反相高效液相色谱柱

原文来自：JANUARY 2003 LC[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]gc[/url] NORTH AMERICA VOLUME 21 NUMBER 1 19,20,22,24,26http://www.chromatographyonline.com/反相高效液相色谱柱的清洗和再生（二）http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20071105/1045750/反相高效液相色谱柱的清洗和再生（三）http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20071105/1045752/[size=4]本文原是2年前让我的研究生左莹暑假特意翻译的，只是后来忘了。一个月前，在整理电脑资料中发现了这篇文献翻译，我重新校对，修整了一些错误，但仍可能会有些翻译不对的地方，或者语句不畅，请大家指正。[/size][color=#00008B]][color=#00FFFF][size=4]反相高效液相色谱柱的清洗和再生[/size][/color][/color] 这个月的“关注色谱柱”着眼于将一根污染的柱子回到或接近初始状态的实用方法。Ron Majors 会讨论硅胶基质或其它类型的反相柱子的清洗步骤。 反相液相色谱是迄今为止高效液相色谱法（HPLC）中使用最广泛的技术[1]。它的广泛使用是因为它能应用于大部分的非极性化合物、许多可电离的及离子化合物的分析。大部分用于反相色谱的固定相是亲水性的，因此分析物是通过其与固定相之间的亲水作用的程度来进行分离的，含有亲水组成的基团也有相似的保留行为。 表一列举了最常见的键合硅胶的固定相（1）。一些比较次等的固定相比如说一些混合固定相（例如：苯基－乙基），末端封尾和不封尾类型的，一些极性固定相同样属于硅胶键合。其它一些各种各样的填料同样也被用于反相液相色谱，包括聚合物，涂布有硅和铝的聚合物，涂有氧化锆的无机－有机杂化物和石墨化的碳。各种不同的固定相都有其自身的优点和缺点。表1 HPLC固定相中的使用比例*固定相 使用比例C1839C826CN**14.5苯基12C43.7亲水作用1.8C21.2C10.8其它0.8聚合物0.5* 来源于文献1** 包括正相色谱，因为正相与反相使用无法确定比例。 反相色谱柱由于可使用多种流动相和添加剂而得到了广泛的使用。其中使用添加剂的一些技术可改变或修饰填料表面。有时，这些添加试剂本身就会污染填料表面或键合相。 由于使用了亲水性的键合固定相，硅胶表层有了其他的化学特征。残余的硅羟基存在于所有的硅胶键合相的表层。图一描述了可能存在的不同类型的硅羟基（2）。由于是弱酸的特性，这些硅羟基会同某些分析物和基体化合物相互作用，尤其是同一些碱性化合物。因为硅羟基的Pka值大约是在4.5左右。电离可能发生在中间的pH值，因此存在其同阳离子产生静电作用的可能性。比较老的A型硅胶可能含有高浓度的金属离子（通常为100ppm，或更高），这些金属离子会在硅胶表面提供更强的酸性，同样还会和金属螯合化合物（3）相互作用。残留的硅羟基会在末端不封尾的键合硅胶和短链键合的固定相上（例如C2和C4固定相）造成较多的麻烦。 色谱柱的使用者必须清楚色谱柱固定相的表面特征和可能存在的分析物—固定相表面的相互作用，所以在使用和发展反相色谱方法时必须考虑可能存在的基体相互作用。比如一些非常疏水的材料如玉米油、特别芳香类材料和蜡可以附着在反相填料表层并改变填料层的特征。含有蛋白质的生物液体会吸附在填料表层，尽管分析者尽了最大的努力来保护高效液相色谱柱以防止外来物质对其的伤害，最终是，某些分析物-基体化合物还是会对固定相产生不利的影响。 当一根色谱柱被污染之后，它的色谱性征可能已经不同于未被污染的色谱柱了。被污染的色谱柱可能会表现出反压力的问题。对于一根被污染的色谱柱则必须通过清洗和再生将它恢复到原来的操作条件。“关注色谱柱”这部分将会讨论一些实用的方法来将色谱柱恢复或接近到初始状态。由于键合的硅胶柱是最常用的，所以我要着重讨论他们。在最后，我将会论述一些其他类型的反相色谱柱的清洗程序。 反相色谱柱中污染物是怎样的形成？ 通常，样品基体里总是含有一些对分析者来说不感兴趣的化合物。盐类、脂质、含脂肪的化合物、腐殖酸、疏水性的蛋白质和其他的一些生物化合物就是在使用中能够接触到高效液相色谱柱的可能物质。这些物质可能会比所需分析的物质更强或更弱的保留能力。那些保留能力比较弱的化合物如盐类，将以死体积被洗脱出来。这些不希望发生的干扰可以通过检测器观察到，它表现为一些色谱峰、斑点、基线干扰，甚至是一些倒峰。如果样品基体组成在色谱柱中有强的保留性，且流动相组成本身就不强到足以使其洗脱出来，这些被吸附的、或是被吸收的化合物将会累积，通常是在经过多次进样之后堵塞在色谱柱的柱头。这种特征是在等度条件下观察得到的。中等保留能力的样品混合物可以被缓慢的洗脱出来，其表现为宽峰、基线干扰或基线漂移。 有时，这些吸附的样品组成达到了比较高的浓度，它们便表现为一种新的固定相。被分析物可与这些杂质作用并表现为新的分离机理。它可能会引起保留时间的变化和峰的拖尾。如果色谱柱受到了比较严重的污染，色谱柱的反压力会达到一个无法承受的高度，这将会使泵超压工作，在堵塞的位置引起柱的塌陷并产生中空。表2分析柱的柱体积柱的尺寸（mm*mm）死体积（mL）250 * 4.62.5150 * 4.6 1.5150 * 3.00.64150 * 2.10.2850 * 4.60.5030 * 4.60.3015 * 4.60.15反相高效液相色谱柱的清洗和再生（二）http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20071105/1045750/反相高效液相色谱柱的清洗和再生（三）http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20071105/1045752/

