主要是做反应中间产物的分离和鉴定。把反应体系中的有机物提出来,进行核磁、红外等分析,确定最后的物质结构。需要的量不多,我想也就是几十毫克,顶多100毫克级别的吧。查了下文献,发现可以用半制备色谱,也有用自动层析仪的。由于对这些仪器都没有什么概念,也不知道如何选择。自动层析仪好像也就2-3万左右,我们这有一台闲置的LC100分析性液相色谱,如果要改造成半制备性,可能也要往里投钱。所以想请有经验的能否指导一二。非常感谢!
主要是做反应中间产物的分离和鉴定。把反应体系中的有机物提出来,进行核磁、红外等分析,确定最后的物质结构。需要的量不多,我想也就是几十毫克,顶多100毫克级别的吧。查了下文献,发现可以用半制备色谱,也有用自动层析仪的。由于对这些仪器都没有什么概念,也不知道如何选择。希望这个功能实现,比较方便,不用操作那么麻烦。因为我们的主要核心研究不是 这个有机物提取。我们主要做有机物的质谱分析的。自动层析仪好像也就2-3万左右,我们这有一台闲置的LC100分析性液相色谱,如果要改造成半制备性,可能也要往里投钱。所以想请有经验的能否指导一二。
希望大家能给点儿关于硅胶柱层析方面的知识及自动液相层析仪的使用方法,谢谢~~
计划购买一台中压层析仪,不知道哪些牌子的好点,主要做天然药物分离
请问一下,有没有用过国产液相色谱层析仪来纯化蛋白质的?仪器的性能如何?上海沪析好象有,但以前用的是pharmacia的AKTA,不知道国产的能不能用,不敢买,大家给提供一下意见吧
请问:多糖疫苗的鉴定是如何做的?听说需要用到蛋白层析仪的。具体是怎么用呢?
全自动层析分离纯化系统和制备液相是一样的吗?有什么区别?
美国如何买层析柱(玻璃柱):做色谱层析分离用的
[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=81329]薄层色谱分析在层析分离过程中的应用[/url]
想用层析柱分离油脂和其中的抗氧化剂(也会做其他一些成分分离),在洗脱接收试管中,直接点样薄层层析检测洗脱成分(要保证95%以上的收率),紫外灯检测,是否会由于抗氧化剂刚洗脱时由于含量较低,检测灵敏度而观察不到???
层析技术的应用与发展,对于植物各类化学成分的分离鉴定工作起到重大的推动作用。如中药丹参的化学成分在30年代仅从中分离到3种脂溶性色素,分别称为丹参酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。但以后进一步的研究,发现除丹参酮Ⅰ为纯品外,Ⅱ、Ⅲ、均为混合结晶。此后通过各种层析方法,迄今已发现15种单体(其中有4种为我国首次发现)。目前新的层析技术不断发展,随着层析理论和电子学、光学、计算机等技术的应用,层析技术已日趋完善。 一.层析法的基本原理:层析过程是基于样品组分在互不相溶的两“相”溶剂之间的分配系数之差(分配层析),组分对吸附剂吸附能力不同(吸附层析),和寓子交换,分子的大小(排阻层析)而分离。通常又将一般的以流动相为气体的称为气相层析,流动相为液体的称为液相层析。 一、 吸附层析法(AdsorptionChromatography) (一)吸附剂、溶剂与被分离物性质的关系:液一固吸附层析是运用较多的一种方法,特别适用于很多中等分子量的样品(分子量小于1,000的低挥发性样品)的分离,尤其是脂溶性成分一一般不适用于高分子量样品如蛋白质、多糖或离子型亲水住化合物等的分离。吸附层析的分离效果,决定于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质这三个因素。 1. 吸附剂:常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。 (1) 硅胶:层析用硅胶为一多孔性物质,分子中具有硅氧烷的交链结构,同时在颗 粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分,因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降低。若吸水量超过17%,吸附力极弱不能用作为吸附剂,但可作为分配层析中的支持剂。对硅胶的活化,当硅胶加热至100~110℃时,硅胶表面因氢键所吸附的水分即能被除去。当温度升高至500℃时,硅胶表面的硅醇基也能脱水缩台转变为硅氧烷键,从而丧失了因氢键吸附水分的活往,就不再有吸附剂的性质,虽用水处理亦不能恢复其吸附活性。所以硅胶的活化不宜在较高温度进行(一般在170cC以上即有少量结合水失去)。 硅胶是一种酸性吸附剂,适用于中性或酸性成分的层析。同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂,其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子,当遇到较强的碱注化台物,则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。 (2)氧化铝:氧化铝可能带有碱性(因其中可混有碳酸钠等成分),对于分离一些碱性中草药成分,如生物碱类的分离颇为理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离。因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应,如异构化、氧化、消除反应等。除去氧化铝中绚碱性杂质可用水洗至中性,称为中性氧化铝。中性氧化铝仍属于碱性吸附剂的范畴,本适用于酸性成分的分离。