程度上影响色谱分离。因此，进样同步化并不会使泵的运行更精确，因为微泄漏造成的流量误差总和仍然存在；而只是泵现在总是产生相同的误差，且重现性显著提高，从而大大降低了保留时间的分散性。对于用户来说，这并没有什么不利之处，因为保留时间的准确性受更换分离柱或更换到另一个超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]系统的影响更大。从质量和验证的角度来看，更重要的是保留时间的精密度，而这种进样同步化可大大提高保留时间的精密度。 总结 [/color][/size][/font][font=Tahoma, Helvetica, SimSun, sans-serif][size=18px][color=#444444]用高度优化的低扩散超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]系统分析溶解在强溶剂中的样品时，可能会出现峰形或保留时间不稳定的问题，尤其是对于早期洗脱的化合物。在分离柱前增加混合体积会有所帮助。质谱仪可从高精度超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]设备中获益，由于保留时间精度更高，分段 MRM(SRM) 模式下的数据点数量也更多。 超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]泵中无处不在的微泄漏可能会对保留时间精度产生明显影响，尤其是在超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-质谱分离中。通过定期系统维护、使用高纯度溶剂以及先进的泵控制机制，可以最大限度地减少这种影响。[/color][/size][/font]

[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=71347]快速梯度HPLC分析[/url]在对组合化学合成化合物库的分析中，为了提高分析通量，要求HPLC系统能够快速、稳定、重现地进行梯度洗脱。以达到快速分析的目的。 本文报告了应用吉尔森HPLC系统，短色谱柱（3.9 x 20 mm）准确、快速的梯度洗脱系统进行样品分析的结果。每个色谱过程在5分钟内完成。

[align=center]开发了一个梯度方法，当我在我的系统上运行它重复性很好，但我不能在另一个系统上得到相同的结果？[/align]当梯度法从一个高效液相色谱系统转移到另一个系统时，偶尔会出现一些困难。除非系统完全相同，否则用户通常会在保留时间上发生一些变化。大多数情况下，留存率的变化不会影响到解决方法的效果，人们通常可以忽略这些差异。另一方面，通过对潜在原因的正确理解，我们可以调整梯度，以从不同的HPLC系统获得相同的性能。梯度驻留体积：它是梯度混合点和柱顶之间的体积。在你通过注入样品开始分析后，梯度将不会到达柱的顶部，直到梯度停留体积被清除。这意味着你的样本最初要经历一段等稳迁移的时期，直到梯度赶上。由于不同系统的梯度停留体积不同，这种等稳偏移时间也会不同，可能导致滞留时间的差异，甚至影响分辨率。另一种可能是梯度本身。系统与系统之间可能存在组成差异。对于今天生产的大多数HPLC系统，这应该只是次要的问题。但是，一般来说，任何梯度系统都能在成分的中间范围，即50% a和50% B的混合物中，提供具有最高准确度的成分。当非常不成比例的a和B混合时，例如5% a或95% a，准确性就会受到影响。[align=center]哪些可能导致我的方法传输问题?[/align]最简单的事情是比较你的梯度两个系统。为了做到这一点，你断开色谱柱，并在梯度的b溶剂中添加紫外线吸收剂。如果你使用的是反相体系，你可以在b溶剂中加入10mg /L的对羟基苯甲酸丙酯。然后在两个系统上运行渐变并记录基线。然后将这两个情节相互比较。你需要找到梯度开始的点，你还需要测量梯度剖面。如果你的梯度是线性的，那么你只需要检查梯度的斜率。很有可能你会发现两种仪器之间的梯度开始是不同的，而轮廓是非常相似的，只是被一些时间抵消了。在这种情况下，你有一个不同的梯度停留体积。[align=center]是否有一种简单的方法来补偿驻留体积的差异?[/align]有一个解决方案大多数时候都是有效的。如果梯度停留体积在你的方法转移到的系统上较小，你可以通过在梯度开始时设计一个补偿体积差异的等稳部分来补偿停留体积的不足。剩下的梯度保持不变。另一方面，如果第二个系统的梯度停留体积比第一个系统的梯度停留体积大，则情况更困难。原则上，您可以启动梯度，然后在延迟一段时间后注入样品，这段时间可以解释两种系统之间梯度停留体积的差异。但在自动系统上，这可能是不可能的，因为注入会触发梯度的开始。在这种情况下，您可能需要回到原点并重新开发该方法。[align=center]我能做什么来防止这种情况在未来发生?[/align]您可以通过为最终将使用该方法的HPLC系统开发该方法来避免这种情况。这需要一些远见和一些计划，但通常不是不可能的。您首先需要做的是描述可能用于您的方法的系统。对于每个系统，你需要知道两件基本的事情:梯度驻留体积和合成精度。你可以在一个实验中得到这两个信息:如上所述，你在你的b溶剂中添加一个紫外线吸收剂。然后你在0% B到100% B的增量5%的多个步骤梯度。流量应该是通常使用的流量，所以最有可能你将使用1毫升/分钟的流量。步骤之间的间隔应该是几分钟，或者5分钟。现在在不同的系统上运行这个梯度，而不需要一个柱，并记录检测器的响应。为每一步编程的时间和实际发生的步骤之间的时间延迟给你梯度延迟时间。台阶的高度给了你构图的一个度量。步骤会被抹去一点，这是系统中混合体积的函数。现在您已经确定了系统的特征，您可以围绕系统的特征设计您的方法。正如我之前提到的，最大的问题通常是渐变驻留体积。如果您知道需要转移您的方法的系统比开发您的方法的系统有更大的驻留体积，那么您应该在您的方法开发中自动添加一个等稳步骤，以补偿这种差异。如果目标系统的驻留体积小于开发系统的驻留体积，那么您应该能够通过在转移方法时在方法的开始部分添加一个梯度延迟时间来简单地补偿这一点。如果在渐变过程中存在组成差异，你也可以通过调整渐变轮廓来弥补这些差异，但我从来没有遇到过这种情况。本讨论假设柱与起始流动相处于完全平衡。我偶尔会遇到这样一种情况，在常规分析中，梯度彼此跟随得如此之快，以至于柱在起始流动阶段永远不会恢复平衡。你会发现，如果你的第一个梯度总是给出不同于后续梯度的结果，你就会遇到这种情况。这可能有利于加快方法的速度，但当将该方法转移到具有不同驻留体积的另一个系统时，这可能会造成困难。

