液相色谱长柱短柱

大约没有哪一年像2020年那样，太多人对它的期待是重启。如今，2020年终于画上了句号，当以后的某一天再回首，新冠、隔离会成为回忆，也会成为难忘的时代记忆。对于色谱耗材圈来说，过去的一年是那么的不平凡，疫情下经历了一次又一次的考验；同时，也是充满机遇的一年，医药领域的巨大需求使得下半年色谱耗材行业逆风而上。回顾2020年，艰难，却并不乏机会；展望2021年，变数仍在。过去的一年，色谱柱/填料行业有哪些事让我们刻骨铭心？未来这个行业又会出现哪些新变化？仪器信息网特别策划了视频/文字微访谈——“大咖访谈录之色谱耗材的昨天、今天与明天”，此次，我们特别邀请纳谱分析技术(苏州)有限公司董事长刘晓东谈一谈纳谱分析色谱耗材的过去和未来。纳谱分析技术（苏州）有限公司董事长刘晓东仪器信息网：请您认为2020年的色谱耗材圈关键词有哪些？刘晓东：2020是充满意外和挑战的一年。由于新型冠状病毒（“新冠”）疫情在全球范围内的传播以及中美关系的种种挑战，对世界格局和商业运作模式产生了深远影响。新冠疫情的肆孽极大地促进了新冠疫苗的研发，在全球范围内影响了生物制药的格局，其中基因治疗更是在反击新冠疫情中大放异彩：在2020年内已获美国FDA紧急使用授权的Pfizer和Moderna的新冠疫苗都是基于基因治疗的原理。Moderna COVID-19疫苗含有信使RNA（mRNA）。该疫苗含有一小段SARS-CoV-2病毒的mRNA，该mRNA指示体内的细胞产生该病毒的独特“尖峰”蛋白。人体收到这种疫苗后会产生刺突蛋白的副本，该蛋白不会引起疾病，但会触发免疫系统学习防御性反应，从而产生针对SARS-CoV-2的免疫反应。2020年在与生物制药企业和国家食药检单位的沟通中，色谱耗材的进口替代越来越多地被提及，除有成本上的因素之外，更多的是供应保证上的原因。举个例子，在生物制药的质检和研发中所需的液相色谱柱往往被一两家国外公司垄断，由于疫情和国与国之间的政治贸易冲突，这些色谱柱的生产质量和稳定供应受到波及，已严重地影响了项目进展。因此，色谱耗材的“高端”进口替代刻不容缓。仪器信息网：对于2020年，给您留下印象最深的事是什么？刘晓东：基因治疗的快速发展：基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，达到治疗目的。基因治疗可以对包含血友病、帕金森症、老年黄斑变性、肌萎缩侧索硬化症、遗传性血管水肿、嗜血细胞综合征、法布里疾病等适应症多种遗传病和老年性以及恶性疾病提供有效的解决方案。然而，目前业界对基因治疗药物和相关物质的分析表征还处于探索阶段，其中液相色谱是重要的分析表征手段之一，需要色谱柱和色谱仪厂家与药物研发人员和单位的密切合作，开拓出全新的色谱表征体系。 生物制药需要性能和稳定性更好的色谱耗材：抗体类生物药物是以往十年也将是未来十年的热点。由于抗体类生物分子稳定性和结构复杂性，其色谱表征极具挑战性。目前国内生物药物研发和生产质检不可或缺的生物色谱柱几乎完全依赖进口，生物色谱柱成本和稳定供应方面具有不确定性。尤其值得关注的是：当前公认的最好的生物色谱柱经常无法满足生物药物的研发和生产所需要的分离性能和稳定性，因此需要色谱柱厂家和生物制药企业通过紧密合作和创新，不断地开发出性能和稳定性更好的液相色谱耗材。 混合机制色谱柱的“兴起”：混合基质类型的色谱柱（填料）上世纪八十年代首次出现，而其规模商品化则是在2003年以后，主要生产厂家为SIELC和Dionex （2011年被Thermo Fisher收购）。SIELC混合机制色谱柱的开发策略以取代通用型液相色谱柱为目标，产品包括PrimeSep和Obelisc系列；Dionex则是以解决色谱分析中的疑难问题为重点，从而开发出一系列专用色谱柱，例如Acclaim Mixed-Mode、Acclaim Trinity、Acclaim Surfactant和GlycanPac AXH等，其中Acclaim Mixed-Mode WCX、Acclaim Mixed-Mode WAX作为全新的色谱柱类型已被美国药典收录为L78和L85。混合机制色谱柱具有选择性独特、可调的特点，对离子性物质的分离具有很好的适用性，但由于各种原因一直没有得到市场的重视。