[align=center][b]双光子激光扫描显微镜的检测模式及其在生物医学领域的应用[/b][/align][align=center][font=宋体]刘皎[/font][sup]1[/sup]，吴晶[sup]1[/sup][/align][align=center]1. [font=宋体]北京大学医药卫生分析中心，北京，[/font]100191[/align][b][font=黑体][[/font]摘要] [/b]双光子激光扫描显微镜（two-photon laser scan microscope, TPLSM[font=宋体]）具有低光毒性、高时空分辨率、高信噪比等优点，结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术，广泛应用于脑科学、免疫学、肿瘤、胚胎发育等生物医学相关研究领域。本文结合作者所在的北京大学医药卫生分析中心共聚焦平台的工作经验，概述了[/font]TPLSM适用的样本、检测模式以及在生物医学领域的应用，以期为相关科研技术人员提供参考。[b][font=&][Abstract][/font] [/b]Two-photon laser scan microscopy (TPLSM) has the advantages of low phototoxicity, high spatial and temporal resolution, and high signal-to-noise ratio.TPLSM combines laser scanning confocal microscopy with two-photon excitationtechnology and it is widely used in brain science, immunology, tumor, embryodevelopment and other biomedical related research fields. Based on the author'swork experience in the confocal center of Peking University Medical and HealthAnalysis Center, this paper summarizes the applicable samples, detection modesand applications of TPLSM in the biomedical field, in order to provide referencefor related scientific researchers and technicians.[b][font=黑体][[/font]关键词] [/b]显微镜双光子，检测模式，应用[b]1 引言[/b]双光子激发技术的基本原理是在高光子密度情况下，荧光分子可同时吸收2个长波长光子，产生一个一半波长光子去激发荧光分子的相同效果。双光子激光扫描显微镜（two-photon laser scan microscope, TPLSM[font=宋体]）在激光扫描共聚焦显微镜的基础上，以红外飞秒激光作为光源，长波长的近红外激光受散射影响小，易穿透标本，可深入组织内部非线性激发荧光，对细胞毒性小且具有高空间分辨率，适合生物样品的深层成像及活体样品的长时间观察成像[/font][1]。使用高能量锁模脉冲激光器，物镜焦点处的光子密度最高，在焦点平面上才有光漂白及光毒性，焦点外不损伤细胞。双光子效应只发生在焦点处，所以双光子显微镜无需共聚焦针孔，也能做到点激发点探测，提高了荧光检测效率[2]。[b][/b]双光子激光扫描显微镜显微镜可以通过XYZ，XYT，XYλ，XYZT，XYλT等多种模式实现多维成像，亦可进行更复杂实验的拍摄，比如二次谐波成像（Second Harmonic Generation Imaging,SHG[font=宋体]）、双光子荧光寿命成像（[/font]Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, TP-FLIM[font=宋体]）、荧光寿命[/font]-[font=宋体]荧光共振能量转移成像（[/font]FluorescenceLifetime - Fluorescence Resonance Energy Transfer Imaging, FLIM-FRET[font=宋体]）等实验以满足对样品的定性、定量、定位、共定位等多维度多功能的研究。[/font]TPLSM已成为生命科学各领域重要的研究工具，可在细胞及亚细胞水平对活体动物的神经细胞形态结构、离子浓度、细胞运动、分子相互作用等生理现象进行直接的长时间成像监测，还能进行光激活染及光损伤等光学操纵，广泛应用于脑科学、免疫学、肿瘤、胚胎发育等生物医学相关研究[3-5]。本文拟通过按TPLSM常见的检测模式分别阐述其在生物医学领域的应用，以其为相关科研技术人员提供参考。[b]2. TPLSM适用的样本[/b]TPLSM适用的样本非常广泛，从液体、固体等形式的材料或制剂、细菌、细胞、细胞团、类器官、组织切片、到各种模式动物（如线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠、兔、猴等）及其[font=宋体]脑、脊髓、肝脏、肺、皮肤等器官[/font]，都可以通过搭载不同载物台进行测试。相对于传统激光扫描共聚焦显微镜200μm的成像深度极限，双光子显微镜成像深度可达800μm，如果是透明化样品可更厚。TPLSM尤其适合活体动物成像，且比小动物荧光成像有更高的分辨率和信噪比，一般TPLSM的XY轴分辨率为200 nm左右，Z轴分辨率为300 nm左右。[b]3. TPLSM的检测模式[/b]3.1 二维成像模式TPLSM可以实现点扫描、点探测，得到生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像，从而获得细胞/组织等光学切片的物理、生物化学特性及变化。也可以对所感兴趣的区域进行准确的定性、定量及定位分析。激光扫描显微镜的zoom功能，可以用来调节扫描区域的放大倍数。但受物镜分辨率的限制，一味的增大zoom值，不能得到相应的高清图像，需根据实际情况参考piexl size进行设定。TPLSM可以实现XY、XZ或XT的二维成像模式，XT线扫会在后文与XYT时间序列成像一起进行举例说明（图2b）。3.2 三维成像模式3.2.1 Z轴序列三维成像（XYZ）[align=left]TPLSM可沿Z轴方向通过电动载物台的连续扫描对样品进行无损伤的光学切片（XYZ），获得三维立体图像。同理，通过沿Y轴方向连续扫描，可获得连续的XZY图像。如图1所示TPLSM[font=宋体]可以顺利观察到可以观察到血管清晰形态结构：单个胚胎的胎盘微血管（图[/font]1a）、肝脏血窦微血管（图1b）和后肢微血管（图1c）[6]。[/align][align=center][img=,690,230]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/12/202212151626576232_4807_3237657_3.png!w690x230.jpg[/img][/align][align=center]图1（a）胚胎胎盘微（b）肝脏血窦和（c）后肢的微血管三维成像[/align]3.2.2 时间序列扫描模式（XYT）[align=left]按照一定的时间间隔重复采集，则可实现对该样品的实时监测（XYT）。此类实验可观察组织区域内特异荧光探针标记的单个细胞或细胞内不同部位接受刺激后的整个变化过程。[font=宋体]如图[/font]2[font=宋体]（[/font]a[font=宋体]），可以根据微血管[/font]XYT[font=宋体]序列扫描的成像结果中某一血细胞在前后两张图的位置移动和这两帧图的扫描时间间隔计算血流速度。若血流速度很快，[/font]XYT扫描不足以捕捉实际流速，可以使用XT线扫计算。如图2（b），微血管XT扫描图像中绿色荧光背景里的黑色线条代表单个血细胞的流动轨迹，每条线条的横坐标代表血细胞移动的距离（distance / μm[font=宋体]），纵坐标代表此段时间（[/font]time/ ms[font=宋体]），根据这两个数据可以计算出单位时间内血细胞的流动速度（[/font]μm / ms）[6]。[/align][align=center][img=,690,262]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/12/202212151627102569_8367_3237657_3.png!w690x262.jpg[/img] [/align][align=center]图2 微血管（a）XYT扫描结果和（b）XT一维扫描结果图像计算血流说明示意图[/align]3.2.3 光谱扫描模式（XYλ/XYΛ）通常配置有可调节接受范围的检测器的TPLSM，可以实现从400nm-800nm的发射波谱扫描。通过配置具有连续可调波长的双光子激光器，还可以实现750nm-1300nm激发波谱扫描。这对于开发研制特殊染料探针的课题来说是很方便、全面的检测功能。3.3四维成像模式（XYZT/XYλT/XYΛT）基于上述三维成像模式，结合时间序列扫描，可以实现TPLSM的四维成像。3.4二次谐波成像（SHG）SHG是一个二阶非线性过程，且一般为非共振过程，适合富含胶原纤维的样本成像，如角膜、鼠尾肌腱、皮肤等。生物组织产生的二次谐波最主要的转换源自胶原，不同生物组织中的二次谐波信号强弱与组织中的胶原含量密切相关，含胶原丰富的组织包括结缔组织和肌肉组织等二次谐波信号也比较强，另外还有一些能产生强二次谐波的生物结构是微管，如细胞分裂中纺锤体。对于具有中心对称性的生物结构，如果局部中心对称性的破坏也会产生二次谐波：在两中心对称介质的界面，不同物态分子的相互作用使局部微观场特性在交界面（如细胞膜）发生突变，从而产生界面二次谐波[7]。除了动物组织外，一些含有特殊分子结构的植物组织也能产生二次谐波。二次谐波显微成像具有高空间分辨率、深成像深度、低损伤、以及对结构对称性的高度敏感性的特点，如果能与其他成像技术结合，将成为生物样品研究的有力工具[8]。3.5双光子荧光寿命成像（TP-FLIM）[9]FLIM技术是研究细胞内生命活动状态的一种非常可靠的方法。荧光寿命是荧光团在返回基态之前处于激发态的平均时间，是荧光团的固有性质，因此其不受探针浓度、激发光强度和光漂白效应等因素影响，且能区分荧光光谱非常接近的不同荧光团，故具有非常好的特异性和很高的灵敏度。此外，由于荧光分子的荧光寿命能十分灵敏地反映激发态分子与周围微环境的相互作用及能量转移，因此FLIM技术常被用来实现对微环境中许多生化参数的定量测量，如细胞中折射率、黏度、温度、pH值的分布和动力学变化等，这在生物医学研究中具有非常重要的意义。目前FLIM技术在细胞生物学中一些重要科学问题的研究、临床医学上一些重大疾病的诊断与治疗研究以及纳米材料的生物医学应用研究等方面均有广泛应用，并取得了许多利用传统的研究手段无法获取的数据。FLIM检测需要脉冲激光，TPLSM带有的高能量锁模脉冲激光器可以满足激发要求。3.6荧光寿命-荧光共振能量转移成像（FLIM-FRET）[10]传统的FRET过程分析通常是基于荧光强度成像来实现，分析的结果容易受光谱串扰的影响。而将FLIM技术应用于FRET过程分析，利用FLIM技术可定量测量这一优势，可非常灵敏地反映供体荧光分子与受体荧光分子之间的能量转移过程。当受体分子与供体之间的距离10nm时，供体的能量转移到受体，受体从基态发生能量跃迁，从而影响供体的荧光寿命。与没有受体分子的时候相比，发生FRET的供体分子的荧光寿命降低。因此，FRET-FLIM联合能够实时监测生物细胞中蛋白质的动态变化，如蛋白质折叠、分子间（蛋白-蛋白，蛋白-核酸）相互作用和细胞间信号分子传递、分子运输以及病理学研究等。[b]4 结论和展望[/b]综上，TPLSM应用灵活，具备多种检测模式，适用于多种样本，亦可实现多种实验目的，如荧光的定量、定性、定位、共定位，动态荧光的测定等。一些特殊的实验模式，将TPLSM在生物医学领域的应用进一步扩大。通过结合其他技术（多手段联合拓展，如膜片钳、原子力显微镜、光电联用等），TPLSM必将成为助力生物医学领域研究的有力工具。双光子荧光成像由于具有天生的三维层析能力以及深穿透能力，在活体生物组织成像上广受欢迎。双光子显微镜镜下空间增大后，可广泛应用于猴、大小鼠、兔等较大的模式动物的活体成像。且可结合电生理技术、光遗传技术，广泛应用于麻醉、清醒或运行行为等生理状态下的动物脑科学神经相关研究，在单细胞、单树突精度上对神经元群体活动进行监控。如结合膜片钳技术，对活体脑组组急性切片神经元进行双光子深层成像[11]；结合光遗传技术，实现视觉皮层同一神经元和神经元群体的稳定操控和长期多次重复记录[12]；对在健身球上移动的头部固定小鼠小脑进行成像，探讨觉醒状态和运动行为对胶质网络中钙离子的激发的影响[13]；结合多种疾病模型，探讨大脑皮层神经元及胶质细胞活性的改变及作用等[14]。随着多种双光子显微镜系统的出现，双光子显微镜成像技术将以其实时、无损地探测、诊断及检测能力，在生物医药及临床医学应用中发挥更大作用。[b]参考文献[/b][1] [font=宋体]李娟[/font],[font=宋体]张岚岚[/font],[font=宋体]吴珏珩[/font].[font=宋体]双光子显微镜的应用优势与维护要素[/font][J].[font=宋体]中国医学装备[/font],2021,18(12):158-163.[2] HendelT,Mank M, Schnell B,et al.Fluorescence changes of genetic calcium indicatorsand OGB1correlated with neural ac tivity and calcium in vivo and in vitro[J].JNeurosci, 2008,28(29):7399-7411.[3] DolginE.What leva lamps and vinaigrette can teach us about cellbiology[J].Nature,2018,555(7696):300-302.[4] Noguchi J,Nagaoka A, Watanabe S,et al.in vivo two-photon uncaging of glutamate revealingthe structure-function relatio nships of dendritic spines in the neocortex ofadult mice[J]. J Physiol,2011,589(Pt 10):2447-2457.[5] BishopD,Nikiél, Brinkoetter M,et al.Nearinfrared branding efficiently correlateslight and electron microscopy[J]. Nat Methods,2011,8(7):568-570.[6] [font=宋体]刘皎[/font],[font=宋体]丛馨[/font],[font=宋体]何其华[/font].[font=宋体]活体小鼠微血管血流倒置双光子激光扫描显微镜检测方法的建立[/font][J].解剖学报,2022,53(02):261-265.[7] [font=宋体]屈军乐[/font],[font=宋体]陈丹妮[/font],[font=宋体]杨建军[/font],[font=宋体]许改霞[/font],[font=宋体]林子扬[/font],[font=宋体]刘立新[/font],[font=宋体]牛憨笨[/font].[font=宋体]二次谐波成像及其在生物医学中的应用[/font][J].[font=宋体]深圳大学学报[/font],2006,(01):1-9.[8] [font=宋体]孙娅楠[/font],[font=宋体]赵静[/font],[font=宋体]李超华[/font],[font=宋体]等[/font].[font=宋体]二次谐波结合双光子荧光成像方法观察人源胶原蛋白透皮吸收情况[/font][J].激光生物学报,2017,26(1):24-29.[9] [font=宋体]刘雄波，林丹樱，吴茜茜，严伟，罗腾，杨志刚，屈军乐，荧光寿命显微成像技术及应用的最新研究进展。物理学报，[/font]2018,67（17）：178701-1-178701-14[10] [font=宋体]罗淋淋，牛敬敬，莫蓓莘，林丹樱，刘琳，荧光共振能量转移[/font]-荧光寿命显微成像（FRET-FLIM[font=宋体]）技术在生命科学研究中的应用进展。光谱学与光谱分析，[/font]2021,41（4）：1023-1031[11] Isom-BatzG,Zimmem PE.Collagen injection for female urinary incontinence after urethralor periurethral surgery[J].J Unol,2009,181(2):701-704.[12] JuN,Jiang R,Mrcknik SL,et al.Long-term all-optical interrogation of corticalneurons in awake-behaving nonhuman prim ates[J].LOSBiology,2018,16(8):e2005839.[13]Nimmerjahn A,Mukamel EA, Schnitzer MJ.Motor behavior activates Bergmann glialnetworks[J].Neuron,2009,62(3):400-412.[23] Huang L, Lafaille JJ, YangG.LearningDependent dendritic spine plasticity is impaired in spontaneousautoimmune encep halomyelitis[J].Dev Neurobiol,2021,81(5):736-745.[14] Huang L,Lafaille JJ,Yang G.LearningDependent dendritic spine plasticity is impaired inspontaneous autoimmune encep halomyelitis[J].Dev Neurobiol, 2021,81(5):736-745.