用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝,不仅可中和氧化铝中含有的碱性杂质,并可使氧化铝颗粒表面带有NO3一或CI一的阴离子,从而具有离于交换剂的性质,适合于酸性成分的层析,这种氧化铝称为酸性氧化铝。供层析用的氧化铝,用于拄层析的,其粒度要求在100~160目之间。粒度大子100目,分离效果差:小于160目,溶浓流速大慢,易使谱带扩散。样品与氧化铝的用量比,一般在1:20~50之间层析柱的内径与柱长比例在1:10-20之向。 在用溶剂冲洗柱时,流速不宜过快,洗脱液的流速一般以每半~1小时内流出液体的毫升数与所用吸附剂的重量(克)相等为合适。 (3)活性炭:是使用较多的一种非极性吸附剂。一般需要先用稀盐酸洗涤,其次用乙醇洗,再以水洗净,于80℃干燥后即可供层析用。层析用的活性炭,最好选用颗粒活注炭,若为活性炭细粉,则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱,以免流速太慢。活性炭主要且于分离水溶性成分,如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭的有为吸附作用,在水溶液中最强,在有机溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱,而有机溶剂则较强。例如以醇-水进行洗脱时,则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物,对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用这些吸附性的差别,可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开,单糖与多糖分开,氨基酸与多肽分开。 2.溶剂:层析过程中溶剂的选择,对组分分离关系极大。在柱层析时所用的溶剂(单一剂或混合溶剂)习惯上称洗脱剂,用于薄层或纸层析时常称展开剂。洗脱剂的选择,须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑在用极性吸附剂进行层析时,当被分离物质为弱极性物质,一般选用弱极性溶剂为洗脱剂;被分离物质为强极性成分,则须选用极性溶剂为洗脱剂。如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂(如以硅藻土或滑石粉代替硅胶),则洗脱剂的极性亦须相应降低。 在柱层操作时,被分离样品在加样时可采用于法,亦可选一适宜的溶剂将样品溶解后加入。溶解样品的溶剂应选择极性较小的,以便被分离的成分可以被吸附。然后渐增大溶剂的极性。这种极性的增大是一个十分缓慢的过程,称为“梯度洗脱”,使吸附在层析柱上的各个成分逐个被洗脱。如果极性增大过诀(梯度太大),就不能获得满意的分离。溶剂的洗脱能力,有时可以用溶剂的介电常数(ε)来表示。介电常数高,洗脱能力就大。以上的洗脱顺序仅适用于极性吸附剂,如硅胶、氧化铝。对非极性吸附剂,如活性炭,则正好与上述顺序相反,在水或亲水住溶剂中所形成的吸附作用,较在脂溶性溶剂中为强。 3.被分离物质的性质:被分离的物质与吸附剂,洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要素,彼此紧密相连。在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下,各个成分的分离情况,直接与被分离物质的结构与性质有关。对极性吸附剂而言,成分的极性大,吸附住强。 当然,中草药成分的整体分子观是重要的,例如极性基团的数目愈多,被吸附的住能就会更大些,在同系物中碳原子数目少些,被吸附也会强些。总之,只要两个成分在结构上存在差别,就有可能分离,关键在于条件的选择。要根据被分离物质的性质,吸附剂的吸附强度,与溶剂的性质这三者的相互关系来考虑。首先要考虑被分离物质的极性。如被分离物质极性很小为不含氧的萜烯,或虽含氧但非极性基团,则需选用吸附性较强的吸附剂,并用弱极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱。但多数中药成分的极性较大,则需要选择吸附性能较弱的吸附剂(一般Ⅲ~Ⅳ级)。采用的洗脱剂极性应由小到大按某一梯度递增,或可应用薄层层析以判断被分离物在某种溶剂系统中的分离情况。此外,能否获得满意的分离,还与选择的溶剂梯度有很大关系。现以实例说明吸附层析中吸附剂、洗脱剂与样品极性之间的关系。如有多组分的混合物,象植物油脂系由烷烃、烯烃、舀醇酯类、甘油三酸醋和脂肪酸等组份。当以硅胶为吸附剂时,使油脂被吸附后选用一系列混合溶剂进行洗脱,油脂中各单一成分即可按其极性大小的不同依次被洗脱。 又如对于C-27甾体皂甙元类成分,能因其分字中羟基数目的多少而获得分离:将混合皂甙元溶于含有5%氯仿的苯中,加于氧化铝的吸附柱上,采用以下的溶剂进行梯度洗脱。如改用吸附性较弱的硅酸镁以替代氧化铝,由于硅酸镁的吸附性较弱,洗脱剂的极牲需相应降低,亦即采用苯或含5%氯仿的苯,即可将一元羟基皂甙元从吸附剂上洗脱下来。这一例子说明,同样的中草药成分在不同的吸附剂中层析时,需用不同的溶剂才能达到相同的分离效果,从而说明吸附剂、溶剂和欲分离成分三者的相互关系。
我要测土壤中的抗生素含量,目前计划流程是这样的:提取——HLB固相萃取——凝胶层析——LC/MS/MS检测因为腐植酸会对色谱影响很大,所以有人建议我用分子排阻滤掉大分子,但是我能查到的资料都是用凝胶色谱测定大分子的,想知道如果我只是要层析分离不用测定,是不是也要用专门的凝胶色谱柱?还是买了填料自己做个层析柱就可以?自己做的话怎么控制洗脱时间?从来没接触过凝胶,还请大大们指点!