[img]https://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09512.gif[/img]安捷伦自动进样的高效液相如何不进样运行梯度洗脱程序？应该不是进流动相吧？大神们有何见解~

99年的分析液相，老板不知道怎么想的前两天给配了一个自动进样器现在全部由电脑控制了说实话用不习惯的话还不如之前手动方便，又吵等度可以跑问题是现在我新建立一个方法，如一段时间内梯度洗脱，程序都设好了方法也保存了，但是用该方法分析样品时，泵不按照我设定的梯度跑刚开始就变成A：0.95mL/min，B：0.005mL/min这个比例我并没有设置试了2天了，还是这样 咋整啊？有人用过没有，谢谢指点

各位同仁，我现在想配液相色谱仪，做化验用，工作量大，包括自动进样，四元梯度洗脱，柱温箱，全波长扫描检测器，脱气系统，中文工作站。我要从三个厂家waters，agilent和岛津中选一个，想买一个比较新的型号，请大家帮忙，从价钱和性能上，比较一下，哪个厂家哪个型号的更号，最基本要求是结实，耐用。精度，重现性，稳定性等其他方面的性能还请各位帮忙评价，谢谢!

戴安双三元梯度系统在一个仪器箱内放置两套三元梯度泵，通过共用自动进样器、柱温箱、软件和电脑达到两套分析系统的功能，两套泵可以并联或串联使用，无论流速范围是常规分析（10ml/min）、微量分析（2.5ml/min）还是纳升级分析(50nl/min)，双三元梯度泵均可满足需要。 1、双三元就是可以同时配制六个流动相，现有的标准有哪一个要使用的到双三元的？2、它的便利你在工作中用的上吗，技术上的每一次改进你觉得都能让你工作更有效率，更轻松吗？3、这款仪器到底适合于常规分析型用还是制备用？4、其泵的精密真的如它所说，比一般的四元梯度有很大的提升吗？也许它的温柔到现在还有很多人不懂！

