游离血红蛋白测试仪

1.氰化高铁血红蛋白HiCN测定法：除SHb外推荐参考方法，具有操作简单、显色快、结果稳定可靠、读取吸光度后可直接定值等优点。致命的弱点是氰-化钾(KCN)试剂有剧-毒，使用管理不当可造成公害。氰化高铁血红蛋白测定法操作(1)直接测定法①加转化液：试管内加5ml?HiCN转化液②采血与转化：取全血20μl，加到盛有转化液的试管底部，用上清液反复冲洗吸管3次，充分混合，静置5min。③测定：以符合WH0标准的分光光度计，波长540nm处，光径(比色杯内径)1.000cm，HiCN转化液或蒸馏水调零，测定吸光度(A)。④计算：根据样本的吸光度(A)直接计算出血红蛋白浓度(g/L)(A为测定管吸光度，44为毫摩尔消光系数，64458/1000为1mol/L Hb溶液中所含Hb克数，251为稀释倍数。)(2)HiCN标准液比色法测定HiCN参考液(50g/L、100g/L、150g/L、200g/L)，分别测得540nm处的吸光度，以参考液血红蛋白含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线或求出K值。①标准曲线绘制和K值计算②样本吸光度③通过标准曲线查出样本血红蛋白浓度，或用K值计算，血红蛋白浓度Hb(g/L)=K×A。 注意事项(1)HiCN贮存：转化液贮存在棕色有塞玻璃瓶中，不能贮存在塑料瓶中，否则会使CN-丢失，测定结果偏低。HiCN转化液在4℃保存一般可数月，不能在0℃以下保存，因为结冰可使高铁氰-化钾还原，试剂失效。(2)标本：异常血浆蛋白质、高脂血症、白细胞数超过30×109/L、脂滴等可产生浊度，干扰Hb测定。(3)HiCN转化液是一种低离子强度、pH近中性的溶液(7.2±0.2)。样本中白细胞过高或球蛋白异常增高时，HiCN比色液会出现浑浊。(4)氰-化钾试剂是剧，测定后的废液应收集于广口容器中，首先以水稀释废液(1:1)，再按每升上述稀释液加次氯酸钠35ml，充分混匀，敞开容器，放置15h以上，使CN-氧化成C02和N2挥发，或水解成C032-和NH4+，再排入下水道。废液不能直接与酸性溶液混合，因为氰化-钾遇酸可产生剧毒的氰氢酸气体。2.十二烷基-硫酸钠血红蛋白SDS测定法：具有操作简单、呈色稳定、准确性和精-确性符合要求、无公害等优点。但由于摩尔消光系数尚未最后确认，不能直接用吸光度计算Hb浓度，而且SDS试剂本身质量差异较大，会影响检测结果。3.HiN3最大吸收峰542nm，显色快，结果稳定。

在使用显微计数法不溶性微粒仪检测血红蛋白中的不溶性微粒时，可能会遇到一些挑战，这些问题可能会影响检测结果的准确性和可靠性。以下是用显微计数法不溶性微粒仪检测血红蛋白不溶性微粒时常遇到的问题。　　问题一：检测时样品的颗粒比较多　　当检测血红蛋白样品时发现颗粒较多，这可能是由于以下几种情况造成的：　　样品制备不当：如果样品没有经过充分的溶解或混合，可能会导致不均匀分布的颗粒被检测到。　　污染：样品可能在采集、储存或处理过程中受到了外界物质的污染。　　样品特性：血红蛋白本身在某些条件下可能会形成聚集体或沉淀物，尤其是在非生理环境下。　　解决办法：　　优化样品处理步骤：确保样品在测试前已按照标准程序进行了适当的处理，例如通过离心去除大颗粒，或者使用过滤器过滤掉不需要的大分子。　　避免污染：在所有操作过程中采取严格的无菌技术，避免外来杂质的引入。　　控制条件：保持样品在接近生理条件下的稳定性，如适当的温度、pH值等。　　问题二：检测的样品为血红蛋白时检测不出正确的结果　　当检测血红蛋白样品时无法获得正确结果，这可能是由于以下几个原因：　　仪器灵敏度不足：仪器可能无法准确检测到血红蛋白溶液中的微粒，特别是当微粒浓度较低时。　　样品干扰：血红蛋白样品中可能存在其他成分，这些成分可能会干扰测量结果。　　校准问题：仪器未定期校准，导致读数不准确。　　解决办法：　　选择合适的仪器：选用灵敏度更高的仪器，或者根据需要调整仪器的设置参数。　　样品预处理：通过适当的方法(如稀释或纯化)来减少样品中的干扰物质。　　定期校准：确保仪器处于最佳工作状态，定期进行校准和维护。　　通过以上方法，可以有效地解决在使用显微计数法不溶性微粒仪检测血红蛋白样品时遇到的一些常见问题，从而获得更加准确可靠的检测结果。需要注意的是，每次实验前后都应仔细清洗仪器并遵循标准化操作规程，以保证结果的一致性和有效性。

