多糖分离纯化系统

各位前辈好！最近想买用来分离β-葡聚糖的凝胶填料柱，分子量范围大概在8x104~1.6x106之间，看网上和书上的凝胶填料范围大多数写的是分离的蛋白质分子量的，有点小纠结了，这个是通用的吗？以蛋白质的分子量来看选择纯化多糖的填料准吗？大家有木有合适的、用的好的凝胶填料厂家，或者说明书啥的哈，谢谢各位了！

目的 从虎眼万年青中提取、分离水溶性多糖，初步研究其特征和抗肿瘤活性。 方法 采用热水提取，乙醇沉淀，Sevag法脱蛋白，DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱色谱和Sephadex G-75凝胶过滤柱色谱分离纯化，得到虎眼万年青均一多糖OCAP-2-2。毛细管区带电泳法（CZE）分析单糖组成；采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定多糖纯度和相对分子质量；动物移植性实体瘤的瘤重实验法研究对小鼠S180肉瘤的抑瘤作用，采用细胞体外培养技术，MTT法检测对人白血病细胞株K562细胞的增殖抑制作用。 结果 经过分离纯化得到的均一多糖组分OCAP-2-2主要由葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖等4种单糖组成，其相对分子质量之比为2.16∶1.26：0.88∶1.00，平均相对分子质量9.84×104，总糖含量为92.3%，总糖醛酸含量为6.21%，蛋白质含量为3.68%；在0.1～100 μgmL-1内与荷瘤对照组相比，OCAP-2-2对小鼠S180肉瘤有显著的抑制活性，其中多糖浓度为100 μgmL-1时抑瘤率达（53.16±4.23）% ([i]P＜[/i]0.001）；OCAP-2-2对K562细胞有明显的增殖抑制作用（[i]P＜[/i]0.01），在多糖浓度为0.10 μgmL-1时，增殖抑制率最高为（39.83±7.31）% ([i]P＜[/i]0.01）。 结论 OCAP-2-2具有很高的抗肿瘤活性，可以探索作为一种潜在的天然抗肿瘤药物。

