高效基因转染系统

NEPA21高效基因转染系统技术研讨会【北京站】 经过近30年的发展革新，电转染已成为基因的功能研究领域中不可或缺的技术手段。华粤行仪器有限公司作为中国独家代理商，携手来自日本的NEPA GENE公司举办巡回技术研讨会，介绍该领域的最新进展。诚邀各位专家学者莅临指导！ NEPA GENE公司专业研发、生产细胞电转染仪及电融合仪等，其生产CUY21系列电转染仪在研究领域中久负盛名，已被数百篇文献引用，其中不乏高水平杂志的文章，如Nature、Cell、PNAS、Genes & Dvelopment等。 2011年，NEPA GENE推出新一代全能型高效基因转染系统NEPA21。其特点有： 全新设计的电转程序， 特别适用于难转染细胞、离体组织或动物活体的转染， 高转染效率、高细胞存活率 电转程序各项参数可见、可调，适用性广 不需要特殊的转染试剂盒辅助，运维成本低 时间：2011年10月10日下午13点 地点：北京外国专家大厦二层第5会议室（朝阳区北四环中路华严北里8号院） 演讲人：早川靖彦 先生（NEPA GENE株式会社社长 暨首席技术专家 ） 宫村敦 先生（NEPA GENE 海外营业部经理 暨产品应用专家） 主持人：罗菁 博士（华粤行仪器有限公司 产品经理） 举办方：华粤企业集团有限公司&mdash 北京分公司 联系电话：总部 020-34821111 北京 010-58772915

水牛是一种分布于热带和亚热带气候条件下的一种家畜，可为人类提供奶、役力和牛肉。全世界水牛总数约为15.8亿头，亚洲存养的水牛数占世界的97%。 由于其经济效益和应用价值，繁殖动物学家需要对牛、羊等大型动物进行研究。近年来，转基因经济动物，如转基因牛、乳腺发生器等研究非常热门。但牛不是一种常规实验室的模式生物，所以在细胞转染和基因改造时，可参考的经验不多。 文献表明，脂质体转染法对水牛细胞的转染效率不高，常规的电穿孔仪常带来较高的细胞死亡率、且转染率也不理想。一些新型的电转染仪，虽然能为许多难转染的细胞带来福音，但其转染试剂盒多针对人、鼠等动物开发，没有专用于牛的试剂盒。 NEPA21不需要转染试剂盒，利用优化的程序即可达到高的转染效率，为水牛甚至其它经济动物的转基因研究带来了便利。 2012年4月，华粤行仪器有限公司在广西大学展开水牛胎儿成纤维细胞的转染试用活动，获得了较高的转染效率和细胞存活率。实验者对NEPA21的转染效果给予了较高的评价。 GFP标准质粒转染水牛胎儿成纤维细胞效果图

神经元（Neuron）是一种高度特化的细胞，是神经系统的基本结构和功能单位之一，它具有感受刺激和传导兴奋的功能。 通常来说，神经元细胞属于终末分化细胞，属于非常难转染的细胞类型。文献表明，传统的转染方法，如脂质体法对于原代神经元细胞转染效果不佳，而一些新型的电转染仪，虽然能为神经元细胞带来福音，但需要使用专门的神经元细胞转染试剂盒，且对神经元细胞的原位贴壁转染仍然束手无策。 NEPA21不需要转染试剂盒，利用优化的程序即可达到高的转染效率；配备专用的贴壁电极，可完美实现神经元细胞的原位贴壁转染，为神经元细胞的转基因研究带来了便利。 2012年6月，华粤行（我司）在山东大学开展了原代大鼠大脑皮层神经元细胞的试用活动，针对原代神经元细胞，进行了悬浮转染及原代贴壁转染，均获得了较高的转染效率和细胞存活率。实验者对NEPA21的转染效果给予了较高的评价。 GFP标准质粒转染原代神经元细胞（悬浮转染）效果图 GFP标准质粒转染原代神经元细胞（原位贴壁转染）效果图 附：我司在合作实验室陕西东澳生物使用NEPA21进行的原代海马神经元原位贴壁转染效果 GFP标准质粒转染原代大鼠海马神经元细胞（原位贴壁转染）效果图

2012年1月，华粤行仪器有限公司（我司）与合作实验室（陕西东澳生物科技有限公司）联合对NEPA21高效转染系统进行测试，成功进行了Hela细胞悬浮转染及U87细胞悬浮和贴壁转染，均获得很好的效果，客户对NEPA21给予了较高的评价。 实验证明，在国内实验条件下，可重复获得NEPA GENE公司（日本）细胞数据库中提供的高转染效率及高细胞存活率结果。 实验亦证明，细胞在悬浮和贴壁状态下使用NEPA21进行转染，均可获得高转染效率。 技术资料： 1. 关于悬浮转染： 使用电转染仪进行细胞转染时，常用的转染方式是用电转杯转染，此时细胞处于悬浮转染下，细胞可与DNA溶液360度接触，转染效率最好。 2. 关于贴壁转染 有些原代细胞是终末分化的，如原代神经元细胞、乳鼠心肌细胞等。这些细胞一旦从活体组织中分离出来贴壁培养，便不可消化传代，也就无法实现悬浮状态的转染。针对这种情况，NEPA GENE开发了适用于普通细胞培养板的贴壁转染电极。 由于贴壁状态下，细胞不能与DNA溶液360度接触，因此通常认为，细胞在悬浮状态下转染，容易获得更好的转染效率。但实际上，NEPA的贴壁（原位）转染电极效果也很显著。

2008年3月31日，服务科学，世界领先的赛默飞世尔科技正式宣布在RNA干扰技术领域取得突破性进展，成功开发出一种最简单的沉默基因的新工具。此产品空前克服了由于细胞转染问题所带来的基因沉默效率不佳的障碍。推出此产品旨在加速包括神经科学、免疫学、干细胞研究和肿瘤学等生命科学领域的科学研究和药物研发的进展。 此产品正式命名为Thermo Scientific Dharmacon Accell siRNA，它是一种全新的siRNA，可不借助任何传统转染介质（比如转染试剂、病毒载体和电转等）而被直接吸收进入细胞。目前已完成对50多种常见细胞株的测试，Dharamcon Accell siRNA均能有效进入细胞并高效沉默靶基因。 RNAi已经成为一种强大的研究工具被用来沉默或者降低靶基因和靶蛋白的表达，从而揭示这些被沉默分子在生物学通路和疾病发生中的重要功能。深入了解基因功能对于药物靶点的研发至关重要。 应用传统的方式转染那些非常难转染的细胞诸如原代培养细胞、悬浮细胞、干细胞和神经元细胞等，往往转染效率低下并会引发细胞死亡。Dharmacon的Accell siRNA是目前唯一一种不凭借任何转染介质即可高效渗透进入细胞的siRNA分子。若将Dharmacon Accell siRNA和SMARTvector shRNA相结合，这将是目前在生物化学和药物研究中最有效的基因沉默工具，研究者可以借此大大加快在人类健康方面的研究步伐。 Dharmacon Accell siRNA只需要简单的和专用的培养基混合，然后添加到到培养细胞即可完成整个转染操作。这是目前最简单的一种操作，只需两步操作，既高效经济又方便省时，并且可以避免实验操作所导致的细胞毒性效应和传统siRNA转染方法所引发的“off-target”效应。 应用传统的转染方法往往面临复杂的转染优化程序，并且适合转染的条件比较狭窄。而Dharmacon Accell siRNA则可以不用任何优化即可进入细胞并达到高效的基因沉默效果。同时由于不使用任何转染试剂，所以可极大地简化RNAi的操作并降低脱靶效益。 Dharmacon科学研发团队的数据显示，在细胞传代中如果反复使用此产品可以持续沉默靶基因达30天之久，而这些都是传统siRNA无法完成的工作。 关于此产品详细信息，请您登陆了解http://www.thermo.com/dharmacon了解。 关于赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific，原“热电”公司) Thermo Fisher Scientific（赛默飞世尔科技）（纽约证交所代码：TMO）是全球科学服务领域的领导者，致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。公司年销售额超过100亿美元，拥有员工约33000人，在全球范围内服务超过350000家客户。主要客户类型包括：医药和生物公司，医院和临床诊断实验室，大学、科研院所和政府机构，以及环境与工业过程控制装备制造商等。公司借助于Thermo Scientific和Fisher Scientific这两个主要的品牌，帮助客户解决在分析化学领域从常规的测试到复杂的研发项目中所遇到的各种挑战。Thermo Scientific能够为客户提供一整套包括高端分析仪器、实验室装备、软件、服务、耗材和试剂在内的实验室综合解决方案。Fisher Scientific为卫生保健，科学研究，以及安全和教育领域的客户提供一系列的实验室装备、化学药品以及其他用品和服务。赛默飞世尔科技将努力为客户提供最为便捷的采购方案，为科研的飞速发展不断地改进工艺技术，提升客户价值，帮助股东提高收益，为员工创造良好的发展空间。欲了解更多信息，请登陆：http://www.thermofisher.com/

Invitrogen&trade 转染新技术产品"新品半价优惠" 您正在做转染实验吗？ 您还在为转染实验的细胞毒性大、转染效率过低、蛋白表达受限而苦恼吗？ 作为全球转染技术的领导者，Invitrogen公司为您准备了转染实验全套解决方案，除了Lipofectamine&trade 2000、293fection 等经典转染试剂，我们还带来了最创新的技术及产品，快来试一试心仪的产品吧！！！ Invitrogen&trade 转染新技术产品介绍: Lipofectamine&trade LTX & PLUS&trade 试剂&mdash 贴壁细胞推荐转染试剂 Lipofectamine&trade RNAiMAX 转染试剂&mdash 专用于siRNA 转导的转染试剂 Neon&trade 电转染系统&mdash 高效介导质粒 及siRNA转染入原代细胞、干细胞及其他难转染细胞 转染实验相关技术及产品选择指南 Invitrogen新技术转染产品 半价优惠 促销时间：即日起至2011年6月30日 购买新新技术转染产品－Lipofectamine LTX及RNAIMAX的新品小包装产品，即可享受半价优惠，（每个实验室限购2支）促销列表： 货号 产品描述 Size 报价（元） 促销价(元) 13778100 LIPOFECTAMINE RNAIMAXh 0.1ml 702 351 A12621 LIPOFECTAMINE LTX AND PLUS SAM 0.1ml 515 258 注： 每种产品，每个实验室限购两支，您还可以通过填写Invitrogen转染产品试用&Demo申请表，获取免费试用新技术转染产品的机会(截至日期2011年7月30日)。

如何将多种生物分子(如DNA，siRN和肽)原位转染进入原代细胞和难转染细胞成为许多科研工作者面临的挑战，传统的电穿孔转染仪是通过将高压电脉冲直接作用于细胞悬浮液上，这就不可避免的造成很大部分细胞的损伤或未被转染。而新一代的基于自适应式电穿孔转染则是通过将精确控制的电流作用于生长在微孔膜上的单层细胞来完成的，同时利用电注射技术，在精确控制的电场作用下将带电荷的分子主动导入细胞，使其在被高效的被转染的同时依然保持着极低的细胞死亡率。 中国科学院广州生物医药与健康研究院 五洲东方新一代原位转染技术交流研讨会现场 4月1日五洲东方公司（www.ostc.com.cn）在广州市中科院广州生物医药与健康研究院举办新一代原位转染技术交流研讨会。研讨会针对目前细胞转染中常见的问题，不同的转染方法的比较，新一代原位转染仪的特点与优势，利用新一代原位转染仪iPorator成功案例分享等方面进行了全方位的探讨交流，新一代原位转染仪iPorator得到多个实验室到会人员认可并留下试用。 实验楼 新一代原位转染仪iPorator凭借着高效率、低损伤、低干扰的电转染技术正在逐步进入广大生命科学领域的实验操作平台。 更多实验室最新技术与仪器新品请关注五洲东方官方微博：http://e.weibo.com/ostc

