质谱流式结果分析

来自麦吉尔大学和多伦多大学等研究人员已经开发出一种方法，可以仅通过一个微小肿瘤组织样本来预测肺癌患者在手术后的发展状况。研究人员将成像质谱流式细胞术与深度学习技术相结合，分析了400 多名来自肺腺癌患者的肺癌样本的肿瘤微环境。肿瘤微环境已被确定为影响治疗进展的异质性来源。通过在空间和单细胞水平上表征肿瘤微环境，研究人员揭示了与临床特征(如生存率)相关的不同细胞状态和特征。正如他们在Nature杂志上报道的那样，他们使用了人工智能来识别肿瘤微环境的某些特征来高精度地预测疾病进展。　　Fig. 1: IMC defines the spatial landscape of LUAD.　　“总的来说，这些数据表明空间分辨的单细胞转录组在未来可能具有非常大的价值，有助于为个性化的围手术期护理计划提供有价值的信息，以最大限度地减少那些能被治愈的人在治疗过程中产生的毒副作用，或提高那些会复发的人的治愈率”，麦吉尔大学的共同资深作者 Daniela Quail 和 Logan Walsh 以及拉瓦尔大学的 Philippe Joubert 领导的研究人员在论文中写道。研究人员使用 Fluidigm(现为 Standard BioTools)企业的成像质谱流式细胞技术系统，分析了 1996 年 2 月至 2020 年 7 月期间收集的 426 名肺腺癌患者的小组织核心样本。他们使用 35 重抗体组来识别各种细胞他们样本的成分，包括癌细胞本身以及基质细胞、适应性和先天性免疫细胞。研究人员总共检测到超过 160 万个细胞，并发现了 14 个不同的免疫细胞群。他们特别关注免疫细胞群与患者的临床数据之间的关联。例如，肥大细胞与延长生存期有关，虽然它们在非吸烟者和患有早期疾病的患者中更为常见。研究人员进一步注意到某些免疫细胞的频率与特定临床亚组之间的联系—例如，CD4 阳性辅助性 T 细胞在女性患者的样本中富集，她们往往会有更好的总体存活率，而老年患者的肿瘤内 CD8 较少- 阳性 T 细胞。与此同时，他们探索了肿瘤微环境中不同的细胞表型如何与生存相关，例如，发现 H1F1-α 阳性中性粒细胞将会产生不利于生存的环境。观察具有相似局部细胞类型组成的区域(邻近细胞)，研究人员进一步指出，不同的组织结构与生存差异有关。例如，富含 B 细胞的邻近细胞与存活显着相关，尤其是 CN-25 邻近细胞，它也富含 CD4 阳性辅助性 T 细胞。通过应用深度学习方法，研究人员发现他们生成的空间信息可以改善对临床结果的预测。他们报告说，创建的模型(包括空间信息)预测进展的准确率高达 95.9%，而基线评分的准确率为 75%，而且他们仅仅使用了一个 1 mm²的肿瘤样本。此外，研究人员使用成像质谱流式细胞术分析了 60 名原发性肺腺癌患者的单独验证队列，并在数据集中发现该模型以 94% 的准确度预测进展。研究人员将他们模型的预测能力追溯到六个标记的组合：CD14、CD16、CD94、αSMA、CD117 和 CD20。总体来讲，准确率为 93.3%，精密度和召回率为 95.6%。研究人员写道：“我们的研究结果代表了对使用临床和病理变量的现有预测工具的重要进步，并且可以更有效地利用不断增长的围术期辅助系统来改善癌症结果。”　　来源：　　1.Sorin, M., Rezanejad, M., Karimi, E. et al. Single-cell spatial landscapes of the lung tumour immune microenvironment. Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05672-3.　　2.基因网

2019年，上海交通大学丁显廷教授和林关宁教授团队联合在Genome Biology上发表了题为“A Comparison Framework and Guideline of Clustering Methods for Mass Cytometry Data”的文章。 该文章从准确性（precision）、一致性（coherence）和稳定性（stability）三个层面由浅入深地阐明了不同单细胞质谱流式技术（CyTOF）细胞族群分析方法的优劣及其适用场景。这是国际一线杂志第一次报道中国大陆学者在单细胞质谱流式技术数据标准化和分析方法学方面的工作。相比传统荧光标记的流式细胞术，CyTOF技术采用金属同位素标记抗体，避免了荧光重叠和自荧光消除的问题，可在单细胞水平同时测量数百万细胞中近百种蛋白质的表达量。这种同时获取高维度蛋白质的超强能力使得CyTOF技术在药物优化、疫苗开发和疾病标记发现方面具有重要的应用价值。然而，迄今为止CyTOF技术的数据标准化、样本和数据的质量控制、分析方法学，主要还是基于欧美学者提出的Accense，PhenoGraph和Xshift等分析方法。虽然这些分析方法已被广泛应用于不同的领域和临床研究，但是很多研究者对于采用哪个方法能更好地分析个体化的数据仍然存在疑惑。在这篇文章中，研究人员在三类异源（骨髓细胞、肌肉组织、结肠组织）6个单细胞组学的数据集上对目前经典的无监督和半监督细胞分群方法进行了基准分析和深度比较。在准确性（precision）分析上，根据四种内部评价指标（Accuracy，F-measure， NMI和ARI）讨论了不同方法对细胞进行分群的准确性；在一致性（coherence）分析上，利用三种外部评价指标（DB，CH和XB）探讨了细胞分群方法揭示细胞数据内部本质结构的能力；在稳定性（stability）分析方面，研究了随细胞采样数量变化，不同方法的准确性和识别出的细胞亚群数量的鲁棒性。此外，这篇文章还讨论了分群方法的分群分辨率，发现PhenoGraph和Xshifit能够识别出更细粒度的亚群（亚群数量偏多），而DEPECHE倾向于识别粗粒度的亚群（亚群数量偏少）。图1 CyTOF数据细胞分群方法的选择决策树综合上述框架的分析结果，这篇文章为单细胞质谱流式分析领域的研究者，特别是初学者以及没有生物信息学基础的研究者，提供了细胞分群方法的选择决策树。图2 聚类方法的稳定性分析上海交通大学生物医学工程学院个性化医学研究院是中国最早建立起单细胞质谱流式技术的单位之一，并已初步实现技术向临床应用的转化，先后利用单细胞痕量蛋白分析技术完成了寄生虫耐药、银屑病、结肠癌、肺结核方面的相关临床应用研究。刘晓博士、宋炜宸博士生是论文的第一作者。丁显廷教授和林关宁教授是论文的通讯作者。相关研究得到国际人类表型组计划、国家传染病重大专项、上海市高峰高原学科建设计划、国家自然科学基金等项目的支持。

8月28日，浙江普罗亭健康科技有限公司的质谱流式细胞分析仪PLT-MC601正式获得浙江省药品监督管理局批准的医疗器械许可证（浙械注准：20232221601）。普罗亭质谱流式细胞分析仪PLT-MC601诞生于2010年的质谱流式细胞技术（Mass Cytometry, CyTOF）采用带有金属同位素标签的抗体对细胞进行标记，通过飞行时间质谱分析各细胞上的标签组成，进行细胞表型和功能的深入研究。避免了荧光流式的计算补偿带来的误差和复杂的配色方案，可实现单细胞级多参数同步检测。对比传统流式技术，质谱流式技术主要特点包括：金属标签，采用金属同位素代替荧光基团做标签系统，增强抗体信号强度超高通道，检测范围从80-209amu，可同时检测单个细胞130个抗体通道高准确性，飞行时间质谱的应用，避免串色现象带来的补偿算法误差金属编码技术，质谱流式可支持10种以上的标本同时检测，大幅提高检测通量

p style=" text-align: justify " 　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 　 span style=" text-indent: 2em " 前言：质谱流式细胞仪（CyTOF） /span /strong /span /p p style=" text-indent: 2em " 质谱流式细胞技术的核心融合了流式细胞技术与质谱技术。目前质谱流式细胞技术采用的仪器是CyTOF（Cytometry by & nbsp Time-Of-Flight），其原理简单来说是利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术，既继承了传统流式细胞仪的高速分析的特点，又具有质谱检测的高分辨能力。 span style=" text-indent: 2em " 传统流式细胞技术和质谱流式细胞技术相比，主要有两点不同：1.标签系统的不同，前者主要使用各种 span style=" text-indent: 2em color: rgb(0, 112, 192) " strong 荧光基团作为抗体的标签 /strong /span ， span style=" text-indent: 2em color: rgb(0, 112, 192) " strong 后者则使用各种金属元素作为标签 /strong /span ；2.检测系统的不同， strong span style=" text-indent: 2em color: rgb(0, 112, 192) " 前者使用激光器和光电倍增管作为检测手段 /span /strong ，而 span style=" text-indent: 2em color: rgb(0, 112, 192) " strong 后者使用ICP质谱技术 /strong /span 作为检测手段。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 近日，浙江大学医学院欧阳宏伟教授课题组在 strong 《Applied Materials Today》在线发表最新论文“Single-cell mass cytometry reveals in vivo immunological response to surgical biomaterials” /strong 。该研究运用 strong 单细胞质谱流式技术 /strong 分析了两种生物材料(聚丙烯补片和丝素补片)在软组织修复过程中的系统性免疫反应特征，比较了两组外周血免疫细胞的比例以及与免疫细胞中激活、迁移相关的功能标志物表达情况，显示丝素补片具有更好的生物相容性。 /p p style=" text-align: justify " 　　生物材料已经在临床被广泛应用，如腹部疝修复使用的补片，软骨修复中使用的支架，肌腱重建中使用的人工韧带等等。然而， strong 生物材料植入体内后会引起体内的免疫应答，严重的免疫反应(异物反应)会造成一系列的并发症：疼痛、感染、组织粘连等，使得治疗失败甚至需要二次手术。 /strong 2016年，业界某巨头公司大量疝修复补片产品因考虑到复发率或再次手术率高等因素被其安全团队召回1。因此， strong 生物材料的临床前安全评估和临床监测非常重要 /strong 。但是，目前检测生物材料的检测方法大多是体外实验不能精准模拟体内复杂的环境 或是聚焦于局部免疫反应而缺乏对全身系统性免疫的评估，因此未能准确评估生物材料的安全性，不能有效预测和规避不良后果。 /p p style=" text-align: justify " 　　 strong 单细胞质谱流式是一项通过使用金属标记抗体，质谱检测信号的新型流式技术，近年来已经被广泛应用于细胞分化、肿瘤检测、药物筛选等多个研究领域。 /strong 它具有高通量、高分辨率的特点：在单细胞水平上可同时分析超过40种细胞标志物，可同时检测上百个通道，可用来分析评估复杂细胞系统中细胞亚群和功能标志物表达情况。因此，单细胞质谱流式技术可以作为深度解析生物材料体内免疫应答的“利器”。 /p p style=" text-align: justify " 　　该研究以外科常见疝修复手术应用的聚丙烯补片和丝素补片为例，首次利用单细胞质谱流式技术评估了这两种生物材料在小鼠腹部缺损模型中引起的系统免疫反应(图1)。结果显示：与聚丙烯补片相比，丝素补片组的外周血中巨噬细胞，单核细胞，中性粒细胞，CD4+ T 细胞，以及CD8+ T 细胞比例更低，免疫细胞比例更接近于对照组 并且免疫细胞激活、迁移相关的功能性标志物 (CD115, CD27, and CD62L)也相对低表达。同时，丝素补片组材料植入处的免疫细胞(巨噬细胞和中性粒细胞)浸润要显著性低于聚丙烯补片组。此外，作者还发现丝素补片组具有较轻的组织粘连和更好的组织修复效果(图2)。这表明系统性免疫应答特征(免疫细胞比例和功能标志物表达情况)可以体现生物材料在体内异物反应的程度，或可作为预测并发症发生和组织修复情况的依据。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 340px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/8feb1c54-1ba4-4f70-8807-a919671ac9d8.jpg" title=" 1.jpg" alt=" 1.jpg" width=" 600" height=" 340" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " 　　图1：运用单细胞质谱流式技术解析材料植入体内后的系统性免疫反应 /p p style=" text-align: justify " 　　 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/0a7c1d2f-8d2f-4680-8a85-2d2d5bacfee4.jpg" title=" 2.jpg" alt=" 2.jpg" / /p p style=" text-align: center " 图2：两种生物材料植入后的组织粘连和组织修复情况 /p p style=" text-align: justify " 　　该研究提出了基于单细胞质谱流式的一种高通量高分辨率的生物材料体内系统性免疫应答评估策略，这可为生物材料的临床前安全评估和临床应用监测提供有效手段，为进一步筛选和开发免疫调控性生物材料提供新思路和新方法。 /p p style=" text-align: justify " 　　植入性医疗器械的快速发展促进人们对医疗服务的要求日益提高，生物材料的安全问题越来越受到重视。生物材料的成分、磨损、代谢、降解产物等带来的风险可以通过不断发展的新型高通量检测技术进行评估。 /p p style=" text-align: justify " 　　近期浙江大学医学院欧阳宏伟教授实验室基于单细胞质谱流式技术，结合HLLA-seq及生物材料-基因作用图谱策略(NGA)，将从单细胞水平、整个机体水平建立起一套完善、系统的评价系统，为生物材料的临床使用保驾护航。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 567px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201906/uepic/c95b96ea-40c8-4450-a6cf-4bffc9db1862.jpg" title=" 3.jpg" alt=" 3.jpg" width=" 600" height=" 567" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: justify " 　　 /p p style=" font-size: inherit font-weight: normal padding: 0px margin: 0px font-family: & #39 Microsoft YaHei& #39 line-height: 40px white-space: normal text-align: center background-color: rgb(255, 255, 255) " a href=" https://www.instrument.com.cn/netshow/SH104342/C325581.htm" target=" _blank" style=" color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong Helios& reg 质谱流式细胞仪系统 /strong /span /a /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " Helios& #8482 质谱流式系统具有高效简洁的工作流程以及广泛的适用性，通过独创的金属标签抗体技术，标记细胞表面及胞内蛋白，实现单细胞的多参数检测，可以对单细胞进行全面的表型、信号通路及功能研究。 /p p br/ /p

质谱流式细胞术可在数百万个单细胞中同时采样并量化分析50多种蛋白质或蛋白质修饰水平。应用质谱流式可从全新的角度判别细胞种类、细胞表型，评估其功能状态和异质性以研究疾病发生和发展的机制。然而，作为一种新兴单细胞蛋白组方法，质谱流式因其技术特性也存有一些功能上的不足之处。目前该技术最大的瓶颈在于其灵敏度的极限，在单细胞中的每种抗原表位需要累积上百个金属标签标记的抗体才可在质谱流式分析中检测到特异性信号。灵敏度不足的问题，使得一些在人类疾病中至关重要的低丰度蛋白，如大量的转录因子、一部分细胞表面受体蛋白以及某些与特定功能相关的磷酸化位点难以被准确分析。在对小体积细胞，例如免疫细胞和微生物细胞的研究中，质谱流式在技术上则更具挑战性。而之前在多个不同实验室进行的放大质谱流式信号的尝试由于信噪比低、放大效果不强、可控性差等问题并没有获得显著效果。如何在不影响信噪比的情况下对质谱流式进行信号放大是一直以来亟待解决的问题。2024年7月29日，哈佛大学Wyss研究所尹鹏教授团队（伦小康博士、盛宽玮博士为共同第一作者）等在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Signal amplification by cyclic extension enables high-sensitivity single-cell mass cytometry 的研究论文。该研究开发了一种名为循环延伸扩增（Amplification by Cyclic Extension，ACE）的信号放大技术，通过设计DNA动态探针实现对质谱流式技术（mass cytometry）中抗原表位金属同位素标记信号的高效放大，解决了质谱流式分析中的灵敏度瓶颈问题。ACE技术可同时放大30种以上蛋白表位信号。应用在悬浮质谱流式和成像质谱流式（imaging mass cytometry或IMC）中，ACE皆可大幅提升低丰度蛋白信号检测的灵敏度及准确性。在这项最新研究中，研究团队运用独特的DNA动态探针设计方法，创立了单链DNA循环延伸信号放大（Amplification by Cyclic Primer Extension，ACE）技术，实现了同时对多通道抗原表位信号的高信噪比高效放大，并应用于质谱流式技术上以大幅提高其灵敏度。ACE利用超短DNA序列作为起始探针（initiator）标记抗体并对胞内靶蛋白进行染色（图1）。在低温条件下，反应体系内的延伸探针（extender，含有两个相邻的起始探针互补序列）可互补结合在起始探针上，体系中的DNA聚合酶应用延伸探针为模版延长起始探针。提高体系温度后，延伸探针从延长过起始探针上解离，此时一个反应循环结束。当体系温度再次降低时，下一个延伸循环开始，起始探针进一步被延长。通过对起始探针序列的温控循环延伸，ACE可快速复制金属检测探针（detector）结合位点，引入检测探针后，单个抗体所携带的金属同位素标记物数量大幅提升。为提升DNA结构的热稳定性，该团队又结合3-cyanovinylcarbazole phosphoramidite (CNVK) 紫外交联方法将携带金属标记的检测探针共价结合在延伸后的起始探针上，使得检测探针在质谱流式仪内高温环境中不易解离（图1）。线型ACE（linear ACE）信号放大技术可平均提升信号13倍（图2）。但当分析极低丰度蛋白的单细胞信号或微生物单细胞蛋白信号需要更强信号时，可在线型ACE基础上应用分支ACE（branching ACE）以达到对抗原信号的500倍以上的放大。为配合质谱流式多维度蛋白表位分析特点，该团队通过设计正交DNA探针序列实现了对33种蛋白表位互不干扰的同时信号放大。图1. ACE技术流程示意图图2. 应用ACE逐级提高质谱流式抗原表位信号ACE技术建立后，研究团队首先将其应用与分析上皮-间质转化（EMT）和间质-上皮转化（MET）过程中的分子调控机制。通过对32个上皮和间质标记物、信号分子和转录因子的单细胞分析，将单个小鼠乳腺癌细胞从上皮状态到间质状态再回到上皮状态的转化过程进行时间重构，精准的展示细胞如何通过调节关键转录因子如Zeb-1和Snail/Slug的数量变化来驱动了EMT和MET分子程序。在第二个应用中，团队聚焦于单个T细胞胞内磷酸化信号网络。由于T细胞体积较小，在单细胞分辨率下每种磷酸化位点的表位数量有限，所以此前针对单个T细胞信号网络反应异质性的研究一直较难开展。团队应用ACE同时放大T细胞受体（TCR）信号网络内的30种关键磷酸化位点（图3），研究样本中T细胞在受到外部信号刺激时的胞内磷酸化网络特异性激活状态是如何分别调控介导应激、炎症、细胞增殖等反应的。应用该技术，团队分析了“组织损伤诱导T细胞麻痹”的分子信号机理，利用从手术患者获取的“术后引流液”（POF）样本刺激T细胞，并捕捉TCR信号网络的动态特征，揭示出导致部分CD4+ T细胞停止分裂并引起免疫抑制的胞内信号网络变化。图3. 应用ACE技术分析T细胞胞内信号网络动态变化最后，团队使用ACE结合成像质谱流式（Imaging mass cytometry，IMC）对人体肾脏组织切片中的蛋白表位进行高维度空间分析。通过检查从一名多囊肾病患者获得的肾皮质切片并对经信号放大后的20种肾脏标记物的空间表位分析，团队发现了存在于肾皮质部位细胞和组织结构的新病理特征：与组织修复相关的干细胞标记物Nestin在肾小球中的不均匀表达可能意味着组织的不同部位可能同时经历不同的病理阶段。ACE质谱流式信号放大技术是单细胞蛋白分析中一项革命性的突破。这套独特的生物技术在生物医学的各个层面都有着广泛的应用前景，尤其可将单细胞高维蛋白表位定量分析扩展到之前由于技术限制而从未涉及到的低丰度蛋白组。另外，结合成像质谱流式IMC，可在未来实现基于ACE信号放大的超分辨率空间蛋白组学成像分析。