[align=center][font='times new roman'][size=16px][b]超高分辨[/b][/size][/font][font='times new roman'][size=16px][b]显微镜及其在生物医学领域的应用[/b][/size][/font][/align][align=center][font='times new roman'][size=14px]刘皎[/size][/font][font='times new roman'][sup][size=14px]1[/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=14px]，[/size][/font][font='times new roman'][sup][size=14px] [/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=14px]吴晶[/size][/font][font='times new roman'][sup][size=14px]1[/size][/sup][/font][/align][align=center]1. [font='times new roman']北京大学医药卫生分析中心，北京，[/font][font='times new roman']100191[/font][/align][font='times new roman'][b]摘要[/b][/font][font='times new roman'][b] [/b][/font][font='times new roman']超高分辨显微镜（[/font][font='times new roman']Super-Resolution Microscopy[/font][font='times new roman']）作为一类强大的科学工具，可以突破传统光学显微镜的分辨极限，实现对微小结构的高分辨率成像，已经在生物医学领域引起了广泛的关注和应用。本文将探讨超高分辨显微镜的不同类型和原理，介绍[/font][font='times new roman']其[/font][font='times new roman']在生物医学领域的应用[/font][font='times new roman']及展望其未来发展[/font][font='times new roman']。[/font][font='times new roman'][b]Abstract[/b][/font][font='times new roman']Super Resolution Microscopy[/font][font='times new roman'], as a powerful scientific tool, can break through the resolution limit of traditional optical microscopes and achieve high-resolution imaging of small structures. It has attracted widespread attention and application in the biomedical field. This article will explore the different types and principles of Super Resolution Microscopy, introduce their applications in the biomedical field, and look forward to their future development[/font][font='times new roman'].[/font][font='times new roman'][b]关键词[/b][/font][font='times new roman']超高分辨[/font][font='times new roman']显微镜，[/font][font='times new roman']成像技术[/font][font='times new roman']，应用[/font][font='times new roman'][b]1 [/b][/font][font='times new roman'][b]引言[/b][/font][font='times new roman']显微镜的产生和发展对于生命科学研究的进步有至关重要的作用[/font][font='times new roman']，它将微观世界呈现在大家面前，包括微生物的存在、组织细胞结构及生理病理活动等。显微镜技术的不断革新将成像分辨率不断提高，但相当长一段时间内光学成像无法突破一个极限值，即[/font][font='times new roman']xy[/font][font='times new roman']轴横向分辨率约[/font][font='times new roman']200nm[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']z[/font][font='times new roman']轴纵向分辨率约[/font][font='times new roman']500nm[/font][font='times new roman']，因此小于这个尺寸的生命活动和结构[/font][font='times new roman']，如病毒、亚细胞结构等，[/font][font='times new roman']是无法清楚地观察到的[/font][font='times new roman']。[/font][font='times new roman']聚焦点的光强会根据点扩散函数（[/font][font='times new roman']point spread functio[/font][font='times new roman']n[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']PSF[/font][font='times new roman']）而展开[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']对于圆形孔径，[/font][font='times new roman']PSF[/font][font='times new roman']呈现为艾里斑（[/font][font='times new roman']Airy disk[/font][font='times new roman']）的模式[/font][font='times new roman']。[/font][font='times new roman']激光扫描共聚焦显微镜（[/font][font='times new roman']Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM[/font][font='times new roman']）的分辨率取决于[/font][font='times new roman']PSF[/font][font='times new roman']的大小，如果焦点很小，则每个像素[/font][font='times new roman']点[/font][font='times new roman']获取到的信息也很小，从而得到清晰锐利的图像；反之，则结果图像变得模糊。因此，[/font][font='times new roman']CLSM[/font][font='times new roman']成像的[/font][font='times new roman']主要挑战在于实现越来越小的[/font][font='times new roman']PSF[/font][font='times new roman']以获得更好的分辨率。德国物理学家恩斯特[/font][font='times new roman'][/font][font='times new roman']阿贝（[/font][font='times new roman']Ernst Abbe[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']1840-1905[/font][font='times new roman']年）在[/font][font='times new roman']19[/font][font='times new roman']世纪[/font][font='times new roman']70[/font][font='times new roman']年代首次[/font][font='times new roman']提出阿贝衍射极限，即[/font][font='times new roman']由于衍射效应，[/font][font='times new roman']PSF[/font][font='times new roman']大[/font][font='times new roman']小与[/font][font='times new roman']λ/NA[/font][font='times new roman']成正比（[/font][font='times new roman']d=0.61λ/NA[/font][font='times new roman']），其中[/font][font='times new roman']λ[/font][font='times new roman']是光的波长，[/font][font='times new roman']NA[/font][font='times new roman']是物镜最重要的参数[/font][font='times new roman']——[/font][font='times new roman']数值孔径[/font][font='times new roman']。由于可见光波长范围在[/font][font='times new roman']400-760nm[/font][font='times new roman']之间，[/font][font='times new roman']NA[/font][font='times new roman']值最大在[/font][font='times new roman']1.7[/font][font='times new roman']左右，所以分辨率极限在[/font][font='times new roman']200nm[/font][font='times new roman']左右。随着物理学和测量技术的进步，突破衍射极限的显微镜不断涌现，目前公认的超高分辨显微镜主要有三类，包括[/font][font='times new roman']结构照明显微镜（[/font][font='times new roman']Structured Illumination Microscopy[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']SIM[/font][font='times new roman']）[/font][font='times new roman']，受激发射减耗显微镜（[/font][font='times new roman']Stimulated Emission Depletion Microscopy[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']STED[/font][font='times new roman']），和[/font][font='times new roman']单分子定位显微镜。单分子定位显微镜包括光敏定位显微镜（[/font][font='times new roman']Photoactivation Localization Microscopy[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']PALM[/font][font='times new roman']）和随机光学重建显微镜（[/font][font='times new roman']Stochastic Optical Reconstruction Microscopy[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']STORM[/font][font='times new roman']）[/font][font='times new roman']。[/font][font='times new roman']2014[/font][font='times new roman']年三位科学家[/font][font='times new roman']史蒂芬[/font][font='times new roman'][/font][font='times new roman']霍尔（[/font][font='times new roman']Stefan W. Hell[/font][font='times new roman']）[/font][font='times new roman']、埃里克[/font][font='times new roman'][/font][font='times new roman']贝兹（[/font][font='times new roman']Eric Betzig[/font][font='times new roman']）和威廉[/font][font='times new roman'][/font][font='times new roman']莫纳（[/font][font='times new roman']William E. Moerner[/font][font='times new roman']）因他们在超[/font][font='times new roman']高[/font][font='times new roman']分辨显微镜技术领域的贡献而获得了诺贝尔化学奖。