继2013年上半年在全国范围内举办CUY21 EDITII电转化仪的免费试用活动大获成功之后，应广大客户要求，我司于今年10月份开始，再次举办大规模的免费试用活动。这次携手单位包括清华大学，中国科学院系统各所。截止至目前为止，已为客户演示实验多达50多次，覆盖细胞、活体种类多达30种之多，比上半年翻了一倍。此次演示实验大多是极难转染的细胞种类，如NIH/3T3、NG108-15、raw264.7、SSC、Sertoli、HepG-2、HEK293、N2a、A549、K41、LN229、PC3、LCL、CHO、NIT1、EAhy926，原代小鼠胚胎干细胞以及细胞系，原代小鼠β胰岛细胞团等。 试用活动覆盖多个学科领域。CUY21EDIT II对比脂质体转染，具有显著提高转染效率的特点；对比慢病毒转染，更是克服了对细胞产生毒性，进而影响后续实验开展的弊端。CUY21 EDITII独有的性能优点，特别是恒流转化模式，为那些极难转染的细胞另辟蹊径。 以下举例部分细胞转化效果图。随着试用工作的进一步开展，相信有更多用户能够体验到这款超级仪器带来的神奇转化效果。如需更多转化protocol或转化效果图，请联系我司各地办事处。 HepG-2细胞转染效率达近98%，存活率达98%（中国科学院动物所提供）NIT1小鼠胰岛瘤β细胞转化效率约达100%，存活率约100%（中国科学院遗传所提供） 极难转染的精原干细胞(spermatogonialstemcells,SSC)转化效率达50%小鼠胚胎干细胞细胞系转染效率达到75%中国科学院动物所提供上海同济大学提供 CUY21 EDIT II 超级多脉冲细胞-活体基因电转化仪 超强机器，超级性能----全球同步上市………… CUY21EDIT II超级多模式定电流活体/细胞基因电转化仪是日本BEX公司2012年10月发布的具有里程碑意义的产品。采用最先进的脉冲芯片控制技术，首次实现了恒电流输出转化，并可根据样品差异进行多脉冲选择。超强的脉冲模式，不需要特殊转染试剂即可高效神奇的转染难转细胞及活体。 关于BEX公司BEX公司成立于1990年，是活体转基因技术及细胞融合技术全球领导者。BEX研发制造在转基因领域最为著名的CUY21电转化仪以及LF系列细胞融合仪。BEX公司于1998年全球发布第一台CUY21EDIT专业活体基因转化仪，从此开创了活体基因转化的新时代，奠定了CUY21做为全球唯一公认的专业活体/细胞转基因仪器，已有2000余台CUY21全系列转化仪服务于全球科研工作者，发表于Nature,Cell及Science等顶级杂志的文献高达数百篇。 国内独家代理商：北京倍辉科技有限公司 www.bio-sun.com.cn info@bio-sun.com.cn

欧洲分子生物学实验室研究人员Moritz Kueblbeck, Andrea Callegari等在bioRxiv分享了一项基于CRISPR方法优化的技术文章，目的在于提升从基因编辑产生的细胞中筛选纯合子的效率。众所周知，使用CRISPR精确敲入 (knock-in) 外源性DNA后，产生的基因编辑克隆需要严格的筛选才能得到目的克隆（纯合子）。基于常规PCR和Southern Blot检测目的克隆的方法耗时长、需要大量劳动力。因此研究人员对传统方法进行了优化，采用荧光标记蛋白和naica数字PCR联合的方法，精准快速的实现了基因编辑后目的克隆的筛选，大大降低了检测的人力、物力、时间成本。亮点：☑ 采用数字PCR和荧光标记的方法，可以在基因组编辑的早期阶段进行检测，整个流程只需要大约3-4小时即可获得结果，能够及时停止“不理想”的编辑克隆的培养，节省人力物力成本。☑ 数字PCR方法只需要检测少量的细胞，相较于Southern Blot大大减少样本制备时间。☑ 基于naica® 微滴芯片数字PCR系统的多重检测能力和Crystal Miner软件的荧光补偿校正功能，能够快速、可靠的对CRISPR编辑细胞进行定量筛选检测。文章内容分享背景原理介绍：CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），规律间隔成簇短回文重复序列，是一种RNA引导的基因组编辑技术,能对基因进行精确性敲除,敲入,替换等,从而实现探究基因功能,修复致病基因等目的。但是，CRISPR技术也会导致有潜在危险的“脱靶”问题，带来不可预测的基因变化，因此对于CRISPR基因编辑的脱靶情况需要灵敏且精准的验证及检测。▲CRISPR结构示意图研究目的：提升从基因编辑产生的细胞中筛选纯合子的效率。传统方法筛选目的克隆的局限性：基因编辑后，筛选纯合子的方法是生成杂合克隆后，通过轮次迭代产生纯合子，整个过程耗时甚至能长达一年，且容易发生脱靶修饰。使用常规PCR区分纯合克隆和杂合克隆的方法只能检测到目的基因，还需要金标准Southern Blot检测脱靶整合的情况，然而，Southern Blot是一种耗时且低通量的技术，需要相对大量的基因组DNA和细胞材料，这些材料的制备会浪费大量的时间和人力成本。优化后的新方法：针对上述问题，Moritz Kueblbeck等人优化了CRISPR的实验流程，改进了CRISPR的转染效率，通过添加荧光标签蛋白实现CRISPR编辑的克隆菌落中相关标记蛋白的正确亚细胞定位，并通过dPCR 来定量目的基因和脱靶基因组编辑事件。通过该方法，快速、可靠的对荧光标记CRISPR编辑细胞进行了定量筛选。【见下图】▲Moritz Kueblbeck等人优化的CRISPR纯合子筛选实验流程▲PCR进行两种细胞系中的标签基因检测。U2OS- TPR-SNAP标签基因整合总数检测 （左）；HK- Nup93-mEGFP标签基因整合总数及目的标签基因检测（右）。矩形图代表克隆，每个红点代表一次测量结果。对于多重荧光检测实验，进行荧光溢出的补偿校正是十分必要的。本研究使用naica® 微滴芯片数字PCR系统进行多重检测，并使用Crystal Miner软件进行荧光补偿校正分析，确保每一个荧光基团被单一检测通道捕获，得到的结果精准可靠。如想对荧光补偿校正有更多了解，请复制下方链接地址到浏览器进行查看：http://dx.doi.org/10.1016/j.bdq.2016.10.002原文链接如下：https://doi.org/10.1101/2021.06.23.449557CRISPR WEBIANR相关视频链接：▲点击上方图片观看相关视频naica® 微滴芯片数字PCR系统法国Stilla Technologies公司的naica® 微滴芯片数字PCR技术在进行核酸检测时具有独特的优势。系统利用cutting-edge微流体创新型芯片—Sapphire芯片（或高通量Opal芯片）作为数字PCR过程的唯一耗材。样品通过毛细通道网格以30,000个微滴的形式进入2D芯片中。3色荧光检测仪器，整个流程只需要两个半小时，并可进行数据的质控和结果追溯分析，获得的数据真实可靠。

成果名称 低压直流细胞电穿孔微流芯片系统 单位名称 北京大学 联系人 马靖 联系邮箱 mj@labpku.com 成果成熟度 □研发阶段 &radic 原理样机 □通过小试 □通过中试 □可以量产 成果简介： 电穿孔（电转染）是一种利用外加电场击穿细胞膜，使平时不能穿透细胞膜的大分子(核酸、蛋白质、药物等)进入细胞的技术。电穿孔技术已在细胞实验、基因治疗等领域广泛应用。但目前的技术均需要金属电极，金属电极产生的金属离子渗出、气泡等对细胞有不利影响，降低了转染效率。此外，高压脉冲电源的使用使得目前此类仪器操作复杂、价格居高不下。这些都大大限制了电穿孔技术的广泛应用。针对上述问题，北京大学工学院熊春阳课题组采用微流芯片技术，实现一种不需要微电极，仅利用简单低压直流电源即可实现的细胞电穿孔技术。这一技术将大大降低仪器制造成本，简化操作流程，并可以进一步发展为高通量、高效率的细胞电转染系统。 2009年，熊春阳副教授申请的&ldquo 低压直流细胞电穿孔微流芯片系统&rdquo 项目得到了第二期&ldquo 仪器创制与关键技术研发&rdquo 基金的支持。课题组利用微流体中因尺度效应而产生的层流，用高电导率的液体来代替电极，将细胞悬浮液通过流动聚焦技术夹在高电导率溶液之间，形成三个平行流动的稳定流层。通过将电极与两侧的高电导率溶液相连，再与直流电源相连，电压会大部分施加在中间电阻较大的细胞流层。由于微流尺度较小，即使很低的电压都可产生较大的场强，从而可以实现细胞电穿孔。 这项工作在基金的支持下得以顺利的推进，通过相关设备的购置和实验测试，课题组完成了微流控芯片的设计和加工、液体导电层的引入、不同类型细胞电转染参数的优化等工作。该项目目前已经顺利结题，相关成果已经申请中国专利，正在申请国际专利。 应用前景：该项目实现一种不需要微电极，仅利用简单低压直流电源即可实现的细胞电穿孔技术。这一技术将大大降低仪器制造成本，简化操作流程，并可以进一步发展为高通量、高效率的细胞电转染系统。由于课题组具有完全的自主知识产权，这一工作可以打破目前国外同类仪器建立的技术壁垒，具备较强的市场推广前景。

2013年最新发表的一篇文章报到了，使用电转方法（NEPA21高效基因转染系统）成功高效转化了未去除细胞壁的衣藻，为人们进行植物细胞的转化提供了新思路。 衣藻作为单细胞藻类，常被用于基础生命活动的研究，如光合作用，细胞周期调控以及细胞运动等。植物细胞转化前通常要去除细胞壁（或使用无细胞壁的突变株），比较费时，而突变株细胞往往比较脆弱，且不适于某些实验，如光合作用的测定等。 FIG. 2. (A) Colonies of hygromycin-resistant transformants plated on TAP agar medium containing 30 mg/mL hygromycin B. (B) Fluorescent signal of LCIBeGFP derived from transformants with the pTT1-LciB-GFP plasmid using NEPA21. Obvious ring fluorescence signals are present around the pyrenoid structure, as previously shown (12).Bar: 5 mm. Rapid transformation of Chlamydomonas reinhardtii without cell-wall removal http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1389172312005348

