离子交换层析介质

近期，东曹生物科技新推出了一款新型的阴离子交换层析介质TOYOPEARL NH2-750F， 它具有不同于普通阴离子交换填料的高耐盐性和选择性，即使在0.15 mol/L的NaCl甚至更高盐浓度的缓冲液中仍然能够保持较高的吸附载量。 产品特点及优势 NaCl浓度超过0.15 mol/L下仍然可以吸附蛋白样品。 酸性蛋白在低于等电点的酸性条件下依然能被吸附。 样品原液可以直接上样，无需稀释 该款填料可以使用线性梯度或者穿透模式来去除抗体中的多聚体。 具有100 nm的孔径，适合IgG和生物大分子样品的纯化 产品介绍手册请点击下载：http://www.instrument.com.cn/netshow/SH101626/down_330056.htm

下游工艺先进性决定了药品的质量抗体药物生产是个非常复杂的过程，大致分为上游的发酵及下游的分离纯化：上游工艺主要包括细胞复苏、传代、发酵生产。而下游工艺主要包括膜过滤及多步层析分离纯化。过去十多年来，基因工程获得突飞猛进的进步，细胞培养的表达量从原来的不到0.5 g/L 到现在普遍达到5g/L，有的甚至超过10g/L。这些进步是由细胞表达载体的开发，克隆筛选以及细胞培养基优化等技术创新所驱动的。由于发酵产率的大幅度提升，使得上游细胞培养成本大幅度降低，下表是抗体生产成本与表达量的关系。表1.表达量与抗体生产成本关系Titer（g/L）Annualproduction（1000kg）DisposableMaterial物料成本（$/g）Cell Culture PurificationFacilitiesc厂房/设备/人工FormulationCost（$/Vial）Total Cost（$/Vial）100 mg 1 g0.51204100422 134244425413 435102410412 26与上游十多倍生产效率提升相比，下游分离纯化技术进步明显滞后，导致下游工序成为生产瓶颈，抗体主要生产成本也转移到下游。下游工艺在整个生物制药生产中占据60%以上生产成本，也被认为是最需要改进的技术领域。下游工艺先进性决定了药品的质量，及药品生产效率和成本，也成为生物制药企业的核心竞争力所在。由于生物分子由于结构复杂，对外部条件敏感，稳定性差，杂质多，浓度低等特点，且监管部门对生物药的纯度和质量要求越来越高。因此下游的分离纯化成为生物制药的瓶颈，也是生物制药成本最大的一块。层析技术由于具有分离纯化效率高，条件温和且容易保持目标分子的生物活性，因此层析是生物制药分离纯化最主要方法。层析介质的“皇冠之珠”——令人爱恨交加的Protein A生物大分子的层析方法主要分为亲和，离子交换，疏水作用及体积排阻。亲和层析是利用介质上的配基与目标蛋白分子有特异性结合，而对其它的蛋白质及杂质不吸附，因此杂质从层析柱中流出，被吸附的目标生物分子通过改变洗脱液的条件使被分离物质与配基解吸附，即可达到分离纯化的目的。亲和层析无疑是最理想的层析分离方法，其与其它分离方法如离子交换、疏水、体积排阻等最大的不同是由于亲和层析只与目标生物分子发生专一性吸附，其它杂质都不吸附，因此亲和层析分离纯化的工艺条件与杂质的组成及含量多少关系不大，从而大大简化亲和分离工艺开发方法，而其它分离方法如离子交换、疏水、体积排阻等都是基于目标分子跟杂质分子之间的大小，电荷及疏水强度的差异来分离的，因此即使分离纯化同样的目标分子，但不同样品的杂质组分不同，含量不同，纯化工艺方法就需要重新调整。Protein A填料由于与大多数抗体有特异性吸附，因此被广泛地用于抗体药物生产过程中，极大地提高了抗体的分离纯化效率，毫无疑问Protein A 亲和介质是层析介质的皇冠上的明珠，其价格也是普通层析介质的十几倍。Protein A 亲和层析介质之所以会成为层析介质的贵族与它对抗体有特异性吸附有关。Protein A 亲和层析是利用Protein A 配基与目标抗体具有专一亲和吸附作用从而达到分离纯化抗体的目的。因为配基与目标抗体的作用的专一性，其分离纯化与目标样品抗体纯度无关，也与样品杂质含量和种类多少无关，使用Protein A 填料一步纯化目标抗体就可以达到95%纯度以上，回收率达到90%以上。Protein A 层析介质的出现，让抗体的分离纯化步骤及方法大大简化，使得抗体的分离纯化比其结构简单多的生物分子都要简单。抗体分离纯化基本都是标准化的三步曲，第一步用Protein A进行抗体捕获，第二步用阳离子去除多聚体，第三步用阴离子精纯去除剩余少量杂质。Protein A亲和层析已经成为平台化技术，被广泛应用在抗体类分子捕获阶段。Protein A与抗体分子之间可特异性结合，特别对IgG1、IgG2、IgG4有较强亲和作用，使得抗体分子与发酵液中不具FC端结构的杂质如宿主蛋白与核酸等有效分离，进而达到纯化目的。亲和特异性赋予了Protein A填料捕获时可接受更宽泛的样品条件，如pH及电导率等。因此，发酵液通过离心、深层过滤后即可直接进行亲和捕获。另外与离子交换、疏水层析等方法相比，Protein A亲和层析纯化抗体料液可以获得更大的纯度，一步就可以获得抗体纯度大于98%，而且在回收率上也有明显优势，亲和捕获回收率可达95%。抗体工作者对Protein A 是爱恨交加，爱的是Protein A 亲和层析的出现大大简化抗体的分离纯化工艺开发,并大幅度提高抗体纯化效率和纯度，而且几乎适用于所有抗体的分离纯化。恨的是Protein A 亲和介质价格贵，寿命短，占据下游分离纯化成主要本。虽然很多科学家曾经致力于研究新的价廉抗体亲和配基以取代昂贵的Protein A亲和配基，但都没有成功找到一个可以取代Protein A 配基的分子。Protein A亲和层析因其高度特异性及同时具有浓缩的效果成为过去近30年里抗体纯化捕获的金标准。Protein A亲和层析介质贵的主要原因有两方面，一方面是Protein A 蛋白配基成本远比传统的小分子配基昂贵，另一方面，Protein A亲和填料寿命较短也是其成本过高的主要因素。一般离子交换填料使用寿命可高达1000次，而亲和填料寿命通常在100-200次。还有Protein A 介质贵与其一直处于高度垄断的局面也有关系，因此Protein A 亲和层析介质国产化以降低抗体的生产成本是必然的发展趋势。ProteinA结构及作用机制ProteinA蛋白是金黄色葡萄球菌细胞壁锚钉蛋白，其C端为细胞壁结合区域，抗体结合区域包括五个同源区域（E、D、A、B、C，N端顺序）。五个domain的序列同源率65-90%（图1）。图1 重组与天然ProteinA基本性质三维空间上，抗体FC端CH2-CH3区域与ProteinA蛋白B结构域上两条反相平行的α螺旋结构相互结合。抗体与ProteinA结合时，主要依靠的是疏水作用力，其次是氢键和双盐桥作用力。疏水作用主要来自于核心区域组氨酸残基。抗体上高度保守的组氨酸残基与ProteinA上的组氨酸残基发生相互作用。碱性或中性条件下，组氨酸残基不带电荷，其咪唑环的疏水效应的增强促进了FC端与ProteinA的结合。当pH降低至4.5以下时，组氨酸带上正电荷，于是两者产生静电排斥力，抗体从ProteinA上解离。除FC端恒定区域外，可变区VH3也参与了ProteinA结合及洗脱，影响洗脱pH（图2）。图2单抗分子结构 图3 抗体分子与ProteinA作用Protein A来源于金黄色葡萄球菌的一个株系，它含有5个可以和抗体IgG分子Fc段特异性结合的结构域，当其作为亲和配基被偶联到填料基质上后，可特异性地与样品中的抗体分子结合，使其他杂蛋白流穿，借助高效亲和层析仅需一步就可使目标抗体纯度超过95%，此外Protein A也可结合另一些免疫球蛋白，如可用于某些种属IgA、IgM的纯化。由于Protein A亲和层析基于天然存在的生物大分子之间特异性结合为分离机理，这种得天独厚的势使得Protein A亲和层析成为重组蛋白\抗体等分离纯化中的绝佳选择（图3）。下一期，江必旺博士将继续分享Protein A亲和填料的关键考核要素有哪些，敬请持续关注。

离子交换层析填料广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质、核酸及多肽的分离纯化。主要包括强酸性阳离子交换层析填料、弱酸性阳离子交换层析填料、强碱性阴离子交换层析填料和弱碱性阴离子交换层析填料四种。蛋白质之所以能够在离子交换层析填料上发生吸附是由于其表面带有电荷。蛋白质分子中的带电基团来源有两种：一种来自于特定的氨基酸；另一种是蛋白质在修饰过程中引入的。蛋白质由氨基酸组成。组成蛋白质时，氨基酸的α-氨基和α-羧基形成肽键而不再发生解离。但很多氨基酸的侧链带有可解离基团，其中有的能进行酸性解离而带上负电荷，如天冬氨酸和谷氨酸的侧链羧基、酪氨酸的酚羟基、半胱氨酸的巯基；有的能进行碱性解离而带上正电荷，如赖氨酸的侧链氨基、精氨酸的胍基、组氨酸的咪唑基。此外，在肽链的N末端还有一个游离氨基，C末端还有一个游离羧基，两者都能发生解离反应。这些基团的pK’值与游离氨基酸中的pK’值是不完全相同的，一般来说，它们比游离氨基酸中的pK’值向靠近中性的方向偏移 。此外，侧链可解离基团在蛋白质三级结构中的位置在很大程度上也会影响到pK’值。如果是结合蛋白质，则辅基中可能也含有可解离基团。月旭DEAE Tanrose 6FF是一种弱阴离子交换层析填料，离子交换基团是二乙基氨基乙基。基本参数应用实例

✦疏水层析填料✦Butyl Tanrose 4FF、Butyl Tanrose 6HP、Butyl-S Tanrose 6FF、Octyl Tanrose 4FF、Octyl Tanrose 6HP、Phenyl Tanrose 6HP、Phenyl Tanrose 6FF(Low Sub)和Phenyl Tanrose 6FF(High Sub)都属于疏水层析介质（Hydrophobic Interaction Chromatography，简称HIC），主要通过分子表面疏水性差别进行分离纯化的一类疏水层析介质。广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质和多肽的分离纯化。本产品五种离子交换树脂均可耐受较高的流速及更高的化学稳定性，适合实验室及工业大规模纯化。4FF/6FF系列填料技术参数HP系列填料技术参数✦疏水层析预装柱✦PreCot疏水层析预装柱用于少量样品纯化，除了配合层析系统使用也可配注射器上样接头使用注射器进行简单纯化装填介质：疏水作用层析介质✦✦技术指标

疏水层析填料Butyl Tanrose 4FF、Butyl Tanrose 6HP、Butyl-S Tanrose 6FF、Octyl Tanrose 4FF、Octyl Tanrose 6HP、Phenyl Tanrose 6HP、Phenyl Tanrose 6FF（Low Sub）和Phenyl Tanrose 6FF（High Sub）都属于疏水层析介质（Hydrophobic Interaction Chromatography，简称HIC），主要通过分子表面疏水性差别进行分离纯化的一类疏水层析介质。广泛用于生物制药和生物工程下游蛋白质和多肽的分离纯化。本产品五种离子交换树脂均可耐受较高的流速及更高的化学稳定性，适合实验室及工业大规模纯化。4FF/6FF系列填料技术参数HP系列填料技术参数疏水层析预装柱PreCot疏水层析预装柱用于少量样品纯化，除了配合层析系统使用也可配注射器上样接头使用注射器进行简单纯化。装填介质：疏水作用层析介质

《疫苗纯化 -- 病毒类疫苗纯化》凝胶过滤介质Tanrose 4FF或Tanrose 6FF是经典的病毒类疫苗纯化方法，可以去除培养基中的杂蛋白、处理量大、快速的特点。柱高一般40-70cm，上样量一般为10-15%。目前使用此方法生产的疫苗品种有：乙肝、狂犬、出血热、流感等。《纯化 -- 重组蛋白》His标签重组蛋白可以很方便用镍 IDA琼脂糖凝胶FF（Ni Tanrose 6FF IDA）或镍NTA琼脂糖凝胶FF（Ni Tanrose 6FF NTA）分离，填料已经螯合好了镍离子，使用非常方便，有更高的吸附载量，特异性更强，可以选择多种洗脱方式，是纯化这类融合蛋白的zui佳工具。GST融合蛋白可以用GST琼脂糖凝胶FF（GST Tanrose 4FF）分离，然后再用肠激酶或凝血酶等酶解就得到表达的产物。凝血酶可以用肝素琼脂糖凝胶FF（Heparin Tanrose 6FF）或苯甲脒琼脂糖凝胶FF（Benzamidine Tanrose 4FF）分离。《纯化 -- 血浆蛋白》阴离子交换在血浆蛋白的纯化中应用非常广泛，结合低温乙醇法在丙种球蛋白纯化后期用DEAE-琼脂糖凝胶FF（DEAE Tanrose 6FF）吸附二聚体等杂质从而达到提高产品纯度的目的，同样也可以在白蛋白纯化过程中使用阴离子交换吸附PKA、微量的IgG以及聚体，在凝血VIII因子纯化过程中使用大孔径的Q琼脂糖凝胶（Solid Q）可以增加载量和回收率。《纯化 -- 核酸、病毒》核酸的纯化用于去除影响测序或PCR污染物等研究。核酸可大致上分为质粒DNA、噬菌体DNA和PCR产物等。病毒也可视作核酸大分子，和质粒DNA一样，可用分离大分子的Tanrose 4FF 凝胶过滤介质去除杂蛋白，再配合离子交换 Q琼脂糖凝胶（Q Tanrose 6FF）分离核酸。也可以用DEAE琼脂糖凝胶FF（DEAE Tanrose 6FF）或Q琼脂糖凝胶FF（Q Tanrose 6FF）富集和分离后再上琼脂糖凝胶6B或6FF得到纯的病毒。《去除 -- 蛋白中的核酸》核酸带阴电荷，在初步纯化时利用阳离子交换介质如 SP 或CM Tanrose FF 结合目标蛋白，可除去大量核酸。核酸在高盐下会和蛋白解离，疏水层析介质很适合用来结合目标蛋白，在纯化蛋白的同时去除核酸。利用核酸酶将核酸切成小片断，用凝胶过滤做精细纯化时便很容易去除了。《纯化 -- 中草药有效成分》中药的化学成分极其复杂。传统中药多是煎熬后服用，有效成分多较为亲水，包括生物碱、黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸、多糖、肽和蛋白质。灵活及综合性地利用多种层析方法。如离子交换、分子筛、反相层析，更容易分离到单一活性成分。葡聚糖凝胶LH-20（Tandex LH-20）同时具备吸附性层析和分子筛功能，例如：用甲醇分离黄酮甙，三糖甙先被洗下来，二糖甙其次，单糖甙随后，zui后是甙元。葡聚糖凝胶LH-20（Tandex LH-20）可使用水、醇、丙酮、氯仿等各种试剂，广泛用于各种天然产物的分离，包括生物碱、甙、黄酮、醌类、内脂、萜类、甾类等。生物碱在酸性缓冲液中带正电，成为盐，SP阳离子交换层析柱可以分离许多结构非常近似的生物碱。相反，黄酮、蒽醌、皂甙、有机酸等可溶于偏碱的缓冲液中，在Q阴离子交换柱上分离效果良好。《样品净化 -- 脱盐、小分子去除》使用凝胶过滤介质Tandex G10、G15、G25等去除小分子，效率高，处理量可达床体积30%。只需在进样后收集首1/3-1/2柱体积的洗脱液，就可以去除该填料分离范围上限以下的小分子，简单直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整个过程一般可于数分种至半小时完成。月旭Tandex G25系列介质专为蛋白质脱盐而设计。病毒、DNA疫苗或质粒可以用琼脂糖凝胶6B除盐或交换缓冲液，蛋白、抗体等可以用葡聚糖凝胶G25快速去盐和交换缓冲液。

