自动细菌涂布接种仪

金黄色葡萄球菌第二法涂布法中，1ml接种到三块平板是用一条玻璃涂布棒涂布就好还是同个样品不同平板也要更换涂布棒涂布，谢谢解答

一、细菌的分布： 微生物种类繁多，繁殖迅速，分布广泛，不论自然界的空气、土壤、水，生活中的食物、各种物体和器械表面，以及动物和人的皮肤粘膜、与外界相通的腔道中都广泛存在着数量极其庞大的各种微生物，其中以细菌、放线菌最多。因此，了解微生物在自然界及正常人体的分布，对于在医疗实践及某些科学实验中树立无菌观念有着重要的意义。 （一）空气中细菌的检查（设计性实验选题） （二）水中细菌的检查（设计性实验选题） （三）人体皮肤表面细菌的检查（设计性实验选题） 【附录】细菌菌落的计数方法 ①选择生长均匀，无片状菌苔生长的平皿观察。一般先用肉眼观察，用记号笔在平板底上进行点数（以免遗漏），然后再持放大镜检查有无遗漏的微小菌落。 ②如菌落多而密集，可用分区法或菌落计数器计数。分区法是用记号笔在平皿底部通过圆心做垂直线，分为http://www.bbioo.com/bio101/UploadFiles/200611/20061113123705956.gif四区，再分别选择菌落密集和稀疏的两个区，再做平分线，使每一小区为平皿面积的1／8 或1／16，然后再分别挑选菌落稀疏和密集的两小区 进行计数，所得数乘以8或16，即为该平皿的菌落总数。（图４-1） ③简易的菌落计数器是一块玻璃板上刻划有144个面积为1平方厘米的正方形小格。将长有菌落的培养皿放上，计算10个小方格内的菌落数，如为30个，则平均1小方格为3个菌落。若培养皿直径是9厘米，则半径为4.5厘米，整个培养皿上的菌数是3个×3.1416×（4.5）2=191个菌落。二、外界因素对细菌的影响微生物和外界环境有密切的关系，当外界环境适宜就能进行正常的新陈代谢生长繁殖；当外界环境条件发生巨大改变，可导致微生物的主要代谢活动发生障碍，生长停顿，甚至死亡。在医学上常用人工的方法造成对微生物不利的环境，来抑制或杀灭微生物，以达到消毒灭菌的目的。其方法大致可分为物理、化学和生物三大类。 （一）物理因素对细菌的影响 1、温度对细菌的影响2、紫外线杀菌试验 （二）化学因素对细菌的影响 化学消毒剂的杀菌作用（三）生物因素对细菌的影响 噬菌体的特异性裂解细菌试验 【材料】大肠杆菌、痢疾杆菌的肉汤培养物、痢疾杆菌噬菌体、普通肉汤、普通琼脂平板。 【方法】 （1）将琼脂平板划分成三等份，注明1、2、3。 （2）分别以接种环取菌后，在1、3处涂布痢疾杆菌，2处涂布大肠杆菌。http://www.bbioo.com/bio101/UploadFiles/200611/20061113123903343.gif（3）分别沾取一接种环的痢疾杆菌噬菌体加于1、2处中央，（注意不要交叉污染），另取一接种环的肉汤放于3处中央。 （4）置37℃孵育24小时后取出，观察噬菌斑出现的位置（见图4-2），并记录之。 （四）细菌对抗生素的敏感性试验---纸片扩散法 　　又称Bauer-Kirby法。是将干燥的浸有一定浓度抗菌药物的滤纸片放在已接种一定量某种细菌的琼脂平板上，经培养后，可在纸片周围出现无细菌生长区，称抑菌圈。测量抑菌圈的大小，即可判定该细菌对某种药物的敏感程度。体外药敏结果可作为病人治疗选用药物的参考。 【材料】金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌18～24小时培养物、普通琼脂平板、小镊子；含有青霉素、庆大霉素、红霉素、复合磺胺、链霉素等抗生素的干燥滤纸片。 【方法】 （1）将金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌培养物密集均匀地涂布整个平板。 （2）将含有抗生素药物的滤纸片用烧灼灭菌的镊子分别贴于平板表面，相互间应间隔一定距离。 （3）37℃培养24小时后，观察结果。 【结果】 根据药物纸片周围抑菌圈直径的大小来判断该菌对各种药物的敏感程度。判断标准见表4-1 （五）中草药对细菌的抑菌作用测定

微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一，微生物检验中常用的生化反应介绍如下： 　　一、糖酵解试验　　不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。　　试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力，培养物可呈弥散生长。本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。　　二、淀粉水解试验　　某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。　　试验方法：以18~24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1°C培养24~48h，或于20℃培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。　　淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。