Jennifer Rottenberger1, Paul Monnier2, Maria Milla2, Tobias Beyer2, Dario Ossola2, Justin S Antony1 and Markus Mezger11 University Children' s Hospital, Department of Pediatrics I, Hematology and Oncology, University of Tübingen, Tübingen, Germany2 Cytosurge AG, Saegereistrasse 25, 8152 Glattbrugg, Switzerland生物制药和生物学研究以及生物制品的生产制造都依赖于基因修饰的细胞系，这些细胞系的基因被修饰，以诱导所需的表现型。随着CRISPR等基因编辑技术的发现和发展，多位点编辑的越来越引起了研究者的重视，但实际研究表明，整个实验进程是冗长而复杂的过程。近期，来自德国图宾根大学附属儿童医院的学者和来自瑞士Cytosurge公司工程师合作，通过FluidFM BOT技术手段，在不到三周的时间内完成了多基因敲除的单克隆细胞系。 FluidFM BOT助力CRISPR实现新突破自CRISPR作为一种基因编辑技术被发现和发展以来，它已经彻底改变了许多生命科学的研究领域。它为科学家提供了一种高度通用的基因工程工具，已经应用于各种广泛的生物体。科学家们对多基因位点编辑的多重策略的兴趣也正在急剧的增加：多重gRNAs的使用可以大大的增强CRISPR的应用范围。如多位点基因编辑，基因失调，细胞凋亡等。用传统技术手段包括转染等方法将多个gRNAs传递到细胞中具挑战。除了由几次DNA双链断裂引起的DNA损伤反应外，细胞活力也可能因物理损伤和化合物进入细胞核所引起的毒性而大大降低。所有这些都大地限制了CRISPR多位点编辑的潜力和效率。FluidFM BOT技术具，可将化合物直接的输送到任何细胞的细胞核中(图1)。因此，所有的试剂可以调整为佳的配比剂量进行注射，这样的话就很大程度上提高了效率，降低了细胞所受的物理压力，同时也减少了脱靶效应。FluidFM BOT技术完全屏蔽了常规基因递送方法的障碍，甚至CRISPR RNP复合物可以与数十甚至数百种不同的gRNAs共同注射。此外，FluidFM BOT的注射物不依赖于待注射物本身的特性，对于难以转染的细胞(如原代细胞)或需要大量的基因插入和沉默时候更具特优势。图1：FluidFM BOT技术可以温和地操作单个细胞。 在传统的细胞系发展系统实验中，为了得到稳定转染的细胞系，候选细胞系在增殖过程中被反复评估。目前需要的时间是12到14周。相比之下，通过FluidFM BOT技术可以挑选一个BOT注射编辑过的单个细胞，并从中产生克隆体——从转染之日起直到克隆体被鉴定出来，不到三周的时间。大大提高了细胞系构建的时间。 FluidFM BOT技术进行多基因敲除构建细胞系接下来，我们将展示了如何使用FluidFM BOT技术在不到三周的时间内生成单克隆多敲除细胞系(图2)。先，通过FluidFM BOT技术将外源物注射到CHO细胞中，同时靶向几个不同基因的基因组位点，直接将gRNA/Cas9 RNP复合物导入细胞核。纳米注射后，记录每个转染细胞的位置，这样以便在注射24小时后使用FluidFM BOT探针进一步分离成功转染的细胞。然后将这些细胞扩展成单克隆细胞系。接下来对细胞进行测序，以确定基因编辑是否成功。图2：FluidFM BOT技术进行细胞株开发流程：1天，细胞经FluidFM BOT注射转染。2天，选择成功转染的细胞，通过FluidFM BOT系统进一步进行单细胞分离。从3天到14天，分离的单细胞扩展成稳定的单克隆细胞系，并对其基因组进行分析。 1天：FluidFM BOT单细胞注射转染通过FluidFM BOT技术进行纳米注射，简单的点击鼠标即可完成对几十个CHO细胞的细胞核进行注射，以大约5个细胞/分钟的速度自动完成注射。荧光标记物与所有不同的gRNA/Cas9 RNP复合物共注射，以方便监测注射过程并识别佳候选复合物(图3)。图3：FluidFM BOT注射CRISPR/Cas9复合物和荧光标记物的CHO细胞的荧光图像。 2天：FluidFM BOT进行单细胞分离和分选FluidFM BOT对细胞进行了注射转染24小时后，使用集成FluidFM BIO系列操作软件(ARYA)可以再次的找到所有目标细胞。进而，进行FluidFM BOT进行单细胞分离和分选，将目标单细胞采用孔径为4 μm的FluidFM探针进行单分离，放入空的孔板中(图4)。从视觉角度可以完全确保细胞系的单克隆性。图4：明场成像可以完全确保细胞系的单克隆性。 3 - 14天：单克隆细胞的扩增和突变分析分离后培养克隆，并在3天和6天后监测其生长情况(图5.1和5.2)。90%以上的分离细胞发育成一个细胞群落。转染后14天，收集克隆并对目标基因进行测序分析。50%的克隆在靶向位点上显示突变。图5.1：分离3天后的12组CHO细胞集落。图5.2：单克隆细胞群落生长6天后 结论结果表明，通过FluidFM BOT技术对单个细胞进行注射，完成了多个gRNAs同时递送到选定的单个细胞中这一艰难的任务。采用FluidFM BOT技术方法进行的CRISPR细胞编辑技术，同时共注入几十种gRNAs所获得的细胞系可以进一步扩增。此外，我们在这里证明了FluidFM BOT技术的使用大大减少了多表型单克隆细胞系的开发时间，从数月减少到三周。 展望FluidFM BOT技术为单细胞基因工程领域带来了全新的突破，有潜力解决科学家目前面临的一些艰巨的挑战，尤其是在他们需要快速和有效地开发单克隆细胞系时。传统的方法完全适用于常见的细胞系和基因工程策略，但当处理不常见的、罕见的或脆弱的、和已知难以转染的原代细胞类型，或者需要复杂的实验设计——例如CRISPR多基因编辑时，传统的方案就非常受限制。在这些特殊情况下，FluidFM BOT技术可能是可用的解决方案。

&bull Cytiva发布全新Sefia细胞治疗生产平台与ELEVECTA稳转细胞系，助力细胞治疗和腺相关病毒生产的降本增效。&bull Cytiva创新分享LNP与CRISPR的结合优势，以及贴壁细胞培养技术，开拓基因药物研发生产新思路。2024年7月3日，上海——全球生命科学领域的先行者Cytiva举办“基因药物创新发布会”，重磅推出Sefia细胞治疗生产平台和ELEVECTA稳转细胞系两款新品，并创新性分享脂质纳米颗粒（LNP）如何赋能CRISPR技术，以及高效的细胞培养方案，助力中国基因药物研发与生产者提升安全与效率，加速创新疗法的可及。“目前，中国拥有全球第二大的细胞与基因治疗管线，未来在创新药领域弯道超车的潜力巨大。Cytiva立足中国，服务中国，希望与本土创新药企、科研院所以及生物技术公司等紧密合作，全面释放创新产品变革行业发展的潜能，为中国创新药加速上市、普惠全球贡献一份力量，”Cytiva中国基因药物运营公司总经理袁铭表示。两款重磅新品发布，助力创新药物可及目前，在中国获批上市的5款CAR-T疗法都得到了Cytiva的支持。本次发布的Sefia细胞治疗生产平台是Cytiva与Kite合作开发的完整细胞治疗工作流程的全新产品，由两个功能封闭的硬件系统Sefia Select和Sefia expansion搭配Chronicle自动化软件集合而成，覆盖细胞治疗产品生产的全部环节，包括细胞分离与分选、激活、基因修饰、细胞扩增、收获、制剂分装等，助力行业降本增效。Cytiva与Kite合作开发的Sefia细胞治疗生产平台Sefia细胞治疗生产平台具备三大优势：&bull 简化步骤，节省空间：与现有主流生产方式相比，该平台通过整合生产步骤，可减少70%-80%的步骤间转换，实现更简单的端到端生产，并在提升效率的同时，节省33%的洁净车间面积，从而降低生产成本。&bull 高度自动化，降低风险：自动化生产步骤可以减少人工干预，从而降低批次制造的失败风险。Cytiva的验证数据表明，在使用该平台进行的逾100次生产中，批次制造零失误。&bull 灵活设置，应用广泛：该平台多种参数支持灵活调节，适用于至少5种细胞治疗类型的研发与生产。本次发布会还推出了开创性的ELEVECTA稳转细胞系，服务于基因治疗的重要载体——腺相关病毒（AAV）的生产，可满足不同治疗项目的多样目标，并具备根据需求转换细胞系的能力，实现AAV的高产量、高质量、大规模、低成本生产，从而提升新型药物的可及性。ELEVECTA稳转细胞系可实现一步诱导生产AAVELEVECTA稳转细胞系具有三大突破性优势：&bull 稳定工艺，助力大规模生产：该产品能将AAV生产所需的必备基因Rep、Helper、Capsid和目的基因（GOI）都稳定转染到宿主细胞内稳定遗传表达，扩增培养后可直接一步诱导实现AAV生产，通过上游工艺的简化，使生产更稳定，批次间差异降低，生产规模更易放大。&bull 简化步骤，显著降低成本：无需质粒、无需转染、无需辅助病毒的生产方式能够节约原料成本和质控成本，提高实心率，降低引入杂质的风险，减轻下游纯化压力。&bull 工艺变革，实现质量跃升：通过质量源于设计（quality-by-design）的方法将hcDNA降低100倍，满足FDA推荐的每剂量hcDNA 低于10 ng的要求，可有效突破质量瓶颈。两大创新技术分享，共探新型疗法新思路近年来，CRISPR基因编辑技术因其有望通过改正引起疾病的基因位点，从源头上解决未被满足的临床需求而受到广泛关注。在本次发布会上，Cytiva分享了LNP与CRISPR技术强强联合的技术优势，以更加高效和安全的递送方式，维持高水平的细胞活性和功能，并降低基因编辑流程的操作时间，拓展基因编辑的使用场景，加速新型疗法的研发与商业化。此外，作为基因治疗三大细胞培养工艺（贴壁、悬浮、微载体）之一，贴壁细胞培养技术一方面能够更好地模拟细胞自然的生长状态，助力细胞功能维持与增殖，减少工艺开发风险，推进药物快速上市；另一方面可显著降低杂质含量，简化下游纯化步骤，降低生产成本。在该技术领域，Cytiva iCELLis固定床反应器使用的瀑布流技术，实现了高效的气质传递，此外，其“甜甜圈”状固定床反应器设计可以实现便捷的灌流工艺，进行大规模高密度的细胞培养。近年来，中国基因药物领域作为最有前景的治疗领域之一正在迅速发展，国内临床管线种类日益丰富，涵盖了病毒载体疗法、细胞治疗、核酸药物和mRNA疗法等多个方向，针对遗传性疾病、肿瘤、罕见病等重大疾病领域，显示出巨大的治疗潜力和市场前景。秉承“推动未见技术，加速非凡疗法”使命，Cytiva将继续携手本土合作伙伴，加速实现创新疗法的可及，变革人类健康的未来。Cytiva、Sefia、Sefia Select、ELEVECTA、Chronicle、iCELLis是以Cytiva之名开展业务的美国Global Life Sciences Solutions公司及其下属分公司的注册商标。© 2020-2024 Cytiva关于 Cytiva Cytiva （思拓凡）是全球生命科学领域的先行者，在全球40余个国家和地区拥有约15,000名员工，致力于推动未见技术，加速非凡疗法。作为值得信赖的合作伙伴，Cytiva积极携手学术及转化医学领域的研究人员、生物技术开发者和制造商，专注于生物药物、细胞和基因疗法以及以mRNA为代表的一系列创新技术的研究，通过提升药物研发和生物工艺的能力、速度、效率和灵活性，为惠及全球患者开发和生产变革性药物和疗法。欢迎访问www.cytiva.com.cn获取更多信息。