仪器信息网讯 2014年1月9日，默克密理博百年层析新年交流会(上海站)在上海浦东嘉里大酒店成功举办。逾百位制药行业用户参加了本次技术交流会。 会议现场 　　本次会议开场别具生面，由默克密理博两位高级管理人员扮演的财神派发福袋开始，向参会人员送上新年问候。 &ldquo 财神&rdquo 派发福袋并致辞 　　本次技术交流会邀请多位制药行业资深用户和专家就最新层析技术、法规、经验和最佳工艺向与会人员做了分享，共同探讨了层析产品设计生产考量、层析技术在实际药品生产中的应用和优化，以及确保药品安全生产的纯化工艺法规的要求。 　　默克密理博郑惠中女士讲述了默克密理博的百年层析历史。默克密理博百年层析源于1904年，为全球首家层析生产商，从1904年生产出二氧化铝填料开始，就一直致力于开发各种填料和层析柱，经过110年的发展，现已拥有多种填料和层析柱。层析填料系列包括制备级无机填料、阴阳离子交换填料、亲和层析填料、疏水层析填料、分子筛层析填料、分析级无机填料及薄层板等 层析柱系列包括实验室级别层析柱、流式装柱层析柱、自动装柱层析柱(生产级别)、轴向装柱层析柱、全自动层析系统等。近期推出的革新方案&mdash &mdash 一次性层析技术的应用更为从事单抗、重组蛋白、血制品蛋白、疫苗、胜肽/胰岛素、小分子等制药领域的用户带来极大的方便。 　　&ldquo 高效层析新进程&rdquo 环节默克密理博工作人员和与会人员分享了默克密理博最新填料产品和层析系统产品。 郑惠中女士分享了Eshmuno® 层析介质产品 　　郑惠中女士介绍到，Eshmuno® A产品具有耐酸、耐碱和去除聚集体的特性，为半刚性、高载量、耐酸碱的蛋白A亲和层析介质，用于含Fc的蛋白质的纯化，具有优异的多具体去除功能 Eshmuno® CPX阳离子交换介质与传统的阳离子交换精纯步骤相比，分离单体及多聚体性能效果卓越，且单位生产力高 Eshmuno® Q阴离子交换介质承传了Eshmuno® 家族填料高流速下维持高载量的特点之外，还具有优异的储存期间高稳定性特性。三种新一代填料串联起来，形成了一个高效的单抗纯化平台。 李宇彩博士分享了Mobius® FlexReady一次性全自动层析超滤系统 　　李宇彩博士介绍说，Mobius® FlexReady一次性全自动层析超滤系统采用了创新的Smart Flexware® 一次性管道流路，可降低批次交叉污染风险，减小系统死体积，便于快速准确安装，是目前配置和使用最为灵活的一机两用式全自动层析兼超滤系统，用户可在层析和超滤之间自由切换，主要于单克隆抗体、疫苗、血液制品和重组蛋白的分离纯化。 　　多位来自制药企业的专家分享了工作中使用默克密理博产品成功案例。 报告人：山东泰邦生物制品有限公司 资深纯化组主管 邵玉娟 报告题目：Improvement on the Plasma IVIG Purification Process Using Chromatography Techniques 　　报告中主要讲述了早期与目前血制品工艺的差异，改进的目标和如何利用层析提高收率与纯度。 报告人：上海复宏汉霖生物技术有限公司 资深研发组长 王家乐 报告题目：Case Study of Protein A Resin Selection and Process Optimization 　　报告讲述了通过一系列的比较试验选择最优化的亲和填料，包括预过滤、缓冲液优化等。 报告人：上海嘉和生物药业有限公司 纯化经理 陈霖杰 报告题目：Process Development for Robust Removal of Aggregates using Cation Exchange Chromatography in Monoclonal Antibody Purification with Implementation of Quality by Design 　　报告主要讲述了通过QbD的方法开发筛选最适多聚体去除的层析步骤方法，建立实际可放大的工艺。 　　会议还邀请了多位专家就无菌药品GMP认证中存在的问题、生物制品的管理以及抗体药申报质量控制等法规问题做了分享。 报告人：国家局药品认证中心特聘专家、国家局高级研修学院客座教授、国际GMP检查员 陈伟 报告题目：生物制品GMP检查中常见问题分析 　　报告列举十八项在日常GMP检查中遇见的易忽略问题，包括人员着装、培养基灌装验证方案等方面。陈伟表示，由于各检查员的知识背景不同，检查的重点也会随着企业生产的产品风险和管理情况有所改变，检查的主要目的是促进和提高企业的GMP管理。 报告人：上海市食品药品检验所 生化药品生物制品室主任 陈钢 报告题目：生物制品的管理 　　报告中介绍了生物制品的定义、种类和生产以及生物制品生产工艺的一般流程，阐述了我国生物制品的管理要求。 报告人：浙江海正药业 QC经理 李镭 报告题目：单抗药物药学研究一般申报要求 　　报告从生产工艺的要求、质量表征分析、质量控制及分析方法验证、标准品、稳定性研究等方面做了详细分析。 　　本次会议还组织了现场答疑和、层析产品实物展示及丰富的现场互动活动。 专家现场答疑 层析产品实物展示及现场交流 　　配合此次默克密理博百年层析的主题，活动融入中国传统古装文化的元素，现场放置多套中国古装，设置了&ldquo 最佳着装奖&rdquo ，参会人员可着古装拍照并现场由其他与会人员进行评选，选出最佳。

2014年1月9日，默克密理博百年层析新年交流会(上海站)在上海浦东嘉里大酒店成功举办。逾百位制药行业用户参加了本次技术交流会。会议现场　　本次会议开场别具生面，由默克密理博两位高级管理人员扮演的财神派发福袋开始，向参会人员送上新年问候。“财神”派发福袋并致辞　　本次技术交流会邀请多位制药行业资深用户和专家就最新层析技术、法规、经验和最佳工艺向与会人员做了分享，共同探讨了层析产品设计生产考量、层析技术在实际药品生产中的应用和优化，以及确保药品安全生产的纯化工艺法规的要求。　　默克密理博郑惠中女士讲述了默克密理博的百年层析历史。默克密理博百年层析源于1904年，为全球首家层析生产商，从1904年生产出二氧化铝填料开始，就一直致力于开发各种填料和层析柱，经过110年的发展，现已拥有多种填料和层析柱。层析填料系列包括制备级无机填料、阴阳离子交换填料、亲和层析填料、疏水层析填料、分子筛层析填料、分析级无机填料及薄层板等 层析柱系列包括实验室级别层析柱、流式装柱层析柱、自动装柱层析柱(生产级别)、轴向装柱层析柱、全自动层析系统等。近期推出的革新方案——一次性层析技术的应用更为从事单抗、重组蛋白、血制品蛋白、疫苗、胜肽/胰岛素、小分子等制药领域的用户带来极大的方便。　　“高效层析新进程”环节默克密理博工作人员和与会人员分享了默克密理博最新填料产品和层析系统产品。郑惠中女士分享了Eshmuno?层析介质产品　　郑惠中女士介绍到，Eshmuno? A产品具有耐酸、耐碱和去除聚集体的特性，为半刚性、高载量、耐酸碱的蛋白A亲和层析介质，用于含Fc的蛋白质的纯化，具有优异的多具体去除功能 Eshmuno?CPX阳离子交换介质与传统的阳离子交换精纯步骤相比，分离单体及多聚体性能效果卓越，且单位生产力高 Eshmuno?Q阴离子交换介质承传了Eshmuno?家族填料高流速下维持高载量的特点之外，还具有优异的储存期间高稳定性特性。三种新一代填料串联起来，形成了一个高效的单抗纯化平台。李宇彩博士分享了Mobius? FlexReady一次性全自动层析超滤系统　　李宇彩博士介绍说，Mobius? FlexReady一次性全自动层析超滤系统采用了创新的Smart Flexware?一次性管道流路，可降低批次交叉污染风险，减小系统死体积，便于快速准确安装，是目前配置和使用最为灵活的一机两用式全自动层析兼超滤系统，用户可在层析和超滤之间自由切换，主要于单克隆抗体、疫苗、血液制品和重组蛋白的分离纯化。　　多位来自制药企业的专家分享了工作中使用默克密理博产品成功案例。报告人：山东泰邦生物制品有限公司 资深纯化组主管 邵玉娟报告题目：Improvement on the Plasma IVIG Purification Process Using Chromatography Techniques　　报告中主要讲述了早期与目前血制品工艺的差异，改进的目标和如何利用层析提高收率与纯度。报告人：上海复宏汉霖生物技术有限公司 资深研发组长 王家乐报告题目：Case Study of Protein A Resin Selection and Process Optimization　　报告讲述了通过一系列的比较试验选择最优化的亲和填料，包括预过滤、缓冲液优化等。报告人：上海嘉和生物药业有限公司 纯化经理 陈霖杰报告题目：Process Development for Robust Removal of Aggregates using Cation Exchange Chromatography in Monoclonal Antibody Purification with Implementation of Quality by Design　　报告主要讲述了通过QbD的方法开发筛选最适多聚体去除的层析步骤方法，建立实际可放大的工艺。　　会议还邀请了多位专家就无菌药品GMP认证中存在的问题、生物制品的管理以及抗体药申报质量控制等法规问题做了分享。报告人：国家局药品认证中心特聘专家、国家局高级研修学院客座教授、国际GMP检查员 陈伟报告题目：生物制品GMP检查中常见问题分析　　报告列举十八项在日常GMP检查中遇见的易忽略问题，包括人员着装、培养基灌装验证方案等方面。陈伟表示，由于各检查员的知识背景不同，检查的重点也会随着企业生产的产品风险和管理情况有所改变，检查的主要目的是促进和提高企业的GMP管理。报告人：上海市食品药品检验所 生化药品生物制品室主任 陈钢报告题目：生物制品的管理　　报告中介绍了生物制品的定义、种类和生产以及生物制品生产工艺的一般流程，阐述了我国生物制品的管理要求。报告人：浙江海正药业 QC经理 李镭报告题目：单抗药物药学研究一般申报要求　　报告从生产工艺的要求、质量表征分析、质量控制及分析方法验证、标准品、稳定性研究等方面做了详细分析。　　本次会议还组织了现场答疑和、层析产品实物展示及丰富的现场互动活动。专家现场答疑层析产品实物展示及现场交流　　配合此次默克密理博百年层析的主题，活动融入中国传统古装文化的元素，现场放置多套中国古装，设置了“最佳着装奖”，参会人员可着古装拍照并现场由其他与会人员进行评选，选出最佳。

p 　　11月21日，从在苏州召开的国家生物制药发展专项工程投产仪式暨纳微新一代单分散硅胶色谱填料和高载量离子交换、Protein A亲和层析介质规模上市发布会上传来信息，由苏州纳微科技有限公司承担的国家发改委、财政部、工信部和国家卫计委联合实施的2013年蛋白类生物药和疫苗发展专项——“蛋白类生物药新型工业分离纯化介质产业化能力建设”项目，通过3年的组织实施，已达到各项建设目标，成功实现反相、疏水、离子交换、Protein A等多系列分离纯化介质的产业化，建成年产25000升单分散聚合物层析介质的生产线和全球首条年产20吨单分散硅胶色谱填料生产线。这一产能的建成，标志着我国具备了高性能层析介质和色谱填料的大规模生产能力，终结了国内分离层析介质和色谱填料单向进口的被动局面。 /p p 　　作为一种高效、快速的分析检测技术，高效液相色谱技术在生命科学、环境科学、药物分析等领域得到广泛应用。制备色谱是生物制药分离纯化中最重要的技术。而硅胶色谱填料作为整个色谱技术的“心脏”，其市场却长期被国外产品垄断。纳微科技历经10年研发攻关，开发出世界独有的单分散(均粒)硅胶色谱填料规模化生产技术，不仅填补了国内高性能球形硅胶色谱填料领域的空白，而且突破了单分散硅胶色谱填料的规模化制备难题，成功建成世界上第一条大规模生产单分散硅胶色谱填料生产线，这将极大地推动我国在该领域的跨越式发展。 /p p 　　离子交换、疏水和Protein A亲和层析介质是蛋白和抗体药物分离纯化最重要的材料,这些材料市场长期由美国GE、日本Tosoh等少数公司垄断。其产品价格昂贵，且每年同比上涨超过10%。纳微科技集化学、生物和材料等交叉领域技术于一体，开发出的单分散高载量离子交换、疏水和Protein A亲和层析介质，其分离纯化蛋白和抗体药物的各项性能，如载量、分辨率、机械强度、使用寿命等，都已超过国际品牌，能极大地促进我国蛋白和抗体药物产业的快速发展。 /p p br/ /p

EXPEC 750型 全自动离子交换系统有效去除干扰成分，重塑基体环境高通量处理样品，自动化流程，工作效率高离子交换树脂可重复使用，实践绿色分析化学产品介绍可根据不同样品的目标分析元素，选择合适的树脂填装离子交换层析柱。活化之后，采用匹配的上样、淋洗、洗脱等方法流程，利用树脂与目标分析元素及干扰元素的物理化学过程，完成分离、富集。产品特点自动化活化、上样、淋洗、洗脱等流程可组合编辑，一键启动。高精度闭环式系统，承压式分离柱，样品/试剂恒速过柱（0.5~100mL/min）。高效率可实现最多六个通道样品同时处理，处理时间在10~20min之间。智能化程序控制智能化，界面简洁、可视化，状态实时显示。高兼容性自动上样、自动收集装置一体化设计，同时兼容ICP/ICP-MS自动进样。模块化方式，灵活组合，有机结合前处理与分析检测过程，构建自动化分析系统，实现实验室4.0。离子交换+快速进样+智能稀释+检测终端（ICP/ICP-MS/… ）产品应用EXPEC 750型全自动离子交换系统可应用于无机元素的分离富集前处理，对于高基体样品，可分离基体干扰；对于低浓度样品，可实现目标元素的富集。通过对样品中痕量元素进行除盐分离富集前处理，可以去除碱土金属及F-、Cl-、Br-等基体，重塑样品的分析基体环境，提升样品回收率至95%-105%。对于低至ppt数量级样品进行富集处理，提高检测终端对样品检测分析的检出限、准确度。