[font=宋体, SimSun]涂布平板法是一种常用的微生物学实验技术，主要用于分离、纯化和计数微生物。以下是该方法的详细介绍：[/font] [font=宋体, SimSun][color=#021eaa][b]实验原理[/b][/color][/font] [font=宋体, SimSun]涂布平板法的基本原理是通过[b][color=#ab1942]将微生物悬液进行稀释，然后将稀释后的悬液均匀涂布在固体培养基表面。[/color][/b]这样，微生物在培养基上生长时能够形成单个菌落，从而实现微生物的分离和纯化。[/font] [font=宋体, SimSun][color=#021eaa][b]操作步骤[/b][/color][/font] [list][*] [font=宋体, SimSun]准备培养基：选择适当的固体培养基，如营养琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂等，按照说明书或实验要求配制并灭菌。待培养基冷却至适宜温度后，倒入无菌平板中，使培养基在平板底部均匀铺展。[/font] [/list][align=center] [/align][list][*][font=宋体, SimSun]稀释微生物悬液：取一定量的微生物悬液，用无菌生理盐水或其他适当的稀释液进行逐步稀释。通常需要进行10倍系列稀释，以获得不同浓度的微生物悬液。[/font][*][font=宋体, SimSun]涂布平板：取适量稀释后的微生物悬液，用无菌玻璃刮刀或涂布器均匀涂布在固体培养基表面。涂布时要保持手法的稳定性和一致性，以确保微生物在培养基上分布均匀。[/font][*] [font=宋体,SimSun]培养微生物：将涂布好的平板倒置放入恒温培养箱中，设置适当的温度和湿度条件进行培养。[b]培养时间根据微生物的种类和生长特性而定，一般需要24~48小时。[/b][/font] [/list] [font=宋体, SimSun][color=#021eaa][b]注意事项[/b][/color][/font] [list][*][font=宋体, SimSun]无菌操作：实验过程中要使用无菌器具和培养基，并在无菌工作台或超净工作台上进行操作，以避免微生物污染。[/font][*][font=宋体, SimSun]稀释倍数的选择：选择合适的稀释倍数是实现微生物分离和纯化的关键。稀释倍数过高可能导致微生物在培养基上无法形成菌落；稀释倍数过低则可能导致微生物在培养基上过度生长，形成菌落重叠。[/font][*] [font=宋体, SimSun]涂布技巧：[color=#ab1942][b]涂布时要保持手法的稳定性和一致性，涂布速度要适中，避免过快导致微生物分布不均或过慢导致培养基干燥。[/b][/color][/font] [/list] [font=宋体, SimSun][color=#021eaa][b]结果分析[/b][/color][/font] [font=宋体, SimSun]通过对涂布平板法得到的平板进行观察和计数，可以估算出原始微生物悬液中的微生物数量。观察平板上菌落的形态、大小和颜色等特征，可以初步判断微生物的种类和生长状态。[/font] [font=宋体, SimSun][color=#021eaa][b]稀释涂布平板法计数微生物的计算公式[/b][/color][/font] [font=宋体,SimSun]稀释涂布平板法是一种常用的微生物计数方法，通过对样品进行稀释并将稀释液均匀涂布于平板上，再根据平板上生长的菌落数量进行统计计算。在该方法中，每克样品中的菌株数可以通过以下公式计算得出：[color=#ab1942][b]菌株数 = （C ÷ V） × M。[/b][/color][/font] [font=宋体, SimSun]其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用稀释液的体积，M代表稀释倍数。通过这个公式，我们可以准确地根据实验结果计算出样品中微生物的数量，为微生物学研究和实验提供了重要的定量依据。[/font] [align=center] [/align][font=宋体, SimSun][color=#3daad6][b][size=17px]误区一——对平均菌落数的理解[/size][/b][/color][/font] [font=宋体,SimSun]在微生物实验中，对平均菌落数的理解至关重要，它反映了样品中微生物的数量，并直接影响到实验结果的准确性和可靠性。[b]在实验过程中，如果空白对照显示有菌生长，说明可能存在污染现象，即质控不在控，此时就不能简单地将所有实验得到的菌落数取平均值。[/b]相反，需要分析可能的污染原因并重新进行实验，以确保实验结果的可信度。[/font] [font=宋体, SimSun]另外，重复实验也是确保实验结果准确性的重要手段。通过在同一稀释度下涂布多个平板并统计菌落数的平均值，能够减小实验误差并提高数据可靠性。在重复实验中，如果某个平板的菌落数与其他平板相差较大，说明可能存在操作失误，这时应该舍弃该数据，并找出原因进行修正。[/font] [font=宋体, SimSun]在计算每克样品中某种菌株数量时，应只考虑符合该菌落特征的菌落数的平均值，避免将其他菌种形成的菌落数计入其中，以确保数据的准确性和可比性。深入理解平均菌落数的概念和正确运用相关原则，能够为微生物实验结果的可靠性提供保障。[/font] [font=宋体, SimSun][color=#3daad6][b][size=17px]误区二——对稀释倍数的判定[/size][/b][/color][/font] [font=宋体, SimSun]在微生物计数实验中，稀释倍数的合理设定对于确保有效活菌数的准确测定至关重要。稀释倍数过大会导致菌落数过少，可能引起计数误差过大；而稀释倍数过小会导致菌落数过多，使计数变得困难。因此，在选择稀释倍数时，需要根据待测样品中微生物数量的预估值来合理设定，以求得准确可靠的实验结果。[/font] [font=宋体, SimSun]举例来说，若测定土壤中细菌数量，[color=#ab1942][b]一般选择10[sup]4[/sup]、10[sup]5[/sup]和10[sup]6[/sup]倍稀释，因为土壤样品中细菌数量可能较为丰富；而测定放线菌数量时，一般选用10[sup]3[/sup]、10[sup]4[/sup]和10[sup]5[/sup]倍稀释，因为放线菌的数量相对较少[/b][/color]。对于真菌数量的测定，则一般选用10[sup]2[/sup]、10[sup]3[/sup]和10[sup]4[/sup]倍稀释。对于自来水中大肠杆菌数量的测定，一般不需要进行稀释，可以直接进行涂布培养。[/font] [font=宋体, SimSun]通过合理选择稀释倍数，可以使待测样品中微生物的数量落在适宜计数范围内，既能保证准确性又能提高实验的操作性。因此，对稀释倍数的判定不宜盲目一致，而应根据具体实验需要和待测微生物数量进行科学合理的设定，以确保微生物计数实验结果的可靠性和准确性。[/font] [font=宋体, SimSun][color=#3daad6][b][size=17px]误区三——对体积与质量的单位换算[/size][/b][/color][/font] [font=宋体, SimSun]在微生物计算中，涂布平板时所用的稀释液体积通常表示为V，一般为0.1mL（毫升）。[b]然而，当待测样品中微生物数量较少时，接种0.1mL稀释液到平板上培养后菌落数未达到30，这时可以考虑增大接种量，例如接种1mL稀释液，以增加菌落数的检测灵敏度。[/b][/font] [font=宋体, SimSun]在实验中，可以通过体积和质量的单位换算公式来进行计算，即体积 = 质量 / 密度(V = m / ρ)。水的密度为1g/cm3，因此质量为1g的水的体积为1cm3，也等于1mL。这意味着1cm3等于1000μL，1mL等于0.001L。通过这样的换算公式，可以方便地在体积和质量之间进行转换，确保实验中的计量单位正确无误。[/font] [font=宋体, SimSun]因此，在微生物实验中，正确理解和使用体积与质量的单位换算是确保实验数据准确性和可靠性的重要步骤。合理选择适宜的接种体积，可以提高微生物计数的准确度，从而获得更可靠的实验结果。[/font] [font=宋体, SimSun][color=#3daad6][b][size=17px]误区四——对统计误差的分析[/size][/b][/color][/font] [font=宋体, SimSun]从稀释涂布平板计数的原理来看，该方法统计的菌落数往往会低于活菌的实际数量，这主要是因为样品难以完全分散为单个细胞，当存在两个或多个活细胞连在一起时，在平板上观察到的只会形成一个菌落。[/font] [font=宋体, SimSun][b]在整个稀释涂布平板计数的过程中，稀释倍数的选择是否合适、涂布是否均匀、培养环境是否能够促进微生物正常生长，以及计数过程是否存在漏计或重复计数等情况，都会对实际统计结果产生影响。[/b][/font] [font=宋体, SimSun]除了以上因素外，还需要考虑到培养时间对菌落数的影响。菌落数目应该在一定时间间隔内进行统计，选择菌落数目相对稳定时的记录作为最终结果。这样能够避免因培养时间不足而导致漏计菌落的情况发生。[/font]