随着生命科学的不断发展及对单细胞分析手段越来越高的需求，传统的荧光流式细胞技术已不能满足科学家们的需要。质谱流式技术(Mass Cytometry)因此应运而生。它通过对传统流式技术和质谱技术的整合，是目前单细胞多参数分析中最先进的技术之一，也有越来越多国内的科研、临床及药物研发的工作者们将他们敏锐的目光投向了这一先进的技术，研究方向涉及肿瘤、免疫、转化医学、干细胞、药理研究等诸多领域。尤其是2020年新冠疫情爆发，质谱流式细胞技术在这一领域更是提供了良好的支持。这里是2020年质谱流式平台部分令人印象深刻的文章。　　图1 质谱流式常见的实验流程　　新冠肺炎研究　　2020年的新冠疫情可以说是年度最大的黑天鹅，给全世界的各个行业都带来了巨大的冲击。而科学工作者和医务工作者们也为了应对这一突发状况做出了巨大努力。在研究过程中，研究人员逐渐发现轻度、中度和重度患者的免疫系统存在显著差异。在这方面，北京佑安医院是比较早的展开研究的单位之一。张玉林等人使用质谱流式成像技术，分析了两位新冠患者肺组织切片的免疫细胞组成。该结果证明，肺组织有CD4 T细胞、CD8 T细胞、NK细胞和巨噬细胞浸润，并且CD45RA T细胞异常是新冠肺炎的特征之一。随后，欧阳雅博和王文敬(图2)等人分别发表文章，分析了不同病程病人的基因表达水平和T细胞占比。测序结果显示，重症病人的T细胞数量下降，其激活和分化的基因表达水平下调。通过质谱流式分析PBMC样本，不同病程的患者的免疫细胞组成同样差异巨大。紧接着，时红波等人又在单细胞蛋白和细胞因子两个层面分析了新的病例，除了进一步验证了上述细胞亚群比例下降之外，还发现IL-2等细胞因子的浓度降低。而且，免疫细胞比例和细胞因子浓度均可用于预测患者病情的恶化程度。这些研究为我们了解新冠肺炎的进展和诊断提供了巨大支持。　　图2 质谱流式分析不同病程病人的PBMC中免疫细胞占比情况。Wang et al.　　加利福尼亚大学的Neidleman等人使用含38个靶点的质谱流式panel分析了9名新冠治愈者的样本，证明了恢复期患者的T细胞特异性激活，其中的CD4 T细胞和CD8 T细胞分别主要由Tcm和Temra细胞组成。这些细胞表达CD127(IL-7受体)，可以稳定增殖，并且持续2个月以上。德国的Schulte-Schrepping等人则联合应用单细胞转录组和质谱流式，在转录组和蛋白水平分别分析了100例临床样本，该研究的内容倾向于髓系细胞。结果显示重度患者的骨髓紧急生成，表现为免疫抑制的前中性粒细胞、幼稚中性粒细胞、功能障碍的成熟中性粒细胞和抑制性HLA-DRto单核细胞大量出现。路易斯维尔大学的Morrissey等人同样重点研究了髓系细胞，其方向则是中性粒细胞对于炎症和病程中出现的凝血问题。结果显示重症患者样本中存在低密度炎症中性粒细胞亚群，并在临床上与D-二聚体和全身性IL-6和TNF-α水平相关，可导致新冠相关的血栓等凝血疾病的出现。　　免疫响应图谱与疾病治疗　　对疾病本身的分析固然重要，但是当务之急是疾病治疗。合理的治疗方案则离不开对患者的免疫系统的持续检测，这里包括了体液免疫和细胞免疫两个部分(图3) 。　　图3 影响免疫反应的各种细胞类型　　Rodriguez等人在治疗过程中，纵向监测了39名新冠患者的免疫反应，绘制了康复过程中的免疫轨迹。结果发现，IFNγ-嗜酸性粒细胞在肺部过度炎症反应之前激活，并随着病情改变了细胞的凝集作用。苏黎世大学的Chevrier等人利用质谱流式和血清蛋白质组学，分析了患者们的先天免疫状态。CD169+ 单核细胞迅速扩增，全身性CCL3和CCL4水平升高等等的一系列数据，支持了病理性先天免疫可能是新冠感染的关键机制，以及重度新冠肺炎需要抗炎干预措施。这一结果揭示了炎症反应在新冠肺炎中的作用，进而出现了一些与之相关的研究。苏黎世大学医院的Adamo等人继续了CD8 T细胞和相关炎症的研究。通过分析发现，不论是绝对数量还是相对数量，外周血CD8 T细胞均下降明显，而且T细胞凋亡和向炎症组织迁移是外周血T细胞减少的原因。并且，IL-7(一种T细胞的生长因子)水平升高，这一结果表明了患者全身T细胞减少和T细胞增殖增加的迹象。质谱流式结果的拟时分析同样显示，重度新冠患者存在广泛的T细胞减少现象，以及随后的T细胞增殖增加的特征。这些结果表明，CD8 T细胞减少可能是重度新冠的标志，并进一步定义了破坏性的炎症环境，以及临床应针对性的及时抗炎，以提高治疗效果。斯坦福大学的Arunachalam等人报告了一种系统生物学方法，用于评估轻至重度疾病的新冠患者的免疫状况。该团队使用用于蛋白质磷酸化特异性表位的胞内标志物的质谱流式磷酸蛋白panel，对PBMC中的免疫细胞表型进行了分型。结果发现，在患者的PBMC中，骨髓细胞HLA-DR和促炎细胞因子表达降低，浆细胞样DCs mTOR信号和IFN-α的产生受损。相反，血浆中炎症介质(包括EN-RAGE、TNFSF14和抑癌蛋白M)的水平升高，这与疾病的严重程度和人血浆中细菌含量的增加有关。最值得注意的是，在所有感染的个体中，成浆细胞和效应CD8+ T细胞的频率增加，并且CD8+效应T细胞的反应时间延长。在新冠肺炎的治疗方面，质谱流式同样起到了重要的作用。冷子宽等人利用间充质干细胞对新冠患者进行治疗，并逆转了重症病人的细胞因子风暴。利用质谱流式检测，可以看到治疗后的患者免疫细胞组成恢复正常。　　疫苗开发　　根据前期的对于新冠病情的分析不难看出，CD8 T细胞对于消除和保护病毒感染至关重要。Schulien等人利用MHC-I四聚体分析定义了新冠肺炎康复期患者的特异性CD8 T细胞的抗原表位，设计利用抗原多肽刺激T细胞，使其被激活为新冠病毒特异性T细胞。新激活的T细胞与原有的T细胞的功能类似，可以对患者起到保护作用。加州大学旧金山分校的Neidleman等人则利用质谱流式确定了疫苗的潜在目标。他们利用定制的离体模型，使用38个标记的抗体panel定义了康复期新冠患者的SARS-CoV-2特异性T细胞表型。该研究确定了针对SARS-CoV-2的有效免疫力的共同特征，并建议诱导类似的针对该病毒的长寿命CD4+和CD8+ T细胞应答作为疫苗接种策略，并评估疫苗诱导的SARS-CoV-2特异性T细胞应答的特征。弗吉尼亚梅森医学中心的DeGottardi等人利用质谱流式研究了黄热病病毒的疫苗。他们分析了cCXCR5 T细胞的起源和发育(cCXCR5可用作TFH细胞活性的生物标志物)。利用这一方法来评估疫苗的安全性。通过对比疫苗接种前后病毒特异性T细胞的活化情况，证明了该疫苗仅引起了病毒特异性T细胞数量的增加，其他类型的细胞不受影响，进而证明了疫苗的安全性。法国疫苗研究所的Palgen等人，利用质谱流式评估了疫苗的接种时间间隔与免疫保护之间的关系。他们利用35个标记的抗体panel，分析了安卡拉病毒疫苗的短期和长期接种方案所产生的影响。间隔2周进行两次皮下注射会导致免疫反应的二级反应减弱和类似的先天髓系反应。相反，间隔2个月可以改善抗体反应的质量，并涉及更多的活化成熟先天细胞。文章揭示了中性粒细胞的新特征，并发现了相关的嗜酸性粒细胞在疫苗响应中的作用，从而确定了初次免疫-加强接种过程中先天性和适应性免疫的机制。在疫苗上市后的安全评价上，质谱流式同样发挥着作用。2009年流感大流行，有证据表明接种疫苗导致了1型嗜睡症(NT1)的发病。隆德大学的Lind等人利用质谱流式分析了GSK公司的Pandemrix® 导致的NT1患者的免疫学特征。结果显示，受影响患者中特异性T细胞亚群明显减少。这项研究标志着使用单细胞分析来解释疾病发病机理和免疫过程的新方法的可能性，并证实了进一步研究CD8+ T细胞以用于未来潜在疗法的观察。马萨诸塞州的Reeves等人，针对寇热(Q-fever，一种由贝纳立克次体(Cb)引起的类流感疾病)，在小鼠模型上展开了研究。研究人员利用质谱流式平台，使用200μL的样本分析了疫苗接种后，循环免疫细胞群的变化(图4)，证明疫苗接种10天内即起到了保护作用，并至少持续到了接种后35天。这项研究完善了对Cb疫苗接种的综合免疫反应的理解，确定了关键免疫调节蛋白的新作用，并为评估Cb候选疫苗提供了信息，同时使反应原性降至最低。　　图4 评估接种Cb疫苗后关键标志物的表达 Reeves et al.　　肿瘤研究与治疗　　免疫疗法是目前癌症疫苗和治疗最引人注目的领域之一，而质谱流式具有识别新抗原特异性T细胞的独特能力，因而在区分疫苗特异性激活的免疫细胞方面脱颖而出。加利福尼亚大学旧金山分校的Mueller等人报告的一项针对弥散性中线神经胶质瘤(DMG，一种致命的小儿脑癌)的临床研究中，研究人员评估了含有特定H3突变的DMG患者中，针对该突变的疫苗的安全性、免疫反应性和有效性。该疫苗每三个月进行一次免疫监测和成像，并使用质谱流式评估PBMC中的免疫反应。该小组利用MHC Dextramer® (图5)和质谱流式技术来分析多个免疫亚群，以更好地探索疫苗触发的抗原反应性CD8+ T细胞与延长的中位OS之间的关联。结果发现，H3反应性CD8+T细胞扩增的患者的中位OS为16.1个月，而相应患者的中位OS为9.8个月。该疫苗的接种耐受性良好。与无应答者相比，H3特异性CD8+免疫应答的患者OS延长。而实验本身则证明了对于细胞表面，细胞质，细胞核等免疫监测的重要性。这项研究验证了质谱流式技术对基于CD8+ T细胞的免疫疗法进行高维免疫监测的能力。　　弗雷德哈钦森癌症研究中心的Li等人通过CyTOF技术结合MHC四聚体来研究免疫检查点治疗的小鼠模型，以便更多地了解免疫检查点抑制剂如何影响肿瘤特异性T细胞，以及这些细胞为何未能成功攻击肿瘤细胞。研究人员发现，活化的肿瘤特异性CD8 +肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在免疫治疗后大量扩增，但是并未导致肿瘤消退。结合单细胞转录组测序的结果，TIL扩增与表型变化相关，包括耗竭marker富集、CD39表达和靶向肿瘤细胞的TCR激活等等。这项工作为研究肿瘤中的新抗原提供了一个新模型，并重新探讨了新抗原特异性T细胞在免疫治疗中的作用。　　图5 金属标记的MHC四聚体示意图，用于鉴定抗原特异性T细胞　　由于篇幅有限，这里仅仅列举了部分研究领域相关的论文，但是令人印象深刻的论文远不止我们所提到的这些。质谱流式可以在单个样本的单细胞水平检测大量(≧50个)不同的蛋白靶标，从而使其能够高效、快速、可靠地获得全面的免疫图像。指示疾病的进展或改善情况。

近日，浙江省重点研发计划—“尖兵”研发攻关计划项目“流式质谱细胞分析技术”启动会暨课题实施方案研讨会在谱育科技顺利召开，来自项目组的五个课题承担单位汇报人和专家组成员参加了会议。大会以线上、线下相结合的形式进行，邀请到的专家有浙江大学化学系潘远江教授、浙江大学公共医学院院长陈光弟教授、清华大学张新荣教授、浙江大学控制科学与工程学院周建光教授。项目组汇报谱育科技承担课题质谱流式细胞分析仪的研制工作，是整个项目的重头戏。谱育科技 副总经理刘立鹏，对大家的到来表示欢迎，同时也感谢大家对谱育科技的信任与支持。谱育科技 副总经理俞晓峰针对谱育科技承担的质谱流式细胞分析仪的研制任务，着重从研究内容与技术路线、研究目标等方面进行了汇报。浙江省疾病预防控制中心理化毒理所汤鋆副所长和谱育科技李锐经理对螯合金属聚合物标记试剂进行汇报。浙江大学附属第一医院特聘研究员盛剑鹏对国产质谱流式细胞分析仪在肿瘤患者免疫状态变化研究中的应用进行汇报。浙江大学附属邵逸夫医院高级工程师王燕忠对承担课题：国产质谱流式细胞分析仪在检测和评估人群免疫状态中的应用研究方案做汇报。西湖实验室副研究员/西湖欧米研发总监许路昂对国产质谱流式细胞分析仪在辅助白血病治疗的应用研究方案做汇报。专家组意见 专家组认真听取了项目组关于实施方案的汇报，建议针对知识产权情况，重点加强离子传输、探针设计开发等创新，聚焦亮点成果的产出，进一步细化实施方案，加强各课题间的联系。并进行充分讨论，一致认为：1该项目所提交的论证材料齐全，符合论证要求；2该项目目标明确，实施方案和技术路线可行，任务清晰合理，年度计划具体、可操作性强，符合项目任务书要求；3预期成果与考核指标基本明确，可考核性强；同意通过实施方案论证。尖兵计划

p style=" margin: 0px 0px 14px background: white text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " strong 仪器信息网讯 /strong & nbsp span style=" text-indent: 2em " 近日，北京大学白玉副教授团队在常压质谱免疫分析平台工作的基础上，设计并拓展质谱探针，利用基于狄恩流的微流控芯片实现单细胞排列，结合纳升电喷雾-高分辨质谱（nanoESI-HRMS），搭建了多维度有机质谱流式细胞分析平台。 /span /p p style=" margin: 0px 0px 14px background: white text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 331px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/e034a7c1-bb38-4c40-8a79-225f9e1d02e2.jpg" title=" 1.jpg" alt=" 1.jpg" width=" 600" height=" 331" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " 多维度有机质谱流式分析平台 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 该平台能够高通量地对单细胞水平的蛋白质和代谢物等多维度信息进行同时获取。相关成果2020年10月21日在& nbsp Angewandte Chemie International Edition& nbsp 在线发表（Multi-Dimensional Organic Mass Cytometry: Simultaneous Analysis of Proteins and Metabolites on Single Cells，Angew. Chem. Int. Ed.,& nbsp 2020, DOI: 10.1002/anie.202009682）。 strong style=" text-indent: 2em " span style=" text-indent: 2em color: rgb(0, 112, 192) " ( /span span style=" text-indent: 2em color: rgb(0, 112, 192) " a href=" https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202009682" target=" _blank" 点击链接了解论文详情 /a ) /span /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 单细胞中内容物体积少、含量低、种类多、分析窗口有限，使得高灵敏、高信息覆盖度、快速、高通量的单细胞分析面临重大挑战。通过单次测量实现多维度、多参数的单细胞定量信息获取，对于细胞分型、鉴定以及单细胞水平的疾病相关分子机制研究具有重要意义。单细胞测序技术方兴未艾，但针对单细胞中蛋白质和代谢物的分析技术仍非常有限，尤其是大量蛋白质和代谢物的同时分析尚未见报道。荧光流式细胞术可对单细胞中多种蛋白质进行分析，然而光谱带宽重叠问题限制了其同时测定的通道数。以CyTOF为代表的质谱流式细胞仪可实现单细胞中40余种蛋白质的同时定量分析，但其依赖于ICP-MS仪器，且ICP-MS无法提供细胞内源物质结构信息，极大地限制了方法的检测对象；有机质谱的结构鉴定能力强、质量分辨率高，可实现单细胞中小分子代谢物的分析。基于有机质谱建立流式细胞分析新方法，从而获取单细胞中蛋白组、代谢组等多组学信息，在单细胞异质性相关研究具有不可替代的分析优势。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 该工作中设计并合成了一系列基于罗丹明质量标签的质谱探针，对单细胞表面的CA125、CEA、EpCAM、CD24、CD44和CD133等重要的蛋白标志物进行标记；标记的细胞利用基于迪恩流的微芯片实现单细胞排列，并利用nanoESI-HRMS实现单细胞检测。离子化过程中可实现质量标签的高效解离和细胞内容物的有效释放，从而确保了单细胞中蛋白质和代谢物信息的同时获取。该质谱流式分析平台成功实现了单细胞水平6种目标蛋白质及84种代谢物的同时检测，证实了蛋白质和代谢物在细胞个体间的显著差异性。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 753px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/834f3be8-504e-4692-8549-7d4e4e92ea8e.jpg" title=" 2.jpg" alt=" 2.jpg" width=" 600" height=" 753" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center line-height: 1.75em text-indent: 2em " A2780细胞质谱流式分析结果 /p p style=" line-height: 1.75em text-align: justify text-indent: 2em " 基于该多维度有机质谱流式细胞分析平台所获取的信息，工作首次同时利用蛋白质及代谢物信息作为细胞分型依据，在5种肿瘤细胞的PCA分析中获得了更好的鉴定和分型结果。在利用Ward’s法得到的聚类结果中，相比于利用单一的蛋白质或代谢物信息，使用蛋白质和代谢物的综合信息能够获得更高的分型灵敏度和特异性。单细胞分析方法在干细胞研究、细胞耐药性研究以及癌症治疗等方面具有重要意义，该流式平台还成功实现了肿瘤细胞耐药异质性分析，其结果有望为分子水平的耐药性细胞研究或癌症干细胞研究提供分析依据。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 590px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/6dfdd07e-01d8-40ed-aed8-bd47e0c1d11b.jpg" title=" 3.jpg" alt=" 3.jpg" width=" 600" height=" 590" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " 细胞分型和肿瘤耐药差异性结果图 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 该论文第一作者为15级博士研究生徐姝婷。工作得到国家自然科学基金委和科技部国家重点研发计划和北京市自然科学基金重点项目的资助。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 研究学者： /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 200px height: 250px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/38d36728-c2e0-4fc5-8087-cbb4d275ac50.jpg" title=" 白玉.jpg" alt=" 白玉.jpg" width=" 200" height=" 250" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " 北京大学副教授 白玉 /p p style=" line-height: 1.75em " 研究领域与研究兴趣： /p p style=" line-height: 1.75em " 　　1.超灵敏质谱分析新方法研究； /p p style=" line-height: 1.75em " 　　2.单细胞质谱分析； /p p style=" line-height: 1.75em " 　　3.新型纳米分离介质在复杂体系分离分析中的应用； /p p style=" line-height: 1.75em " 　　4.常压敞开式质谱离子化技术及其仪器研发； /p p style=" line-height: 1.75em " 　　5.疾病相关的代谢组学研究。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " strong 点击了解白玉课题组网页： /strong a href=" https://www.chem.pku.edu.cn/PAAL/" target=" _blank" https://www.chem.pku.edu.cn/PAAL/ /a /p p br/ /p

Fluidigm新一代质谱流式系统CyTOF® XT™ 于2021年中推出，旨在简化深层细胞图谱研究的设计和工作流程，通过自动化及可重现的工作流程来标准化样本分析，推动加速新疗法的开发研究，以改善人类健康。CyTOF® XT™ 的强大功能对于制药和生物技术行业的临床和转化研究人员及其合作研究机构具有特殊价值。CyTOF® XT™ 新一代质谱流式系统CyTOF XT™ 已经是富鲁达创新质谱流式技术发展的第四代平台，在这个新系统中涵盖创新简化的操作、更高的通量、样品自动化、更快的检测时间和更低的运行成本。Fluidigm总裁兼首席执行官Chris Linthwaite说：“新一代CyTOF® XT™ 系统在通量、自动化、工作效率以及成本方面都有所提升，为通过高维质谱流式技术捕捉人类免疫系统复杂性提供了最可靠并可重复的方法。CyTOF XT是我们屡获殊荣的流式质谱系统家族的最新成员，加入了Helios™ 和Hyperion™ 成像系统。这些平台将帮助研究人员提高对疾病和疗法的科学理解，并对许多领域提供新的见解，例如，包括检查点抑制剂的功能、药物对信号通路的影响、对免疫治疗作出反应的肿瘤微环境生物学以及候选疫苗的疗效。”

p 　　科研人员经常面临一个困境，如何同时达到如下目标：(1)在广泛的网络中获取特定细胞行为尽可能多的信息；(2)采取高针对性的方法，对有限数量的细胞特征进行分析，获得更高的分辨率。目前的流式细胞分析技术和质谱分析技术单独都很难达到以上目标。 /p p 　　如果你有同样的困惑，那先恭喜你，看完下面内容，从此不再纠结。 /p p 　　◆◆ strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 质谱流式档案 /span /strong ◆◆ /p p 　　学名： 质谱流式 /p p 　　洋名：Mass Cytometry /p p 　　昵称：CyTOF /p p 　　自述：相对于其他研究细胞的技术，我算是比较「young」的了，也许你不认识我，但是我爹「质谱技术」、我娘「流式技术」的大名应该如雷贯耳吧?作为他们的优秀结晶， 我是地道的「富二代」，综合了我娘的「单细胞水平研究能力」和我爹的「多指标分辨能力」，正所谓「青出于蓝而胜于蓝」，轻松实现单细胞水平一次检测四十多个蛋白标志物，让你对细胞的研究更具有深度和广度。下图 show 一下我是如何实现如此强大的功能： /p p 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/5a2c7bab-bff0-4a6f-bc19-713ecce8c367.jpg" title=" 11.jpg" alt=" 11.jpg" style=" text-align: center " / /p p 　　采用金属元素标记的抗体来识别细胞表面或内部的抗原，细胞被逐个送入等离子炬中进行离子化，使得标签金属离子释放出来，释放出的金属离子被送入飞行时间检测室中进行分离检测，检测器会精确记录各种离子到达的时间，进而换算出每个细胞中各种金属标签的精确含量。最后，可采用 SPADE、PCA、viSNE 以及 Gemstone 等方法分析数据。 /p p style=" text-indent: 2em " 为啥要研究单细胞水平呢? 因为细胞具有异质性。如同下图，玻璃珠大小均一，似乎都一样。但是一旦赋予色彩，立刻表现出个性化。我们的免疫细胞、干细胞、肿瘤细胞等均具有异质性，通常不能用单一的标志物来区分它们，需要多个标志物同时使用才能将细胞更精细的分群和研究。传统的荧光标记流式细胞分析技术，在各个荧光通道之间通常会有信号的叠加，出现干扰，导致结果不准确。但使用各种金属元素作为标签的质谱流式技术(CyTOF)可以同时检测四十几个蛋白标志物，且无需考虑通道之间的干扰。 /p p 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/408fd1b0-90ef-402f-8dd9-5f77bab61ea0.jpg" title=" 111.jpg" alt=" 111.jpg" style=" text-align: center " / /p p 　　以人外周血白细胞分型为例， 流式细胞术同时标记十色以上分析难度较大，我们一起欣赏下质谱流式标记 27 个蛋白标志物的结果： br/ /p p 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/b6fc56fe-5352-4e1c-a2a7-3d793a0e02be.jpg" title=" 14.jpg" alt=" 14.jpg" style=" text-align: center " / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 27 种抗体染色白细胞，并通过质谱流式技术分析 /span /p p style=" text-indent: 2em " ◆◆ strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 质谱流式应用实例 /span /strong ◆◆ /p p 　　 strong 粒细胞的发育和功能研究 /strong /p p 　　Evrar 等人利用质谱流式(CyTOF)技术，同时检测 40 个表面标志物的表达情况，对小鼠骨髓样本进行了系统的亚群分析，并细致研究了粒细胞分化过程中细胞的表型和功能变化。作者在骨髓中发现了三种不同的中性粒细胞亚群：具有高度增殖活性的前体细胞 preNeu 亚群，未成熟亚群和成熟亚群, 后两者均由 Pre-Neu 定向分化而来。这三种亚群在粒细胞分化过程中占有非常重要的地位。深入研究表明，C/EBPε 转录因子在巨噬细胞祖细胞分化为 preNeu 的过程中起到重要作用，随着 preNeu 的继续分化，细胞增殖的活性会降低，相反细胞迁移及免疫功能则会逐渐增强。作者利用胰腺癌小鼠模型进行了验证，结果表明，相比肿瘤负荷低的小鼠，肿瘤负荷高的小鼠外周血及肿瘤组织中未成熟中性粒细胞浸润的比例更高一些，而成熟中性粒细胞的比例并没有显著差异。 /p p 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/c4d8a3ef-ab09-4d07-8926-e8e771cde005.jpg" title=" 15.jpg" alt=" 15.jpg" style=" text-align: center " / /p p br/ /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 质谱流式结果揭示了具有不同表型特征的增殖性中性粒细胞 /span /p p 　　 strong 细胞因子检测 /strong /p p 　　Baxter等同时标记了 26 个表面标志物和 14 种胞浆细胞因子，通过不同标志物组合分群并研究不同刺激条件下多种细胞因子的表达，以阐明自身免疫疾病中细胞因子表达水平的改变是如何导致自我耐受受损。　　 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/d3fe1793-81ce-435b-94fe-64ec4bbf2350.jpg" title=" 16.jpg" alt=" 16.jpg" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(127, 127, 127) " SLE 疾病患者的 CD14hi 单核细胞中诱导的细胞因子 /span /p p 　　 strong 信号通路研究 /strong /p p 　　Treg 细胞和辅助 Th17 细胞分化不平衡会导致自身免疫疾病或炎症反应的发生。厦门大学周大旺教授团队[5] 应用 CyTOF 质谱流式细胞仪发现了 Hippo 信号通路中转录共激活因子 TAZ 在决定 CD4+ 初始 T 细胞分化为炎症的 Th17 效应细胞并抑制 Treg 调节性细胞分化中发挥着关键作用。深入研究发现，诱导 Th17 细胞分化的两大信号 IL-6 和 TGF-b 下游的转录因子 Smad3 和 STAT3 协同促进 TAZ 基因的转录和表达。TAZ 通过组蛋白乙酰化转移酶 Tip60 降低 Treg 细胞中关键蛋白 Foxp3 乙酰化水平来抑制 Treg 细胞的分化。当缺失 TAZ 或过表达 TEAD1 后，可以大幅提高初始 T 细胞分化为 Treg 细胞的能力。 /p p 　　这项研究阐明了 TAZ 在调节 CD4+ 初始 T 细胞分化为 Th17 细胞和 Treg 细胞的过程中发挥着关键调控作用及其重要机理。该项研究对多种自身免疫性疾病的发病机理提供理论依据，也为早期诊断和治疗慢性炎症性疾病提供可能的分子标志物和治疗靶标。 /p p 　　 img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201811/uepic/b89e5f88-b84a-4cc5-b97f-cde8ef396e94.jpg" title=" 17.jpg" alt=" 17.jpg" style=" text-align: center " / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(127, 127, 127) " Th17 亚组显示出 TAZ 的富集，TAZ 与 Th17 细胞介导的自身免疫疾病相关 /span /p p 　　当然，金属标记可以实现无交叉的多重标记，但是如果抗体种类不能满足需求也是极为尴尬的，Bio-Techne 旗下两大抗体品牌 R& amp D System& reg 和 Novus Biologicals& reg 提供3000+ 种用于质谱流式技术的抗体，满足多种金属标记的需求。 /p