求教高效液相色谱的反相柱哪个牌子好一些

请问一下，正向高效液相色谱和反向高效液相色谱的区别如何看？

请问 高效液相色谱的正相与反相怎么区分

三 清洗硅胶基质的色谱柱 恢复一根已受污染的高效液相色谱柱的关键在于了解污染物的性质，然后寻找一种合适的溶剂将其去除。如果污染物是由于一些强保留物质的多次进样积聚而产生，一个除去这些污染物的简单的冲洗过程往往会使色谱柱恢复性能。有时，在经过了等度操作之后，用20个柱体积的90％～100％的溶剂B（二元反相体系中较强的溶剂）将会除去这些污染物。（表二列出了各种型号的高效液相色谱柱的柱体积，所以读者可以很轻易地确定色谱柱的冲洗体积。）例如，脂质类的化合物可以使用一些非水性的溶剂来去除，如甲醇、乙睛、四氢呋喃。如果你正在使用含水的缓冲流动相，则千万不能将流动相直接跳到强溶剂中。将流动相猛然间改到高比例有机相的举动会导致高效液相色谱流动体系的缓冲沉淀，这将会造成更加严重的问题，如使筛板堵塞，接口管路堵塞，泵的密封垫失效，刮伤泵的柱塞杆，使进样阀转子失灵。相反，应使用非缓冲的流动相来冲洗色谱柱（就是用水来代替缓冲液）。在经过了5～10个柱体积的非缓冲溶剂冲洗之后才能允许较强的溶剂流经色谱柱。 有时，流动相中的强溶剂组分是不能充分去除色谱柱中的污染物的。必须另外使用一种更强的溶剂或一系列的溶剂才能清洗色谱柱。假如污染物是非生物性的，则使用者可以通过一种或更多的其他有机溶剂来去除不需要的化合物。可以使用许多种的溶剂和溶剂组合方式。访问一些色谱柱生产厂商的网站可以浏览到一些推荐使用的溶剂系统。 一般来说，所有的清洗都会遵循一个相似的模式。清洗过程中的溶剂浓度是增加的，通常最后都是使用一些非极性的溶剂（例如：乙酸乙酯，乃至碳氢化合物），它将会有助于溶解一些脂质类和油类化合物。重要的是要确保这一系列的每个溶剂都能与所使用的下一个溶剂互溶。一个清洗循环的结论是，在回到初始的流动相系统之前，可通过中间的可互溶的溶剂反向走。例如，异丙醇就是这个中间步骤的一个极好的溶剂，因为它能够同有机溶剂互溶，如正己烷和二氯甲烷，而且同样也能够和水相溶剂互溶。因为异丙醇有很大的粘度，所以必须确保清洗时流速不能太高，否则会引起泵的压力过载。同样，如果使用了紫外检测器，则需避免使用在紫外光谱区有吸收的溶剂，因为这样会需要大量的清洗溶剂才能去除所有吸收的溶剂以得到一个稳定的基线。对于典型的键合硅色谱柱和无缓冲液的流动相的一个推荐使用的清洗系统就是：l100％甲醇；l100％乙睛；l75％乙睛——25％异丙醇；l100％异丙醇；l100％二氯甲烷；l100％正己烷； 当使用了二氯甲烷或正己烷作为冲洗溶剂后，由于溶剂的不互溶性，需要先用异丙醇冲洗色谱柱，而后才能使用含水的流动相。冲洗色谱柱的清洗溶剂的体积最小为柱体积的十倍。对于一根250mm×4.6mm的色谱柱，分析者可以使用经典的1～2mL/min的高效液相色谱流量。为了要回到原来的流动相，色谱工作者可以跳过颠倒使用该系列的清洗溶剂。推荐使用异丙醇为中间的清洗溶剂，然后用不含缓冲液的流动相冲洗，最后再用最初使用的流动相进行冲洗。四氢呋喃是另一个使用广泛的溶剂，它可以被用来清洗受污染的色谱柱。如果使用者怀疑色谱柱受到了比较严重的污染，则可以用二甲亚砜或二甲基甲酰胺与水以50：50的比例，以小于0.5mL/min的流速进行清洗。成功的反向液相色谱柱的再生需要花费相当多的时间，使用溶剂进行冲洗可以设置梯度程序来进行通宵操作。* 在清洗过程中产生了是否应该将色谱柱颠倒过来冲洗的问题。因为大部分的强保留的污染物都会留在色谱柱的前端，将色谱柱颠倒过来清洗会减少已被溶解的污染物流出色谱柱的迁移距离。就填料层的稳定性而言，大部分的现代高效液相色谱柱都是用比普通操作压要高得多的压力装填的；因此，色谱柱的填料层应该不会受到反向的流速的干扰。