感受态是指细菌处于容易吸收外源DNA的状态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导人细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性]培养基[/url]中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp[sup]r[/sup]等)得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性[://]培养基[/url]上。重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其编码α肽链的DNA序列，此结构称为[i]lac[/i]Z'基因。[i]lac[/i]Z'基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段(146个氨基酸)。任何携带着[i]lac[/i]Z'基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的半乳糖苷酶，在IPTG(异丙基β—D—硫代半乳糖苷)诱导后，在含有Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷)的培养基平板上形成蓝色菌落（半乳糖苷酶能将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝）。而当有外源DNA片段插入到位于[i]lac[/i]Z'中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，也就不能分解Xgal而显蓝色，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。[仪器、材料与试剂](一) 仪器和材料 超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温箱、恒温水浴、离心管、试管、培养皿、锥形瓶、接种针、玻璃涂棒、酒精灯、镊子、牙签、大肠杆菌DH5a 、质粒(二) 试剂0.1mol／L CaCl2溶液 LB液体培养基 LB固体培养基 氨苄青霉素(Amp)：用无菌水配制成100mg／mL溶液，置—20℃冰箱保存。Xgal：将Xgal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg／mL，不需过滤灭菌，分装小包装，避光贮存于-20℃。IPTG：取2g IPTG溶于8mL双蒸水中，再用双蒸水补至10mL，用0.22um滤膜过滤除菌，每份1mL，贮存于-20℃。[实验步骤](一) 制备感受态细胞1、吸取15µl E.coil菌液，接种于20ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，待OD600=0.5左右将该菌悬液以1：50接种量转于50ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20-30min测一次OD600，至OD600=0.6左右，停止培养。2、培养液转入离心管中，在冰浴10min，4℃下5000rpm离心10min。3、弃上清液，用4ml冰预冷的0.1M CaCl2溶液轻轻悬浮菌体至均匀，冰上放置30min。4、4℃下5000rpm离心6min。5、弃上清液，用2ml冰预冷的0.1M CaCl2溶液轻轻悬浮菌体至均匀，冰上放置片刻后即制成感受态细胞悬液。6、以上制好的感受态细胞悬液可在冰上放置，24小时内直接用于转化实验，也可加入15%高压灭菌过的甘油，混匀后，分装于1.5ml离心管中，每管100µ l感受态细胞悬液，置-70℃条件下保存。.(二) 质粒DNA转化大肠杆菌1、取100µl摇匀后的感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作），加入5µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42 IPTG水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min。2、加入900µl LB液体培养基，则总体积约1ml，混匀于37℃振荡培养90分钟使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性Amp[sup]r[/sup]。3、在预制的LB琼脂平板上，加40uL 20mg／mL的Xgal和4uL 200mg／mL的IPTG溶液，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面，37℃倒置吸收。4、将恢复培养的菌体4000rpm离心5min，移去上层900µl LB培养基，用余下的100µl重悬菌体至均匀。(四) α互补现象的检查将重悬菌体均匀涂布于含X-gal+IPTG+氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养12—24h，出现菌落。其中白色菌落从理论上讲为重组克隆。如果进一步验证，可挑取多个白色菌落分别接种到1ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养6-8h，然后提取质粒酶切验证，或进行菌落PCR扩增鉴定。

FZ/T 01081-2009 热熔粘合衬热熔胶涂布量和涂布均匀性试验方法

请教前辈们一下，我用玻璃的涂布棒一直在平板上涂布不均匀，一样的板一个长菌一个就不长，还有其他的涂布方式吗

之前用接种胶囊，成本较高，用土壤或者废水做接种液也不太好掌控，可不可以用养鱼的硝化细菌呢？之前尝试过法国科迪的消化细菌，标样是做出来了，但是成本也高，如果尝试消化细菌可以把标样做出来，是不是就可以用硝化细菌？