流式细胞术( Flow Cytometry,FCM)是20世纪70年代发展起来的一项利用流式细胞仪完成的细胞分析新技本。目前已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等的基础和临床研究的各个领域。国产流式细胞仪最早研制于20世纪80年代初，但受到当时科技发展和国内生产力的限制，而没有商业化的产品问世。直至2010年左右，国产流式细胞仪厂商开始雨后春笋般成立。并随着技术的积累和发展，国产流式细胞仪不仅从性能上能够和国外仪器比肩，也有着自身的特色和优势。与此同时，国产流式配套试剂的发展也呈现一片火热的局面。为帮助广大实验室用户及时了解国产流式细胞仪前沿技术进展、创新产品与解决方案，仪器信息网特别邀请宸安生物CEO王宇翀博士为我们分享国产质谱流式技术发展的那些事儿！ 本文嘉宾：王宇翀 博士 宸安生物CEO2012年在英国创业从事AI药物筛选系统开发，拥有多年质谱组学研究经历；2016年创立宸安生物，领导公司科研项目和学术团队建设，并负责公司战略发展核心规划；荣获上海市高层次人才、杭州市海外高层次人才等荣誉；英国质谱协会，英国皇家化学学会，美国化学学会会员；剑桥大学系统生物学博士；浙江大学竺可桢学院生物工程本科。仪器信息网：贵司目前主推的流式细胞产品是什么？请您谈谈该产品的技术特点，与同类型进口品牌相比核心竞争优势如何？王宇翀博士：上海宸安生物科技有限公司目前主推的流式细胞产品是我司自主研发的单细胞流式质谱系统Starion星瀚®和Lunarion宵晖TM，涵盖了从试剂到设备再到数据分析软件的单细胞分析完整解决方案。该系统基本技术原理如下：流式质谱技术采用金属标记的抗体识别细胞表面或胞内的抗原，标记后的细胞经雾化后进入电感耦合等离子体矩管中进行离子化，离子云被传输至飞行时间质量分析器中，检测器依次记录各种金属离子到达的时间，检测出不同标签的离子信号峰，最终确定细胞表面和胞内各标签对应检测物的含量。检测产生的高维数据通过归一化、聚类和降维算法进行处理，结果可以反映基于靶蛋白丰度的各种细胞群体的表型和功能。对待检测样本的单细胞水平进行更深度的分子机制解析，挖掘分析潜在的细胞免疫分型以及细胞内信号传导通路，从而为生命科学研究和临床精准诊断提供参考。与同类型进口品牌相比，我司的核心竞争优势主要体现在以下两点：（1）性能更加优越，具体表现为：分辨率方面，宸安生物的产品可以达到800以上，确保了各通道之间无干扰；灵敏度方面，宸安生物的产品能达到5.0*105 cps (1 ppb Tb 159)，显著高于国际同类型产品；检测器采样率方面，我司产品为2 Gb/s, 14 Bit，具有更强的采集能力，能够实现更好的信号保真度以及动态范围。（2）宸安生物的Starion星瀚®作为国内第一台单细胞流式质谱仪，预计将于今年上半年获得我国医疗器械Ⅱ类注册证，领先于进口品牌实现临床水平的稳定性和易用性，检测结果与荧光流式数据高度一致，率先实现该类型先进平台的临床化。仪器信息网：请介绍贵公司流式细胞产品研发历程中里程碑事件。王宇翀博士：2018年上半年，宸安生物完成了单细胞流式质谱系统原型机组装并开始调试；2019年中，完成了配套试剂的研发测试；2020年底，单细胞流式质谱设备原型机性能达到设计指标，进入产品化阶段；2021年初，首台单细胞流式质谱系统投放至武汉同济医院；2021年10月，在中国免疫学大会上，宸安生物正式发布了Starion星瀚®流式质谱系统；2022年底，宸安生物发布了全新一代流式质谱桌面级系统Lunarion宵晖TM，将强大的功能凝聚在更小的机箱中，实现了流式质谱产品的小型化、桌面化。其中，Lunarion宵晖TM入选了仪器信息网“流式细胞新产品2022年盘点”，代表了流式细胞产品领域高性能国产产品的强势崛起。仪器信息网：贵公司流式细胞仪相关产品主要应用哪些领域的哪些实验环节？满足了哪些用户的痛点需求？王宇翀博士：流式质谱作为新一代细胞流式技术，通过质谱系统对质量标签进行定量，从物理水平解决了荧光素带来的光谱重叠问题，实现流式分析技术的代际提升，不但通道数量大幅提升且互不干扰，其产生的数据也更加稳定准确，特别是对检测指标数量要求高的复杂单细胞分析。流式质谱技术可以应用于：免疫分型、稀有细胞亚群鉴定、生物标志物发现、患者分层、疗效预测、疾病进展监测、T细胞抗原筛选及疫苗研发等多领域。案例一：在血液病系统疾病诊断领域，宸安生物联合了国内多家三甲医院、科研机构，开发了基于流式质谱的白血病初筛方案，是世界首个白血病淋巴瘤流式质谱诊断标准化方案。流式质谱技术能节省大量操作及试剂成本，通过“一管法”完成血液系统疾病诊断（＞40指标），大幅提升了医技人员的工作效率，降低了数据分析难度，减少了试剂的消耗，体现出流式质谱技术在样本处理、样本检测、数据库建立、基于算法的结果判定等多方面发挥的优势。案例二：宸安生物参与了两项CAR-T细胞治疗相关的临床试验，完成了超过200例样本的检测，每个样本检测42个指标，能够完成细胞治疗患者免疫系统重建的动态监控、CAR-T细胞在体内的数量和功能监测、CAR-T细胞治疗预后良好患者的动态分层。该项目结果也可用于前瞻性的细胞疗法患者筛选。对免疫系统的分析亟需更强大的诊断工具，流式质谱是唯一能够满足上述数据采集通量的临床级诊断技术。仪器信息网：请评价下光谱流式、流式质谱、成像流式、流式荧光技术等不同流式技术检测应用方法的特点和优劣势？未来流式技术发展趋势又是怎样的？王宇翀博士：流式荧光技术：是基于编码微球和流式技术的一种临床应用型的高通量发光检测技术。相较于传统化学发光法，流式荧光技术能够支持多指标检测，具有通量高、速度快、操作简便等特点，但存在荧光标签的串色问题、受限于稀有荧光素的供应。光谱流式：每个荧光染料的发射光谱在定义的波长范围内被一组检测器所捕获，这样每个荧光染料的流式荧光光谱都可以被识别、记录其光谱特征，并在多色实验中充分使用。流式细胞仪的检测器可以检测到每个细胞或颗粒的散射光信息和多个荧光信号，最终分析细胞或颗粒上的信息。光谱流式通过光谱拆分技术部分解决了荧光补偿问题，但需要难度较大的配色方案，试剂成本高，通道数量较流式质谱相比较少。流式质谱：流式质谱是结合传统流式和质谱两个平台的技术，能够同时获得单个细胞的多种参数。流式质谱作为定量手段的优势在于其高分辨率，并且克服了传统流式荧光发射基团光谱重叠的问题。流式质谱仪可提供过百个检测通道，可以同时对更多的细胞特征进行分析。通过标记稳定的金属标签，流式质谱仪可以在不同的通道生成信号，识别不同靶向蛋白的标记，并且各参数之间几乎没有重叠。相较于传统流式，流式质谱是采用金属元素对抗体进行标记，因此通道数量会受限于金属标签的供应；另一方面，受采样速度的影响，流式质谱对样本的处理速度相较于传统流式而言较慢。成像流式：成像流式的特点是在传统流式细胞仪的基础上增加了高速明场相机，可采集经过流动室的待测细胞的明场图像，除了得到常规的流式数据外还可验证细胞群是否是单细胞，通过细胞成像结果可以更好地显示出各个亚群细胞的形态特征。优势在于无需更改现有流式实验方案或牺牲样本通量，一次实验即可同时得到流式数据和成像结果。成像功能的缺点在于高速液流状态下细胞的状态和表型可能出现变化，另外目前成像的分辨率和灵敏度还待进一步提升，从而实现更准确的定量分析。流式技术作为一种细胞定量分析和分选技术，未来在以下几个方面可能有较好的发展趋势和发展前景：加强流式细胞仪与前处理设备的联机运作，形成流式的自动化流水线，大大提高临床的检测效率；人工智能的参与促进分析软件不断进步，并且能够显著提高数据存储与管理能力；仪器设计趋于小型化，能够降低试剂消耗，提高检测速度，并且更利于仪器普及至下沉市场。仪器信息网：国产流式企业在核心零部件、试剂耗材、自动化样本处理、技术人才等产业链上下游面临的市场机遇与挑战主要是哪些？王宇翀博士：对性能要求不高的流式分析和流式分选领域我国已基本实现自研自产，但对于高性能的设备，其核心零部件主要还是进口垄断，这也成为制约我国医疗设备、科学仪器发展的重要原因。目前已有越来越多的国内厂商、研究所参与到核心零部件的研发、制造当中，在价格上相对更为低廉、在服务支持上更为完善，但在质量上要达到和国际厂商同水平的精度标准还有较大的发展空间。流式企业的上游主要是抗体原料、荧光试剂、微球和芯片等，供应商技术壁垒较高，科研试剂目前还是较多依赖进口，目前国际巨头对这部分核心原料垄断程度较高，国内具备自主上游供应能力的厂商较少。流式细胞技术的前处理涉及到抗原或抗体的标记，孵育，清洗、混匀等步骤，为了尽可能地减少人工操作可能产生的错误以及损耗，提高标准化程度，自动化样本处理是未来发展的主要趋势，也是临床检测的刚需，目前已有多家国产厂商在这一领域发力。核心技术人才对国产流式企业来说是发展的基础与保障。国产流式企业核心人才总体来说还是较为稀缺的，但近年来，随着国内的经济发展与国家政策的支持，越来越多的高层次海外人才愿意投身到国产流式技术的发展事业当中。同时，国内流式市场的日益发展，势必也能吸引更多的高水平研发人才。另一方面，企业也要加强对于实验员等基础岗位的规范化培养，形成完善的人才储备机制。仪器信息网：请谈谈过去几年在相对垄断的市场中，国产流式企业是如何破局并发展壮大的？期间有哪些利于国产流式企业发展的政策等有利因素。王宇翀博士：过去几年，国产流式企业的破局主要体现在以下两个方面：（1）试剂的破局：2017年国家药监局出台的《226通告》将一批临床及科研常用试剂由周期长、成本高的三类注册证下放为周期短、成本低的一类备案管理，这一变化使得大量国产厂家涌入流式领域，流式试剂产量大幅提升；（2）设备的破局：在国产流式设备发展初期，有多家国产厂家在低配置的分析流式领域都有不错的表现，相继被国外巨头收购。近年来，也有越来越多的国内厂家发布了自主研发制造的流式设备，体现了国产流式创新的崛起。在国家科技强国战略的指导下，政府对生命科学领域日益重视。2021年 ，由国家工信部联合多部委发布的《“十四五”医药工业发展规划》中提到，“十四五”是医药工业向创新驱动转型、实现高质量发展的关键五年，政府对于生命科学和疾病领域的研究支持不断增强，未来国内科研基础经费的投资仍将保持较快增长，这对于国产流式企业的发展而言是积极的政策信号。仪器信息网：国内流式细胞仪市场已经从导入期进入快速增长期，请介绍当前全球以及国内流式细胞仪市场规模及现状。过去三年最强劲的市场需求来自哪些领域？王宇翀博士：根据Markets & Markets的统计，2021年流式细胞仪全球市场达43亿美元，预计2026年达到63亿美元，复合增长率为8.1%。目前国内流式细胞仪市场约为12亿美元，复合增长率可达30%，可以看出国产流式细胞仪还有很大的增量空间。近几年流式市场需求较为强劲的领域：（1）血液病中的白血病免疫分型：流式质谱技术的出现，为血液病分型提供了完美的解决方案，因为不是通过荧光检测，不存在信号重叠问题，仅需抽取患者少量样本，而分析的准确性显著提升，分析成本大为下降，分析速度显著提高。（2）免疫功能监测：全球新冠疫情的爆发，使得检测试剂采购量呈现爆发式增长。通过外周血分析淋巴细胞亚群来监测细胞免疫和体液免疫功能，全面反映机体当前的免疫功能、状态，对患者而言能够及时观察疗效及检测预，对健康人而言也能帮助全面了解自身免疫状况，及时纠偏，防患于未然。（3）细胞因子检测：在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用日趋重要，流式细胞术较传统方法凸显了多指标联检的优势。仪器信息网：请您谈谈未来中国流式细胞仪、试剂耗材市场的发展前景如何？哪些应用领域会被市场看好？王宇翀博士：如前所述，中国流式细胞仪、试剂耗材市场还有很大的增量空间，发展前景总体是光明的。医疗器械进口替代也日益成为主流趋势，只要国产流式细胞仪能够实现性能稳定、不断拓宽应用场景，再结合原本相较于进口产品成本低廉的优势，将来国内临床主要市场被国产流式细胞仪取代只是时间问题。以下应用领域可能会被市场看好：（1）CAR-T治疗中，流式技术起到了重要的基石作用：在筛选靶点、预测毒性、判断回输物质量、检测MRD、免疫监测、复发机制研究等多个流程当中都发挥着举足轻重的作用。（2）纳米流式技术的出现为推动外泌体在临床疾病诊断和治疗领域的广阔应用提供了坚实的技术基础。（3）聚焦免疫系统相关疾病，在分子生物学水平为临床精准诊断和治疗助力。（4）对于肿瘤患者而言，流式技术能帮助监测肿瘤旁细胞、肿瘤微环境，深度解析细胞信号传导通路，寻找潜在的治疗靶点，探索潜在的生物学效应，提高患者生存率。（5）随着流式技术的不断进步，应用场景的不断拓宽，流式技术日益普及，有望成为临床检验的重要工具。仪器信息网：请分享贵司未来的发展战略规划，是否会有海外市场拓展计划以及融资上市规划？王宇翀博士：宸安生物目前已全面启动商业化，Starion星瀚®单细胞流式质谱系统预计于今年上半年获得医疗器械Ⅱ类注册证，之后将大规模落地临床领域。全新一代流式质谱桌面级系统Lunarion宵晖TM获得注册证后，将进一步拓展下沉市场，在全国临床领域全面铺开。宸安生物未来也打算积极布局国际业务，筹建区域商务中心和区域生产制造基地，进入欧美市场，并辐射新兴经济体和一带一路沿线国家。编辑：刘立东KOL点击参与主题征稿活动↓为帮助广大实验室用户及时了解国产流式细胞仪前沿技术进展、创新产品与解决方案，仪器信息网特此约稿。欢迎投稿，投稿文章将在专栏展示并在仪器信息网相关渠道推广（公众号 3i生仪社 原创首发，如需转载请联系开通白名单），word图文投稿邮箱：liuld@instrument.com.cn，关于征稿内容要求也可邮件咨询或电话联系：13683372576（同微信）

