免疫共沉淀试剂盒

用酶联免疫试剂盒检测黄曲霉毒素时,试剂盒里面的酶标记物有沉淀,是什么原因？

[b][font=宋体]一、引言[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]在生物学和医学研究中，免疫技术已经成为一种重要的研究工具。其中，免疫沉淀（[/font][font=Calibri]Immunoprecipitation[/font][font=宋体]）和免疫共沉淀（[/font][font=Calibri]Co-Immunoprecipitation[/font][font=宋体]）是两种常用的技术，它们在探索蛋白质相互作用、定位蛋白质复合物等方面发挥着至关重要的作用。本文将对这两种技术的定义、应用、优缺点以及常见问题进行解析。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]二、[url=https://cn.sinobiological.com/services/ip-co-ip-service]免疫沉淀与免疫共沉淀[/url]的定义[/font][font=宋体][font=宋体]：[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]免疫沉淀：免疫沉淀（[/font][font=Calibri]immunoprecipitation[/font][font=宋体]）是指利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。它通常用于蛋白质的纯化和富集，以便进行后续的分析，如蛋白质谱分析或[/font][font=Calibri]Western blot[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]免疫共沉淀：免疫共沉淀（[/font][font=Calibri]co-immunoprecipitation[/font][font=宋体]）是一种用于检测两种或多种蛋白质之间相互作用的技术。当一种蛋白质与特异性抗体结合后，可以通过共沉淀的方式将与之相互作用的蛋白质一同沉淀下来。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]三、应用[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）免疫沉淀（[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]）一般可用于以下的研究分析[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1.[/font][font=宋体]磷酸化位点分析[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2.[/font][font=宋体]激酶活性分析[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3.[/font][font=宋体]乙酰化位点发现与鉴定[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）免疫共沉淀（[/font][font=Calibri]Co-IP[/font][font=宋体]）一般可用于以下的研究分析[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1.[/font][font=宋体]利用质谱鉴定相互作用蛋白[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2.[/font][font=宋体]蛋白相互作用的验证[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3.[/font][font=宋体]缺失分析联合[/font][font=Calibri]co-IP[/font][font=宋体]进行蛋白互作结构域分析[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4.[/font][font=宋体]测定两种目标蛋白质是否在体内结合[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5.[/font][font=宋体]确定一种特定蛋白质的新的作用搭档[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6.[/font][font=宋体]分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]四、优缺点[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]免疫沉淀：优点在于特异性高，能够有效地将目标蛋白与其他蛋白分离；缺点是需要大量的抗体和较长的实验时间。[/font][font=宋体]免疫共沉淀：优点在于能够直接检测蛋白质间的相互作用，且操作相对简单；缺点是可能会受到非特异性结合的干扰，导致结果出现偏差。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]五、常见问题解析[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]）免疫共沉淀中的[/font][font=Calibri]input[/font][font=宋体]是指什么？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]input[/font][font=宋体]是阳性对照。免疫共沉淀实验中，会直接取细胞裂解液进行[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]，用于验证细胞裂解液中确实存在目的蛋白，即阳性对照。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]2[/font][font=宋体]）如何避免重链，轻链的影响（点击此链接详述）[/font][font=Calibri]?[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]设计合适的[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]实验；[/font][/font][font=宋体]选择合适种属的抗体；[/font][font=宋体][font=宋体]选择特异性识别重链[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]轻链的二抗。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]（[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]）[/font][font=Calibri]Input[/font][font=宋体]对照组出现假阴性结果？[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]裂解液过于剧烈，采用温和的裂解条件；[/font][font=宋体]选择目的蛋白或相互作用蛋白含量低的样品：过表达提高目的蛋白的含量，进行免疫共沉淀。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]六、结论[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]总的来说，免疫沉淀和免疫共沉淀是两种强大且常用的免疫技术，各自具有独特的优势和局限性。了解这两种技术有助于我们更准确地理解和应用它们。在未来，随着生物技术的发展，这两种技术也将会更加完善，为科学研究提供更多的可能性。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]