血红蛋白（Hb）变异，是一组由珠蛋白基因突变引起的常见遗传性变异，其特征是血红蛋白分子结构发生变化。迄今为止，已鉴定出1300多个变异体，其中，超过150个不稳定的Hb变异体被记录为引起不同严重程度的溶血性贫血的原因。对Hb变异体进一步的研究，可用于新生儿筛查、产前筛查… … 此外，许多研究表明Hb变异可能会对糖化血红蛋白（HbA1c）的测量产生干扰，因此，临床相关Hb变异体的鉴定和表征对于做出正确诊断至关重要。目前，高效液相色谱法（HPLC）和毛细管电泳（CE）是HbA1c测量和Hb分析的一线方法。近日，北京大学深圳医院检验科纪玲博士团队使用融智生物科技（青岛）有限公司的QuanTOF发现了一种新的Hb变种，即Hb辽宁，这是国内首次由MALDI-TOF MS鉴定出来的血红蛋白变异体。相关研究结果已经发表在Clin Chem Lab Med 2019上，论文题为“Detection of a novel hemoglobin variant Hb Liaoning by matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry”（https://doi.org/10.1515/cclm-2019-0300）。先证者是来自中国辽宁省的一名36岁汉族男子，被送往北京大学深圳医院进行例行健康检查。首先使用毛细管电泳（CE）分析仪测量HbA1c水平，该分析仪没有产生HbA1c值，非典型电生理图显示无明显异常峰值。电泳软件将配置文件识别为“非典型”，主要是由于存在额外的峰值。因此，研究人员假设Hb变异可能会干扰HbA1c分析。随后，使用高效液相色谱法（HPLC）、硼酸亲和力高效液相色谱法、免疫分析法和MALDI-TOF分析仪分别进一步定量HbA1c。其中，MALDI-TOF分析仪为融智生物科技（青岛）有限公司的新一代宽谱定量飞行时间质谱QuanTOF。 融智生物新一代宽谱定量飞行时间质谱平台QuanTOF HbA1c测试结果分别为：5.2％（33mmol/mol，高效液相色谱法），5.1％（32mmol/mol， 硼酸亲和力高效液相色谱法），4.9％（30mmol/ mol，免疫分析法）和4.9％（30mmol/mol， QuanTOF）。与从硼酸亲和力高效液相色谱法获得的结果比较，观察到高效液相色谱法（2.0％），免疫分析法（-3.9％）和QuanTOF（-3.9％）的可接受偏差（国家糖化血红蛋白标准化计划[NGSP]标准，偏差在±5.0％内）。高效液相色谱法的色谱图未显示变异体。然而，QuanTOF的质谱图显示出异常的Hb链（m/z=15,169.4），相对强度占总αHb的26.0％（图1B）。在谱图中还发现了正常的Hb链，包括αHb亚基（m/z=15,127.9），βHb亚基（m/z = 15,868.0）和糖化-βHb（m/z=16,030.0）（图1A，B）。 对照血红蛋白和Hb辽宁的MALDI-TOF质谱。（A）来自正常成人的对照血红蛋白和（B）来自先证者的Hb辽宁。分开的两个峰质量相差41.5Da，清楚地表明存在变异体α链（m/z=15,169.4）。箭头表示存在正常α链（m/z=15,127.9），正常β链（m/z=15,868.0）和糖化-βHb（m/z=16,030.0）。 使用毛细管电泳（CE）和离子交换高效液相色谱进行随后的Hb分析。令人惊讶的是，没有出现异常峰或非典型色谱图的迹象。研究人员随后进行Sanger测序以确认Hb变异体的存在以及性质。测序数据显示α2基因中存在新的杂合突变[α15（A13）（GGT GTT），Gly Val，HBA2：c.47 G T]，导致甘氨酸的编码转换（分子量：75.1 Da）在密码子15处的缬氨酸（分子量：117.1Da）。如图1B所示，从甘氨酸到缬氨酸（42.0Da）的取代诱导的相对分子量的变化也可以从αHb亚基和变异体Hb亚基（41.5Da）之间的m/z变化中找到。由于以前没有报道该变种，研究人员根据患者所在的地区将其命名为Hb辽宁。 Sanger测序的结果。 Sanger测序揭示了一种新的突变[α15(A13)(GGTGTT), GlyVal, HBA2:c.47 GT]。 为了确定患者与Hb辽宁相关的血液学特征，对其进行血液学数据测量显示，得到的血液学指标并没有发现贫血迹象，这表明患者非病理性Hb变异。Hb变异是溶血性贫血的原因之一，同时也是HbA1c测量中的分析干扰。在本研究的案例中，Hb辽宁没有显示出明显的临床表现。然而，该变异体在使用CE法的HbA1c测量中引起干扰。在以前的研究中，通常使用硼酸盐亲和HPLC方法作为比较方法，因为它无论Hb种类如何都测量总糖化血红蛋白，因而被认为不受大多数Hb变异体的影响。结果中提到的可接受的偏差表明Hb辽宁对高效液相色谱和QuanTOF的HbA1c测量没有显著影响。高效液相色谱法（HPLC）和毛细管电泳（CE）是HbA1c测量和Hb分析的一线方法。仅有有限的研究显示了MALDI-TOF MS在HbA1c测量中的应用。在目前的研究中，阳离子交换HPLC和电泳方法在检测Hb辽宁时面临挑战，因为电荷差异不明显且超出检测限。而MALDI-TOFMS能够通过m/z差异区分Hb辽宁。当然了，MALDI-TOF MS可能无法区分所有类型的Hb变异体，尤其是当m/z差异很小且超出仪器分辨率时。最后同样重要的是，鉴定Hb变异和识别HbA1c检测中的干扰是至关重要的，尤其是在Hb变异的高患病率区域。