[/font][font='times new roman'][b]2 [/b][/font][font='times new roman'][b]不同类型的超高分辨显微镜[/b][/font][font='times new roman'][b]2.1[/b][/font][font='times new roman'][b] [/b][/font][font='times new roman'][b]结构照明显微镜（[/b][/font][font='times new roman'][b]Structured Illumination Microscopy[/b][/font][font='times new roman'][b]，[/b][/font][font='times new roman'][b]SIM[/b][/font][font='times new roman'][b]）[/b][/font][font='times new roman']SIM[/font][font='times new roman']本质是利用两束激发光在样品上进行干涉，产生明暗交替的莫尔条纹，高空间频率的莫尔条纹会放大激发条纹与样品空间频率不一致的结构，从而将样品中的高频信息整合入收集到的图像中。[/font][font='times new roman']通过投射特殊的光照明模式如格点或条纹光栅，以一定的模式照射样品，引入空间频率信息，采集多个图像并经过复杂的数据处理之后，重建高分辨率图像。由于每个图像都采用不同的结构照明模式，包含了不同的信息，合并后的图像能够展示出比传统显微镜更多的细节[/font][font='times new roman']。[/font][font='times new roman']相比于其他超高分辨成像技术，[/font][font='times new roman']SIM[/font][font='times new roman']最大的优势就是宽场[/font][font='times new roman']成像，速度快，基本可以达到实时观察。[/font][font='times new roman']SIM[/font][font='times new roman']技术的前身可以追溯到[/font][font='times new roman']20[/font][font='times new roman']世纪[/font][font='times new roman']70[/font][font='times new roman']年代初。当时，光学学家特奥多尔[/font][font='times new roman'][/font][font='times new roman']赫普恩（[/font][font='times new roman']Theodor [/font][font='times new roman']H?upl[/font][font='times new roman']）首次提出了使用周期性光栅照明来提高显微镜分辨率的想法。这奠定了[/font][font='times new roman']SIM[/font][font='times new roman']技术的基础，尽管当时还没有实际的[/font][font='times new roman']SIM[/font][font='times new roman']显微镜。[/font][font='times new roman']21[/font][font='times new roman']世纪初期，史蒂芬[/font][font='times new roman'][/font][font='times new roman']霍尔（[/font][font='times new roman']Stefan W. Hell[/font][font='times new roman']）和埃里克[/font][font='times new roman'][/font][font='times new roman']贝兹（[/font][font='times new roman']Eric Betzig[/font][font='times new roman']）等科学家分别独立开发了[/font][font='times new roman']SIM[/font][font='times new roman']的现代版本。[/font][font='times new roman']SIM[/font][font='times new roman']技术开始广泛传播，吸引了生物学家和显微镜专家的关注。它被认为是一种相对低成本的[/font][font='times new roman']超高分辨[/font][font='times new roman']率成像方法，因为它不需要昂贵的激光设备或复杂的样品准备。[/font][font='times new roman'][b]2.2 [/b][/font][font='times new roman'][b]受激发射减耗[/b][/font][font='times new roman'][b]显微镜（[/b][/font][font='times new roman'][b]Stimulated Emission Depletion Microscopy[/b][/font][font='times new roman'][b]，[/b][/font][font='times new roman'][b]STED[/b][/font][font='times new roman'][b]）[/b][/font][font='times new roman']STED[/font][font='times new roman']技术的概念最早由斯德哥尔摩大学的斯蒂芬[/font][font='times new roman'][/font][font='times new roman']霍尔（[/font][font='times new roman']Stefan W. Hell[/font][font='times new roman']）提出。他的想法是通过将激发光束与一个特殊的抑制光束结合，从而实现对荧光标记物的光抑制，[/font][font='times new roman']通过受激辐射淬灭光斑外围的荧光分子，[/font][font='times new roman']使其在空间上变得更加紧凑，[/font][font='times new roman']减少[/font][font='times new roman']PSF[/font][font='times new roman']从而提高分辨率。[/font][font='times new roman']我们也叫“甜甜圈”技术。[/font][font='times new roman']STED[/font][font='times new roman']显微镜背后基本思想就是利用非线性光学设计一个低于阿贝衍射极限的更小[/font][font='times new roman']PSF[/font][font='times new roman']。[/font][font='times new roman']分辨率与[/font][font='times new roman']STED[/font][font='times new roman']光强有关，提高[/font][font='times new roman']STED[/font][font='times new roman']光的强度可以使荧光光斑焦[/font][font='times new roman']点中心直径趋于[/font][font='times new roman']0[/font][font='times new roman']，但是实际应用中，光损伤较大，[/font][font='times new roman']STED[/font][font='times new roman']光强不可能无限增加，顾[/font][font='times new roman']其分辨率[/font][font='times new roman']最高[/font][font='times new roman']可达到[/font][font='times new roman']3[/font][font='times new roman']0[/font][font='times new roman']nm[/font][font='times new roman']左右[/font][font='times new roman']。[/font][font='times new roman']目前的[/font][font='times new roman']STED[/font][font='times new roman']只能应用于较薄的组织器官或细胞，光毒性较强，成像厚度有限不太适合活体或活细胞长时间成像。[/font][font='times new roman']STED[/font][font='times new roman']光路较为复杂，对系统稳定性要求较高。[/font][font='times new roman'][b]2.3 [/b][/font][font='times new roman'][b]单分子定位显微镜[/b][/font][font='times new roman']单分子定位显微镜[/font][font='times new roman']中荧光标记的单个分子被分别激发和检测。单分子的中心可以以极高的精度确定从而实现高分辨率，包括光敏定位显微镜（[/font][font='times new roman']Photoactivation Localization Microscopy[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']PALM[/font][font='times new roman']）和随机光学重建显微镜（[/font][font='times new roman']Stochastic Optical Reconstruction Microscopy[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']STORM[/font][font='times new roman']）。[/font][font='times new roman']PALM[/font][font='times new roman']的历史可以追溯到[/font][font='times new roman']2006[/font][font='times new roman']年，由埃里克[/font][font='times new roman'][/font][font='times new roman']贝兹（[/font][font='times new roman']Eric Betzig[/font][font='times new roman']）和哈拉尔德[/font][font='times new roman'][/font][font='times new roman']赫斯（[/font][font='times new roman']Harald Hess[/font][font='times new roman']）提出了单分子定位这一概念。在[/font][font='times new roman']PALM[/font][font='times new roman']中，样品中的分子被标记上特定的荧光染料。这些染料可以通过光激活从一个基态转变到一个激发态，此过程可通过使用激活光（通常是紫外光）来实现。同期[/font][font='times new roman']STORM[/font][font='times new roman']的成像技术也发展起来，代表科学家是华人庄小威。[/font][font='times new roman']STORM[/font][font='times new roman']的工作原理与[/font][font='times new roman']PALM[/font][font='times new roman']类似，是通过特殊的分子标记和随机活性化，实现单分子定位进而实现超高分辨率成像。具有光激活能力的标记物通常在某种光照条件下会发光，但也会在某一时刻被随机地熄灭。这种随机光熄灭是[/font][font='times new roman']PALM[/font][font='times new roman']技术的关键，因为它允许在不同时间点捕获标记物的位置。通过记录标记物的位置，可以得到它们的坐标。这一过程需要在短时间内多次拍摄样品，以获得足够多的数据点。最后，通过将多个标记物的坐标叠加在一起，可以生成高分辨率的图像。这种以成像时间换取空间分辨率的形式，使得[/font][font='times new roman']PALM[/font][font='times new roman']或[/font][font='times new roman']STORM[/font][font='times new roman']的分辨率通常能够达到数十纳米。[/font][font='times new roman'][b]3 [/b][/font][font='times new roman'][b]应用领域和未来发展[/b][/font][font='times new roman']超高分辨显微镜可以探索微观世界的无限可能性，已经彻底改变了科学研究的方式。在细胞生物学领域，它被用于研究[/font][font='times new roman']亚细胞结构，如微丝、微管、肌动蛋白等，[/font][font='times new roman']细胞器[/font][font='times new roman']如线粒体、溶酶体等，[/font][font='times new roman']分子分布和细胞膜动态、观察蛋白质的相互作用；在神经科学领域，它可用于观察神经元的亚细胞结构和突触的细节，有助于解剖和理解神经系统的结构和功能，以及神经系统相关疾病的机制；在癌症研究领域，被用于研究癌细胞的特征、蛋白质分布以及肿瘤微环境，这对于癌症的早期诊断和治疗规划非常重要；在材料科学领域，它被用于研究纳米材料的结构和性质、帮助科学家精确控制和制备纳米结构；在药物研发领域，它可用于研究药物靶标蛋白的定位和与其他分子的相互作用，这对于药物设计和筛选非常重要[/font][font='times new roman']；在微生物领域，对于研究细菌[/font][font='times new roman']结构变化至关重要，规避了电子显微镜无法进行活体成像等弊端，可以更加推进微生物学发展。[/font][font='times new roman']当然，[/font][font='times new roman']超[/font][font='times new roman']高[/font][font='times new roman']分辨成像技术[/font][font='times new roman']也有一定的挑战。超高分辨成像技术[/font][font='times new roman']通常需要高度复杂的设备和精密的校准，这使得其设备成本相对较高，[/font][font='times new roman']再加上样本制备的困难，[/font][font='times new roman']限制了其广泛应用。