质谱流式简介 流式细胞术Flow Cytometry是最经典的单细胞分析技术，可以对单细胞中的多个参数进行检测，从而对样品进行亚群和功能分析。基于荧光的流式细胞技术到现在已经发展了50多年，是非常成熟的细胞检测技术，目前被广泛应用于生物学的各个研究领域，是各大三甲医院里进行单细胞检测的金标准，尤其是白血病的检测。传统流式技术使用荧光基团对细胞内的各个蛋白质进行检测，所以又被称为荧光流式。然而，由于荧光基团的限制传统流式技术存在明显的技术瓶颈，一是因为目前可用的荧光基团数量有限，最多一般不超过20个，实验室常用的通常12个；二是各荧光基团的发射谱带较宽，相邻谱带重叠严重，导致一次分析可同时检测的通道数量相当受限。当检测通道数量8个时，实验的panel设计和补偿计算就已经开始变得极其复杂，使得多参数检测成为一项极为费时、复杂的技术性工作，对操作者的要求极高，从而大大限制了它的发展。传统流式的检测窗口非常拥挤，难以容下更多的检测通道 进入21世纪后，新的生物学技术层出不穷，研究人员对于造血发生、免疫细胞分化成熟、癌细胞转化、干细胞自我更新和分化等领域的研究不断深入，单细胞异质性的重要性已经成为共识。要想更清晰地了解细胞内部的多种细胞因子的各种变化，对检测通道数量和信号质量就有了更高的要求。传统流式技术在诸如此类的科研领域中已经力有不逮，迫切需要一种更高效、易用、更多参数同时检测的流式细胞技术。质谱流式Mass Cytometry将传统流式技术和质谱技术进行组合创新，使用镧系元素的各个同位素作为金属标签（或者质量标签）替代先前的荧光标签，并使用ICP-TOFMS对金属同位素进行高速、全谱、高分辨的定量分析，彻底解决了传统流式中存在的荧光串色问题，实现了50个参数的同时检测。质谱流式凭借飞行时间质谱超高的分辨率可以完全分离各个金属同位素，相邻通道间的重叠0.3%，因而无需进行计算补偿，大大简化了实验流程。质谱流式凭借其超高的通量、灵敏度以及稳定性等优点，适用于免疫、肿瘤、血液、药物和遗传学等众多研究领域。概括说来，质谱流式的主要技术特点如下： 通道数量极多。理论上超过100个，目前商业可用50个。随着技术进步，更多元素可以用来作为标签，检测通道数会进一步增加。 临近通道间无干扰，无需计算补偿。ICP质谱具有超高的分辨能力，可以完全区分用来标记的各种元素。实验数据表明，相邻通道间的干扰0.3%，基本可以忽略不计，无需计算补偿。这样不仅使实验流程得到简化，也节约了标本和试剂。使用稀土元素作为标签，背景干扰小，信噪比极高。质谱流式使用生命体中不存在的稀土元素作为检测标签，并利用抗原抗体的特异性结合，可以实现超高的检测信噪比。 超高的灵敏度，保证低丰度蛋白的检测。质谱流式兼具质谱仪和聚合物-金属螯合技术双buff。众所周知，质谱仪无与伦比的灵敏度是其能成为分析仪器之王的主要因素之一。理论上，质谱流式可以检测到万分之一的金属标签原子。除此之外，质谱流式使用在聚合物上螯合了1000个左右的金属元素，再与抗体上的巯基结合，相当于将待测蛋白质进行了3个数量级“扩增”，最低可在单细胞内实现几百个稀有蛋白质的检测。 多样化的数据处理方式，实现对样品的深入分析。通道数激增以及质谱流式超快的检测速度使得数据量急剧增大，对数据处理方法提出了更高的要求。目前，各种降维、聚类和可视化方法已被用于从原始数据中提取有用的生物学信息进行可视化显示，常用的分析方法有：SPADE、PCA、viSNE以及Gemstone等。 质谱流式的工作流程质谱流式的历史1959年，美国化学家Rosalyn Yalow（女）和Solomon Berson在检测血浆胰岛素含量的研究中开发出了放射免疫测定技术（Radioimmunoassay, RIA），因其灵敏度高、特异性强、精确度佳以及样品消耗量小，发展迅速，广泛用于蛋白质、酶、多肽激素以及各种药物的测定。1977年， Yalow和另外两位得奖人共享了诺贝尔生理学或医学奖，获奖理由是“for the development of radioimmunoassays of peptide hormones”。尽管放射免疫测定优点众多，然而放射性同位素对人、环境以及生物样品活性的影响难以忽视。此后，又先后基于酶、化学发光、荧光、金属（尤其是稀土元素）及金属化合物，发展出了胶体金、酶联免疫、时间分辨荧光（基于镧系元素螯合物）和化学发光免疫等各种免疫检测技术。2001年7月17日，MDS Sciex（以后的AB Sciex以及现在的Sciex）的科学家Dmitry Bandura（物理学家）, Vladimir Baranov（化学家）, Scott Tanner(质谱学家)和Zoe Quinn提交了专利，提出了一种使用过渡元素标记抗体，并利用抗体和待测样品的免疫结合，最终通过ICP质谱或ICP发射光谱进行检测的方法，由此开启了质谱流式的纪元。请记住前面这三位大神，后面还会提到。无独有偶，第二天（2001年7月18日）清华大学的张新荣教授提交了题为《A novel combination of immunoreaction and ICP-MS as a hyphenated technique for the determination of thyroid-stimulating hormone (TSH) in human serum》的文章，提出了一种使用稀土元素铕（Europium，Eu）作为标签的免疫反应和ICP-QMS组合的新颖技术，用于血液中促甲状腺激素（TSH）的检测。事实上，2001年3月23号，张新荣教授就提交了另外一篇文章《Application of the Biological Conjugate between Antibody and Colloid Au Nanoparticles as Analyte to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry》，并于次年1月1日发表，文章中提出使用胶体金纳米颗粒作为免疫检测的标签，同样使用ICPMS作为检测器。张新荣教授也是位非常令人尊敬的科学家，做了非常多开创性的研究工作，不盲目跟风，喜欢另辟蹊径。我猜张老师手底下应该没有特别强的工程团队，所以尽管有不少成果转化的项目但是都xxx，纯属我瞎猜乱说，张老师勿怪。国内的质谱公司可以多找张老师聊聊，搞点原创性的科研成果转化。话接上文，更具戏剧性的是，前面提到的专利其实早在2000年12月28日就已通过临时申请的方式进行了提交，并于2001年7月17日提交了正式申请。根据美国的专利制度，为了抢占优先权日可以通过临时申请提交简易的专利文本，但同时需要临时申请后的一年内提交正式申请进行替代，此时正式申请的专利享有临时申请的优先权日，同时临时申请的文本内容也会在正式申请公开时作为优先权文件一并公开。所以理论上来说张新荣教授在质谱流式理论的萌芽期是有重要贡献的，只不过研究院校更追求学术文章，对专利的重视程度远不如商业机构。当然，此时专利也好，文章也罢，和目前我们看到的质谱流式还是有一墙之隔的，还没有提及用于单细胞的检测，不过离成为质谱流式也就是临门一脚的事情。这有一定的历史原因，一方面单细胞检测在当时还不是那么热门，各种免疫检测技术想的都是怎么解决放射免疫检测的弊病；另一方面尽管人们意识到了这个技术对于多参数检测的优势，但是奈何20年前市面上没有几家公司在生产ICP-TOFMS，当然20年后的今天也算不上很多。这并不是因为ICP-TOFMS的技术门槛太高，而是因为ICP-TOFMS几乎没有自己的对口应用，因而缺乏市场驱动。加之由于ICP-QMS（四极杆质谱）引入了碰撞反应池技术（这个技术的发明者还是那位大神Scott Tanner）解决了多原子干扰的问题，很大程度上解决了四极杆分辨率不够的问题，所以定量要求高，分辨率要求不太高的应用使用ICP-QMS就可以很好地满足要求了，性价比比较高。而对于分辨率要求很高的时候，还有各种无机磁质谱，如果是要求有比较高的同位素丰度比，还有多接收的磁质谱。基本上，ICP-TOFMS没有用武之地，当时属于比较小众的质谱仪器。那个时候大概只有澳大利亚的GBC公司和美国的LECO公司在生产ICP-TOFMS，大多时候也是用于地质分析领域。2004年10月，前面提到的三位大神以及同样是在MDS Sciex的同事Olga Ornatsky（生物学家）合伙成立了一家叫DVS Sciences公司，公司名字用的就是三人名字的首字母，不得不说外国人的确很喜欢用自己的名字做公司名，跟我们的那些老字号其实很像。Scott Tanner作为团队的老大任CEO/CTO，从老东家Sciex的手里拿到了相关技术的授权后，2005年他们把公司开在了加拿大，开始打磨这台全新的ICP-TOFMS仪器平台（日后的第一代CyTOF）。Scott Tanner是加拿大人，在多伦多的York University拿到物理化学的博士学位后加入MDS Sciex，并一直那里工作了25年。Scott Tanner认为 University of Toronto是一个非常完美的地方，可以助力他们完成CyTOF仪器和试剂的开发。2005年至2011年期间，Scott Tanner先后任职多伦多大学生物工程系和化学系教授。此后，DVS从Genome Canada和Ontario’s Ministry of Research& Innovation等加拿大政府机构拿到了总计1700万美元的资助。2011年，又从Mohr Davidow Ventures, 5AM Ventures以及Roche，Pfizer等商业机构获得了1500万美元的投资。截止到2011年，DVS从外部获得的资金支持再加上7台CyTOF的销售收入差不多有4000万美元。值得一提的是，在第一代CyTOF定型之前，DVS团队先后经历了3代原型机和8代试剂的开发，可以说是非常的坎坷，技术创业之艰辛可见一斑。2009年，加拿大DVS Sciences公司发布了第一个质谱流式平台CyTOF（Cytometry by Time-of-Flight）。很快，CyTOF的用户就开始遍布世界各处 ，除了加拿大的多伦多大学，还有美国NIH、斯坦福大学、日本、中国台湾等研究机构都有装机。Scott Tanner和第一代质谱流式CyTOF第一代质谱流式CyTOF事实上，质谱流式早期的快速发展离不开一个人，那就是斯坦福大学医学院的Garry Nolan教授，这又是一位全面开花的骨灰级大佬，不仅学术做得好，科研转化还贼成功，是Rigel（NASDQ上市公司）, Nodality（医疗诊断技术开发）, BINA（基因组学计算技术，被Roche收购）, Apprise（测序解决方案，被Roche收购）等公司的创始人，IONpath（另一家单细胞质谱成像技术公司，和质谱流式有比较大的渊源，后面会提到）和Akoya的联合创始人，以及多家公司（包括DVS）的董事和顾问。Garry Nolan教授在免疫学研究领域名声斐然，是传统流式技术的大牛。Scott Tanner带着自己的黑科技找上门后，Garry Nolan教授意识到这是一项至少能改变免疫学研究的革命性技术，随后便基于CyTOF对人类的骨髓细胞进行了研究，在单细胞水平同时进行了34个参数的检测，系统性揭示了造血系统免疫信号的传导机制，对人类造血系统中的细胞分化有了更详细的认识。相关研究成果刊登在Science杂志上，一经发表立刻引发了全球同行的巨大兴趣，至今全世界研究者使用CyTOF发表了不计其数的CNS（Cell、Nature、Science）文章。由此，质谱流式在生物医学领域名声大噪，持续保持一年几十台的装机量，仪器单价也从一开始的60万美元到了80万美元。毕竟，谁都明白掌握核心科技就能快人一步，贵一点怕什么。不得不说，Garry Nolan教授是一个极其合格的KOL，不仅让CyTOF声名远扬，还为CyTOF适配了很多开源的生信算法，制定了各种各样试验流程供后来者参考，同时还建立了CyTOF论文专门解答和讨论用户在使用CyTOF过程中遇到的各种疑难杂症，甚至还组织各细分领域的大佬们专门开设了CyTOF的小型课程（油管上有资源），可以说Garry Nolan教授为质谱流式的普及铺好了第三块基石。2013年5月，DVS推出了第二代质谱流式CyTOF2以及新款MaxPar试剂盒。CyTOF 2采用了全新的底盘设计，能同时检测单细胞中最多达120种生物标记物，每秒最多可检测1000个细胞，改进了离子光学设计从而将灵敏度提高了1倍。5种新款MaxPar试剂盒含有开展高维度实验所需的所有必要试剂，提供最多达17种开箱即用的金属螯合抗体，并且能够与最多16种额外抗体同时结合，在单试管中实现多个细胞群体的高分辨率单细胞检测。第二代质谱流式CyTOF 22014年1月29日，美国公司Fluidigm（富鲁达）宣布将以约2.075亿美元收购DVS Sciences。此时，质谱流式发展到了第二代——CyTOF 2。此后，Fluidigm又从Perkin Elmer公司手里买断了和质谱流式有关的所有专利，自此Fluidigm公司拥有了完整的专利、技术和团队，开始全力以赴推动质谱流式向前发展。不过，CyTOF在富鲁达手里并没有如一开始想象的那般美好，至少时至今日也还没到实现Scott Tanner设想的一年100台的装机量或者是每年1亿美元的销售额。富鲁达目前的市值还不到3亿美元，最近3年质谱流式年均销售收入不到7000万美元（包括仪器、试剂和服务），仪器占比~50%。按平均单价70万美元粗略估算，一年的新增装机大约是50台。这对于一个偏高端的单品质谱仪器其实也还算是一个不错的销量，但对于一个NASDQ的上市公司而言实在算不上是成功，而且科研领域如此火爆，几乎没有同类产品产品的竞争。不得不让人深思，到底是哪里不对劲儿呢？是富鲁达的管理层的问题吗？还是质谱流式的市场有限？亦或是传统流式的反围剿太猛？近些年富鲁达的高层的确频繁换人，今年从Casdin Capital和 Viking Global Investors注入了2.5亿美元的战略融资之后，从丹纳赫等头部生命科学公司引入了大批高管。招商换帅的同时，富鲁达又把公司英文名改了，现在叫Standard BioTools Inc.，这不得不让人联想到我国五行文化中常见的“更名改运”的策略。换了班底，改了名字，又有大笔的现金流进账，且看3年内会不会有什么起色吧。目前质谱流式主要是在科研市场，虽然临床和制药领域已经开展了不少临床试验，但是还没有真正进入临床市场，比较还没有任何一家公司获得任何国家的医疗器械注册证。如果真能打开临床市场的大门，的确是会带来巨大的利润。不过奇怪的是，这么多年过去了一直没有听说富鲁达在进行医疗器械的注册，事出反常不应该啊。至于传统流式的反攻，我相信一定是有的。其实关于质谱流式和传统流式的讨论一直都存在，毋庸置疑质谱流式绝对是有优势的，只不过大部分情况下只是在多参数，高分辨方面有比较大的优势，其他不少指标实际上逊色不少的，比如传统流式的样品分析速度10000个细胞/秒，质谱流式通常低于1000个细胞/秒；传统流式的灵敏度和样品利用效率都高于质谱流式；另外传统流式可以进行细胞筛选和回收，质谱流式则不能。而且，基于荧光的流式技术也在发展，比如2004年提出的光谱流式也是主打多参数，创新点在于光路系统、光电检测和数据算法上，如今2014年成立的Cytek推出的Aurora光谱流式也可以实现5激光40色的多参数检测。而且，其24色的仪器和试剂分别已经拿到了NMPA医疗器械二类和试剂一类注册证，成功迈入了临床市场。2021年7月，Cytek公司成功敲钟NASDQ，市值一度高达25.4亿美元，目前回落到15.8亿美元。2021年，Cytek全年收入1.28亿美元，而今年第一季度净收入同比增长高达44%。所以说，质谱流式的确还是需要居然思危的，赶紧增效降费，找准自己的市场定位，拿下医疗注册证，这些都是当务之急。话说当年在Fluidigm之前，DVS其实是找了多个潜在买家的，包括Life Technologies，Agilent和Thermo Fisher等巨头。大概是当时的DVS过于弱小，而安捷伦和赛默飞这种质谱大厂一看，心想你这个质谱也没什么啊，比你这复杂的我都有，何必花钱买呢。巨头没有看在眼里。如今，Life Technologies已经被赛默飞收购，安捷伦以2.5亿美金买了中国的流式公司艾森生物，而赛默飞也推出了自己的Attune NxT流式细胞仪（基于声波聚焦技术，分析速度高达35000个/秒）。富鲁达历年股票走势图2014年，厦门大学付国教授团队迎来了第一台质谱流式CyTOF-2，这是质谱流式在中国大陆境内的第一次装机。若日后国产质谱流式能有所发展，这应该是一个需要被记住的日子。2015年，富鲁达发布了第三代质谱流式系统Helios，改进了信号放大电路将灵敏度提高了50%，同时采用了更高效的样品进样器将离子云的尺寸减小了50%。第三代质谱流式Helios2017年10月4日，富鲁达发布了一款新的产品Hyperion™ 组织质谱成像系统，同样是使用包含金属同位素标签的抗体试剂对福尔马林固定的样本或者石蜡包埋以及冰冻组织的切片样品进行染色，然后通过激光烧蚀技术进行微米尺度的采样，并最终通过质谱流式进行检测，由此可以实现亚细胞水平的组织成像，为组织微环境的研究提供了全新的视野。质谱流式成像系统Hyperion Imaging System关于质谱流式的“好戏”其实还没完，2019年9月，富鲁达一纸诉状起诉一家叫IONpath的创业公司，称其2018年发布了侵犯其专利技术的MIBITM（Multiplexed Ion Beam Imaging）高维空间蛋白质组学技术，同样可以在亚细胞水平进行40个生物标记物的多重质谱成像。富鲁达称自2019年起IONpath开始向市场积极推广，并顺服和默许富鲁达的用户搭配使用IONpath的MIBI仪器和富鲁达的试剂。IONpath何许人也？还记得我们前面列举过Garry Nolan教授一大堆的创始人头衔吗？没错，Garry Nolan教授是IONpath的联合创始人，而公司的主要创始人也是来自Garry Nolan教授实验室。Garry Nolan教授曾是DVS的科学顾问委员会的主席，DVS被收购之后，仍担任顾问职责直到2016年底。同时，同样来自Garry Nolan实验室的其他IONpath创始人也在富鲁达担任顾问，而且IONpath成立于2014年，是任职顾问不久之后的事情。看来IONpath的确是动了富鲁达的奶酪，据说IONpath的发展速度比DVS早期还要快，第一年的装机量就接近小10台。这恰好给了富鲁达管理层找到了一个业绩不佳的口实，好家伙，原来是你小子在偷偷吸血。作了他！富鲁达来势汹汹，且言之凿凿。其实，老实说从MIBI和Hyperion两者的硬件架构上来看，其实差别还挺大的。尤其是，MIBI的空间分辨率指标其实比Hyperion还高了好多，前者的空间分辨率可到280nm，是真正的亚细胞水平，而后者通常只有1μm。这主要取决于前端的采样技术。我们前面提到Hyperion用的激光烧蚀，那主要受限于激光聚焦的束斑尺寸，目前也基本上只能做到1μm这种水平，而MIBI采用的是二次离子质谱技术（SIMS），这也不是一个新鲜玩意儿，属于一个比较高端的配置，是使用聚焦的高能离子束（Primary Ions，叫它一次离子好了）对样品表面进行轰击，然后解吸和电离出二次待测样品离子（Secondary Ions）的技术。富鲁达的Hyperion Imaging System（黄框和紫框）+HeliosIONpath的MIBI采用了SIMI-TOF技术路线 尽管你装置上有创新，技术路线上有差异，但是富鲁达告IONpath的是方法学侵权，这就无解了。看过刘慈欣《三体》小说的都知道，降维打击吓死人，方法学就是最上位，最简洁的思路，这就是降维打击。不过，任何时候也不能坐以待毙，毕竟天无绝人之路，何况手里还有世界上最领先的质谱成像技术。2020年9月24日，IONpath宣布获得了1800万美元的B轮融资，众多的新老投资人中还包括老牌质谱公司Bruker。自从Bruke推出了timsTOF系列产品之后，在组学领域牢牢站稳了脚跟，现在又在逐步布局空间蛋白质组学了。2021年6月，Bruker还发布了针对单细胞蛋白组学的timsTOF SCP，可在数百个单细胞的分析中得到约 1,500 个蛋白质/细胞的定量分析结果，实现了真实无偏的单细胞蛋白组分析。不得不说，质谱这个已经发展了100多年的玩意儿目前看还是没有尽头的，而国内的质谱水平也还只是小学生，我们的视野应该放开一些，多一些合作开拓大市场，小一些争斗莫纠缠在小市场。话说回来，资本的嗅觉是最敏锐的，钱来了生路就来了。果不其然，2021年1月法院驳回了富鲁达对IONpath的指控，但保留其继续上诉的权利，同时称二者的技术并不完全相同，前者是一个细胞一个细胞的分析，而后者像是打印机一样来回分析，反复扫描。这么说来，专利这种侵权官司远没有几个权利要求读起来那么简单，官司打起来了律师才是最关键的。所以未来如果国内质谱公司遇到和国际巨头打官司的情况，不要气馁和害怕，除了靠好的研发人员夯实技术，也要找个好律师加持。2021年5月富鲁达发布了第四代质谱流式CyTOF XT，更加注重整机自动化运行，新增了样品自动上样、采集功能，配备了内部监控系统，自动感知管路堵塞，自动调谐，自动数据转换，一管样品可以实现50+标志物的多参数分析。第四代质谱流式CyTOF XT2022年5月11日，IONpath宣布完成了Corporate Round融资，巨头Thermo Fisher是唯一投资结构，同时这也是IONpath的第4次融资。被第二个质谱巨头加持，说明IONpath的路是走对了，这下妥了。而就上个月，2022年6月10号，Thermo刚宣布了已与TransMIT质谱开发中心合作，共同促进质谱成像技术在空间多组学领域的发展，具体是将前者的Orbitrap质谱和后者的Scanning Microscope Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization(SMALDI) MSI和3D-surface MSI技术进行联用，可用于绘制包括代谢物、多肽、酶解的蛋白质等多种标记物分子的空间分布。由此可以看出，质谱成像技术是巨头们都在积极布局的一个市场。所以不管是Standard BioTools还是IONpath，日后无论能不能经营好，技术肯定是不愁找不到好买家的。国外热热闹闹的同时，国内也是暗流涌动，毕竟现在生物技术、医疗、质谱都是好生意。2021年9月，聚光科技子公司谱育科技同时发布了质谱流式细胞仪和全光谱流式细胞仪。2021年10月，宸安生物发布了质谱流式Straion星瀚。事实上，国内还有不少厂家在路上，至少一只手数不过来。EXPEC 7910 ICP-QTOF（from谱育科技官网）Starion星瀚 （from宸安生物官网） 质谱流式的确是个不错的方向，没有那么多的巨头挡着，技术路径比较简单，市场前景又很明朗，还能彰显大国重器，为国分忧，是再好不过的潜力股了。在笔者看来，质谱流式技术的发展才刚刚开始，技术的迭代、细分和升级依然大有可为。未来的领先地位或许不会是Standard BioTools掌握，至少从目前的趋势看不会。国产质谱的崛起需要有一款旗帜产品在全球树立国产质谱的形象，质谱流式目前就具备这样的特质。参考资料：[1]Palladium-based Mass-Tag Cell Barcoding with a Doublet Filtering Scheme and Single Cell Deconvolution AlgorithmDOI: 10.1038/nprot.2015.020.[2]Meeting the Challenges of High-Dimensional Single-Cell Data Analysis in Immunologyhttps://doi.org/10.3389/fimmu.2019.01515[3]单细胞蛋白组学之质谱流式细胞技术https://phoenix.tsinghua.edu.cn/index.php?c=show&id=19[4]Progress and Applications of Mass Cytometry in Sketching Immune LandscapesDOI 10.1002/ctm2.206[5]The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1977https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/1977/summary/[6]Standard Biotools财报https://investors.fluidigm.com/static-files/5ac228c4-b83b-4027-affc-5d8a9b65febb[7]多伦多大学杂志访谈：Seeing Into the “Soul” of Cellshttps://magazine.utoronto.ca/research-ideas/science/scott-tanner-cell-analysis-cytof-mass-cytometry/[8]Standard BioTools官网https://www.fluidigm.com/[9]中国第一台CyTOF 2质谱流式细胞仪震撼亮相厦门大学https://www.bio-equip.com/news.asp?ID=453068556[10]C&EN专访：Instrumental Efforts——Entrepreneurs take big risks to bring the latest scientific tools to markethttps://cen.acs.org/articles/89/i32/Instrumental-Efforts.html[11]Garry Nolan’s Labhttps://web.stanford.edu/group/nolan/index.html[12]MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structureDOI: 10.1126/sciadv.aax5851