一如大家所知，生命科学的中心法则是所有生命活动遵循的基石，DNA双螺旋结构发现者之一Francis Crick在1958年提出的这一规则为现代分子生物学乃至整个生命科学领域奠定了最坚实的科学基础，也为生物医药领域，特别是近年来愈发明显的新型modality、多学科融合的新型疗法、不断涌现的生物技术新范式提供了底层科学上的指导。倚锋资本投资团队遵循这一科学法则，尝试探讨行业发展趋势与其中存在的投资机会。题为“生命科学中心法则系列”，本篇为第一期“基因治疗”，作为开篇，期待讨论与交流。基因治疗的定义基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，进而达到治疗的目的。基因治疗是一种根本性的治疗策略，有望从根本上治愈一些现有常规疗法不能解决的疾病。导入的基因可以是与缺陷基因对应、在体内表达具有特异功能的同源基因，也可以是与缺陷基因无关的治疗基因。按照导入基因的策略，可分为三种类型：基因增补、基因抑制、基因编辑。图片来源：Nature，兴业证券研究所基因治疗的三种策略从源头而言，大多数疾病的发生都是基因层面出了问题，根据基因变异类型的不同，大致可分为两类：1）基因突变导致其指导合成的蛋白质功能异常，表现为蛋白质没有功能、功能变弱或过强，甚至产生有害蛋白；2）基因表达强度异常，表现为不该表达的基因表达、应该表达的基因不表达、基因表达的强度过强或过弱等。基因增补：将外源基因导入表达靶细胞(如肝脏细胞)，其表达产物能修饰缺陷细胞的功能，是目前已上市和在研基因疗法的最主要策略。简而言之，就是“缺啥补啥”，也是迄今理论基础最清晰、最容易成药的策略。基因抑制：使无法正常工作的致病基因减弱或沉默，实现方式有些类似于基因编辑，难度较大。相比之下，小核酸干扰机制(RNAi)反而更适用于该策略。基因编辑(以CRISPR/Cas9为代表)：切割靶基因，并对其进行精确编辑(删除、插入、替换等)，实现对患者基因组“错误”基因的修正，基因编辑可以认为是基因治疗的终极手段，其涉及的治疗过程比基因增补复杂、潜在风险也更大、技术挑战也更高，目前发展阶段不如基因增补成熟。基因治疗的作用机制：中心法则生命科学的中心法则：在生物体内，遗传信息沿着“DNA-RNA-蛋白质”的方向逐级传递，蛋白质是遗传信息的表现形式，亦是一切有机生命体的表现形式，因此疾病发生时多表现为蛋白质层面的异常；DNA、RNA、蛋白质三个层面，传统的小分子(如靶向药)、大分子(单抗，重组蛋白等)都是针对蛋白质层面的治疗策略，基因治疗是针对源头(DNA)的治疗策略，RNAi、mRNA是针对中间过程的治疗策略。图片来源：Nature；倚锋资本投资团队绘制；网络根据中心法则，每一个生理过程都可以理解为特定的基因在特定的时间和空间里表达的结果，平衡被打破就会诱发疾病。几乎所有疾病的发生理论上都可以在DNA水平进行解释，这也是基因治疗的理论基础。根据基因变异类型的不同，导致疾病发生的基因异常大致可分为两类：1）基因突变导致基因指导合成的蛋白质功能异常，表现为蛋白质没有功能、功能变弱或功能过强，甚至产生有害蛋白；2）基因表达强度异常，表现为不该表达的基因表达、应该表达的基因不表达、基因表达的强度过高或过低等。然而，疾病的发生往往涉及多个基因，对应的蛋白质之间的相互作用形成了一个庞大的调控网络，仅对某一个或几个基因进行调节难以达到治疗疾病的目的。目前对人体基因功能和疾病发生机制的研究仍然非常有限，存在大量未被发现的新基因和信号网络。基因和疾病太多的不确定性极大地限制了基因治疗的应用领域，故而基因治疗目前只适用于少数致病机制或治疗方案非常明确的疾病，其中以单基因遗传病为代表。资料来源：倚锋资本团队整理基因治疗与传统药物的成药机制比较小分子(以靶向药、小分子抑制剂为代表)、大分子(以单克隆抗体为代表)大多作用在蛋白质层面，基本作用机制是抑制或激活特定蛋白的活性 基因治疗从DNA的层面介入，可以从源头上解决疾病的发生。图片来源：researchgate.net资料来源：倚锋资本团队整理基因治疗的分类体内&体外根据给药方式和治疗流程的不同，基因治疗可分为“体内”治疗和“离体”治疗(体外)两大类:“体内”基因治疗的操作流程相对简单，大致可分为3个步骤：1）利用基因工程的方法将正常基因插入到 病毒载体的DNA上；2）将重组后的病毒DNA体外包装产生具有感染能力的完整工程病毒；3）把重组后的病毒直接注入病人体内，病毒感染病变细胞并将正常基因带到靶细胞中，实现疾病的治疗。“体外”基因治疗可分为6个步骤：1）将正常基因插入到病毒载体的DNA上；2）将重组后的病毒DNA体外包装产生具有感染能力的完整工程病毒；3）获取病人的体细胞，如造血干细胞等，体外培养扩增；4）用重组后的病毒感染获取的病人细胞，病毒把正常基因导入靶细胞中；5）对携带正常基因的重组细胞体外 培养扩增；6）将携带正常基因的重组细胞回输到病人体内，实现疾病的治疗。图片来源：Proceedings Biological Sciences，华金证券研究所细胞与基因治疗(Cell Gene Therapy)细胞治疗是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程的方法获取和/或通过体外扩增、特殊培养等处理后，产生的特异性功能强大的细胞，回输体内后，从而达到治疗疾病的目的。细胞治疗和基因治疗并不容易划分清楚，为了更好的概括，有一种方法是将细胞和基因治疗合称细胞和基因治疗(cell and gene therapy，CGT)；另外一种是分为广义、狭义的区分，按照技术类别来分，这种方法更容易区分。狭义的基因治疗只是基因递送，不包括CAR-T/TCR-T和溶瘤病毒治疗，广义的基因治疗则包含了基因递送和 CAR-T/TCR-T、溶瘤病毒。图片来源：The source, harvesting procedure, culture and several potential uses of stem cells，兴业证券研究所基因治疗的技术路径分类(FDA)FDA将基因治疗产品按照技术方式分为五类(载体方式):质粒DNA基因治疗：是指基因工程化的、能够将治疗性基因导入人类细胞的环形DNA分子。通常是分离/扩增目的基因后将其导入到质粒中，然后转染细菌进行质粒的增殖，以生产用于治疗的质粒产品，质粒进入细胞核后可转录出mRNA从而表达目标蛋白。比如2019年3月在日本获批的Collategene，即为搭载肝细胞生长因子 (HGF)的质粒，用于治疗外周动脉闭塞性疾病。病毒载体基因治疗产品：对病毒进行改造(比如删去复制基因)去除其引发传染性疾病的能力，再将目的基因通过质粒共培养的方式装载到病毒颗粒中，病毒感染细胞进入细胞核后释放目的基因并转录表达。比如于 2019年5月由FDA批准上市的诺华公司的Zolgensma，即为搭载SMN1基因的改造AAV9病毒，递送到神经系统后可表达出SMN蛋白从而可以治疗脊髓性肌肉萎缩症(SMA)，曾经为史上最昂贵的药，售价为210万美元。(Bluebird的Zynteglo在2022年8月17号于FDA获批，高达280万美元/1900万人民币，刷新了世界最昂贵药物的记录。但是在短短一个月后，2022年9月16日Bluebird又再一次官方宣布FDA已加速批准基因治疗药物Skysona上市，用于减缓4-17岁早期活动性脑肾上腺脑白质营养不良(CALD)男孩神经功能障碍的进展，Skysona在美国的定价为300万美元，这意味着全球最贵药物的记录在短短30天内再次被打破，最新的天价药王诞生)。细菌载体基因治疗：通过改造去除细菌(如沙门氏菌)引发传染性疾病的能力但仍然保留其对某些组织(如肿瘤)的亲和性，再将目的基因/寡聚核苷酸导入细菌，给药后即可感染靶细胞并释放基因改造材料。暂无该类药物上市，在研的包括癌基因沉默的产品、提高癌抗原表达的产品。基因编辑治疗：能够精确对生物体基因组的特定目标基因进行修饰，从而达到破坏有害基因或者修复变异基因的目的。基因编辑技术包括同源重组、锌指核酸酶(ZFNs)技术、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)技术和获得2020年诺贝尔化学奖的CRISPR/Cas9技术。目前暂无药物上市。细胞基因治疗产品：从患者提取细胞后，经过基因改造(通常使用病毒载体)后返输回患者体内。比如于2017年获批的Kymriah，即是将患者的T细胞取出，通过慢病毒将CD19抗体基因转染到T细胞中，该基因可在T细胞表面表达出CD19抗体，经筛选增殖后回输患者体内，实现对B细胞淋巴瘤的杀伤。图片来源：FDA，The promise and challenge of therapeutic genome editing，兴业证券研究所基因治疗的核心因素核酸序列的设计。1）直接影响目标蛋白的表达，以及分泌效率；2）DNA序列决定了蛋白的表达，同时也决定了表达蛋白的二级、三级结构(蛋白的折叠与空间构象，是生命科学的最重要话题之一)；3）蛋白的二级与三级结构又直接会影响到从靶细胞(如肝脏细胞)向血液中的分泌能力。这是决定药物剂量的第一个因素。将核酸序列递送至靶细胞中，即：递送问题。如何更加有效的将核酸序列递送至靶细胞，取决于载体的递送效率、载体的制备质量、对靶细胞的转染效率。这是决定药物剂量的第二个因素。工业化生产(CMC，临床转化)。基因治疗的CMC(关键化学、制造和控制)不同于传统的化学药，在整个IND临床报批、上市后稳定生产供应要求更高，而且有一点非常关键：基因治疗是新兴技术，获批上市的产品为数尚少，不像传统的小分子与大分子药，没有大范围的可遵循的IND、BLA(NDA)、CMC固定行业标准，所以企业与监管机构的有效沟通显得格外重要。一款优秀的基因治疗产品，从科学到临床的几个要素第一个要素是致病基因。比如DMD，序列改造很重要，将改造后的序列装进容量有限的AAV里面做成药，是几乎所有基因治疗产品都要面对的首要核心话题 又譬如血友病A，删除B Domain，如何保留序列、如何引入外源序列、增强分泌，亦是一个核心的science话题。所以，在第一个层面上的设计，将会很大程度上影响后续的研发与推进；第二个要素是基因表达的系统。病毒的瞬时作用元件，首要是启动子，天然抑或是人工改造的启动子，在基因药物的设计中非常重要，不同的启动子；还有在表观遗传学里面，增强子起到至关重要的调控作用；第三个要素是基因载体。以AAV为例：复制的起点、包装的信号、末端的序列，AAV的自身天然序列ITR，外壳蛋白的CAP序列 第四个要素是基因导入系统。转入到特定的组织细胞里面，AAV不同血清型、突变型、人工改造型，决定了基因药物的有效性、副作用；优化AAV的设计，使其具备更好的组织靶向性、器官靶向性，将会有效的降低剂量、降低毒副作用；第五个要素是在临床用药的实施。不同的给药方式，如静脉、肌肉、鞘内注射、玻璃体/脉络膜上腔注射的具体选择，对于不同的产品、患者群体、以及不同的适应症，是一个非常重要的课题，Zolgensma在国外是静脉注射，在国内报批的临床是鞘内注射(2022年6月开启，北大一院儿科熊晖教授)。核酸序列设计针对翻译后蛋白合成过程进行优化，特异性启动子，蛋白折叠、适量表达等多种因素；启动子效果不能太强、也不能太弱，根据具体的治疗蛋白需求，设计恰到平衡的启动子是关键之一；针对蛋白质分泌过程进行优化，增加目标蛋白向血液中的分泌效率(外泌率)、提高目标蛋白的活性 譬如，如何让肝脏细胞把蛋白快速分泌到血液循环中，真正起到治疗效果；如果生产的蛋白不能正确的折叠、不能有效的分泌出细胞膜，而是“憋”在细胞里面，就会造成毒性。上述两点使得治疗效果得以改善，同时可以降低治疗剂量，这对于基因治疗是关键制约因素之一。序列设计往往在过分强调载体优化的大背景下被忽略。从投资的角度而言，或许是一个差异化的机会。图片来源：网络递送载体现有基因治疗载体的核心话题是基因到达靶细胞的效率，理想状态下只要能把基因递送到指定的细胞上，许多疾病基本可以治疗，但实现起来有诸多困难。比如，肝脏疾病只有40%的传递效率，眼科疾病20-40%，脑科疾病甚至低于10%(由于血脑屏障)；理想的基因治疗载体特性：1）具有靶向特异性，能靶向特定的器官、组织、细胞，且可以高效转导、长期稳定表达转基因；2）有足够的空间来容纳和递送大片段的治疗基因；3）具有高转导效率，能感染分裂和非分裂的细胞；4）缺乏自动复制载体自身的能力，具有较低的免疫原性的或致病性，不会引起炎症；5）高度稳定、易制备、可浓缩和纯化，具备大规模生产的能力。其中：对于靶细胞的转染效率与安全性(毒性)直接相关，因为较高的转染效率意味着较低的使用剂量，直接降低了细胞毒性，最典型的就是肝毒性。图片来源：Nature Reviews Drug Discovery载体的分类非病毒载体:主要有裸露的DNA、质粒、脂质体、微球粒，以及内源性的物质如外泌体、红细胞及囊泡、血小板。该类载体具有低免疫原性、可以多次给药等优点，但目前工程化、量产化的CMC、纯化等工艺问题还存在不少瓶颈；病毒载体：包括腺相关病毒(AAV)、慢病毒(LV)、腺病毒(AdV)和逆转录病毒(RV)等，相比于腺病毒和逆转录病毒来说，腺相关病毒(AAV)与慢病毒载体(LV)安全性较好，两者所占临床试验的比例近年来也在逐步增加，其中AAV载体已经成为基因治疗的首选载体；当前大部分CGT治疗项目为病毒载体，使用非病毒载体的项目大约仅占项目总数的28.3%。几种载体的对比资料来源：倚锋资本团队整理基因治疗的首选载体：AAV - 自然进化的礼物腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)是一种大小约为26nm，只包含一条单链线状DNA基因和蛋白质衣壳的无包膜病毒，最早在恒河猴肾细胞的培养物中首次发现；AAV是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，所以无自主复制能力，需要与辅助病毒(腺病毒或疱疹病毒)进行共感染以便复制，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。目前的科学界共识是AAV不会导致任何人类疾病，大多数成年人都感染过AAV病毒，但尚未发现该病毒是任何疾病的致病因素。图片来源：Semantic Scholar作为基因疗法载体的重组腺相关病毒(rAAV)携带的蛋白衣壳与野生型AAV几乎完全相同，然而衣壳内的基因组中编码病毒蛋白的部分被删除，取而代之的是治疗性转基因(transgene)。AAV基因组中唯一被保留的部分是ITRs，它起到指导基因组的复制和病毒载体组装的作用。将编码病毒蛋白的部分完全删除的优点是：一方面可以最大化重组AAV携带转基因的容量，另一方面减小体内递送转基因时产生的免疫原性和细胞毒性。AAV作用机制重组AAV颗粒通过与宿主细胞表面表达的糖化受体相结合，通过网格蛋白(clathrin)介导的内吞作用进入细胞。在内吞形成的内体(endosome)酸化之后，病毒衣壳的VP1/VP2部分构象发生变化，导致病毒从内体中脱离，并且通过核孔进入细胞核。进入细胞核后，单链DNA从衣壳中释放出来。这时单链DNA还不能进行转录，它们需要变成双链DNA。单链DNA可以利用宿主细胞的DNA聚合酶来 合成互补链，或者两条从不同AAV颗粒中释放的互补链退火(annealing)形成双链DNA。双链形式的AAV基因组然后利用ITRs进行分子内或分子间基因组重组，这一过程让AAV基因组成为稳定的游离DNA(episomal DNA)，导致基因组能够在不再进行有丝分裂的细胞中持续进行基因表达。图片来源：Nature Reviews Drug DiscoveryAAV血清型的靶向性目前已发现12种AAV血清型和100多种突变体，不同血清型的区别在于衣壳蛋白，因此导致不同血清型AAV对各组织或细胞感染效率不同(靶向性)。多数基因疗法的靶向组织是肝脏、横纹肌和中枢神经系统，几乎所有天然AAV能够在肝脏中转染，因此重组AAV为靶向肝脏提供了优良的基因递送平台，包括A型和B型血友病、家族性高胆固醇血症等疾病。AAV8和AAV9衣壳蛋白能够靶向身体中的多种肌肉类型，这让AAV介导的基因疗法能够用于治疗多种肌肉疾病，其中包括杜氏肌营养不良症(DMD)。值得一提的是，肌肉可以作为生成治疗性分子的“体内工厂”，因此靶向肌肉组织的基因疗法可以用于治疗非肌肉疾病。AAV递送的另一个重要方向是中枢神经系统(CNS)，包括眼睛和大脑。眼睛是一个相对隔离的环境，直接进行眼内注射递 送AAV基因疗法能够达到治疗多种遗传性眼病的效果。Spark公司开发的获批疗法Luxturna就是治疗由于RPE65基因突变而导致失明的患者。资料来源：NatureReviews Drug DiscoveryAAV载体面临的一些问题预存免疫(pre-existing anti-AAV antibody)：据传染病学统计，40-80%的人体内携带针对AAV的抗体。这可能导致AAV作为基因疗法载体在未递送转基因时就被免疫系统摧毁，降低转基因的表达水平。解决策略包括使用从非人灵长类中分离的AAV衣壳，AAV载体的理性设计与定向进化。提高AAV载体对于组织的特异性:几乎所有天然AAV衣壳蛋白能够在肝脏中引发有效的转基因表达；AAV8和AAV9衣壳蛋白能够靶向身体中的多种肌肉类型；AAV9和AAVrh.10能够穿越血脑屏障。通过载体设计优化得到更多组织特异性更佳的AAV载体也是当前的方向。装载容量的问题：AAV载体的容量只有约4.7kb,对于很多较大的基因，需要选择其截断的有功能的区域，如递送凝血八因子FVIII时去除了其B-domain，递送DMD基因时，选择了micro-DMD基因。核心解决策略在于优化治疗基因序列的设计。图片来源：Nature Reviews Drug DiscoveryAAV基因治疗的发展现状2016-2019年临床以AAV为载体的基因治疗试验数量增长迅猛，从不足10个增加到了接近45个 临床试验中所用最多的是基于AAV2血清型载体，但是新的血清型如AAV8、AAV9、AAV10也在不断被用于临床试验 以AAV为载体的基因治疗主要靶向眼、肝、肌肉和脑部，其中尤以靶向眼部疾病的临床试验数量为多，大多进行I/II期临床试验。图片来源：NatureReviews Drug Discovery基因治疗的适应症主要包括：眼部疾病、血液疾病、神经退行性疾病以及其它遗传类疾病。目前全球已发现7000多种已确定的罕见病，超过80%的罕见病具有已知的单基因致病机理。从基因治疗MOA的角度而言，最佳的适应症范围即为单基因致病机理的遗传疾病。比如，眼科适应症在基因治疗中具有以下优势：1）相对的免疫豁免；2）两只眼睛，其中一只可以做control；3）相对安全；4）AAV的用量相对较少；5）20%的遗传疾病都发生在眼睛上，可选择疾病种类较多。基因治疗的获批上市产品体内基因治疗获批三款：Glybera(已退市，UniQure)、Luxturna(Spark)、Zolgensma(诺华)资料来源：兴业证券研究所Spark，Luxturna，FDA首款2017年12月，FDA批准了Spark公司的Luxturna上市，用于治疗双等位RPE65基因突变导致的II型先天性黑蒙症 (LCA，Leber’s congenital amaurosis)，Luxturna是FDA历史上第一个基因治疗药物。已有研究发现了19个与LCA相关的致病基因，其中由RPE65基因突变导致的LCA称为LCA II型，约占LCA的16%。RPE65基因突变导致RPE65蛋白失去异构酶活性，从而造成光感受器细胞不能对光发生反应，最终导致视力丧失。Luxturna采用了AAV2载体，递送RPE65基因，直接注射到视网膜色素上皮(RPE)细胞中。在患者细胞表达RPE65蛋白后，细胞内的视黄醛循环得以继续，从而渐渐获得感光的视觉能力。图片来源：Spark公司官网；网络罗氏在2019年12月完成了48亿美元收购企业Spark Therapeutics的交易，包括已上市的罕见眼科疾病药物Luxturna和处于III期阶段的B型血友病疗法SPK-9001等。Luxturna每只眼睛定价42.5万美元，双眼治疗价格在85万美元(眼科基因疗法的独特优势是:可以选择单眼治疗，也可选择双眼治疗)。其2018年共销售了75份，销售额达2700万美元。从Spark Therapeutics公司公布的III期临床试验数据来看,在接受治疗的29名患者中有27名患者的规力得到了显著改善,有效率高达93.1%，随访1年后,仍有21名患者保持良好的治疗效果。Leber氏先天性黑蒙症(LCA)是一组遗传性视网膜变性疾病，由至少18个不同基因的突变引起。它是儿童遗传性失明的最常见原因，10万名儿童中会有3人受到影响。该疾病一般出现在儿童时期，并导致严重的视力丧失和潜在的失明。LCA最常见形式为LCA10，约占所有患者的20%-30%，目前没有可用的治疗选择。全球首个上市的眼科基因疗法Luxturna的方法在LCA10患者中是不可能的，因为导致该病的突变基因太大，无法放入用作运送工具的灭活病毒中。目前正在临床中的做法是采用Crispr基因编辑策略。诺华，Zolgensma2019年，FDA批准了诺华公司研发的AAV基因疗法Zolgensma，用于治疗2岁以下患有存活运动神经元1(SMN1)等位突变导致的脊髓性肌萎缩症(SMA)的儿童患者。Zolgensma采用了AAV9载体，能够透过血脑屏障，将SMN1基因递送到中枢神经系统从而发挥功能。资料来源：FDA官网基因治疗的差异化投资方向1.病毒载体向非病毒载体的过渡，如LNP，特别是人体内源性物质如外泌体、红细胞及囊泡、血小板；未来的大方向是低免疫原性、可重复给药；2.序列设计的持续优化、差异化，从biology的角度降低AAV剂量；3.小分子诱导、转录因子based目标序列表达开关，即带有signal on/off机制的基因治疗；4.AAV的器官靶向优化，降低空壳率，进而降低AAV剂量与毒性；5.从罕见病向常见病的拓展，譬如眼内表达抗VEGF的蛋白(脉络膜上腔注射)；6.明确的MOA(science)，尚待改进的技术手段(technology)。