[font=宋体]染色质免疫共沉淀[/font][font=宋体][font=宋体]染色质免疫共沉淀（[/font][font=Calibri]Chromatin Immunoprecipitation Assay, ChIP[/font][font=宋体]）：[/font][font=Calibri]ChIP[/font][font=宋体]是一项比较流行的研究转录因（[/font][font=Calibri]transcriptionfactor,TF[/font][font=宋体]）与启动子（[/font][font=Calibri]promoter[/font][font=宋体]）相互结合的实验技术。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]复合物，并通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]相互作用的信息。它能真实、完整地反映结合在[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]序列上的调控蛋白，是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的一种很好的方法。 [/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]染色质免疫共沉淀（[/font][font=Calibri]ChIP[/font][font=宋体]）实验的优点[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]与传统的研究转录因子和[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]相互作用的方法相比，染色质免疫共沉淀（[/font][font=Calibri]ChIP[/font][font=宋体]）技术是一种在体内研究[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]与蛋白质相互作用的理想方法。染色质免疫共沉淀（[/font][font=Calibri]ChIP[/font][font=宋体]）的优点在于能够在体内捕获转录因子和靶基因的相互作用，能同时快速地提供一种或者多种基因的调控机制，因此有着非常重要的应用价值。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]染色质免疫共沉淀（[/font][font=Calibri]ChIP[/font][font=宋体]）实验的局限性[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]染色质免疫共沉淀（[/font][font=Calibri]ChIP[/font][font=宋体]）技术也有一定的局限性：[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]第一，该技术需要抗目的蛋白或者特殊修饰标签的高度特异性抗体。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]第二，假阴性信号可能源于无效的抗体结合或者在交联过程中抗原受到干扰。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]第三，甲醛固定可能是暂时的，甚至是非特异的，可能导致相邻的蛋白形成假阳性信号。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]第四，难以同时得到多个蛋白质对同一序列结合的信息等。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]免疫共沉淀[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]免疫共沉淀[/font][font=Calibri](Co-IP)[/font][font=宋体]是免疫沉淀的延伸[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]主要用于蛋白[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]蛋白相互作用检测。如果样品溶液中存在与靶蛋白相互作用的目的蛋白[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]也会被一同捕获及纯化得到[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]通过[/font][font=Calibri]SDS-PAGE[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Western[/font][font=宋体]和质谱等方法鉴定与靶蛋白结合的蛋白。其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。其基本流程如下[/font][font=Calibri]:[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供免疫共沉淀（[/font][font=Calibri]Co-IP[/font][font=宋体]） [/font][font=Calibri]/ [/font][font=宋体]免疫沉淀（[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]）技术服务，推荐理由：[/font][/font][font=宋体][font=宋体]①一站服务[/font][font=Calibri], [/font][font=宋体]方便快捷[/font][/font][font=宋体][font=宋体]您只需提供细胞或组织裂解液，义翘神州助您完成免疫沉淀[/font] [font=Calibri](IP) [/font][font=宋体]和免疫共沉淀 [/font][font=Calibri](Co-IP) [/font][font=宋体]实验。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②经验丰富[/font][font=宋体][font=宋体]长期从事[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]相关检测的技术团队，具有丰富的实践经验。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③价格实惠[/font][font=宋体][font=宋体]使用义翘神州优质的[/font][font=Calibri]IP[/font][font=宋体]抗体和磁珠[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]胶珠，享受优惠价格。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以关注：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/ip-co-ip-service[/font][/font]

用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等化学试剂的盒子。主要有：　　1免疫共沉淀试剂盒　　2elisa试剂盒　　3sod试剂盒　　4反转录试剂盒　　5检测试剂盒　　6rna提取试剂盒　　7rt [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]试剂盒　　8诊断试剂盒　　9生化试剂盒　　10氯霉素检测试剂盒　　11葡萄糖试剂盒　　12免疫组化试剂盒　　13tunel 试剂盒　　14逆转录试剂盒　　15免疫荧光试剂盒　　16化学发光试剂盒　　17放射免疫试剂盒　　18细胞凋亡试剂盒　　19乳酸脱氢酶试剂盒　　20葡萄糖检测试剂盒　　21ldh试剂盒　　22脂联素试剂盒　　23胶回收试剂盒　　24mda试剂盒　　25猪瘟 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url] 试剂盒　　26ip3放免试剂盒　　27防癌隐血试剂盒　　28试剂盒价格　　29[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]试剂盒　　30蛋白提取试剂盒　　31dna提取试剂盒　　32mts试剂盒　　33bca 试剂盒　　34出血热试剂盒　　35sod试剂盒　　36酶联免疫试剂盒　　37心肌抗体试剂盒　　38支原体检测试剂盒　　39蛋白抽提试剂盒

免疫共沉淀和western blot区别

国产的酶联免疫试剂盒，质量较好的是哪几家？

1．概述赛庚啶酶联免疫反应测试盒是用于检测肌肉，肝脏，肾脏和尿液中赛庚啶残留。该试剂盒特点包括：Ø 高回收率，快速 ；Ø 高灵敏度（0.03ng/g或ppb）,低检测限（肉类/组织0.1ppb，尿液0.1ppb）；Ø 快速的ELISA检测方法（在不考虑样品数量下只需不到2小时）；Ø 高重现性。2．试剂盒原理赛庚啶酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联反应原理，相关的抗原已经包被于微孔板上。药物分析时，样品同特异性抗体一同加入孔中，如果样品中含有赛庚啶，会特异性竞争抗体，因而抑制板上包被的赛庚啶与抗体结合。HRP标记的二抗，与结合在板上一抗相结合，TMB底物加入板孔中，底物的颜色显色强度与样品中赛庚啶的含量成反比。

食品安全检测试剂盒。现已有氯霉素、克伦特罗（瘦肉精）、磺胺嘧啶、沙丁胺醇、链霉素等快速检测试剂盒。沙丁胺醇酶联免疫检测试剂盒检测灵敏度达0.1ng/ml。ruojun 楼主，这里是技术交流，不能做广告，你可以选择技术特点，检测过程，问题等进行。