[align=center][/align][font=宋体]一、原理[/font][font=宋体]1.[/font][font=宋体]多糖的分级与纯化[/font][font=宋体]多糖纯化的实质是将粗多糖中的杂质（包括蛋白质、色素、低聚糖、无机盐等非糖物质）除去而获得分子量和极性均一的多糖组分。比较常用的方法有：醇沉法、超滤法和柱层析法等。其中柱层析法应用比较普遍，多用于样品的精细分级,具有操作简单，重现性好的优点，但样品上样量小。用于多糖分离的柱层析主要有两类：一类是通过分子量大小进行分级的凝胶柱层析，如Sephadex G-100（200、50、25、10）、SepharoseCL-6B等系列；另一类是离子交换层析，是根据多糖所带电荷的性质不同选择相应的离子交换柱对多糖进行分级。如待分离的多糖带有负电荷，可选择阴离子型的DEAE-纤维素柱或DEAE-Sepharose柱进行分级，以获得均一的多糖组分。[/font][font=宋体]通过热水煮提方法提取的多糖，通常是混合物，且分子量不均一，其单糖组成、分子结构和聚合度往往不同，可通过柱层析的方法，对其进行分级以达纯化的目的。本实验中，采用[/font]DEAE-[font=宋体]纤维素柱层析的方法对中草药中水溶性粗多糖进行分级纯化，分离纯化出各级分多糖，[/font][font=宋体]为后续研究多糖的结构特征和生物活性奠定基础。[/font][font=宋体]2.[/font][font=宋体]苯酚—硫酸法[/font][font=宋体]游离的寡糖、多糖中的己糖或糖醛酸在浓硫酸的作用下，脱水生成糠醛，再与苯酚作用起显色反应，在一定范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，吸收值与糖含量呈线性关系。且己糖在[/font]490 nm[font=宋体]处（戊糖及糖醛酸在[/font]480 nm[font=宋体]）有最大吸收，故用比色法测定多糖含量。该法简单，快速，灵敏，且颜色持久，同一台设备同一光源仅需制作一条标准曲线。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二、步骤[/font]1.[font=宋体]中草药水溶粗多糖的提取流程[/font][font=宋体]中草药粉末[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]蒸馏水浸泡过夜[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]超声[/font]/[font=宋体]微波[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]水浴浸提[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]过滤去除药渣[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]定容[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]多糖含量测定[/font][font=宋体]加等体积[/font]95%[font=宋体]乙醇[/font][font=Symbol][/font]4[font=宋体]℃冰箱过夜，醇沉多糖[/font][font=Symbol][/font]5000r/min[font=宋体]离心去上清液[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]粗多糖[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]脱蛋白[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]脱色素[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]透析[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]浓缩[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]冷冻干燥得水溶多糖[/font][font=Symbol][/font]DEAE-[font=宋体]纤维素色谱柱[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]收集多糖组分[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]测定每[/font]50s[font=宋体]洗脱液的[/font]OD[font=宋体]值[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]绘制横坐标为管数与纵坐标为[/font]OD[font=宋体]值的洗脱曲线[/font][font=宋体]根据洗脱曲线收集多糖溶液[/font][font=Symbol][/font]4[font=宋体]℃无水乙醇醇沉过夜[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]离心[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]多糖沉淀[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]常规干燥[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]纯度鉴定[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]纯多糖[/font]2.