然而，如果色谱柱顶端的筛板的空隙要比底部的来得大，这种反向的方式则是有害的。比如说，如果底部筛板的空隙为2µ m，则足够容纳装填有平均填料粒径为5µ m的色谱柱。（含有粒径5±2µ m的尺寸分布）。然而生产商往往在色谱柱的顶端安装空隙度比较大的筛板，以防止其被样品或流动相颗粒所堵塞。如果这种筛板的空隙度要比粒径大小分布的最小微粒大，部分填料会经筛板而流出色谱柱，这样就会产生中空。如果色谱柱上有一个箭头来提醒色谱柱的流向，我觉得应该在反向使用色谱柱之前参考说明使用书，浏览生产商的网站，或与技术支持组进行商讨，以确定这是否是一个安全的举动。无论你是否将色谱柱反向使用，最好要将色谱柱同高效液相色谱检测器断开，使污染物或者颗粒留在筛板上而不流经检测池，因为这些物质会污染检测池。 清洗污染的反相色谱柱的频率依懒于有多少不明物质被注射到柱子中，因为反相色谱柱有时在分辨率损失和外来物质的洗脱前可以忍受大量的污染物, 使用者往往等到他们观察到一些异常现象才对柱子进行清洗。然而，长时间累积的污染物会使色谱柱的清洗工作变得更难。正因为如此，如果你知道自己的色谱柱很容易受到脏的样品基体的污染时，我建议定期清洗你的色谱柱。清洗的次数越多，清洗条件也就越简单。反相硅胶基质色谱柱中残留蛋白质的清洗 如果一些如血浆、血清的生物物质留在了反相液相色谱柱上，色谱工作者必须使用一些不同的清洗程序。在大部分情况下，一些比较纯的有机试剂如乙睛或甲醇是不能溶解肽和蛋白质的，所以它们不能有效清洗反相液相色谱柱。然而加入了缓冲液、酸或者一些离子对试剂的混合有机溶剂能够有效清洗这些物质。起初，可以尝试含比较高浓度的溶剂B的流动相来冲洗色谱柱。Freiser和他的同事（4）发现来回反复地梯度洗脱，使用三氟乙酸的水溶液和三氟乙酸—正丁醇可以使污染的反相液相色谱柱再生。Bhadway和Day（5）建议进样100µ L的三氟乙醇到250mm×4.6mm色谱柱可以达到清洗的目的。如果这些方案都失败了的话，推荐使用Cunico和他的同事们（6）的强洗脱液和溶解性的试剂（见表三）。然而，在用这些试剂冲洗色谱柱之前，应该参考色谱柱的手册，或和生产商进行商议，以确保其不会破坏色谱柱的填料。硅键合色谱柱的填料往往能够与这些试剂共存，而聚合物色谱柱可能会因为与特定溶剂结合而使填料产生膨胀或收缩，从而影响到色谱柱的性能。表三 用于HPLC反相色谱柱蛋白质物质除去的清洗溶剂溶剂组成乙酸1%的水溶液三氟乙酸1%的水溶液0.1%三氟乙酸-异丙醇40：60（V：V）（粘稠的，通常降低流速）TEA-异丙醇40：60（V：V）（在三乙胺混合前用0.25N的磷酸调节pH到2.5）尿素或胍的水溶液5-8M（调节pH到6-8）NaCl，Na3PO4，Na2SO4水溶液0.5-1.0M (Na3PO4 pH 7.0)DMSO-水 或 DMF-水50：50（V：V）来自参考文献6。如果使用了早期的一系列溶剂，则必须确保表三中的溶剂与这个系列中的溶剂都是互溶的。异丙醇是一个良好的中间冲洗溶剂。在体系中的清洗体积最少为20个柱体积。由于一些溶剂清洗系统具有一定的粘滞性，所以必须调整冲洗流速以避免产生超压。在清洗完一根含有胍和尿素的色谱柱后，需要用至少40～50柱体积的色谱级的水进行冲洗。对于反相高效液相色谱柱来说使用一些如十二烷基磺酸钠（SDS）和Triton的清洗剂来清洗是不妥的，因为这些化合物会强烈地吸附在硅胶基质的表面而难以去除。这些试剂会影响填料表层，改变填料的性质。然而，分离小组的研究发现，肽合成过程中保护基团和净化剂产物对柱子的污染，可以通过在流动相中注射500µ L的1％SDS溶液以1mL/min的流速进行冲洗（7）。如果接下来使用含0.1％(V/V)三氟乙酸的5％～95％乙睛的梯度，在开始的条件下进行平衡，多肽的分离效果则可恢复。