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基因治疗是将外源功能基因导入人体靶细胞，以纠正或补偿基因缺陷和异常所导致的疾病，达到治疗目的的新型疗法。根据其治疗途径的不同，基因治疗可分为体内治疗和体外治疗。与基因治疗不同的是，细胞治疗则是利用患者自身或供体的活细胞，经体外改造后回输患者体内，替换受损细胞、病变细胞或刺激人体免疫反应和再生，从而达到治疗疾病的目的[1]。目前，基因细胞治疗有望从根本上治愈肿瘤、遗传病和感染性疾病等常规疗法不能解决的疾病。得益于生物技术的进步和相关政策的利好，基因细胞治疗技术正在迅速发展，同时也面临诸多挑战。我国《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》指出[2]，无菌检测、支原体检测、内毒素检测、细胞存活率、总细胞数量、病毒载体滴度/纯度、效应细胞比率、CAR转导/转染效率、CAR基因拷贝数、复制型病毒残留等质控指标必须通过严格测试，以保证相关产品的安全和有效性。细胞治疗质控流程基因治疗质控流程质量控制贯穿于整个基因细胞治疗的研发和生产过程，如何确保和提高质量控制的精准性是基因细胞治疗的成功研发和顺利生产的关键。与传统荧光定量PCR技术相比，数字PCR作为一种可精准实现核酸分子绝对定量的新技术，已被广泛应用于载体构建、细胞转染/病毒包装、污染监测和生物分布等完整的质控过程，为基因细胞治疗相关产品的成功研发和安全生产保驾护航[3]。自动化的质控检测是提高基因细胞治疗产品安全性和质量可控性的重要途径之一。质控检测的自动化不仅可以减少不同批次产品间的差异变化和交叉污染，还可降低时间成本。QIAcuity集成式纳米微孔板的数字PCR系统，将微反应体系制备、PCR扩增和数据分析集成到全自动仪器中，整个流程只需一步手工操作即可在2小时内快速获得实验结果。在提升检测速度和操作简便性的同时，也最大程度减少由于人工操作不当等外界因素引入而导致的实验误差。如何确保和提高基因细胞治疗的安全性、有效性和一致性是开发基因细胞治疗产品亟待解决的问题。QIAcuity dPCR系统作为一种全自动化的基因细胞治疗产品质控工具，结合经优化设计的高度特异和灵敏dPCR Assays，可精准实现支原体和残留宿主细胞等污染物的单拷贝检出以及重复展现病毒载体的拷贝数（95%的置信区间，CV＜10%），更大程度提高基因细胞治疗产品的安全性和有效性[4]。10x梯度稀释的CAR-T细胞线性关系（LOD为0.13copies/ul）dPCR检测载体拷贝数一致性评估（a样本CV值为3%；b样本CV值为4%）在基因细胞治疗的整个质控流程，QIAGEN可实现CD3、CD28和ICOS等外源目的基因、AAV病毒滴度、残留宿主细胞、总细胞量、支原体和大肠杆菌的检测，所有Assays均经过严格的湿实验验证，确保其检测特异性和灵敏度。细胞治疗应用基因治疗应用参考文献1. B Furuta-Hanawa,T Yamaguchi,et al.Two-Dimensional Droplet Digital PCRas a Tool for Titration and Integrity Evaluation of Recombinant Adeno-Associated Viral Vectors[J]. Human gene therapy methods,2019,30(4):2. 食药监总局发布细胞治疗产品研究与评价技术指导原则[J].中国医药生物技术,2018,13(01):47.3. X Dai,Y Mei,et al.Standardizing CAR-T therapy:Getting it scaled up[J]. Biotechnology advances,2019,37(1):4. Lu Alex,Liu Hui,et al. Application of droplet digital PCR for the detection of vector copy number in clinical CAR/TCR T cell products[J]. Journal of translational medicine,2020,18(1):END