通常单位里多选用酶联免疫试剂盒法检测瘦肉精等药残，每盒中都有多于实际使用量很多的浓缩洗液，1、对于不同检测试剂，如盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、磺胺等，它们的洗液是不是可以通用？2、稀释洗液用的蒸馏水是否可以用市面上桶装纯净水代替？对检测结果会产生什么影响？

请问有小伙伴用上海恒远生物科技有限公司免疫球蛋白的试剂盒吗？

1．概述REAGEN™红霉素酶联免疫反应测试盒是用于检测水/尿/肉/鱼/虾中的红霉素的残留量。该试剂盒特点包括：Ø 高回收率（80-105%），快速（10-40分钟），多种样品低成本提取方法。Ø 高灵敏度（0.5ng/g或ppb），牛奶检测下限(2.5 ppb)。Ø 高重现性。Ø 快速的ELISA检测方法（只需不到2小时）。2．试剂盒原理REAGEN™红霉素酶联免疫反应测试盒基于竞争性酶联反应原理，含有红霉素的药物抗原已经包被于微孔板上，在分析时，样品中药物特异性地与抗体相结合。如果药品中有药物存在，它将阻止包被于微孔板上的药物与抗体结合。当与样品药物相结合的药物抗体被洗涤去除后，只剩下与微孔内药物相结合的抗体，与经酶标记物相结合。反应后颜色深度与样品中红霉素的含量成反比。

如何做酶联免疫法试剂盒的有效性？

共沉淀分离富集重金属中，加温加酸解吸实验的解吸率如何计算

在ELISA试剂盒实验中每一个步骤都至关重要，其中的温育是在试剂盒实验中影响测定成败最为关键的一个因素。ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和 2～8℃。 保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA试剂盒板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜笼盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。ELISA试剂盒若用保温箱，应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。应留意温育的温度和时间应按划定力求正确。抗原抗体反应4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。室温温育的反应，操纵时的室温应严格限制在划定的范围内，尺度室温温度是指20～25℃，详细操纵时可根据仿单的要求控制温育。 要保证在设定的温度下有足够的反应时间，一般来说，加完样本和/或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温 升至37℃，需要一定的时间，尤其是在室温比较低以及非水浴的状态下，这段升温时间可能还比较长，而在临床实验室中，很少有人注意这个问题，通常是将微孔 板一放入温箱即开始计时，这样就很容易造成实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来的问题。因此，为保证37℃下足够的温育时间，临 床实验室可自行确定本实验室不同季节(不同室温下)微孔板从室温拿至温箱后需要多长时间孔内温度才能达到37℃，从而适当延长板条在温箱中的放置时间。

我想鉴别一下我们的BCA试剂盒的成分，我们的BCA试剂盒有3种液体组成A液，B液，C液。C液是蓝色的硫酸铜，就是不知道A液B液是什么，A液是白色瓶装的，B液是棕色瓶装的，B液应该是不能见光的。今天我在A液和B液中分别加入盐酸，A液有气泡产生，我猜想可能是碳酸类溶液，但是在B液中加入盐酸马上生成黄色絮状沉淀，不知道B液是不是二喹啉甲酸，不知道怎么去证明，求大神帮忙分析一下B液产生的黄色絮状沉淀是什么 成分。谢谢大家

酶联免疫法，你觉得试剂盒好用，还是试纸条好用？

共沉淀中分离富集重金属，探讨机理，加温加酸解吸实验应该如何做

请教各位高手：我总是做不好共沉淀，回收率做不上来，是怎么回事啊?条件是不是很苛刻啊？（比如说各种离子的浓度，温度，PH值），还有就是载体和被吸附离子的性质，离子量很大和微量的时候，被吸附的性质一样吗？比如说痕量硒可能会被La的沉淀吸附，那当硒是基体的时候，用La沉淀吸附硒中的其它杂质可行吗？怎么才能知道哪些离子会被吸附，哪些离子不能吸附啊？查书？通过仪器检测？

大神们，对于样品体积的影响应该如何测定？假设最初样品体积为100，当样品体积为200时，载体离子和共沉淀剂用量成倍增加，待测离子用量如何加？

ELISA酶联免疫法因其灵敏度高，特异性好的有点被广泛运用与各种实验。在ELISA试剂盒实验虽然时间短，但是过程十分复杂，且实验中的每个步骤都需要实验人员百分之百的投入。稍有疏忽很可能就会导致实验结果背景值过高、白板等现象。为了能让大家在ELISA实验前有个充分的了解，今天要为大家讲解的是ELISA试剂盒实验操作之标本采集及贮存。血清标本宜在新鲜时检测，严重溶血标本禁用。一般说来，在 5 天内测定的血清标本可放置于4℃，标本在冰箱中保存时间过长导致血清IgG 聚合，使间接法的 试剂 本底加深。超过一周测定的需-20℃保存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀并避免产生气泡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使 抗体 效价跌落，所以测 抗体 的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存;最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管;并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关;EDTA、酶抑制剂(如NaN3)可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性;血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。严重溶血，以 HRP 为标记的ELISA 测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性; 混有红细胞的血清 易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净;如有 细菌污染 ，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应; 标本凝固不全 ，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果; 采血试管洗涤不彻底 、反复使用易交叉污染; 塑料试管能吸附抗原物质 ，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。所以为了保证我们实验的结果，在标本采集和贮存的时候我们需要保证其不被污染不受到破坏。