大家好！我做的一个实验是梯度的，30：70的甲醇和水0-18Min变为100甲醇.以前都没出现什么问题，空白（进空针走流动相）一直都很好，很干净。这星期做突然在13min左右出现两个鬼峰，延迟时间到25分钟时，20分钟左右也有很高一个鬼峰。而且不管进多少针基本没有变化。样品，标品里也都一样。分别换了甲醇和水情况还是一样，没有变化。有哪位大虾出现过类似情况，帮助一下？

梯度程序检有关物质，主峰的位置也出梯度峰，影响自身对照的面积，不知道啥原因，请各位大侠帮忙看看是啥原因导致的啊

岛津双泵液相 梯度分析 32分钟出现鬼峰（以前没有的 最近出现了）排除了柱子 保护住 进样器的问题 鬼峰一直都在 现在怀疑是泵不稳定 谁有检测梯度准确性的方法 用什么标准样品 走个什么标准程序。

[align=center][b][size=15px]梯度的缩放[/size][/b][/align][size=15px]问题：我在150 mm x 4.6 mm色谱柱上开发了一个洗脱方法。但是有两个相邻杂质峰分离不好，我希望用250 mm 柱长的色谱柱来解决这个问题。但是，当我使用250 mm 的长柱时，得到的结果却不尽人意：这两个相邻杂质峰的分离度更差，而且其他的杂质峰洗脱顺序也发生了一定变化。但是色谱柱的生产商告诉我这两种长度的色谱柱的填料是一样的。为什么会出现这种问题呢？[/size][size=15px]回答：如果15 cm和25 cm色谱柱中的填料确实相同，那使用更长的色谱柱，各杂质峰应该得到相同的分离，且具有更高的分离度。但您测试时，其他的杂峰的洗脱顺序发生变化，说明两个色谱柱中的填充剂不相同。但是因制造商坚持认为两根色谱柱的填料来自同一批次，并且由于您已经使用15厘米色谱柱已有一段时间，因此您这个问题，要怀疑在您的方法开发过程中该15cm的色谱柱在已经老化，已不能代表该型号色谱柱填料。这种情况并不少见，并且通常是色谱工作者感到严重挫败的原因。因此，我始终建议进行方法开发及方法验证时使用新的色谱柱。[/size][size=15px]问题：我还有另外的相同填料的15cm的色谱柱，当我运行相同的梯度时，在另外一根相同填料15cm的色谱柱上各峰的出峰情况与我已使用的这一根一致。这说明我使用得这根色谱柱并没有老化，不是吗？[/size][size=15px]回答：确实有这个可能。不过您说您使用的是梯度方法，这使问题变得复杂化。你如何将这个梯度方法从短柱上转移至长柱上的？[/size][size=15px]问：我没有把梯度方法进行缩放，而是在短柱及长柱上用了相同的梯度程序、相同的流速及相同的运行时间。[/size][size=15px]答：这很可能就是原因所在。当在不同的色谱柱上使用梯度方法时，梯度体积应与色谱柱体积成比例地缩放，以使具有相同洗脱结果。当然，与等度色谱法一样，这会增加色谱柱的分析时间。由于系统死体积，还会发生一些其他复杂情况。在下文中，我将更详细地讨论梯度方法的缩放比例。[/size][size=15px]为了能够在不同色谱柱之间获得相同的梯度分布，应与色谱柱体积成正比地改变梯度体积。如果想在15 cm的色谱柱与25 cm的色谱柱上获得相同的洗脱结果，在两根色谱柱具有相同的内径前提下，使用较长的色谱柱时，您的梯度体积应大25/15 = 5/3。如果在两色谱柱上都保持相同的流速，则梯度持续时间和其他梯度事件时间应相应增加5/3。[/size][size=15px]当更改色谱柱直径时，也要遵循与色谱柱体积成比例地缩小或放大梯度体积的规则。如果要将梯度从150 mm x4.6 mm的色谱柱缩放到150 mm x 3 mm的色谱柱，则应将梯度体积减小2.35倍。通常，这将是必然的选择，因为无论如何您都正在减少与柱体积成正比的流速。在这种情况下，您可以使梯度曲线保持恒定并获得（与更换柱子之前）相同的结果。[/size][size=15px]到现在为止，所有计算都假定您使用的仪器的死体积可以忽略不计和/或对分离没有影响。通常，这种计算方式适用于在梯度后期洗脱的保留良好的化合物。但是，对于前期洗脱的化合物而言，并不一定是这种情况。在常用的单泵梯度系统中，梯度是在泵的低压侧产生的，而在较旧的系统中，会明显的延迟梯度到达色谱柱前端的（时间）。此梯度方法中这一段的死体积，可能会影响前期洗脱化合物的洗脱模式。更改色谱柱尺寸时，梯度方法的死体积与色谱柱体积的比率应保持恒定。不幸的是，当想要将梯度从较大体积的色谱柱缩放到较小体积的色谱柱时，这种计算方式的转化可能存在较严重问题。幸运的是，您希望将梯度从体积较小的柱子放到体积较大的柱子上，从而简化了这种情况。[/size][size=15px]为了调整梯度的延迟（使前后一致），首针需要测量仪器的死体积。最好在没有色谱柱的情况下，测定少量的具有紫外吸收的化合物（例如用甲醇作为溶剂的1％丙酮），以1 ml / min的流速从甲醇到甲醇运行一个阶梯梯度，以达到最佳效果。测量梯度程序从开始变化到变化至终浓度一半的时间，再成倍调整流速运行，通过对比流速调整前后的时间的变化就可以计算出仪器的死时间。在使用体积较小的色谱柱时，由于这个死体积会使我们设定的梯度程序上延迟到达柱前端，因此，我们需要以相同的比率（死体积/柱体积）在较大的色谱柱上进行推迟梯度，以得到完全相同的梯度曲线。例如，如果使用150 mm x 4.6 mm色谱柱时系统的死体积为1 ml，则对于250 mm x 4.6 mm色谱柱应为1.66 ml。因此，在充分考虑了150 mm色谱柱和250 mm色谱柱上获得的实际梯度分布差异后，我们需要为250 mm色谱柱的梯度程序在开始阶段先加上0.66 ml的等度运行。完成此操作后，两根色谱柱均获得相同的洗脱曲线。[/size]