[font=宋体]脱蛋白[/font][font=宋体]由于粗多糖中含有一定量游离的和结合的蛋白，为保证多糖的纯度，必须将蛋白质脱去。常用的脱蛋白方法有[/font]Sevag[font=宋体]法、三氯乙酸法和蛋白酶法（如链蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶）等。[/font][font=宋体]（[/font]1[font=宋体]）[/font]Sevag[font=宋体]法[/font][font=宋体]根据蛋白质在有机溶剂（如氯仿）中易发生变性析出的特点[/font][font=宋体]，把多糖配制成[/font]5%[font=宋体]的糖液，然后按照[/font]1:3[font=宋体]的体积比加入[/font]Sevag[font=宋体]试剂（氯仿∶正丁醇[/font]=4[font=宋体]∶[/font]1[font=宋体]），混匀后剧烈振荡，静置分层后吸去水层与溶剂层交界处的变性蛋白质，重复操作多次，直到除尽蛋白质为止。[/font][font=宋体]（[/font]2[font=宋体]）三氯乙酸法[/font][font=宋体]将粗多糖配成[/font]5%[font=宋体]的糖液，加入[/font]30%[font=宋体]三氯乙酸溶液，使三氯乙酸终浓度为[/font]15%[font=宋体]，在[/font]4℃[font=宋体]冰箱中放置过夜，离心弃去沉淀，得无蛋白的多糖溶液，再用[/font]1 mol/L NaOH[font=宋体]溶液中和至[/font]PH[font=宋体]为[/font]7[font=宋体]。[/font][font=宋体]（[/font]3[font=宋体]）蛋白酶法[/font][font=宋体]将粗多糖配成[/font]5%[font=宋体]的糖液，用酸碱调[/font]pH[font=宋体]至中性，加链蛋白酶[/font]0.5 L[font=宋体]，放恒温箱中[/font]37℃[font=宋体]保温[/font]24 h[font=宋体]后，加热升温至[/font]80℃[font=宋体]使酶失活，离心，得无蛋白的多糖溶液。[/font]3.[font=宋体]脱色[/font][font=宋体]（[/font]1[font=宋体]）[/font] [font=宋体]活性炭法[/font][font=宋体]将脱蛋白后的多糖配成[/font]5%[font=宋体]的糖液，用[/font]NaOH[font=宋体]溶液调[/font]pH[font=宋体]为[/font]4.5[font=宋体]，加入活性炭粉末，于[/font]80℃[font=宋体]保温[/font]2 h[font=宋体]后过滤。反复进行[/font]3[font=宋体]次，直到溶液颜色不再降低为止。[/font][font=宋体]（[/font]2[font=宋体]）过氧化氢法[/font][font=宋体]将脱蛋白后的多糖溶液，用浓氨水调至[/font]pH[font=宋体]为[/font]8.0[font=宋体]，逐滴滴加[/font]20%H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub][font=宋体]至溶液为浅黄色，[/font]50℃[font=宋体]水浴，保温[/font]2 h[font=宋体]后过滤。[/font]4.[font=宋体]透析脱盐[/font][font=宋体]将脱蛋白、脱色后多糖配成[/font]5%[font=宋体]溶液，置于透析袋中，先用自来水逆向流水透析[/font]72 h[font=宋体]后，再用蒸馏水透析[/font]24 h[font=宋体]，每[/font]4 h[font=宋体]换水一次。[/font]5.[font=宋体]干燥[/font][font=宋体]将脱蛋白、脱色、脱盐后的中草药多糖溶液，水浴[/font]80℃[font=宋体]浓缩至[/font]10 mL[font=宋体]，加三倍体积的无水乙醇过夜，离心取沉淀，经无水乙醇、乙醚洗涤后，常规干燥得中草药去蛋白去色素的多糖。[/font]6.[font=宋体]多糖含量测定[/font][font=宋体]采用苯酚[/font]-[font=宋体]硫酸法测定样品中的多糖含量。绘制标准曲线，根据葡萄糖标准曲线和样品吸光值计算其糖含量。[/font][font=宋体]标准曲线的制作：准确称取[/font]105℃[font=宋体]干燥恒重的标准葡萄糖[/font]50 mg[font=宋体]定容于[/font]500 mL[font=宋体]容量瓶中，加水至刻度，用移液管分别吸取[/font]0[font=宋体]、[/font]0.1[font=宋体]、[/font]0.2[font=宋体]、[/font]0.3[font=宋体]、[/font]0.4[font=宋体]、[/font]0.5[font=宋体]、[/font]0.6[font=宋体]、[/font]0.7[font=宋体]、[/font]0.8[font=宋体]、[/font]0.9[font=宋体]、[/font]1.0 mL[font=宋体]转入试管中，各以蒸馏水补至[/font]1.0 mL[font=宋体]，每个浓度重复四个平行。然后分别向每支试管中加入[/font]4%[font=宋体]苯酚试剂[/font]1mL[font=宋体]及浓硫酸[/font]2 mL[font=宋体]，摇匀，沸水浴中煮沸[/font]10 min[font=宋体]，冷却至室温，放置[/font]10 min[font=宋体]后在[/font]λ= 480 nm[font=宋体]处测定吸光值[/font]A[font=宋体]。