大家好,第一次发帖,也是实验做的很郁闷啊,我分离的物质中等极性的黄酮类物质,氯仿甲醇试了 正己烷丙酮试了 还抹了很多体系都是顶多1个点 要不就是很长的拖尾 不知道怎么回事求解。谢谢 板子买的G254的高效薄层层析板
上世纪60、70年代是色谱/层析技术快速发展的时代,首先是层析介质有了飞速的发展,各种人工合成的介质出现,如硅胶、聚苯乙烯二乙烯基树脂、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺等树脂或凝胶的出现,极大地拓展了层析技术的应用领域和范围,基于不同介质的层析方法也如雨后春笋般不断涌现。如Bio-Rad公司于上世纪50年初推出的分析级离子交换树脂AG系列,广泛用于各种分子物质的分离纯化,包括无机离子、有机酸、核酸以及糖类等。值得一提的是,上世纪4、50年代正是DNA、RNA研究如火如 荼的时期,而Bio-Rad推出的AG系列树脂在核酸纯化方面具有极其出色表现,受到众多研究人员的欢迎与好评。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734846.JPG_small.jpg http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734847.JPG_small.jpg Bio-Rad AG系列树脂 此外,因为马丁(Martin)和辛格(Synge)的钻研与畅想,他们的预言分别在1952年及20世纪60年代被人们所应证。而马丁(Martin)和辛格(Synge)两人也于1952年被授予诺贝尔化学奖。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734849.JPG_small.jpg Bio-Rad专家介绍:其中设想1“流动相可用气体代替液体,因为与液体相比,分离时候,物质间作用力更小,对分离也就更有好处”也就是气相色谱仪(GC),即以气体作为流动相的色谱法,1952年诞生,目前,该法已被广泛应用于分离和分析复杂的多组分混合物。特别是挥发性物质,我们都知道挥发性物质在实验或分离时会受到干扰,而气相色谱仪的产生给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变单。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734850.JPG_small.jpg 设想2“若能够使用非常细的颗粒填料,并在色谱柱两端施加较大的压差,从而增加了理论培板数,这将会大大提高分离效率。”也就是高效液相色谱HPLC,20世纪60年代末诞生,现在高效液相色谱HPLC已成为化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术,是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可少的工具。高效液相色谱的优点是:检测的分辨率和灵敏度高,分析速度快,重复性好,定量精度高,应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点是:不能很好地兼容生物缓冲系统,因为HPLC系统通常采用不锈钢材质,因此具有良好的有机溶剂耐受性以及高压力承受。但是生物缓冲系统往往涉及到各种不同浓度的盐溶液,比如最常用的磷酸盐缓冲液等,而不锈钢系统不能耐受盐腐蚀,因此为了满足生物研究中样品的快速分析、分离,蛋白质快速层析技术应运而生。蛋白质快速液相层析(Fast Protein Liquid Chromatography),基于HPLC技术,但又有别于HPLC,它的主要液体接触部件均采用生物盐溶液耐受的塑料或者橡胶,这样能够极大地降低缓冲盐对系统的腐蚀,如Bio-Rad最早一代层析系统Biological LP,正是为了满足70-80年代间快速发展的生命科学领域内对未知组分、物质的分离、纯化的需求应运而生。在其诞生之初,风靡北美。下期,伯乐生命bio-rad专家将为大家带来21世纪层析法特点及先进层析系统,敬请关注!如今的色层分析法经常用于分析、分离无色的物质,已没有颜色这个特殊的含义,但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2014/01/A1388734851.JPG_small.jpg 现在我们简称为色谱法、层析法或色谱技术、层析技术。
这段时间,我一直在做乙草胺的纯化.我选用的是石油醚:乙酸乙酯=80:20湿法装柱,填柱用的硅胶:待分离样=1:10,也是用湿法加样,所用硅胶也在120度活化了两个小时。过柱子确实有一些杂质分离开了,但更多还是留在样品中,请问,我该改进哪些步骤可以提高分离效果呢?另外,还有,我分离后的样品回收率太低,一般柱层析的回收率能达到多少呢?
我在做柱色谱分析实验时,所用填料为硅胶(100-200目)2.5g,洗脱剂为(1)乙酸乙酯:甲醇=1:1,(2)甲醇,先用1系统20ml淋洗,再用2系统80ml淋洗,收集2系统洗脱液,但是最后结果都是2系统中所要成分大部分都在1系统的洗脱液中,但有时又能收集到合格的2系统洗脱液,造成结果很难重现。因为是注册的方法,没办法变操作大步骤,希望有人能指导一下层析柱的操作注意事项。 我正常的操作:①装柱子是用1系统浸润硅胶,湿法装柱,装的过程中会敲打或将柱子在台面上墩实、并使之平整。 ②然后用1-2ml 1系统液体溶解样品上样(尽量2-3次溶完样品洗进柱子),③再之后就是先把样放到柱子里,④再加1系统洗脱液20ml,洗脱,没有过多控制流速,因为流速已经很慢了(1秒1-0.5滴)。⑤流完1系统洗脱液至近干(弃去),缓慢小心加入80ml 2系统洗脱液(怕冲坏柱子),然后收集流出液。。。。 不知道有什么不妥的地方,请各位老师交流指正。
我在做柱色谱分析实验时,所用填料为硅胶(100-200目)2.5g,洗脱剂为(1)乙酸乙酯:甲醇=1:1,(2)甲醇,先用1系统20ml淋洗,再用2系统80ml淋洗,收集2系统洗脱液,但是最后结果都是2系统中所要成分大部分都在1系统的洗脱液中,但有时又能收集到合格的2系统洗脱液,造成结果很难重现。因为是注册的方法,没办法变操作大步骤,希望有人能指导一下层析柱的操作注意事项。 我正常的操作:①装柱子是用1系统浸润硅胶,湿法装柱,装的过程中会敲打或将柱子在台面上墩实、并使之平整。 ②然后用1-2ml 1系统液体溶解样品上样(尽量2-3次溶完样品洗进柱子),③再之后就是先把样放到柱子里,④再加1系统洗脱液20ml,洗脱,没有过多控制流速,因为流速已经很慢了(1秒1-0.5滴)。⑤流完1系统洗脱液至近干(弃去),缓慢小心加入80ml 2系统洗脱液(怕冲坏柱子),然后收集流出液。。。。 不知道有什么不妥的地方,请各位老师交流指正。
层析技术层析技术的应用与发展,对于植物各类化学成分的分离鉴定工作起到重大的推动作用。如中药丹参的化学成分在30年代仅从中分离到3种脂溶性色素,分别称为丹参酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。但以后进一步的研究,发现除丹参酮Ⅰ为纯品外,Ⅱ、Ⅲ、均为混合结晶。此后通过各种层析方法,迄今已发现15种单体(其中有4种为我国首次发现)。目前新的层析技术不断发展,随着层析理论和电子学、光学、计算机等技术的应用,层析技术已日趋完善。 一.层析法的基本原理:层析过程是基于样品组分在互不相溶的两“相”溶剂之间的分配系数之差(分配层析),组分对吸附剂吸附能力不同(吸附层析),和寓子交换,分子的大小(排阻层析)而分离。通常又将一般的以流动相为气体的称为[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]层析,流动相为液体的称为液相层析。 一、 吸附层析法(AdsorptionChromatography) (一)吸附剂、溶剂与被分离物性质的关系:液一固吸附层析是运用较多的一种方法,特别适用于很多中等分子量的样品(分子量小于1,000的低挥发性样品)的分离,尤其是脂溶性成分一一般不适用于高分子量样品如蛋白质、多糖或离子型亲水住化合物等的分离。吸附层析的分离效果,决定于吸附剂、溶剂和被分离化合物的性质这三个因素。 1. 吸附剂:常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。 (1) 硅胶:层析用硅胶为一多孔性物质,分子中具有硅氧烷的交链结构,同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键的形成而吸附水分,因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而降低。