AC-174铺板和栏杆系统跨度梯度验收标准

很少用到梯度洗脱，请教个问题，可能没有实际意义只是有点想不明白自动进样，如果样品运行时间和梯度设置的周期不一样的话，比如运行时间10min，而一个周期设了20Min,那么仪器是如何工作的呢，是梯度走一半继续下一针呢，还是进下一针时还在运行上一个余下的梯度呢，相反恩如何运行时间长而周期设短了呢，还有最后一个指令结束后是一直按照最后的条件走吗

走梯度时候，进5个空白，都不重复，形状不重复，是什么原因呢？领导说是系统不平衡，也没具体说什么我都平衡50min了，应该够了吧柱子是新柱子头几天走还好好的蛮重复的

请教 高压梯度和低压梯度应用场合有什么不同？ 具体地说，某一项分析如果采用高压梯度，是不是一定也可以采用低压梯度呢？ 或者仅仅是经济条件方面不同呢？双泵的高压梯度和低压梯度仪器配置，资金相差大约有多少？

HPLC 低压四元系统，色谱条件：乙腈-水=5：95，经过15分钟梯度变化到85：15，等度5min检测波长：216，254nm柱温30flow：1.0ml/min空白进样时（接色谱柱），在乙腈比例达到80~85时出现鬼峰，峰高1~2mau；重复进样，重复出现（216波长明显）。空白进样（不接色谱柱或以背压管替代），无此现象出现；更换色谱乙腈（optima级）和 超纯水（milli-Q级），问题依然存在。请各位老师帮忙分析判断一下原因！

如题：在梯度洗脱的时候，需要用初始比例冲洗，使系统回复到初始状态，请问这个梯度周期的平衡时间一般是多少？有不少人说要用10~30的柱体积平衡，但是一般15cm*4.6mm的C18的一个柱体积是2.5mL，假如要用10个柱体积，用1mL/min的流速冲洗那不是起码半小时？难道每次进样后都平衡半小时才走下一个样？有点不符合实际，想问一下大家一般用多长时间平衡再进下一个样的？