以吸光值[/font]A[font=宋体]为纵坐标，糖含量[/font]C[font=宋体]为横坐标，得糖的标准曲线。[/font][font=宋体]样品溶液制备：精密称取水溶性粗多糖[/font]5 mg[font=宋体]，先加[/font]10 mL[font=宋体]蒸馏水溶解，然后定容至[/font]50 mL[font=宋体]。[/font][font=宋体]样品含量测定：用移液管吸取样品液[/font]1.0 mL[font=宋体]，加入[/font]4%[font=宋体]苯酚溶液[/font]1 mL[font=宋体]及浓硫酸[/font]2 mL[font=宋体]，按上述方法进行操作，测其吸光值，以标准曲线计算样品糖含量[/font][font=宋体]按下式计算中草药多糖的质量浓度与得率。[/font] [img=,300,41]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/11/202111021041176368_5305_3528941_3.gif!w300x41.jpg[/img]7.[font=宋体]分级[/font][font=宋体]（[/font]1[font=宋体]）[/font] DEAE-[font=宋体]纤维素的预处理和装柱[/font][font=宋体]将[/font]DEAE-[font=宋体]纤维素用蒸馏水充分浸泡溶胀后，倾倒除去水分，再用[/font]0.5 M NaOH[font=宋体]溶液浸泡[/font]1 h[font=宋体]，用蒸馏水反复洗涤至[/font]PH[font=宋体]等于[/font]7[font=宋体]。再用[/font]0.5 M[font=宋体]的[/font]HCl[font=宋体]溶液浸泡[/font]1 h[font=宋体]，用蒸馏水洗至中性，真空清除气泡，备用。[/font][font=宋体]装柱时，先将[/font]DEAE-[font=宋体]纤维素沿着玻璃棒缓慢倒入，以防产生气泡。柱子装好后，依次用[/font]5[font=宋体]倍柱体积的蒸馏水、[/font]3[font=宋体]倍柱体积的[/font]1.0 M NaCl[font=宋体]和[/font]5[font=宋体]倍柱体积的蒸馏水进行平衡，流速设定为[/font]20 cm/ h[font=宋体]。[/font][font=宋体]（[/font]2[font=宋体]）水溶性粗多糖的离子交换柱层析的线性梯度洗脱[/font][font=宋体]称取[/font]50 mg[font=宋体]水溶性粗多糖，溶于[/font]5 mL[font=宋体]蒸馏水中，在已平衡好的[/font]DEAE-[font=宋体]纤维素离子交换柱（[/font]1.5 × 14 cm[font=宋体]，[/font]Cl[sup]-[/sup][font=宋体]型）上进行上样，先用[/font]100 mL[font=宋体]蒸馏水做流动相进行洗脱，再用[/font]0~1.0 M NaCl[font=宋体]溶液[/font]300 mL[font=宋体]进行线形梯度洗脱，流速[/font]1.0 mL/min[font=宋体]，每个试管收集[/font]3 mL[font=宋体]洗脱液，苯酚—硫酸法测定洗脱液中相对的糖含量分布。[/font]8.[font=宋体]纯度鉴定[/font][font=宋体]（[/font]1[font=宋体]）高效液相色谱法[/font][font=宋体]采用高效液相色谱仪系统，[/font] 10A[font=宋体]检测器，[/font]CLASS-Vp[font=宋体]工作站，[/font]TSK-gel G-3000PWXL[font=宋体]不锈钢色谱柱（[/font]7.8 × 300 mm)[font=宋体]，柱温为[/font]40℃[font=宋体]。[/font][font=宋体]取各级多糖样品溶于[/font]0.7 M Na2SO4[font=宋体]溶液中，其多糖终浓度为[/font]2 mg/mL[font=宋体]，上样[/font]20 μL[font=宋体]，流动相为[/font]0.7 M Na2SO4[font=宋体]溶液，流速为[/font]0.5 mL/min[font=宋体]。[/font][font=宋体]（[/font]2[font=宋体]）紫外光谱分析[/font][font=宋体]将水溶性粗多糖各级分多糖样品配成[/font]0.1 mg/mL[font=宋体]的溶液，用[/font]752PC[font=宋体]型紫外可见分光光度计于[/font]200-400 nm[font=宋体]处扫描检测。[/font][font=宋体]（[/font]3[font=宋体]）旋光仪分析[/font][font=宋体]不同的多糖具有不同的比旋度，它们在不同浓度的乙醇中具有不同溶解度，所以，如同一多糖水溶液经不同浓度的乙醇沉淀所得的沉淀物，具有相同比旋度，则证明该多糖为均一组分。[/font][font=宋体]将评估多糖样品溶于水，成为近似半饱和溶液，置于磁力搅拌器上，在搅拌下加乙醇，使溶液中乙醇浓度达到[/font]20%[font=宋体]，搅拌片刻，使沉淀完全，离心得沉淀。上清液中再继续滴加乙醇，使溶液中乙醇浓度达[/font]40%[font=宋体]，所产生的沉淀再经离心。前后两次沉淀，分别干燥后在相同条件下测定其水溶液的比旋度。[/font][font=宋体]将[/font]10 mL5%[font=宋体]饱和糖液用国产[/font]WXG[font=Symbol]-[/font]6[font=宋体]型自动旋光仪，钠灯光源，以蒸馏水调零点，[/font]1dm[font=宋体]管室温下测定。[/font]