值得注意的是全球液相色谱柱的龙头Waters 新近推出了它的首款混合机制色谱柱Atlantis PREMIER BEH C18 AX，预示着这一独特的分离模式将受到更多的关注。仪器信息网：您认为明年的色谱柱/填料市场将有哪些新需求？贵公司将重点在哪些领域发力？是否会有相应的新产品推出？刘晓东：我认为2021年液相色谱柱的市场需求主要为三个方面：1）针对单抗、多抗和ADC异质体分离的高性能分离色谱柱；2）针对基因治疗药物及相关物质表征的色谱柱；3）针对市场“痛点”或标准方法的专用色谱耗材。对应上述需求，纳谱分析重点发展领域为：1）完善单抗类生物大分子表征用色谱柱体系；在目前已商品化的BioCore Protein A亲和柱、BioCore SEC体积排阻柱、BioCore WCX和BioCore SCX阳离子交换柱以及BioCore HIC疏水作用柱的基础上，进一步开发出BioCore 阴离子交换色谱柱、BioCore Glycan寡糖色谱柱、BioCore RP完整蛋白或蛋白片段色谱柱。2）针对基因治疗药物及其相关物质的色谱表征用色谱柱及方法的开发：推出DNACore系列色谱柱。3）针对目前分析分离痛点的“专用”色谱柱，包括ChromCore PEI 聚乙烯亚胺分析专用柱、ChromCore SAA表面活性剂分析专用柱、ChromCore PAH多环芳烃分析专用柱、ChromCore vADE维生素A、D和E分析专用柱等产品。 仪器信息网：新的一年，您对行业发展有哪些新期待？请问公司设立了哪些小目标？刘晓东：2021是充满挑战、也是充满希望的一年。纳谱分析期望在以下三个方面取得实质性进展：1）不断深化进口液相色谱耗材的高端国产取代，让不同领域的广大色谱分析工作者有性能优良、价格合理、供应保证的产品可以选用；2）重点发展生物制药研发和生产中不可或缺的液相色谱柱业务，通过不断创新和完善产品线而成为这一细分领域的引领者之一；3）运用先进的色谱填料技术和设计理念，研发出针对性强的专用色谱柱用以解决当前液相色谱分离中的“痛点”问题，从而建立纳谱分析在液相色谱分离填料技术方面的领先地位。从2018年成立以来，经过近三年的努力，纳谱分析在研发、生产和推广先进的色谱耗材产品和色谱技术理念等方面取得了显著进展：建立多个核心技术平台，申请14项发明专利，并以此为基础研发出了包括生物大分子分离（BioCore）、小分子分离（ChromCore）、手性分离（UniChiral）液相色谱柱以及样品前处理产品（SelectCore）等四大系列、近千个品规的产品，并逐渐受到越来越多色谱用户的认可。我们希望通过自身的努力和广大用户的支持，争取2021年的业务与2020年相比有80%以上的增长。此外，我们希望有机会与业界的同行合作互惠，共同为提高中国液相色谱产业化水平、为广大液相色谱用户提供优质的服务尽一份力，正如纳谱分析的公司愿景所述：成为“最可信赖的色谱分离合作伙伴和创新引导者”。 【背景】液相色谱是一种重要的科学分析手段，主要应用领域包括制药、生物技术、食品安全、环境监测、化工等行业和科研中的分析检测。液相色谱的核心元素是“色谱柱”。目前全球液相色谱柱每年约有300-400万根的需求量，折合15-20亿美元的销售额，并呈稳步增长的态势。其中（生物）制药的应用是推进液相色谱柱发展的重要动力，约占液相色谱柱销售总量的三分之一。在全球范围内，液相色谱柱主要被国外厂家垄断，其中Waters 、Agilent和Phenomenex三家占有50%以上的市场份额。中国色谱柱市场需求占全球市场10%左右。然而，与坚挺的市场需求相比，国产色谱柱只占全球市场份额的2%。目前中国液相色谱柱市场主要被Agilent、Shimadzu、Waters和Thermo Fisher等国外厂家垄断，国产色谱柱在国内市场占有率仅为20%，其中绝大部分国产液相色谱柱的色谱填料或微球原料依赖进口。从色谱柱的品种来看，国产液相色谱柱品规较为单一，尤其是生物制药中研发和生产质检不可或缺的生物色谱柱基本完全依赖进口。此外，国产液相色谱柱与进口产品相比在性能和质量方面尚有明显差距。国产液相色谱柱大都集中在质量要求不高而价格敏感的应用，缺乏核心竞争力，导致其发展受到局限。