麦氏比浊管是McFarland发明的一种用于微生物比浊的不同浊度的标准浊度管。具体的配制方法是根据硫酸和氯化钡的比例来定的，有表可查，这样不同比例生成的硫酸钡沉淀的浓度不同，且都有定值。 这是传统的麦氏比浊管的配制方法，目前也有市售的商品化产品，不需要自己配制，并且还有由乳胶粒子悬浮液制成的麦氏比浊管，与传统的麦氏比浊管相比，保存时间更长也更稳定。但麦氏比浊管具体应该怎么使用呢？ [b]操作方法[/b] 1、轻摇标准试管。 2、无菌操作将被测定的肉汤培养物加到与标准管相同直径（大小）的无菌试管中。 3、以无菌操作向被测定试管加入无菌生理盐水（NaCl），直到浓度与所要求的标准管的浓度相同。 4、直接用眼睛看（需要经验，误差较大）。 5、找张白纸，打上平行直线，然后观察读数（如图示，利用光在不同浓度液体折射不同）。 例如，需配大约100cfu/mL 的细菌菌液浓度： 1. 无菌操作用接种环挑取测试细菌的纯培养物到盛有一定量无菌生理盐水管中，混悬。 2. 以比色卡作为背景目测，直到浊度与0.5 麦氏比浊标准管的浊度相一致，如上图所示。 3. 0.5 号麦氏浊度标准管相当于1×108CFU/mL 浓度，以此为参照值，取1mL 浊度跟0.5 号麦氏浊度标准管相一致的菌悬液到9mL 无菌生理盐水管中，作10 倍梯度稀释107、106、105……，102 稀释度含菌量大约为100cfu/mL。 [color=#641111]注：1. 测试菌的纯培养物可以是冻干菌株复苏后纯培养物。[/color] [color=#641111] 2.本法仅供细菌液浓度的粗略计算。[/color] [b]注意事项：[/b] 1、如果测定的肉汤培养物不澄清，由培养物的值减去未接种培养基的值来校正细菌浓度。 2、如果肉汤颜色很深，把未接种试管放在标准管的后面读数即可。 3、测定好的细菌，最好做一下梯度稀释涂布计数。 4、此种方法测定的准确性不是很高，如果是对细菌数量要求较精确的，请用紫外分光光度计。 5、麦氏比浊液应放室温暗处保存，用前混匀，有效期为6个月。应用时为了准确也可以使用比浊仪但一定要防止麦氏浊度标准管未摇匀或已过期失效。 在微生物学检验中，[color=#641111]麦氏比浊法常作为细菌鉴定、实验配制菌液时大致判断菌液浓度的一种方法，[/color]通常认为，如将配菌液浓度配成0.5麦氏比浊管时，相当于1.0×108细菌数/ml，由于方法本身就是一种估计的方法，所以尽管不同细菌大小差异很大，但除了真菌孢子，细菌的差别不大，结果不会有影响。 [align=center][b]附孢子菌悬液制作方法：[/b][/align] [b]1. 菌种活化[/b] 将保藏菌接种在PDA斜面培养基试管中，培养7d～14d，使生成大量孢子。未制备孢子悬液时，不得拔去棉塞。每打开1支只供制备1次悬液，每次制备孢子悬液必须使用新培养的霉菌孢子。 [b]2. 孢子悬液制备[/b] 在上述PDA斜面培养基中加入少量无菌蒸馏水，用无菌接种环轻轻刮取表面的新鲜霉菌孢子，将孢子悬液置于250mL锥形瓶内，然后注入40mL洗脱液。 锥形瓶中加入直径5mm的玻璃珠10粒～15粒与孢子混合，具塞后置水浴振荡器中不断振荡使成团的孢子散开，然后用单层棉纱布过滤以除去菌丝。将其装入灭菌离心管中，用离心机分离沉淀孢子，去上清液。再加入40mL洗脱液，重复离心操作3次。制成浓度为(0.8～1.2)×106spores/mL的霉菌孢子悬液。若需要精确计数，则可以用改良察氏液体培养基稀释孢子悬液，用血球计数板计数。孢子悬液应在当天使用，若不在当天使用应在 3℃～7℃保存，并尽量在4d内使用。