请问“等度反相高效液相色谱法”中的“等度”是什么意思？是指等度洗脱吗？谢谢！

高效液相色谱仪中反相HPLC柱子的清洁和再生

在高效液相色谱（HPLC）中，反相色谱柱（Reverse Phase Column，简称RPC）是一种常用的色谱柱，其特点是使用非极性的固定相和极性的流动相进行分离。 01.反相色谱柱的组成1）固定相（Stationary Phase）： 固定相通常是通过在硅胶基质上键合疏水性官能团来构建的，这些官能团可以是C18（十八烷基）、C8（辛基）、C4（丁基）或苯基等（C18、C8、C4的选择可参见高效液相色谱|反相色谱小知识-常见的固定相种类）。这些官能团提供了非极性的作用表面，与样品中的疏水性分子相互作用。（固定相的疏水性与样品分子的疏水性之间的作用力是分离过程中的关键因素。） 2）色谱柱管（Column Tube）： 色谱柱管通常由不锈钢或特殊塑料制成，以容纳填料并保证溶剂流动。柱管的内壁可能经过特殊处理，以减少样品与管壁的相互作用。 3）填料（Particle Filler）： 填料是固定相的载体，通常是球形硅胶颗粒，它们可以提供大量的表面积以供键合疏水性官能团。填料的粒径、孔径和形态（如球形、无定形）会影响色谱柱的效率和分离能力。 4）封端技术（End Capping）： 为了减少硅胶基质上的游离硅羟基与极性组分的相互作用，提高色谱峰的对称性，通常会采用封端技术。封端可以减少色谱峰拖尾，提高柱效和重现性。 02.固定相与流动相的作用 1）固定相（Stationary Phase）的作用： a. 提供相互作用表面：固定相具有特定的化学性质（如疏水性），能够与样品中的不同分子产生相互作用，如吸附、离子交换或化学键合等。 b. 分离基础：[color=#595959]固定相的化学和物理性质是实现样品分离的基础。在反相色谱中，固定相通常是疏水性的，与样品中的疏水性分子相互作用较强。 c. 影响保留时间：固定相的性质直接影响样品分子在色谱柱中的保留时间，即分子在色谱柱中移动的速度。 2）流动相（Mobile Phase）的作用： a. 携带样品通过色谱柱：流动相是推动样品分子通过色谱柱的介质，通常是一种或多种溶剂的混合物。 b. 调整分离选择性：通过改变流动相的组成（如有机溶剂和水的比例）、极性或pH值，可以调整样品分子与固定相之间的相互作用强度，从而影响分离效果。 c. 影响保留时间和选择性：流动相的极性越强，疏水性分子与固定相的相互作用越弱，分子的保留时间越短。反之，流动相的极性越弱，保留时间越长。 d. 影响色谱峰的形状：流动相的组成和性质还会影响色谱峰的对称性和分辨率。 03.反相色谱柱的分离机制 1）疏水作用： 在RPC中，固定相通常是高度疏水的，这意味着它不易与水分子相互作用。样品中的溶质分子根据它们的疏水性（即它们逃避水的倾向）与固定相的疏水基团相互作用。 2）分子与固定相的相互作用： 疏水性越强的分子越倾向于与固定相的疏水基团相互作用，因此它们在色谱柱中的移动速度较慢。这些分子在色谱柱中的保留时间较长，因为它们需要更多的时间才能被流动相洗脱。 04.反相色谱柱使用的影响因素 1）色谱柱的选择：色谱柱的固定相类型（如C18、C8、C4等）对分离效果有显著影响。不同的固定相有不同的疏水性，影响样品的保留时间。 2）流动相的组成：流动相的极性对样品的保留和分离至关重要。通常，流动相由水和有机溶剂（如甲醇、乙腈等）组成，通过调整有机溶剂的比例来控制样品的保留时间。 3）柱长：柱长对分离效率有影响，通常有机小分子和肽类的分辨率随柱长的增加而增加，但对于蛋白质和核酸等大分子，较短的柱子也可获得良好的分离效果。 4）色谱柱的填料粒径：填料粒径影响柱效和分离速度，较小的粒径可以提高柱效，但可能会增加柱压。 5）色谱柱的封端技术：封端技术可以减少样品与色谱柱中未反应的硅羟基的相互作用，改善峰形，特别是对于碱性化合物。 6）流动相的流速：流速对分辨率有显著影响，流速越小，色谱峰越宽，分辨率越低。流速的选择对制备色谱尤为重要。 7）温度：温度的升高可以降低流动相的粘度，加快流动速度，提高传质速度，从而提高分辨率。但温度升高也可能导致疏水性作用减弱，影响分离效果。 8）样品的pH值：调节流动相的pH值可以影响样品组分的解离状态，增加组分在固定相上的保留，改善峰形，特别是在分析弱酸或弱碱样品时。 9）样品的溶解度：样品在流动相中的溶解度应适宜，以避免在柱头沉淀，影响分离效果；必要时增加保护柱。 https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/09/202409301607495010_770_3203140_3.png!w490x14.jpg 总结一下： 简单来说，反相色谱柱在高效液相色谱中是用来分离不同疏水性分子的。它的固定相是一些疏水性的官能团，比如C18，它们就像一些小小的非极性的“粘性”表面，能够抓住样品中的疏水分子。 而流动相则是偏极性的溶剂混合物，比如含有水和有机溶剂，它的作用是带着样品分子穿过色谱柱。通过调整流动相的组成和比例，我们可以控制样品分子在色谱柱中的移动速度，从而实现分离。 色谱柱的性能还受到柱长、填料粒径、封端技术、流速、温度和样品pH值等因素的影响。这些因素就像调节旋钮，通过它们可以优化分离效果，让不同的分子按照我们希望的方式分开。

高效液相色谱仪怎么把正相冲回反相

[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=26431]反相高效液相色谱法测定淫羊藿叶[/url]发个帖子和大家分享～欢迎回帖～[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=26432]反相高效液相色谱法测定淫羊藿叶[/url]

[size=4] 由于使用高效液相色谱时间不长，对它的一些功能还不是很清楚，所以想问问液谱高手们： 高效液相色谱，配有二极管阵列检测器和C18反相柱，想问下可以通过它做食品分析：除了测防腐剂、糖精钠、合成色素，还能做其他哪些指标啊？ 或者再增加个其他什么柱子？可以增加些分析功能啊？ 谢谢了！！！[/size]

[color=#444444]反向高效液相色谱是流动相的极性大于固定相，极性大的物质先出峰，但有个问题我想不明白，当流动相为乙腈：水=50:50时，物质1在5.1min出峰，物质2在8.9分钟出峰，当改变流动相的比例为乙腈：水=30:70时，物质1和2的出峰时间均退后，而且物质1和2出峰时间相差更大，这应该怎么解释？水的极性大于乙腈，改变流动相的比例后，流动相的极性更大了，出峰时间不应该更短吗？为什么刚好相反？[/color]

