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做专属性实验,比较两种洗脱方法的优劣,制定质量标准草案,完善现有标准,梯度按英国药典本品原料药的色谱条件进行,等度按本品制剂中国质量标准色谱条件进行,把样品破坏后,分别用等度与梯度洗脱,只是流动相与流速不同,其他色谱条件相同,各杂质峰用紫外扫描后,应该是同一峰吗?出峰个数、峰面积应该一样吗?
1 .梯度洗脱等于无限个等度洗脱http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/12/201512131829_577712_3047134_3.jpgfigure 1a所示,条件是60%B的等度洗脱,我们会发现,在色谱的前端,峰并没有很好地分离,而在色谱的尾端,虽然峰分离的很好,但峰变的很宽。如果降低B的比例,前面的峰的可以得到分离,而后端的峰宽将会变的更宽;如果提高B的比例,后端的峰可以快速流出,峰宽也会窄一些,但前端的峰会更加难以分离,所以,遇到这种情况,很难用等度洗脱得到很好的分离。为什么会出现这种情况?通过计算,发现1a中样品的保留因子范围是0.934(34/0.9 ≈ 38),样品的极性差别很大,而通常等度洗脱的保留因子范围是120(20/1=20), 1a中保留因子的范围38远远大于20,所以是不适合用等度洗脱的。figure 1b,梯度洗脱的条件是 50-100% in 5 min,会发现不论是前端还是后端,峰都得到了很好的分离,并且峰宽几乎是一样的Figure 1c做了一个试验,将figure 1中分析的15种物质分成了5组,每组都是等度洗脱,B的比例分别是49%,61%,72%,80%和88%,每组的保留因子大概都是k等于3,峰宽也几乎一样,是不是和figure 1b很相似?如果将c中的等度洗脱的条件叠加,就是一个梯度洗脱,也就是说梯度洗脱可以理解为是有无数个比例变化很小的等度洗脱的叠加。2.梯度洗脱的窄峰宽和等峰宽梯度洗脱的最大好处就是能够窄的峰宽,并且同一梯度内的峰宽都是一样的,为什么呢?http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/12/201512131830_577713_3047134_3.jpg如Figure 2b所示,梯度条件是 5-100% B ,梯度时间是20min,2a显示了梯度变化时,保留因子k(虚线)的变化以及峰宽(实线)的变化。在梯度开始时,有机相比例低,保留因子k最大,峰还停留在柱头,峰宽为0,随着有机相比例的增加,物质开始柱子内移动,有机相比例不断增加,k值也一直下降,物质在柱子中不断移动直到流出。峰1和峰2的保留时间虽然不一样,但其移动的模式是一样的,并且k的变化曲线也是一样的,所以在梯度洗脱条件下,其峰宽也是一样的。1梯度洗脱等于无限个等度洗脱figure 1a所示,条件是60%B的等度洗脱,我们会发现,在色谱的前端,峰并没有很好地分离,而在色谱的尾端,虽然峰分离的很好,但峰变的很宽。如果降低B的比例,前面的峰的可以得到分离,而后端的峰宽将会变的更宽;如果提高B的比例,后端的峰可以快速流出,峰宽也会窄一些,但前端的峰会更加难以分离,所以,遇到这种情况,很难用等度洗脱得到很好的分离。为什么会出现这种情况?通过计算,发现1a中样品的保留因子范围是0.934(34/0.9 ≈ 38),样品的极性差别很大,而通常等度洗脱的保留因子范围是120(20/1=20), 1a中保留因子的范围38远远大于20,所以是不适合用等度洗脱的。figure 1b,梯度洗脱的条件是 50-100% in 5 min,会发现不论是前端还是后端,峰都得到了很好的分离,并且峰宽几乎是一样的Figure 1c做了一个试验,将figure 1中分析的15种物质分成了5组,每组都是等度洗脱,B的比例分别是49%,61%,72%,80%和88%,每组的保留因子大概都是k等于3,峰宽也几乎一样,是不是和figure 1b很相似?如果将c中的等度洗脱的条件叠加,就是一个梯度洗脱,也就是说梯度洗脱可以理解为是有无数个比例变化很小的等度洗脱的叠加。2梯度洗脱的窄峰宽和等峰宽梯度洗脱的最大好处就是能够窄的峰宽,并且同一梯度内的峰宽都是一样的,为什么呢?如Figure 2b所示,梯度条件是 5-100% B ,梯度时间是20min,2a显示了梯度变化时,保留因子k(虚线)的变化以及峰宽(实线)的变化。在梯度开始时,有机相比例低,保留因子k最大,峰还停留在柱头,峰宽为0,随着有机相比例的增加,物质开始柱子内移动,有机相比例不断增加,k值也一直下降,物质在柱子中不断移动直到流出。峰1和峰2的保留时间虽然不一样,但其移动的模式是一样的,并且k的变化曲线也是一样的,所以在梯度洗脱条件下,其峰宽也是一样的。
2005年版中国药典中规定用梯度洗脱测三七药材中的含量.我在做此试验时,条件都按药典规定的设置完后,开始做的空白梯度挺好.当进第一针对照后出来的三个色谱峰也不错.可连续进第二针对照后,最后一个峰却没有在同样的保留时间内走出来.接着我又进第三针对照,可是还没有出峰.为什么会这样?究竟是什么原因呢?我设置的时长是75分钟.最后一个峰在65分钟左右出峰.请高手们多多指教.