我现在正在做植物中多糖的提取、分离和纯化，在测定多糖分子量时，若没有除蛋白会不会影响结果？还有多糖要多纯才能进行测定分子量呢？谢谢

我提取出来的多糖，经DEAE-52离子交换柱分离得到三个不同组分，但是经HPLC---TSK G-4000PWxl洗脱却得到一个很均一的峰...想了解下为什么会这样？看峰形很对称、狭窄（比我用的标准糖的峰宽要窄），说明多糖分子量很均一么？洗脱条件：0.3ml/min，超纯水超纯水洗脱，TSK G-4000PWxl柱子，ELSD（蒸发光散射检测器）[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/04/201004121638_211589_1169172_3.gif[/img]补充：楼下有板油提到说是GPC的峰形是这种图形有问题，馒头形的会好一些....但是..我走的标准品差不多也是这个形状的，我把标准品的图形也给放上，大家给参考下..标准品用的是Sigma的Dextran标准品，分子量是1000Da...[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/04/201004131525_211844_1169172_3.gif[/img]

分离纯化谷物β-葡聚糖一般用什么阴离子交换色谱柱和凝胶过滤色谱柱哇

[color=#333333]该文建立了大孔树脂-高速逆流色谱分离中药材地黄中有效成分毛蕊花糖苷的方法。考察了4种大孔树脂对地黄粗提物中毛蕊花糖苷的静态吸附与解吸情况,其中D101大孔树脂对目标成分的吸附率与解吸率最理想,实验结果表明体积分数为10%的乙醇洗脱得到的毛蕊花糖苷含量最高,目标成分含量从4.9%提高到32.6%。最后,部分纯化的样品(165 mg)采用高速逆流色谱进一步纯化,两相溶剂系统由乙酸乙酯-正丁醇-水(1∶4∶5,v/v/v)组成,分离得到45 mg纯度为96%的毛蕊花糖苷。 [/color]

多糖分子量怎么求，可以有具体点的方法吗

请问有没有做过利用Thermo 的SEC 色谱柱测多糖分子量或者分离多糖的？可行么？有什么注意的地方？

http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/brow/em09504.gif各位大虾，请教一下多糖分子量分布GPC柱子的选择问题，我想做香菇多糖的分子量分布，对照的分子量分别为10000,21400,41100,133800和2000000，样品的分子量大约为40~50万，请问我选择OHpak SB-803HQ 的柱子合适吗？我在网上查了一下，它的排阻限是 100,000，粒径是 6um，规格I.D.×L（mm） 8.0 x 300。还有这里的排阻限是什么意思啊，是指能通过该柱子的最大分子量吗？多糖的分离与填料的粒径有何关系啊？

请教如何出去多糖中的单糖和双糖

我做植物多糖，想对提取出的多糖进行分子量测定，直接用HPLC凝胶柱测定分子量，该多糖分子量在1w以上，不知该怎么对柱子进行选型，请诸位经验丰富的大虾多多指点。

刚接触GPC，公司也没有什么资料，只是保留了以前多糖分子量的谱图，以前测得多糖分子量几万，现在通过标曲再定量分子量只有几千，测灵芝多糖用什么色谱条件比较好啊，以前的要调PH，现在我查文献磷酸盐调PH检测也达不到之前的分子量，双蒸水走出峰是早了，但是分不开。色谱柱型号是Ultrahydrogel 120,Ultrahydrogel 250,Ultrahydrogel 500,三根色谱柱串联，流速是0.8ml/min.温度35度，2414示差检测器，求大神指导迷津。

[font=宋体]蛋白质的分离纯化是生物科学领域中的一项关键技术，它涉及到从复杂的混合物中分离并纯化出特定的蛋白质。这个过程通常包括多个步骤，每个步骤都需要精确的操作和优化，以确保最终得到的蛋白质具有高纯度和活性。下面我们将详细介绍蛋白质的分离纯化步骤。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分离、精细分离三个步骤。[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]①前处理[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]为此，动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较麻烦，破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波破碎，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]组织和细胞破碎后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]如果所要的蛋白主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等，则可利用差速离心的方法将它们分开，收集该细胞组分作为下步纯化的材料。如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当介质提取。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]②粗分离[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分离用超滤、盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白溶液。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]③精细分离[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]样品经粗分级分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法包括离子交换层析、亲和层析、疏水层析以及分子筛等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]结晶是[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification][b]蛋白质分离纯化[/b][/url]的最后步骤。尽管结晶过程并不能保证蛋白一定是均一的，但是只有某种蛋白在溶液中数量上占有优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白。由于结晶过程中从未发现过变性蛋白，因此蛋白的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/recombinant-protein-expression-service][b]重组蛋白表达服务[/b][/url][/font][font=宋体]，可以根据客户需求，选用不同表达[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]纯化标签、表达宿主等，真正为客户实现深度私人定制。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化详情：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification[/font][/font]