各位: 我是一家蜂产品生产企业的化验员,从事蜂产品抗生素检验,一直以来我们都是用德国拜发的试剂盒,做的效果还不错.但是价格有点高,每年检验抗生素的费用太大,所以想考虑用国产的.可是我没有用过国产的,如果买回来一试不行就白花钱了,所以想请问做过这类检验的先生\女士们,请你们给我点见意,说说国产的试剂盒效果怎么样. 还有就是国产的哪个品牌好啊,价格多少?

评价酶联免疫试剂盒、胶体金检测卡的程序、标准操作或方法有哪些？

用酶联免疫法检测三聚氰胺时，哪家的试剂盒好用？分享心得时，高分奖励。

大佬们，共沉淀-火焰[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Wp][color=#3333ff]原子吸收光谱[/color][/url]法测定重金属时，可以ph大于11吗，用的是什么缓冲溶液

琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀反应。抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇时，便出现可见的白色沉淀线。这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时，便依各自扩散速度的差异，在适当部位形成独立的沉淀线，因此广泛地用于抗原成分的分析。琼脂扩散实验可根据抗原抗体反应的方式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免疫电泳、对流免疫电泳、单向及双向火箭电泳实验。一、单向琼脂扩散实验1. 材料（1）诊断血清（抗体：抗人IgG或IgA免疫血清）（2）待检血清（抗原）：人血清http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/02/B1361084631_small.jpg （3）参考血清：全国统一人血清免疫球蛋白参考血清（批号不同，免疫球蛋白含量不同）。（4）其它：生理盐水、琼脂粉、微量进样器、打孔器、玻璃板、湿盒等。2. 方法（1）将适当稀释（事先滴定）的诊断血清与予溶化的2%琼脂在60℃水浴预热数分钟后等量混合均匀制成免疫琼脂板。（2）在免疫琼脂板上按一定距离（1.2~1.5 cm）打孔，见图1。（3）向孔内滴加1：2，1：4，1：8，1：16，1：32稀释的参考血清及1：10稀释的待检血清，每孔10 μl，此时加入的抗原液面应与琼脂板一平，不得外溢。（4）已经加样的免疫琼脂板置湿盒中37℃温箱扩散24小时。（5）测定各孔形成的沉淀环直径（mm），用参考血清各稀释度测定值绘出标准曲线，再由标准曲线查出被检血清中免疫球蛋白的含量。二、双向琼脂扩散实验1. 材料（1）诊断血清：兔抗人血清（2）待测血清：人血清（3）阴性对照血清（4）其它：生理盐水、琼脂粉、载玻片、打孔器、微量进样器等。2. 方法（1）取一清洁载玻片，倾注3.5~4.0 ml 加热熔化的1%食盐琼脂制成琼脂板。（2）凝固后，用直径3 mm 打孔器，孔间距为5 mm。孔的排列方式如图2所示。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/02/A1361084537_small.jpg（3）用微量进样器于中央孔加抗体，于周围孔加各种抗原。加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。（4）加样后的琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24~48小时。（5）结果观察：若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原—抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。若在72小时仍未出现沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出现阳性对照与被检样品的沉淀线发生融合，才能确定待检样品为真正阳性。（6）结果分析：琼脂扩散结果受许多因素影响。①抗原特异性与沉淀线形状的关系：在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时，则可出现两单沉淀线的融合。反之，如相邻抗原完全不同时，则出现沉淀线之交叉；两种抗原部分相同时，则出现沉淀线的部分融合。见图3。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/02/A1361084538_small.jpg②抗原浓度与沉淀先导形状的关系：两相邻抗原浓度相同，形成对称相融合的沉淀线；如果两抗原浓度不同，则沉淀线不对称，移向低浓度的一边。见图4。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/02/A1361084539_small.jpg③温度对沉淀线的影响：在一定范围内，温度扩散快。通常反应在0~37℃下进行。在双向扩散时，为了减少沉淀线变形并保持其清晰度，可在37℃下形成沉淀线，然后置于室温或冰箱（4℃）中为佳。④琼脂浓度对沉淀线形成速度的影响：一般来说，琼脂浓度越大，沉淀线出现越慢。⑤参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线形成的影响：抗原、抗体相距越远，沉淀线形成的越慢，所以在微量玻片法时，孔间距离以0.25~0.5 cm 为好，距离远影响反应速度。当然孔距过远，沉淀线的密度过大，容易发生融合，有碍对沉淀线数目的确定。⑥时间对沉淀线的影响：沉淀线形成一般在1~3天出现，14~21天出现的数目最多。玻片法可在1~2小时出现，一般观察72小时，放量过久可出现沉淀线重合消失。

琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀反应。抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇时，便出现可见的白色沉淀线。这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时，便依各自扩散速度的差异，在适当部位形成独立的沉淀线，因此广泛地用于抗原成分的分析。琼脂扩散实验可根据抗原抗体反应的方式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免疫电泳、对流免疫电泳、单向及双向火箭电泳实验。一、单向琼脂扩散实验1. 材料（1）诊断血清（抗体：抗人IgG或IgA免疫血清）（2）待检血清（抗原）：人血清http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/02/B1361084631_small.jpg （3）参考血清：全国统一人血清免疫球蛋白参考血清（批号不同，免疫球蛋白含量不同）。（4）其它：生理盐水、琼脂粉、微量进样器、打孔器、玻璃板、湿盒等。2. 方法（1）将适当稀释（事先滴定）的诊断血清与予溶化的2%琼脂在60℃水浴预热数分钟后等量混合均匀制成免疫琼脂板。（2）在免疫琼脂板上按一定距离（1.2~1.5 cm）打孔，见图1。（3）向孔内滴加1：2，1：4，1：8，1：16，1：32稀释的参考血清及1：10稀释的待检血清，每孔10 μl，此时加入的抗原液面应与琼脂板一平，不得外溢。（4）已经加样的免疫琼脂板置湿盒中37℃温箱扩散24小时。（5）测定各孔形成的沉淀环直径（mm），用参考血清各稀释度测定值绘出标准曲线，再由标准曲线查出被检血清中免疫球蛋白的含量。二、双向琼脂扩散实验1. 材料（1）诊断血清：兔抗人血清（2）待测血清：人血清（3）阴性对照血清（4）其它：生理盐水、琼脂粉、载玻片、打孔器、微量进样器等。2. 方法（1）取一清洁载玻片，倾注3.5~4.0 ml 加热熔化的1%食盐琼脂制成琼脂板。（2）凝固后，用直径3 mm 打孔器，孔间距为5 mm。孔的排列方式如图2所示。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/02/A1361084537_small.jpg（3）用微量进样器于中央孔加抗体，于周围孔加各种抗原。加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。（4）加样后的琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24~48小时。（5）结果观察：若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原—抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。若在72小时仍未出现沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出现阳性对照与被检样品的沉淀线发生融合，才能确定待检样品为真正阳性。（6）结果分析：琼脂扩散结果受许多因素影响。①抗原特异性与沉淀线形状的关系：在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时，则可出现两单沉淀线的融合。反之，如相邻抗原完全不同时，则出现沉淀线之交叉；两种抗原部分相同时，则出现沉淀线的部分融合。见图3。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/02/A1361084538_small.jpg②抗原浓度与沉淀先导形状的关系：两相邻抗原浓度相同，形成对称相融合的沉淀线；如果两抗原浓度不同，则沉淀线不对称，移向低浓度的一边。见图4。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/02/A1361084539_small.jpg③温度对沉淀线的影响：在一定范围内，温度扩散快。通常反应在0~37℃下进行。在双向扩散时，为了减少沉淀线变形并保持其清晰度，可在37℃下形成沉淀线，然后置于室温或冰箱（4℃）中为佳。④琼脂浓度对沉淀线形成速度的影响：一般来说，琼脂浓度越大，沉淀线出现越慢。⑤参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线形成的影响：抗原、抗体相距越远，沉淀线形成的越慢，所以在微量玻片法时，孔间距离以0.25~0.5 cm 为好，距离远影响反应速度。当然孔距过远，沉淀线的密度过大，容易发生融合，有碍对沉淀线数目的确定。⑥时间对沉淀线的影响：沉淀线形成一般在1~3天出现，14~21天出现的数目最多。玻片法可在1~2小时出现，一般观察72小时，放量过久可出现沉淀线重合消失。