因此，液相色谱柱的国产化，特别是国际水平的国产化势在必行。纳谱分析技术（苏州）有限公司旨在打造一个世界领先、自主创新的液相色谱柱的中国品牌，实现液相色谱柱及色谱材料的高端国产化，打破外国公司在核心技术和产品上对该领域的长期垄断。在此过程中，培养一批液相色谱分离材料、色谱柱装填和应用开发的专业技术人才，和一个世界一流水平的产业化团队，助力中国液相色谱产业化水平的提升，为包括生物制药在内的广大用户提供高质量的产品和优质的服务。 【嘉宾介绍】刘晓东，纳谱分析技术（苏州）有限公司联合创始人/首席科学家/董事长。美国爱荷华州立大学化学博士。曾任世界500强科学仪器公司色谱耗材全球研发总监，具有丰富的研发管理、研发创新和战略规划经验以及广阔的国际视野；资深色谱分离技术专家，专注液相色谱分离材料和色谱柱研发20余年，擅长色谱填料顶层设计、表面化学修饰、色谱柱装填和应用开发，独立完成或主导了40余个新型液相色谱分离产品的研发和生产转移；拥有80余项发明专利，撰写50余篇相关技术论文和3篇液相色谱专业书籍章节，并在各种国际大型色谱会议上作50余篇报告。2018年回国创立纳谱分析技术（苏州）有限公司，致力于液相色谱柱的创新以及国际水平的产业化。刘晓东博士的创业项目受到江苏省各级政府的大力支持，已获2018年苏州工业园区创业领军人才、2019年姑苏创业领军人才、2019年江苏省双创创业人才、江苏省海外高层次人才等荣誉。

色谱柱高效液相色谱仪 色谱柱是高效液相色谱仪的重要组成部分，在色谱仪分析系统中起着分离作用，是色谱分析的核心部件，对高效液相色谱柱的正确使用不仅能延长色谱柱的使用寿命，还能有效保证实验结果。以下简单介绍液相色谱柱在使用过程中应当注意的问题 01性能测试 新色谱柱使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考依据 (柱性能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异有所不同，在测试中需保证方法一致性）。 02流动相的配制 液相色谱是通过样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点： 流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中（或长时间保留在柱中）。流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应。流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时既能得到好的分离效果，同时又降低柱压，延长柱子的使用寿命（可运用提高温度的方法降低流动相的黏度）。流动相的物化性质与使用的检测器相适应。流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。流动相配制好后，一定要进行脱气，除去溶解在流动相中的微量气体。 03新色谱柱使用前冲洗步骤 1、首先查看色谱柱的说明书，注意色谱柱封存的溶剂、推荐流速、pH值、最大耐受柱压、及最高使用温度等信息。2、如分析使用的流动相与色谱柱内储存的溶剂混溶，可以直接使用流动相参照色谱柱说明书中推荐的流速、温度等条件冲洗色谱柱20倍柱体积以上。如果分析条件使用的流动相与色谱柱内储存的溶剂不混溶，请选择与色谱柱内储存溶剂和流动相都混溶的溶剂，作为置换溶剂，逐步置换到分析使用的流动相。每次置换均应冲洗色谱柱20倍柱体积以上。 04日常使用注意事项 1、请使用HPLC级别以上的试剂作为流动相。2、流动相要用0.45um孔径以下的微孔滤膜滤过。3、流动相的pH值不能超出色谱柱的适用范围。4、注意流动相的流动方向要与色谱柱标识的方向一致。5、容易滋生微生物的流动相不要存放过久，要及时换新，以免微生物滋生污染色谱柱。6、色谱柱分析结束后要及时彻底冲洗。7、长时间不用的色谱柱要将流动相置换为色谱柱保存的溶剂，并两端用堵头封死保存。8、色谱柱要避免剧烈碰撞、跌落等。 