最近在做生姜糖蛋白的提取纯化，看了很多文献，都要用到DEAE-52纤维素纯化，想问一下大家收集管数应该按照什么计算，是按照柱体积吗，多少个柱体积为一管呢？目前洗脱条件如下：上样浓度50mg/ml，上样量1ml，柱子规格16mm×20cm，洗脱液0.2mol/L Tris缓冲液(含0.1mol/LNaCl),pH7.8,每10ml一管进行收集，共收集50管，在1-5管处有蛋白和多糖共同的洗脱峰。

[color=#fe2419][size=2]维权声明：本文为19861005原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。[b][size=3]多糖提取分离的基本流程[/size][/b][/size][/color][font=KaiTi_GB2312][size=4] 长期以来，天然药物化学与药理学研究工作侧重于脂溶性化学成分，如生物碱，苷类等，而对水溶性多糖类有效成分重视不够，在天然药物活性成分研究中往往将多糖作为杂质除去。近年来，国内外对多糖的研究比较活跃，其作为生物效应调节剂，主要具有抗肿瘤，抗炎，抗凝血，抗病毒，降血糖，降血脂等活性。[/size][size=4][/size][size=4] 今天我就和大家探讨一下多糖的提取分离方法。[/size][size=4][/size][color=#fe2419][size=4][b]（一）提取[/b][/size][/color][size=4][/size][size=4] 水提得到的粗多糖水溶液，加入[/size][size=4]95%[/size][size=4]乙醇使含醇量达[/size][size=4]80%[/size][size=4]，[/size][size=4]4[/size][size=4]摄氏度静置过夜，多糖析出。减压抽滤，用[/size][size=4]95%[/size][size=4]乙醇洗至上清液无色，挥干醇。[/size][size=4][/size][color=#fe2419][size=4][b]（二）除蛋白[/b][/size][/color][size=4][/size][size=4] 这是至关重要的一步，由于蛋白是大分子，它的存在会干扰多糖的纯化。一般选用[/size][size=4]sevage[/size][size=4]法萃取或离心，多糖浓度为[/size][size=4]1mg/ml, [/size][size=4]氯仿[/size][size=4]-[/size][size=4]正丁醇比例通常在[/size][size=4]3:1~5:1[/size][/font][font=KaiTi_GB2312][size=4]之间，变性的蛋白质一般在两相交界处产生一条白色的带。建议进行小试，确定最佳比例，同时确定除蛋白的次数，如果含量较多建议八次以上，含量较少的话四到五次即可。[b][color=#fe2419]（三）检测[/color][/b][/size][size=4][/size][size=4] 除蛋白前后用紫外分光光度计检测[/size][size=4]280nm[/size][size=4]（蛋白质）和[/size][size=4]260nm[/size][size=4]（核酸）下的吸收值，多糖浓度为[/size][size=4]0.4mg/ml[/size][size=4]对照验证除蛋白的效果。需注意的是氯仿的比例不宜太大，否则可能会破坏多糖。萃取时产生的乳化现象，可用超声除去。除蛋白后的多糖水溶液会有很浓的有机试剂味道，可以用悬蒸除去。[/size][size=4][/size][b][color=#fe2419][size=4]([/size][size=4]四[/size][size=4])[/size][size=4]离子交换纤维素[/size][size=4](DEAE-[/size][size=4]纤维素[/size][size=4])[/size][size=4]进行初步分离[/size][size=4][/size][/color][/b][size=4] [/size][size=4]一般选用[/size][size=4]DE-52[/size][size=4]型离子交换纤维素[/size][size=4][/size][b][color=#0162f4][size=4][/size][size=4]柱的预处理[/size][size=4][/size][/color][/b][size=4] [/size][size=4]加蒸馏水浸泡过夜，期间换几次水，每次除去细小颗粒，，用[/size][size=4]0.5mol/LHCl[/size][size=4]溶液浸泡[/size][size=4]1~2h, [/size][size=4]蒸馏水漂洗至中性；再用[/size][size=4]0.5mol/LNaOH[/size][size=4]溶液浸泡[/size][size=4]1~2h, [/size][size=4]蒸馏水漂洗至中性。