默克中国与国际制药项目管理协会（IPPM）在北京和上海两地联合举办了2016生物制药层析技术高峰论坛，来自华东、华北、东北等地多家生物制药企业共约300位专家用户参加了高峰论坛。默克资深层析产品及应用专家携手业内层析应用专家共同分享了层析技术最新进展及应用案例，与会者对层析技术未来发展趋势进行了探讨。上海场北京场王慕阳女士-默克工艺解决方案销售副总监致欢迎词。默克百年层析源于1904年，为全球首家层析生产商，从1904年生产出二氧化铝填料开始，就一直致力于开发各种填料和层析柱，经过110年的发展，现已拥有多种填料和层析柱。王慕阳表示默克推出的众多优异的层析产品，推动着生物制药行业的发展，帮助用户解决了层析工艺研发和生产中的诸多问题。众所周知，2015年默克公司发布新LOGO形象。在本次论坛上，王慕阳为与会者诠释了默克的企业风格的创新变化。默克工艺解决方案部销售副总监 王慕阳会议邀请上海复宏汉霖生物技术有限公司工艺开发副总裁李泽生博士致开幕辞。默克工艺解决方案部层析市场技术经理蒋华平主持本次论坛。本次论坛就Fractogel® 离子交换填料的应用、工业规模下的装住及填料寿命的验证、反相填料在胰岛素分析方面的应用等议题和与会者进行了共同探讨。德国默克高级市场部经理Dr. Lars Peeck向与会者分享了Fractogel® 离子交换填料在生物制药行业中的应用案例。Fractogel® 离子交换填料于上个世纪上市，目前在应用于多种上市生物制品生产中。报告中分享了Fractogel® 离子交换填料在抗体及血液制品中的应用，指出，Fractogel® 离子交换填料系列产品在病毒去除等多个方面具有高流速、低倍压的特点。报告人：德国默克高级市场部经理Dr. Lars Peeck报告题目：Fractogel® 离子交换填料在生物制药应用中案例分享默克工艺解决方案部生物工艺开发高级经理吴云涛就层析填料使用寿命和清洗验证的应用探讨和工业规模层析填料装柱方法进行了分享。报告对装柱原理进行了介绍，并从装柱原理如何指导装柱、装柱过程中的注意事项、装柱过程中出现的各种问题及解决方法等方面进行了详细的阐述。报告人：默克工艺解决方案部生物工艺开发高级经理 吴云涛报告题目：工业规模层析填料装柱方法德国默克工艺解决方案部层析产品研发总监 Dr. Michael Schulte分享了反相硅胶填料在小分子药物工艺中的应用优化及胰岛素案例。报告分析了胰岛素药物市场发展和市场潜能，分析了糖尿病患者的市场发展，预测到2035年糖尿病患者约占总人口的十分之一，也由此，胰岛素药物的潜在需求市场巨大。Dr. Michael Schulte还就胰岛素生产工艺的特点进行了阐述，并分析了生产过程中几类较难去除的杂质。此外，Dr. Michael Schulte还表示，默克的层析填料已有百年历史，在胰岛素的生产和研发方面有着极其丰富的经验，并以默克现有两个系列反相填料产品为例，给出某些胰岛素生产工艺中杂质去除的策略及方法。报告人：德国默克工艺解决方案部层析产品研发总监 Dr. Michael Schulte报告题目：反相硅胶填料在小分子药物工艺中的应用优化及胰岛素案例分享会议还邀请多位嘉宾就层析填料相关技术发展及应用做精彩报告。报告人：药明康德高级研究员 蒋俊俊报告题目：药明康德高通量工艺开发平台介绍及应用分享报告人：杭州九源基因工程有限公司副主任工程师 郭旺明报告题目：应用Eshmuno® A 亲和层析去除FC 融合蛋白的电荷异构体报告人：海正药业生物药研究所所长 缪仕伟报告题目：层析工艺与抗体关键质量属性报告人：德国默克产品经理 Ms. Katrin Jaenicke报告题目：填料生产中的质量控制本届高峰论坛引入主题元素——竖琴，蒋华平对代表着世界先端生物制药科学技术的行业与古典乐和竖琴的之间的相关性进行了介绍，并对本次论坛的主题元素进行了阐释。演奏表演会上，与会嘉宾和现场听众进行了面对面的沟通交流，与会听众就工作中所遇到的层析填料相关问题积极提问，现场交流热烈。北京场（左起：吴云涛、Michael Schulte、Katrin Jaenicke、Lars Peeck、张滨）上海场（左起：胡哲嘉、吴云涛、Michael Schulte、Lars Peeck、缪仕伟、郭旺明）与会专家互动交流为使用户近距离了解默克层析产品，本届论坛上，默克公司设立了机具艺术感的产品展示区域，展示层析系统、层析柱和填料等多种产品。产品展示本届论坛在默克工艺解决方案部亚太区层析市场经理胡哲嘉博士的致辞中闭幕。

仪器信息网讯 近日，默克中国与国际制药项目管理协会(IPPM)在北京和上海两地联合举办了2016生物制药层析技术高峰论坛，来自华东、华北、东北等地多家生物制药企业共约300位专家用户参加了高峰论坛。默克资深层析产品及应用专家携手业内层析应用专家共同分享了层析技术最新进展及应用案例，与会者对层析技术未来发展趋势进行了探讨。上海场北京场　　默克工艺解决方案部销售副总监王慕阳女士致欢迎词。默克百年层析源于1904年，为全球首家层析生产商，从1904年生产出氧化铝填料开始，就一直致力于开发各种填料和层析柱，经过110年的发展，现已拥有多种填料和层析柱。王慕阳表示默克推出的众多优异的层析产品，推动着生物制药行业的发展，帮助用户解决了层析工艺研发和生产中的诸多问题。众所周知，2015年默克公司发布新LOGO形象。在本次论坛上，王慕阳为与会者诠释了默克的企业风格的创新变化。默克工艺解决方案部销售副总监 王慕阳　　会议邀请上海复宏汉霖生物技术有限公司工艺开发副总裁李泽生博士致开幕辞。默克工艺解决方案部层析市场技术经理蒋华平主持本次论坛。　　本次论坛就Fractogel® 离子交换填料的应用、工业规模下的装住及填料寿命的验证、反相填料在胰岛素分析方面的应用等议题和与会者进行了共同探讨。　　德国默克高级市场部经理Dr. Lars Peeck向与会者分享了Fractogel® 离子交换填料在生物制药行业中的应用案例。Fractogel® 离子交换填料于上个世纪上市，目前在应用于多种上市生物制品生产中。报告中分享了Fractogel® 离子交换填料在抗体及血液制品中的应用，指出，Fractogel® 离子交换填料系列产品在病毒去除等多个方面具有高流速、低背压的特点。报告人：德国默克高级市场部经理Dr. Lars Peeck报告题目：Fractogel® 离子交换填料在生物制药应用中案例分享　　默克工艺解决方案部生物工艺开发高级经理吴云涛就层析填料使用寿命和清洗验证的应用探讨和工业规模层析填料装柱方法进行了分享。报告对装柱原理进行了介绍，并从装柱原理如何指导装柱、装柱过程中的注意事项、装柱过程中出现的各种问题及解决方法等方面进行了详细的阐述。报告人：默克工艺解决方案部生物工艺开发高级经理 吴云涛报告题目：工业规模层析填料装柱方法　　德国默克工艺解决方案部层析产品研发总监 Dr. Michael Schulte分享了反相硅胶填料在小分子药物工艺中的应用优化及胰岛素案例。报告分析了胰岛素药物市场发展和市场潜能，分析了糖尿病患者的市场发展，预测到2035年糖尿病患者约占总人口的十分之一，也由此，胰岛素药物的潜在需求市场巨大。Dr. Michael Schulte还就胰岛素生产工艺的特点进行了阐述，并分析了生产过程中几类较难去除的杂质。此外，Dr. Michael Schulte还表示，默克的层析填料已有百年历史，在胰岛素的生产和研发方面有着极其丰富的经验，并以默克现有两个系列反相填料产品为例，给出某些胰岛素生产工艺中杂质去除的策略及方法。报告人：德国默克工艺解决方案部层析产品研发总监 Dr. Michael Schulte报告题目：反相硅胶填料在小分子药物工艺中的应用优化及胰岛素案例分享　　会议还邀请多位嘉宾就层析填料相关技术发展及应用做精彩报告。报告人：药明康德高级研究员 蒋俊俊报告题目：药明康德高通量工艺开发平台介绍及应用分享报告人：杭州九源基因工程有限公司副主任工程师 郭旺明报告题目：应用Eshmuno® A 亲和层析去除FC 融合蛋白的电荷异构体报告人：海正药业生物药研究所所长 缪仕伟报告题目：层析工艺与抗体关键质量属性报告人：德国默克产品经理 Ms. Katrin Jaenicke报告题目：填料生产中的质量控制　　本届高峰论坛引入主题元素——竖琴，技术经理蒋华平对代表着世界先端生物制药科学技术的行业与古典乐和竖琴的之间的相关性进行了介绍，并对本次论坛的主题元素进行了阐释。演奏表演　　会上，与会嘉宾和现场听众进行了面对面的沟通交流，与会听众就工作中所遇到的层析填料相关问题积极提问，现场交流热烈。北京场(左起：吴云涛、Michael Schulte、Katrin Jaenicke、Lars Peeck、张滨)上海场(左起：胡哲嘉、吴云涛、Michael Schulte、Lars Peeck、缪仕伟、郭旺明)与会专家互动交流　　为使用户近距离了解默克层析产品，本届论坛上，默克公司设立了极具艺术感的产品展示区域，展示层析系统、层析柱和填料等多种产品。产品展示　　本届论坛在默克工艺解决方案部亚太区层析市场经理胡哲嘉博士的致辞中闭幕。

哈喽哈喽，各位亲爱的读者朋友们，大家好呀。好久不见，小编甚是想念大家，不知道大家有没有想小编呢！今天小编将会给大家带来我们月旭两大核心液相色谱柱-离子交换以及亲水分析柱介绍。主要从键合相类型，耐受PH范围，色谱柱具有的特点来带大家走近我们这两大核心色谱柱。离子交换色谱的原理离子交换色谱是指离子交换色谱中的固定相中的一些带电荷的基团， 这些带电基团通过静电相互作用与带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将与结合在固定相上带相反电荷的离子进行交换。离子交换色谱的固定相有阳离子交换官能团和阴离子交换官能团两种。阳离子交换官能团带有负电荷，用于阳离子的分离；阴离子交换剂官能团带有正电荷，用于阴离子分离。阳离子交换官能团zui常用的有磺酸盐型，阴离子交换官能团zui常用的是季胺型。离子交换色谱的流动相通常是含盐的缓冲水溶液。为了适应不同的分离需要，有时添加适量的能与水相溶的有机溶剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等，以改进样品的溶解性能，提高选择性，改善分离。在以水溶液为流动相的离子色谱中，缓冲溶液的浓度直接影响着离子平衡。当缓冲液浓度增加时，流动相中反离子浓度的增加，增强了它与样品离子争夺离子交换官能团的能力，从而减弱样品组分与离子交换树脂的亲和性。流动相中的离子类型对样品分子的保留值产生显著的影响。月旭离子交换柱产品特点HILIC柱简介1990年，Alpert教授提出了一个新概念：亲水作用色谱（Hydrophilic Interaction Chromatography，HILIC）。这种色谱分析方式用来分离强极性和亲水性化合物，比如核苷和核苷酸、氨基酸、糖类等。它采用极性固定相和极性流动相，一般使用比固定相极性低的溶液，如：乙腈/水等。在HILIC色谱中与反相色谱不同的是，流动相的极性越大，洗脱能力越强，但水相比例zui好不要超过40%，不要低3%HILIC的作用原理目前仍在研究中，zui被广泛接受的说法是分析物在流动相和固定相表面富集水层间的分配作用，同时也包含有弱静电作用、氢键和分子双极性作用等。月旭HILIC柱产品特点时间过的真快，不知不觉小编又要和大家说再见了，感谢大家一直以来的支持，期待我们下次的相遇——只有你想见我的时候我们的相遇才有意义。

近期，江必旺博士于仪器信息网分享了系列关于Protein A亲和层析介质的文章。《浅谈令人“爱恨交加”的Protein A亲和层析介质》《盘点Protein A亲和填料质控必看的重要参数》《Protein A材质对生物分离传化的影响 ，微球精准制造技术应运而生》本期，江必旺博士将就Protein A 发展方向与大家分享。高载量，高机械强度，高耐碱性是Protein A 发展方向。目前市场上用于生物分离层析介质主要由两大类材料组成：第一类是以琼脂糖，葡聚糖为代表的天然高分子层析介质；第二类是以聚苯乙烯和聚丙烯酸酯为代表的合成高分子层析介质。其中天然多糖高分子改性介质由于具有亲水强，生物兼容性好，能减少对生物分子的非特异性吸附等特点，因此在分离过程中容易保持生物分子的生物活性。另外交联天然多糖介质在溶胀状态下其多糖分子链可以舒展开来形成网状孔道结构，因此多糖介质表面积大，容易做成高载量的介质。但软胶在干燥状态下脱去水容易导致孔道结构塌陷，因此，软胶填充的层析柱一般不能干，否则介质容易孔道结构容易塌陷从而失去分离性能。软胶是生物大分子分离纯化应用历史最悠久，应用最广泛的层析介质。但天然多糖改性高分子介质因其基质柔软而被称为软胶，其主要缺陷是机械强度差、压缩比大、柱床不稳定、操作困难、流速慢、生产效率低等。相反，合成多孔高分子层析介质微球具有机械强度高，化学稳定性好等特点，因此可以耐受更大的压力、更快的流速，从而提高分离效率，其市场应用增速最快。另外合成高分子微球粒径大小，粒径均匀性更容易控制，使得合成高分子介质更容易装柱，柱效和分辨率也更高。同时聚合物介质孔道结构是通过无数高度交联的纳米粒子堆积而成。这些纳米粒子不溶胀，分子进不去，因此其表面积比琼脂糖基质的小，但孔径通透性更好，因此分子传质速度快，在高流速下载量可以保持的更好。但合成高分子层析介质的缺点是其疏水往往比软胶大，导致非特异性吸附大，容易使生物分子失去活性。因此聚合物微球表面需要进行亲水化改性以降低其非特异性吸附才能满足层析分离的需求。无论是以交联琼脂糖为基质的离子交换介质还是以表面亲水化改性的聚合物为基质的离子交换介质都有各自的优缺点，但它们的目标都是一致的，都是往高载量、高机械强度，高分辨率、高回收率方向发展。因此为了生产更理想的层析介质，交联琼脂糖层析介质要解决的问题是在保持它亲水性优势下如何提高其机械强度，而聚合物介质问题是在保持其机械强度优势条件下如何解决亲水化问题并降低非特异性吸附。未来离子交换层析介质的发展方向就是融合软硬胶的优点，做成载量高，机械强度大的介质。