[size=4] 我们对现今应用较为普遍的VITEK-AMS鉴定系统中报告“不能鉴定细菌”(UIO)菌株作了进一步分析，探讨其发生原因、处理方法，以期建立一套切实可行的仪器与手工方法相结合的细菌鉴定方法。[/size][size=4]　　[b]一、材料与方法[/b][/size][size=4]　　1. 仪器与试剂：VITEK-AMS 60型全自动细菌鉴定仪及其配套GNI、GPI、YBC试验卡（生物梅里埃公司产品)。[/size][size=4]　　2. 试验菌株：1 025株本院1999.10.21-2000.3.3临床标本分离的菌株进行了Vitek- AMS鉴定，其中应用GNI 卡631例、GPI卡334例、YBC卡60例。[/size][size=4]　　3.VITEK-AMS鉴定法：根据细菌表型特征，选择相应GNI+、GPI、YBC卡，严格按仪器操作说明进行，孵育后当检验地带网仪器报告结果为UIO时，挑取生长对照孔(GPI卡第1孔、GNI+卡第3孔、YBC卡第24孔)悬液于非选择性培养基上重新分离，观察是否纯培养，若是，分别按同法及以下两法鉴定。否则， 经纯培养后重新上机鉴定。[/size][size=4]　　4. 双歧检索鉴定法：根据Vitek全自动微生物分析系统技术资料提供的双歧检索表，依生化结果检索至属或种。[/size][size=4]　　5. 常规鉴定法：按照全国临床检验操作规程［1］进行，并经API系统(生物梅里埃公司) 复核鉴定至种。部分菌株鉴定依据文献［2］进行。 [/size][size=4]　　[b]二、结果[/b][/size][size=4]　　1. UIO发生机率：总共1025株细菌鉴定中，共出现UIO 44株，占4.3%。其中GPI卡334株，出现UIO16株，占4.8%；GNI+卡631株，出现UIO 24株，占3.8%；YBC卡60株，出现UIO4株，占6.7%。[/size][size=4]　　2.UIO发生原因：在44株出现UIO中，9株（0.9%)为待检细菌不纯，3株(0.3%)为浊度不合要求，2株(0.2%)为接种物孵育时间过长（超过48h），2株(0.2%)为超出试验卡鉴定范围（均为臭鼻克雷伯菌），1株(0.1%)为菌悬液不乳化（粘液型绿脓假单胞），其他如冲液时气泡过多，或其他原因不确定者27株（2.6%）。[/size][size=4]　　3.处理：（1）9株不纯菌株，经纯培养后，重新上机，均能成功鉴定。（2）35株纯培养但报告UIO菌株中，18株(1.8%)可通过双歧检索法获得结果，并与常规分类法结果完 全一致。3株（0.3%）浊度不合要求者经调整浊度后重新上机获得结果。 2株(0.2%)接种物超过48h菌株，经重新孵育后得以鉴定。1株(0.1%)为悬液不乳化菌株经|检验地带网|配制3个麦氏单位菌悬液，然后低速离心1～2 min(1 000r/min)，取上清液比浊并调节到所需的浓度后，得以鉴定。(3)余下11株(1.1%)菌中，仅2株(1株为大肠埃希菌，另1株为臭鼻克雷伯菌)不能从双歧检索表中查出结果，其他9株(主要为洋葱假单胞菌、琼氏不动杆菌、木糖产碱氧化杆菌等)，虽能从双歧检索表获得结果，但与常规鉴定法结果不相符合，或出现矛盾的生化结果，需增加试验项目，按常规鉴定方法及 API系统报告结果。[/size][size=4]　　[b]三、讨论[/b][/size][size=4]　　实验表明95.7%的临床分离菌株可通过VITEK-AMS正确鉴定，仅4.3%菌株无法一次性成功鉴定。细菌不纯是产生这部分菌株的主要原因（占近1/5），其他如待检菌菌龄、菌液浓度也是关系鉴定成败的关键。由于仪器本身原因（如对于罕见生物型、新种或不典型菌株无法鉴定）也不可忽视。正确处理这部分菌株，有重要的临床意义。实际应用自动化仪器时，必须挑取纯培养菌落，可提高鉴定率，对确认为纯培养而无法鉴定者，可通过传统分类法，参照双歧检索表能成功鉴定将近一半菌株，因此合理应用双歧检索表不失为一种较好的辅助方法。但仍有占总数1.1%菌株需用常规方法或其他方法如API系统重新鉴定。[/size][size=4]　　参考文献[/size][size=4]　　1，叶应妩，王毓三，主编. 全国临床检验操作规程. 第2版. 南京： 东南大学出版社,1997.5.[/size][size=4]　　2，Patrick R. Manual of clinical Microbiology (7th Edition). Washington DC: American Society for Microbiology, 1999.316-647. [/size]

一、灭菌1、 洗净两个250mL锥形瓶。（注：1提前准备好，以节约时间；2可开启培养箱37℃）2、 用滤纸称量1g蛋白胨、0.5gNaCl（也可直接加入到锥形瓶中称量，但是速度较慢，需防止过量），倒入锥形瓶中。3、 称量0.3g牛肉浸膏，用玻璃棒沾少许，滴加到锥形瓶中（因取量较少，所以玻璃棒不宜沾多，以防过量）。4、 加入100mL去离子水，稍加热溶解（注：1营养琼脂培养液需加热至沸腾使琼脂充分溶解；2此时，可开启高压灭菌锅开始预热升温，注意检查灭菌锅内水量。）5、 调pH至6.8±0.1，加入约15滴1mol*L-1 NaOH溶液（7-8滴）。6、 将营养汤锥形瓶包扎封口，放入高压灭菌锅中121摄氏度灭菌约15min，（A号控温不稳定），（注：做实验要求既好又快，合理安排时间，提前做好准备，计算好时间）。7、 灭菌结束后，迅速去除两瓶营养肉汤，放入超净台中冷却，待接种，（此时开启紫外灯灭菌。）二、接种1、 灭菌后的肉汤放入超净台中，约需1h冷却；2、 戴好口罩，用75%酒精喷洗手杀菌，坐于超净台前，点起酒精灯，从冰箱中拿出冷藏的菌种，对接种铂丝灭菌冷却接种，（提前开启培养箱，设定温度为37°C，振荡速度为100rpm）。3、 接种完毕，放入振荡培养箱中培养18-24h，（一般18h细菌活性最强，最适宜做实验，所以实验前需计算好时间。）（注：离开实验室时，注意再次查看振荡培养箱的温度，振荡是否都开启。）

[font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]（1）菌落长在一起有三种情况：[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]①平板上存在杂菌，杂菌污染造成菌落集中在一起；[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]②配制培养基时没有将样品混匀，使营养物质分布不均匀，导致菌落长在一块；[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]③稀释涂布平板法：在稀释涂布时，未能均匀涂布；平板划线法：划线太重，接种针的原菌种未能分散开来。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]（2）菌落和菌苔有什么区别？[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]①菌落：是由单个细菌细胞或一堆同种细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见的子细胞群落。菌落形态包括菌落的大小、形状、边缘、光泽、质地、颜色和透明程度等。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]②菌苔：是细菌在固体培养基接种线上由母细胞繁殖长成的一片密集的、具有一定形态结构特征的细菌群落，一般为大批菌落聚集而成。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]③菌落与菌台的区别：[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]菌落：圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起；在伊红美蓝琼脂平板上：深紫黑色、光滑、湿润、带有金属光泽的圆形菌落。[/color][/size][/font] [font=system-ui, -apple-system, &][size=16px][color=#333333]菌苔：边缘光滑整齐；表面较透明；显出鲜艳的颜色；显得湿润，易被接种环挑起。[/color][/size][/font]