若吸水量超过17%,吸附力极弱不能用作为吸附剂,但可作为分配层析中的支持剂。对硅胶的活化,当硅胶加热至100~110℃时,硅胶表面因氢键所吸附的水分即能被除去。当温度升高至500℃时,硅胶表面的硅醇基也能脱水缩台转变为硅氧烷键,从而丧失了因氢键吸附水分的活往,就不再有吸附剂的性质,虽用水处理亦不能恢复其吸附活性。所以硅胶的活化不宜在较高温度进行(一般在170cC以上即有少量结合水失去)。 硅胶是一种酸性吸附剂,适用于中性或酸性成分的层析。同时硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂,其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子,当遇到较强的碱注化台物,则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。 (2)氧化铝:氧化铝可能带有碱性(因其中可混有碳酸钠等成分),对于分离一些碱性中草药成分,如生物碱类的分离颇为理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离。因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应,如异构化、氧化、消除反应等。除去氧化铝中绚碱性杂质可用水洗至中性,称为中性氧化铝。中性氧化铝仍属于碱性吸附剂的范畴,本适用于酸性成分的分离。用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝,不仅可中和氧化铝中含有的碱性杂质,并可使氧化铝颗粒表面带有NO3一或CI一的阴离子,从而具有离于交换剂的性质,适合于酸性成分的层析,这种氧化铝称为酸性氧化铝。供层析用的氧化铝,用于拄层析的,其粒度要求在100~160目之间。粒度大子100目,分离效果差:小于160目,溶浓流速大慢,易使谱带扩散。样品与氧化铝的用量比,一般在1:20~50之间层析柱的内径与柱长比例在1:10-20之向。 在用溶剂冲洗柱时,流速不宜过快,洗脱液的流速一般以每半~1小时内流出液体的毫升数与所用吸附剂的重量(克)相等为合适。 (3)活性炭:是使用较多的一种非极性吸附剂。一般需要先用稀盐酸洗涤,其次用乙醇洗,再以水洗净,于80℃干燥后即可供层析用。层析用的活性炭,最好选用颗粒活注炭,若为活性炭细粉,则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱,以免流速太慢。活性炭主要且于分离水溶性成分,如氨基酸、糖类及某些甙。活性炭的有为吸附作用,在水溶液中最强,在有机溶剂中则较低弱。故水的洗脱能力最弱,而有机溶剂则较强。例如以醇-水进行洗脱时,则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物,对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用这些吸附性的差别,可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开,单糖与多糖分开,氨基酸与多肽分开。 2.溶剂:层析过程中溶剂的选择,对组分分离关系极大。在柱层析时所用的溶剂(单一剂或混合溶剂)习惯上称洗脱剂,用于薄层或纸层析时常称展开剂。洗脱剂的选择,须根据被分离物质与所选用的吸附剂性质这两者结合起来加以考虑在用极性吸附剂进行层析时,当被分离物质为弱极性物质,一般选用弱极性溶剂为洗脱剂;被分离物质为强极性成分,则须选用极性溶剂为洗脱剂。如果对某一极性物质用吸附性较弱的吸附剂(如以硅藻土或滑石粉代替硅胶),则洗脱剂的极性亦须相应降低。 在柱层操作时,被分离样品在加样时可采用于法,亦可选一适宜的溶剂将样品溶解后加入。溶解样品的溶剂应选择极性较小的,以便被分离的成分可以被吸附。然后渐增大溶剂的极性。这种极性的增大是一个十分缓慢的过程,称为“梯度洗脱”,使吸附在层析柱上的各个成分逐个被洗脱。如果极性增大过诀(梯度太大),就不能获得满意的分离。溶剂的洗脱能力,有时可以用溶剂的介电常数(ε)来表示。介电常数高,洗脱能力就大。以上的洗脱顺序仅适用于极性吸附剂,如硅胶、氧化铝。对非极性吸附剂,如活性炭,则正好与上述顺序相反,在水或亲水住溶剂中所形成的吸附作用,较在脂溶性溶剂中为强。 3.被分离物质的性质:被分离的物质与吸附剂,洗脱剂共同构成吸附层析中的三个要素,彼此紧密相连。在指定的吸附剂与洗脱剂的条件下,各个成分的分离情况,直接与被分离物质的结构与性质有关。对极性吸附剂而言,成分的极性大,吸附住强。 当然,中草药成分的整体分子观是重要的,例如极性基团的数目愈多,被吸附的住能就会更大些,在同系物中碳原子数目少些,被吸附也会强些。总之,只要两个成分在结构上存在差别,就有可能分离,关键在于条件的选择。要根据被分离物质的性质,吸附剂的吸附强度,与溶剂的性质这三者的相互关系来考虑。首先要考虑被分离物质的极性。如被分离物质极性很小为不含氧的萜烯,或虽含氧但非极性基团,则需选用吸附性较强的吸附剂,并用弱极性溶剂如石油醚或苯进行洗脱。但多数中药成分的极性较大,则需要选择吸附性能较弱的吸附剂(一般Ⅲ~Ⅳ级)。采用的洗脱剂极性应由小到大按某一梯度递增,或可应用薄层层析以判断被分离物在某种溶剂系统中的分离情况。此外,能否获得满意的分离,还与选择的溶剂梯度有很大关系。现以实例说明吸附层析中吸附剂、洗脱剂与样品极性之间的关系。如有多组分的混合物,象植物油脂系由烷烃、烯烃、舀醇酯类、甘油三酸醋和脂肪酸等组份。当以硅胶为吸附剂时,使油脂被吸附后选用一系列混合溶剂进行洗脱,油脂中各单一成分即可按其极性大小的不同依次被洗脱。 又如对于C-27甾体皂甙元类成分,能因其分字中羟基数目的多少而获得分离:将混合皂甙元溶于含有5%氯仿的苯中,加于氧化铝的吸附柱上,采用以下的溶剂进行梯度洗脱。如改用吸附性较弱的硅酸镁以替代氧化铝,由于硅酸镁的吸附性较弱,洗脱剂的极牲需相应降低,亦即采用苯或含5%氯仿的苯,即可将一元羟基皂甙元从吸附剂上洗脱下来。这一例子说明,同样的中草药成分在不同的吸附剂中层析时,需用不同的溶剂才能达到相同的分离效果,从而说明吸附剂、溶剂和欲分离成分三者的相互关系。
薄层层析是将吸附剂或者支持剂(有时加入固化剂)均匀地铺在一块玻璃上,形成薄层。把欲分离的样品点在薄层上,然后用适宜的溶剂展开,使混合物得以分离的方法。由于层析在薄层上进行故而得名。 薄层层析是一种微量、快速的层析方法。它不仅可以用于纯物质的鉴定,也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定。还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。 根据分离的原理不同,薄层层析可以分为两类:用吸附剂铺成的薄层所进行的层析为吸附薄层层析;用纤维素粉、硅胶、硅藻土为支持剂铺成的薄层,属于分配薄层层析。 薄层层析中以吸附薄层为多用,吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。 吸附TLC→固定相为吸附剂→氧化铝、硅胶。(较多用)TLC→{ 分配TLC→固定相为液态(水)→固定相吸苷在支持剂上。 (一)吸附薄层的基本原理: 吸附薄层主要是利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同,及展开剂对它们的解吸附能力的不同,使各成分达到分离。 吸附作用主要由于物体表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德华力等产生。吸附强度决定于吸附剂的吸附能力,还受被吸附成分的性质影响,更与展开剂的性质有关。
柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。这两项技术掌握与 否,对于提高实验的效率至关重要。常见的例子是:在柱层析时,由于层析柱中的硅胶 填料装得不均匀(没有填严实),使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花,导 致分离效果不好。更常见的例子是:层析柱虽然装得不错,但是由于淋洗剂选择不恰 当,结果导致几十毫克产品,用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。分离同样的东 西,熟手可能只需要半个小时,而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。 由此可见,这两项技术掌握与否,对于提高工作效率,减轻工作量,减少有机溶剂的使用,从而对身心健康和环境保护都有明显的作用。 柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过 TLC确定。这里要指出的一点是:TLC的作用除了跟踪反应进程,检测试剂和原料纯度 外,一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。