球菌的细胞壁，与IgG的Fc片段具有非常强的特异性，分子量约为42×103，如图所示。一般在蛋白 A亲和层析中，配基在中性pH条件下结合抗体，在酸性pH条件下与蛋白解离。‍蛋白A与抗体IgG的Fc片段结合模式基于蛋白 A 亲和层析的抗体捕获工艺较为稳定，但也存在一些不足，主要包括：（1）介质成本高。（2）配基易脱落。（3）洗脱条件苛刻。（4）Protein A介质的再生比较困难。针对以上问题，部分商业化蛋白A亲和层析介质中使用的基本为改造的蛋白A配基，改善了天然蛋白A的缺点，提高了耐碱能力和洗脱 pH。月旭科技推出的耐碱抗体亲和介质-耐碱Protein A Solid/耐碱Protein A 4FF， 由大肠杆菌表达，经层析纯化获得，纯化过程不适用抗体柱亲和层析，避免了产品中掺入无关IgG的可能，改配基pH耐受0.5M NaOH和0.5M HCl处理，不降解，抗体结合能力不变。该介质适合从大批培养液捕获单克隆抗体或Fc融合蛋白，也适合与从腹水或者血浆中捕获多克隆抗体。技术参数‍应用实例订货信息

2017年12月1日，由东曹（上海）生物科技有限公司（TOSOH）、默隆（上海）实业有限公司主办的液相色谱分离分析及中低压层析纯化技术应用研讨会在上海博雅酒店举行。会议特邀国外专家以及TOSOH资深技术人员前来，围绕生物医药（单克隆抗体、ADC药物等）在研发或生产中所涉及的HPLC分析分离及中低压层析纯化技术展开介绍及讨论，共吸引了100余位专业人士参加。研讨会现场东曹株式会社生命科学事业部市场部部长山崎洋介带来了题为《TSKgel色谱柱在单克隆抗体HPLC分析领域的最新技术介绍》的精彩报告。抗体是一种结构复杂的糖蛋白，其结构也是各不相同。抗体类药物在其生产工艺（培养、分离纯化）或贮存过程中容易导致产品的不均一性，所以在药物研发以及纯化、生产过程中，对抗体药物的定量和定性的分析是十分重要的。山崎先生介绍了TSKgel色谱柱在尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、亲水相互作用色谱法和反相色谱法中的应用。山崎先生还带来了题为《抗体药物在中低压层析技术方面的最新话题》的精彩报告。研究报告指出：在未来的5年，即至2022年，抗体药物的整体市场将每年提升6.5%。随着生物制药以及诊断试剂领域对单克隆抗体的需求日益旺盛，需要更大量、更高纯度的抗体产品。因此通过层析法实现抗体的下游纯化变的日趋重要。山崎先生介绍了Protein A亲和层析填料、离子交换层析填料、疏水层析填料和混合模式层析填料在纯化过程中的应用。报告指出Protein A亲和层析法可获得高纯度的单抗，因此普遍用于初始纯化步骤中。离子交换层析法（IEC）的高载量特点也使之在抗体的制备纯化过程中被广泛采用。疏水相互作用层析法（HIC）具有去除抗体多聚体以及脱落的Protein A配体等杂质的性能。混合模式层析法（MXC）也被应用到了抗体的层析纯化工艺中。东曹株式会社生命科学事业部市场部部长山崎洋介在做报告东曹（上海）生物科技有限公司技术中心应用开发部部长张琳博士带来了题为《TSKgel色谱柱在生物样品分析实验中条件优化与应用举例》的精彩报告。报告首先介绍了生物样品分析常用TSKgel系列色谱柱SEC、IEC、HIC、RPC、HILIC、AFC的使用对象。SEC系列主要应用于多肽、胰岛素、葡胺聚糖等物质的分析，IEC、HIC系列主要应用于抗体、核酸分析，RPC用于抗体片段，HILIC用于糖链、寡糖，AFC用于抗体定量。报告分别举例说明了TSKgel色谱柱在面对不同分析物质时的使用特点。最后，还组织了现场抽奖活动，六位参会嘉宾幸运地抽到了精美礼品，会议在热烈的氛围中圆满结束。

2015默克密理博层析技术高峰论坛于4月29日在上海思南公馆精彩落幕。一百多位制药企业相关人员和行业专家参加了本次层析技术高峰论坛。默克密理博百年层析源于1904年，为全球首家层析生产商，此次层析高峰论坛融合多种古典元素在古美静谧的思南公馆举行，默克密理博也为大家精心准备了惊喜环节，请来昆曲名角儿现场演绎经典曲目《游园惊梦》 。可谓精彩纷呈，学习百年精彩层析技术的同时更是体验百年经典艺术。 会议开场前，默克密理博美丽的亚太区层析技术高级市场专员郑惠中女士先是向来宾介绍了默克密理博诚意满满的日程表，为本次充实的层析技术高峰论坛做暖场。 而后沈克强（上海药明康德新药开发有限公司生物制药和生物工艺部的执行主任）先生作为本次高峰论坛特邀主持人做出欢迎致词，论坛正式拉开帷幕。沈先生向来宾表示，默克密理博的层析高峰论坛是少数纯粹着重技术的交流分享论坛，他个人已经参加了三次，非常推荐！ 报告人：Dr. Lothar Jacob (Merck KGaA) 报告题目：工业规模抗体生产-工艺进步的策略探讨 资深产品经理Jacob博士在报告中阐述了抗体生产方法的历史变革，平台建立的注意事项，以及最新的纯化方法与工具，包括默克密理博新一代的亲和填料Eshmuno? A及阳离子填料Eshmuno? CPX等的优异性能。 报告人：Dr. Nanying Bian/ Dr. Lothar Jacob 报告题目：层析在除病毒的应用与探讨 现如今，层析作为除病毒的有效步骤是一种趋势。报告中卞博士与Jacob博士共同阐述利用层析方法去除病毒的案例及数据，包括利用蛋白A亲和填料以及阴阳离子交换树脂去除病毒效果分析。总体来讲，默克密理博阴离子去除病毒的效果优良，对于不同种类模型病毒有去除5~7个对数值的效果，而蛋白A亲和填料，不论Prosep?系列还是新一代的Eshmuno? A填料，都可以达到3～5个对数值间的效果，而阳历子交换树脂对特定模型病毒业可以达到4个对数值以上的去除效果。之后来自药明康德的晏明慧女士带来了从静态载量到动态载量的案例分享，晏女士分享了利用动力学模型和高通量筛选设备的实验设计，以及对各种亲和填料静态载量与动态载量之间的差异与可预测性的比较。 报告人：朱蓉蓉 (EMD Chemicals) 报告题目：利用精确的宿主蛋白检测提升工艺品质与产品质量 默克密理博资深科学家朱蓉蓉女士阐述了各种宿主蛋白的检测方法间的特性与限制，其方法有效性的验证，并分享了最新宿主蛋白的精确检测方法，主要展示了用2D-gel及LCMSMS两种方法的数据及成果，用以提升工艺品质与产品质量。 报告人：Prof. Christian Frech (Mannhaim University of Applied Science) 报告题目：层析模型用于提升离子交换层析表现的探讨 报告中Frech教授讲到利用模型精确预测与寻找优化点是纯化界的新潮流。通过讲述如何利用日本山本教授的层析模型，精确推算不同目标产物洗脱的电导度，并进一步利用衍生的公式，推算出利用pH梯度洗脱的模型，从而提供阴阳离子优化策略中科学又有效率的新方法。 报告人：吴云涛（默克密理博高级层析工艺开发经理） 报告题目：高通量筛选在层析工艺开发上的应用 而后吴云涛先生对高通量筛选在层析工艺开发上的应用作出报告，吴云涛先生讲述了高通量筛选的应用领域，及实际应用在层析优化案例上的案例分享。利用高通量筛选配合数据分析，同时测试多种不同填料，并缩短寻找优化条件的时间，进而提高整个工艺开发的效率。 会议现场 来自药明康德的研究员唐思远先生为来宾分享了利用线性梯度模型分离酸碱峰的探讨。在报告中利用层析线性梯度模型的原理，进行酸碱峰分离的初步探讨，对Eshmuno?系列阳离子的优化进行了精彩的数据分享。 而后黎晓维女士（北京天广实生物技术股份有限公司纯化部经理）分享了阳离子交换层析在抗体偶联药物（ADC）纯化中的应用，利用Eshmuno? CPX填料与多家阳离子填料进行比较与探讨。在不同洗脱模式下，Eshmuno? CPX不管是在多聚体的去除上，还是在会影响药物生物活性的偶联比DAR值（Drug Antibody Ratio）上，都有优异的效果。 上海生物制品所第五研究室主任郑炎先生分享了血制品行业中vWF分子制备的案例，目标为制备高纯的FVIII/VWF复合物，能针对VWD（血管性血友病）或A型血友病两种疾病进行治疗，并减少病人的给药剂量。而阴离子填料Fractogel? EMD TMAE在纯化中带来了极佳的表现，报告中也展示不同洗脱条件对于活性的影响，并分享了产品稳定的影响因素。 昆曲《游园惊梦》环节，来宾互动 继百年层析历史简介与百年经典昆曲欣赏之后，朱蓉蓉女士再度上台分享话题&ldquo 柱前柱后-- 产品与工艺开发中生物可比性的研究&rdquo 。报告阐述在生物仿制药物的研发必定经过各种与原研药效果与成份的比对。而在制备生物仿制药从上游到下游的过程中，有许多可能影响质量的因素，以及控制的方法，从分析专家的角度提供了最精确的整体资讯。 与专家对谈环节 在此环节提供给来宾与六位专家分别面对面探讨层析问题的机会，并请各位专家根据讨论环节最终做出讲评，分享给大家所关切的议题与相对应的解决方法。

近日，纳谱分析技术（苏州）有限公司（以下简称“纳谱分析”）宣布，正式推出BioCore SCX强阳离子交换蛋白分离色谱柱新品。该款色谱柱适用于单抗、双抗以及单抗偶联药物中电荷异质体的分离，主要用于生物制药、医疗、科研等领域。据了解，BioCore SCX是以单分散无孔聚合物微球为基质，结合独特的表面键合技术而成的高性能阳离子交换蛋白分离色谱柱。其固定相是由在无孔、单分散、高交联度、聚二乙烯苯微球表面键合一层中性亲水层，以及在亲水层上接枝的磺酸官能团构成。创新的微球技术保证了色谱柱的高柱效、耐压性、耐热性、化学稳定性以及有机溶剂的兼容性，其键合技术还可有效的阻绝生物大分子与疏水性基球的接触，可最大限度的降低生物大分子与固定相间不利的相互作用，确保单抗电荷异体分离所需的选择性。此外，每个批次的BioCore SCX的填料都按照严格的质量管理体系生产，并且用相关生物大分子（IgG单抗）质检以确保分离性能和批次间一致性。关于纳谱分析纳谱分析技术（苏州）有限公司旨在打造一个世界领先、自主创新的液相色谱柱的中国品牌，实现液相色谱柱及色谱材料的高端国产化，打破外国公司在核心技术和产品上对该领域的长期垄断。在此过程中，培养一批液相色谱分离材料、色谱柱装填和应用开发的专业技术人才，和一个世界一流水平的产业化团队，助力中国液相色谱产业化水平的提升，为包括生物制药在内的广大用户提供高质量的产品和优质的服务。

东曹生命科学部门提供各种分离模式的中低压、中高压层析填料，以满足不同客户的分离纯化需求。 如果您想了解东曹的层析填料产品有哪些基质类型？各有什么样的产品特点和适用范围？您都能在《Toyopearl层析填料选择指南》中查询到详细信息，寻找最适合自己纯化需求的填料产品。 下载《Toyopearl层析填料选择指南》海报电子版请访问下面链接：http://www.instrument.com.cn/netshow/SH101626/down_550758.htm 关于Toyopearl层析填料：Toyopearl层析填料采用亲水性的聚甲基丙烯酸基质，化学稳定性好、耐压高、流速快，机械强度大，适合大规模分离制备生物医药品如抗体、疫苗、血浆蛋白、多肽、核酸等。Toyopearl层析填料包括了常用的分离模式：尺寸排阻（SEC）、疏水（HIC）、离子交换（IEC）以及亲和（AFC）层析模式。填料粒径尺寸分为20-40um的“超精”级（S级），具有最高的分辨率；40-90um用于经济型纯化的M级；以及用于大量制备的90-120um的“粗糙级”(C级)；100-300um“超粗级”(EC级)。由于Toyopearl色谱层析填料采用了和TSKgel色谱柱相同的化学基团，因此我们可以完美地将TSKgel色谱柱开发时所用的方法直接扩大到用Toyopearl层析填料进行大规模的分离纯化。

近日，赛分科技成功开发了首款亲和层析填料——MabPurix™ Protein A，该填料以琼脂糖凝胶为基质，表面键合配体Protein A，主要应用于生物制药领域——抗体的纯化。作为全球色谱产品最为完善的企业之一以及生物分离色谱的领航者，赛分科技十分重视新产品研发，目前的色谱分离填料已涵盖反相、正相、离子交换、手性、体积排阻、亲和、HILIC、离子排斥、配体交换等十几种类型，产品品种齐全，性能优越。其中，色谱填料产品包括硅胶基质和聚合物基质两大类，几十小类，可根据客户实际需要分别应用于不同的领域中。本次所开发的MabPurix™ Protein A填料是赛分科技推出的首款亲和层析填料，也是首次推出的以琼脂糖凝胶为基质的填料，此前，赛分科技的填料基质包括球形硅胶、不定形硅胶、聚甲基丙烯酸酯、PS/DVB等。与其它基质相比，琼脂糖基质填料具有更好的生物相容性。MabPurix™ Protein A的加入使得赛分科技的产品品种更加齐全，尤其对于生物分离色谱产品家族里，MabPurix™ Protein A的成功推出具有里程碑的意义。 赛分科技的聚合物基质填料家族 MabPurix™ 亲和层析填料 MabPurix™ 亲和层析填料专为大规模抗体纯化而设计，是由高纯度Protein A与高交联度琼脂糖偶联后的产物，用于从血清、腹水、细胞培养上清和细胞提取物中分离和纯化多种哺乳动物不同亚型的抗体或包含抗体Fc片段的基因工程重组蛋白。Protein A是金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白，单链，它通过与免疫球蛋白的Fc区相互作用，可结合大多数哺乳动物的IgG，尤其对人IgG1、IgG2、IgG4，小鼠IgG 2a和IgG 2b具有高亲和力。MabPurix™ Protein A亲和层析填料具有高稳定性、高选择性、高效率的特点，是抗体纯化的优选。 ● 可根据用户的需要提供各种规格的预装柱；● 强化基质保证了高流速、低背压；● 特殊设计的定向键合技术保证了高的载量；● 可耐受苛刻的在线清洗条件；● 可以很容易的由小规模的实验室制备向大规模的工业化生产进行线性放大。 更多信息请登录：http://www.sepax-tech.com.cn/products/gytl/juhe/infinity/99.html 关于赛分科技 赛分科技有限公司（Sepax Technologies, Inc）总部位于美国特拉华州高新技术开发区，致力于开发和生产药物与生物大分子分离和纯化领域的技术和产品。赛分科技是集研发、生产和全球销售为一体的实业型企业。公司主要产品为液相色谱柱及耗材、固相萃取柱（SPE）及耗材、液相色谱填料以及分离纯化仪器设备。在液相色谱领域里，赛分科技已开发出了100多种不同型号的液相色谱材料，涵盖了反相、正相、超临界（SFC）、手性（Chiral）、离子交换、体积排阻、亲和、HILIC等各种类别，为世界范围内液相色谱产品最为完善的企业之一。 赛分科技的创新技术使之生产出具有最高分辨率及最高效的生物分离产品，包括体积排阻、离子交换、抗体分离、和糖类化合物分离色谱填料和色谱柱，可广泛地应用于单克隆抗体、各种蛋白、DNA、RNA、多肽、多糖和疫苗等生物样品的分析、分离和纯化。赛分科技先进的技术和完善的产品线已使赛分成为全球生物分离的领航者。 公司网站：www.sepax-tech.com.cn www.sepax-tech.com