分析喷气燃料中抗氧剂的真实含量对于研究和控制喷气燃料贮存的安全性具有重要意义。国外Cunningham等用高效液相色谱紫外检测器分析抗氧剂,国内目前普遍采用正相色谱,即以正己烷为流动相、用硅胶色谱柱和紫外检测器,直接测定喷气燃料中抗氧剂2,6-二叔丁基对甲酚的含量。我们利用该法测定样品时,发现油品出峰拖尾、保留时间漂移较大,重复性较差,并存在其他添加剂、油品组分及中间氧化产物的干扰等问题,说明该法对2,6-二叔丁基对甲酚抗氧剂的选择性不好。熊中强等采用反相高效液相色谱法测定了2,6-二叔丁基对甲酚的含量,虽然可使抗氧剂峰较好的分离,对实验室新配制的抗氧剂标准燃料溶液测定可以得到较为准确的结果,但对于实际储存的喷气燃料中抗氧剂的含量测定准确性较差,说明该法还不能很好地解决油品氧化中间产物等复杂组分干扰的问题。本文采用反相高效液相色谱-质谱(LC-MS)选择离子法测定喷气燃料中2,6-二叔丁基对甲酚的含量,方法简便、快速、高效。

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[size=4]清洗键合硅胶反相色谱柱的特殊方法[/size]有时，使用有机溶剂是不能去除色谱柱上的污染物的。如果金属离子被硅胶吸附或与键合，这种情况就特别明显了。这时，可以使用螯合试剂如0.05M的乙二胺四乙酸（EDTA）来冲洗色谱柱。EDTA会同许多金属形成络合物，并把他们进行溶解。在使用过了EDTA后，分析者可以用水彻底冲洗色谱柱。如果样品基体含有一些离子性的化合物，可以改变pH值使其变成非离子状态，然后用水—有机溶剂混合溶剂进行冲洗。例如，一个强碱性的基体化合物可以将其pH值调到小于3而将其去除，这会使质子化的胺在水中溶解性更大。对于去除酸性的基体化合物则是将pH值调到比较高—略高于其pKa——pH值大约为8或9，在这个pH值条件下，酸正处于它们的离子状态。然而，要小心键合硅胶基质的色谱柱，因为长时间暴露在高pH值下会损坏的（8）。为了控制缓冲体系和色谱柱中残留缓冲液中的细菌生长，色谱工作者可以使用一些家用的漂白剂稀释到1：10或1：20，用50个柱体积过柱，接着再用50个柱体积的高效液相色谱级的水进行冲洗。不能让漂白剂流经检测器，因为它会破坏流通池。为了防止溶剂瓶中的细菌生长，应该当天配制足够使用的缓冲液，并将不用的缓冲液存放在冰箱中，并加入0.1%的叠氮化钠，不允许在没有流速的情况下使缓冲液长时间驻留在色谱柱中。色谱工作者往往会讨论使用离子对试剂之后对色谱固定相柱产生的影响。一些离子对试剂如辛磺酸（用于阳离子）和四丁基溴化铵（用于阴离子）在含有某些有机改性剂的条件下会强烈地吸附在键合硅相的表面。色谱柱受到了污染不可能再生到他们的初始状态，这只能说用于离子对色谱的色谱柱需要为这门技术而献身，而且永远无法再用于常规的反相高效液相色谱。Bidlingmeyer（9）则并不赞同这种一般性的观点，认为较为极端的pH值，如在酸性条件下（pH 1-3）键合相和末端封尾硅羟基的水解或在高pH值（pH 7-8）条件下的硅胶溶解，这些离子对试剂能改变一些色谱柱的属性。为了去除磺酸类的离子对试剂，他推荐首先使用至少20倍柱体积的不含离子对试剂的相同流动相冲洗色谱柱，然后用不含缓冲液的流动相进行冲洗（在这个清洗步骤中，甲醇是一个比乙睛要好的有机溶剂；对于长链的离子对试剂，需要使用四氢呋喃）很明显，磺酸类的离子对试剂和胺类的离子对试剂存在不同的色谱行为，其对于色谱柱的影响是不同的。Bidlingmeyer和他的同事们（10）证明了当使用了C18柱，流动相浓度大于70％甲醇，SDS，这个长链的阴离子离子对试剂是不会吸附在固定相上的。这种发现也恰好验证了分离组的研究（7）。硅胶键合整体柱，例如Chromolith 色谱柱（Merk KGaA Darmstadt,Germany）应该被当成其他类型的硅胶色谱柱来进行处理。聚合柱的再生用来分离生物分子的聚合柱也会被污染而需要清洗。这种聚合材料的化学稳定性往往决定于它们的强度。实际上，许多的生产商推荐用1.0M的硝酸或1.0M的氢氧化钠来清洗聚合柱。