[size=3][font=宋体]免疫共沉淀（[/font][font=Times New Roman]Co-Immunoprecipitation[/font][font=宋体]）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质[/font][font=Times New Roman]X[/font][font=宋体]的抗体免疫沉淀[/font][font=Times New Roman]X[/font][font=宋体]，那么与[/font][font=Times New Roman]X[/font][font=宋体]在体内结合的蛋白质[/font][font=Times New Roman]Y[/font][font=宋体]也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]其优点为：（[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（[/font][font=Times New Roman]2[/font][font=宋体]）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（[/font][font=Times New Roman]3[/font][font=宋体]）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（[/font][font=Times New Roman]2[/font][font=宋体]）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（[/font][font=Times New Roman]3[/font][font=宋体]）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]实验流程为：[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]（[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]）转染后[/font][font=Times New Roman]24-48 h [/font][font=宋体]可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解[/font][font=Times New Roman]30min, [/font][font=宋体]细胞裂解液于[/font][font=Times New Roman]4[/font][font=宋体]°[/font][font=Times New Roman]C[/font][font=宋体]，[/font][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]最大转速离心[/font][font=Times New Roman]30 min[/font][font=宋体]后取上清；[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]（[/font][font=Times New Roman]2[/font][font=宋体]）取少量裂解液以备[/font][font=Times New Roman]Western blot[/font][font=宋体]分析，剩余裂解液加[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]μ[/font][font=Times New Roman]g[/font][font=宋体]相应的抗体加入到细胞裂解液，[/font][font=Times New Roman]4[/font][font=宋体]°[/font][font=Times New Roman]C[/font][font=宋体]缓慢摇晃孵育过夜；[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]（[/font][font=Times New Roman]3[/font][font=宋体]）取[/font][font=Times New Roman]10[/font][font=宋体]μ[/font][font=Times New Roman]l protein A [/font][font=宋体]琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗[/font][font=Times New Roman]3 [/font][font=宋体]次，每次[/font][font=Times New Roman]3,000 rpm[/font][font=宋体]离心[/font][font=Times New Roman]3 min[/font][font=宋体]；[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]（[/font][font=Times New Roman]4[/font][font=宋体]）将预处理过的[/font][font=Times New Roman]10[/font][font=宋体]μ[/font][font=Times New Roman]l protein A [/font][font=宋体]琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中[/font][font=Times New Roman]4[/font][font=宋体]°[/font][font=Times New Roman]C[/font][font=宋体]缓慢摇晃孵育[/font][font=Times New Roman]2-4h[/font][font=宋体]，使抗体与[/font][font=Times New Roman]protein A[/font][font=宋体]琼脂糖珠偶连；[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]（[/font][font=Times New Roman]5[/font][font=宋体]）免疫沉淀反应后，在[/font][font=Times New Roman]4[/font][font=宋体]°[/font][font=Times New Roman]C [/font][font=宋体]以[/font][font=Times New Roman]3,000 rpm [/font][font=宋体]速度离心[/font][font=Times New Roman]3 min[/font][font=宋体]，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用[/font][font=Times New Roman]1ml[/font][font=宋体]裂解缓冲液洗[/font][font=Times New Roman]3[/font][font=宋体]－[/font][font=Times New Roman]4[/font][font=宋体]次；最后加入[/font][font=Times New Roman]15[/font][font=宋体]μ[/font][font=Times New Roman]l[/font][font=宋体]的[/font][font=Times New Roman]2[/font][font=宋体]×[/font][font=Times New Roman]SDS [/font][font=宋体]上样缓冲液，沸水煮[/font][font=Times New Roman]5[/font][font=宋体]分钟；[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]（[/font][font=Times New Roman]6[/font][font=宋体]）[/font][font=Times New Roman]SDS-PAGE, Western blotting[/font][font=宋体]或质谱仪分析。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]注意的问题：[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]（[/font][font=Times New Roman]1[/font][font=宋体]）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（[/font][font=Times New Roman]NP40[/font][font=宋体]或[/font][font=Times New Roman]Triton X-100)[/font][font=宋体]。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（[/font][font=Times New Roman]0.2[/font][font=宋体]％[/font][font=Times New Roman]SDS)[/font][font=宋体]，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的[/font][font=Times New Roman] cocktailer[/font][font=宋体]。[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]（[/font][font=Times New Roman]2[/font][font=宋体]）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]（[/font][font=Times New Roman]3[/font][font=宋体]）使用对照抗体：[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]单克隆抗体：正常小鼠的[/font][font=Times New Roman]IgG[/font][font=宋体]或另一类单抗[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]兔多克隆抗体：正常兔[/font][font=Times New Roman]IgG[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] [/font][font=宋体]在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点：[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] (1) [/font][font=宋体]确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] (2) [/font][font=宋体]要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；[/font][/size][size=3][font=Times New Roman] (3) [/font][font=宋体]确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。[/font][/size]

当抗原与相应抗体形成一个接触面时，如二者比例适当，接触面上可形成一个乳白色的环状物即为阳性沉淀反应。一、材料（1）免疫血清：免疫兔抗人血清。（2）抗原：人血清。（3）小沉淀管、毛细吸管、橡皮头、生理盐水。二、方法（1）取小沉淀管2只，以毛细吸管吸取抗人血清约0.2ml，加入第一管，加时注意不能有气泡。（2）以毛细吸管吸取生理盐水0.2 ml 加入第二管。（3）用毛细吸管吸入血稀释0.2ml 加入各管，加时应注意使抗原溶液缓缓由管壁流下，轻浮于血清面上，使成一明显界面，切勿使之相混。（4）置室温中10~20分钟，观察液面有无乳白色沉淀环，若有则为阳性。

当抗原与相应抗体形成一个接触面时，如二者比例适当，接触面上可形成一个乳白色的环状物即为阳性沉淀反应。一、材料（1）免疫血清：免疫兔抗人血清。（2）抗原：人血清。（3）小沉淀管、毛细吸管、橡皮头、生理盐水。二、方法（1）取小沉淀管2只，以毛细吸管吸取抗人血清约0.2ml，加入第一管，加时注意不能有气泡。（2）以毛细吸管吸取生理盐水0.2 ml 加入第二管。（3）用毛细吸管吸入血稀释0.2ml 加入各管，加时应注意使抗原溶液缓缓由管壁流下，轻浮于血清面上，使成一明显界面，切勿使之相混。（4）置室温中10~20分钟，观察液面有无乳白色沉淀环，若有则为阳性。