Pall免费在线讲座 　　上游工艺技术的持续改善已经使蛋白表达水平越来越高，从而使下游产量超过1g/L，甚至达到10g/L。这些前提将直接影响到下游工艺，直至遇到技术瓶颈。然而，目前的趋势，比如使用更高载量、选择性更广的层析填料，以及更多使用一次性技术如膜层析等，将会突破这些瓶颈，使制药行业的快速发展获得强大动力。 　　如何有效去除杂质是制药工艺中一个很大的挑战，这也是膜层析技术应用最受欢迎和流行的应用点。膜层析的操作非常简便，其高速以及高效的特性有效降低了工艺时间和成本，提高总产量。本次网络讲座将会阐述膜层析的基本原理，并举例客户应用，说明如何将该技术整合到工艺中，以节约时间和成本。 　　参会者将有机会学习： 　　如何使用Mustang® 膜层析产品有效去除杂质，提高工艺经济性? 　　如何将膜层析产品纳入到一次性系统的设计中? 　　如何使用膜层析技术解决当前以及未来的工艺挑战? 　　谁应该参加? 　　● 致力于高效、高质药物研发和生产的行业领导者 　　●下游工艺研发专家、工程师和组长 　　●早期制药工艺开发相关的科学家 　　● 产品工程师 　　● 验证专员 　　● 层析专员 　　● 生产人员 　　● 关注 cGMP 临床试验产品的质量经理 　　● 工程咨询 　　讲座专家： 　　Russell M. H. Jones 　　Mustang膜层析全球产品经理 　　Pall Life Sciences 　　John M. Jenco, Ph.D 　　高级首席科学家 　　技术服务部 　　Pall Life Sciences 　　Dr Iann Rancé 　　工艺开发总监 　　Cytheris公司下游工艺及分析部门 　　讲座信息 　　讲座时间：2012年2月16日， 23:00pm(北京时间) 　　注册网址：https://event.webcasts.com/starthere.jsp?ei=1003510&sti=S 　　(本次讲座全部免费，但是请务必提前登陆注册，收到确认邮件后即可顺利参会。) 　　颇尔公司及Mustang层析技术简介 　　作为全球过滤、分离、纯化技术的领导者，颇尔公司(Pall Corporation)提供经济、高效、创新的层析纯化平台，帮助制药用户满足日益严格的应用需求，实现高产量目标。Pall层析产品提供极佳的独特选择性，完美解决当下的工艺挑战，具从实验室到生产规模的真实放大性，独特的平台可提高工艺经济性，应用于制药工艺下游多个步骤。产品系列包括：层析填料，PRC预装柱，LRC层析空柱，Mustang离子交换膜产品，Resolute层析柱，PKP层析系统，PK层析系统等。 　　Mustang离子交换层析产品为生物工艺提供了灵活的解决方案，包含一次性和重复使用两大类产品，均可放大。高流速，高通量，操作简便，紧凑设计等特性显著降低缓冲液的消耗，提高整体工艺的经济性。 　　Mustang膜层析技术是目前高效去除杂质、捕获大目标分子(质粒DNA，病毒载体等)的首选技术。

漫谈离子交换层析之生物大分子分离纯化应用——江必旺博士全球生物制药产业发展迅猛，根据Frost&Sullivan市场调研，2018年全球生物制药市场规模约为2642亿美元。单抗类药物由于特异性好，靶向性高，副作用小，疗效显著，成为发展最快的一类生物药。单抗药物在2020年市场已达到1550亿美金。生物药的生产可分为上游发酵过程和下游纯化分离过程，上游工艺主要包括细胞复苏、传代、发酵生产。而下游工艺主要包括膜过滤及多步层析分离纯化。过去十多年来，基因工程获得突飞猛进的进步，细胞培养的表达量从原来的不到0.5 g/L 到现在普遍达到5g/L，有的甚至超过10g/L。这些进步是由细胞表达载体的开发，单克隆筛选以及细胞培养基优化等技术创新所驱动的。由于发酵产率的大幅度提升，使得上游细胞培养成本大幅度降低。与上游十多倍生产效率提升相比，下游分离纯化技术进步明显滞后，导致下游工序成为生产瓶颈，抗体主要生产成本也转移到下游。下游纯化在整个生物药生产中占据主要生产成本，也被认为是最需要改进的技术领域。下游工艺先进性决定了药品的质量，及药品生产效率和成本。生物药生产的技术瓶颈：实现高效、经济的分离纯化生物制药下游生产工艺目的就是把目标药物分子从复杂发酵液体系中分离出来以满足药品纯度及质量的需求。一方面监管部门对生物药的纯度和质量要求越来越高，另一方面用于治疗用的生物分子种类越来越多，结构越来越复杂，且生物分子对外部条件敏感，稳定性差，杂质多，使得生物制药分离纯化的挑战更大。比如说治疗用抗体不仅对其含量有严格的要求，还必须去除工艺相关杂质如HCP, DNA，Endotoxin, 聚集体及降解片段等（表2）。 因此如何经济、高效的从发酵的复杂组分中浓缩、分离和纯化目标生物分子已成为全球生物药生产的技术瓶颈。在蛋白类生物药生产过程中，分离成本可占总生产成本的50～80％，分离纯化技术还对生物药的分子形态、收率、质量和成本具有关键作用。色谱或层析技术对复杂生物分子具有极高的分离纯化效率, 且条件温和, 在分离纯化过程中容易保持目标生物分子的活性，因此层析技术是目前生物药分离纯化最重要的手段，甚至是唯一的手段，几乎所有生物分离纯化都离不开层析技术。离子交换层析技术的优势生物分子的分离可以根据其尺寸大小、表面电荷、疏水性能、及与配基的亲和作用性能的差异分别采用分子筛，离子交换，疏水，亲和等层析分离模式。由于蛋白类生物分子是由氨基酸组成，几乎都带有电荷，因此蛋白分子在不同pH 条件下其带电状况不同，当pH等于蛋白的等电点时，蛋白处于电中性，当pH 小于等电点时，蛋白带正电荷，当pH 大于等电点时，蛋白带负电。不同生物分子带的表面电荷正负性质及表面电荷数量不同而且会随着流动相的pH改变而改变，使得不同组份的生物分子在离子固定相的电荷作用力有较大差异，因此绝大多数生物分子可以通过离子交换进行分离纯化。离子交换层析在生物分离纯化具有较多优点：第一，载量高，离子交换对蛋白的吸附量可超过100 mg/ml, 有利于提高批处理量及大规模纯化效率；第二，离子交换分离纯化选择条件比较多，既可选择不同的离子强度，也可选择不同的pH值作为分离条件。而且色谱出峰顺序可根据蛋白质的等电点进行预测。第三，离子交换层析操作简单，流动相便宜，蛋白质活性回收率高，综合成本低。第四，离子交换在蛋白的纯化过程中可同时实现产品的浓缩，有利于低浓度蛋白样品的分离纯化。减少后续浓缩工艺。总之，离子交换具有交换载量高，适用性广，且容易保持生物分子的活性而使得离子交换成为生物大分子分离纯化最常用的分离模式，根据Markets and Markets 市场报告离子交换介质用量已超过所有其它层析介质（包括SEC，亲和，疏水、复合模式及其它）用量总和。离子交换层析介质的种类离子交换色谱(IEC)是利用带有不同电荷的样品组分与固定相的离子功能基团形成电荷作用力而吸附在固定相上, 然后通过增加流动相的盐的浓度或改变pH来以降低样品组分与固定相的电荷作用力从而达到洗脱分离的目的。因此离子交换过程是低盐上样，高盐洗脱的过程。按所使用的离子交换介质所带基团的不同，可分为强碱性阴离子型（含季胺基，Q型）、弱碱性阴离子型（含伯、仲胺基，DEAE型）、强酸性阳离子型（含磺酸基，SP型）和弱酸性阳离子型（含羧酸基，CM型）等四种类型。为了增加离子交换的选择性，同时含有离子和疏水功能基团的混合模式离子交换介质也已问世，由于混合模式离子交换层析可以同时提供疏水作用力和静电作用力，因此其具有独特的选择性在分离纯化上具有广泛的应用。另外由于有疏水作用力混合模式离子交换介质耐盐性好，生物样品可以在高盐条件上样。离子交换基团要发挥离子交换作用，必需在溶液中解离成离子。季胺盐（Q）强阴离子交换介质和磺酸型(SP)的强阳离子交换介质离解的pH范围很大，在水溶液中几乎百分之百离解。而羧甲基(CM)型弱阳离子型交换介质和二乙胺乙基（DEAE）型弱阴离子交换介质离解的pH范围小得多。羧甲基(CM)弱阳离子型交换介质在pH 变大后逐渐离解成羧基负离子，pH大到一定程度就可完全离解；二乙胺乙基（DEAE）弱阴离子交换介质在pH 变小后氮原子上逐渐结合质子，pH小到一定程度就可完全让氮原子都结合上质子，达到完全离解。离解度越大，对应的柱子吸附量也大，不离解的弱离子交换介质是无吸附能力的。当然，吸附量还与目标蛋白质在此pH下的电荷情况有关。从羧甲基(CM)弱阳离子型交换介质在pH 变大后离解度逐渐变大看，pH值大有利于弱阳离子型交换介质使用。但是此时蛋白质带的正电荷减少，不利于蛋白质的吸附。当pH值大到一定程度，蛋白质可能带负电荷，就不被弱阳离子型交换介质吸附。从二乙胺乙基（DEAE）弱阴离子型交换介质在pH 变小后离解度逐渐变大看，pH值小有利弱阴离子型交换介质使用，但是此时蛋白质带的负电荷减少，不利于蛋白质的吸附。当pH值小到一定程度，蛋白质可能带正电荷，就不被弱阴离子型交换介质吸附。很多情况下，只要介质在使用pH范围，也就是在离子状态，蛋白质的带电性质和电荷多少是影响蛋白质吸附量的决定因素。另外，蛋白质样品一般要求在分离后保留生物活性，而保留蛋白质活性需要一个合适的pH值。所以选择离子交换分离纯化生物分子时，要综合考虑样品组分的等电点、蛋白质稳定的pH 范围和交换基团离解范围选择交换基团类型。常规四种离子交换结构图基质组成对离子交换层析介质的影响目前市场上用于生物分离层析介质主要由两大类材料组成：第一类是以琼脂糖，葡聚糖为代表的天然高分子层析介质；第二类是以聚苯乙烯和聚丙烯酸酯为代表的合成高分子层析介质。其中天然多糖高分子改性介质由于具有亲水强，生物兼容性好，能减少对生物分子的非特异性吸附等特点，因此在分离过程中容易保持生物分子的生物活性。另外交联天然多糖介质在溶胀状态下其多糖分子链可以舒展开来形成网状孔道结构，因此多糖介质表面积大，容易做成高载量的介质。但如果软胶在干燥状态下脱去水孔道结构容易塌陷，因此，软胶填充的层析柱一般不能干，否则介质容易孔道结构容易塌陷从而失去分离性能。软胶是生物大分子分离纯化应用历史最悠久，应用最广泛的层析介质。但天然多糖改性高分子介质因其基质柔软而被称为软胶，其主要缺陷是机械强度差、压缩比大、柱床不稳定、操作困难、流速慢、生产效率低等。相反，合成多孔高分子层析介质微球具有机械强度高，化学稳定性好等特点，因此可以耐受更大的压力、更快的流速，从而提高分离效率，其市场应用增速最快。另外合成高分子微球粒径大小，粒径均匀性更容易控制，使得合成高分子介质更容易装柱，柱效和分辨率也更高。同时聚合物介质孔道结构是通过无数高度交联的纳米粒子堆积而成。这些纳米粒子不溶胀，分子进不去，因此其表面积比琼脂糖基质的小，但孔径通透性更好，因此分子传质速度快，在高流速下载量可以保持的更好。但合成高分子层析介质的缺点是其疏水往往比软胶大，导致非特异性吸附大，容易使生物分子失去活性。因此聚合物微球表面需要进行亲水化改性以降低其非特异性吸附才能满足层析分离的需求。无论是以交联琼脂糖为基质的离子交换介质还是以表面亲水化改性的聚合物为基质的离子交换介质都有各自的优缺点，但它们的目标都是一致的，都是往高载量、高机械强度、高分辨率、高回收率方向发展。因此为了生产更理想的层析介质，交联琼脂糖层析介质要解决的问题是在保持它亲水性优势下如何提高其机械强度，而聚合物介质问题是在保持其机械强度优势条件下如何解决亲水化问题并降低非特异性吸附。未来离子交换层析介质的发展方向就是融合软硬胶的优点，做成载量高，机械强度大的介质。介质孔径大小及孔隙率对生物分离的影响除了粒径大小和分布会影响层析介质分离性能外，孔径大小、比表面积及孔隙率也是生物分离纯化介质最重要参数之一。层析分离模式主要是分子与介质表面功能基团作用的结果，层析介质可及比表面积是影响其吸附载量的主要因素之一，可及比表面积是分子可到达的内孔表面积加上介质外表面积。由于内孔表面积占据整个比表面积的90%以上，而内孔表面积主要由孔径大小，孔隙率来决定。孔径越小比表面积越大，但如果孔径太小，目标生物分子进不去，这样的小孔及其表面积对分离是没有作用的。孔径太大，比表面积也会降低，因此对于不同分子量大小的生物分子，有个最优的孔径大小，其可及表面积最大，分离效果最好。比如说用于抗生素这类分子量小的生物分子，孔径一般选择小于30纳米以下，而对于抗体蛋白分离纯化的介质一般选择孔径在100纳米左右，而对于病毒这种大尺寸的生物，需要400纳米以上超大孔的介质。另外孔隙率越大，比表面积越大，载量也会越大，同时机械强度越差，因此选择孔隙率也需要平衡机械强度和载量的要求。不同孔径大小的单分散聚合物色谱填料图层析介质粒径大小及均匀性对生物分离的影响单分散与多分散层析介质分离性能对比示意图层析介质粒径大小和分布是影响其分离性能最重要的参数之一。粒径越小，分布越均匀，柱效越高，分辨率越高。因此制备精确的粒径大小及高度的粒径均一性单分散层析介质一直是业界追求的目标。纳微成功开发出单分散大孔聚合物层析介质可以用于高效分离生物大分子。另外粒径均匀，填充的柱床稳定，重复性好，不容易堵塞筛板，而且可以使用更大孔径的筛板以降低反压。表面亲水改性对离子交换性能的影响大分子分离纯化介质的一个共性要求就是介质表面亲水性要好，以达到降低蛋白的非特异性吸附并保持生物分子的活性的要求。因此商业化的聚合物层析介质一般有两种合成方法：第一种就是选择具有足够亲水的单体直接合成亲水聚合物多孔微球，然后通过表面键合不同功能基团以制备离子、疏水、分子筛及亲和层析介质。比如说日本Tosoh 和美国 Biorad公司都是采用亲水较强的带多羟基丙烯酸酯或丙烯酰胺单体，这类介质与糖基组成的软胶类似不需要进行表面亲水化处理就可以直接键合功能基团做成离子交换层析介质。第二种方法是用疏水性较强的单体如苯乙烯，丙烯酸酯合成疏水聚合物多孔微球。这种微球由于疏水性较强不能直接用于蛋白分离纯化的层析介质，而是要先经过表面亲水化改性，才可以键合功能基团制备生物大分子分离纯化用层析介质。Thermofisher 生产的POROS 离子交换层析介质就是在疏水的聚苯乙烯微球表面通过亲水化改性后再键合不同功能基团制成离子交换层析介质。多孔聚苯乙烯微球表面亲水化改性是由Purdue 大学 Regnier教授研究组发明的专利技术（ US Patent No. 5503933）。因此Thermofisher利用该技术成功地开发出用于蛋白药物如抗体分离纯化的亲水化聚苯乙烯层析介质，该介质目前已被广泛地用于抗体及疫苗的纯化，在去除抗体多聚体等杂质方面具有明显优势。显然，第二种方法制备聚合物层析介质步骤多、工艺复杂、技术门槛高、成本高，但其制备的介质具有更高的机械强度，更小的压缩系数和更低的溶胀系数，可耐受更高的压力和流速，而且具有传质速度快、寿命长等优势。间隔臂对离子交换层析介质的影响除了介质基质材料组成，表面亲水性能及功能基团种类及密度会影响离子交换层析介质分离效果外，其功能基团与基球表面之间的间隔臂长短以及接方式也很重要。尤其是对于生物大分子的分离纯化，由于生物分子体积大，相比于小分子，其表面电荷的可及性差，因此间隔臂越长，越有利用介质表面离子功能基团与生物大分子带电功能基团起作用。对于小分子的分离纯化，由于空阻比较小，离子交换载量与离子功能基团的密度基本成正比，与基团与介质表面之间手臂长短关系不大。因此用于小分子分离纯化的离子交换介质，其离子功能基团可以直接连接到介质表面，中间不需要长间隔臂。但对于大分子分离纯化的离子交换介质，间隔臂对载量和分离效果都有较大影响。 德国默克开发出触角型的离子交换介质就是把离子功能基团通过高分子链从微球表面延伸出来，这种触角型的离子交换介质更容易与生物大分子有效结合，同时也有利于孔道空间的利用，解决了聚合物由于表面积比软胶小从而导致聚合物离子交换介质载量低的问题。触角型离子交换不仅载量高，而且传质速度快，分辨率高。单分散离子交换层析介质的最新进展为了高效率把目标生物分子从复杂样品里分离出来，并保持其生物活性，用于分离纯化的层析介质材料必须满足苛刻的要求如介质材料组成、形貌、粒径大小、粒径分布、孔径大小和分布、功能基团、及表面亲水性能等。粒径分布均匀，形貌规整的球形填料填充柱床的紧密程度一致性好，流动相在柱床中的流速均匀，流动相经过柱床的路径长短一致，从而有效降低涡流扩散系数，使色谱峰宽变窄，理论塔板数升高。粒径分布与流速特征关系图另外粒径大小一致，可以保持分子在填料微球的扩散迁移路径基本保持一致，相应的保留时间也一致，减少分子扩散系数，从而获得更高的柱效。因此高度粒径均一的单分散色谱填料既可以降低涡流扩散系数又可以减少分子扩散系数，从而提高柱效。另外粒径越精确、分布越窄、其柱床越稳定、反压越低、批间稳定性好。纳微生产的单分散色谱填料不仅完全可以替代SOURCE 系列产品，而且粒径，孔径及材质的选择都远远超过SOURCE产品种类和规格。纳微单分散聚合物层析介质包括聚苯乙烯和聚丙烯酸酯系列。聚苯乙烯表面改性层析介质系列可以替代POROS用于抗体和蛋白的分离纯化，而聚丙烯酸酯系列可以替代Tosoh, Merck, Biorad等生产的聚丙烯酸酯或聚丙烯酰胺层析介质。层析介质关系到药品生产的成本和质量。不同厂家生产的离子交换层析介质都有各自的特点，没有最好的，只有选择最合适的。但层析介质的国产化无疑对中国生物制药产业链安全供应至关重要。越来越多像纳微这样的中国公司已经具备生产一流的层析介质的能力，这些国产化的层析介质也得到越来越多的药企认可。后记在问及江必旺博士对该技术的期望时，他表示：“色谱和层析是药物分离和分析最重要手段，尤其是生物制药领域，层析几乎是生物制药分离纯化的唯一方法。中国生物制药快速崛起会带动中国色谱和层析介质的发展，同时色谱和层析技术的进步及国产化会降低中国生物药的成本，提高药品的纯度和质量。因此中国的色谱和层析技术遇到千载难逢的发展机遇, 相信一定会得到迅猛的发展。”作者简介苏州纳微科技董事长 江必旺博士 江必旺博士，国家特聘专家，获北京大学化学系学士， State University of New York at Binghamton博士学位，在University of California at Berkeley 从事博士后研究。 回国后创建了北京大学深圳研究生院纳微米材料研究中心并任该中心主任。于2007年，江必旺博士创建了苏州纳微科技股份有限公司，专门从事高性能微球材料的研发及产业化。江博士带领团队突破了单分散硅胶色谱填料精确制备技术难题，成为全球唯一一家可以大规模生产单分散硅胶色谱填料的公司。江博士团队还开发出世界领先的单分散聚合物层析介质、如离子交换、亲和，疏水及分子筛等系列亲和层析介质，打破国长期垄断。江博士创建的纳微科技成为色谱领域第一家在科创板上市公司。【专家约稿招募】若您有生命科学相关研究、技术、应用、经验等愿意以约稿形式共享，欢迎邮件投稿邮箱：liuld@instrument.com.cn微信/电话：13683372576扫码关注【3i生仪社】，解锁生命科学行业资讯！Webinar预告（点击报名）