某些反相聚合物柱子如聚乙烯填料（苯乙烯——二乙烯基苯）（PS-DVB）和聚合整体柱如CIM RP-SDVB的叠片柱(BIA Seperations, Ljublijana, Slovenia)以及Swift色谱柱(Isco, Lincoln, Nebraska)可以承受较宽的pH值范围（通常为1～13，有时为0～14），但是，使用者在用一些要求苛刻的有机试剂清洗色谱柱时应该谨慎。根据它们键交联度，当色谱柱暴露在有些有机溶剂中时，会使色谱柱填料产生收缩或膨胀。8—10％以上的高交联度的聚合填料通常具有非常良好的机械稳定性，在水相溶剂中有最小程度的收缩，而在有机溶剂中有最小程度的膨胀。在用一系列溶剂清洗聚合柱之前，最好能够参阅色谱柱手册，或同色谱柱生产商的技术支持部门进行商讨。按照BIA分离要求（11），使用者再生PS-DVB的聚合物整体柱可以通过：l 用10个柱体积的含0.1％的三氟乙酸的异丙醇，以一半的工作流速进行冲洗柱子；l 用至少5个柱体积的100％流动相B以一半的工作流速进行冲洗柱子；l 用至少10个柱体积的100％的流动相A以工作流速重新平衡色谱柱。如果要清洗一根有丁基和乙基的甲基丙烯酸填料的整体柱，可以用10倍柱体积的每份含1.0M的氢氧化钠、水、20％的乙醇溶液和缓冲液，反方向冲洗色谱柱（12），并将蛋白质除去。对于大部分的亲水性蛋白质，使用者应在用水清洗之后加入一个用异丙醇（30％V/V）或乙醇（70％V/V）的清洗步骤。对于微生物污染的清除和钝化，一根PS-DVB整体柱可以用0.5～1.0M的氢氧化钠完全清洗。装填的整体柱应该在室温下用氢氧化钠浸泡至少一个小时以上。用来分离复杂蛋白质如不溶性的细胞膜蛋白、结构蛋白和病毒外壳蛋白的传统聚合填料的色谱柱只需粗糙的清洗条件。例如，清洗这些复杂蛋白质（13）也许要在60 °C条件下用到含3M盐酸胍的50%的异丙醇。肽的合成中来自于固定相树脂的碎片，产生了活性碳正离子，这些碳正离子可以用苯甲醚和硫代苯甲醚来提取。这些碳正离子反应会产生大量的芳香分子，这些芳香分子会在肽的纯化中破坏反相色谱柱。这些污染物在C18柱内有很强的保留，不能用100％的乙睛或甲醇除去。为了清洗这些色谱柱，应该颠倒色谱柱的使用方向，然后用3～5个柱体积的100％异丙醇，3～5个柱体积的二氯甲烷，3～5个柱体积的异丙醇，再回到原来的初始溶剂系统进行冲洗（14）。芳香性杂质的洗脱可以用紫外检测器在260nm波长下进行核实。 氧化锆基质的高效液相色谱柱的再生ZirChrom 分离有限公司（Anoka，Minnesota）已经生产了一系列的氧化锆柱。其生产线也包括了一些反相液相色谱柱，如聚丁二烯、聚苯乙烯、石墨碳等形式。氧化锆要比硅胶更抗pH值，所以涂敷了氧化锆的色谱柱有更高的耐受性，能够经受住苛刻的操作环境，如高的pH值和操作温度。然而由于这些特殊的表面特性，分析者必须保持特定的分析条件以使他们的色谱柱成功地接受各种分析工作。碳酸、氟化物、磷酸根离子都会强烈地吸附在氧化锆柱上。为了将它们从色谱柱中清除，需用50倍柱体积的20％乙睛—0.1M氢氧化钠或0.1M的四甲基氢氧化铵，10倍柱体积的水，50倍柱体积的20％乙睛－0.1M硝酸，再用10倍柱体积的水，20倍柱体积的100％的有机溶剂进行冲洗。对于聚丁二烯和聚苯乙烯柱，色谱工作者可以用甲醇、乙睛、异丙醇或四氢呋喃。石墨碳色谱柱则需要在相同的溶剂中至少加入20％的四氢呋喃（15）。总结反相液相色谱柱会由于一些含强保留成分的样品基体的反复进样而造成污染，尤其是一些分子量高的、亲水性比较强的化合物、如蛋白质这样的生物流动性组成和一些会吸附在硅醇基上的强碱性物质。另外，某些流动相添加试剂如离子对试剂和表面活性剂会吸附在填料表面并改变其性质。被污染的色谱柱会产生糟糕的峰形、假的可重复的保留性、高的反压力和基线干扰。通常一些能够破坏污染物与色谱柱键合或硅胶表面反应的有机溶剂和试剂可以用来清洗色谱柱。 色谱工作者需要小心谨慎，因为这些试剂本身有很强的破坏作用，使用时会造成固定相本身的损坏。此外，通过使用样品的前处理过程，尽可能少地接触到污染物的样品，来防止色谱柱受污染是一个很好的步骤。在所有的应用中，本人强烈推荐使用保护柱来防止色谱柱的污染并对分析柱可能造成的伤害。