生命科学仪器是指为生命科学研究和生物技术领域使用的仪器。而在所有生命科学仪器分类中，分子生物学仪器设备应用最为广泛。在了解分子生物学仪器之前，我们先要了解什么分子生物学的定义：研究生物大分子之间相互关系和作用的一门学科，而生物大分子主要是指基因和蛋白质两大类。因此分子生物学仪器包含了基因组学和蛋白组学两大分类仪器。小编今天为业内专家同行献上一篇分子生物学类仪器归纳与梳理，以供同行学习交流及采购需要。按照仪器具体功能再进行划分，基因组学仪器包括分子克隆仪器和核酸分子杂交仪器。蛋白组学仪器包括蛋白质表达仪器，目的蛋白的分离与纯化仪器和功能蛋白质组学仪器。分子生物学仪器分类NO1. 分子克隆仪器分子克隆仪器是分子生物学仪器门类的核心仪器，这项仪器的主要是为获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，帮助科研人员深入分析基因结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。核心分子克隆仪器品类如下：仪器名称功能核酸提取纯化仪用于从生物中提取纯化DNA或RNA基因扩增仪（PCR仪）目的基因的放大、扩增电泳仪目的基因的分离及检测凝胶成像分析系统DNA片段的观察及影像紫外投射仪从凝胶中切割目的基因基因导入仪（电穿孔仪）外源DNA片段向大肠杆菌及哺乳动物细胞的转化或转染NO2. 核酸分子杂交仪器核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选，基因组中特定基因序列的定量定性检测，基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为 Southern 印迹法和 Northern 印迹法。核酸分子杂交仪器品类如下：仪器名称功能分子杂交仪核酸等样品的杂交干胶仪将凝胶干燥处理便于长期保存紫外交联仪核酸固定转膜仪将核酸转移至膜上测序仪DNA，RNA测序DNA合成仪引物的合成生物芯片（微阵列芯片）DNA杂交读取分子数量序列信息NO3. 蛋白质表达相关仪器目的基因能否发挥其效应，只能通过其表达有功能的蛋白质来实现。蛋白质表达相关仪器是研究蛋白组学的基础。仪器名称功能蛋白印迹仪目的蛋白的检测液体闪烁计数仪（同位素探测器）样品放射性的检测发酵罐宿主细胞的高密度培养超声波破碎仪宿主细胞破壁NO4. 目的蛋白分离与纯化仪器由于遗传工程中，下游的处理和分析鉴定，基因工程产品的制备都需要纯度较高的蛋白质。因此，蛋白质的分离纯化相关仪器是研究蛋白质化学组成，结构及生物学功能等的基础。仪器名称功能多肽合成仪用于多肽和蛋白质的合成蛋白层析纯化系统蛋白质的分离纯化蛋白质测序仪蛋白质测序核磁共振仪蛋白质三级结构的测定高效液相色谱仪蛋白质的分离纯化离子交换色谱仪蛋白质的分离纯化凝胶过滤层析柱蛋白质的分离纯化亲和色谱仪蛋白质的分离纯化NO5. 功能蛋白质组学仪器蛋白质组为基因组所表达的全部蛋白质。功能蛋白质组学是目前的研究热点，它以某种特定细胞、组织或生物体为研究对象，研究蛋白质的翻译后修饰、蛋白质结构、蛋白质的定位及表达水平差异与功能之间的关系，研究蛋白质之间的相互作用及其意义，构建蛋白质功能网络。这一类仪器主要为研究蛋白质功能服务，是分子生物学仪器的发展方向。仪器名称功能化学发光系统蛋白质的光化学反应，用于临床检验分析及医药、病毒、免疫等科学试验。生物大分子相互作用仪蛋白质互作的研究。质谱仪测定蛋白质分子结构由于起步较晚，国内生命科学仪器行业不如国外成熟度高。造成国产生命科学仪器给人的直观感受是参差不齐、价格混乱。在国内生命科学科研市场，进口仪器仍然是主流。

前情提要：26亿美元！赛多利斯拟收购Polyplus|加注CGT疗法生命科学集团赛多利斯通过其法国上市子公司Sartorius Stedim Biotech成功完成对法国公司Polyplus的收购。该交易于2023年7月18日完成，获得了所需的监管批准。Polyplus是细胞和基因治疗创新技术的领先提供商。Polyplus开发和生产的转染试剂是制造病毒载体的关键原料。该公司通过收购质粒构建、蛋白和质粒生产等相邻技术，扩大了其在基因治疗和基因修饰细胞治疗领域的产品组合。关于赛多利斯赛多利斯集团是生命科学研究和生物制药行业的领先国际合作伙伴。该集团的实验室产品与服务板块提供创新型实验室仪器和耗材，致力于满足制药和生物制药公司以及学术研究机构旗下科研和质量控制实验室的需求。生物工艺解决方案板块推出了广泛的产品组合，专注于一次性解决方案，帮助客户安全高效地制造生物技术药物和疫苗。集团总部位于德国哥廷根，拥有约60个制造和销售基地遍布全球。集团自身业务增长显著，并通过不断收购互补性技术以扩展其产品组合。2022财年集团销售收入约为42亿欧元。截至2022年底，约16,000名员工为全球客户提供服务。

细胞与基因治疗是生物制药市场中增长最快的细分领域之一，也是除抗体药物领域外，另一个备受资本市场追捧的赛道，虽然一度受2016年的魏则西事件所影响，但仍阻挡不住各方对这一领域的看好和投入，近些年，国内不断涌现出专注于细胞与基因治疗产品的企业，到2024年，预计全球细胞与基因治疗市场规模将达437亿美元。有人说，细胞与基因治疗正在开创一个新的医疗时代。近几年，细胞与基因治疗研发投入在急剧增加，而这一过程必然离不开相关的技术和实验室工具，用于基因操作、细胞生长和维持，目前，许多现有实验室工具和新的技术正被应用于细胞与基因治疗产品研发、质量控制和生产制造过程中。2021年最新调研数据显示，细胞与基因治疗的实验室工具市场规模超过20亿美元，其中许多技术和产品呈双位数增长，随着这一领域的快速发展，相关的实验室产品市场也将水涨船高，目前，已有众多规模不一的仪器供应商加快了该领域的布局。细胞与基因治疗研发生产所用的仪器和耗材可简单分为六个部分：通用技术、基因治疗工具、转导与转染、细胞富集、细胞培养与扩增和冷冻保存。每一部分都包括一套广泛用于细胞与基因治疗开发制造的技术，包括仪器和消耗品。其中有成熟的实验室技术和产品，如PCR和流式细胞仪，还有较新的技术，如CRISPR和自动细胞处理系统。微流控、实时监测和生物信息学相关分析技术主要用于细胞与基因治疗确保产品产品的安全性和法规依从性，以及解决生产效率的问题，这些问题正是细胞与基因治疗走向市场所面临的挑战。细胞与基因治疗 实验室工具清单类别产品通用技术PCR细胞分析细胞计数基因治疗工具CRISPR质粒提取纯化转导与转染病毒载体转座子电穿孔细胞富集细胞分离细胞分选仪自动化细胞处理系统细胞培养与扩增乳细胞培养若血清补充剂GMP细胞培养基GMP血清及补充剂常规生物反应器一次性悬浮生物反应器一次性附着生物反应器冷冻保存冷冻介质和保护剂冷冻袋和冷冻瓶据悉，细胞培养和扩增产品在细胞与基因治疗工具市场中占比最高，最常用的消耗品是细胞培养基和血清，在细胞扩增领域的仪器方面，一次性生物反应器的需求正在快速增长。与传统反应器相比，一次性生物反应器具有更加灵活和节省时间的优越性。这一市场的规模也一定程度上反映了细胞疗法的高成本。上面所说的细胞培养和扩增细分市场占比最高，不包括按市场规模划分的两个最大的单个技术细分市场，主要是归类到通用技术和基因治疗工具市场中，这两类市场也是细胞与基因治疗领域非常具有代表性的市场，同样由耗材产品驱动，其中通用技术贯穿与整个实验室工作流。在细胞与基因治疗领域，赛默飞、默克生命科学是两大领先的实验室产品供应商，他们可提供的产品范围十分广泛，并且在细胞培养和扩增市场占有重要地位，此外，Cytiva、赛多利斯、BD和康宁公司也是这一领域主要的实验室产品供应商。除以上主要的工艺产品供应商外，还有一些特定技术的供应商，包括艾本德、贝克曼库尔特、Miltenyi Biotec和STEMCELL Technologies等。随着全球越来越多的细胞与基因治疗产品获得监管部门的批准，逐步形成标准化的研发流程和生产流程，细胞与基因治疗实验室工具将伴随着这一领域的发展而前景广阔。

细胞和基因治疗（CGT）寻求的是从源头上治疗疾病，它不仅在实现个性化治疗方面具有无限的潜力，而且很有可能治愈以往无法治愈的疾病。在过去的十年里，CGT的研究已经被加速，一些包括淋巴瘤、白血病、脊髓性肌肉萎缩症和遗传性视网膜疾病的药物获批上市。尽管如此，CGT疗法本身就很复杂，有很大程度的可变性，为从源头上保障CGT药物的安全性、有效性，贯穿于整个CGT研发和生产过程的质量控制显得尤为重要，因此如何确保和提高质量控制的精准性是CGT药物成功研发和顺利生产的关键。数字PCR作为一种可精准实现核酸分子绝对定量的技术，不仅可以可靠而精确地确定质粒质量、病毒滴度和载体拷贝数，而且还可以执行可靠的污染监测，例如支原体和宿主细胞DNA残留检测，为CGT相关产品的成功研发和安全生产保驾护航。QIAGEN以QIAcuity dPCR系统为主体的一系列解决方案，除了已推出的QIAcuity CGT dPCR Assay、QIAcuity resDNA Quant Kit，现又推出CGT Viral Vector Lysis Kit病毒载体裂解新品，再次加速促进CGT应用发展。CGT Viral Vector Lysis KitCGT Viral Vector Lysis Kit提供了从腺相关病毒 (AAV) 样品裂解到病毒滴度定量的完整标准化工作流程。它摒弃了费力的纯化步骤，其改进的配方将QIAGEN强大的样品处理和定量能力相结合，特别适用于不同纯度（例如：生产阶段样本、高度纯化的病毒载体样本）及不同血清型AAV样本（例如：AAV1, AAV2、AAV5、AAV6、AAV8和AAV9）的纯化。同时，搭配使用QIAcuity CGT dPCR Assay，可愈加简单地实现AAV病毒滴度的一致、准确、精确、高度可重复的定量。QIAcuity CGT dPCR AssayQIAcuity CGT dPCR Assay，基于QIAcuity dPCR系统而开发，以实现AAV精确定量。10种常见靶标基因，每种具有3种荧光基团（FAM/HEX/CY5）可供选择双淬灭探针设计，减少背景信号以获得最佳性能避免AAV产品批次误差，保证批次间CV＜10%不依赖于标准品，具有更高的数据重复性和准确性支持单重和多重检测，具有客户定制功能，最多可实现5重dPCR检测动态范围广，精确度高AAV2 样本DNA 经连续稀释后利用QIAcuity CGT dPCR FAM Assay 进行检测。DNA 上样量为2.5-15000copies/μl。采用8.5k 纳米微孔板进行检测，相关系数大于0.99。所有Assay 的变异系数均小于4%。QIAcuity resDNA Quant KitQIAcuity resDNA Quant Kit，基于QIAcuity dPCR系统而开发，适用于3种常见细胞系（CHO、E.coli、HEK293）的宿主细胞DNA残留精确检测。内含阳性及内参对照，多拷贝靶标分析确保结果不受宿主细胞DNA碎片水平的影响与qPCR相比具有更高的检测灵敏度（检出限可低至5 fg）即使在PCR污染物和其他抑制剂存在的情况下，也能提供准确的宿主细胞DNA定量结果在低上样量的情况下，QIAcuity大肠杆菌ResDNA 定量试剂盒（dPCR）可提供更高的准确度反应设置参考制造商的实验流程，结果代表重复样本的平均值* 低于某厂商大肠杆菌定量试剂（qPCR）的动态范围QIAcuity dPCR系统QIAcuity集成式数字PCR系统，将微反应制备、PCR扩增和数据分析集成到全自动仪器中，整个流程只需一步手工操作，即可在2小时内快速获得实验结果。在提升检测速度和操作简便性的同时，也最大程度减少由于人工操作不当等外界因素引入的实验误差。同时，搭配QIAgility全自动体系构建系统，可实现dPCR反应体系的自动化配置，更大程度上减少人工操作，提高工作效率。此外，配套软件QIAcuity Software Suite，专为满足21CFR Part 11 规定的要求而设计。小编总结在细胞和基因治疗的整个质控流程，QIAGEN可实现CD3、CD28和ICOS等外源目的基因、AAV病毒滴度、残留宿主细胞、总细胞量、支原体和大肠杆菌的检测，所有Assay均经过严格的湿实验验证，确保其检测特异性和灵敏度。同时，更有EndoFree Plasmid Kit，将高效的内毒素去除步骤整合到质粒纯化流程中，得到的DNA高度适用于可重复且结果可靠的转染。聚焦生物制药，QIAcutiy大有可为，QIAGEN凭借其强大的研发实力，提供完整的、集成式的解决方案，以促进细胞和基因治疗行业的蓬勃发展。