[/font][font='times new roman']样品准备在超高分辨成像中具有重要作用，新的标记技术和荧光探针的发展将提高成像的灵敏度和特异性[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']开发更友好、无损伤的样品准备方法，以减少对样品的干扰[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']甚至[/font][font='times new roman']包括无标记成像技术以减少样品标记的需求。开源软件和自动化工作流程将使超高分辨成像技术更易于使用和共享，促进科学研究的进展。[/font][font='times new roman']超高分辨技术通常对于三维成像和大样本的深度成像有限制，需要克服分辨率和深度之间的权衡。[/font][font='times new roman']同时超高分辨[/font][font='times new roman']成像的时间分辨率还可以继续提升[/font][font='times new roman']。[/font][font='times new roman']虽然[/font][font='times new roman']目前[/font][font='times new roman']SIM[/font][font='times new roman']和[/font][font='times new roman']minflux[/font][font='times new roman']更适合[/font][font='times new roman']观察[/font][font='times new roman']活细胞[/font][font='times new roman']动态过程，但时间分辨率的提高仍然是一个挑战，特别是对于极短时间尺度的现象[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']这将使科学家能够更深入地探索微观世界，并获得更多信息。[/font][font='times new roman']随着技术的不断进步，[/font][font='times new roman']超高分辨[/font][font='times new roman']成像有望在[/font][font='times new roman']包括临床医学[/font][font='times new roman']等[/font][font='times new roman']更多领域得到广泛应用[/font][font='times new roman']，未[/font][font='times new roman']来如果能实现超高分辨的动物甚至人的[/font][font='times new roman']活体成像，减少样品固定和处理的需求，允许观察生物过程的实时发生[/font][font='times new roman']将会更有现实意义[/font][font='times new roman']。[/font][font='times new roman']并且在科学研究的需求下，[/font][font='times new roman']多模态[/font][font='times new roman']或多尺度[/font][font='times new roman']成像将[/font][font='times new roman']与[/font][font='times new roman']不同[/font][font='times new roman']的[/font][font='times new roman']超高分辨[/font][font='times new roman']技术相结合，[/font][font='times new roman']例如，结合光学成像和质谱成像[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']从分子水平到组织水平[/font][font='times new roman']提供[/font][font='times new roman']生命活动[/font][font='times new roman']更全面的信息。[/font][font='times new roman']也可以[/font][font='times new roman']发展高通量的样品处理和成像技术，以便更快速地获得大规模的数据。[/font][font='times new roman']超高分辨[/font][font='times new roman']成像生成的数据量巨大，处理和分析这些大数据需要强大的计算资源和高效的算法。数据存储和传输也是挑战。[/font][font='times new roman']超高分辨[/font][font='times new roman']成像数据可能受到噪声和伪迹的影响，这需要高级的图像处理技术来减少其影响，以获得准确的图像。数据分析通常需要复杂的算法和数学模型，需要专业知识和技能。对于某些应用，如神经科学中的活体成像，需要实时数据分析，这增加了挑战。深度学习和人工智能技术[/font][font='times new roman']有望[/font][font='times new roman']在数据分析中发挥越来越重要的作用，[/font][font='times new roman']实现[/font][font='times new roman']自动处理和解释图像数据。发展实时数据分析技术，使科学家能够在数据采集过程中获得及时反馈。开发更易用的高级图像处理工具，使非专业用户也能够进行数据分析。结合不同成像技术和数据源的信息，以提供更全面的信息。开发自动化和高通量的数据分析工作流程，以应对大规模数据的挑战。促进数据共享和开放科学，以促进合作和加速科学研究的进展。未来，随着计算能力的提高和新技术的引入，[/font][font='times new roman']超高分辨[/font][font='times new roman']成像数据分析将变得更加强大和高效。这将有助于更深入地理解微观世界，并在生物学、医学、材料科学等领域推动创新和发展。[/font][font='times new roman']总的来说，尽管[/font][font='times new roman']超高分辨[/font][font='times new roman']成像面临一些挑战，但其前景充满希望。未来的发展将使这一领域更加强大，有望在科学研究和实际应用中提供更多的机会和洞察力。[/font][font='times new roman'][b]4 [/b][/font][font='times new roman'][b]结论和展望[/b][/font][font='times new roman']超高分辨显微镜的成像原理基于破解传统显微镜的分辨极限，通过结构照明、图像重建[/font][font='times new roman']和单分子成像等策略，实现对微小结构的高分辨率成像。这一技术的应用领域包括生物学、材料科学、纳米技术和医学等，有望推动科学研究的进一步发展。超高分辨显微镜已经在生物医学领域取得了显著的突破，使研究人员更深入地理解细胞和分子结构。然而，仍然存在挑战，包括样品准备和数据分析的复杂性。未来，我们可以期待更多技术的发展，以进一步提高分辨率和扩大应用领域。[/font][font='times new roman']随着技术的不断发展，我们可以期待更多超分辨显微镜技术的突破，如更高分辨率、更高灵敏度和更快成像速度。超分辨显微镜的应用也将继续扩展到新的领域，如药物研发、个性化医学和环境科学。它将为我们提供更多工具来解决生物学的重要问题，如疾病机制、药物研发和生态系统健康。总之，超分辨显微镜技术的未来展望是光明的，它将继续推动科学研究向前迈进，揭示微观世界的微小奥秘，为改善生活质量和解决全球挑战做出贡献。这个领域的不断创新将激发更多科学家的热情，共同追求更深入的科学知识和更广泛的应用。[/font][font='times new roman'][b]参考文献[/b][/font][font='times new roman']Hell[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']S [/font][font='times new roman']W[/font][font='times new roman']．[/font][font='times new roman']Far-field[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']optical[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']nanoscopy[/font][font='times new roman'][J][/font][font='times new roman']．[/font][font='times new roman']Science[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']2007[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']316(5828)[/font][font='times new roman']：[/font][font='times new roman']1153-1158[/font][font='times new roman']Hell[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']S W[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']Wichmann J[/font][font='times new roman']．[/font][font='times new roman']Breaking[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']the diffraction[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']resolution[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']limit[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']by stimulated[/font][font='times new roman']-[/font][font='times new roman']emission[/font][font='times new roman']-[/font][font='times new roman']depletion fluorescence[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']microscopy[J][/font][font='times new roman']．[/font][font='times new roman']Optics[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']Letters[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']1994[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']19(11)[/font][font='times new roman']：[/font][font='times new roman']780-782[/font][font='times new roman']Dani A[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']Huang B[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']Bergan J[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']et[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']a1[/font][font='times new roman']．[/font][font='times new roman'] Super-resolution[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']imaging of chemical synapses[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']in the brain[J][/font][font='times new roman']．[/font][font='times new roman']Neuron[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']2010[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']68(5)[/font][font='times new roman']：[/font][font='times new roman']843[/font][font='times new roman']—[/font][font='times new roman']856[/font][font='times new roman']PATTERSON[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']G[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']DAVIDSON[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']M[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']MANLEY[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']S[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']et[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']al[/font][font='times new roman']. [/font][font='times new roman']Superresolution[/font][font='times new roman'] imaging using single-molecule localization[/font][font='times new roman'][J][/font][font='times new roman']．[/font][font='times new roman']A[/font][font='times new roman']nnual Review of Chemistry[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']2010[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']6[/font][font='times new roman']1:345-367[/font]