常说的过柱子应该叫柱层析分离,也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。 柱子可以分为:加压,常压,减压。 压力可以增加淋洗剂的流动速度,减少产品收集的时间,但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的,但是时间也最长,比如天然化合物的分离,一个柱子几个月也是有的。 减压柱能够减少硅胶的使用量,感觉能够节省一半甚至更多,但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结),以及有些比较易分解的东西可能得不到,而且还必须同时使用水泵抽气(很大的噪音,而且时间长)。以前曾经大量的过减压柱,对它有比较深厚的感情,但是自从尝试了加压后,就几乎再也没动过减压的念头了。 加压柱是一种比较好的方法,与常压柱类似,只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气,双连球或者小气泵(给鱼缸供气的就行)。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大,不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 关于柱子的尺寸,应该是粗长的最好。 柱子长了,相应的塔板数就高。柱子粗了,上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是样品层比较薄),这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米,而样品就有二厘米,那么分离的难度可想而知,恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米,那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了,不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了(有些不环保的说,不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费)。 现在见到的柱子径高比一般在1:5~10,书中写硅胶量是样品量的30~40倍,具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分rf在0.2~0.4,杂质相差0.1以上),就可以少用硅胶,用小柱子(例如200毫克的样品,用2cm×20cm的柱子);如果相差不到0.1,就要加大柱子,我觉得可以增加柱子的直径,比如用3cm的,也可以减小淋洗剂的极性等等关于无水无氧柱,适用于对氧,水敏感,易分解的产品。 可以湿柱,也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次,因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解,毕竟要分离的是敏感的东东,小心不为过。也是因为分离的东西比较敏感,所以接收瓶一定要用可密封的,遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压,随需而定。因为是schlenk操作,所以点板是个问题,如果样品是显色的,恭喜了,不用点板,直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色,只好准备几十个schlenk瓶,一瓶一瓶的点,不过几次之后就知道样品在哪,也就可以省些了。像我以前过一根无水无氧柱,需要六个schlenk,现在只一个就能把所要的全收集到。 无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外,很容易是样品分解,特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的,选择余地比较大,但是比硅胶要贵些。
层析法又称色层分析法或色谱法(Chromatography),它是在1903-1906年由俄国植物学家M. Tswett首先系统提出来的。他将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱,并继续以石油醚淋洗,由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同,色素被逐渐分离,在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图(Chromatogram)。如图3-1 所示: 当时这种方法并没引起人们的足够注意,直到1931年将该方法应用到分离复杂的有机混合物,人们才发现了它的广泛用途。随着科学技术的发展以及生产实践的需要,层析技术也得到了迅速的发展。为此作出重要贡献的当推英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理论。这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论,以理论塔板来表示分离效率,定量的描述、评价层析分离过程。其次,他们根据液-液逆流萃取的原理,发明了液-液分配色谱。特别是他们提出了远见卓识的预言:一、流动相可用气体代替液体,与液体相比,物质间的作用力减小了,这对分离更有好处;二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差,应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数),这将会大大提高分离效率。前者预见了[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]的产生,并在1952年诞生了[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱仪[/url],它给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变革;后者预见了高效液相色谱(HPLC)的产生,在60年代末也为人们所实现,现在HPLC已成为生物化学与分子生物学、化学等领域不可缺少的分析分离工具之一。因此, Martin和Synge于1952年被授予诺贝尔化学奖。如今的色层分析法经常用于分离无色的物质,已没有颜色这个特殊的含义。但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。现在我们简称为层析法或层析技术。 层析法的最大特点是分离效率高,它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定,又可用于大量物质的分离纯化制备。因此,作为一种重要的分析分离手段与方法,它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在,它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。层析的基本理论 层析法是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同,使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如:我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异,使其在流动相与固定相之间的分配系数(或称分配常数)不同,达到彼此分离的目的。 对于一个层析柱来说,可作如下基本假设: 1. 层析柱的内径和柱内的填料是均匀的,而且层析柱由若干层组成。每层高度为H,称为一个理论塔板。塔板一部分为固定相占据,一部分为流动相占据,且各塔板的流动相体积相等,称为板体积,以Vm表示。 2. 每个塔板内溶质分子在固定相与流动相之间瞬间达到平衡,且忽略分子纵向扩散。 3. 溶质在各塔板上的分配系数是一常数,与溶质在塔板的量无关。 4. 流动相通过层析柱可以看成是脉冲式的间歇过程(即不连续过程)。