上海科技大学季泉江教授团队在Cell Reports发表了题为 “Guide RNA engineering enables efficient CRISPR editing with a miniature Syntrophomonas palmitatica Cas12f1 nuclease”的研究论文。该论文报道了Syntrophomonas palmitatica Cas12f1（SpaCas12f1）的生化特征及DNA切割机制，证明CRISPR-SpaCas12f1系统能在细菌中实现多种编辑目的，且通过工程化向导RNA使该系统转化为哺乳动物细胞中高效的基因组编辑器。CRISPR-Cas系统是目前常用的基因编辑工具，但是由于传统的Cas核酸酶分子量普遍太大，使其在在体基因治疗的应用中受限。近年来，为了解决这一难题，小的Cas核酸酶逐渐被发现和探究。其中，Cas12f 核酸酶是目前紧凑的 CRISPR 效应核酸酶，比传统Cas9和Cas12a核酸酶小一半以上，在临床治疗应用中具有巨大潜力，然而高效的Cas12f基因编辑系统仍旧较少。图1.CRISPR-SpaCas12f1的表征与改造来自Syntrophomonas palmitatica的紧凑型SpaCas12f1只有497个氨基酸，该研究首先系统地表征了SpaCas12f1的生化特性及对DNA识别与切割的模式，证明了SpaCas12f1是一种镁离子依赖的嗜热核酸酶，可在tracrRNA和crRNA的帮助下有效切割含有5' -NTTY (Y代表C或T)PAM的双链DNA。此外，SpaCas12f1拥有与AsCas12f1相似的切割模式，即在靶向链上引入一个切口，非靶向链上引入两个切口（图1）。由于SpaCas12f1在大肠杆菌中拥有质粒干扰活性，为探究其能否成为一个在细菌中高效的基因组编辑工具，研究人员通过引入SpaCas12f1和Lambda Red重组酶系统及单链修复模板，实现了CRISPR-SpaCas12f1在大肠杆菌（Escherichia coli）和肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）中多种精准的基因组编辑。同时，研究人员发现SpaCas12f1的tracrRNA具有独特的head-to-toe的发夹结构，这是限制SpaCas12f1在哺乳动物细胞有效编辑的主要因素。通过对RNA二级结构预测及小RNA测序结果分析，研究人员设计了五种策略，系统地工程化向导RNA，成功地获得了高效的引导RNA，gRNA_MS13，从而实现CRISPR-SpaCas12f1高效哺乳动物细胞编辑。这项研究扩展了微型CRISPR核酸酶工具库，并为基因治疗和工程化微型CRISPR系统提供了新的思路。

8月末，华大基因基因检测在感染性疾病方面取得了新突破，推出了一款名为“PTseqTM呼吸道感染病原微生物靶向高通量基因检测”的产品，重新定义病原测序产品的应用方向，将重点放在呼吸系统感染的核心需求上，积极推动了感染性疾病的精准诊疗发展。呼吸道感染是临床最常见的感染性疾病之一，其病原组成复杂多样，约50％的患者很难明确病原体。因此，进行及时准确的病原学诊断，尽早确定目标病原并进行针对性用药治疗，是改善患者预后、降低病死率和后遗症发生率的关键。因此，华大基因积极研发基因检测产品，帮助医疗机构实现呼吸道感染病原体的精准诊断。华大基因基因检测推出的这款产品利用了国产自主测序平台、专利引物设计系统以及独有的污染校正算法，基于tNGS技术进行检测。它不仅具备了测序技术的广谱性优势，还兼具了多重PCR技术的高灵敏度优势，同时也具备了检测性能与高性价比。其检测范围涵盖了268种靶标，包括227种病原微生物、30种耐药基因和11种毒力基因。它不仅能够覆盖95%以上的呼吸道感染常见核心病原体，还可以进行重点耐药基因和毒力基因的鉴定。华大基因基因检测产品能够全方位地帮助患者制定个体化的抗感染治疗方案，降低耐药性的发生风险，助力呼吸道感染的精准诊疗。此外，华大基因基因检测产品具有高性价比、省时省力的特点，聚焦患者核心需求，可以一步到位进行DNA病原体+RNA病原体检测，价格远低于mNGS检测技术。从收到合格样本到报告出具，整个检测流程只需不到18小时。基于华大基因mNGS产品PMseq®十年检测积累的大数据，这款华大基因基因检测产品采用靶向高通量测序（tNGS）技术，使其在有效性和性价比之间取得了平衡，提升精准防控感染的技术可及性，为更多呼吸道感染患者精准诊疗提供另一种选择，普惠大众。这款产品将成为华大基因病原微生物检测产品体系的有力补充，推动感染性疾病的精准诊疗发展。一直以来，华大基因基因检测利用先进的测序技术，致力于为患者提供更加精准、高效和经济的感染性疾病诊断产品。通过提供准确的病原检测结果和个体化的治疗方案，华大基因基因检测产品为患者提供更优的治疗选择，帮助医疗机构更有效地应对呼吸道感染等感染性疾病。该产品的发布，为未来的感染性疾病诊疗研究提供了更广阔的空间。

一起涨“姿势”——那些年在我们身体里的基因表达近年来，阻碍人类健康长寿的第一大杀手就是疾病，例如癌症，是目前最难攻克的疾病之一。疾病研究和药物开发也一直是生命科学领域的专家学者不断攻克的领域。而目前的研究显示，人类的大多数疾病都会与细胞因子表达异常引起信号通路异常有关。报告基因对于基因表达的研究来说是非常有用的工具，它可以代替要研究的目的基因，从而帮助我们了解目的基因的信号通路和相关的疾病。荧光素酶是最常用的报告基因，使用光度计和化学发光功能的微孔板读板机我们可以很容易的检测到荧光素酶，另一方面，由于在细胞实验中其背景较低，因此具有很高的灵敏度。我们通常用萤火虫荧光素酶表达水平高低反映出我们感兴趣的基因在系统中的地位。而海肾来源的荧光素酶则更常在多荧光实验中作为第二种报告基因，来规范化多种在不同样本中变化较大的指标如转染效率，细胞活力等。NF- κB是参与细胞进程中许多基因表达的“主要调节者”，如炎症，免疫，分化，增殖和凋亡。肿瘤坏死因子α (TNF- α)可以激活细胞信号通路来降解NF- κB的抑制剂，从而促使其释放并进入核内，调节数百目的基因的表达。NF- κB通路的紊乱可以诱发多种疾病，如多发性硬化病，糖尿病，阿尔兹海默病等，因此利用合适的工具加深我们对NF- κB通路的理解是十分必要的。图1 NF-κB信号通路。TNF-α激活信号层级反应使NF-κB抑制剂IKB降解，并释放NF-κB转录因子。（了解更多资料请咨询美谷）SpectraMax® DuoLuc™ Reporter 试剂盒可以对哺乳动物细胞中的萤火虫和海肾荧光素酶进行高灵敏度的定量。依次向微板孔中加入两种适量的反应试剂即可检测荧光。这种双荧光信号检测系统可以在归一化检测荧光信号(萤火虫荧光)的同时提供持续表达的对照荧光信号(海肾荧光)。运用SpectraMax® iD5 多功能微孔板读板机、注射器系统和 SmartInject™ 技术可以将实验条件最优化。在这里我们将展示如何在哺乳动物细胞模型中， 通过双荧光报告检测系统和SpectraMax iD5 微孔板读板机来检测核转录因子κB (NF- κB)的活性。

2013年4月25日，华粤行（我司）细胞生物学新技术巡回交流会在北京天坛医院成功举办。 随着多种生物基因组测序工作的完成，现代生命科学研究已进入功能基因组研究时代，即利用细胞或动物作为研究模型和手段，研究测序得到的庞大的基因数据的功能和相互作用。而体外细胞研究如何更接近体内的生理、病理状态，如何高效的获得基因功能研究的细胞、动物模型，也是备受科研工作者关心的问题。本次交流会围绕该议题，深入交流探讨了低氧细胞/动物模型建立和转基因细胞/动物模型获取的新技术及应用进展。 Biospherix低氧细胞培养装置 会上，我司细胞学产品应用专员梁雪向与会老师介绍了Biospherix为低氧研究提供的全套解决方案，并交流了在干细胞、肿瘤、药物研发、疾病机理等领域低氧模型的建立及相关文献研究进展。 NEPA21高效基因转染系统 当介绍到NEPA21高效基因转染系统及其研究进展时，交流会进入高潮。NEPA21针对各种难转染细胞（胚胎干细胞、神经干细胞、神经元、免疫细胞、原代心肌细胞等）的高效电转效果，及在斑马鱼、胚胎活体、组织器官等方面的应用案例，引发了与会师生的高度关注和热烈讨论。我司应用专员与师生会深入探讨了大家在转染实验中遇到的难题，并交流了影响细胞转染效果的因素、改进措施及注意事项。本次交流会受到与会师生的一致欢迎和好评，感谢大家对华粤行细胞团队的关注与支持！ NEPA21高效基因转染系统 当介绍到NEPA21高效基因转染系统及其研究进展时，交流会进入高潮。NEPA21针对各种难转染细胞（胚胎干细胞、神经干细胞、神经元、免疫细胞、原代心肌细胞等）的高效电转效果，及在斑马鱼、胚胎活体、组织器官等方面的应用案例，引发了与会师生的高度关注和热烈讨论。我司应用专员与师生会深入探讨了大家在转染实验中遇到的难题，并交流了影响细胞转染效果的因素、改进措施及注意事项。本次交流会受到与会师生的一致欢迎和好评，感谢大家对华粤行细胞团队的关注与支持！