请提供书名及购买地址，此书详细讲述低温电镜技术在生物医学应用的教科书，包括样品制备技术，试验操作技术， 设备维修和维护技术。以下是参考书单，不知哪本合适。1.《生物显微镜原理与维修 》--------[罗必胜编著. ] [1997 ] 2.《生物医学电子显微镜技术 》--------[程时，彭学敏主编. ] [1997 ] 3.《生物电子显微镜观察与分析 》--------[陈柏林主编. ] [1997 ] (点击：210次) 4.《生物电子显微镜实验技术 》--------[曹汉民编著. ] [] (点击：61次) 5.《生物医学超微结构与电子显微镜技术 》--------[洪涛主编. ] [1980 ] (点击：49次) 6.《电子显微镜生物标本制备技术 》--------[黄立编. ] [1982 ] (点击：136次) 7.《生物学中的电子显微镜技术 》--------[朱丽霞等编著. ] [1983 ] (点击：57次) 7.《医学生物学电子显微镜图谱 》--------[中国医学科学院主编. ] [1978 ] (点击：59次)很感谢
以下内容来自网络，原文发表在2012年。序号11、 电子显微镜的类型和型号：透射电子显微镜Hitachi-75002、 所在单位和地址：重庆医科大学生命科学研究院，校本部图书馆四楼3、 联系电话：023 684858384、 相关资料（如网址）：http://sky.cqmu.edu.cn/web/read.php?wid=525、 是否对外服务：是6、 其他：330元/例（含样品制备、切片、观察及4张照片）序号21、电子显微镜的类型和型号：扫描电子显微镜S-3000N2、所在单位和地址：重庆医科大学生命科学研究院，校本部图书馆四楼3、联系电话：023 684858384、相关资料（如网址）：http://sky.cqmu.edu.cn/web/read.php?wid=535、是否对外服务：是6、其他信息：380元/例（含样品制备、喷金、观察及4张照片）序号31、 电子显微镜的类型和型号：透射电子显微镜 日立 H-7500（leica Uc6）2、 所在单位和地址：新乡医学院 实验楼A座 东配楼1楼南3、 联系电话：0373-30290154、 相关资料：切片刀是LEICA UC65、 是否对外服务：是6、 其他：150元/例,听说要涨到380元/例了。序号41、 电子显微镜的类型和型号：透射电镜一台（JEM-1010）2、 所在单位和地址：南京医科大学五台校区 1号楼149室 电镜室3、 联系电话：025-868620295、 是否对外服务：是6、 其他信息：检测项目：1.各种活体取材的组织样品的超薄切片及超微结构观察及超微病理学分析，包括实验动物和病人的组织样品。2.培养细胞的超薄切片及超微结构观察。3.细菌、病毒的超薄切片及超微结构观察。4.纳米材料的微细结构观察。5.材料科学中各种材料的微细结构观察。
[align=center][font='times new roman'][size=16px]激光扫描共聚焦显微镜的[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]检测[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]模式及其在生物医学领域的应用[/size][/font][/align][align=center][font='times new roman'][size=14px]吴晶[/size][/font][font='times new roman'][sup][size=14px]1[/size][/sup][/font][font='times new roman'][size=14px]，刘皎[/size][/font][font='times new roman'][sup][size=14px]1[/size][/sup][/font][font='times new roman'][sup][size=14px], *[/size][/sup][/font][/align][align=center]1. [font='times new roman']北京大学医药卫生分析中心，北京，100191[/font][/align][font='times new roman'][/font][align=center][font='times new roman'][size=13px]* [/size][/font][font='times new roman']通讯作者[/font][/align][font='times new roman']摘要[/font][font='times new roman']由于激光扫描共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）特有的分辨率和技术优势，使得其成为了生物学、医学及药学等领域重要的科研工具。本文结合[/font][font='times new roman']作[/font][font='times new roman']者所在的北京大学医药卫生分析中心共聚焦平台的工作经验，概述了CLSM适用的样本、[/font][font='times new roman']检测[/font][font='times new roman']模式以及在生物医学领域的应用，以期为相关科研技术人员提供参考。[/font][font='times new roman']A[/font][font='times new roman']bstract[/font][font='times new roman']Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) has become an important scientific research tool in the fields of biology, medicine and pharmacy due to its unique resolution and technical advantages. Based on the author's work experience in the confocal [/font][font='times new roman']center[/font][font='times new roman'] of Peking University Medical and Health Analysis Center, this paper summarizes the applicable samples, detection modes and applications of CLSM in the biomedical field, in order to provide reference for related scientific researchers and technicians.[/font][font='times new roman']关键词[/font][font='times new roman']激光扫描共聚焦显微镜，[/font][font='times new roman']检测[/font][font='times new roman']模式，应用[/font][font='times new roman']1 引言[/font][font='times new roman']从17世纪世界上第一台原始的光学显微镜问世以来，光学显微镜在20世纪经历了快速发展时期[1]。但由于普通的光学显微镜受光波衍射效应的限制，分辨率已接近理论极限值。因此，为改善成像质量，提高图像清晰度，从而提高显微镜的成像分辨率，人们采用增加物象与背景的反差来实现此目的[2]。激光扫描共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）的诞生，在一定程度上实现了这一目的。1984年，Bio-Rad公司首次推出世界第一台商品化的CLSM，从此CLSM迅速发展成为现代生物医学等领域科研的有力工具，广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域。[/font][font='times new roman']伴随着光学、计算机等技术的迅速发展，CLSM的分辨率甚至可以突破光学极限（0.2μm），达到0.05μm甚至0.02μm。与分辨率可以达到0.2nm的电子显微镜相比，CLSM的优势是既可以用于固定样品的拍摄，还可以用于活细胞实验，比如观察在特定刺激下细胞某个结构或者荧光强度的变化等。同时还可以通过XYZ[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']XYT[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']XYλ[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']XYZT[/font][font='times new roman']，[/font][font='times new roman']XYλT等多种模式实现多维成像，亦可进行更复杂实验的拍摄，比如荧光共振能量转移（[/font][font='times new roman']Fluorescence Resonance Energy Transfer, [/font][font='times new roman']FRET）,荧光漂白恢复（[/font][font='times new roman']Fluorecence Recovery After Photobleaching, [/font][font='times new roman']FRAP），荧光寿命成像（[/font][font='times new roman']Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, [/font][font='times new roman']FLIM）[/font][font='times new roman']，荧光相关光谱/荧光互相关光谱（Fluorescence Correlation/Co-Correlation Spectroscopy, [/font][font='times new roman']FCS[/font][font='times new roman']/FCCS）[/font][font='times new roman']等实验以满足对样品的定性、定量、定位、共定位等多维度多功能的研究。[/font][font='times new roman']本文拟通过按CLSM常见的[/font][font='times new roman']检测[/font][font='times new roman']模式分别阐述其在生物医学领域的应用，以其为相关科研技术人员提供参考。[/font]2. [font='times new roman']CLSM适用的样本[/font][font='times new roman']CLSM适用的样本非常广泛，从液体、固体等形式的材料或制剂、细菌、培养的粘附细胞、悬浮细胞、细胞团、类器官、各种染色、非染色荧光标记的组织或组织切片、到各种动物（如模式动物线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠等），都可以通过搭载不同载物台进行测试。所有的样品都可以通过匹配不同的器皿（包括共聚焦专用小皿、玻片、transwell小室、孔板等等）和固定器（比如不同热台、孔板支架等）放置到载物台上进行测试。[/font]3. [font='times new roman']CLSM的[/font][font='times new roman']检测[/font][font='times new roman']模式[/font]3.1 [font='times new roman']单一光切片模式（XY或XZ）[/font][font='times new roman']CLSM的最基本优势在于利用激光代替传统场光源，借助于激光扫描共聚焦显微镜的软件系统，CLSM可以实现点扫描、点探测，得到生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像，从而获得细胞/组织等光学切片的物理、生物化学特性及变化。也可以对所感兴趣的区域进行准确的定性、定量及定位分析。[/font][font='times new roman']CLSM特有的zoom功能，可以用来调节扫描区域的放大倍数。增加选定区域的zoom值，其图像会被放大。但zoom值会受吴晶分辨率的限制，一味的增大zoom值，不能得到相应的高清图像。因此，需根据实际情况参考piexl size进行设定。[/font]3.2 [font='times new roman']三维成像模式[/font]3.2.1 [font='times new roman']Z轴系列及三维成像模式，三维定位/图像重构[/font][font='times new roman']CLSM可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的系列光学切片，获得标本真正意义上的三维数据，这一功能被称为“细胞CT”：通过扫描振镜在X、Y方向的连续扫描，控制软件将扫描的像素点组成共聚焦图像，通过电动载物台沿Z轴方向的连续扫描，可获得样品不同层面连续的光切图像（xyz）。同理，通过沿Y轴方向连续扫描，可获得连续的xzy图像。再经计算机图像处理及三维重建软件，可产生生动逼真的动态效果。[/font]3.2.2 [font='times new roman']时间序列扫描模式(XYT)[/font][font='times new roman']共聚焦显微镜若按照一定的时间间隔、重复地采集样品内固定区域的荧光图像，并对其进行定位、定性及定量分析，则可实现对该样品的实时监测（XYT），此类实验可观察特异荧光探针标记的单个细胞不同部位或不同组织区域接受刺激后的整个变化过程，常用于对单个细胞内各种离子、膜电位、活性氧的比例及动态变化做实时定量分析，例如动态测定活细胞或组织内游离Ca[/font][font='times new roman'][sup][size=13px]2+[/size][/sup][/font][font='times new roman']、Mg[/font][font='times new roman'][sup][size=13px]2+[/size][/sup][/font][font='times new roman']、K[/font][font='times new roman'][sup][size=13px]+[/size][/sup][/font][font='times new roman']、Na[/font][font='times new roman'][sup][size=13px]+[/size][/sup][/font][font='times new roman']等离子的分布和浓度的变化、活细胞内H[/font][font='times new roman'][sup][size=13px]+[/size][/sup][/font][font='times new roman']浓度的变化、细胞/线粒体膜电位，自由基等。当Y方向上的扫描行数设为1时，便可进入特殊的XT模式，在这种扫描模式下得到的图像，可以用来计算血流速度等。[/font]3.2.3 [font='times new roman']光谱扫描模式（XYλ/XYΛ/XZλ）[/font][font='times new roman']通常配置有可调节接受范围的检测器[/font][font='times new roman']的CLSM[/font][font='times new roman']，可以实现从400nm-800nm的发射波谱扫描。通过配置具有连续可调波长的白激光，CLSM还可以实现激发波谱扫描。