质谱流式细胞术及其在精准医学中研究进展张浩1,2,3, 韩国军1,2,31北京大学跨学部生物医学工程系；2北京大学口腔医院；3 北京大学医学部医学技术研究院。质谱流式细胞术（Mass Cytometry）是近年来应用最为广泛的单细胞技术之一种。其将流式细胞技术与质谱分析技术结合在一起，用金属同位素代替荧光标记特异性抗体或探针，并利用质谱来定量同位素标签，可以在单细胞水平完成多种生物标志物的检测分析，包括核酸、蛋白质及其它小分子。其具有高通量、高灵敏度和高稳定性等优点，尤其适合于肿瘤、免疫、血液、药物和遗传学等学科的研究。当前新冠病毒COVID-19对人体免疫系统造成严重侵害，质谱流式技术能够更深入、全面的分析人体免疫系统的各种细胞亚型及其比例的变化，并预测临床病程的变化趋势，对于早期诊断、治疗与病理研究具有重要意义。 （一） 质谱流式细胞术发展历史图 1美国斯坦福大学医学院Garry Nolan 实验室中三台质谱流式仪器： CyTOF 1， CyTOF 2，CyTOF 3 （Helios）和BD公司荧光流式细胞仪LSR II。[1]质谱流式细胞术从最初的分析方法学概念到单细胞仪器装置、最终在基础生物学与临床医学中取得重要的应用，经过近二十年的发展历程。图1为2015年美国斯坦福大学医学院免疫学与微生物学系Garry Nolan教授实验室中三台不同型号CyTOF质谱流式仪与BD公司荧光流式细胞仪同时使用的照片。回顾质谱流式细胞术的发展历史，有三位重要的科学家作出了杰出的贡献。如图2中所示，首先2002年清华大学张新荣教授在学术期刊Analytical Chemistry中第一次提出元素标记策略用于电感耦合等离子体质谱的生物大分子检测的方法学研究[2]；2009年加拿大多伦多大学的Scott Tanner教授在学术期刊Analytical Chemistry中首次发布质谱流式细胞仪（Cytometry for Time of Flight，CyTOF）的研究工作[3]，并成立DVS Sciences公司将传统流式细胞术与电感耦合等离子体质谱相结合，推出了首台商用质谱流式分析仪器。2011年斯坦福大学Garry Nolan教授首次将质谱流式技术成功应用于临床血癌免疫性疾病的单细胞的表型与磷酸化蛋白信号通路研究[4]，开创了质谱流式医学应用的新篇章。2014年，DVS Sciences公司和质谱流式技术被美国Fluidigm公司收购，随后分别于与2015年和2017年陆续推出了Helios质谱流式系统和Hyperion组织成像系统以及700多种相关抗体和预设计标记试剂盒。目前为止，全球已经安装超过200台质谱流式细胞仪，中国拥有30台以上。并且，已经有50多个临床试验使用了质谱流式细胞术，这表明高通量、高灵敏、高稳定的质谱流式时代已经来临。图2 质谱流式细胞术三位主要奠基人：图A左一为清华大学张新荣教授；图A右一为加拿大多伦多大学Scott Tanner教授； 图B第一排右一为美国斯坦福大学Garry Nolan。（二） 质谱流式细胞术原理质谱流式细胞术主要工作原理是通过重金属同位素标记抗体或探针，然后识别细胞表面或内部信号，被标记的细胞以细胞悬液形式进入雾化器，随后样品在等离子体内发生汽化，产生离子云、离子在四级杆内根据质荷比进行筛选，然后在时间飞行器中通过已知强度的电场加速后到达检测器，而其到达检测器的飞行时间与离子质量有关。最后将原子质量谱的数据转换为细胞表面或内部的信号分子数据，并通过专业计算机分析软件对获得的数据进行降维处理分析，从而得到细胞外部表型和内部信号网络的数据结果。图3 质谱流式细胞术金属稳定同位素标记探针。包括标记单克隆抗体分子的稀土同位素；标记细胞编码的贵金属同位素；标记细胞周期的卤素[1]。北京大学韩国军教授首次建立了48种稳定同位素单克隆抗体统一标记策如图3所示，并定量分析了镧系、钇、铟、钯同位素间的CyTOF质谱干扰。系统性的建立了标准方法用于同位素标记抗体定量分析、抗体活性与选择性验证、以及抗体细胞染色浓度优化等，被多个国际质谱流式实验室作为同位素抗体标记标准手册使用。与传统流式技术相比，质谱流式细胞术主要有以下优势：① 前者使用荧光基团偶联抗体或分子，后者主要通过金属同位素进行标记，因为细胞中不含或很少含有这些金属同位素，因此背景信号较低，检测数据可靠性较高；② 传统荧光流式采用激光器和光电倍增管作为检测手段，最多可同时检测通道数不足20个，而质谱流式细胞术使用ICP-MS作为检测手段，不仅提高了检测通道数，可同时检测100个左右参数，而且避免了通道信号之间的串色干扰，无补偿或补偿非常小，使方案设计更加容易。③ 除可以在单细胞水平进行自身多参数分析以外，还可以检测分析一些金属治疗药物的分布及代谢情况，比如顺铂类化疗药物等。但质谱流式细胞术当前也存在一些问题，比如样本采集速度慢，每秒最多约1000个事件；测量不同样本之间需要程序清洁，导致每个样本平均测样时间延长；由于样本被气化，所以无法进行前向散射和侧向散射测量，也不能分选回收细胞进行后续实验等。（三）质谱流式细胞术的应用3.1 细胞表型鉴定与信号通路检测质谱流式细胞术非常适合对复杂的细胞表型进行深层次分析，可以区分在疾病发展过程中发挥不同作用的相似细胞，这对疾病的个体化治疗具有重要意义。Su等人通过对结直肠癌患者血液中的T细胞群进行质谱流式分析，展示了患者个体及不同患者之间 T 细胞亚群的表型多样性[5]。此外，Lelieveldt等用HSNE进行数据分析，在免疫细胞中发现了稀有细胞群[6]。分析细胞因子可以为研究免疫激活状态提供新的视角。Vendrame 等人利用 CyTOF评估细胞因子对自然杀伤 (NK) 细胞的影响，发现白介素 (IL)-12/IL-15/ IL-18刺激可显著增加NK细胞中γ干扰素 (IFN‐γ)的表达[7]。Doyle等对丙型肝炎病毒(HCV)感染患者的肝脏和外周血中的浆细胞样树突状细胞(pDCs)进行了研究，证明肝脏pDC具有多功能性，能够在慢性HCV感染期间产生大量的IFN-γ 和其他免疫调节因子[8]。随着检测细胞因子的报道不断增多，CyTOF将可能成为免疫细胞功能研究中不可或缺的工具。细胞受外界刺激后，细胞内信号网络会做出相应反应。使用靶向磷酸化蛋白的金属螯合抗体，CyTOF能够检测单个细胞内的信号通路。Shinko等人为临床血样提供了磷酸化信号蛋白染色的优化方案[9]。厦门大学周大旺教授团队应用 CyTOF质谱流式细胞仪发现了Hippo信号通路中转录共激活因子TAZ在调节 CD4+初始T细胞分化为Th17细胞和Treg细胞的过程中发挥着关键调控作用及其重要机理[10]。 3.2细胞周期鉴定、RNA和蛋白质的共同检测细胞周期改变是肿瘤进展、生物发育和免疫调节的重要方面。Behbehani 等人开发了一种新的CyTOF方法来描绘细胞周期阶段，分别使用IdU、磷酸化视网膜母细胞瘤抗体、细胞周期蛋白 B1抗体、细胞周期蛋白 A 抗体和磷酸化组蛋白H3抗体来标记S、G0、G1、G2、和 M 期细胞[11]。并利用这种细胞周期鉴定方法，研究展示了介导急性髓性白血病化疗敏感性的细胞周期差异[12]。为了能够在单细胞分辨率下同时检测 RNA 和蛋白质，Frei 等人开发了 RNA 邻近连接技术 (PLAYR)[13]。PLAYR包括杂交、连接、滚环扩增和检测四个阶段。针对目标RNA设计两个相邻区段的探针，与目标RNA结合后再与Backbone和Insert两个探针进行杂交，随后Backbone和Insert探针连接成一个环，做为后续滚环扩增的模板，与带有金属标签的探针杂交后就可以扩增并检测了。PLAYR的优势在于可以同时兼容蛋白检测，在实验过程中，可以先用抗体对胞内外蛋白进行标记，然后在用PLAYR流程对RNA进行原位标记和扩增。我们可以根据表面Marker对细胞进行亚群分析，深入研究每个亚群中信号通路、转录因子的激活及其相关基因的表达。并且利用PLAYR监测脂多糖刺激后PBMCs中8个细胞因子mRNA和18个蛋白表位的变化，揭示了每个细胞的功能能力与其蛋白标记物表达之间的相关性。3.3 质谱流式细胞术成像Geisen 等人使用 CyTOF 对组织样本进行成像以获得蛋白质空间组学[14]。他们提出的IMC （Imaging Mass Cytometry）技术使用分辨率为 1 μm 的激光光斑进行烧蚀、雾化、电离，并通过惰性气流传送到质谱检测器。IMC 被认为是具有里程碑意义的发展，因为它在亚细胞分辨率下将细胞间相互作用和的空间信息联系在一起，并能同时分析多达50种参数。自推出以来，IMC 正迅速被应用于各个研究领域。Damond 等人使用 IMC 对4例非糖尿病患者、4例首发1型糖尿病患者和4例长期1型糖尿病患者的胰岛进行研究，描述了人类1型糖尿病的进展，并发现在发病之前β胰岛素细胞表型已经发生改变[15]。另一类元素标记的单细胞成像技术是利用二次离子质谱SIMS（Secondary Imaging Mass Spectrometry），图4为北京大学韩国军教授利用NanoSIMS 50L质谱对Hela单细胞核中新生成的DNA与RNA的时空分析[16]。图4 基于二次离子质谱的高分辨Hela细胞核成像技术与人工智能机器学习数据分析。3.4 新冠肺炎检测及治疗 Silvin等人对COVID-19 患者外周血进行单细胞CyTOF及RNA测序，发现血浆内钙结合蛋白水平和非典型单核细胞减少可以鉴别严重的COVID-19患者[17]。Schrepping等人对全血和外周血单个核细胞进行RNA测序和单细胞蛋白质组学分析，揭示了SARS-CoV-2感染后免疫系统的反应[18]。而Rendeiro等人利用质谱流式细胞术进行空间成像，研究包括SARS-CoV-2 感染在内的人类急性肺损伤的细胞组成和空间结构。从而使我们能够从结构、免疫学和临床角度提出生物学上可解释的肺病理图谱，为理解COVID-19和一般的肺损伤病理学提供了重要的基础[19]。（四）总结质谱流式细胞术相较传统荧光流式细胞技术具有可以同时检测更多参数不需补偿、方案设计简单、灵敏度高等优点。其多参数检测的特征尤其适合对细胞表型、细胞因子、信号通路等进行深层次分析，适用于肿瘤、免疫系统疾病、传染病、血液病、药物临床试验、预后评估等方面研究。但质谱流式细胞术也存在采样较慢、清洁费时、成本较高等问题，因此还需研究人员根据自己的实验目的及需求进行选择。参考文献：1. Han GJ, Spitzer MH, Bendall SC, et al. Metal‐isotope‐tagged monoclonal antibodies for high‐dimensional mass cytometry[J]. Nat Protoc, 2018 13(10):2121-2148. DOI: 10.1038/s41596-018-0016-7.2. C. Zhang, Z. Y. Zhang, B. B. Yu, J. J. Shi, X. R. Zhang. Application fo the biological conjugate between antibody and colloid Au nanoparticle as analyte to inductively coupled plasma spectrometry. Anal.Chem. 20023. Bandura DR, Baranov VI, Ornatsky OI, et al. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time - of - flight masss pectrometry[J]. Anal Chem, 2009 81(16):6813-22. DOI: 10.1021/ac901049w.4. Bendall SC, Simonds EF, Qiu P, et al. Single‐cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum[J]. Science, 2011 332(6030):687-96. DOI: 10.1126/science.1198704.5. Di J, Liu M, Fan Y, et al. Phenotype molding of T cells in colorectal cancer by single‐cell analysis[J]. Int J Cancer. 2020 146(8):2281‐2295. DOI:10.1002/ijc.32856.6. van Unen V, Hollt T, Pezzotti N, et al. Visual analysis of mass cytometry data by hierarchical stochastic neighbour embedding reveals rare cell types[J]. Nat Commun. 2017 8(1):1740. DOI:10.1038/s41467-017-01689-9.7. Vendrame E, Fukuyama J, Strauss‐Albee DM, et al. Mass cytometry analytical approaches reveal cytokine‐induced changes in natural killer cells[J]. Cytometry B Clin Cytom. 2017 92(1):57‐67. DOI:10.1002/cyto.b.21500.8. Doyle EH, Rahman A, Aloman C, et al. Individual liver plasmacytoid dendritic cells are capable of producing IFNalpha and multiple additional cytokines during chronic HCV infection[J]. PLoS Pathog. 2019 15(7):e1007935. DOI:10.1371/journal.ppat.1007935.9. Shinko D, Ashhurst TM, McGuire HM, et al. Staining of phosphorylated signalling markers protocol for mass cytometry[J]. Methods Mol Biol. 2019 1989:139‐146. DOI:10.1007/978-1-4939-9454-0_10.10. Geng J, Yu S, Zhao H, et al. The transcriptional coactivator TAZ regulates reciprocal differentiation of TH17 cells and Treg cells[J]. Nat Immunol, 2017 18(7):800-812. DOI: 10.1038/ni.3748. 11. Behbehani GK, Bendall SC, Clutter MR, et al. Single‐cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle[J]. Cytometry A. 2012 81(7):552‐566. DOI:10.1002/cyto.a.22075.12. Behbehani GK, Samusik N, Bjornson ZB, et al. Mass cytometric functional profiling of acute myeloid leukemia defines cell‐cycle and immunophenotypic properties that correlate with known responses to therapy[J]. Cancer Discov. 2015 5(9):988‐1003. DOI:10.1158/2159-8290.CD-15-0298.13. Frei AP, Bava FA, Zunder ER, et al. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells[J]. Nat Methods. 2016 13(3):269‐275. DOI:10.1038/nmeth.3742. 14. Giesen C, Wang HA, Schapiro D, et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry[J]. Nat Methods. 2014 11(4):417‐422. DOI:10.1038/nmeth.2869.15. Damond N, Engler S, Zanotelli VRT, et al. A map of human type 1 diabetes progression by imaging mass cytometry[J]. Cell Metab. 2019 29(3):755‐768.e5. DOI:10.1016/j.cmet.2018.11.014.16. Coskun. A. F., Guojun Han, Ganesh S. et al. Nanoscopic subcellular imaging enabled by ion beam tomography, Nature Communications, 2021, 12(789)17. Silvin A, Chapuis N, Dunsmore G, et al. Elevated Calprotectin and Abnormal Myeloid Cell Subsets Discriminate Severe from Mild COVID-19[J]. Cell, 2020 182(6):1401-1418.e18. DOI: 10.1016/j.cell.2020.08.002.18. Schulte-Schrepping J, Reusch N, Paclik D, et al. Severe COVID-19 Is Marked by a Dysregulated Myeloid Cell Compartment[J]. Cell, 2020 182(6):1419-1440.e23. DOI:10.1016/j.cell.2020.08.001. 19. Rendeiro AF, Ravichandran H, Bram Y, et al. The spatial landscape of lung pathology during COVID-19 progression[J]. Nature, 2021 593(7860):564-569. DOI:10.1038/s41586-021-03475-6. 【作者简介】张浩 博士 2020级北京大学口腔医学技术专业科研型博士，导师韩国军教授。硕士就读于山东大学口腔医院（导师刘少华教授），从事血管瘤临床治疗及泡沫硬化剂的改良研究，发表SCI论文4篇。目前师从韩国军教授，主要从事口腔鳞癌单细胞质谱研究及质谱病理诊断新方法研究。韩国军 研究员北京大学跨学部生物医学工程系研究员、博士生导师，北京大学口腔医院双聘博士生导师。2013年毕业于清华大学化学系（导师张新荣教授），2013至2020年在美国斯坦福大学医学院Mass Cytometry创始人Garry Nolan课题组从事新一代质谱流式相关技术与临床医学应用研究。曾获教育部自然科学一等奖，并在Nature Communications、Nature Protocols、Cell Reports、Angew Chem、Anal Chem、Cytometry等发表论文20余篇。目前主要从事质谱新技术在临床医学中应用研究，与北京大学口腔医院、北京大学第三医院、北京大学第一医院开展单细胞质谱流式临床精准医学研究。点击查看流式细胞仪专场Webinar预告（点击报名）专家约稿招募：若您有生命科学相关研究、技术、应用、经验等愿意以约稿形式共享，欢迎邮件投稿或沟通邮箱：liuld@instrument.com.cn微信/电话：13683372576扫码关注【3i生仪社】，解锁生命科学行业资讯！

原标题：清华大学王文会团队: 基于阻抗流式细胞术的单细胞样本“一步式”分选除盐质谱预处理系统——01——研究背景单细胞质谱检测技术为单细胞化学特性分析提供了一种强有力的免标记分析手段，并在癌症分析、药物刺激、免疫分析等临床应用中展现出潜在价值。然而单细胞质谱往往需要进行必要的预处理操作，如将目标细胞从混合细胞群体样本中分离出来以提高质谱检测的准确性；除盐操作去除细胞常见缓冲液中的非挥发性盐，降低基质效应提高质谱检测灵敏度。目前这些预处理往往是通过多种设备或手动操作完成，效率较低；开发有效的一步式预处理方法对于单细胞质谱分析意义重大，但目前这方面的研究较为缺乏。为此，清华大学的王文会教授团队提出一种基于阻抗流式细胞术IFC的“一步式”分选除盐质谱预处理系统，经过处理的细胞样本可直接兼容现有的免标记质谱流式、液滴微萃取等单细胞质谱分析手段。研究工作以“Microfluidic Impedance Cytometry Enabled One-Step Sample Preparation for Efficient Single Cell Mass Spectrometry”为题发表在期刊Small上，并被选为Frontispiece。本工作基于IFC原理设计微流控芯片结构，结合压电驱动实现一步式单细胞分选除盐操作，将目标细胞从细胞群中分离出来的同时实现其外基质的置换。经实验验证，系统的分选效率99%、除盐效率99%，并被证实了在癌细胞和血细胞的分离、癌变细胞与正常细胞的分离与质谱检测方面的功能。图1. 基于阻抗流式细胞术的“一步式”分选除盐质谱预处理系统示意图——02——研究内容本工作中搭建了具有四层结构的微流控芯片，如图1所示。利用IFC进行细胞的电学及尺寸特性表征实现不同细胞的识别，待其流经分选区域时由压电执行单元对目标细胞进行分选，通过合适的流速配比，执行单元将目标细胞推至作为下鞘液的质谱兼容的挥发性盐溶液中，同时实现样本的分选与除盐。芯片采用两套电极，其中第1套用于单细胞电学表征，第2套用于表征确认除盐效率。图2. 微流控芯片结构及其工作流程示意图以商用均一性较好的6 μm和10 μm直径的PS微球对系统的分选效率进行了表征。在约9000个样本的实验中，系统展现出了99.53%的分选成功率，同时样本中的10 μm微球纯度由2.48%提升至92.23%，实现了约37倍的富集效率，如图3所示。此外在模拟血液中CTCs分离的实验中，在HeLa癌细胞与人体外周血单核细胞PBMC的混合样本中分选出HeLa细胞，其纯度由15.78% 提升至87.34%，展示出巨大的临床应用潜能。图3. 微流控系统的分选性能评估从定量的角度，以270 mM NaCl溶液作为样本液、去离子水作为下鞘液为例验证了系统的除盐效率，单次分选操作引入的NaCl物质的量仅为0.77±0.16 pMol，即使在300 cells/s的分选通量下除盐效率也能够达到99.62%；同时在实际的细胞样本测试中可以看出，未经除盐的样本信号被完全淹没，而经过该系统除盐后的能够清晰分辨单细胞的典型代谢与脂质峰，证实了系统优秀的除盐性能。图4. 微流控系统的除盐性能评估该系统进一步用于正常乳腺上皮细胞MCF-10A和癌变的乳腺癌细胞MDA-MB-468的分选与检测。通过双频点的锁相检测，分别表征了两类细胞的电学特性，并据此进行了分选操作，结果表明MCF-10A细胞的纯度由 10.64% 提升至77.78%，展现出了约7.31 倍的富集效率。此外将收集到的细胞样本直接与免标记质谱流式装置级联实验，同时表征了两类细胞的代谢特征，结果表明，部分显著差异表达的代谢和脂质可能是致使细胞电学特性差异的原因，充分验证了系统在多模表征与临床分析中的应用价值。图5. 正常细胞与癌变细胞的电学与代谢特性表征分析——03——总结展望本工作提出的基于IFC的一步法单细胞样品质谱预处理方法极大地方便单细胞质谱分析，突破了复杂操作和不必要的损耗。作为一个独立的样品制备模块，本微流控系统能够兼容多种质谱分析方法，为高效的质谱样品制备提供新的范式，进而为单细胞的多模态(如电学特性、代谢特征)表征提供新的思路。论文信息Microfluidic Impedance Cytometry Enabled One-Step Sample Preparation for Efficient Single-Cell Mass Spectrometry ；Junwen Zhu, Siyuan Pan, Huichao Chai, Peng Zhao, Yongxiang Feng, Zhen Cheng, Sichun Zhang, Wenhui Wang* (王文会，清华大学)；Small, 2024, https://doi.org/10.1002/smll.202310700作者简介本工作的完成单位为清华大学精密仪器系、精密测试技术与仪器全国重点实验室。精仪系王文会教授为通讯作者，精仪系博士研究生朱焌文为第一作者。清华大学张四纯教授、程振助理研究员、清华大学博士生潘思远、柴惠超、赵鹏、丰泳翔为论文工作做出了重要贡献。本研究得到了国家自然科学基金的资助。【相关阅读】有望提高2个数量级微流控介电泳分离通量！清华大学王文会Advanced Materials封面成果速递https://www.instrument.com.cn/news/20240604/722338.shtml 3i流式KOL|清华大学王文会教授团队在阻抗流式细胞术上取得系列进展https://www.instrument.com.cn/news/20231030/689623.shtml

细胞是生物结构、功能单元及生命活动的基本单位，对其深入研究有助于进一步认识生命规律。临床样本量通常较少，单细胞多指标分析对疾病早期诊断及预后、药物开发等具有重要意义。为了满足对单细胞多参数分析日益增长的需求，Tanner等提出了质谱流式细胞仪的概念。与传统的荧光流式相比，该仪器基于非光学物理检测原理与金属标签抗体识别细胞，检测通道理论上可达上百种，同时，检测通道之间相互无干扰，具有高灵敏度、高稳定性及低变异系数的优点。 目前常见的质谱流式金属标签是基于1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸等配位基团的聚合物金属标签（MCP），每条聚合物链上仅连有20-50个金属原子，相当于每个抗体上连有150-200个金属原子，无法实现低丰度标志物的检测。此外，MCP聚合物标签只可与稀土金属和铋等的三价离子配位（对应约40个检测通道），超过60%的同位素通道并没有实际使用，制约了质谱流式在实际应用中的多指标检测能力。由此可见，提高质谱流式金属标签的灵敏度，实现低丰度细胞标志物的检测以及开发新的质谱流式同位素通道，提高质谱流式多指标检测能力是当前质谱流式技术亟需解决的问题。因此，需要开发设计新型的金属同位素载体提高单个金属标签上金属原子个数及负载稀土之外金属元素。 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所研究员白鹏利课题组是国内最早进行质谱流式检测试剂研究团队之一，经过多年的积累，已掌握金属标签的合成、筛选及抗体标记等技术，积累了深厚的学术与技术基础。近期，白鹏利课题组首次提出了一种基于便捷的金属元素掺杂聚苯乙烯纳米球的质谱流式金属标签合成策略，将稀土、锆和铪等金属元素通过溶胀的方法掺杂到聚苯乙烯纳米颗粒中，并进行抗体偶联，制备了一系列质谱流式金属标签，实现了对单核细胞（MNCs）的单细胞高灵敏多指标检测。 纳米颗粒通常会与细胞产生强烈的非特异性吸附，可能导致假阳性结果，影响检测结果的准确性，因此降低材料的非特异性吸附水平对质谱流式检测试剂颇为重要。科研人员通常对纳米颗粒进行复杂的表面修饰来降低材料的非特异性吸附水平，操作繁琐困难。本研究发现改变染色缓冲液成分可有效降低聚苯乙烯纳米材料对细胞的非特异性吸附，例如，使用含10%FBS的PBS缓冲液时聚苯乙烯纳米颗粒与细胞的非特异性吸附水平下降至使用商品化缓冲液的5%，这为改善纳米颗粒类质谱流式金属标签非特异性吸附性能提供了新的发展方向。 该团队将Eu金属掺杂到200nm聚苯乙烯球中后与抗CD8抗体偶联制备的金属标签，可实现对MNCs中CD8+T细胞的有效分群，分群效果与商品化的MCP标签一致，当标签用量为4000NPs/Cell时，检测灵敏度可达到商品化标签的5倍，且该标签对商品化标签表现出颇高的兼容性，证明其具备在实际质谱流式检测中具备应用潜力。 该工作将La、Zr和Hf等金属掺杂到聚苯乙烯纳米颗粒中，与抗CD45抗体偶联制备相应的金属标签，均能够实现对MNCs细胞的分群，并首次实现了177Hf、178Hf、179Hf和180Hf四个元素通道在质谱流式检测中的应用，拓宽了质谱流式检测通道。未来，将其他金属同位素掺杂到聚苯乙烯纳米颗粒中制备金属标签将会开拓更多的元素通道。该工作为质谱流式检测通道拓展提供了一种通用易行的策略。 相关研究成果以A Universal Mass Tag Based on Polystyrene Nanoparticles for Single-Cell Multiplexing with Mass Cytometry为题，发表在Journal of Colloid and Interface Science上（2023, 639, 434-443.）。研究工作得到国家重点研发计划、江苏省自然科学基金、中科院仪器装备项目和中科院青年创新促进会等的支持。 图1.基于金属掺杂聚苯乙烯纳米颗粒的质谱流式金属标签制备策略及单细胞多指标检测示意图 图2.Eu-PS-NPs标签在不同细胞染色缓冲液中对MNCs细胞染色后质谱流式散点图。（a）Fluidigm CSM，（b）PBS，（c-f）5-20% of FBS in PBS，相应信号强度柱状图（g）和热图（h）。 图3.商品化标签及Eu-PS-NPs标签染色后质谱流式散点图对比。（a）141Pr-MCP_CD45、152Sm-MCP_CD3、151Eu-MCP_CD8、159Tb-MCP_CD4，（b）141Pr-MCP_CD45、152Sm-MCP_CD3、151Eu-PS-NPs_CD8、159Tb-MCP_CD4。 图4.Eu、Zr、Hf、La掺杂聚苯乙烯纳米球标签制备及对MNC细胞分群结果

肝胆胰恶性肿瘤起病隐匿，导致诊断、治疗延后，影响预后。目前临床使用的血清学标志物灵敏度及特异度仍有待提升。在过去的十年中，免疫治疗的发展改变了癌症的治疗现状。一项使用小鼠模型的研究发现肿瘤可诱导系统免疫功能障碍，且这一障碍可通过肿瘤切除得到逆转。越来越多的证据也提示肿瘤发生发展伴随着系统性免疫紊乱和外周免疫细胞的改变。因此，探测外周血免疫细胞组成变化可能有助于早期发现肝胆胰恶性肿瘤。质谱流式技术(CyTOF)作为新发展起来的检测免疫细胞组成和数量的技术，可获得外周血免疫细胞组成、表型和功能的高维信息。利用质谱流式技术评价外周免疫状态，有望为肿瘤早筛早诊提供全新工具。　　　　近日，浙江大学医学院附属第一医院梁廷波教授团队联合国内14家医院在Gut上在线发表了题为Mass cytometry-based peripheral blood analysis as a novel tool for early detection of solid tumours: a multicentre study的研究成果。该研究基于质谱流式检测外周血细胞组分改变构建了肝癌、胰腺癌筛查模型，取得了优异的肿瘤诊断效能，有望提高相关肿瘤早诊率，进而改善这部分患者的预后情况。　　　　这是一项前瞻性、多中心临床研究，共入组2348名受试者，其中包含肝癌患者790名，肝良性疾病患者341名，胰腺癌患者376名，胰腺良性疾病患者208名，健康受试者633名。采集受试者外周血并进行质谱流式分析，通过来自浙大一院的训练集及随机森林算法完成模型构建，并在内部验证队列和10余家外部验证队列中进行模型效能评价。研究者建立了外周免疫评分PBIScore和联合现有临床肿瘤标志物的整合外周免疫评分iPBIScore。阿里云提供了云计算服务。　　结果显示，基于PBIScore的肝癌诊断模型在训练集、内部验证集、外部验证集的AUC分别达到0.98、0.91、0.85 基于iPBScore的肝癌诊断筛查在训练集、内部验证集、外部验证集点AUC分别达到0.99、0.97、0.96。基于PBIScore的胰腺癌诊断模型在训练集、内部验证集、外部验证集的AUC分别达到0.98、0.89、0.89 基于iPBScore的胰腺癌诊断筛查在训练集、内部验证集、外部验证集点AUC分别达到0.99、0.98、0.97。同时，在肿瘤标志物阴性和极早期肝癌、胰腺癌患者中该模型也保持了很好的检测效能。　　此研究是目前最大规模的基于质谱流式技术评估外周免疫并开发肿瘤诊断方法的研究，在取得优异诊断性能的同时提示，进一步明确了外周免疫细胞亚群的改变可以反映肿瘤发生发展情况。值得一提的是，该研究显示，这一方法有作为泛癌早筛早诊的潜能，将可能在未来健康人体检和肿瘤高危人群筛查中发挥重要作用。　　原文链接：　　https://gut.bmj.com/content/early/2022/09/15/gutjnl-2022-327496