05流动相流速的选择 因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不用的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1mL/min，对于内径4.0mm柱，流速0.8mL/min为最佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间（如使用反相柱时，可适当增加有机试剂甲醇或乙腈的含量）。 液相色谱柱在色谱分析中起着至关重要的角色，是样品分离的核心，正确使用色谱柱才能达到更好的理想的分离效果，提高色谱柱的使用寿命。 岛津液相色谱仪LC-40 融合“AI”与”loT”尖端技术的液相色谱仪诊断精灵＆修复精灵智能判断流动相中气泡的存在，主动排气，自动重启分析序列流速控制精灵智能流量控制，流速逐渐增加至柱温设定值，保护色谱柱流动相精灵储液盘内置传感器，实时监测流动相剩余量溶剂配置精灵自动以任意比例混合流动相，方便、准确地制备出分析所需流动相仓温管控精灵空气循环制冷控温模块，防止热空气进入样品仓形成冷凝水谱峰解析精灵最小肩缝提取，共流出峰切割，线性范围拓展

p 　　现代高效液相色谱分析中，色谱柱的选择直接影响了分离效果的好坏，选择合适的色谱柱可以缩短方法开发所需的时间，并且使方法更具稳定性。但是现在市场上色谱柱种类繁多，不同类型的色谱柱分离对象不同，因此，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。 /p p 　　色谱柱参数 /p p 　　物理性质 /p p 　　柱长，内径，如250*4.6mm。一般柱长在2—250mm，柱越长，分离度越高，但柱压更高，分离所需时间更长 但分离度与理论塔板数的平方根成正比，所以一昧增加柱长并不是最有效的分离手段，一般情况下，150mm、5um的填料可以提供足够的塔板数。 /p p 　　 center img alt=" 最全的液相色谱柱知识分享和选择技巧 你值得拥有！" src=" http://images.ofweek.com/Upload/News/2017-07/28/nick/1501205781977068668.jpg" width=" 640" height=" 195" / /center p /p p & nbsp /p p 　　粒径，影响色谱分离度。粒径越小，分离越快，柱效越高，但柱压力越高，柱容易被污染，导致柱寿命降低。常见分析柱通常使用5um填料，复杂的多组分样品分离一般使用3.5um粒径，更大内径的制备色谱柱通常使用更大的粒径。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选用更小的粒度的填料是很有用的。3.5um填料填充柱的柱效比相同条件下的5um填料的柱效提高近30% 然而，3.5um的色谱柱的背压却是5um的2倍，因此如何选择填料粒径需要根据现实情况而定。 /p p 　　 center img alt=" 最全的液相色谱柱知识分享和选择技巧 你值得拥有！" src=" http://images.ofweek.com/Upload/News/2017-07/28/nick/1501205794940065273.jpg" width=" 268" height=" 153" / /center p /p p & nbsp /p p 　　孔径，60A，120A，300A等。孔径小，则含孔率高，比表面积大，载碳量高 色谱柱填料孔径大小需和分子大小相匹配，保证分子自由进出填料孔并与孔内表面的键合相进行分离分配，通常要求孔径直径是分子直径的3倍以上，一般小分子使用80—120A，大分子使用300A。 /p p 　　 center img alt=" 最全的液相色谱柱知识分享和选择技巧 你值得拥有！" src=" http://images.ofweek.com/Upload/News/2017-07/28/nick/1501205810572019417.jpg" width=" 336" height=" 186" / /center p /p p & nbsp /p p 　　颗粒形状，一般有球形和不规则形，当使用黏度较大的流动相时，球形颗粒可以降低柱压，延长色谱柱寿命。 /p p 　　 center img alt=" 最全的液相色谱柱知识分享和选择技巧 你值得拥有！" src=" http://images.ofweek.com/Upload/News/2017-07/28/nick/1501205819292003604.jpg" width=" 428" height=" 166" / /center p /p p & nbsp /p p 　　比表面积，指的是每克填料的表面积，如180m2/g—350m2/g，与粒度和含孔率有关 比表面积大，会增加样品与键合相之间的反应，增加保留和分离度 比表面积小则可以缩短分析时间和平衡时间，并不是比表面积大或者小就更好，需要选择合适的比表面积。 /p p 　　化学性质 /p p 　　硅胶基质：最通用的基质，强度大，化学修饰容易，但使用的pH值范围有限(一般为2—8，特殊修饰的可以达到1—12)。 /p p 　　聚合物基质：多为聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂，化学稳定，应用pH范围宽，具有更强的疏水性，对蛋白质等样品分离效果较好 但强度较小，有机溶剂可能导致聚合物溶胀而受损，批次重复性较差，商品化色谱柱不多，一般价格较贵。 /p p 　　载碳量：基质表面键合相的比例，载碳量高，则保留增加，适合分析非极性化合物。 /p p 　　键合相：键合试剂不同，对化合物的选择性不同，一般长链的烷基键合相(C18 C8)比短链的(C4 C3)稳定 非极性的键合相比极性的键合相(-NH2)稳定。 /p p 　　封端：用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来，以减少残留的硅醇基，减轻待测组分与酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象。尤其对于极性样品而言，未封端处理的色谱柱分离效果较差。 /p p 　　正相& amp 反相色谱 /p p 　　目前市场上主要以反相色谱为主，约占80%的比例。& nbsp /p center img alt=" 最全的液相色谱柱知识分享和选择技巧 你值得拥有！" src=" http://images.ofweek.com/Upload/News/2017-07/28/nick/1501205763928073622.png" width=" 621" height=" 98" / /center p 　　在了解了色谱柱的基本知识后，色谱柱的选择也就迎刃而解了。 /p p 　　柱长及内径的选择 /p p 　　长度的选择：柱越长，总柱效越高(n值越大)，柱越长，分析时间也越长。250—300mm是最普遍的柱长，实验室一半以上的工作都是采用此规格柱子，一般用来分离l0到50个组份的中等至复杂混合物 500—600mm，要求较高分辨率的应用，—般用来分离大于50个组份或包含有难分离物质的复杂样品程序升温分析。 /p p 　　内径：柱效率与柱半径平方成反比，内径越小柱效越高，但内径越大，柱容量也增加，允许进样量就越多。当进样量超过柱容量时，则因柱内每块理论板内不能建立真正的平衡，将会导致色谱蜂畸变，柱分辨率降低，重现性不好。因此对于复杂样品需要精确分离，必须使用小内径柱子。另一方面若样品中存在具有很不相同浓度组份化合物，为了增加样品容量就必须使用内径大的柱子，目前实验室使用最常见的柱子内径一般是4.6mm。 /p p 　　一般选择原则：分析大分子量化合物选择大孔径色谱柱 对于高pH值或者碱性化合物需要选择高封端或者特殊封端的色谱柱，以改善峰形，延长色谱柱使用寿命等。 /p p 　　现在商品化的液相色谱柱琳琅满目，根据色谱柱的参数可以给我们提供一个初步的选择，但由于各个仪器厂商的填料技术和键合技术都有差异，即使都是C18柱，同一品牌不同系列都有不同的功能，有能耐受低pH值的、有耐高温的、有适合碱性样品的等等。所以在选择色谱柱前要好好研究色谱柱参数，仔细阅读色谱柱说明书，才能找到合适的色谱柱和适宜的分离方法。 /p /p /p /p /p