从一个塔板到另一个塔板流动相体积为Vm。当流过层析柱的流动相的体积为V时,则流动相在每个塔板上跳越的次数为n:n = 5. 溶质开始加在层析柱的第零塔板上。根据以上假定,将连续的层析过程分解成了间歇的动作,这与多次萃取过程相似,一个理论塔板相当于一个两相平衡的小单元。层析的基本概念1. 固定相: 固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质(如吸附剂,凝胶,离子交换剂等),也可以是液体物质(如固定在硅胶或纤维素上的溶液),这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附,溶解,交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。 2. 流动相: 在层析过程中,推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等,都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂,薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。3. 分配系数及迁移率(或比移值): 分配系数是指在一定的条件下,某种组分在固定相和流动相中含量(浓度)的比值,常用K来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。 K=Cs/Cm 其中Cs: 固定相中的浓度,Cm: 流动相中的浓度。 迁移率(或比移值)是指:在一定条件下,在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf来表示。(Rf大于或等于1)可以看出:K增加,Rf减少;反之,会减少,Rf增加。 实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率是指:在一定条件下,在相同时间内,某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于1,也可以大于1。用Rx来表示。不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。很显然,差异越大,分离效果越理想。 分配系数主要与下列因素有关:①被分离物质本身的性质;②固定相和流动相的性质;③层析柱的温度。对于温度的影响有下列关系式: lnK = -(DG0/RT) 式中: K为分配系数(或平衡常数) DG0为标准自由能变化 R为气体常数 T为绝对温度 这是层析分离的热力学基础。一般情况下,层析时组分的DG0为负值,则温度与分配系数成反比关系。通常温度上升20°C, K值下降一半,它将导致组分移动速率增加。这也是为什么在层析时最好采用恒温柱的原因。有时对于K值相近的不同物质,可通过改变温度的方法,增大K值之间的差异,达到分离的目的。 4. 分辨率(或分离度) 分辨率一般定义为:相邻两个峰的分开程度。用Rs来表示。图3-2 是计算分辨率的示意图。 分辨率: 由上式可见,Rs值越大,两种组分分离的越好。当Rs = 1时,两组分具有教好的分离,互相沾染约2%,即每种组分的纯度约为98%。当Rs=1.5时,两组分基本完全分开,每种组分的纯度可达到99.8%。如果两种组分的浓度相差较大时,尤其要求较高的分辨率。 为了提高分辨率Rs 的值,可采用以下方法: ⑴ 使理论塔板数N增大,则Rs上升。 ① 增加柱长,N可增大,可提高分离度,但它造成分离的时间加长,洗脱液体积增大,并使洗脱峰加宽,因此不是一种特别好的办法。 ② 减小理论塔板的高度。如减小固定相颗粒的尺寸,并加大流动相的压力。高效液相色谱(HPLC)就是这一理论的实际应用。一般液相层析的固定相颗粒为100mm;而HPLC柱子的固定相颗粒为10mm以下,且压力可达150kg/cm。它使Rs大大提高,也使分离的效率大大提高了。 ③ 采用适当的流速,也可使理论塔板的高度降低,增大理论塔板数。太高或太低的流速都是不可取的。对于一个层析柱,它有一个最佳的流速。特别是对于[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url],流速影响相当大。 ⑵ 改变容量因子D(固定相与流动相中溶质量的分布比)。一般是加大D,但D的数值通常不超过10,再大对提高Rs不明显,反而使洗脱的时间延长,谱带加宽。一般D限制在1 £ D £ 10,最佳范围在1.5-5之间。我们可以通过改变柱温(一般降低温度),改变流动相的性质及组成(如改变pH值,离子强度,盐浓度,有机溶剂比例等),或改变固定相体积与流动相体积之比(如用细颗粒固定相,填充的紧密与均匀些),提高D值,使分离度增大。 ⑶ 增大a(分离因子,也称选择性因子,是两组分容量因子D之比),使Rs变大。实际上,使 a 增大,就是使两种组分的分配系数差值增大。同样,我们可以通过改变固定相的性质、组成,改变流动相的性质、组成,或者改变层析的温度,使 a 发生改变。应当指出的是,温度对分辨率的影响,是对分离因子与理论塔板高度的综合效应。因为温度升高,理论塔板高度有时会降低,有时会升高,这要根据实际情况去选择。通常,a 的变化对Rs影响最明显。 总之,影响分离度或者说分离效率的因素是多方面的。我们应当根据实际情况综合考虑,特别是对于生物大分子,我们还必须考虑它的稳定性,活性等问题。如pH值、温度等都会产生较大的影响,这是生化分离绝不能忽视的。否则,我们将不能得到预期的效果。5. 正相色谱与反相色谱 正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性,因此,在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快,先从柱中流出来。 反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性,在这种层析过程中,极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。 一般来说,分离纯化极性大的分子(带电离子等)采用正相色谱(或正相柱),而分离纯化极性小的有机分子(有机酸、醇、酚等)多采用反相色谱(或反相柱)。
我公司做薄层色谱,需大量硅胶板,因此欲求购薄层层析铺板器(手动、自动最好都有)详细信息及报价请发送至:[color=#DC143C]shboyg@126.com[/color][color=#DC143C]请可以提供本产品的供应商及时给与留言或留下联系方式![/color]
[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=86892]薄层层析分离氨基酸.ppt [/url]
常用的层析分析方法coolautumn 在分离分析特别是蛋白质分离分析中,层析是相当重要、且相当常见的一种技术,其原理较为复杂,对人员的要求相对较高,这里只能做一个相对简单的介绍。 一、 吸附层析 1、 吸附柱层析 吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相,以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。 2、 薄层层析 薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相,以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层,然后按纸层析操作进行展层。 3、 聚酰胺薄膜层析 聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时,展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程,就能导致分离物质达到分离目的。 二、 离子交换层析 离子交换层析是在以离子交换剂为固定相,液体为流动相的系统中进行的。离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行,或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。` 三、 凝胶过滤 凝胶过滤又叫分子筛层析,其原因是凝胶具有网状结构,小分子物质能进入其内部,而大分子物质却被排除在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时,溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。 