2023年3月28日，宸安生物的Polaris Starion M1.0流式细胞质谱仪正式获得江苏省药品监督管理局医疗器械注册证（注册证编号：苏械注准20232220387），成为全球第一台可用于体外诊断的流式细胞质谱仪，是流式质谱技术迈向临床诊疗的重要里程碑。专家寄语 王建祥教授中国医学科学院北京协和医学院血液病医院血液学研究所副所院长流式细胞质谱仪是非常高效强大的分析工具，它是结合了流式细胞术和质谱分析的技术，可以在单细胞水平一次进行多指标的检测，因此，流式质谱无疑会助推血液病的诊断技术。宸安生物的流式细胞质谱仪获批上市、取得医疗器械注册证，这也是血液系统疾病诊断的一个里程碑，它会进一步提高血液系统疾病诊断的准确率和快速性。朱平教授第四军医大学西京医院主任医师解放军风湿病专科研究所所长自身免疫性疾病发生发展过程中涉及的免疫学机制十分复杂，需要强大的工具来进行研究和诊断。流式细胞质谱仪具有在单细胞水平上一次检测多个标志物的优势，有潜力成为临床免疫学科先进的研究工具和诊断工具，特别是在单细胞分辨率下解析免疫疾病发病机制，将有力促进临床免疫的发展。宸安生物流式细胞质谱仪取得临床器械注册证，是我们国产高端医疗器械发展的一项重大成果，它开拓了我们临床诊断工具的新高度，我期待在未来利用流式质谱仪为疾病的精准诊疗提供新见解。诊断级流式细胞质谱仪有哪些特点？流式细胞质谱仪是结合流式细胞试剂方法学和质谱硬件技术的高性能分析平台。使用质量标签标记的抗体，并通过高速飞行时间质谱来获取高分辨率、高灵敏度、高通量的数据，从而实现对单个细胞或微球的多参数分析。此次获批的产品为Polaris Starion M1.0，具有全球同类产品中领先的性能和稳定性：强大且简单拥有巨大的检测通道数，灵敏度全球领先，可轻松实现单次40指标以上的单细胞高维分析，通道之间无干扰，无需配色补偿，项目开发简便快速，轻松实现超越现有方法学的检测性能。标准、稳定经过临床试验的充分验证，在相同检测项目上与现有方法学数据高度一致；自带内标校准，确保定量结果在平台全生命周期的稳定可靠。具有简单且标准化的工作流程，一键校准，操作系统支持多人多权限同时登录，针对不同临床应用场景搭配成熟分析模板。更低的使用成本对于多指标应用场景，由于无需选择特殊波段荧光素，并且无需拆分多次进样，流式质谱的试剂成本相较现有方法学具有显著优势；另外，宸安生物开发了多样本编码技术，可大幅降低样本前处理复杂性，同时进一步降低试剂用量。关于宸安生物宸安生物致力于为用户提供强大易用的单细胞解决方案，通过高通量单细胞组学技术和先进算法，提供高分辨生命科学研究工具和临床诊断平台。

p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　 strong 仪器信息网讯 /strong 近日，全球最大的专业致力于人用疫苗研发和生产的企业——& nbsp Sanofi Pasteur（赛诺菲巴斯德）在Nature子刊《Communications Biology》发表了 strong 百日咳新疫苗研发 /strong 的相关成果。文章解析了遗传脱毒的百日咳毒素的晶体结构，并用质谱流式技术评估了遗传脱毒和化学脱毒两种百日咳毒素的免疫原性。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 254px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/621f7ecb-627d-4f0f-85f3-1cf4e0f8d14e.jpg" title=" 11111111111111111.png" alt=" 11111111111111111.png" width=" 600" height=" 254" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　 span style=" color: rgb(0, 0, 0) " strong 1.为什么关注百日咳新疫苗的研发? /strong /span /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　百日咳是由百日咳杆菌引起的一种高度传染性且非常危险的疾病，婴幼儿多见。减少百日咳发病率最有效的策略是接种疫苗，目前无细胞百日咳(aP)疫苗被证明是安全和有效的。然而尽管广泛开展了疫苗接种, 近年来许多国家的百日咳发病率仍在不断上升，这表明目前开发出的疫苗无法长期持续有效地控制疾病。因此，越来越多的研究机构关注百日咳新疫苗的开发。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　 strong 2.为什么选择遗传脱毒的百日咳毒素作为研究对象? /strong /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　百日咳毒素(PTx)是百日咳杆菌最重要的毒力因子之一，具有多种生物学活性，能引起百日咳众多的临床症状，因此PTx是改进aP疫苗的一个重要靶标。目前所有可用的aP疫苗中采用的是化学脱毒的PTx，也被称为百日咳类毒素(PTd)。化学脱毒虽然能有效地抑制PTx毒性，但会影响毒素的整体结构，损害产生抗毒素的强中和抗体所需的表位，因此近年来很多研究机构尝试通过构建PTx的基因突变体来产生遗传脱毒百日咳毒素(gdPT)。本研究中采用的是gdPTR9K/E129G，早期的研究证明这个突变体毒素的毒性已被完全消除。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　 strong 3.该研究有哪些重要成果? /strong /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　通过X射线晶体结构测定研究人员发现来自赛诺菲生产的gdPTR9K/E129G与PTx的晶体结构几乎相同(图1)。 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 氢氘交换质谱分析显示R9K/E129G两个位点突变引起了毒素催化域的动态变化，直接影响NAD+的结合，并且导致B-oligomer更紧密的包装，使其相应的热稳定性增加。 /strong /span /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong /strong /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/0d560ac8-a352-4b51-9b56-9859d2087bd3.jpg" title=" 22222222222222222222222.png" alt=" 22222222222222222222222.png" / /p p style=" text-align: center line-height: 1.75em " span style=" text-align: center " 　图1 PTx与gdPT X射线晶体结构比较结 /span span style=" text-align: center " 果，右图为底部视角 /span /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　疫苗抗原的关键功能是诱导保护性免疫反应，增强免疫记忆，保护接种者免受后续病原体的挑战。为了全面而精细地评估化学脱毒的PTd和遗传脱毒的gdPT刺激产生适应性记忆免疫反应的能力，研究人员采用质谱流式技术，选取包含30个 marker的Fluidigm Maxpar Direct免疫分型 panel，对人类模型样本进行了分析。研究发现在刺激后，gdPT组和PTd组细胞表型有明显区别，但在PTd和模拟对照组之间差异很小(图2)。gdPT刺激使初始T细胞向增殖的记忆T细胞转化。而另一项值得注意的变化出现在记忆T细胞亚群(CD45RO+)内，gdPT刺激组大量增殖的记忆T细胞呈现出活化的表型，CD4+和CD8+亚群中CD38和CD25的表达相比PTd组显著升高。此外，在gdPT刺激组检测到表达CD45RO的NK细胞亚群，而这个亚群在PTd和对照组均未检测到。这些结果表明gdPT与PTd相比具有更广泛的免疫原性。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/cabb8098-0718-4d16-bf0e-f21dac4adcaf.jpg" title=" 333333333333.png" alt=" 333333333333.png" / /p p style=" text-align: center line-height: 1.75em " 　　图2 PTd、gdPT刺激人类模型样本质谱流式分析结果(Mock为Media对照) /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　目前含有gdPT并与其他百日咳抗原联合使用的疫苗正在或已经通过临床评估获得许可。虽然这些临床研究证明相对于化学脱毒抗原，gdPT形成的体液反应质量有所改善，但很少有研究详细解读这些细胞反应。本研究的质谱流式数据补充了丰富的有关抗体介导免疫的信息，有助于促进gdPT抗原后续的临床评估。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em text-indent: 2em " strong a href=" https://www.nature.com/articles/s42003-020-01153-3" target=" _blank" 原文链接：https://www.nature.com/articles/s42003-020-01153-3 /a /strong 　　 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 质谱流式细胞技术 strong (Mass Cytometry) /strong 是利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术，它继承了传统流式细胞仪的高速分析的特点，又具有质谱检测的高分辨能力。传统流式细胞技术和Mass Cytometry相比，主要有两点不同：第一、标签系统的不同，前者主要使用各种荧光基团作为抗体的标签，后者则使用各种金属元素作为标签 第二、检测系统的不同，前者使用激光器和光电倍增管作为检测手段，而后者使用ICP质谱技术作为检测手段。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " Mass Cytometry用金属标签抗体标记的细胞进入质谱流式细胞仪后，逐个通过ICP质谱检测装置，然后对每个细胞中各种金属标签进行定量检测，进而得知每个细胞中各目标蛋白的含量。 /p

p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 消化道相关病毒对人体健康产生重大威胁，尤其是乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒，在中国有数量庞大的患者。乙型肝炎病毒感染者无论在潜伏期、急性期或慢性期，其血液都具有传染性。临床上主要通过注射乙肝疫苗来达到预防的目的。一旦感染乙肝，目前治疗方案主要有NUC治疗，而NUC治疗只能干扰DNA合成，并不能将乙肝病毒从患者体内清除，因此具有很高的反复性。丙型肝炎病毒（慢性感染）为一类致癌物。临床丙型肝炎病人50%可发展为慢性肝炎，甚至部分病人会导致肝硬及肝细胞癌。非常遗憾的是医学界尚未研制出有效预防丙肝的疫苗。因为丙肝病毒是RNA病毒，极易变异，研制疫苗的难度很大。质谱流式在这两种病毒方向的应用主要涉及到临床治疗方案的改善，疫苗的效价评估及潜在治疗靶点的探索。 /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 消化道相关病毒 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 目前质谱流式在消化道相关病毒的研究主要集中在轮状病毒，乙型肝炎病毒HBV和丙型肝炎病毒HCV三种病毒领域。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 轮状病毒（ rotavirus）肠炎是由轮状病毒所致的急性消化道传染病。病原体主要通过消化道传播，主要发生在婴幼儿，常由A组轮状病毒引起，发病高峰在秋季，故名婴儿秋季腹泻。B组轮状病毒可引起成人腹泻。轮状病毒领域目前已发表文献涉及到T细胞结合表位筛选和寻找轮状病毒特异性B细胞亚群。T细胞结合表位筛选利用新发现的质谱流式和MHC四聚体技术相结合，创建了一种高通量筛选的技术。该技术用金属标签替代四聚体上的荧光基团，进而可以用质谱流式进行检测，从根本上解决荧光串色问题，提升单次检测通道。加之他们用三金属组合的方式标记四聚体来取代传统单金属标记的方法，进一步增加筛选的通量，用10种金属就可以实现120种抗原肽的筛选。利用该方法，Newell等人对人体内轮状病毒的109个MHC四聚体上77个T细胞潜在结合位点进行筛选，在健康个体的血液中鉴定出6个限制于人白细胞抗原（HLA）-A *0201的T细胞表位。值得一提的是，研究还发现特异性结合轮状病毒VP3蛋白的T细胞具有独特的表型，并在肠道上皮中大量存在。轮状病毒相关B细胞研究中，Nair, N.等人在轮状病毒上标记金属离子，进而研究在肠道中特异性结合在轮状病毒VP6结构性蛋白的B细胞亚群特征，揭示肠道B细胞组成异质性及其与肠道分泌细胞之间的关系。这些研究揭示出轮状病毒感染后抗原呈递及免疫反应特征，对于今后轮状病毒治疗及疫苗研发提供重要的理论基础。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " HBV相关研究涉及到感染进程及临床治疗两个方向。利用上述质谱流式和多肽-MHC四聚体技术的结合，Cheng, Y.等人对不同阶段HBV患者体内T细胞进行HBV基因组中HLA-A*1101限制性484种T细胞潜在结合位点进行了筛选，最终发现特异性结合HBV(pol387)和HBV(core169)表位的T细胞随着疾病发展呈现出明显分化和异质性。根据这些T细胞表型变化，作者绘制出HBV疾病进展图谱。如此深入的研究对于今后HBV感染阶段分型及治疗策略有很好的指导意义。临床治疗方面，Rivino, L.等人利用质谱流式探索HBV感染后NUC治疗停止治疗判定标准。发现患者体内是否存在功能性HBV-特异性T细胞亚群可作为慢性HBV患者停药的潜在生物标志物。慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的慢性炎症增加了肝细胞癌（HCC）的风险。但是，关于HBV相关HCC的免疫状况及其对有效癌症免疫疗法设计的影响知之甚少。Lim, C. J.等人利用免疫组化和质谱流式技术，对HBV相关的HCC和非病毒相关的HCC的免疫微环境进行了细致研究，找到HBV相关HCC的独特免疫亚群，结合患者预后信息，作者发现Treg与HCC的预后不良相关，而Trm与HCC的预后良好相关。这种深入的研究对今后HCC的治疗和免疫疗法的适当应用具有重要意义。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " HCV感染全球数以百万计的人，是肝硬化和肝细胞癌的主要原因。而针对丙型肝炎病毒（HCV）的保护性疫苗仍未满足临床需求。已有成果利用质谱流式对新研发HCV疫苗疗效进行评价，单次实验可分析更多的免疫亚群反应。Doyle, E. H.等人用质谱流式对HCV感染后肝脏中的pDC功能进行分析，发现pDC是肝脏中唯一的单个核细胞，依旧具备多功能性，可大量分泌IFNα等多种细胞因子。可在今后治疗方案改善中作为潜在靶标。这些研究对于临床均具有重要的应用和指导意义。 /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 人乳头瘤病毒（HPV） /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " HPV感染会引发的宫颈癌和口咽鳞状细胞癌。质谱流式对两种肿瘤免疫微环境的研究发现。虽然是同一种病毒感染，但是由于组织类型的不同，其免疫微环境呈现出很大的差异性。这说明组织类型会显著影响肿瘤中的免疫渗透概况。这对治疗方案的调整有很大的指导意义。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 口咽鳞状细胞癌的可分为HPV阴性和HPV阳性。质谱流式对这两种类型患者的综合免疫亚群分析结合临床情况，发现患者肿瘤内存在I型HPV16特异性T细胞会提升其整体生存率，缩小肿瘤大小，减少淋巴结转移。并且会改变肿瘤微环境，使其呈现出响应标准治疗的特征。这些发现说明在口咽鳞状细胞癌中引入HPV16特异性T细胞会提升治疗效果。对临床治疗具有很大的启发。 /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 小结 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 本文对质谱流式在消化道相关病毒和人乳头瘤病毒方向的文献进行汇总，所列文献涉及到的应用方向如下：1、病毒感染T细胞识别表位筛选，2、疫苗评估，3、确定疾病分型标准，发现biomarker的研究。在这些应用方向，质谱流式的单细胞多通道检测有其不可替代的优势。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 2013年开始兴起的技术——质谱流式与多肽-MHC四聚体技术相结合——在近两年呈现出越来越多的高水平成果。得益于质谱流式的单细胞多通道检测，利用该技术在筛选T细胞表位的同时，还可以对抗原特异的T细胞进行多参数的表型和功能分析；一次得到更多更准确的病毒特异性T细胞及抗原呈递信息，这对疫苗的研发有着举足轻重的作用。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 疫苗研发和效价评估方面。疫苗注射后所引起的免疫反应也是全方面的。能够评估的免疫亚群越全面，对于效价的评估越准确。质谱流式在这方面有其得天独厚的优势。从最开始的抗原表位筛查到注射疫苗后免疫反应的评估，质谱流式都可以大大提升覆盖度，使得研究更加快速，结果更加准确。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 综上，质谱流式在：1、病毒感染T细胞识别表位筛选，2、疫苗评估，3、确定疾病分型标准，发现biomarker的研究领域都有着传统流式无法比拟的优势，可助力研究人员在单次实验中拿到更多的信息，对免疫系统进行更加综合全面系统的评估。 /p p br/ /p

21世纪后，新的生物学技术层出不穷，研究人员对于造血发生、免疫细胞分化成熟、癌细胞转化、干细胞自我更新和分化等领域的研究不断深入，单细胞异质性的重要性已经成为学界共识。这就对细胞分析工具的检测通道数量和信号质量就有了更高的要求，传统流式技术在诸如此类的科研领域中已经力有不逮，迫切需要一种更高效、易用、更多参数同时检测的流式细胞技术。在这样的背景下流式质谱技术应运而生。2023年3月28日，宸安生物的Polaris Starion M1.0流式细胞质谱仪正式获得江苏省药品监督管理局医疗器械注册证（注册证编号：苏械注准20232220387），成为全球第一台可用于体外诊断的流式细胞质谱仪，是流式质谱技术迈向临床诊疗的重要里程碑。近日，仪器信息网走访了国内首家流式质谱系统研发制造企业——宸安生物，与宸安生物医学事业副总裁王心竹博士等专业人士进行了深入交流。中：宸安生物医学事业副总裁王心竹博士 左二：仪器信息网生命科学主编 李博宸安生物成立于2016年，是一家领先的单细胞精准诊断科技公司。作为国内首家、国际上第二家流式质谱系统研发制造企业，专注于为用户提供强大易用的单细胞解决方案，通过高通量单细胞组学与先进算法的结合，深度解析免疫系统个体化差异和动态变化，为复杂疾病的生物学机制解析、疾病的精准分型、伴随诊断和创新治疗提供科研和临床级的产品和服务。自流式质谱技术商业化以来，由于其高昂的进口价格和烦琐的维保售后过程，导致其应用面很窄，目前仅用于科学研究。但宸安生物Starion星瀚®和Lunarion宵晖TM的成功研发上市，标志着流式质谱技术正式开启新的应用领域——临床诊断！据了解，Starion星瀚®作为国产第一台单细胞流式质谱仪，先于进口品牌实现了临床水平的稳定性和易用性，其检测结果与荧光流式数据高度一致，率先实现该技术平台的临床化应用。Polaris Starion M1.0流式细胞质谱仪（注册证编号：苏械注准20232220387）生物医学发展以创新分析工具为驱动据悉，宸安生物CEO王宇翀博士在学术期间受导师的启发，意识到生命科学是以发现工具为驱动力的学科。这也是宸安生物研发流式质谱的初衷。王心竹博士介绍道：“宸安生物团队在组建之初做了非常多的市场调研，但最终锁定研发单细胞诊断和分析工具——流式质谱技术。”宸安生物仅用了3年的时间就自主研发出了国内首台流式质谱仪，王心竹博士表示：“我们是从最基本的物理学原理出发去设计整套流式质谱平台”。2021年4月，宸安生物的Starion星瀚®️流式质谱系统以满分的成绩通过了国家卫健委临检中心举办的淋巴细胞亚群室间质量评价。除此之外，本次走访了解到宸安生物推出的流式细胞质谱系统Starion星瀚®、Lunarion宵晖TM采用金属标签标记抗体，以粒子质荷比信号强度作为检测指标，既克服了荧光流式光谱信号重叠的问题，又突破了荧光检测通道的限制，理论上能够实现超过135个检测通道。同时，宸安生物的流式质谱系统在灵敏度、分辨率上实现大幅提升，可以精确地反映出细胞基于靶蛋白丰度的各种细胞群体的表型和功能，实现了超越现有方法学的检测性能。为了满足更多客户的需求，让流式质谱技术以更高的性能和更低的成本惠及给更多的用户，落地下沉市场。宸安生物于2022年12月26日发布了旗下全新一代桌面级质谱流式系统Lunarion宵辉™，。王心竹博士提到：“Lunarion宵晖™桌面级流式质谱系统添加了全自动进样模块及全流路自动清洗系统，将更多的功能凝聚在更小的机箱之中，相较Starion星瀚®体积缩小了40%，使其支持更多装机环境。”流式质谱临床应用前景广阔谈及流式质谱的未来新应用领域，王心竹博士在采访中谈到：“流式质谱由于其技术独特性，可以轻松实现单次40个指标以上的单细胞高维分析，无需选择特殊波段荧光素，并且无需分多次进样相较于现有的方法学更加容易实现标准化，因此在临床上拥有更广泛的应用性。”宸安生物为流式质谱技术打开了通往临床的大门。未来在血液病检测、免疫功能监测和细胞因子检测等方面应用前景广阔。随着流式质谱技术的不断进步，应用场景的不断拓宽，技术的日益普及，有望成为临床检验的重要工具。王心竹博士在采访中表示：“从临床端来看，我认为流式质谱技术在血液系统疾病诊断领域会最先达成共识。流式质谱技术可以对血液病患者的血液或骨髓样本中白血病相关免疫表型深度分析，对白血病诊断分类、病情监测和预后评估等方面提供重要参考依据。”宸安生物流式质谱的研发成功打破了国外企业在流式质谱行业的垄断，为用户提供了更多的选择空间，也为精准医疗提供了技术支持。国家对生命科学领域的政策支持也为流式质谱技术的市场下沉提供了助力。持续研发优化产品，挖掘更多应用价值流式质谱数据的解读还面临许多挑战，面对复杂的流式数据，是对使用者进行培训还是优化仪器？王心竹博士表示：“由于肿瘤细胞的异质性和免疫系统的复杂性，血液系统疾病诊断长期依赖形态学观察，其准确性无法满足临床的需求。流式质谱技术在高维数据产出，数据标准化、灵活性方面具有的独特优势，流式质谱技术可以应用先进的数据分析方法和先进算法，轻松实现一个检测方案完成血液病的初筛诊断，数据通用且可重复，促进了跨越实验室的合作和数据共享。”关于流式质谱技术在未来临床应用上的发展方向，王心竹博士补充道：“近年来临床上越来越多地关注精细免疫分析，许多顶尖三甲医院会基于六色抗体细胞进行免疫分析，但通过流式质谱技术可以轻松实现40个指标的检测，这样就可以区分五六十个细胞亚群在不同的疾病里面分别代表什么意义，这也是我们现在想去做的工作。”对于现有产品的改进方面，王心竹博士表示：“目前，临床样本通常需要经过复杂的预处理步骤，预处理的复杂性可能导致样本的损失和处理过程中的变异性。为了尽可能减少人工操作产生的误差和损耗。样本前处理自动化是未来流式必须要回答的问题，也是临床检测的刚需，这也是我们正在研发的项目之一；未来，我们会持续产品研发，以客户临床、科研需求为出发点，为客户提供更多具有实际应用价值的产品和服务。”目前，宸安生物已全面启动商业化，未来将不断加强技术创新和产品研发。通过不断优化，使流式质谱技术实现标准化、精细化、自动化，让它能更好的为生命科学及医疗健康领域服务，正如王心竹博士说的那样：“希望未来宸安生物的流式质谱系统能够服务于更多客户。”

【招商赞助中】第六届细胞分析网络会议，全日程公布！https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/icca2023.html正文：2023年5月，宸安生物全资子公司重庆晟都医学检验实验室参加了由国家卫生健康临床检验中心（NCCL）举办的2023年全国流式细胞术-淋巴细胞亚群室间质量评价。此次考核的评估项目共包含CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3-CD16+CD56+以及CD3-CD19+五项指标。报告显示，宸安生物的旗舰产品Starion星瀚®流式质谱系列以五项指标满分的佳绩通过了本次评估，再次证明了其在实际使用中的卓越检测精度和准度！宸安生物旗下的Starion系列流式质谱系统，结合了流式细胞仪高通量的检测能力和飞行时间质谱的全谱分析能力，可实现在单细胞分辨率下同时对数十种目标蛋白的深度分析。通过高通量单细胞组学与先进算法的结合，深度解析免疫系统个体化差异和动态变化，为复杂疾病的生物学机制解析、疾病的精准分型、伴随诊断和创新治疗提供科研和临床级的流式质谱产品和服务。*根据产品型号不同，配置参数有所差异招商中！！【精彩会议Webinar】第六届细胞分析网络会议，全日程公布重磅来袭！全日程公布：https://www.instrument.com.cn/webinar/meetings/icca2023.html围绕4大主题：【1】类器官与器官芯片【2】单细胞分析技术：微流控、质谱、测序、转录组【3】细胞治疗产品的CMC质量控制分析【4】细胞成像分析技术8月30日精彩等你：https://insevent.instrument.com.cn/t/uus（主办单位：仪器信息网，赞助联系13683372576）