[/font][font='times new roman']3.3四维成像模式（XYZT/XYλT/XYΛT）[/font][font='times new roman']基于[/font][font='times new roman']上述[/font][font='times new roman']三维成像[/font][font='times new roman']模式[/font][font='times new roman']，结合时间序列扫描，可以实现CLSM的四维成像。[/font][font='times new roman']3.4反射光/透射光/微分干涉（DIC）成像模式[3-4][/font][font='times new roman']反射光成像主要是指光源发出的光到达样品后发生反射，检测器将此反射光信号转化为电信号进而生成样品表面的图像。利用反射光成像，能够更好的获得样品的表面纹理等信息，是对荧光图像信息的进一步补充。[/font][font='times new roman']透射光成像技术是通过光源发出的光到达样品后，透过样品的光进入检测器生成光信号，再由检测器转变为电信号所形成的图像信息。透射光成像通常能够更好的呈现目标的外轮廓信息，亦是对荧光图像信息的进一步补充。[/font][font='times new roman']很多CLSM配置有DIC模式。与其他成像技术相比，DIC成像技术通过对光路中梯度变化的呈现，实现“伪立体”效果，如在梯度比较小的区域中，相对比较扁平的上皮细胞亦可以较好的实现“立体”结构，同时，由于DIC成像技术不存在相差成像等技术中出现的光晕，还可以利用这个特点检测到细胞表面分布着的细菌，这是很多成像技术所观察不到的。因此DIC成像技术的主要优势在于不需要对相差环和聚光镜遮挡等因素进行考虑，可以直接实现高数值孔径的物镜观察，即可以提高轴向分辨率，这在对分辨率要求十分高的实验中具有重要的应用价值。[/font][font='times new roman']3.6 特殊[/font][font='times new roman']检测[/font][font='times new roman']模式[/font][font='times new roman']3.6.1 荧光漂白恢复（FRAP）[/font][font='times new roman'][5][/font][font='times new roman']FRAP技术由Axelrod等于20世纪70年代研发，指对细胞内的某一区域荧光漂白后，通过测定荧光分子的恢复速率，来研究活细胞中生物分子的动力学特征。[/font][font='times new roman']通过FRAP实验可以研究生物膜脂质分子的侧向扩散、细胞间的通讯、胞浆及细胞器内小分子物质转移性的观测、以及细胞骨架、核膜结构或大分子组装等。[/font][font='times new roman']3.6.2荧光能量共振转移（FRET）[/font][font='times new roman'][6][/font][font='times new roman']FRET是指两个荧光基团间能量通过偶极-偶极耦合作用以非辐射方式从供体传递给受体的现象。目前FRET技术可广泛用于单个固定细胞、亚细胞或活细胞原位生理环境下检测生物大分子的构象变化和分子间的直接相互作用，如检测配体-受体、蛋白分子共定位、转录机制、蛋白折叠以及蛋白质二聚化等，亦可用于检测酶活性变化、细胞凋亡以及膜蛋白的研究等。[/font][font='times new roman']在FRET体系中，常用的荧光能量供体、受体对主要有：CFP/YFP、BFP/RFP、CY3/CY5等。[/font][font='times new roman']进行FRET实验时，需要满足以下几个条件：① 所检测样品包含两个荧光分子，能量的提供者叫做供体，能量的接受者叫做受体；② 供体与受体的距离在[/font][font='times new roman']10[/font][font='times new roman']nm之间；③ 供体的发射波长与受体的激发波长一致。当供体的激发波长照射样品时，若没有FRET效应产生，只会检测到供体的发射光；反之，如果有FRET效应发生，则CLSM可检出供体发射的荧光减弱，而受体的发射光增强。[/font][font='times new roman']3.6.4 荧光寿命成像（[/font][font='times new roman']FLIM[/font][font='times new roman']）[7][/font][font='times new roman']FLIM技术是研究细胞内生命活动状态的一种非常可靠的方法。荧光寿命是荧光团在返回基态之前处于激发态的平均时间，是荧光团的固有性质，因此其不受探针浓度、激发光强度和光漂白效应等因素影响，且能区分荧光光谱非常接近的不同荧光团，故具有非常好的特异性和很高的灵敏度。此外，由于荧光分子的荧光寿命能十分灵敏地反映激发态分子与周围微环境的相互作用及能量转移，因此FLIM技术常被用来实现对微环境中许多生化参数的定量测量，如细胞中折射率、黏度、温度、pH值的分布和动力学变化等，这在生物医学研究中具有非常重要的意义。目前FLIM技术在细胞生物学中一些重要科学问题的研究、临床医学上一些重大疾病的诊断与治疗研究以及纳米材料的生物医学应用研究等方面均有广泛应用，并取得了许多利用传统的研究手段无法获取的数据。[/font][font='times new roman']3.6.5 荧光共振能量转移-荧光寿命成像（FRET- [/font][font='times new roman']FLIM[/font][font='times new roman']）[8][/font][font='times new roman']FRET本身不是一种成像技术，而是一个物理过程。传统的FRET过程分析通常是基于荧光强度成像来实现，分析的结果容易受光谱串扰的影响。而将FLIM技术应用于FRET过程分析，利用FLIM技术可定量测量这一优势，可非常灵敏地反映供体荧光分子与受体荧光分子之间的能量转移过程。当受体分子与供体之间的距离10nm时，供体的能量转移到受体，受体从基态发生能量跃迁，从而影响供体的荧光寿命。与没有受体分子的时候相比，发生FRET的供体分子的荧光寿命降低。因此，FRET-FLIM联合能够实时监测生物细胞中蛋白质的动态变化，如蛋白质折叠、分子间（蛋白-蛋白，蛋白-核酸）相互作用和细胞间信号分子传递、分子运输以及病理学研究等。[/font][font='times new roman']3.6.3 荧光相关光谱/荧光互相关光谱（[/font][font='times new roman']FCS[/font][font='times new roman']/FCCS）[9-12][/font][font='times new roman']FCS[/font][font='times new roman']和FCCS都是在涨落光谱技术的基础上衍生而来的，通过检测某一微小区域内荧光信号的瞬时涨落变化，分析分子的密度、扩散以及分子之间的相互作用，是一种新兴的单分子检测技术。由于FCS/FCCS的高灵敏性可以用来检测生物系统中发生的小概率时间，因此此技术主要用于分子之间相互作用、活细胞分析、核酸分析、蛋白质的寡聚化、蛋白质的动力学研究以及纳米制剂粒径测量等研究，在检测物质浓度、扩散速度、分子结合速率等方面体现出巨大的优越性，亦可用于肿瘤的早期诊断以及高通量药物筛选等。[/font][font='times new roman']FCS技术，即在CLSM焦点的微小测量区域内，通过对荧光强度随时间变化的自发性波动分析和其时间函数自相关的分析，并通过计算机统计与拟合运算，在活细胞内单分子水平给出分子的扩散系数、分子数目、分子浓度及分子之间结合与分离状态等动力学参数的检测方法。其实质是监测带有荧光基团的物质在激光作用体积内的扩散情况，可揭示异质群体中的每个个体，并对各自的亚群进行鉴定、分类、定量比较，亦可对复杂的生化反应提供详细、确定的动力学参数。[/font][font='times new roman']发明FCS的最初目的是在生物系统中研究非常稀的样本浓度的化学动力学特征。随着探测手段、自相关电子学等方面的技术进步，FCS在生物化学中的研究和应用越来越广泛，如经典的细胞膜中脂质扩散研究就是通过CLSM整合了FCS技术后所取得的巨大进展。[/font][font='times new roman']FCCS技术，确切来说是FCS技术的一种延伸应用。其既保持了FCS技术的灵敏性，又可以解决FCS对两种粒子的扩散速度要有明显不同的要求（至少相差2倍，即二者质量差相差8倍）。该技术在实验中通常将两种粒子用不同的荧光进行标记，荧光分子被激发后，产生两种互不干扰的荧光信号，分别被两个独立的检测器探测，然后将探测到的信息进行交叉函数分析。如果分子间存在相互作用，那么两种不同的荧光信号将同时经过检测通道，这时两个检测器就会产生同步的信号波动，从而产生互相关信号；而当单色荧光分子独立在微区域内运动时，则不会产生互相关信号。这样，相互作用的荧光分子和独立运动的荧光分子就被区分开来。由于FCCS技术直接反映分子间的相互作用，而不像FRET技术那样受分子扩散或聚集的影响，因此在生物分子互作、蛋白寡聚化、酶活性研究领域中有重要的应用前景。[/font][font='times new roman']4 结论和展望[/font][font='times new roman']综上，CLSM应用灵活，具备多种检测[/font][font='times new roman']模式，适用于多种样本，[/font][font='times new roman']亦可[/font][font='times new roman']实现多种实验目的，如荧光的定量、定性、定位、共定位，动态荧光的测定等[/font][font='times new roman']。一些特殊的实验模式，将CLSM在生物医学领域的应用进一步扩大。通过[/font][font='times new roman']结合其他[/font][font='times new roman']技术[/font][font='times new roman']（多手段联合拓展[/font][font='times new roman']，如膜片钳、原子力显微镜、光电联用等[/font][font='times new roman']）[/font][font='times new roman']，CLSM必将成为[/font][font='times new roman']助力生物医学领域研究[/font][font='times new roman']的有力工具[/font][font='times new roman']。[/font][font='times new roman']参考文献[/font]1. [font='times new roman']黄德娟，浅谈显微镜的发展史及其在生物学中的用途。赤峰教育学院学报，2000，2：51-52[/font]2. [font='times new roman']肖艳梅，付道林，李安生，激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）及其生物学应用。激光生物学报，1999,8（4）：305-311[/font]3. [font='times new roman']弓宇, 郭英玲, 张枫, 刘红旗, 基于反射光和透射光成像的图像识别方法比较。机电产品开发与创新，2013,26(3):7-9[/font]4. [font='times new roman']虞兆芳, DIC成像技术的优势。求知导刊，2016,2：53[/font]5. [font='times new roman']隋鑫，满奕，张越，林金星，荆艳萍，荧光漂白恢复技术及其在生物膜系统研究中的应用。电子显微学报，2017,36（6）：601-609[/font]6. [font='times new roman']肖忠新，张进禄，荧光共振能量转移技术在激光共聚焦显微镜中的应用。中国医学装备，2014,8（11）：73-75[/font]7. [font='times new roman']刘雄波，林丹樱，吴茜茜，严伟，罗腾，杨志刚，屈军乐，荧光寿命显微成像技术及应用的最新研究进展。物理学报，2018,67（17）：178701-1-178701-14[/font]8. [font='times new roman']罗淋淋，牛敬敬，莫蓓莘，林丹樱，刘琳，荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像（FRET-FLIM）技术在生命科学研究中的应用进展。光谱学与光谱分析，2021,41（4）：1023-1031[/font]9. [font='times new roman']曲绍峰，林金星，李晓娟，FCS/FCCS技术及其在植物细胞生物学中的应用。电子显微学报，2014，33（5）：461-468[/font]10. [font='times new roman']张普敦，任吉存，荧光相关光谱及其在单分子检测中的应用进展。分析化学，2005,33（6）：875-880[/font]11. [font='times new roman']黄茹，周小明，荧光相关光谱在生物化学领域中的应用。激光生物学报，2013,22（4）：289-293[/font]12. [font='times new roman']游俊，荧光相关光谱（FCS）在生物活细胞中的应用。湖北大学学报（自然科学版），2005，27（1）：53-56[/font]
生物显微镜主要用在生物医学方面，可按不同方法进行分类。按标准分类：GB/T 2985-2008中表述，生物显微镜分为三类：①普及显微镜适用于一般明场观察；②实验室显微镜兼有明场、暗场、相差和荧光显微术和显微摄影术；③研究用显微镜除能够实现实验室显微镜功能外，还具有偏光、微分干涉显微术和激光共聚焦显微镜。按结构分类：按照光路结构显微镜可以分为正置显微镜和倒置显微镜。
摘要：本文将对生物显微镜进行详细介绍，包括其原理、类型、应用领域以及未来发展趋势。生物显微镜是生命科学研究中不可或缺的工具，它让我们能够深入观察生命的微观世界，从而更好地理解生命的奥秘。一、生物显微镜的原理生物显微镜的工作原理基于光学成像技术，通过透镜组合将微小物体放大并呈现出清晰的图像。它主要由光源、物镜、目镜、载物台等部分组成。生物显微镜利用可见光或荧光等光源照射样品，通过物镜将样品放大，再经过目镜进一步放大，最后由观察者或相机捕捉到放大的图像。二、生物显微镜的类型[list=1][*]光学显微镜：利用可见光成像，适用于观察细胞结构、组织切片等样品。[*]荧光显微镜：利用荧光染料标记样品，通过激发荧光观察特定结构或分子。[*]共聚焦显微镜：通过激光扫描样品，实现三维层析成像，适用于观察厚样本。[*]超分辨显微镜：突破光学衍射极限，实现更高分辨率成像，如STED显微镜、PALM/STORM显微镜等。[/list]三、生物显微镜的应用领域[list=1][*]生命科学研究：观察细胞结构、分子定位、生物大分子互作等。[*]医学诊断：病理诊断、细胞学检查、病原微生物检测等。[*]环境科学：观察微生物、污染物等环境样品的形态和结构。[*]材料科学：观察纳米材料、复合材料等微观结构和性能。[/list]四、生物显微镜的未来发展趋势[list=1][*]高分辨率与高速成像：随着技术的不断进步，生物显微镜将实现更高的分辨率和更快的成像速度，为生命科学研究提供更多细节和动态信息。[*]多模态成像：将多种成像技术融合到一台显微镜中，如光学、荧光、拉曼等多种模态，以实现对样品的多角度、多层次观察。[*]智能化与自动化：AI和机器学习等技术的发展将推动生物显微镜的智能化和自动化进程，实现自动样品定位、图像分析等功能，提高研究效率和准确性。[*]非线性光学成像：利用非线性光学效应，如二次谐波生成、多光子激发等，实现无标记、无损伤的深层组织成像，为生物医学研究提供新的观察手段。[*]便携式与便携式显微镜：为了满足野外、临床等场景的实时观测需求，生物显微镜将朝着更小巧、便携的方向发展。[/list]总结：生物显微镜作为揭示生命微观世界的利器，在生命科学、医学、环境科学等领域发挥着重要作用。随着科技的不断进步和创新，生物显微镜的分辨率、成像速度和功能将不断提升，为探索生命奥秘提供更多可能性。在未来，我们有理由相信生物显微镜将继续为科学研究和应用领域带来更多的突破和成就。