四、 亲和层析 亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似,每对反应物之间都有一定的亲和力。正如在酶与底物的反应中,特异的废物(S')才能和一定的酶(E)结合,产生复合物(E-S')一样。在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力,并产生复合物。而亲和层析与酶一底物反应不同的是,前者进行反应时,配体(类似底物)是固相存在;后者进行反应时,底物呈液相存在。实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上,制成亲和吸附剂M-L,或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此,当把围相载体装人小层析柱(几毫升到几十毫升床体积)后,让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、范德瓦尔力,以及结构互补效应等作用吸附到固相载体上,而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来,并形成了第一个层析峰。然后,恰当地改变起始缓冲 液的PH值、或增加离子强度、或加人抑③剂等因子,即可把物质S从固相载体上解离下来,并形成了第M个层析峰(见图6-2)。显然,通过这一操作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲和力(其大小有差异)时,采用选择性缓冲液进行洗脱,也可以将它们分离开。用过的固相载体经再生处理后,可以重复使用。 上面介绍的亲和层析法亦称特异性配体亲和层析法。除此之外,还有一种亲和层析法叫通用性配体亲和层析法。这两种亲和层析法相比,前者的配体一般为复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似底物等),它具有较强的吸附选择性和较大的结合力。而后者的配体则一般为简单的小分子物质(如金属、染料,以及氨基酸等),它成本低廉、具有较高的吸附容量,通过改善吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。 五、 聚焦层析 聚焦层析也是一种柱层析。因此,它和另外的层析一样,照例具有流动相,其流动相为 多缓冲剂,固定相为多缓冲交换剂。 聚焦层析原理可以从PH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。 1、PH梯度溶液的形成 在离子交换层析中,PH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的。例如,当使用阴离子 剂进行层析时,制备PH由高到低呈线性变化的梯度溶液的方法是,在梯度仪的混合室(这层析柱者)中装高PH溶液,而在另一室装低PH极限溶液,然后打开层析柱的下端出口,让洗脱液连续不断地流过柱体。这时从柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低变化的。而在聚焦层析中,当洗脱液流进多缓冲交换剂时,由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团,故PH梯度溶液可以自动形成。例如,当柱中装阴离子交换剂PBE94(作固定相)时,先用起始缓冲液(配方见表了一2)平衡到PHg,再用含PH6的多缓冲剂物质(作流动相)的淋洗液通过柱体,这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用。随着淋洗液的不断加人,住内每点的PH值从高到低逐渐下降。照此处理J段时间,从层析柱顶部到底部就形成了PH6~9的梯度。聚焦层析柱中的PH梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的,但是随着淋洗的进行,PH梯度会逐渐向下迁移,从底部流出液的PH却由9逐渐降至6,并最后恒定于此值,这时层析柱的PH梯度也就消失了。 2.蛋白质的行为 蛋白质所带电荷取决于它的等电点(PI)和层析柱中的PH值。当柱中的PH低于蛋白质的PI时,蛋白质带正电荷,且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动,固定相中的PH值是随着淋洗时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境PH高于其PI时,蛋白质由带正电行变为带负电荷,并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过,蛋白质周围的环境PH 再次低于PI时,它又带正电荷,并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移,上述过程将反复进行,于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来,从而达到了分离的目的。 不同蛋白质具有不同的等电点,它们在被离子交换剂结合以前,移动之距离是不同的,洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。
目的要求(1)了解克隆基因表达的方法和意义。(2)了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。实验原理克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理,同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统,其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中,携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中,在 37℃,IPTG诱导下,超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白,该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸(NTA)使镍离子(Ni2+)固相化的层析介质加以提纯,实为金属熬合亲和层析(MCAC)。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。试剂和器材一、试剂 LB液体培养基:Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL. 氨苄青霉素:100mg/mL 上样缓冲液:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0 Washing Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0 IPTG二、器材摇床,离心机,层析柱(1′10 cm)操作方法一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中(含100ug/mL 氨苄青霉素),37℃震荡培养过夜。2. 转接1mL过夜培养物于100mL(含100ug/mL 氨苄青霉素)LB液体培养基中,37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h.4. 12,000rpm 离心10 min, 弃上清,菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化1. NTA层析柱的准备:在层析柱中加入1mL NTA介质,并分别用8mL 去离子水,8mL上样缓冲液洗涤。2. 重组蛋白的变性裂解:在冰浴中冻融菌体沉淀,加入5mL上样缓冲液, 用吸管抽吸重悬,超声波破裂菌体,用振荡器等轻柔的混匀样品60min, 4℃ 12000rpm 离心 30 min, 将上清吸至一个干净的容器中,并弃沉淀。取10ul 上清样品用于SDS-PAGE 分析。3. 上清样品以10-15mL/h 流速上Ni2+-NTA柱,收集流出液,取10ul样品用于SDS-PAGE 分析。4. 洗脱杂蛋白:用Washing Buffer以10-15mL/h流速洗柱,直至OD280 = 0.01.分步收集洗脱液,约3-4h,取10ul洗脱开始时的样品用于SDS-PAGE 分析。5. 洗脱目标蛋白:用Elution Buffer洗柱,收集每1 mL 级分,分别取10ul样品用于SDS-PAGE 分析。