接种方法1：划线法。 [img]https://picasso-static.xiaohongshu.com/fe-platform/89214fad0c95300ab58a96037fddafa0415d387e.png[/img]适用范围：用于菌种分离纯化，获得单菌落。 [img]https://picasso-static.xiaohongshu.com/fe-platform/ae143d3423b5af03ae6b63dc197872ec6a59a6ff.png[/img]操作方法：接种环蘸取少量待分离样品，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线合适的话，经培养后，可得到单菌落。 优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离。缺点：不能进行菌落计数。 接种方法2：涂布法。 [img]https://picasso-static.xiaohongshu.com/fe-platform/89214fad0c95300ab58a96037fddafa0415d387e.png[/img]适用范围：用于菌落计数。 [img]https://picasso-static.xiaohongshu.com/fe-platform/ae143d3423b5af03ae6b63dc197872ec6a59a6ff.png[/img]操作方法：先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，然后用无菌吸管吸取0.1mL菌液接种在已凝固的琼脂平板上。再用无菌涂布棒将菌液在平板上涂抹均匀，将涂布好的平板静置30min，使菌液渗透至培养基内，然后将平板倒转，过夜培养，至长出菌落后即可计数。 优点：可以计数，观察菌落特征。缺点：接种前需梯度稀释，吸收量较少，操作繁琐，平板不干燥效果不好，容易蔓延。 接种方法3：倾倒法。 [img]https://picasso-static.xiaohongshu.com/fe-platform/89214fad0c95300ab58a96037fddafa0415d387e.png[/img]适用范围：用于菌落计数。 [img]https://picasso-static.xiaohongshu.com/fe-platform/ae143d3423b5af03ae6b63dc197872ec6a59a6ff.png[/img]操作方法：吸取1mL菌液加入平板中，倒入已融化并冷却至45~50℃的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，过夜培养，至长出菌落后即可计数。 优点：可以计数，较方便。缺点：接种前需梯度稀释，不能观察菌落特征。 接种方法4：斜面法。 [img]https://picasso-static.xiaohongshu.com/fe-platform/89214fad0c95300ab58a96037fddafa0415d387e.png[/img]适用范围：用于菌种保藏。 [img]https://picasso-static.xiaohongshu.com/fe-platform/ae143d3423b5af03ae6b63dc197872ec6a59a6ff.png[/img]操作方法：用接种环或接种针伸入菌种管内，挑取适量菌落。伸入斜面培养管内，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上蜿蜒划线，或直接自下而上地蜿蜒划线。接种完成之后，用火焰灭菌培养管口，并塞上棉塞，适温培养。 接种方法5：液体培养基法。 [img]https://picasso-static.xiaohongshu.com/fe-platform/89214fad0c95300ab58a96037fddafa0415d387e.png[/img]适用范围：用于菌液比浊实验。 [img]https://picasso-static.xiaohongshu.com/fe-platform/ae143d3423b5af03ae6b63dc197872ec6a59a6ff.png[/img]操作方法：用无菌接种环挑取菌落或标本，在试管内壁与液面交界处轻轻研磨，使细菌均匀得散落在液体培养基中进行适温培养。 接种方法6：螺旋法。 [img]https://picasso-static.xiaohongshu.com/fe-platform/89214fad0c95300ab58a96037fddafa0415d387e.png[/img]适用范围：用于菌落计数。 [img]https://picasso-static.xiaohongshu.com/fe-platform/ae143d3423b5af03ae6b63dc197872ec6a59a6ff.png[/img]操作方法：对数减少的样品容量以阿基米德螺旋线的形式被自动分注在旋转式培养基表面。培养基上每一点的容量可以被知晓和校准。菌液的浓度可以通过培养皿上一定区域的菌落数量除以同区域样品分注量来计算。 优点：菌液无需稀释，自动化接种，效率高，可节省实验耗材和时间。缺点：实验成本较高，适用于样品量较大的实验。

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请问各位，涂布器是什么样子啊？我们要做薄层色谱，要铺板，想买涂布器，又不知道涂布器什么样子？谁有涂布器的图片，发张来看看，感激感激！！

微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一,微生物检验中常用的生化反应介绍如下：一、糖酵解试验　　不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。　　试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力，培养物可呈弥散生长。本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。

问:分离的细菌如何鉴定?答:细菌的传统鉴定 1. 形态特征及染色结果 ①革兰氏染色 ②鞭毛染色 ③荚膜染色 ④细胞壁染色（NaCl法：1.取1d25%NaCl溶液于洁净的载玻片上。2.挑一环培养6h的细菌在25%的NaCl中涂匀，自然凉干。3.滴加0.01%的结晶紫于其上，30s后水洗干燥，油镜观察。） ⑤抗酸染色 2. 培养特征观察取菌龄24-28h的菌3.6接种于PDA平板，PDA斜面，营养肉汤中培养24h，进行琼脂柱，明胶穿刺培养，30℃培养24h。 3. 生理生化实验需氧性测定和运动性测定：将斜面培养24h的待测菌用接种针穿刺到培养基管底，3d后观察变化。如果菌落沿培养基表面生长，表明为好氧菌，反应为阳性，如果菌落沿穿刺线生长，反应为阴性。培养基成分：蛋白胨0.2g，NaCl0.5g，K2HPO40.2g，琼脂0.5-0.6g，葡萄糖1.0g，水100ml。 4. 生长温度测定在肉汤培养基（外加1%葡萄糖）中用接种针接种，在恒温水浴锅中不同温度下（[c

http://img.ycwb.com/news/attachement/jpg/site2/20101030/90fba60187190e35b72d07.jpg 济南市中心医院病原微生物学实验室培养皿中的细菌济南市中心医院是卫生部确定的全国19个超级细菌监测哨点医院之一。其病原微生物学实验室肩负着监测超级细菌的重任。检测超级细菌需要经过四道程序：工作人员首先将从临床患者感染部位提取的样本放在培养基上接种，然后再送入二氧化碳培养柜中进行18-24个小时的培养。培养出细菌后，进行细菌鉴定和药物敏感性试验，如果发现疑似耐药性反应，就会将其送到“临床基因扩增检验实验室”做基因分析，最快两三天就可以确认是否是超级细菌。