生物摄影师，也为医学或生物医学摄影师，是与某些科学领域的详细的知识熟练的摄影师。 他们利用高质量的设备，在医学，生物学和化学等领域的照片。 生物摄影师医疗学校，医院， 出版公司，药品生产企业和其他组织的工作。 插图 生物摄影师拍照提供科学出版物，医学期刊，教材，教具和研究报告的插图。记录医疗程序 一种生物摄影师的职位描述可能包括采取外科手术或尸体解剖图片或视频。显微摄影 生物摄影师可能需要使用显微摄影，采取微观物体的全面详细的照片，人们可以不用显微镜。解剖照片 生物显微镜摄影师还可以创建在不同的个体不同解剖区的照片，以便研究人员和学生，可以增加他们的知识。取证 一些生物摄影师在取证工作，在刑事和民事诉讼证据的照片。
电子显微镜在生物医学方面是形态学的常用仪器，建议收集各单位电子显微镜相关信息，以便需要的战友得到相关的信息，建议格式如下序号：1、 电子显微镜的类型和型号；2、 所在单位和地址；3、 联系电话：4、 相关资料（如网址）：5、 是否对外服务：6、 其他信息。(如：收费标准，具体服务项目、类别等)
激光共聚焦扫描显微镜是近代最先进的细胞生物医学分析手段之一。与传统荧光显微镜相比，共聚焦显微镜能得到更清晰的样品图像。它不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察
-暗视野显微镜 在普通光学显微镜台下配一个暗视野聚光器),来自下面光源的光线被抛物面聚光器反射，形成了横过显微镜视野而不进入物镜的强烈光束,因此视野是暗的，视野中直径大于 0.3μm的微粒将光线散射，其大小和形态可清楚看到。甚至可看到普通明视野显微镜中看不见的几个毫微米的微粒。因此在某些细菌、细胞等活体检查中常常使用。 实体显微镜 由双筒目镜和物镜构成。放大率 7～80倍。利用侧上方或下方显微镜灯照明。在目镜内形成一个直立的放大实像，可以观察未经加工的物体的立体形状、颜色及表面微细结构,并能进行显微解剖操作,也可以观察生物机体的组织切片。
随着社会科学技术的发展，生物研究也在慢慢成为科研的一个重要部分，特别是在医学界，很多科研人员都会拿生物来做研究，包括一些生物细胞的分析以及免疫的观察，而研究生物，显微镜是不可缺少的一部分，生物显微镜在现代的生物研究领域起到不可替代的作用。下面我们一起来看看生物显微镜到底有什么样的作用，以广州明美光电的MI12S生物显微镜为例子吧，我们先看看成像效果图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/06/201606071103_596218_1783654_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/06/201606071103_596219_1783654_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/06/201606071103_596219_1783654_3.jpg从这些图片中我们可以看出，用生物显微镜，我们可以清晰的观察到生物细胞。加上荧光模块，使用荧光显微镜，效果会更加逼真。
细胞活体的培养，是现代生物医学界一重要科研项目，细胞的繁殖，复制，新陈代谢过程，这些都是科学家们都想观察到的现象，借助于荧光显微镜，我们可以很清楚的观察到细胞的所有繁殖过程，那么什么样的倒置荧光显微镜比较好呢? 我们需要注意一下几点:倒置荧光显微镜一般由落射荧光显微系统与倒置生物显微系统组成，采用优良的无限远色差独立校正光学系统，配置长工作距离平场消色差物镜与大视野目镜。紧凑稳定的高刚性主体，充分体现了显微操作的防振要求。落射荧光显微系统采用模块化设计理念，可以安全、快揵地调整照明系统，切换荧光滤色片组件。产品可应用于细胞组织，透明液态组织的显微观察，也可用于生物制药，医学检测、疾病预防等领域内的荧光显微术观察。 我们来看看倒置荧光显微镜到底是怎么样的！http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/06/201606131012_596689_1783654_3.jpg倒置荧光显微镜成像效果http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/06/201606131014_596690_1783654_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/06/201606131014_596691_1783654_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/06/201606131014_596692_1783654_3.jpg
本人现有几台光学显微镜,操作简单,维护方便,八成新.是专门为学生、实验室、学校、医学领域设计的。它有 6 个级别的放大倍数，分别是：40X（倍）、64X、100X、160X、400X、640X。它采用玻璃镜头，结构件绝大部分是金属件，经久耐用。可用与观察各类生物标本,如根,茎切片,花粉等,以及生物医学中的研究和常规检验. 型号是XSP-15型640倍单目生物显微镜 有需要得可以联系 还有4台~~有意者请联系 0315-6186285 13730507482或发邮件 wzj123198@sina.comQQ: 50659273
[url=http://www.f-lab.cn/biomicroscopes/goren-bio.html][b]便携式生物显微镜[/b][/url]是专业为野外研究或现场应用而设计的手持便携式显微镜,具有便携而多功能的独特优势,结构紧凑且坚固耐用,是现场观察研究的理想显微镜。[b]便携式生物显微镜特点[/b]便携式设计且具有实验室级显微镜的性能和实惠的价格多功能设计,可以很容易地修改执行为明场，暗场，相衬，或偏振显微镜多样显微镜器件达到实验室显微镜水平：照明元件、调焦机构、子级光学系统,样品台可由电池供电或110V / 240v电源供电。[img=便携式生物显微镜]http://www.f-lab.cn/Upload/Goren-Bio.jpg[/img][b]便携式生物显微镜[/b]应用 地质学、考古学、生物学、教育、司法、地球科学、生物学、医学、Botany、热带疾病，病理学，艺术学，Mineralogy。[b]便携式生物显微镜结果[img=便携式生物显微镜]http://www.f-lab.cn/Upload/Goren-Bio-results.jpg[/img][img=便携式生物显微镜]http://www.f-lab.cn/Upload/goren-application.JPG[/img][/b]（A）数组（“涂抹部分”）从Maresha附近的中始新世沉积放射虫、以色列（显微镜放大倍数：40×）；（B）场浸渍和光薄片的土从Tsaghkasar、亚美尼亚（100×，正交偏光镜）；（C）结核杆菌（600×，油浸）；（D）硅藻（舟形藻，200×）。更多生物显微镜官网：[url]http://www.f-lab.cn/biomicroscopes.html[/url]
最近观察了一段时间激光共聚焦显微镜版，人气不是很旺。当初是我提出来要将激光共聚焦显微镜单独开版，主要是考虑到国内激光共聚焦显微镜的用户日益增多，而且激光共聚焦显微镜的应用领域与光学显微镜有一定差异，所以作为一个新的设备，应该有很多可以讨论和交流的。但是目前讨论交流确实存在一些问题。激光共聚焦显微镜的用户大头在生物医学研究所和大型医院，似乎这些用户群体不太愿意在论坛上交流，另一个应用领域在材料上，但是国内材料研究领域拥有激光共聚焦显微镜还是少数，所以真正活跃的用户不多。有感于此，建议将激光共聚焦显微镜版划到我的光学显微镜版作为一个子版，我来管理。
电子显微镜在生物医学方面是形态学的常用仪器，建议收集各单位电子显微镜相关信息，以便需要的战友得到相关的信息，建议格式如下http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/brow/emyc1010.gif序号：1、 电子显微镜的类型和型号；2、 所在单位和地址；3、 联系电话：4、 相关资料（如网址）：5、 是否对外服务：6、 其他信息。http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/brow/em09511.gif留言:大家积极参与，人人为我，我为人人，大家一起建起这个资源库！注意序号要连续；注意不要重复！
显微镜(microscope)简称光镜，是一种将肉眼无法看清楚的微生物体进行光学放大成像的常用仪器。在生命科学、材料科学、基础科学及众多的微观领域中都离不开显微镜。1590年.荷兰的Han，父子始创放大10倍显微镜。175.8年，Dollond制成消色差透镜，提高了显微镜放大倍数。1873年，德国科学家Abbe设计成近代显微镜。1953年.上海江南光学仪器厂国产显微镜诞生，并陆续生产了荧光、相衬、偏光等专用显微镜。生物及医用显微镜可分为光学放大及电子放大两大类。前者按用途可分为普通型、特种型、高级型显微镜和手术显微镜。普通型生物显微镜仅供一般用途使用，通常的农用与医用显微镜、倒税显微镜均属这一类。特种型生物显微镜可作某些专用的观察和研究。暗场生物显微镜、荧光显微镜、偏光显微镜、相衬和干涉相衬显微镜等均属于这一类。高级型生物显微镜系指大型多用途的生物显微镜.研究用生物显微镜和万能研究用生物显微镜等属于这一类。一、显微镜放大成像系统显微镜光学系统由物镜和目镜两部分组成。因为被观测的物体本身不发光，而要借助于外界照明，故显微镜需要有一个照明系统，这些部分都是由较复杂的透镜组成，尤其物镜更为复杂。下图是显微镜成像的光路原理图，图中的物镜和目镜均用薄透镜表示。http://www.yi7.com/file/upload/201201/07/14-00-33-93-1.jpg显微镜成像原理显微镜的物体AB处于物镜的2倍焦距之内一倍焦距之外，它首先通过物镜成一放大的倒立实像A'B'，且使之位于目镜的物方焦平面上或焦平面以内很靠近的地方，然后目镜将这一实像再次成一个正立虚像A"B"于无限远或人眼明视距离之外，以供眼睛观察。显微镜对物体进行2次放大，因此与放大镜相比，具有更高的放大倍率，能观察到肉眼所不能直接观察的微小物体，分辨更细小的细节。在这里目镜相当于放大镜，只不过这时放大镜的物是物镜所成的像而已。由于物镜所成的像是实像.因而可在实像处(即目镜的物方焦平面处)安放各种用途分划板.供对准或测量用。二、显徽镜的放大率与分辨本领1.显微镜的分辨本领 分辨本领主要指接物镜分辨被检查物体细微结构的能力，也就是说在显微镜下判别的最小微粒的大小或两点之间最短距离及某物点最小直径的限度，便叫做显微镜的分辨本领.或称为鉴别率。通常用d表示:http://www.yi7.com/file/upload/201201/07/14-00-33-14-1.jpg式中.A表示波长;n sins (NA)表示数值孔径。 从式中可知，显微镜的分辨率主要取决于光的波长和数值孔径这两个因素。d值越小，分辨本领也就越强，越能看清物体的细微结构。鉴别率计算单位是Um. 显微镜的鉴别率的提高只有两个办法: (1)增大物镜的数值孔径(镜口率)。从图可以看出，影响数值孔径(n sina)的因素有两个:其一为物体上某点射人物镜光锥角(镜口角)的一半(sina);其二为检品与物镜间媒质的折射率n。即数值孔径为NA = n sine镜口角半数最大能到900，故si na的最大值为1.00，这时物镜的焦距最短而曲度也很大，制造上是极为困难的。即使能办到，在干燥系中的镜口率只有1 x sin90“（控气n二1)。若再增大镜口率便只有从媒质着手，所以便有水、甘油，石蜡油和香柏油等浸润均匀媒质的应用，确实改进了镜口率不少.它最高可到1.40。如果用澳萘液可达1.67左右，更接近盖片和透镜的折射率。http://www.yi7.com/file/upload/201201/07/14-00-33-51-1.jpghttp://www.yi7.com/file/upload/201201/07/14-00-33-44-1.jpg (2)缩短光源的波长:采用紫外线作光源，波长可到0.1Um，这样放大倍数比自然光放大的倍数大3-4倍，普通紫外线光波在0.2 Um左右，即使能产生出0.1 Um波长的紫外线.一般透镜也将把它吸收干净.无法利用。显微镜的最大数位孔径可达1.5 Um左右，在这种情形下: http://www.yi7.com/file/upload/201201/07/14-00-33-33-1.jpg即在这种显微镜里，仍可分辨的两点间最短距离差不多等于所用光波波长的1/30假定绿光的光波的波长http://www.yi7.com/file/upload/201201/07/14-00-33-23-1.jpg那么显微镜能分辨的最短距离为:http://www.yi7.com/file/upload/201201/07/14-00-33-89-1.jpg 则这台显微镜的最高分辨距离也超不过。.182 Um。肉眼在明视距离(250 mm)能分辨的两点之间最短距离为0.1 mm，约为上述d值的560倍.因此I台光学显徽镜的放大率有100()倍也就足够了。这是因为光的本性及光的绕射现象就限制了显徽镜的放大极限。凡是光波超过微粒直径的2倍时，光线就很方便地绕过微粒而继续前进，所以普通干燥系显微镜的最大鉴别率只能达到光源波长的1/2，直径小到0.2 5m的微粒就无法被光学显微镜发觉。虽然后来应用浸润系方法，如油镜，提高了折射率，其鉴别率也只不过能提高到光源波长的1/3而已。而且还要用最好的透镜才能达到。
数码目镜数码目镜也称为显微相机，可以使现有的普通光学显微镜立刻升级为数码显微镜显微相机，是专门为普通光学显微镜图像数字化而开发设计的。她具有安装简便，通用性强、使用成本低廉、功能齐全、简单易用等特点。安装只需要2个步骤：1、取下原有的显微镜目镜，2、插入电子目镜替换原有目镜。即可通过USB线缆将显微镜下的图像传输至电脑进行实时显示，并可以随时抓怕冻结图像、录像、测量长度、角度、弧度、矩形面积及周长、不规则图形面积及周长、细胞计数、色彩分割、伪彩色还原、虚拟3D、图像边缘识别、傅立叶变换、光点测量及部分PS图像处理功能。可满足大多数专业应用。非常适合教师教学和装备数字化实验室、医学研究、工业生产（PCB线路版检查，IC质量控制）、医疗（病理切片观察）、食品（微生物菌落观察、计数）、科研、教育（教学、演示、学术交流）、公安（印章验证、弹头检测）等领域...... DCM系列显微相机从普教级到科学级有十几个型号，可以按照不同的要求，选择合适的配置。显微相机的光学接口为国际标准目镜尺寸，适用于任何目镜筒内径为23.2mm、30.0mm或者30.5mm的各类生物显微镜、体视显微镜、金相显微镜、荧光显微镜、偏光显微镜、熔点仪、硬度计等光学设备。另有C-Mount接口的专用型号，可配在标准的C接口上使用。显微相机的光学部分全部采用高透光率优质光学玻璃制成，比树脂镜头产品性能有极大的提高。组装车间装备有千级无尘，超高压静电除尘设备，并采用新型防尘结构，确保每件产品的优质效果。jacobxu7001@163.com[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2009/11/200911201009_185541_1734324_3.jpg[/img]
微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