1.高效液相色谱柱的维护：我们在使用新的色谱柱应该在我们自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。而且在使用的过程中常常有堵塞的现象，造成这种现象的主要原因是①溶剂中的不溶物②样品中的不溶物③泵进样器等中的不溶物④柱内不溶物的形成等。如果当色谱柱堵塞以后我们可以对色谱柱进行修复，首先，使用含盐缓冲液后(如离子对试剂)应用溶解性强的溶剂(如水)进行冲洗。其次，先断开检测器，然后用对来自样品中的物质有强溶解性的溶剂进行冲洗，对于反相色谱柱，可使用甲醇、乙睛、四氢呋喃、氯仿、庚烷等，在此条件下，应避免溶剂的pH低于2或高于8。最后如果经过上述还是没有修复，色谱柱压力还是没有下降，则要断开检测器，将色谱柱反方向放置，然后检查柱压，若压力稳定下降，则保持色谱柱反方向连接，用低于0.5ml/min流速冲洗一小时。如果压力不下降，则要看内置过滤器是否被堵塞，如果被堵塞应冲洗或更换，若进口端的填料发生堵塞，柱子将不可能被彻底恢复，只能通过去掉进口端的部分填料，重新填充进行有限的柱效恢复。而且修复的厚度是2-5mm。2.高效液相色谱柱的保养：色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。我们在对色谱柱使用前进行测试以后，我们要根据不同的情况对色谱柱进行保养：①反相色谱柱每天实验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。②长期保存色谱柱：如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水(含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞)中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温.3高效液相色谱柱的维护与保养在液相色谱仪中的应用：高效液相色谱(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的分离分析技术，是现代分离测定的重要手段。问世以来，因其具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度好、能分析高沸点但不能气化的热不稳定生理活性物质的特点而被广泛应用于生物化学、药物及临床分析。高效液相色谱柱是消耗品，会随使用时间或进样的次数增加，出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰，柱效下降。需要定期进行彻底清洗和再生，不同的色谱柱清洗方法各不相同比如：3.1反相柱分别用甲醇:水=90:10，纯甲醇(HPLC级)，异丙醇(HPLC级)，二氯甲烷(HPLC级)等溶剂作为流动相，依次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的色谱柱体积.然后再以相反的次序冲洗。3.2正相柱分别用正己烷(HPLC级)，异丙醇(HPLC级)，二氯甲烷(HPLC级)，甲醇(HPLC级)等溶剂做流动相，顺次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的柱体积(异丙醇粘度大，可降低流速，避免压力过高).注意使用溶剂的次序不要颠倒，用甲醇冲洗完后，再以相反的次序冲洗至正己烷，所有的流动相必须严格脱水。3.3[/

[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=39898]反相高效液相色谱法测定五氯硫酚锌盐[/url]电子图书馆的东东，载下来与大家分享[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=39899]反相高效液相色谱法测定五氯硫酚锌盐[/url]

1.高效液相色谱柱的维护：我们在使用新的色谱柱应该在我们自己的液相色谱仪上进行性能测试，即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且，在以后的使用中，应时常对色谱柱进行测试。而且在使用的过程中常常有堵塞的现象，造成这种现象的主要原因是①溶剂中的不溶物②样品中的不溶物③泵进样器等中的不溶物④柱内不溶物的形成等。如果当色谱柱堵塞以后我们可以对色谱柱进行修复，首先，使用含盐缓冲液后(如离子对试剂)应用溶解性强的溶剂(如水)进行冲洗。其次，先断开检测器，然后用对来自样品中的物质有强溶解性的溶剂进行冲洗，对于反相色谱柱，可使用甲醇、乙睛、四氢呋喃、氯仿、庚烷等，在此条件下，应避免溶剂的pH低于2或高于8。最后如果经过上述还是没有修复，色谱柱压力还是没有下降，则要断开检测器，将色谱柱反方向放置，然后检查柱压，若压力稳定下降，则保持色谱柱反方向连接，用低于0.5ml/min流速冲洗一小时。如果压力不下降，则要看内置过滤器是否被堵塞，如果被堵塞应冲洗或更换，若进口端的填料发生堵塞，柱子将不可能被彻底恢复，只能通过去掉进口端的部分填料，重新填充进行有限的柱效恢复。而且修复的厚度是2-5mm　　2.高效液相色谱柱的保养：色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。我们在对色谱柱使用前进行测试以后，我们要根据不同的情况对色谱柱进行保养：①反相色谱柱每天实验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动相，实验完成后应用10%的甲醇/水冲洗30分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗30分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。②长期保存色谱柱：如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水(含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞)中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温.　　3高效液相色谱柱的维护与保养在液相色谱仪中的应用：高效液相色谱(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的分离分析技术，是现代分离测定的重要手段。问世以来，因其具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度好、能分析高沸点但不能气化的热不稳定生理活性物质的特点而被广泛应用于生物化学、药物及临床分析。高效液相色谱柱是消耗品，会随使用时间或进样的次数增加，出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰，柱效下降。需要定期进行彻底清洗和再生，不同的色谱柱清洗方法各不相同比如：　　3.1反相柱分别用甲醇:水=90:10，纯甲醇(HPLC级)，异丙醇(HPLC级)，二氯甲烷(HPLC级)等溶剂作为流动相，依次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的色谱柱体积.然后再以相反的次序冲洗。　　3.2正相柱分别用正己烷(HPLC级)，异丙醇(HPLC级)，二氯甲烷(HPLC级)，甲醇(HPLC级)等溶剂做流动相，顺次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的柱体积(异丙醇粘度大，可降低流速，避免压力过高).注意使用溶剂的次序不要颠倒，用甲醇冲洗完后，再以相反的次序冲洗至正己烷，所有的流动相必须严格脱水。　　3.3离子交换柱长时间在缓冲溶液中使用和进样，将导致色谱柱离子交换能力下降，用稀酸缓冲溶液冲洗可以使阳离子柱再生，反之，用稀碱缓冲溶液冲洗可以使阴离子柱再生。

[color=#444444]反相高效液相色谱柱方法的设定有什么经验吗？为什么跑的峰基线有点高[/color][color=#444444]?[/color][color=#444444]谢谢大家了[/color]