请问哪位过菌种的接种呢？有没有相关的标准啊我是要来做质控的，谢谢

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请大侠帮忙分析一下。在做胶粘剂涂布量测试时数据重复性极差，使用两根不同的丝棒数据竟然会差不多，请教哪些因素会影响涂布量？应该如何控制

请问薄层涂布器哪家好,其价格大约多少

25%苯基-75%甲基聚硅氧烷为固定液，涂布浓度为20%的填充柱，这里的20%是指“25%苯基-75%甲基聚硅氧烷”吧？另外80%是什么？然后“25%苯基-75%甲基聚硅氧烷”这里面的25%的苯基和75%的甲基聚硅氧烷是分别配好再混合还是一起配的，这个用什么溶的？

关于涂布纸挺度的单位，挺度的单位有g.cm，mN,mN.m，请问一下它们之间是怎样换算的？还有挺度有纵横两个方向，分另是CD/MD表示，请问CD表示横向，而MD表示纵向吗？

微生物接种和菌种保藏注意事项下列各方法可根据实验室具体条件与需要选做。 (一) 液体石蜡保藏法 1.液体石蜡灭菌 在250mL三角烧瓶中装入100mL液体石蜡，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，12l℃湿热灭菌30min，然后于40℃温箱中放置l4d(或置于105～110℃烘箱中lh)，以除去石蜡中的水分，备用。 2.接种培养 同斜面传代保藏法。 3.加液体石蜡 用无菌滴管吸取液体石蜡以无菌操作加到已长好的菌种斜面上，加入量以高出斜面顶端约1cm为宜。 4.保藏 棉塞外包牛皮纸，将试管直立放置于4℃冰箱中保存。利用这种保藏方法，霉菌、放线菌、有芽孢细菌可保藏2年左右，酵母菌可保藏1～2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。 5.恢复培养 用接种环从液体石蜡下挑取少量菌种，在试管壁上轻靠几下，尽量使油滴净，再接种于新鲜培养基中培养。由于菌体表面粘有液体石蜡，生长较慢且有粘性，故一般须转接2次才能获得良好菌种。 (二) 冷冻干燥保藏法 1.准备安瓿管 选用内径5mm，长10.5cm的硬质玻璃试管，用10%HCl浸泡8～10h后用自来水冲洗多次，最后用去离子水洗1～2次，烘干，将印有菌名和接种日期的标签放人安瓿管内，有字的一面朝向管壁。管口加棉塞，121℃灭菌30min。 2.制备脱脂牛奶 将脱脂奶粉配成20%乳液，然后分装，121℃灭菌30min，并作无菌试验。 3.准备菌种 选用无污染的纯菌种，培养时间，一般细菌为24～48h，酵母菌为3d，放线菌与丝状真菌7～10d。 4.制备菌液及分装 吸取3mL无菌牛奶直接加入斜面菌种管中，用接种环轻轻搅动菌落，再用手摇动试管，制成均匀的细胞或孢子悬液。用无菌长滴管将菌液分装于安瓿管底部，每管装0.2mL。 5.预冻 将安瓿管外的棉花剪去并将棉塞向里推至离管口约15mm处(图24—2A)，再通过乳胶管把安瓶管连接于总管的侧管上，总管则通过厚壁橡皮管及三通短管与真空表及干燥瓶、真空泵相连接(图24—1)，并将所有安瓶管浸入装有干冰和95%乙醇的预冷槽中，(此时槽内温度可达-40～-50℃)，只需冷冻1h左右，即可使悬液冻结成固体。 6.真空干燥 完成预冻后，升高总管使安瓿管仅底部与冰面接触，(此处温度约-10℃)，以保持安韶管内的悬液仍呈固体状态。开启真空泵后，应在5～15min内使真空度达66.7Pa以下，使被冻结的悬液开始升华，当真空度达到26.7～13.3Pa时，冻结样品逐渐被干燥成白色片状，此时使安瓿管脱离冰浴，在室温下(25~30℃)继续干燥(管内温度不超过30C)，升温可加速样品中残余水分的蒸发。总干燥时间应根据安瓿管的数量，悬浮液装量及保持剂性质来定，一般3~4h即可。 7.封口样品 干燥后继续抽真空达1.33Pa时，在安瓿管棉塞的稍下部位用酒精喷灯火焰灼烧，拉成细颈并熔封(图24-2B、C)，然后置4℃冰箱内保藏。 8.恢复培养 用75%乙醇消毒安瓿管外壁后，在火焰上烧热安瓿管上部，然后将无菌水滴在烧热处，使管壁出现裂缝，放置片刻，让空气从裂缝中缓慢进入管内后，将裂口端敲断，这样可防止再用无菌的长颈滴管吸取菌液至合适培养基中，放置在最适温度下培养。 冷冻干燥保藏法综合利用了各种有利于菌种保藏的因素(低温、干燥和缺氧等)，是目前最有效的菌种保藏方法之一。保存时间可长达10年以上。

我做一挥发油的含量测定，原来用0.25ID的石英毛细管柱（PEG涂布）做,现在用0.32ID的石英毛细管柱（PEG涂布）做,后者的峰面积是前者的近10倍,虽说与对照品比较含量均为合格,但二者峰面积相差这么大,如何解释?