生物显微镜是用来观察生物切片、生物细胞、细菌以及活体组织培养、流质沉淀等的观察和研究，同时可以观察其他透明或者半透明物体以及粉末、细小颗粒等物体。左图所示为生产的倒置生物显微镜型，该生物显微镜也是食品厂、饮用水厂办QS、HACCP认证的必备检验设备。用途 生物显微镜供医疗卫生单位、高等院校、研究所用于微生物、细胞、细菌、组织培养、 悬浮体、沉淀物等的观察，可连续观察细胞、细菌等在培养液中繁殖分裂的过程等。在细胞学、寄生虫学、肿瘤学、免疫学、遗传工程学、工业微生物学、植物学等领域中应用广泛。显微镜的重要光学技术参数在镜检时，人们总是希望能清晰而明亮的理想图象，这就需要显微镜的各项光学技术参数达到一定的标准，并且要求在使用时，必须根据镜检的目的和实际情况来协调各参数的关系。只有这样，才能充分发挥显微镜应有的性能，得到满意的镜检效果。 显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系，但应以保证分辨率为准。保养注意事项显微镜不论在使用或存放时应避免灰尘、潮湿、过冷、过热、与含有酸碱性的蒸气。 不得将化学药品放在显微镜附近，更不得在显微镜箱内放有化学药品(干燥剂除外)。 显微镜应经常装上目镜，使灰尘不致落到物镜里面。 透镜的表面若有灰尘，应先用黄鼠狼毛笔拭去，然后再行擦拭。 透镜的擦拭只能用专用拭镜纸或棉球擦拭。 透镜表面若有污秽时，可用拭镜纸或棉球，0少许石油精或二甲苯轻轻擦拭，但不得用酒精.否则透镜胶层将被溶解。 油浸式的物镜使用后的擦拭须依上述方法进行，不得让香柏油在透镜面上干涸. 更不得用酒精或类似液体浸洗镜头。
生物显微镜和工具显微镜又称工具制造用显微镜，是一种工具制造时所用高精度的二次元坐标测量仪。生物显微镜工具显微镜是利用光学原理将工件成像经物镜投射至目镜，即借着光线将工件放大成虚像，再利用装物台与目镜网线(eyepiece reticle)等辅助，以作为尺寸、角度和形状等测量工作，可作为检验非金属光泽的工件表面。生物显微镜工具显微镜仪器在立柱上装有一显微镜，放大倍率从10倍至100倍间等数种倍率，工具显微镜的测量系统光源( 灯炮 ) 通电后，光线依次经过二个透镜滤热镜 ( 片)、镜径薄膜、透镜、反射镜、装物台、物镜、反射镜、目镜等，工件与物镜间的距离，随着放大倍率和工件厚薄，可利用对焦旋钮调至理想位置。1、 生物显微镜工具显微镜将人眼瞄准，采集元素的个别点坐标，改为CCD摄像机自动采集元素图像，采集信息量增大，减少人工干预，操作效率提高。 2、生物显微镜工具显微镜软件数据处理结果除以数据表示外,增加了图形信息窗，处理的点、线、图、弧等元素展现在屏幕上，形象直观，条理清晰，避免出错，并且可以输出到AUTOCAD形成工程图。3、引进先进的英国RENISHAW钢带反射光栅系统代替原有的玻璃光栅系统，该系统信号优良，安装间隙大，外形小巧，发热量小，安装调试简单，抗污染，抗腐蚀能力强，耐震性好等众多优点，大大提高了系统的可靠性，是当今国际最先进的光栅系统之一。4、 生物显微镜和工具显微镜生物显微镜工具显微镜除X、Y坐标数字显示外，将测高坐标和分度头角度坐标也改成数显，实现了四坐标全数显化，这一改进对凸轮轴测量十分有益。5、用半导体激光器作为指向器，红色光点打在工件表面，用于快速确定测量部位，避免了因CCD视场面积小带来的找象困难，解决了目前图像系统的通病。引用：www.bsdgx.com
生物显微镜与金相显微镜的区别主要是在照明方式与物镜上面： 1、生物显微镜用的是透射照明，一般用来观察透时和半透明的样本，不能用来观察不透明物体，而金相显微镜主要是落射照明方式（也叫同轴照明），光源从物镜射出，主要用于观察不透明样本的表面，当然也有附带透射照明装置的较高级金相显微镜，可同时用于观察透明样本。 2、从物镜来看，生物显微镜的高倍物镜都有考虑盖玻片厚度（0.17）和载玻片、培养器皿厚度（1.2），所以其物镜是通常标有 /0.17（正置显微镜）、 /1.2（倒置显微镜），正置生物显微镜10倍以下物镜则是 /-，也就是可以不考虑，这是为了校正玻璃对于光折射的影响，而金相显微镜的物镜通常标有/0 。
生物显微镜是生物教学实验中常用的一种精密光学仪器，由机械系统和光学系统两部分组成。机械系统包括：镜筒传动部分、物镜转动部分、载物台、压片夹和遮光器的转换部分、镜架和底座的转动部分等。光学系统包括：目镜、物镜、聚光镜和反光镜等。本文试图用简练的语言介绍一些生物显微镜日常的保养和常见问题的处理，以方便大家在日常中的使用和保养：一、 日常保养1.整体保养：生物显微镜要放置在干燥阴凉、无尘、无腐蚀的地方。使用后，要立即擦拭干净，用防尘透气罩罩好或放在箱子内。2.机械系统的维护保养：使用后，用干净细布擦净，定期在滑动部位涂些中性润滑脂。如有严重污染，可先用汽油洗净后再擦干。但切忌用酒精或C4H10O清洗，因为这些试剂会腐蚀机械和油漆，造成损坏。3.光学系统的维护保养：使用后，用干净柔软的绸布轻轻擦拭目镜和物镜的镜片。有擦不掉的污迹时，可用长纤维脱脂棉或干净的细棉布蘸少些二甲笨或镜头清洗液擦拭。然后用干净细软的绸布擦干或用吹风球吹干即可。要注意的是清洗液千万不能渗入到物镜镜片内部，否则会损坏物镜镜片。聚光镜（XSP-12A、16A型才有）和反光镜用后只要擦干净就可以了。二、常见问题的处理1.物镜转换器转动困难或定位失灵：转换器转动困难可能是固定螺丝太紧。使转动困难，并会损坏零件。太松，里面的轴承弹珠就会脱离轨道，挤在一起，同样使转动困难；另外弹珠很可能跑到外面来，弹珠的直径仅有一毫米，很容易遗失。固定螺丝的松紧程度以转换器在转动时轻松自如，垂直方向没有松动的间隙为准。调整好固定螺丝后，应随即把锁定螺丝锁紧。不然的话，转换器转动后，又会发生问题。转换器定位失灵有时可能是定位簧片断裂或弹性变形而造成。一般只要更换簧片就行了。2.遮光器定位失灵：这可能是遮光器固定螺丝太松，定位弹珠逃出定位孔造成。只要把弹珠放回定位孔内，旋紧固定螺丝就行了。如果旋紧后，遮光器转动困难，则需在遮光板与载物台间加一个垫圈。垫圈的厚薄以螺丝旋紧后，遮光器转动轻松，定位弹珠不外逃，遮光器定位正确为佳。3.镜架、镜臀在倾斜时固定不住：这是镜架和底座的连接螺丝松动所致。可用专用的双头板手或用尖咀钳卡住双眼螺母的两个孔眼用力旋紧即可。如旋紧后不解决问题，则需在螺母里加垫适当的垫片来解决。 综上所述,对于生物显微镜的维护保养,只要做到防尘、防潮、防热、防腐蚀。用后及时清洗擦拭干净,并定期在有关部位加注中性润滑油脂即可。对于一些结构复杂,装配精密的零部件,如果没有—定的专业知识,一定的技能和专用工具,就不能擅自拆装,以免损坏零部件。文章转载于：http://www.microimaging.com.cn/
工业显微镜和生物显微镜的区别，但就字面意思上能了解到它们最大的区别，就是用途不同，这里主要从其物镜上来说明它们的不同之处：物镜的鉴别能力可分为平面和垂直鉴别能力。物镜(objectivelens)物镜是决定光学显微镜基本性能及功能的最重要的光学单元。因此，为了满足各种需求和应用，我们研制出了有着最佳光学性能和功能(这对光学显微镜而言也是最重要的性能和功能)的物镜，推出了能满足不同使用目的多种物镜产品。 光学显微镜的用途大致分为“生物用”和“工业用”两大类。物镜也可以按照这两种用途，划分为“生物物镜用”物镜和“工业用”物镜。在工业用途中，一般是在金属矿物切片、半导体晶圆和电子零部件等标本没有被遮盖的状态下进行观察的。所以，工业显微镜用物镜采用了物镜前端和标本之间没有盖玻片状态的最佳光学系统设计。然而在生物用途中，一般是将生物标本放置在载玻片上，并从上面用盖玻片遮盖固定。由于生物用物镜需要透过盖玻片观察样本，所以采用了考虑到盖玻片的厚度(一般为0.17mm)的光学系统设计。 在这里说明生物显微镜和工业显微镜的物镜也是大有不同的，基本上物镜是按照用途、观察方法、倍率、性能(像差校正)等进行分类。其中，按照像差校正来分类的是显微镜物镜特有的分类方法。
徕卡DM750生物显微镜http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/01/201601121035_581595_3049546_3.jpg 徕卡DM750生物显微镜，是为高级生命科学课程的全面要求以及医学、兽医和牙医学校的专业培训专门设计的，同时，是为了革新科研教学以及实验在生命科学课程上有更多的动手操作时间而专门设计开发的。这款教学显微镜，设计人性化，操作简单，成像清晰，在日常实验工作中带来便利的同时，徕卡DM750生物显微镜在使用及维护方面也显示出了极大的优势。1、一体化的垂直手柄便于运输，保证更安全的搬运显微镜；各种镜筒在安全地固定在支架上的同时可以自由旋转；带目镜锁定螺钉的标准镜筒可以防止目镜脱落；2、一体化的电源线收集盒避免了电源线包装不当对显微镜组件造成的损坏；垂直电源线插入可以防止电源线在保存或使用时部分脱离主机，并且使实验台干净整洁；3、LED长寿命照明，平均使用寿命超过15年。LED 照明消耗的能量比标准卤素照明少大约 80%；http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/01/201601121035_581597_3049546_3.jpg4、专利的延时开关功能可在2小时不用后自动关闭照明，节约能源；5、徕卡显微系统有限公司在显微镜的所有触点上都使用了添加剂进行处理，可以抑制细菌生长。这样利用显微镜表面的特殊处理有助于防止疾病传播，从而形成更健康的实验室环境；http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/01/201601121035_581596_3049546_3.jpg6、标准聚光镜，放大倍率4X-100X；7、聚光镜可实现明场和相衬的转换。选配用于低放大倍率的摇摆式聚光镜；8、可以选装具有最佳照明和对比度的Koehler视场照明；9、DM750配备4位或5位物镜转换盘；http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/01/201601121035_581599_3049546_3.jpg10、可配相衬、荧光、共览、集成或独摄像CCD,提供了无限扩展的可能；11、DM750显微镜载物台采用特殊材料加工，可以更好的防止摩擦损坏；12、重平衡聚焦手柄提供了惯性，可以非常精确地定位聚焦；http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2016/01/201601121035_581600_3049546_3.jpg13、所有包装都是完全可回收利用的；所有玻璃组件中均不含铅；所有产品都经过独立的安全实验室的测试，并带有 cULus 和 CE 认证标志以证明其设计安全。 徕卡显微系统有限公司致力于教育发展和为国际社会做贡献。为了我们自己和子孙后代，我们积极实施可以让我们的环境更清洁、更安全的措施！
生物显微镜可以分为四大类，哪四大类呢~~~那就是正置显微镜、倒置显微镜、体视显微镜和共聚焦显微镜。
这款[url=http://www.f-lab.cn][b]数码生物显微镜DMBA210[/b][/url]是专业为教学应用设计的数字生物显微镜,就有良好的光学性能和机械性能,在数码显微镜品牌中具有较低的数码显微镜价格。这种[url=http://www.f-lab.cn][b]数码生物显微镜DMBA210[/b][/url]在标准显微镜基础上大大改进了光学性能,可广泛用于生命科学、医学和生物学的教学和初级研究应用。[b][url=http://www.f-lab.cn]数码生物显微镜DMBA210[/url]具有[/b]全消色差图像，以获得清晰和明确的可视化和数字的结果。成像头通过USB2.0与输出3.0mp连接进行即时性成像。[img=数码生物显微镜]http://www.f-lab.cn/Upload/DMBA210.jpg[/img][url=http://www.f-lab.cn][b]数码生物显微镜DMBA210[/b][/url]参数[table][tr][td][b]Model[/b][/td][td=3,1][b]DMBA210[/b][/td][/tr][tr][td=1,4][b]Observation Tubes[/b][/td][td=3,1]Ergonomic 30 degree viewing angle[/td][/tr][tr][td=3,1]55-75mm interpupillary distance[/td][/tr][tr][td=3,1]Large field of view with 18mm or 20mm options[/td][/tr][tr][td=3,1]Built-in Digital with 20/80 split and 3.0MP imaging sensor delivering high-resolution streaming images through a USB2.0 connection[/td][/tr][tr][td=1,4][b]Eyepieces[/b][/td][td=3,1]N-WF 10x/18mm[/td][/tr][tr][td=3,1]N-WF 10x/20mm[/td][/tr][tr][td=3,1]N-WF 15x/13.3mm[/td][/tr][tr][td=3,1]N-WF 12.5x/16mm[/td][/tr][tr][td=1,9] [/td][td][b]Magnification[/b][/td][td][b]N.A.[/b][/td][td][b]W.D (mm)[/b][/td][/tr][tr][td]EF-N Plan 4x[/td][td]0.1[/td][td]6.3[/td][/tr][tr][td]EF-N Plan 10x[/td][td]0.25[/td][td]4.4[/td][/tr][tr][td]EF-N Plan 20x[/td][td]0.4[/td][td]4.66[/td][/tr][tr][td]EF-N Plan 40x[/td][td]0.65[/td][td]0.35[/td][/tr][tr][td]EF-N Plan 60x[/td][td]0.85[/td][td]0.13[/td][/tr][tr][td]EF-N Plan 100x[/td][td]1.25[/td][td]0.13[/td][/tr][tr][td]EF-N Plan Phase 10x[/td][td]0.25[/td][td]4.4[/td][/tr][tr][td]EF-N Plan Phase 40x[/td][td]0.65[/td][td]0.35[/td][/tr][tr][td=1,3][b]Illumination Options[/b][/td][td=3,1]6V/30W Halogen[/td][/tr][tr][td=3,1]3W LED[/td][/tr][tr][td=3,1]Mirror[/td][/tr][tr][td][b]Condenser[/b][/td][td=3,1]Abbe 1.25NA with slot for accessories and condenser lock available[/td][/tr][tr][td=1,2][b]Stage[/b][/td][td=3,1]Hard Coated Mechanical Stage with 76x30mm travel range[/td][/tr][tr][td=3,1]Left or Right Stage drive available[/td][/tr][tr][td=1,3][b]Other Options[/b][/td][td=3,1]Simple Phase Contrast 10x and 40x sliders for condenser[/td][/tr][tr][td=3,1]Darkfield slider for condenser[/td][/tr][tr][td=3,1]Simple Polarization with analyzer and polarizer[/td][/tr][/table]
做微生物检测菌落总数时，培养皿中有好多点点，不确定是样品细渣还是菌落的情况下，看别人有的说可以用显微镜验一下，请问具体怎样用显微镜操作？
生物显微镜是教学和科研工作中必不可少的精密光学仪器。生物显微镜的好坏直接影响到实验教学标本观察的质量，因此加强生物显微镜的管理，定期进行保养和维护是极其重要的环节。保养得当可以提高生物显微镜的观察质量和利用率，更好地为教学、科研服务；保养和管理不当,就会大大缩短其使用寿命,最终导致仪器报废。针对我院生物显微镜数量多、型号规格各异、使用频率高的特点，我们对生物显微镜进行了规范化管理和科学保养，收到了良好的效果。
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