我要比较好的从海洋沉积物中分离出pcbs(不含或含少量pah),我在文献看到会发生pcbs与pah共流出现象,用什么层析柱可实现pcbs与pah的分离。
一、实验目的1. 了解凝胶层析的原理及其应用。2. 通过测定蛋白质分子量的训练,初步掌握凝胶层析技术。二、实验原理凝胶层析又称排阻层析,凝胶过滤,渗透层析或分子筛层析等。它广泛地应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等,而测定蛋白质的分子量也是它的重要应用之一。凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质。用它来分离物质,主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子(近于球形)具有不同的排阻效应实现的。亦即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。分离原理参见“理论部分的凝胶层析一节”。对于某种型号的凝胶,一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外,只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外;而一些小分子不被排阻,可自由扩散,渗透进入凝胶内部的筛孔,尔后又被流出的洗脱液带走。分子越小,进入凝胶内部越深,所走的路程越多,故小分子最后流出柱外,而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间,只能进入一部分凝胶较大的孔隙,亦即部分排阻,因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后,分子便按照从大到小的顺序依次流出,达到分离的目的。凝胶层析分离原理示意动画。对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间,其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav(分离化合物在内水和外水体积中的比例关系)表示,Kav值的大小和凝胶柱床的总体积(Vt)、外水体积(V0)以及分离物本身的洗脱体积(Ve)有关:Kav = (Ve-V0)/(Vt-V0) ----------- (1)在限定的层析条件下,Vt和V0都是恒定值,而Ve是随着分离物分子量的变化而改变。分子量大,Ve值小,Kav值也小。反之,分子量小Ve值大,Kav值大。有关凝胶层析柱中凝胶自身(基质)体积(Vg)、外水体积(V0)、内水体积(Vi)及柱床总体积(Vt)的参见示意图。凝胶层析柱中的几种层析峰。有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要参数,同时也是测定蛋白质分子量的一个依据。在相同层析条件下,被分离物质Kav值差异越大,分离效果越好。反之,分离效果差或根本不能分开。在实际的实验中,我们可以实测出Vt、V0及Ve的值,从而计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶,在一定的分子量范围内,Kav与logMw (Mw表示物质的分子量) 成线性关系:Kav =-b logMw + C --------- (2)其中 b,C为常数。同样可以得到:Ve =-b'logMw + C' --------- (3)其中 b', C'为常数。即 Ve 与 logMw 也成线性关系。我们可以通过在一凝胶柱上分离多种已知分子量的蛋白质后,并根据上述的线性关系绘出标准曲线,然后用同一凝胶柱测出其它未知蛋白的分子量。三、器材与试剂(一)器材1. 玻璃层析柱((20mm×60cm)2. 恒流泵(或下口恒压贮液瓶)3. 自动部分收集器4. 紫外分光光度计5. 100ml试剂瓶6. 1000ml量筒7. 250ml烧杯8. 50ml、100ml烧杯9. 10ml(或5ml)刻度试管(二)试剂1. 标准蛋白(1)牛血清白蛋白:Mw=67,000(上海生化所)(2)鸡卵清清蛋白:Mw=45,000(美国SIGMA公司)(3)胰凝乳蛋白酶原A:Mw=24,000(美国SIGMA公司)(4)溶菌酶:Mw =14,3002. 未知蛋白质样品:由实验室准备3. 0.025M KCl-0.1M HAC(乙酸)(洗脱液1000ml)4. 蓝色葡聚糖-2000
在分离分析特别是蛋白质分离分析中,层析是相当重要、且相当常见的一种技术,其原理较为复杂,对人员的要求相对较高,这里只能做一个相对简单的介绍。 一、 吸附层析 1、 吸附柱层析 吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相,以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。 2、 薄层层析 薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相,以液体为流动相的一种层析方法。这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层,然后按纸层析操作进行展层。 3、 聚酰胺薄膜层析 聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时,展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程,就能导致分离物质达到分离目的。
[font=宋体]蛋白纯化介质在研究目的蛋白的结构、功能以及相互作用过程中起着至关重要的作用。亲和层析法因其出色的选择性、结合力和分辨率,成为一种常用的蛋白和抗体纯化方法。义翘神州提供的多种亲和纯化介质,不仅简单易用,而且适用于批量操作或重力驱动的纯化过程。这些介质能够高效、便捷、可靠地分离蛋白和抗体,为下游应用提供了强有力的支持,确保实验结果的可靠性和重复性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析法的原理[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]亲和层析法是利用生物大分子与特定分子间特异性、可逆结合的特性,实现生物大分子的分离。作为蛋白质分离的有效手段,通常仅需一步操作,即可获得高纯度的蛋白质。在亲和层析中,蛋白质的分离基于其与特定配体的特异性相互作用,而非共价结合的能力。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]凝胶过滤层析,又称分子筛层析法,是一种独特的蛋白质分离和纯化技术。当样本流经葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶等介质时,这些介质根据蛋白质的大小和形状进行筛选。经过这一过程,目的蛋白得以纯化,为后续的下游应用提供了高质量的原料。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]亲和层析操作步骤:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在进行亲和层析时,需将蛋白在适宜的条件下加载至柱子上,确保蛋白(或标签)与其配体之间能够发生特异性结合。随后,通过洗涤步骤,清除与固定相发生非特异性结合的污染蛋白,同时保持蛋白与配体之间的特异性相互作用不受干扰。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]接下来,采用含有竞争性分子的缓冲液进行洗脱,竞争性分子能够与配体结合,从而将目标蛋白从柱子上取代下来。这一步中,竞争分子通常会在后续的色谱流程或透析处理中予以去除。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]通过以上步骤,亲和层析成功实现了目标蛋白的纯化和分离,为后续的实验和应用提供了高质量的原料。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情请关注:[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析纯化蛋白[/b][/url][/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac[/font][/font][font=Calibri] [/font]