2012年5月，华粤行仪器有限公司（我司）细胞生物学新技术巡回研讨会携日本NEPA 21 新一代全能型高效基因转染系统来到科研创新实力雄厚的中国科技大学。为科研工作中遇到的难转染的免疫细胞－P493-6细胞提供了一种高效的转染方式。 P493-6细胞是人B淋巴细胞源细胞系，实验室采用脂质体转染法完全不奏效，利用病毒侵染方式也仅能得到不足5%的转染效率，这种困境一度让师生感到沮丧。而NEPA21 新一代全能型高效基因转染系统的尝试，获得了令实验者惊喜的转染效果。师生对NEPA21 全能型高效基因转染系统给予了高度评价。 NEPA21不需要转染试剂盒，利用优化的程序即可达到高的转染效率，为各种难转染细胞，如原代细胞、干细胞、神经细胞、免疫细胞、血液细胞等，以及离体组织和动物活体的转基因研究带来了便利。 NEPA21进行P493-6细胞GFP质粒转染效果图（图片由中科大提供）

FOBI整体荧光成像系统可以对动植物体发出的荧光信号进行采集成像。FOBI内置四种不同的荧光通道（蓝、绿、红、红外），应用于各种荧光蛋白和染料的标记分析。能快速实时得到直观、高品质的图像和视频。1、应用范围广：肿瘤、免疫、药物开发等生命科学领域各个都可应用；荧光成像信号强，曝光时间短，无须事先转染荧光素酶基因，在活体成像研究中比生物发光成像应用更广。2、实时：曝光时间短，成像快，可实时进行动物手术操作。3、真彩色：使用彩色CCD图像传感器，能获得全方位真彩色图像，对比度更高，图像更清晰。4、操作简单，功能实用：信号背景一键消除，软件界面简洁无复杂操作过程；可录制视频用于回顾分析和教学；仪器可改装用于较大动物。5、数据准确：采用LED散漫光光源，光均匀性好，信号采集误差小；软件去除荧光背景保证数据准确。6、小巧方便：仪器整体结构紧凑，体积小，重量轻，占用空间小，可自由选择实验场地，省去转移动物的麻烦。7、价钱便宜，维修成本低：采用实用的仪器部件和功能，节省成本，可自行选择仪器配置。8、用户多，有大量文献支持 ：已有100多篇SCI文章发表，包括Cell等高分期刊。创新点：（1）相比其它产品的伪彩处理，FOBI是真正意义上的真彩色图； （2）仪器整体结构紧凑，性能稳定，体积小，重量轻，占用空间小； （3）软件自带的一键扣除荧光背景信号和荧光定量分析功能，可在成像过程中实时分析图像的相对荧光强度和荧光区域的面积； （4）专为荧光成像应用设计； （5）无论成像质量和文章发表数目均在专做荧光成像的同类产品中处于领先水平。 FOBI整体荧光成像系统，小动物活体成像系统

转座在生物体基因重塑过程中具有关键性的作用。IS200/IS605 和 IS607 家族的插入序列（insertion sequences, ISs）是最简单的可移动遗传元素之一，仅包含其转座和调节所需的基因。2021年9月9日，张锋团队在Science杂志上发表了一篇题为 The widespread IS200/605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases 的文章（详见BioArt报道：Science | 张锋团队再发文：源于IS200/605转座子家族的多种核酸酶或可成为基因编辑新工具）【1】，重建了CRISPR-Cas9系统的进化起源，发现了3种高度丰富但功能未知的转座子编码的可编程RNA引导核酸酶：IscB、IsrB和TnpB，并对IscB的蛋白功能进行了详细探究。该研究还发现TnpB可能是CRISPR-Cas9/Cas12核酸酶的祖先，推测TnpB也具备RNA引导的核酸酶活性。近日，来自立陶宛维尔纽斯大学的Virginijus Siksnys团队（CRISPR开创者之一，通过研究CRISPR-Cas9 生化性质，得出了Cas9酶可以定点切割DNA的结论，特别致敬CRISPR幕后的英雄们——最全的一份CRISPR英雄谱）在Nature杂志上在线发表了题为Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease的研究论文。研究人员通过一系列生化实验证实CRISPR-cas核酸酶的祖先TnpB是可重编程的 RNA 引导的功能性核酸酶。TnpB通过reRNA（right element RNA，长非编码RNA，来源于ISDra2转座子中的RE元件）引导去切割靠近TTGAT转座相关模块（Transposon associated motif, TAM）5’端的DNA，并可以切割人类基因组DNA。如图1所示，IS200/IS605家族的Deinococcus radiodurans ISDra2中包含tnpA和tnpB基因，以及位于两侧的LE（Left element）和RE（Right element）。在纯化TnpB的过程中，作者发现有许多RNA也被一同纯化。对TnpB结合的RNA进行small RNA测序（sRNA-seq）分析，发现它们大多是长度约为150nt的长非编码RNA，来源于ISDra2中的RE序列，作者将这些RNA称为reRNAs（right element RNA）。reRNA 3’端的16nt来源于IS200/IS605转座子的侧翼DNA序列，其余序列与TnpB基因的3’端和RE序列匹配，说明TnpB可以与转座子3’端来源的reRNA形成RNP复合物。图1. D. radiodurans ISDra2位点PAM（protospacer adjacent motif）序列是Cas9或Cas12核酸酶启动DNA切割所必须的，那么TnpB发挥作用可能也需要类似的序列。通过PAM鉴定实验【2】，作者观察到在目标基因5’端上游富集了大量的TTGAT序列，并称之为Transposon Associated Motif (TAM)。体外DNA切割实验证实TnpB具备RNA引导的靶向dsDNA的核酸酶活性。进一步分析发现，将TnpB序列中的RuvC-like活性位点突变后，TnpB失去了切割能力，说明RuvC模块与TnpB的活性相关。研究人员发现实现TnpB的DNA切割功能需要同时满足两个条件：（1）TAM序列；（2）与靶基因匹配的位于reRNA 3’端的序列。随后，作者对切割产物进行了测序分析，结果显示，TnpB采取的是一种交错切割模式，在NTS（non-target strand）的多个位置和 TS (target strand) 的单个位置进行切割，最终产生5’-悬挂端（overhangs）（图2）。图2. TnpB-reRNA复合物切割双链DNA的实验设计及流程最后，作者探究了TnpB在细胞内切割目标dsDNA的能力。首先，在E.coli中进行的质粒干扰实验表明TnpB可以在原核生物体内切割dsDNA。紧接着，作者想知道TnpB是否可以应用于切割人类基因组。将编码TnpB和reRNA的工具质粒转染至HEK293T细胞中，72小时后，提取基因组DNA（gDNA）测序分析目标切割位点中的序列插入和删除（insertions and deletions，indels）情况（图3）。实验结果显示，TnpB在两个测试靶点（AGBL1-2和EMX1-1）中引入突变的频率为10%-20%，这与之前报道过的CRISPR-Cas9和Cas12的效率类似【3-7】。进一步分析发现，切割位点引入的删除突变占主导地位，与Cas12切割谱中观察到的现象类似【5,7】。这些结果说明RNA引导的TnpB核酸酶可以切割真核生物的基因组DNA。图3. 利用TnpB编辑人类基因组综上所述，该研究从ISDra2系统中鉴定了一个新的具有dsDNA切割功能的核酸酶TnpB，其在原核和真核细胞中均能有效切割dsDNA，具有编辑人类基因组的巨大潜力。在进化树上，虽然TnpB与微型 Cas12f核酸酶的关系最为紧密，但作者认为两者之间依旧存在重大区别：（1）TnpB与Cas12f使用的guide RNA不同；（2）TnpB是单体，仅需要一个reRNA；而Cas12f 核酸酶是二聚体，需要结合一个拷贝的crRNA-tracrRNA duplex；（3）TnpB需要TAM序列，Cas12f需要PAM序列，两种序列截然不同。原文链接:https://doi.org/10.1038/s41586-021-04058-1

近日，深圳市深研生物科技有限公司宣布完成了亿元级B轮融资。本轮融资由斯道资本领投，玖菲特投资、钜科投资跟投，老股东某国际知名产业集团持续跟投，星汉资本担任独家财务顾问。本轮所筹资金将用于公司细胞治疗智能化生产装备平台的研发及海内外市场拓展，同时将进一步加强对病毒载体大规模生产技术的研发。公司资料显示，深研生物成立于2014年，是一家专注于基因治疗及细胞治疗领域中的核心技术与核心工艺的研究与开发的科技型企业。公司致力于通过计算机科学、电子工程、纳米材料、化学工程等多学科与生命科学的交叉融合、技术创新，在生命科学领域发现革新途径，使生命科学技术向前快速演进，并逐步解决基因治疗、细胞治疗、生命科学与医药研发领域中所面临的一系列关键技术问题。在基因与细胞治疗核心技术领域，深研生物专注于开发核心技术。通过自身的技术优势和自主研发的自动化实验平台，公司开发了一系列生物技术平台，助力基因与细胞治疗领域的发展。针对传统瞬时转染方式生产慢病毒载体的缺点，深研生物创新地研发出基于稳转细胞系的慢病毒载体生产系统，EuLV® ️系统。这一技术突破了慢病毒载体规模化生产的技术瓶颈，大大提升了慢病毒载体的生产效率及产品一致性，并大幅降低了慢病毒载体的生产成本，为慢病毒载体的生产带来了革命性的改变。根据智慧芽数据显示，深研生物及其关联公司目前共有30余件专利申请，其中发明专利超过20件，公司专利布局主要聚焦于称重传感器、分离机等相关领域。

2021年度十大医疗创新（由美国克利夫兰诊所Cleveland Clinic评选），基因疗法成功入选。细胞与基因治疗改变了人类治疗遗传疾病和疑难杂症的方式，一些具有里程碑意义的研究将细胞和基因治疗推向制药工业面前，这个领域的迅速发展也带来了重大挑战，如病毒载体的攻克、如何将基因转移或编辑效率提高到有效治疗疾病所必需的水平，基因治疗后对患者的长期监测，以及基于现有生物技术的局限性是否能解决当前面临的一些问题等。数字PCR技术（ Digital PCR)作为新一代核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可直接数出含有DNA分子的微分区的个数，通过泊松分布算法对起始样品进行绝对定量。具有灵敏度高、精确度高、对抑制物的耐受度高等优势。在细胞和基因治疗领域中，数字PCR可以用于病毒基因组的拷贝数定量、标准物质的绝对定量、微生物快检、宿主DNA或RNA残留检测等方面。北京深蓝云生物科技有限公司（Cycloudbio）数字PCR产品经理-李冰先生与会报告“细胞与基因治疗中数字PCR方法的应用和实践”，聚焦在细胞和基因治疗领域中，数字PCR方法学的并行与转换为重点，更好地让广大临床、科研工作者了解数字PCR技术及其在基因和细胞治疗领域的相关应用。会议信息时间：2021年3月19日-20日地点：中国上海会议涵盖领域：细胞治疗，基因治疗，创新疗法，溶瘤病毒， CDMO，CRO，法规，IND应用，GLP，临床试验设计，GMP，免疫调节，病毒载体，高通量筛选，转染，联合疗法，IVD，数字PCR，CRISPR / CAS9基因编辑，人源化动物模型，mRNA肿瘤疫苗，纳米抗体，BsAbs，肿瘤微环境，干细胞疗法，重组蛋白等。深蓝云展台位置：A12深蓝云展台产品展示naica® 下一代数字PCR平台naica® 全自动微滴芯片数字PCR系统，以Sapphire芯片（全自动）或Opal（高通量）芯片为耗材，形成由25,000-30,000个微滴组成的单层二维阵列，该单层微滴阵列形成后直接进行PCR扩增实验。反应完成后对微滴进行三通道成像，从而对起始核酸浓度进行绝对定量。仅需2.5小时即可获取结果。▲ naica® 微滴芯片数字PCR系统Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统Azure Cielo实时荧光定量PCR系统来自于美国Azure Biosystems公司，配备高品质温度模块，采用光纤和CMOS的检测系统，高能LED的激发，提供高灵敏和可靠的数据。▲ Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统Echo正倒置一体显微镜Echo正倒置一体显微镜兼具正置和倒置显微镜的功能，方便小巧，一机多能，可以非常便利地通过旋转实现正倒置配置的切换；以先进的iPad Pro替代了传统目镜设计，进行操控，观察，传输，采集图像和管理，同时基于iOS的Echo app，使软件操作更加人性化。▲ Echo Revolve 正倒置一体显微镜▲ Echo Rebel 正倒置一体显微镜

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