反相高效液相色谱保留因子模型参数的量子化学研究色谱中保留因子方程参数的确定对色谱分离条件的优化选择十分重要。以甲醇－水为流动相，我们曾尝试建立保留因子方程参数与苯系衍生物前线轨道能量之间的关系［］。本文以乙腈／水体系为流动相，对上述关系作一探讨。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=111070]反相高效液相色谱保留因子模型参数的量子化学研究[/url]

请教：用反相高效液相色谱能测定环己烷中痕量钴吗？

反相高效液相色谱法测定吸入用异丙托溴铵溶液中的有关物质卢来春，张 蓉△，刘同华，蒋学文(第三军医大学新桥医院药学部，重庆400037)摘 要：目的 采用反相高效液相色谱法测定吸入用异丙托溴铵溶液中的有关物质。方法 色谱柱为phenomenex-C8(4.6mm×250mm，5μm)和Ultimate® XB-C8(4.6mm×250mm，5μm)，流动相A 为乙腈一0.25庚烷磺酸钠溶液(29：71)用磷酸调pH值至3.2，流动相B为乙腈；检测波长为210nm；流速为l.0ml/min；进样量20μl。结果 异丙托溴铵与其有关物质能完全分离。结论 本方法准确、专属性强，可用于吸入用异丙托溴铵溶液有关物质的测定。关键词：反相高效液相色谱法；异丙托溴铵；有关物质中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：1671-8348(2007)11-1O672-O2反相高效液相色谱法测定吸入用异丙托溴铵溶液中的有关物质

离子色谱和高效液相色谱的定义和基本原理 ?离子色谱（Ion Chromatography, IC）?是一种利用离子交换原理，通过阴阳离子交换柱对样品中的离子进行分离的液相色谱方法。它主要用于分析阴离子和阳离子，通常采用?酸、?碱及?盐的水溶液作为流动相，使用?电导检测器进行检测。?高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）?则是利用混合物中各组分在固定相和流动相中的溶解度、分配系数、吸附能力等差异来实现分离。它广泛用于分析?有机化合物，通常采用有机溶剂作为流动相，使用?紫外-可见光度检测器进行检测。 仪器结构的区别 ?泵体和流路材料?：离子色谱通常采用非金属材料，如聚醚醚酮（PEEK）塑料作为泵体、流路和阀体，以耐受酸碱环境。而高效液相色谱多数采用金属材料，可以耐受有机溶剂，但对酸碱环境敏感。?检测器?：离子色谱主要使用电导检测器，而高效液相色谱常用紫外-可见光度检测器。?抑制器?：离子色谱中，抑制型离子色谱采用抑制器，这是高效液相色谱中没有的装置。 应用范围的区别 ?离子色谱?：主要用于无机离子的分析，广泛应用于水质分析、?[url=https://www.baidu.com/s?rsv_idx=1&wd=%E8%8D%AF%E7%89%A9%E5%88%86%E6%9E%90&fenlei=256&usm=2&ie=utf-8&rsv_pq=98bb5dff001b1cbd&oq=%E7%A6%BB%E5%AD%90%E8%89%B2%E8%B0%B1%E5%92%8C%E9%AB%98%E6%95%88%E6%B6%B2%E7%9B%B8%E8%89%B2%E8%B0%B1%E5%8C%BA%E5%88%AB&rsv_t=9d20iHeCEoeEFPq2PFr4V7nepFIwtfoUu%2FfRACeOmsPkb53TLJMtDAMEwhw&sa=re_dqa_generate]药物分析、?环保监测、食品安全等领域。?高效液相色谱?：主要用于有机化合物的分析，广泛应用于医药、化工、食品、环保等领域。 检测器的区别 ?离子色谱?：主要使用电导检测器，有时也使用安培检测器和紫外检测器。?高效液相色谱?：主要使用紫外-可见光度检测器。 流动相的区别 ?离子色谱?：通常使用酸、碱及盐的水溶液作为流动相。?高效液相色谱?：可以使用各种有机溶剂，如甲醇、乙腈等，也可以使用水和其他溶剂的混合物。 固定相的区别 ?离子色谱?：使用离子交换柱作为固定相，分为阴离子交换柱和阳离子交换柱。?高效液相色谱?：使用吸附剂作为固定相，分为正相色谱和反相色谱，正相色谱用于分离非极性化合物，反相色谱用于分离极性化合物。

[color=#444444]我准备用离子对反相高效液相色谱对核苷酸进行分析，查文献得到的洗脱程序如下：[/color][color=#444444] 100%缓冲液A 5min[/color][color=#444444] 0--77%缓冲液B 27min[/color][color=#444444] 77%缓冲液B 5min[/color][color=#444444] 0--100%缓冲液A 1min[/color][color=#444444] 100%缓冲液B 10min[/color][color=#444444]想请教各位：1.在第2、3步反应中，只有溶液B吗？剩余的一些百分比是水还是溶液A？2. 这种洗脱程序在岛津工作站中如何设定？谢谢各位的指教。。。。。。。。。[/color]

内容:Agilent1100高压液相色谱仪基本操作步骤Agilent1100液相基本操作步骤Agilent1100高压液相色谱仪维护保养知识保养事项： 高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法液相色谱柱使用及保养高压液相色谱HPLC培训教程(一)高压液相色谱HPLC培训教程(七)高效液相色谱仪中反相HPLC柱子的清洁和再生HPLC对流动相的基本要求高 效 液 相 色 谱Waters 600E-2487 HPLC系统SOPWaters高效液相色谱系统操作规程高效液相色谱仪(Agilent 1100)操作注意事项色谱扫盲班[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=41460]高效液相色谱知识收藏[/url]

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