东曹生命科学（Tosoh Bioscience）是全球知名的色谱分离解决方案供应商，近日宣布对现有SkillPak预装柱产品线进行了拓展，推出了2.5 cm I.D.和5.0 cm I.D.两种规格的层析柱新品，用于单克隆抗体、抗体片段、ADC、寡核苷酸以及病毒等生物大分子的纯化工艺开发。关于SkillPak预装层析柱SkillPak预装填有亲和、阴/阳离子交换、疏水以及尺寸排阻等各种分离模式的TOYOPEARL或TSKgel层析填料，性能卓越、稳定可靠，可与常用的低压或中压液相色谱层析系统配合使用。SkillPak不仅可以重复再生使用，还充分考虑了每种填料不同的装填压缩比，能够精确展示各种尺寸层析柱的纯化效果。公司现有产品1 mL和5 mL SkillPak主要用于纯化工艺开发或变更时进行参数和方法的优化，以及耐用性的测试等。此次新上市的50 mL和200 mL规格的层析柱可将开发好的纯化工艺线性放大。SkillPak预装层析柱的应用1. 抗体纯化工艺中洗脱pH值的确定在mAb纯化工艺中，找到适合mAb洗脱的缓冲溶液和pH值，可降低样品中聚集体增加的风险。为了确定mAb结合和洗脱的最佳条件，我们将含CHO细胞培养上清液的mAb进样至预装有TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F填料的SkillPak层析柱中。图1. 使用1 mL和5 mL SkillPak确定mAb洗脱pH值图1中的A和B显示了使用线性pH值梯度在pH 3.5时获得尖锐的mAb组分峰 (洗脱最大)。为了最大程度地提高回收率，可选择pH 3.3～3.5进行分步洗脱。2. 下游工艺的无缝放大我们使用装填了阴离子交换填料TOYOPEARL NH2-750F的不同尺寸的SkillPak层析柱分离蛋白标准品。下图中蛋白标准品的分离结果显示，不同尺寸层析柱上其洗脱曲线相似，证明了SkillPak出色的放大能力。图2. 不同尺寸的SkillPak分离蛋白标准品同时，我们还在5 mL、50 mL和200 mL的SkillPak层析柱上测定了牛血清白蛋白 (BSA) 的动态吸附载量。BSA在不同尺寸的SkillPak上动态吸附载量值非常接近，最大偏差为4%，表明吸附能力与层析柱尺寸无关，这一点对于工艺放大时的上样量来说非常重要。表1. 不同尺寸SkillPak上BSA的动态吸附载量如您想了解SkillPak预装柱的详细信息，欢迎联系我们索取产品资料或申请免费试用。Tel：400-825-6296

沃特世公司（WAT:NYSE）最新推出了Protein-Pak™ Hi Res离子交换（IEX）色谱柱，用于在沃特世 ACQUITY UPLC ® 系统上分析生物分子，包括单株抗体、重组蛋白质、DNA/RNA和疫苗。生物治疗药物厂商使用该色谱柱分析完整生物分子的各种带点状态，可以获得更高的分辨率，更快的分析速度，以及更好的重现性。，因此，提高了监测能力，有助于厂商高品质和高效率的生产。 　　沃特世Protein-Pak Hi Res IEX系列色谱柱的开发，是为了使用UPLC® 技术定性分析目前在众多新型生物制药疗法中发现的重组蛋白质和单株抗体的。这些无孔的、高健合密度颗粒技术与传统的多孔IEX颗粒技术在大分子分离方面比较，具有较高峰值容量和较高的分辨率。另外，新的颗粒技术及表面化学特性也提高了色谱柱的载样能力和分辨率，同时最大限度减小了色谱柱污染。 　　在聚合物颗粒的表面健合的离子交换的健合相包括强阴离子交换(季胺盐，Q)和弱强阳离子交换物质(羧甲基(CM)和磺丙基(S))。它们在pH值3-10这个范围内可以耐受高盐浓度和高压。离子交换色谱法被证实是重要的用于评估生物分子带电状态的技术。生物分子生产的重现性是个难点问题。是重现，蛋白质带电量的变化是脱酰胺或糖基化作用的良好标志，进而会影响产品稳定性和功效，因此需要密切监测。更多详情，请访问网站 www.waters.com/proteins。 　　将UPLC技术的能力扩展至生物分子 　　2004年，沃特世公司推出了ACQUITY UPLC系统，彻底改变了LC分离技术，相比传统HPLC技术，UPLC技术大大的提高了样品通量。沃特世公司最新的Protein-Pak Hi Res IEX色谱柱与ACQUITY UPLC系统的完美结合，可以在保持关键组分的分辨率下，获得最高的灵敏度。另外，每根色谱柱都采用沃特世ACQUITY UPLC eCord™ 技术，有助于监测单根色谱柱在整个色谱柱生命周期内的使用参数 – 信息永远伴随着色谱柱。 　　总之，这些互相结合的技术极大地增强了单株抗体、重组蛋白质、DNA或RNA以及疫苗成分的定性分析能力。 　　关于沃特世公司(www.waters.com) 　　50年来，沃特世公司(NYSE:WAT)通过提供实用且可持续的创新，实现了全球医疗保健、环境管控、食品安全、水质监测等领域的显著进步，为基于实验室的许多机构创造了商业价值。 　　沃特世的技术突破和实验室解决方案开创了分离科学、实验室信息管理、质谱技术和热分析的相互组合，为客户提供了一个持久成功的平台。 　　沃特世公司2009年的总收入达15亿美元拥有5,200名员工 公司正在帮助全球客户推进科研进程，并为其提供绝佳的操作体验。

近期，中国科学院合肥物质科学研究院等离子体物理研究所低温等离子体应用研究室助理研究员张呈旭等人采用等离子体方法在制备高性能阴离子交换膜方面取得新进展。相关研究成果近日发表在能源领域学术期刊《电源杂志》上(J. Power Sources, 2014, 272: 211)。 　　阴离子交换膜因其对离子具有选择透过作用，在能源、环境、化工等领域有着广泛的应用价值。目前，阴离子交换膜的制备方法主要有氯甲基化法和辐射接枝法。氯甲基化法利用氯甲基化反应在聚合物骨架结构上引入氯甲基基团，然后通过季铵化反应得到阴离子交换基团，然而氯甲基化反应常需要使用剧毒致癌物质氯甲醚，且季铵化试剂有机胺也具有毒性和挥发刺激性。辐射接枝法通过在聚合物膜上接枝功能性单体，再经季铵化处理获得阴离子交换基团，虽然可以避免使用氯甲醚，但仍需大量使用毒性有机胺试剂。同时，高的辐射能量容易引起聚合物基体结构损坏，影响膜的稳定性。 　　为此，研究人员发展了一种绿色、温和的阴离子交换膜制备新方法，以聚合物粉体为基体，经等离子体轰击和单体接枝聚合反应，在聚合物粉体上直接引入阴离子交换基团，制备功能基团均匀分布的阴离子交换膜。制得的阴离子交换膜具有较好的热稳定性、化学稳定性、离子交换容量、离子电导率和较低的乙醇透过率。前期研究成果均发表在国际权威学术期刊上，并已申请两项国家发明专利，有望直接面向市场应用。 　　该研究得到了国家自然科学基金和安徽省自然科学基金的支持。

研究背景来自于痘病毒科，正痘病毒属家族的痘病毒是一类大的、具有囊膜的DNA病毒。在痘病毒的12个成员中，有些是重要的人类病毒，例如猴痘病毒（最近暴发的猴痘疫情，截至2023年1月30日，已传播至110个国家或地区，并造成全球范围内85449人感染，89人死亡）、天花病毒（一种可引起天花的高度传染性及致命性的病原体）、痘苗病毒（VACV，一种用于预防天花和猴痘的自然减毒活疫苗）等。正痘病毒的持续性传播及流行对全球的公共卫生安全造成了极大威胁。因此，迫切需要鉴定正痘病毒所编码的入侵相关蛋白，以促进更有效的抗病毒疗法的研发。科研速递入侵是病毒建立感染的第一步，也是机体体液免疫所靶向的重要阶段。与大多数其它囊膜病毒利用一种或少数几种病毒蛋白行使入侵功能不同，痘病毒可编码4种蛋白（A26、A27、D8、H3）和另外的11种蛋白（A16、A21、A28、F9、G3、G9、H2、J5、L1、L5、O3）来分别介导病毒的粘附和膜融合。病毒的11种融合相关蛋白还可进一步组装成一个大型复合物，称为入侵-融合复合体（EFC）。此外，先前的反向遗传学研究表明，几乎每个EFC蛋白都可在痘病毒生命周期的粘附后（半融合或完全融合）过程发挥关键作用。因此，对EFC组分或复合物的结构研究将有助于逐步揭示EFC的神秘融合机制，并进一步促进预防/治疗药物的研发。 然而，在本研究之前，仅有两个EFC组分的蛋白结构（F9和L1）得以解析。 四川大学逯光文教授团队在2023年1月在感染性疾病领域高水平期刊Emerging Microbes & Infections（ IF= 19.568）上发表了题目为「Crystal structure of vaccinia virus G3/L5 sub-complex reveals a novel fold with extended inter-molecule interactions conserved among orthopoxviruses」对G3/L5两个蛋白结构做出了最新的研究！（原文地址：https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/22221751.2022.2160661) 助力设备 逯光文教授团队在该研究中使用赛谱仪器SDL蛋白层析系统，用离子交换色谱，凝胶过滤色谱及蛋白质印迹法鉴定并获得了痘苗病毒G3/L5异源二聚体复合物。