一、IP前的准备工作：coIP：分为内源性蛋白的相互作用和非内源性蛋白相互作用（后者包括外源蛋白之间以及外源拖内源蛋白）。非内源性蛋白的相互作用，主要是通过过表达来实现，通常为简化实验、提高IP效率会让外源蛋白带上标签（tagged；这也是没有相应的可用于IP的内源蛋白抗体之前唯一可行的方案），因此就tag的使用而言存在很多小技巧。1. His-tagged主要用于纯化蛋白。有些人喜欢用His-tagged蛋白然后进行coIP，实际上它存在潜在的隐患。当初鄙人用Sigma a-His（鼠单抗；免费广告）WB外源蛋白发现CE里面一塌糊涂（带型漂亮就是非常多的带），那时候还抱怨这个抗体特异性不好。后来，当了解到很多蛋白会有富含histidine的domain以后，恍然大悟，恰恰是因为效价非常好，所以很多内源性的蛋白都被该抗体识别。同理，如果用Ni-NTA beads去PD His-tagged的蛋白，完全有可能PD那些内源性的富含histidine domain的蛋白，造成coIP的假象，而这样的蛋白还非常多。2. tandem-tagged不能用于分析钙调信号通路。tandem tag实际上从成本角度和His tag差不多，洗脱试剂价格低廉，因此可用于大规模PD之后的质谱分析，能获取最全面的相互作用的信息。然后由于其中包含钙调蛋白相互作用domain，天然会结合钙信号相关蛋白，从而干扰或掩盖靶蛋白与钙信号蛋白之间的相互作用，有一定的应用局限。当然，笔者不太清楚近年来该方法有无改进，但正是由于引入钙调domain才实现了降低成本的目的，因此猜测可能性不大。3. Myc、HA、Flag-tagged：Myc仍然会有天然的干扰，应用略有局限；相较后两者是人工合成专门用于tagged蛋白（有相应的专利，因此目前无论抗体或交联好的beads价格都非常昂贵），因此干扰最小、最常用。如需进一步细致区分，a-Flag效价比a-HA略高，因此更适合IP。当然，公司仍在努力寻找效价更好的a-HA以及IP HA的抗体（Flag系Sigma专利，因此目前只能忍受其过高的定价）。那么，之前颇流行的a-HA鼠源单抗（其clone名称为12CA5）为何被潜在地摒弃了？原因大概是：该克隆株可以轻易获取，流传甚广，因此可以取腹水自制；效价不高，特异性很差。尤其是特异性的问题，用该抗体去交联的beads做coIP，隐患很大（可以轻易PD非常浓的非特异性蛋白）——因此，购买商品化a-HA beads时，请仔细阅读产品说明（避开12CA5系列）。4. tag的位置。将tag构建到蛋白的N端还是C端，也是一个潜在的能够影响coIP结果的因素。比如，分泌蛋白的N端通常有分泌信号肽，如果将tag构建到N端，则外泌时会被信号肽酶连同信号肽一起切除；所以这时必须构建在C端。再如，多数蛋白的C端是疏水区，有的时候将tag构建在C端会影响蛋白原来的空间结构，如恰好C端同时是相互作用的结构域，某些时候还可能被遮蔽，从而干扰相互作用。因此，通常构建质粒的时候是N端、C端tagged同时分别构建，以备万一。内源性蛋白的相互作用，主要依靠抗体IP，WB或者质谱分析。另外一条途径，是用外源性蛋白的coIP指代内源性蛋白，上文提到的tandem-tag技术的目的就是为了实现这种可能。它的核心是将外源性蛋白的过表达降低极低水平用于模拟体内环境。实际上，在构建外源过表达体系的时候，通常可以得到一系列表达水平差异的稳定单克隆，可以通过进一步筛选获得外源与内源相加与原内源蛋白水平相当的细胞株（在细胞调控承受的范围以内，内源性蛋白水平会因为相应的外源蛋白表达而适当下调），这样的细胞株可以用于模拟内源性蛋白的相互作用；因为理论上未改变细胞的生理特异，相应的生命过程仍受内源因素调控。当然构建相应的细胞株需要转染并筛选，又因为要控制表达量水平，筛选工作耗时更长；并且细胞状态会因为传代过多而有些改变。因此，绝对的内源性蛋白的相互作用仍是一个不可或缺的数据，尤其对一个新发现的蛋白复合体。IP内源性蛋白首先要确认相应的抗体是否能够用于IP。能够用于IP的抗体，通常其识别区域恰是天然状态下靶蛋白暴露于外的区段，常为疏水性结构域；因此在自己制备抗体的时候要更多考虑这个因素，至于商品化的要仔细阅读说明。在确定抗体可以用于IP A蛋白以后，抗体投入量如何掌握呢？通常情况下0.1ug-3ug较常用（纯化的抗体），其变化取决于抗体的效价，但通常未知情况下0.5ug或1ug是最常用。一般如果样品易制备则尽量用样品过饱和抗体，让投入抗体能物尽其用；相反，通常1ug抗体已经是过量的。