同志们好，最近想买个手动薄层涂布器，自己铺板子用，但是一直找不到卖的地方，谁知道在哪儿可以买到啊，知道卖家的联系方式也好啊，着急用，谢谢各位！！

1．固体培养基标本或液体培养物划线接种到固体培养基表面后，单个细菌经分裂繁殖可形成一个肉眼可见的细菌集团，称为菌落（colony）。(1)菌落的形态特征：大小、形状（露滴状、圆形、菜花样、不规则等）、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白色、黑色、绿色、无色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等。据细菌菌落表面特征不同，可将菌落分为3型： ①光滑型菌落（S型菌落）：菌落表面光滑、湿润、边缘整齐，新分离的细菌大多呈光滑型菌落。②粗糙型菌落（R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皱纹或颗粒状，边缘大多不整齐。R型菌落多为S型细菌变异失去菌体表面多糖或蛋白质形成。R型细菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型细菌弱。但也有少数细菌新分离的毒力株就是R型，如炭疽孢杆菌、结核分枝菌等。③粘液型菌落（M型菌落）：菌落粘稠、有光泽、似水珠样。多见于厚荚膜或丰富粘液层的细菌、结核杆菌等。(2)菌落溶血特征：菌落溶血有下列3种情况。①α溶血：又称草绿色溶血，菌落周围培养基出现1~2mm的草绿色环，为高铁血红蛋白所致；②β溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；③γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化，红细胞没有溶解或缺损。(3)色素：有些细菌产生水溶性色素，使菌落和周围的培养基出现绿色、金黄色、白色、橙色、柠檬色等颜色，产生的色素有水溶性或脂溶性。(4)气味：某些细菌在培养基中生长繁殖后可产生特殊气味，如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦的臭味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、白色假丝酵母菌（酵母味）和放线菌（泥土味）等。

我找了好久才找到的资料，在这里和大家共同分享。一、大肠杆菌细菌是单细胞的原核生物。细菌细胞的结构有细胞壁、细胞膜、细胞质等。细菌无成型的细胞核，细胞壁由肽聚糖组成。由于细菌细胞壁结构不同，细菌可分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。革兰氏阳性菌细胞壁厚，无荚膜，多产生外毒素；革兰氏阴性菌细胞壁薄，有荚膜，多产生内毒素。革兰氏阳性菌对青霉素更为敏感。大肠杆菌是革兰氏阴性、异养兼性厌氧型肠道杆菌。在肠道中一般对人无害，但任何大肠杆菌进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌在基因工程技术中被广泛的应用，它的质粒是最常用的运载体，它也是基因工程中常用的受体细胞。二、培养基配置微生物生命活动过程中需要的化合物有碳源、氮源、生长因子、无机盐和水。有的化合物既是碳源又是氮源、能源。生长因子是微生物生长不可缺少的微量有机物，但不一定需要外界补充，有的微生物可以自身合成。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤：1．称量：准确称取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。配置LB固体培养基时还需加1g琼脂。2．溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。3．调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。4．灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1kg压力灭菌15min。5．倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。向培养皿中转移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。否则，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。三、灭菌和消毒1．无菌技术： ①对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒； ②将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌； ③为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰旁进行； ④避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。2．消毒方法： ①日常生活经常用到的是煮沸消毒法； ②对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法； ③对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用紫外线进行物理消毒； ④实验操作者的双手使用酒精进行消毒。3．灭菌方法： ①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法； ②培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅； ③表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。4．比较消毒和灭菌： 比较项 理化因素的作用强度 消灭微生物的数量 芽孢和孢子能否被消灭 消毒 较为温和 部分生活状态的微生物 不能 灭菌 强烈 全部微生物 能5．注意事项： ①实验中用的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易吸水，吸水后容易造成污染。灭菌后，通常在60～80℃烘箱中除去灭菌时的水分； ②物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气，其目的是有利于锅内温度升高，随后关闭排 气阀继续加热，加热结束切断热源后，要使温度自然降低，气压务必降至零时打开锅盖，其目的是防止容器中的液体暴沸； ③在用任何器皿转接时，瓶塞和封口膜只能夹在手上，不许放在台面上，接种时要在酒精灯火焰旁操作； ④培养基一定不能沾在三角瓶口、试管管口和培养皿壁上，否则容易污染； ⑤接种时要胆大心细，动作快捷，这是减少污染的关键； ⑥接种后，培养皿必须倒放（盖在下方）在恒温培养箱中，如正放则水蒸气在盖上凝成水滴，滴到接种后的培养基表面， 水流扩散会使菌落扩散，就很难形成单菌落了。四、细菌的分离1．划线分离法：用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线到最后，可使细菌间的距离加大。在培养10～20h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。其操作步骤是：将培养皿底部用拇指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 3～5条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线时，接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于恒温箱培养。取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。2．涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释到10－5 ～10－7之间，然后取0.1ml不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。细菌的两种分离法各有优点,都可采用。五、菌落和菌种种类的辨认单个细菌用肉眼是看不见的，但是，当单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，便会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。不同种类的细菌所形成的菌落在大小、形状、颜色、光泽度、透明度等方面具有一定的特征。细菌的菌落表面一般是光滑而湿润的，有黏稠性，多数透明或半透明，但也有细菌的菌落表面是干燥、有褶皱的；放线菌由于有纤细的菌丝并可产生孢子，所以菌落表面是紧密的绒状、坚实多皱，长孢子后就成粉末状，由于菌丝和孢子有多种色素，所以在菌落培养基底部和菌落表面都有不同的颜色，菌落不易用接种环挑动；酵母菌落类似于细菌菌落，表面光滑而湿润，有黏稠性但大多呈乳白色，少数呈红色。如果菌落无法辨认，只有借助于显微镜观察。在显微镜下细菌一般为杆状、球状和弧状，直径都在1um左右；放线菌菌丝是没有横隔的分枝丝状体，气生菌丝顶端分裂成串状孢子，孢子丝有直线形、螺旋状、弯曲式或轮生等；酵母有卵圆型或丝状，但卵圆形细胞大于细菌，直径约5~7um。