2015年5月21日，北京慧德易科技有限公司联手东曹(上海)生物科技有限公司和深圳市华创精科生物技术有限公司在天津日航酒店共同举办了&ldquo 液相色谱分离分析及中低压层析纯化技术应用研讨会&rdquo ，来自全国各地的共约100余名色谱界专家和学者参加了此次会议。会议主要从&ldquo 用于抗体纯化的层析填料新产品&rdquo 、&ldquo 针对抗体/ADC药物分析的应用&ldquo 以及&rdquo 反相/正相色谱柱在原料药和中草药方面的应用&ldquo 等几个方面向到场嘉宾介绍了东曹(上海)生物科技有限公司最新研发的TSKgel UP-SW系列色谱柱，并与到场嘉宾做了细致的交流。同时，在此次会议上还邀请到了日本山口大学研究生院的山本修一教授就色谱法中的生物识别和移动现象以及规模放大、规模缩小的开发做了精彩报告。会议在热烈的讨论中落下了帷幕。 会议现场 来自东曹(上海)生物科技有限公司的史俊霞工程师向到场嘉宾做了&ldquo 针对抗体/ADC药物分析的最新应用以及最新2umUHPLC色谱柱介绍&ldquo 报告，报告首先对抗体&mdash 药物偶联物(ADC)做了简要介绍，ADC即将单克隆抗体和高效细胞毒素完美地结合到一起，充分利用前者靶向，选择性强以及后者活性高的优点，同时又消除了前者疗效低和后者副作用大的缺陷。ADC常用的HPLC分析方法包括HIC、HIC/LC-MS、SEC和IEC等，接着史俊霞就分别对用TSKgelButy-NPR、TSKgel G3000SWXL、TSKgel SP-STAT分析曲妥珠单抗偶联药物的偶联比、曲妥珠单抗和曲妥珠单抗偶联药物的聚体以及抗体偶联药物的电荷异构体等做了分析，结果发现用TSKgelButy-NPR(4.6mmX10cm)曲妥珠单抗偶联药物的偶联比时，在流动相中添加20%异丙醇各组分的分离度较好 用TSKgel G3000SWXL(7.8mmX30cm)分析曲妥珠单抗和曲妥珠单抗偶联物的单体与二聚体时，添加10%的IPA在流动相中，单体与二聚体的分离度超过了1.5，各组分峰型良好。用TSKgel SP-STAT(4.6mmX10cm)在PH梯度条件下可以得到更多的ADC电荷异构体信息。最后史俊霞介绍了东曹(上海)生物科技有限公司最新研发的TSKgel UP-SW3000色谱柱，该色谱柱是一款主要针对生物大分子开发的SEC色谱柱，采用2um的硅胶作为基质，并用二醇基进行表面修饰，它可以同时兼容于UHPLC和HPLC系统。同时将TSKgel UP-SW3000色谱柱与竞争产品色谱柱在分离单抗的效果上做了对比。 东曹(上海)生物科技有限公司工程师 史俊霞 报告提目：《针对抗体/ADC药物分析的最新应用案例分享》 　　来自东曹(上海)生物科技有限公司的张琳博士向到场嘉宾介绍了TSKgel反相/正相色谱柱的介绍及在原料药和中草药方面的应用以及TSKgel色谱柱的常见问题和解决方法。张琳首先介绍了TSK品牌的由来，即源于东曹公司以前的名字&ldquo Toyo Soda Kogyo&ldquo ,其最有名的产品是用于蛋白分析的TSKgel G3000SWXL系列色谱柱，接着张琳向在场嘉宾介绍了使用TSKgel ODS系列反相色谱柱按照2010年版《中国药典》的要求考察了实验参数对于结果的影响情况。最后张琳还对色谱柱在化药-抗生素分析中的应用做了简要介绍。同时还介绍了TSKgel色谱柱的常见问题和解决方法。 东曹(上海)生物科技有限公司技术部主任 张琳 报告题目：《TSKgel反相/正相色谱柱在原料药和中草药方面的应用及TSKgel色谱柱使用中的常见问题解答》 　　来自于深圳市华创精科生物技术有限公司的栗云天经理向到场嘉宾介绍了公司最新开发的新一代全自动层析柱及层析系统。深圳市华创精科生物技术有限公司其产品主要包括分析液相、中压和高压制备液相、工业层析操作系统和层析柱，产品种类涵盖反相聚合物、反相硅胶、手性制备、离子交等不同类型的填料及预装柱，以及从分析到半制备、到工业生产不同规格的层析柱和操作系统。 深圳市华创精科生物技术有限公司经理 栗云天 报告题目：《新一代全自动层析柱及层析系统介绍》 日本山口大学研究生院教授 山本修一 报告题目：《用于生物大分子的新一代下游工艺的介绍》 东曹株式会社研究员 田中亨 报告题目：《根据FcR的糖链结构来进行抗体分离纯化》 东曹株式会社 桥本佳巳 报告题目：《新型磺酸基阳离子交换填料的介绍》

继上篇《浅谈令人“爱恨交加”的Protein A亲和层析介质》（点击回顾）后，江必旺博士本期带我们了解影响Protein A层析介质的多种参数，供广大用户学习，也欢迎大家在评论区留言讨论。Protein A亲和填料的关键考核要素Protein A是用于抗体第一步分离纯化，其性能影响抗体生产的效率，成本，纯度等等，因此抗体厂家对Protein A 介质的要求较高。其关键点在Protein A 介质的载量，机械强度，耐碱性，使用寿命，纯度和回收率，配基脱落及HCP的残留及产品的质量和稳定供应等等。介质载量：层析介质的载量是药厂选择的重要参数，载量越高，同样柱体积填料可以处理更多的抗体料液，生产效率也就越高。但Protein A 亲和填料载量与柱保留时间有关，一般情况是柱留时间越长，测试的载量越大，也就是说流动相速度越快载量越低，这主要是因为抗体在介质微球中的扩散速度受限造成的。抗体的纯化生产效率与流动相速度有关，速度越快生产效率越高，但速度越快载量越低，上样量越少，因此要平衡好载量和流速以达到最高生产效率。评估亲和介质载量要看，其载量是在什么样的流速下测试的，理想的介质是在高流速条件下具有较高的载量。这样有利于兼顾生产效率和产量；抗体回收率和纯度：一般来说Protein A亲和层析介质用于抗体分离纯化回收率都比较高（一般都高于90%以上），回收率越高，成本越低。另外纯化后抗体的纯度也是药厂重点考虑的因素，Protein A 亲和层析往往是用于第一步捕获，一步亲和层析就可以把纯度提高到95%以上，通过第一步纯化后抗体纯度越高，后续精细分离的压力越小。抗体回收率和纯度往往更Protein A配基种类有关系，不同厂家采用的配基不同，会影响收率和纯度。介质寿命及耐碱性：亲和层析介质比离子交换介质价格高很多，而且使用寿命又比离子交换介质短很多，使得亲和层析介质在抗体的纯化介质中占据80%成本。因此亲和层析介质的寿命是抗体厂家要考虑的另外一个重要参数。高效服役时间的长短会在一定程度上影响纯化的经济性，也能从某种程度上避免更换填料带来的潜在问题；另外药物生产过程中，氢氧化钠被广泛用于层析介质及系统的清洗、消毒及存储等过程。采用氢氧化钠再生可避免不同cycle间的蛋白及核酸的交叉污染，也可有效降低Bioburden。当浓度大于0.1M时，可有效灭活Murine Leukemia Virus等病毒，杀灭细菌及芽孢杆菌，降低内毒素水平。因此Protein A 亲和层析介质的耐碱性对其寿命及纯化抗体的质量具有重大意义。一般Protein A 亲和层析介质需要耐受0.5 M NaOH溶液清洗，且在经过100 Cycles清洗后，动态载量仍要维持在95%以上； 表1氢氧化钠对不同病毒灭活的效果统计HIVBVDCPVBHVPOLSV-40MLVADV0.1M NaOHSpike2.0×1069.5×1062.0×1096.9×1097.1×1081.7×1082.6×1052.2×10820min5.8×1021.5×1049.6×1024.5×1012.0×1044.7×1044.0×1016.3×10160min5.8×1022.7×1045.0×1034.5×1012.1×1032.0×1044.3×1012.9×101Inactivat（log10)3.52.55.68.25.53.93.86.90.5M NaOH Spike2.0×1069.5×1062.0×1096.9×1097.1×1081.7×1082.6×1052.2×10820min5.6×1021.7×1021.5×1035.9×1012.0×1048.4×1034.7×1012.0×10160min6.7×1022.7×1025.0×1035.9×1016.2×1031.0×1035.5×1012.2×101Inactivation（log10)3.54.76.18.15。16.23.77Note：病毒浓度检测采用组织细胞感染计量TCID50大量的微生物如酵母细菌可干扰层析过程，同时可以造成筛板堵塞等问题，更重要的是微生物产生的内毒素和蛋白酶严重污染纯化料液。氢氧化钠可有效抑制、杀灭酵母及细菌等微生物。数据见下表。表2 氢氧化钠对不同病毒灭活的效果统计OrganismConc.NaOH(M)Time(hrs)Temp.E.coli0.0124/22℃S.aureus0.114/22℃C.albicans0.514/22℃A.niger0.514/22℃B.subtilis spores14822℃P.aeruginosa1122℃Note:细菌低于检测限度(3Organisoms/ml)所需要的时间内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁成分，主要是类脂多糖，也被称作热源。注射药物中含有纳克级含量即可使人体产生寒颤，高热甚至休克等不良反应。GMP生产的各环节严格控制热源，层析过程也是重点监控步骤。采用氢氧化钠对层析系统及填料进行SIP可确保把热源含量降至最小。下图是不同浓度氢氧化钠对于内毒素的灭活效果。机械强度：高机械强度的介质耐压性好，耐受更高的流速，从而提高生产效率，缩短纯化周期；另外高机械强度填料可装填更长柱子，从而提高批次处理量；高机械强度介质可以减少碎片避免筛板堵塞，降低压力；还有高机械强度的介质可以上高浓度，高粘度的样品；最后高机械强度有利于放大生产，越大的柱子，对介质机械强度要求越高，因此高机械强度的介质在大规模层析纯化过程中越不容易给压塌，可以确保生产的安全性。Protein A层析介质除了要考虑载量，机械强度，耐碱性及寿命外，还要考虑Protein A的 脱落及内毒素的控制及生产的批次稳定性等。下期，江必旺博士将为我们带来“Protein A 亲和层析介质的制备方法”干货文章，敬请期待。