另外一个需要考虑的因素是B蛋白的大小，尤其B蛋白已知。当B蛋白分子量接近55KDa或24KDa附近的时候，问题会比较复杂。因为在最后一步洗脱的过程，很容易将轻链和重链带入到IP终产物，它将严重干扰实验结果。二、解决方案1. IP外源tagged-A蛋白，洗脱尽量用相应的peptide，一方面提高特异性，另一方面由于洗脱条件温和，重链和轻链脱落也会较少；在IP前，尤其对于新Flag、HA beads可以用washing buffer或者低pH Glycine-HCl漂洗一下beads，把结合不牢的重链和轻链先洗掉。此外，Flag、HA-beads通常是鼠抗，那么IB B蛋白的抗体应该选用兔抗。针对beads的新旧，反过来说，采用再生的旧beads有利于避免轻重链的干扰，且IP前的封闭可以省去——不要指望高盐、酸洗能彻底去除已经非特异结合到beads上的杂质，通常这些蛋白都比较黏。高盐、大量纯化蛋白时，采用再生的beads可以获取即便银染，背景仍非常干净的高纯度蛋白样品。2. IP内源性蛋白，尤其最后涉及低pH Glycine-HCl洗脱或者SDS LB煮beads（后者重、轻链更严重），如B蛋白为60KDa即能与55KDa重链分开时，且抗体效价许可的前提下，降低抗体投入量会显著减弱重、轻链信号，从而不会使得B蛋白信号不致被重链信号吞没；若有条件再配合交错抗体种属来源，即IP A蛋白的抗体为兔抗，IB B蛋白用兔抗以外任何一种诸如鼠抗、羊抗；反之亦然。即使交错抗体的种属，实际上当重轻链脱落过多时（尤其是重链），在IB的时候它符合《WB实战指南》提到的杂蛋白过浓会非特异结合任意抗体，这在coIP的实验结果分析中要格外小心。有人会说可以用未免疫的IgG做阴性对照，但是偶尔会发生一些未知意外，恰好IgG的重链没有显影（毕竟这不是抗原抗体特异性结合）。BTW：偶尔这样的结果还能重复出来，但是反过来IP B蛋白，IB A蛋白可能就100%失败。所以，当蛋白分子量接近重、轻链的时候，下结论要格外小心，除严格阴性、阳性对照外，reverse IP的结果也很重要。最好加一个不相干的蛋白的同种属的抗体做阴性对照beads封闭和样品的preclear：如果采用新beads，beads的封闭就显得非常必要。封闭用1-5mg/ml BSA（ChIP还要加鱼精DNA）扔buffer里一直静置就好了；若临时添加可考虑翻转半小时；样品preclear用protein A beads翻转半小时。实际经验，杂蛋白若是很黏怎么处理都只是相对好一些。所以，IP、漂洗的盐浓度影响更大。coIP：抗体剂量上文提过了；其他flag、protein A等等beads一般用10ul足够了，偶尔根据需要微调，诸如过表达纯化蛋白。总之，一般CE的成本较低，若用CE饱和抗体、beads，只要你抗体、beads和操作始终一致，最后IP的A蛋白能保证一致，结果有效。干粉状的beads用IP buffer充分溶胀后离心去beads的碎片；其他液态的不需要此过程。现在市售的商品化beads如sigma flag可不需要IP buffer漂洗直接IP，未发现对coIP结果的明显干扰。通常，再生的beads由于放置-20度延长保存期需要加入大量甘油，不漂洗直接使用不容易把beads分匀，从而造成不同tube间初始差异，这时候会对IP结果影响很大。用抗体做内源性IP时，个人喜欢抗体2hr+beads 1hr，抗体孵育可过夜；beads不超过3hrs（含flag等等标签蛋白IP情况）。这里面提到一个细节，就是先加beads还是先加抗体。在某些情况下，CE离心去除细胞碎片后的上清是一个刚好的溶解平衡体系，添加其他物质如beads这类可作为沉淀凝结核的物质会破坏原本的溶解平衡；它可能类似水蒸气凝结成雨水或雪花需要灰尘作为凝结核，其结果就是让一些原本溶解完全的蛋白发生沉淀。那么，beads翻转越久蛋白会沉淀越多，而这种沉淀无法靠漂洗去除干净，最终进入sample从而可以检测到任意蛋白的结合。因此，限制beads翻转孵育时间非常关键；通常beads孵育1-2hr已经充分结合了。做IP的beads其物理性质跟吸附DNA的或诸如Ni-NTA之类的差异很大，不需要高速离心，通常台式小离心机4-5K、30sec就足够了；有时候忘记了，静置较久beads已自然沉降甚至不需要离心。在这种情况下，不必要的高速离心只会给beads施加巨大的离心力，次数多了beads通通碎裂，严重影响再生beads的质量——避免一些不必要的操作；当然不打算重复使用就无所谓了。三、Beads再生商品化的