“或许流式质谱是一个独特的赛道，其技术和应用都在同一起跑线上，或者说我们并没有被拉下很长的距离，就类似传统汽油轿车和电动轿车一样。”——程小卫 皖仪分析事业部 总经理继上期《聚浪成潮 以待花开|质谱国产替代之路有多长？》(点击查看)，本文皖仪分析事业部总经理程小卫将围绕质谱流式技术展开阐述。 7. Q-TOF了解一下 7.1 基本原理和结构TOF飞行时间质谱，是原理最简单的质谱。就是施加到离子的电势能转化为动能，基本公式就是m为离子的质量；z为离子所带的电荷数目；V为施加到离子的电势，脉冲电压，它对于所有质量的离子是相同的；v为离子的飞行线速度，离子质量越大，飞行速度就越慢。离子飞行的线速度v等于飞行距离L除以飞行时间tL为由仪器的飞行管所决定的常数。所以，上述基本公式可以转化为m/z=2Vt2/L2因而离子质荷比正比于飞行时间的平方。比如，m/z为3000的分子，飞行时间才1微秒。图：系统结构图示意图（资料来源：安捷伦用户培训资料）离子源：产生离子化，并将产生的离子在电场的作用下进入毛细管。毛细管/锥孔：离子导入通道，将离子源产生的离子传输进入质谱。同时，隔离外部的常压与质谱内部的高真空。离子光学组件：包括Skimmer 1，八极杆以及Lens 1 和Lens 2。进一步除去溶剂和中性分子，高效的离子传输组件，并聚焦随机运动的离子进入四极杆。四极杆：质量过滤器，双曲线的四极杆优化离子传输和质谱分辨率。可以选择让某些质荷比的离子依次通过或者所有的离子全通过。碰撞池：线性加速的高压碰撞池。优化质谱/质谱分裂，从而在一个短的停留时间仍可消除交叉干扰。六极杆设计有助于捕获碎片离子。离子束整形器：将随机运动的离子压缩为一个薄层，进入脉冲发生器。减少离子在纵向的扩散，提高分辨率。脉冲发生器：以一定的频率在纵向施加高压，将从离子束整形器过来的离子快速抛入飞行管。飞行管：离子在飞行管内纵向飞行，不同质荷比的离子通过飞行管的时间不同。检测器：包括微通路板、闪烁器和光电倍增器。高增益，寿命长，线性范围宽。Q-TOF 的真空系统由一个前级真空泵（机械油泵）和两个分子涡轮泵组成。前级真空一般在 1.8-2.5 Torr 之间，不同型号的 Q-TOF，高真空的范围不同。 7.2 Q-TOF的工作方式 Q-TOF 有三种不同的工作方式：• TOF 模式：这种模式下，可以得到离子的一级质谱图。四极杆处于离子全通过状态(TTI, Total Transmission Ion)，所有的带电离子都会通过四极杆，碰撞池不施加碰撞能量，带电离子不会裂解，TOF 工作在扫描模式下，直接检测得到一级质谱图。这种操作模式下Q-TOF 的行为与单TOF 类似。• 自动 MS/MS (Auto MS/MS) 模式：这种模式下，根据用户设定的条件，对符合条件的离子自动做二级质谱。当某个或某些离子满足用户的预设条件时，四极杆处于 SIM（选择离子监测）模式，碰撞池施加碰撞能量将离子撞碎，而 TOF 仍然工作在扫描模式，得到符合设定条件的离子的二级谱图。当没有离子满足用户预设的条件时，Q-TOF 仍工作在TOF 模式下。这种工作模式比较常用于方法开发，未知物质鉴定以及结构解析。在自动 MS/MS 模式中，仪器根据操作者设定的规则自动决定哪些质荷比的母离子通过四极杆，在碰撞池中被打碎然后由 TOF 进行全扫描分析。Q-TOF 首先进行 TOF 模式扫描出一级质谱，然后根据离子的强度和设置的其他规则参数来选择母离子，进行MS/MS 分析。对于自动MS/MS 模式，仪器用下列的逻辑程序判断是否对某离子进行MS/MS 分析。• 目标 MS/MS (Targeted MS/MS)模式: 在这种操作模式下，只有用户指定的离子，可以得到二级质谱图。仪器只对操作者输入的目标离子进行MS/MS分析。对于用户选定的目标离子，四极杆进行选择离子监测，运行 SIM 模式，碰撞池施加碰撞能量将离子撞碎，而 TOF 仍然工作在扫描模式，得到选定离子的二级质谱图。这种工作模式比较常用于定量分析，已知物质的鉴定和结构阐明。目标 MS/MS 模式通常用于已知物的分析。操作者需要预先知道它们的母离子以及各自的保留时间 。对于目标 MS/MS 模式，仪器使用以下程序来判断是否对离子进行 MS/MS 分析。• 软件的重要性前面提及Q-TOF是原理最简单的质谱，受限于计算机的发展，言即表达的是软件的重要性。QqQ和Q-TOF质谱软件除了基本的数据采集、控制仪器、定性分析、定量分析，还有锦上添花的小工具软件为的是更友好更方便更智能。比如：安捷伦的Optimizer 标配给QqQ，优化质谱参数，优化好的参数放在一个dMRM database里；Study Manager for QqQ and TOF/Q-TOF 小工具，编样品信息和序列，适用于大批量样品处理；Dynamic MRM database Kit wl method for QQQ；Easy-Access 软件（岛津公司称为Open Solution软件），用于插队样品，合成实验室的样品多的情况；个性化定制化合物库软件personal compound database library（e.g. PCDL） 作为高分辨定性质谱Q-TOF在定性相关的软件需求上更加突出：比如：分子特征提取软件（MFE， Molecular Feature Extractor） 外源代谢物鉴别软件（Metabolite ID）用于药物代谢物鉴定 蛋白质分析软件，用于大分子，计算分子量和序列匹配；代谢组学软件，区别于外源性代谢物，鉴定内源性代谢变化；数学统计学软件，比如PCA主成分分析，方差分析等等。以及各种数据库软件，比如毒物、滥用药物数据库；农药、兽药数据库；内源/外源代谢物数据库等等。• 不得不提到的OrbitrapOrbitrap（静电场轨道阱）是一种拥有超高分辨率的质量分析器，由俄罗斯科学家 Makarov 于 2000 年发明。该发明专利被赛默飞公司收购，目前是赛默飞专利独有的高分辨质谱技术。Orbitrap 是继磁质谱质量分析器、飞行时间质量分析器（TOF）、傅里叶变换离子回旋共振质量分析器（FT-ICR）这些高分辨质谱技术之后，发明原理完全创新的高分辨质谱技术，克服了既往高分辨质谱技术的诸多不足，是具有划时代意义的新一代高分辨质谱技术。从 2005 年 LTQ Orbitrap 推出以来，随着 Makarov 团队不断优化，Orbitrap 系列产品凭借其卓越的分辨率、灵敏度、多项创新技术，逐渐成为高端质谱领域的代表者。图：Orbitrap 系列产品的核心优势图（资料来源：赛默飞世尔官网）因为Orbitrap是赛默飞的独家技术且因作者水平有限，所以不做过多阐述。 8. 流式质谱要知道 无论称作流式质谱，还是叫作质谱流式，其中质谱是检测手段，流式是方法学，一种细胞定量分析和分选技术。无论是低分辨的离子阱、四极杆质谱，还是Q-TOF、IM-QTOF、Orbitrap等高分辨质谱技术上，无论是无机质谱还是有机质谱，要想突破质谱的卡脖子技术，都有很大挑战和难度。但，或许流式质谱是一个独特的赛道，其技术和应用都在同一起跑线上，或者说我们并没有被拉下很长的距离，就类似传统汽油轿车和电动轿车一样。8.1 传统流式和流式质谱的区别在学习了解流式质谱前，简单温习一下流式荧光技术和光谱流式的概念。流式荧光技术：是基于编码微球和流式技术的一种临床应用型的高通量发光检测技术。相较于传统化学发光法，流式荧光技术能够支持多指标检测，具有通量高、速度快、操作简便等特点，但存在荧光标签的串色问题、受限于稀有荧光素的供应。光谱流式：每个荧光染料的发射光谱在定义的波长范围内被一组检测器所捕获，这样每个荧光染料的流式荧光光谱都可以被识别、记录其光谱特征，并在多色实验中充分使用。流式细胞仪的检测器可以检测到每个细胞或颗粒的散射光信息和多个荧光信号，最终分析细胞或颗粒上的信息。光谱流式通过光谱拆分技术部分解决了荧光补偿问题，但需要难度较大的配色方案，试剂成本高，通道数量较流式质谱相比较少。鉴于此，流式质谱应需而生。流式质谱：是结合传统流式和质谱两个平台的技术，能够同时获得单个细胞的多种参数。流式质谱作为定量手段的优势在于其高分辨率，并且克服了传统流式荧光发射基团光谱重叠的问题。流式质谱仪可提供过百个检测通道，可以同时对更多的细胞特征进行分析。通过标记稳定的金属标签，流式质谱仪可以在不同的通道生成信号，识别不同靶向蛋白的标记，并且各参数之间几乎没有重叠。相较于传统流式，流式质谱是采用金属元素对抗体进行标记，因此通道数量会受限于金属标签的供应；另一方面，受采样速度的影响，流式质谱对样本的处理速度相较于传统流式而言较慢。图源：宸安生物包括经典流式和光谱流式在内的荧光流式利用荧光基团标记抗体，再利用抗体结合抗原的方法标记细胞，用激光激发荧光基团，通过检测发射出的荧光信号的波长和强弱实现参数的定量检测。而质量流式用稳定的金属标签代替荧光基团来标记抗体，通过质谱检测细胞上金属元素的含量实现参数的定量检测。这也是质谱流式的这个名称的由来。图源：宸安生物我们可以看到在荧光流式中，不同荧光素的发射光谱存在大量重叠，不仅限制了检测通道的数量，而且为配色和后续的数据分析带来了困难，不同荧光信号之间的串扰，必须在数据分析过程中调补偿的方式来消除，这样的操作非常依赖于操作人员的经验，也为不同的设备、实验室数据之间的标准化带来了很大的难度。另外，一些生物样本中的自发荧光作为背景也会干扰数据的分析。而质谱流式极大程度地解决了这些问题，在质谱流式检测范围内的金属元素信号几乎没有重叠，不需要为此调补偿，并且这些金属元素正常情况下在生物体内极少存在，因此质谱流式信号几乎没有背景。这些特点带来的直接优势是检测通道数量的提升和数据分析上的便捷，更多参数的同时检测也可以为我们提供更高维度的数据结构和信息。8.2流式质谱的基本原理流式质谱技术 （Cytometry Mass）结合了传统流式技术高效的单细胞研究能力和飞行时间质谱的全谱高分辨率优势，采用金属标记抗体与待测抗原结合，理论上可提供140个检测通道，并且克服了传统流式荧光发射基团光谱重叠的问题，实现了单细胞水平的高通量分析。图源：宸安生物质谱流式技术采用金属标记的抗体识别细胞表面或胞內的抗原，标记后的细胞经雾化后进入电感耦合等离子体矩管中进行离子化，离子云随后被传输至飞行时间质量分析器中，在飞行时间质谱分析器中，金属离子质量越大，飞行时间越长，检测器依次记录各种金属离子到达的时间，检测出细胞中各种标签金属的含量，最终形成不同的金属离子信号峰。检测产生的高维数据通过分类、聚类和降维算法进行处理，结果可以反映基于靶蛋白丰度的各种细胞群体的表型和功能。金属离子的信号强度可以代表蛋白分子的表达丰度。可以实现对目标蛋白的全面覆盖和批量分析。单个样本中可以实现细胞表面蛋白，胞内蛋白，和分泌型分子的同步检测。对样本单细胞水平的深度解析可以提供从未被挖掘的信息，作为伴随诊断参考，揭示新的分子机制。图源：宸安生物这张图描述了质谱流式的样本从金属抗体染色到上机检测的流程。细胞被染上金属抗体后会经历雾化、电离形成一团离子云、离子云在经过过滤和筛选之后只剩下抗体上的金属离子，随后这些离子通过飞行时间质谱依据质荷比不同形成分散的离子峰，结合金属元素和抗体及抗原一一对应的信息，我们最终得到不同抗原在细胞上的丰度。这些数据会经过处理转化成荧光流式通用的FCS格式的流式标准文件，可以使用一些熟悉的流式数据分析软件，比如FCS express, Flowjo等对数据进行传统的圈门分析，或者使用聚类降维等高维数据分析方法挖掘更多的信息。图源：宸安生物质谱流式的上样形式与荧光流式一样，都是处理好的单细胞悬液。在开始检测后，质谱流式首先通过雾化将样本转换为大量的微小液滴，细胞悬液以30uL每分钟左右的速度被压入如图所示的雾化器中，雾化器中央是一根水平悬空的毛细管，毛细管外是用于辅助雾化的氩气，当样本流出右侧毛细管末端时，会被周围喷出的雾化气散成大量呈雾状的小液滴，细胞被包裹在这些小液滴当中。图源：宸安生物接下来这些小液滴会被180℃的雾化室中，随后液滴蒸发，尺寸缩小，被氩气携带进入离子源进行电离，在离子源位置氩气在高频切换电磁场作用下被加热产生温度极高的等离子体火焰，而细胞在等离子体中经历去溶剂、解离、原子化和电离等一系列变化，最终变成一团离子云。图源：宸安生物这些在等离子体外生成的离子云通过金属锥，从低真空度进入高真空度的环境，随后在四极杆质量选择器中经历引导和筛选，排除低质量的背景离子，只留下抗体上高质量金属离子进入后续的检测器。图源：宸安生物质谱流式使用TOF作为检测器。检测离子云时，所有离子被正交加速电场施加一个相同的初始动能，随后在反射场中作回返运动，由于不同离子的质荷比不同，在加速之后获得的初速度不同，这导致不同离子回返到达检测器的时间不同，检测器通过到达的时间差别区分不同的离子，在这里有两个质谱流式中很重要的概念：Push和Event Length。Push是指每次正交加速电场将离子加速进入回返场的时间间隔，即TOF的检测周期。Event Length是指一个细胞产生的完整离子云被检测完所需要的Push个数。可以表达成“检测一个细胞经历的Push数量=Event Length”这也是一个在之后的圈门过程中很重要的一个参数。 8.3 流式质谱的主要应用领域 新药开发是一项复杂、昂贵、耗时的工作，需要解决来自各领域的技术难题。流式质谱技术可以在管线的各个阶段协助做出以数据为导向的决策，从而将安全有效的疗法成功地推向市场。药物发现阶段：提供免疫分型深度分析，信号通路检测、细胞因子检测、T细胞激活\耗竭分析和新生抗原筛选。临床前开发阶段：提供免疫分型、细胞因子、PK/PD动态分析。临床试验阶段：单细胞水平的蛋白组学可对患者精准分群，进行免疫治疗反应的监测。批准和上市后：作为辅助诊断的工具，实现高效快速检测、指导治疗方案的选择和进行疗效监测。在血液系统疾病、基于高维免疫评估的感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤免疫、基于高维免疫评估的细胞治疗等皆是流式质谱的用武之地。

由中国分析测试协会和中关村材料试验技术联盟发布的团体标准《质谱仪器分类与代码》于于2024年1月5日发布，标准将于4月5日开始实施。　　质谱仪器作为质谱技术作为一种高灵敏、高分辨的分析技术，越来越受到关注和重视，其在食品、环境、制药、医疗以及学术研究等行业的应用也日益广泛。而在中国质谱界，对于日渐丰富的质谱仪器品类，如何更好的分类质谱仪器势在必行，于是本标准也在业内专家大力支持下应运而生。　　《质谱仪器分类与代码》标准的分类原是按仪器结构和原理对质谱仪器进行分类，具体按照联用技术、离子化技术、质量分析器三个维度划分。分类方法采用分面分类法，包括按照联用技术划分、按照离子化技术划分、按照质量分析器类型划分。　　分类方法　　采用分面分类法，按“分面—亚面—类目”建立类表结构体系。根据质谱仪器的结构组成分为三个分面，每一分面根据对应的原理逐次分为若干亚面或若干类目。　　分面一：按照联用技术划分　　根据质谱仪器联用技术分为直接离子化分析、色谱联用以及常用非色谱联用三个亚面。根据不同的色谱类型分为液相色谱、气相色谱、离子色谱、薄层色谱、超临界流体色谱、毛细管电泳 6 个类目 各类目再根据该色谱原理不同，再逐一划分。常用非色谱联用分为热解吸、流式细胞术、激光烧蚀 3 个类目。　　1) 直接离子化分析 　　2) 色谱联用划分为：　　a) 液相色谱包括：　　—液相色谱 　　—高效液相色谱 　　—超高效液相色谱 　　—多维液相色谱 　　b) 气相色谱包括：　　—气相色谱 　　—全二维气相色谱 　　c) 离子色谱 　　d) 超临界流体色谱 　　e) 薄层色谱 　　f) 毛细管电泳 　　3) 常见非色谱联用划分为：　　a) 热解吸 　　b) 流式细胞术 　　c) 激光烧蚀。　　4) 其他。　　分面二：按照离子化技术划分　　根据离子化原理不同，对常用的离子化技术进行分类。分为轰击离子化、电喷雾离子化、化学离子化、致离子化、放电离子化、热离子化、场致离子化七个亚面。各亚面根据该种离子化原理是否有不同细分，再逐一划分若干类目。　　1)轰击离子化包括：　　a) 电子轰击离子化 　　10T/CAIA/YQ 008—2024/T/CSTM 01082—2024　　b) 快速原子轰击离子化 　　c) 二次离子化 　　2) 电喷雾离子化包括：　　a) 电喷雾离子化 　　b) 解吸附电喷雾离子化 　　c) 纳升电喷雾离子化 　　d) 脉冲直流电喷雾离子化 　　e) 电喷雾萃取离子化 　　f) 电喷雾辅助激光解吸离子化 　　g) 极性反转电喷雾离子化 　　3) 化学离子化包括：　　a) 化学离子化 　　b) 大气压化学离子化 　　c) 质子转移反应 　　4) 光致离子化包括：　　a) 基质辅助激光解吸离子化 　　b) 单光子离子化 　　c) 多光子离子化 　　d) 激光解吸离子化 　　5) 放电离子化包括：　　a) 介质阻挡放电离子化 　　b) 辉光放电离子化 　　c) 低温等离子体离子化 　　d) 电晕放电离子化 　　e) 解吸电晕束离子化 　　f) 火花放电离子化 　　g) 电感耦合等离子体离子化 　　6) 热离子化 　　7) 场致离子化包括：　　a) 场解吸离子化 　　b) 场离子化 　　8) 其他。　　分面三：按照质量分析器类型划分　　根据质谱仪器的主质量分析器(输出最终分析结果的质量分析器)的不同原理，划分为五个亚面，分别为四极杆质量分析器、飞行时间质量分析器、离子阱质量分析器、磁质量分析器、傅里叶变换质量分析器。各亚面根据该种质量分析器原理不同，再逐一划分若干类目。　　1) 四极杆质量分析器 　　2) 飞行时间质量分析器包括：　　a) 直线飞行时间质量分析器 　　b) 单次反射飞行时间质量分析器 　　c) 多次反射飞行时间质量分析器 　　3) 离子阱质量分析器包括：　　11T/CAIA/YQ 008—2024/T/CSTM 01082—2024　　a) 二维离子阱质量分析器 　　b) 三维离子阱质量分析器 　　4) 磁质量分析器包括：　　a) 单聚焦质量分析器 　　b) 双聚焦质量分析器 　　5) 傅里叶变换质量分析器包括：　　a) 静电阱质量分析器 　　b) 离子回旋共振质量分析器 　　6) 其他。　　本文件起草单位：广东省麦思科学仪器创新研究院、广州禾信仪器股份有限公司、暨南大学、宁波大学、中国计量科学研究院、中国广州分析测试中心、赛默飞世尔科技(中国)有限公司、杭州谱育科技发展有限公司、宁波华仪宁创智能科技有限公司、常州磐诺仪器有限公司、中国科学院苏州生物医学工程技术研究所、上海质谱仪器工程技术研究中心、北京东西分析仪器有限公司、江苏天瑞仪器股份有限公司、钢研纳克检测技术股份有限公司、苏州安益谱精密仪器有限公司、北京清谱科技有限公司、山东英盛生物技术有限公司、安捷伦科技(中国)有限公司、珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司、岛津企业管理(中国)有限公司、西北核技术研究院。本文件主要起草人：朱芷欣、刘丹、周振、黄正旭、罗德耀、周志恒、丁传凡、丁力、黄泽建、陈江韩、徐牛生、俞晓峰、姚继军、闻路红、周向东、程文播、王世立、韩娜、刘召贵、沈学静、张小华、高俊海、景叶松、朱颖新、王海鉴、朱敏、潘晨松、洪义、李磊、陈政阁、黎彦、刘虎威、李志明、沈小攀。附件：TCAIAYQ 008—2024TCSTM 01082—2024《质谱仪器分类与代码》.pdf

布局生命科学与诊断新赛道基于流式细胞分析技术应用解决细胞功能分析研究问题谱育科技在BCEIA 2021重磅发布 质谱流式细胞仪、全光谱流式细胞仪 2款生命科学新品。特邀 张新荣教授 现场新品揭幕及专题报告。张新荣，清华大学化学系教授、博士生导师，BCEIA大会副主席、中国分析测试协会副理事长、中国仪器仪表学会分析仪器分会副理事长等。EXPEC 7910 ICP-QTOF 质谱流式细胞仪 更快、更高、更强的ICP-MSEXPEC 7910青出于蓝而胜于蓝谱育科技ICP-MS产品系列不断开拓创新从ICP-MS 到 ICP-MSMS再到全新推出的高速、高分辨、高能力的ICP-QTOF技术平台将ICP-MS质谱技术推向了新的制高点垂直电感耦合等离子体技术从单质量分辨到全通的带宽连续可调四极杆技术反射式飞行时间质谱技术三位一体，技胜一筹● ● ●EXPEC 7910 质谱流式细胞仪基于ICP-QTOF技术的质谱流式细胞仪，全谱直读质谱分析，整合特有的垂直炬管、90°偏转离子光学、多模式四极杆、全新一代碰撞反应池、垂直引入反射式TOF等优势技术，获得超乎想象的更多、更快、更全的测量信息，解决了生命科学单细胞研究中多元素同时分析的需求。颠覆性的垂直炬管设计（VIP）分析高挥发性有机物和高盐样品时，垂直炬管比传统的水平炬管具有更高的耐受性和等离子体稳定性，炬管和离子接口的使用寿命更长。直角离子光学（RIO）高效离子传输，彻底消除中性粒子干扰，提高信噪比。多模式四极杆（MMQ）高稳定性纯钼四极杆，具有单质量分辨、段扫描、全通多种工作模式。瀑布流式高效碰撞反应池（DFC）第三代碰撞反应池，瀑布流式进气设计，碰撞和反应截面更大，干扰消除更彻底。高压缩比矩形离子整形光学系统（ISO）创新设计，高效压缩离子束，提高离子利用率和传输效率。oa-TOF质量分析器垂直引入反射式飞行时间质量检测器，更高分辨率，更高灵敏度，更快速度。应用方向