导读 在全球和中国医药市场上，抗体药物已连续多年占据销售榜单前几位。当前，随着国家医改政策的改革和完善，国际、国内市场打通，抗体市场也开始进入“你方唱罢我登场”群雄逐鹿的竞争阶段，生产企业如何在确保产品质量的基础上，通过改进工艺，来降低成本、提高生产效率和市场竞争力？江博士文章给读者提供了一条切实可行的思路和方法，请看“如何突破抗体生产瓶颈”。抗体药物市场及发展趋势 全球生物制药产业发展迅猛，根据frost&sullivan市场调研，2018年全球生物制药市场规模约为2642亿美元。单抗类药物由于特异性好，靶向性高，副作用小，疗效显著成为发展最快的一类生物药。单抗药物在全球生物药中所占市场份额超过50%，达到1353亿美金。 中国巨大的市场潜力，国际重磅抗体药专利到期，大量的海归人才回流及中国日益强大的资本助力，都为中国抗体制药发展提供了前所未有的历史机遇。但是中国抗体制药企业也面临巨大的挑战。首先中国药企无论是技术、规模、经验，人才还是资金，跟国际生物制药巨头相比，都有着较大的差距。其次中国加入ich和国际药监管体系接轨，降低药品进口关税，对进口抗癌药物实施零关税等系列政策，降低了国外原研药进入中国市场的门槛，给中国生物药企业带来了巨大压力和挑战。另外，越来越多的制药企业进入抗体药的开发领域，每个重磅抗体药物基本上都有几十家企业在仿制研发申报，因此国内抗体药企不仅要面临国外原研药巨头的打压，还要面对国内众多同行及印度廉价药企业激烈的竞争。最后带量采购新政允许通过一致性评价的仿制药与原研药可以一起同台竞标，低价中标，消除了销售渠道的壁垒使得国内外生物药企的竞争回归到技术创新，产品质量和成本的竞争。 因此国内生物药企是否能在激烈的竞争中取得优势取决于其生产工艺的先进性，因为制药工艺水平决定了产品的质量和成本。抗体药物的生产工艺进展 抗体药物生产是个非常复杂的过程，大致分为上游的发酵及下游的分离纯化：上游工艺主要包括细胞复苏、传代、发酵生产。而下游工艺主要包括膜过滤及多步层析分离纯化。过去十多年来，基因工程获得突飞猛进的进步，细胞培养的表达量从原来的不到0.5 g/l 到现在普遍达到5g/l，有的甚至超过10g/l。这些进步是由细胞表达载体的开发，克隆筛选以及细胞培养基优化等技术创新所驱动的。由于发酵产率的大幅度提升，使得上游细胞培养成本大幅度降低（表1）。表1 表达量与抗体生产成本关系与上游十多倍生产效率提升相比，下游分离纯化技术进步明显滞后，导致下游工序成为生产瓶颈，抗体主要生产成本也转移到下游。下游工艺在整个生物制药生产中占据60%以上生产成本，也被认为是最需要改进的技术领域。下游工艺先进性决定了药品的质量，及药品生产效率和成本，也成为生物制药企业的核心竞争力所在。生物制药下游生产工艺目的就是把目标药物分子从复杂发酵液体系中分离出来以满足药品纯度及质量的需求。一方面监管部门对生物药的纯度和质量要求越来越高，另一方面生物分子具有结构复杂，且对外部条件敏感，稳定性差，杂质多，浓度低等特点，使得生物药分离纯化的挑战更大。比如说治疗用抗体不仅对含量有严格的要求，还必须去除各种潜在的杂质如宿主hcp, dna，endotoxin, 抗体聚集体及降解片段等（表2）。表2 抗体药物对各种杂质的要求 层析技术具有分离纯化效率高，条件温和且容易保持目标分子的生物活性，因此成为生物制药分离纯化最主要工具。但下游层析分离纯化技术牵涉到材料、生物、化学及设备等交叉技术领域。因此研究下游分离纯化技术的人才较少，另外上游基因工程技术几乎在所有高校都有专业研究团队，而且培养了大量的人才，而下游分离纯化技术却很少在高校有专门研究，也缺乏相关的专业课程来培养分离纯化的人才。过去10多年上游基因工程的迅猛发展虽然带来上游发酵成本的大幅度下降，但下游分离纯化技术进步缓慢使其成本居高不下。因此要降低抗体生产成本关键就是要解决下游分离纯化的瓶颈问题。 抗体的层析分离步骤基本都可以采用标准化的三步曲：第一步用protein a介质进行抗体捕获和浓缩；第二步用离子交换进行中间纯化以去除多聚体，宿主蛋白等杂质；第三步是精纯去除剩余dna，endotoxin,protein a 等微量杂质。在这三步抗体的分离纯化过程中，第一步的protein a亲和捕获占据分离纯化成本80%以上，也是下游分离纯化的瓶颈所在。亲和层析之所以成本高的主要原因：首先是protein a 价格昂贵，其价格是普通层析介质十几倍；第二，protein a使用寿命短，一般离子交换填料使用寿命多达1000次，而亲和填料寿命通常在100-200次；第三，protein a 用于抗体的捕获和浓缩，需要处理大体积的发酵液，而亲和步骤载量往往又低于阴阳离子交换层析，使得亲和层析介质使用量比中间纯化或精纯的要多得多。因此，要降低抗体的生产成本，解决抗体的生产瓶颈关键在于改进第一步protein a 亲和捕获。 下游分离纯化核心的工艺流程 protein a 亲和层析是利用protein a 配基与目标抗体具有专一亲和吸附作用从而达到分离纯化抗体的目的。野生型protein a蛋白是金黄色葡萄球菌细胞壁锚钉蛋白。三维空间上，抗体fc端ch2-ch3区域与protein a蛋白b结构域上两条反相平行的α螺旋结构相互结合。因此protein a与抗体分子特别是与igg1、igg2、igg4有特异性结合，使得抗体分子与发酵液中不具fc端结构的杂质如宿主蛋白与核酸等有效分离，进而达到纯化目的。protein a 亲和层析介质是通过把proteina 配基偶联到微球介质上制备而成的。因为protein a配基与目标抗体的作用的专一性，因此亲和层析的分离纯化工艺和方法与抗体样品杂质含量和种类多少影响不大，使用protein a 介质一步纯化目标抗体就可以达到95%以上纯度，回收率达到90%以上。亲和纯化效率也基本不受杂质多少影响，而其它分离模式如离子交换，疏水，分子筛等的分离工艺方法及效率大多取决于与目的蛋白同时存在的杂质种类和含量。因此，只要样品杂质不同，即使是纯化同样的目标生物分子，采用的分离工艺和方法就不同。以重组胰岛素分离纯化为例，不同厂家虽然生产的是同一目标胰岛素，但采用分离纯化方法完全不一样，主要原因就是每家生产的胰岛素杂质组成和含量不一样，因此需要不同的纯化工艺。而比胰岛素分子量更大，结构更复杂的抗体基本可以采用标准化的三步曲，主要原因就是protein a 亲和介质的出现大大简化抗体的分离纯化工艺，但protein a 价格昂贵让抗体生产厂家爱恨交加。 protein a 介质价格高的主要原因是其生产工艺复杂，proteina 配基是通过生物发酵生产的，经过纯化后偶联到介质上成为protein a 亲和介质，因此生产成本远高于传统的离子交换、疏水、分子筛等介质。另一方面protein a产品主要由欧美几家供应商垄断，也是价格居高不下的原因之一。为了降低抗体生产成本，不少研究工作者在寻找可以取代protein a且价格低廉的新型层析介质来纯化抗体，虽然可能在一些个案中获得成功，但都无法撼动protein a 在整个抗体分离纯化的垄断地位。proteina 亲和层析成为过去近30年里抗体纯化捕获的金标准。因此要降低抗体亲和层析这一步的成本首要的方案是实现protein a 介质的国产化以降低产品价格；其次是通过采用创新的连续层析工艺技术或其它新工艺以提高protein a 介质的利用率并提高抗体生产效率。当然不断改进protein a 介质性能使其具有更高的载量和更长的使用寿命也可以降低抗体的生产成本。 protein a 介质国产化创新之路 目前市场上主流protein a产品是ge生产的以琼脂糖为基质的产品，也是最早商业化的产品。琼脂糖为基质的protein a 介质具有载量高，亲水性能好，非特异性吸附低等优点，但琼脂糖介质天然缺陷是机械强度差，因此也被称为软胶。由于该介质耐压性能差，生产中需要降低柱高、减小流速以防止压力过高造成柱床塌陷，限制了抗体批处理量及抗体生产效率。软胶protein a 另外一个缺陷是传质速度慢，主要原因是软胶孔径较小，排阻大。因此软胶protein a 都需要驻保留时间长，流速慢条件下，抗体吸附载量才会比较高，但在高流速下动态载量下降的非常快。因此一个理想的抗体纯化用protein a 介质需要具有高流速，高载量，高机械强度，及更长的使用寿命等特点。protein a 介质载量是由微球孔径，比表面积，配基密度来决定的；机械强度则是由proteina基球材料化学组成，交联度及孔隙率来决定的；protein a 配基脱落及使用寿命主要由配基，基球性能及偶联方式来决定。实现高性能protein a 亲和介质的国产化需要从底层创新开始。抗体结构示意图创新之一：单分散基球替代多分散基球 层析介质粒径大小和粒径分布是影响层析分离的重要参数。粒径分布越均匀，装柱越容易、柱床越稳定、柱效越高、流速越均匀、洗脱越集中、分离效率越高、流动相用量越少，柱与柱重复性也越好；protein a 介质被誉为层析介质皇冠上的明珠，价格昂贵，可是市场上protein a 介质都是采用粒径分布较宽的基球。主要原因是单分散微球制备技术难度极大，世界上可以规模生产的单分散多孔微球只有dynal公司一家，ge销售的source 系列单分散聚苯乙烯色谱填料就是dynal生产的。但source 产品的粒径最大只有30微米，不能满足protein a 介质对粒径一般要大于40微米的要求。纳微经过多年的努力开发出世界领先的微球精准制备技术，突破大单分散大粒径多孔微球的制备难题，成为全球第一家生产单分散protein a 亲和层析介质的公司。纳微单分散protein a介质与传统软胶基质微观结构对比传统多分散protein a亲和软胶与unimab液流路径对比示意图 创新之二：通透大孔径基球微替代小孔微球 protein a 基球孔径大小会影响生物分子在介质的传质速度和有效载量，孔径越大，分子传质速度越快，在高流速下具有高载量。基于软胶基质的ge protein a亲和介质孔径较小，比表面积高，其静态吸附载量高，但传质阻力大，在驻留时间短，流速快的条件下，动态载量下降的很快。纳微经过优化筛选，专门设计的大孔结构基球，其孔径达到ge protein a 介质的一倍左右。因此该介质传质速度快，使得介质在高流速下具有高载量。从实验测试数据可以看到，纳微unimab与ge mabselectsure在驻留时间大于4分钟时，载量都差不多，当驻留时间小于2分钟时unimab的载量比mabselectsure载量高50%以上, 而且速度越快unimab载量优势越明显。抗体生产效率是由动态载量和流速共同决定，流速越快载量越高，生产效率越高，成本越低，但亲和层析介质的动态载量与流速成反比，流速越快，载量越低，因此对于每个protein a亲和介质纯化抗体效率都会随着流速升高效率逐步提高，到了一个最优的流速后，如果继续增加流速，纯化效率反而降低。林东强教授实验证明对于批次亲和层析，驻留时间是2分钟时生产效率达到最高，而驻留时间在2分钟条件，unimab的动态载量比mabselectsure 高50%以上。对于连续层析驻留时间是1分钟时生产效率最高，而这个保留时间，unimab的动态载量更是mabselectsure一倍以上。另外从抗体流穿曲线对比图也可以看出具有大孔结构及高度粒径均匀性的单分散protein a亲和层析介质与多分散软胶porteina 介质相比具有更陡的穿透曲线，说明纳微单分散层析介质具有更畅通的孔道结构，分子扩散速度快，抗体流穿少，回收率高。因此利用纳微大孔结构微球不仅可以提高分子传质速度，提高抗体生产效率，降低成本，而且在连续层析中，具有更明显的优势。unimab与mabselectsure产品不同驻留时间动态载量对比不同protein a 层析介质驻留时间与抗体生产效率与关系对比抗体流穿曲线对比图 创新之三：高度交联聚丙烯酸酯基球替代软胶或低交联的聚丙烯酸酯基球 高机械强度介质不仅可以耐受更高流速、更高压力、更大粘度样品，还可以装更高的柱床，以增加抗体批处理量、提高抗体生产效率、减少设备投资、减少厂房占用面积。因此纳微protein a 介质是选择高度交联的聚丙烯酸酯基球，与市场上以琼脂糖或低交联度聚丙烯酸酯为基球生产的protein a 介质相比具有溶胀系数小、压缩比例低、而且机械性能强。实验证明 unimab在2公斤装柱压力下，其柱床压缩比例只有5%，而无论是ge 生产的以琼脂糖为基球还是tosoh 生产的低交联聚合物为基球的protein a 介质压缩比例往往超过15%。unimab与软胶与压力流速曲线对比 创新之四：表面亲水化改性微球替代亲水性微球 用于抗体或蛋白纯化分离的层析介质必须具有很好的表面亲水性，因此市场上主要的protein a 产品要么是基于亲水多糖类材料，或者是用亲水单体做的基球，这种基球虽然亲水性能好，非特异性吸附低但机械强度差。为了保持基球的机械强度并解决介质亲水性问题，纳微采用先合成高机械强度高交联的聚丙烯酸酯微球，然后通过多步表面亲水化改性，再进行protein a配件偶联。这种方法虽然工艺复杂，但生产的介质既有高机械强度，又有表面亲水性能好，非特异性吸附低等特性。因此unimab在抗体分离过程中，hcp去除效果好, 可以达到软胶protein a 的同等水平。纳微unimab与对照填料的hcp去除效果 创新之五：protein a 配基创新 除了基球之外，protein a 配基也是影响介质性能重要因素，尤其是介质的寿命。ge之所以垄断protein a 亲和层析介质市场，最主要的是ge拥有耐碱性protein a 专利技术，其核心专利技术是通过基因工程改变b domain 不耐碱的3个氨基酸以改善其耐碱性能。纳微通过优化组合不同片段设计出新序列的protein a 配基，不仅耐碱性好，而且具有自主知识产权，并能自主实现大规模生产。纳微独有的耐碱性配基加上具有卓越性能的基球，及优化偶联工艺开发出高性能的protein a 亲和介质。以下是某单抗项目上unimab介质载量随使用次数增加的衰减变化表。每个cycle采用0.1m氢氧化钠cip，接触时间1小时。连续200个cycle 后dbc10%依然在初始值的75%左右，充分体现了纳微proteina介质的良好耐碱性。纳微世界领先的微球精准制造技术，可以对微球的材料组成、粒径大小、粒径均匀性、孔径大小及表面性能达到前所未有的精准控制。纳微利用这一技术平台开发出新一代单分散多孔聚丙烯酸酯为基质的protein a 亲和层析介质克服了传统proteina 软胶的缺点，也为实现下一代连续层析技术产业化提供理想的介质。unimab载量随使用次数增加的衰减变化表 protein a介质创新和生产工艺创新实现抗体生产效率提升 单抗药物的市场竞争越来越激烈，降低抗体生产成本，高效、稳定的产出合格的产品是每个抗体生产厂家追求的目标。亲和层析作为单克隆抗体分离纯化的关键步骤，关系到下游的主要成本及生产效率，产品质量，也是目前下游生产的主要瓶颈。因此纳微通过底层技术创新不仅实现protein a 介质的国产化，而且克服了现有产品的缺陷，必将大幅度提供抗体生产效率，降低抗体生产成本，更重要的是纳微创新性单分散层析介质可以推动下游工艺技术的创新和进步。比如说高机械强度的protein a 介质就使得通过增加柱床提高批处理量成为可能。而高流速下的高载量及耐高压特性为最终实现抗体连续层析工艺打下基础。新型连续层析工艺（右）连续流层析分离过程示意图(来源于林东强教授课题组文章)

由中国生物工程杂志社(中国生物工程学会会刊)主办的第14期蛋白质分离纯化技术专题研讨班定于2012年9月15-16日在上海举行。本期研讨班课程综合了国内外最新的蛋白质分离纯化技术与方法，特别是广泛吸纳了历届参会代表的大量问题解答与反馈意见以及研发与产业中的实际应用需求，经权威专家的反复提炼而成。研讨班内容涵盖蛋白质样品制备、纯化策略、过程优化，相关的产品规定、政策解读以及技术经济分析等内容，并注意突出重点和难点，如基因工程上下游的整体策略、纯化中的具体难点，层析介质的选择等多方面，以及层析柱蛋白质失活等具体问题。 　　本期研讨班由中国科学院从事制备与纯化技术的一线专家授课，注重引导学员讨论实际案例，突出互动性以提高学习效果，从而帮助参会人员在短时间里高效率地掌握蛋白质分离纯化工具，获得规范和先进的蛋白质纯化与工艺开发知识和方法，提高蛋白质分离纯化实践中解决具体问题的能力。 　　本期研讨班课程涵盖了从样品制备到纯化策略和过程优化的全过程，主要内容包括： 　　蛋白质样品的获得层析预处理原则与技术：离心、过滤、超滤、双水相抽提蛋白质层析，包括： 　　(1)层析介质选择：层析介质特性对层析过程的影响——材质、孔径、官能团 　　(2)层析技术：分子排阻、离子交换、疏水层析、金属螯合、亲和层析等 　　(3)层析步骤整合方法：选择性、分辨率、动态载量、主要杂质的控制和去除 　　(4)蛋白质纯化平台：适应于分子生物学实验室蛋白质纯化的方法和实例 　　单克隆抗体纯化，包括： 　　(1)单克隆抗体的生化性质 　　(2)单克隆抗体纯化的工具 　　(3)单克隆抗体纯化的策略和方案 　　用于疫苗和基因治疗的病毒颗粒纯化策略和方法 　　(1)双水相技术 　　(2)整体柱分离技术：病毒颗粒的离子交换，疏水，IMAC及亲和层析纯化 　　蛋白质纯化的溶液体系 　　(1)蛋白质纯化的缓冲溶液组成和功能 　　(2)各种层析模式的常用缓冲溶液的设计和使用 　　蛋白质层析技术经济分析 　　研讨班还安排高效重组蛋白表达策略与经验介绍等专题内容。 　　会议时间、地点：2012年9月15-16日，中国科学院上海学术活动中心(好望角大饭店)，地址：上海市肇嘉浜路500号。报到时间：2012年9月14日，报到地点：好望角大饭店一层。 　　参会办法：参会代表请于9月7日前填写会议回执后Email/邮寄/传真至会议主办单位中国生物工程杂志社，会议费每人1600元，在读研究生每人1400元(凭有效证件)，食宿统一安排，费用自理。 　　联系方式： 　　通信地址：北京市海淀区中关村北四环西路33号中国生物工程杂志社(100190) 　　联 系 人：任红梅13641036700 　　电 话：(010)82624544，82626611-6511 传真：(010)82624544 　　电子邮件：renhm@mail.las.ac.cn 　　中国生物工程杂志社 　　2012年8月 　　第14期蛋白质分离纯化技术专题研讨班报名回执表 　　(参会代表请于2012年9月5日前Emial/传真/邮寄至中国生物工程杂志社) 单位名称 通信地址 邮编 姓名 性别 职称 电话 传真 E-mail 是否住会 　　第14期蛋白质分离纯化技术专题研讨班住宿预订表 　　(住会者请务必2012年9月5日前回传本表，否则无法安排住宿) 单位名称 联系人 电话 手机 电子邮件 代表姓名 性别 是否需要单人间 入住日期 离店日期 　　报到及住宿酒店 　　好望角大饭店，地址：上海市肇嘉浜路500号，酒店电话021-64716060。住宿标准：330元/天标准间。由于好望角大饭店属于政府采购指定酒店，对于事业单位的参会代表，可以凭工作证享受政府采购价格298元/标准间(含早餐)。