Modified from BRUCE GOLDMAN手术以后多久康复？血液会提前告诉你一切。每年有数以百万计的人接受各种大手术，但是没有人知道他们多久可以恢复。有些人几天会感觉明显好转，而对于其他人则可能需要一个月或更长的时间。对于具体某一个病人，医生也无法告诉他究竟属于那种类型。就在最近，斯坦福大学医学院的研究人员发现，在手术后的第一个24小时内，一小群免疫细胞的活性水平变化可以为预测病人的康复期提供有力的线索。基于此，他们可以预测病人何时将从手术引起的疲劳和疼痛中恢复，并重新站立起来。图一、斯坦福大学的新发现：A Fingerprint of Surgical Recovery在这项研究是基于对32个经过髋关节置换手术的中老年患者血样进行深入分析后得出的结论，该成果发表在今年9月24日发表的Science Translational Medicine.杂志上。这可能是迄今为止最全面的对于创伤后免疫系统反应特征的研究。斯坦福大学的研究者能有这一发现是因为他们使用了一个高度灵敏的技术——“单细胞质谱流式技术”。这是一种在Garry Nolan（斯坦福大学的微生物学和免疫学教授）的实验室中发展起来的新技术，它利用金属元素做为抗体的标签，质谱装置做为检测手段，可以同时检测免疫细胞表面以及内部的几十个生化特征，不但可以告诉我们这些细胞属于什么种类，还可以告诉我们他们的活性如何。图二、利用金属元素作为抗体的标签，CyTOF2质谱流式细胞仪可以对单细胞进行几十个通道的检测第一个24小时的重要线索“我们了解到，在手术后的第一个24小时，你会在血液中发现一些重要线索，这些线索为我们揭示了决定一个病人术后两周时状态的因素。”Martin Angst说，他是麻醉学教授、疼痛和手术期用药方面的专家，同时也是这项研究的共同通讯作者。图三、 Martin Angst教授这一发现可能会开创一个新型的个性化诊断方法——只需在术后检查病人少量血液样本，就可以预测他的恢复时间（斯坦福拥有相关方面的临时专利）。这种诊断可以帮助医生及早决定应该对哪位病人采用更优化的恢复方案，帮助病人告诉自己的亲人和老板大概的出院时间。充分理解研究中所发现的分子机制，可能会指导临床医生操纵免疫系统，从而让病人更快的恢复。“虽然每年超过2亿例的外科手术中绝大多数是小手术，”Angst说“但是，仅在美国，就有数以百万计的像髋关节置换术这样的大创伤手术，这些手术会引发患者显著的炎症反应。愈合与阻碍“炎症最初的爆发阶段对愈合过程非常关键，”Angst表示，“你需要释放这条‘猛龙’，但是你需要能够驾驭它。太多的炎症会导致恢复的延迟。”免疫系统的组件必须不断动态的调整自己的功能，以便加速而不是阻碍伤口的愈合。几年前，Angst参加了Nolan的一个讲座，讲座中介绍了质谱流式技术。它可以在单细胞上实现超过50种不同的表面和内部蛋白的同时测量，而标准的细胞分选流式通常最多能进行12-15个参数的测量。这个讲座促成了Angst和Nolan之间的合作，博后Brice Gaudilliere成为了他们合作的桥梁，他和Nolan的研究生Gabriela Fragiadakis一起成为本项研究的共同第一作者。图四、 Garry Nolan教授“质谱流式一次可以检测如此多的参数，这项特殊能力为研究人员提供了一个通向‘细胞灵魂’的窗口，”Nolan说，“我们不仅能识别免疫细胞的身份，还可以观察它的精神状态。”Nolan本人拥有Fluidigm公司的股权，这家公司生产了本研究中所用的质谱流式仪和相关试剂。该研究招募了32个没有其他疾病的患者，年龄大多是在50岁到80岁之间。他们都在斯坦福大学整形外科接受了初次全髋关节置换手术。研究组采集了他们的术前1小时、术后1小时、24小时、72小时以及术后4～6周的血液样本。这些样品在采集后被迅速送到Nolan的实验室进行质谱流式分析。在每个样本中大概分析了有近50万个细胞，这些细胞内外的35个蛋白的表达量都被精确检测。这些数据不但揭示了每个细胞的身份，还记录了隐藏在各个细胞内部的关键活动。图五、质谱流式技术可以实现对免疫细胞的精细分群在术后的六周内，患者每三天填写一次问卷调查，说明自己疼痛和疲劳的程度以及他们新髋关节功能恢复情况。瞄准关键指标斯坦福研究小组观察到手术后有一个“被精确协调的、细胞类型和时间特异的免疫反应模式”(Angst语)。该模式包括多种免疫细胞一连串协同的上升和下降过程，同时伴随着每种细胞内部的各种变化。“令人惊讶的是，这种手术后的表型出现在每一例病人中，” Angst说，“只是各类型细胞的数量和活性变化倍数各有不同。”有一个因素比较特别，手术后24小时与术后1小时之间，几个关键作用蛋白在一小群 “首先反应”的免疫细胞中的激活状态变化非常关键。这一因素关系到病人恢复过程中40%～60%的差异。这些“前线细胞”在手术后不久会显著增多，但和细胞内活动变化不同，其数量的增加与病人恢复时间的相关度并不强。图六、几个关键蛋白的激活状态和术后恢复呈现很强的相关性。在一个典型健康人血样中，这群细胞大约只占其白细胞总数的1～2 %，所以，使用低通量的检测技术时，它们内部的变化很容易被忽略掉。这项研究中观察到的相关性远强于以往所有关于炎症反应和临床康复关系方面的报道。这些研究一般只是监测了手术后不同时间点血液中各种分泌物的水平的变化或者不同细胞的转运情况。但是，这些研究缺乏同时观察众多参数的能力，因此无法知道在特定时间点是哪些免疫细胞正在向血液中分泌这些物质，或者此时其他类型的细胞都在干什么。预测恢复的可能途径“如果一个相关性只能解释恢复过程中百分之二甚至百分之十的差异，在临床上是可能不完全的相关，”Angst说，“而我们确凿的相关性则可能产生一个预测术后恢复的方法，这在临床中是非常有用的。”图七、利用血液检查预测术后恢复的方法有望用于临床虽然尚未证实，研究人员相信，这群活动模式与病人恢复过程最为相关的细胞群，是一个被称为“髓系抑制性细胞”的亚群，其他的研究显示它们对炎症具有抑制作用。这些细胞在癌症中起到负面作用，它们过度的活动似乎会抑制身体的免疫系统攻击肿瘤。但在手术后的背景下，他们的活动可能就是医生所希望的。现在，斯坦福的研究团队正打算看看他们是否能找出一个可以预测恢复速度的术前免疫特征。“如果我们能在术前预测病人恢复时间，”Gaudilliere说，“我们也许会看到病人受益于免疫系统的预先激活或者术前的各种干预措施，如物理治疗的等。它甚至可以帮助我们决定何时或是否应该对病人进行手术。”如果想要了解更多，请在电脑上登录东胜创新资料库网址下载学术pdf文档观看：http://s.oatos.com/hxsy3pClinical recovery fromsurgery correlates with single-cell mmunesignaturesBrice Gaudillière et al.

p 　　近日，福建医科大学质谱流式细胞仪采购项目拟采用单一来源采购方式进行采购。 /p p 　　据悉，质谱流式细胞仪主要用于对单个细胞的多参数分析(30个以上)，且通道间没有互相干扰。可对骨髓、外周血等复杂细胞群体的免疫表型、信号通路、细胞功能等方面进行全面、精细、深入的研究分析 可以应用于细胞生物学、分子生物学、免疫学、血液学、药物研发、临床诊断等方面的研究。 /p p 　　本次拟采购的质谱流式细胞仪主要用于临床肿瘤样本的免疫细胞亚群分析及新治疗靶点的筛选和鉴定。传统的基于荧光的流式细胞仪受到荧光基因发射光谱重叠等物理限制，所能检测的通道数量有限(不超过20个，一般少于12个)，无法满足对免疫细胞亚群的精细分析 由于不同通道的信号之间相互干扰(串色)，检测时需要计算和调节补偿，检测通道有限和串色问题所需的样本量大，无法达到对肿瘤组织浸润的免疫细胞亚群精细分析的需求。 /p p 　　质谱流式细胞仪利用金属元素作为检测的手段，实现对单个细胞的多参数分析且通道间没有相互干扰，所需样本量少，可对肿瘤组织、外周血等复杂细胞群体的免疫表型、信号通路、细胞功能等方面进行全面、精细、深入的研究分析。 /p p 　　该项目拟定的唯一供应商为Fuildigm公司。据了解，Fuildigm是全球唯一一家拥有质谱与流式细胞仪联用技术专利的公司，目前市场中尚无其他合适替代产品，因此该项目“必须采用单一来源方式采购该设备”。 /p

• Q1总收入3279.4万美元，同比增长19%据公开信息表明，富鲁达的第一季度营收同比增长19%。由于COVID-19测试市场的不确定性，富鲁达下调了全年营收的预期。截至3月31日的三个月内，富鲁达公布的总收入为3279.4万美元，而去年同期为2761.7万美元，这一数字略超出了分析师平均预期的3200万美元。Q1收入产品收入 服务收入其他收入总收入2021年2472.8万美元628.6万美元178万美元3279.4万美元2020年1898.1万美元518.6万美元345万美元2761.7万美元增长率+30%+21%-49%+19%富鲁达第一季度产品收入相比于一年前的1898.1万美元增长了30%，达到2472.8万美元，而其服务收入则从518.6万美元上升至628.6万美元，增长约21%。其他收入（开发、许可证、特许权使用费和赠款收入）从345万美元下降49%，至178万美元。• 专注医疗决策工具，拟将“持久诊断业务”纳入核心组学研究工具业务富鲁达董事长兼CEO Chris Linthwaite在一份声明中表示：“富鲁达在本季度表现强劲，我们致力于将微流体和质谱流式细胞术特许经营转变为持久增长平台。但随着新冠疫苗接种量的增加，以及对COVID检测和相关收入减少，我们迫切需要在核心市场培育新的收入流和伙伴关系。”他认为，富鲁达传统市场的根本性变化将使其能够专注于下一代医疗决策工具，创造更高的经常性收入，并利用重要的潜在市场机会。早在今年2月份公布富鲁达第四季度和2020年全年盈利后，Chris Linthwaite表示，富鲁达设想在微流体技术驱动下的COVID-19测试之外，将“持久诊断业务”纳入核心组学研究工具业务。Chris Linthwaite说：“无论近期COVID测试市场的动态如何，最终大流行加速了我们的创新管道，使我们能够建立危机前我们所缺少的众多资产和能力。比如这一流行病加速了我们的创新活动，并从政府获得了非稀释性的资金赠款，以帮助为持久诊断产品业务的特许经营奠定基础。这些投资也将有利于我们的非诊断业务。”• 全新质谱流式平台、微流控技术设备陆续研发中Chris Linthwaite指出，公司正在开发全新“样本进结果出”(sample- to-answer)装置，该装置利用公司核心微流体技术进行PCR测试，该项目部分是由美国国立卫生研究院的快速加速诊断计划（National Institutes of Health (NIH)’s Rapid Acceleration of Diagnostics (RADx)）提供资金的。这款装置首先将在BioMark HD基因分析系统上运行，且富鲁达也会在美国国防高级研究计划局（Defense Advanced Research Projects Agency，DARPA）资助下开发新版本平台。预计新的装置将在未来几个月上市，而新版BioMark平台将在第四季度末预计推出之前，会有很快的早期准入计划。Fluidigm BioMarkTM HD基因分析系统（点击查看详细参数）同时，他指出，富鲁达下一代用于蛋白质组学研究的质谱流式平台也在研发进行中。他表示，公司将在未来几周内提供更多有关这方面的细节，并指出“该产品路线图的进展，包括早期访问用户的反馈，有助于我们下半年核心业务收入前景的改善。” Helios® 质谱流式细胞仪系统（点击查看详细参数）主要亮点回顾：与上一年相比，该公司在所有地区实现了增长。对公共教育市场的COVID-19测试主要提供微流体技术服务，并完成100万美元订单。在2021年第一季度末，共计144项临床试验正在使用Fluigm® 专有CyTOF® 技术（质谱流式细胞技术）。截至2021年第一季度末，涉及CyTOF技术的出版物和综述总计超过1500篇，其中105篇是针对成像质谱技术™ 。发表在著名的《自然通讯》杂志上的数据证明了CyTOF技术和成像型质谱流式系统在预测个体患者对肿瘤治疗的反应方面的潜力。

近日聚光科技（杭州）股份有限公司公布其及子公司获得的各项政府补助情况，自2022年1月1日至2022年5月18日累计收到资金共计人民币7489万元，其中增值税即征即退资金为4273万元，其他政府补助资金为3217万元。仪器信息网编辑注意到，聚光子公司杭州谱育科技发展有限公司（简称：谱育科技）共收到政府补助7笔，其中1项增值税即征即退的项目，关于研发技术补助的项目共3项，包括流式质谱细胞分析技术补助、首台套资金补助和色谱质谱联用技术补助，1项关于万人计划科技创业领军人才补贴，截至5.18日谱育科技共获政府补助5610.5万元。以下为具体情况：获得补助的主体提供补助的主体项目本期收到补助时间本期收到补助的金额补助类型会计处理杭州谱育 科技发展 有限公司国家税务总局 杭州市临安区 税务局增值税即征即退2022.01.01-2022. 05. 1823,906, 395. 77与收益相关其他 收益杭州谱育 科技发展 有限公司杭州市临安区 人力资源和社 会保障局临安区企业 自主引才政 策兑现2022.02.281,500,000.00与收益相关其他 收益杭州谱育 科技发展 有限公司浙江省科学技 术技术厅流式质谱细 胞分析技术 补助2022.03.291,140,000.00与收益相关其他 收益杭州谱育 科技发展 有限公司浙江省科学技 术厅万人计划科 技创业领军 人才补贴2022.04.24200,000.00与收益相关其他 收益杭州谱育 科技发展 有限公司杭州市临安区 经济和信息化 局2022年省工 业与信息化 发展首台套 资金补助2022.04.29625,000.00与收益相关其他 收益杭州谱育 科技发展 有限公司杭州市临安区 发现现代服务 业领导小组办 公室临安区标准 制定奖励2022.05.03200,000.00与收益相关其他 收益杭州谱育 科技发展 有限公司杭州市临安区 经济和信息化 局色谱质谱联 用技术补助2022.05.1718,280,000.00与收益相关其他 收益/ 递延 收益而聚光科技及其他子公司共获得政府补助7489万元，以下为具体情况：获得补助的主体提供补助的主 体项目本期收到补助 时间本期收到补助的 金额补助类型会计 处理聚光科技（杭州）股 份有限公 司国家税务总局 杭州市滨江区 税务局增值税即征即退2022.01.01-2022. 05. 1815,907, 631.21与收益相关其他 收益聚光科技 （杭州）股 份有限公 司杭州市人力资 源和社会保障 局稳岗补贴2022.01. 19266, 348. 88与收益相关其他 收益聚光科技 （杭州）股 份有限公 司浙江省财政厅高通量毛细 管电泳分析 系统的研制 及应用研究2022.02.251, 080, 000. 00与收益相关其他 收益/ 递延 收益聚光科技 （杭州）股 份有限公 司杭州市高新技 术产业开发区 人力资源和社 会保障局高新区博士 后进站科研 补助2022.04.261, 080, 000. 00与收益相关其他 收益聚光科技（杭州）股 份有限公 司杭州市高新技 术产业开发区 人力资源和社 会保障局杭州市博士 后进站科研 补助2022.04.27780, 000. 00与收益相关其他 收益聚光科技（杭州）股 份有限公 司浙江省经济和信息化厅浙江省装备 制造业首台（套）重大 技术装备保 险补偿2022.04. 12332, 000. 00与收益相关其他 收益杭州聚光 环保科技 有限公司国家税务总局 杭州市滨江区 税务局增值税即征即退2022.03. 11212, 389. 38与收益相关其他 收益杭州聚光 物联科技 有限公司杭州市科技局21研发费用投入补助2021.04.111,215,000.00与收益相关其他 收益杭州谱育 科技发展 有限公司国家税务总局 杭州市临安区 税务局增值税即征即退2022.01.01-2022. 05. 1823,906, 395. 77与收益相关其他 收益杭州谱育 科技发展 有限公司杭州市临安区 人力资源和社 会保障局临安区企业 自主引才政 策兑现2022.02.281,500,000.00与收益相关其他 收益杭州谱育 科技发展 有限公司浙江省科学技 术技术厅流式质谱细 胞分析技术 补助2022.03.291,140,000.00与收益相关其他 收益杭州谱育 科技发展 有限公司浙江省科学技 术厅万人计划科 技创业领军 人才补贴2022.04.24200,000.00与收益相关其他 收益杭州谱育 科技发展 有限公司杭州市临安区 经济和信息化 局2022年省工 业与信息化 发展首台套 资金补助2022.04.29625,000.00与收益相关其他 收益杭州谱育 科技发展 有限公司杭州市临安区 发现现代服务 业领导小组办 公室临安区标准 制定奖励2022.05.03200,000.00与收益相关其他 收益杭州谱育 科技发展 有限公司杭州市临安区 经济和信息化 局色谱质谱联 用技术补助2022.05.1718,280,000.00与收益相关其他 收益/ 递延 收益北京鑫佰 利科技发 展有限公 司北京市顺义区 科学技术委员 会高新补贴2022.03.18300,000.00与收益相关其他 收益补助对上市公司的影响上述政府补助将对公司经营业绩产生积极影响，预计对公司2021年度利润总额的影响为2844万元（已经在《2021年年度报告》中进行了披露）， 对公司2022年度利润总额的影响为4279万元，对以后年度利润总额的 影响为366万元。

近日，清华大学欧阳证教授课题组在analytical chemistry上发表了single-cell mass spectrometry analysis of metabolites facilitated by cell electro-migration and electroporation，且以acs editors' choice形式亮点报道。 文章介绍了基于细胞电迁移-电穿孔的单细胞质谱分析方法，该方法无需细胞高精度操控平台，仅通过对单细胞施加一定序列的电压，即可实现对单个酵母等具有细胞壁的细胞内代谢物的可控释放与质谱分析。 acs美国化学会报道： acs 编辑良择 | 基于细胞电迁移-电穿孔的单细胞质谱分析方法通讯作者：欧阳证，清华大学作者：zishuai li (李自帅)，zhengmao wang (王正茂)，junmin pan (潘俊敏)，xiaoxiao ma (马潇潇)，wenpeng zhang (张文鹏)，zheng ouyang (欧阳证) 单细胞分析对研究细胞在转录组学、蛋白组学以及代谢组学等方面的异质性有着重要的意义。目前，科学家们开发了大量的单细胞分析方法和技术，例如荧光分析法、微流控芯片、流式细胞仪、单细胞测序等。质谱分析，因其低样品消耗量、高灵敏度、高定量准确性等优势，已经被广泛应用于单细胞蛋白组学、脂质组学和代谢组学分析中。然而，目前大部分的单细胞质谱分析方法，都需要依托于高精度操作平台，这给单细胞分析技术的应用带来了一定的挑战。 清华大学欧阳证教授课题组报道了一种基于细胞电迁移-电穿孔的单细胞质谱分析方法。该方法无需细胞高精度操控平台，仅通过对单细胞施加一定序列的电压，即可实现对单个酵母等具有细胞壁的细胞内代谢物的可控释放与质谱分析。如图1所示，在硼玻璃纳喷管中加入适当体积(约0.5 μl)的细胞悬浮液(约104细胞/ml)，该溶液内平均只含有单个细胞。由于细胞表面通常带负电，通过非接触式电极对溶液施加直流负电压，使细胞迁移到纳喷管尖端，并在针尖处封闭一段超小体积(约1.5 pl)的液体。之后施加高压脉冲电压，在细胞膜表面形成电穿孔，细胞内代谢物即释放到前端的超小体积液体中，从而避免了细胞内代谢物的过度稀释。最后，采用非接触式电极加压，由纳升电喷雾离子化将该部分溶液离子化并进行质谱分析。图1. 基于细胞电迁移-电穿孔的单细胞质谱分析方法 该研究中，首先用酵母细胞进行了方法验证。如图2所示，从离子流热图中可以看出，施加脉冲电压后，在质荷比m/z 50到800的范围内出现了大量的代谢物离子信号。图2b-c中比较了施加脉冲电压前后的单细胞分析质谱图。通过精确质量对比、串级质谱分析等方法，该课题组在单个酵母细胞内检测到了71种代谢物。图3a-f展示了几种典型代谢物的串级质谱谱图。 图2. (a)质谱离子流热图。在5 s时刻施加了高压脉冲电压。(b)负离子模式。(c)正离子模式。 图3. 负离子模式下单酵母菌代谢产物典型的串级质谱谱图 (a) glu, (b) gsh, (c) amp, (d) adp, (e)atp, (f) udp-hex. 除了酵母细胞，该方法还可用于其他种类的具有细胞壁结构的单细胞菌类的高灵敏度质谱分析。图4展示了莱茵衣藻(chlamydomonas reinhardtti)、杜氏盐藻(dunaliella salina)、斜生栅藻(scenedesmus obliquus)、绿眼虫(euglena viridis)的单细胞分析质谱图。图4. 不同种类细胞的单细胞质谱谱图。从内向外依次为：莱茵衣藻，杜氏盐藻，斜生栅藻，绿眼虫。 此外，该课题组还研究了不同培养环境下，单个细胞内代谢物相对含量的变化情况。将两组莱茵衣藻细胞，分别在有/无光照条件下培养24小时，之后采用本方法进行单细胞内代谢物的质谱分析。单细胞质谱分析表明，在黑暗条件下，衣藻细胞内的卡尔文循环内的碳固定被终止，细胞内有氧呼吸强度下降，糖酵解代谢增强。此时，细胞的光合作用停止，细胞通过糖酵解分解糖类以提供基本的代谢需求，同时降低有氧呼吸强度以维持生存。图5. 黑暗条件下的莱茵衣藻单细胞内部分代谢物强度比值变化。 本研究的相关结果已发表在analytical chemistry，并以acs editors' choice形式亮点报道。该论文得到了国家自然科学基金项目的支持。 文章链接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.analchem.0c02147

一、项目编号：阳乐-YZ2021-002二、项目名称：宜春市袁州生态环境局挥发性有机物在线气相色谱质谱分析仪系统及运维服务采购项目三、中标（成交）信息：供应商名称：江西迈翰环保科技有限公司供应商联系人：焦彬供应商联系电话：0791-88356039供应商地址：江西省南昌市东湖区中大路 289 号中标（成交）金额（元）\（%）：2968000.00四、主要标的信息：名称品牌规格型号数量单价宜春市袁州生态环境局挥发性有机物在线气相色谱质谱分析仪系统及运维服务采购项目谱育科技、智翔宇EXPEC2000（规格MS型）等12968000.0五、评审专家名单：张欠涛（组长）,黄招光,万翔,付光辉,钟莉（业主评委）六、代理服务收费标准及金额：36648.00 元七、公告期限：自本公告发布之日起1个工作日。八、其他补充事宜：如对本结果有异议的，可自本公告期限届满之日起七个工作日内，以书面形式向采购人、采购代理机构提出质疑，逾期不再受理。九、凡对本次公告内容提出询问，请按以下方式联系：1.采购人信息名称：宜春市袁州生态环境局地址：宜春市袁州大厦7楼联系方式：189795397702.采购代理机构信息名称：江西省阳乐招标代理有限公司地址：江西省宜春市袁州区新康府街道馨苑社区办公楼2楼联系方式：158795020113.项目联系方式项目联系人：钟莉电话：18979539770