[/size][size=4][/size][b][color=#2690fe][size=4][/size][size=4]洗脱[/size][size=4][/size][/color][/b][size=4] [/size][size=4]样品浓度在[/size][size=4]20mg/ml[/size][size=4]左右。先用水洗脱，再用[/size][size=4]NaCl[/size][size=4]梯度洗脱，小试时的梯度应密集一些，[/size][size=4]0.05, 0.1, 0.3, 0.5mol/L[/size][size=4]洗脱，每瓶[/size][size=4]8ml, 10min[/size][size=4]左右一瓶即可。根据紫外检测的结果，再进行梯度的修改。[/size][size=4][/size][color=#0162f4][b][size=4][/size][size=4]合并流分[/size][/b][size=4][/size][/color][size=4] [/size][size=4]硫酸[/size][size=4]-[/size][size=4]蒽酮法结合紫外检测[/size][size=4][/size][b][color=#fe9a95][size=4]（[/size][size=4]1[/size][size=4]）硫酸[/size][size=4]-[/size][size=4]蒽酮试剂的配制[/size][size=4][/size][/color][/b][size=4]称取[/size][size=4]0. 1g[/size][size=4]蒽酮至容量瓶中，加少量浓硫酸，搅拌使其溶解，加浓硫酸至[/size][size=4]50ml[/size][size=4]摇匀，得[/size][size=4]0.2%[/size][size=4]的硫酸[/size][size=4]-[/size][size=4]蒽酮试剂，尽量现配先用，也可放[/size][size=4]4[/size][size=4]摄氏度冷藏备用，若颜色变绿，则说明已变质不能使用。[/size][size=4][/size][color=#fe9a95][b][size=4]（[/size][size=4]2[/size][size=4]）方法[/size][/b][/color][size=4][/size][size=4]馏分隔管检测，每管取[/size][size=4]0.5ml[/size][size=4]，在冰浴中加入[/size][size=4]2ml[/size][size=4]硫酸[/size][size=4]-[/size][size=4]蒽酮试剂，然后在沸水中煮[/size][size=4]10~15min, [/size][size=4]自来水冷却，放至室温。[/size][size=4][/size][color=#fe9a95][b][size=4]（[/size][size=4]3[/size][size=4]）紫外检测[/size][/b][/color][size=4][/size][size=4] [/size][size=4]主要看[/size][size=4]610nm[/size][size=4]出吸收值，合并馏分。[/size][size=4][/size][b][color=#f10b00][size=4]（五）凝胶[/size][size=4]G[/size][size=4]进一步纯化[/size][/color][/b][size=4] [/size][size=4] [/size][size=4]通常采用[/size][size=4]G-100[/size][size=4]或[/size][size=4]G-200[/size][size=4]不断进行纯化[/size][size=4] [/size][b][color=#f10b00][size=4]（六）纯度检测[/size][size=4][/size][/color][/b][size=4] [/size][size=4]采用高效液相凝胶柱进行检测[/size][size=4][/size][size=4][b]总结[/b] 以上就是本人在多糖提取分离过程中的一些步骤和小心得，愿与大家分享，互相学习，互相进步，共同为加快多糖研究的进展推波助澜~[img]http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/brow/em09502.gif[/img][/size][/font][size=4][font=Times New Roman][/font][/size]

具体的方法随各中草药的性质不同而异，以后将通过实例加以叙述，此处只作一般原则性的讨论。 　　（一）溶剂分离法：一般是将上述总提取物，选用三、四种不同极性的溶剂，由低极性到高极性分步进行提取分离。水浸膏或乙醇浸膏常常为胶伏物，难以均匀分散在低极性溶剂中，故不能提取完全，可拌人适量惰性填充剂，如硅藻土或纤维粉等，然后低温或自然干燥，粉碎后，再以选用溶剂依次提取，使总提取物中各组成成分，依其在不同极性溶剂中溶解度的差异而得到分离。例如粉防己乙醇浸膏，碱化后可利用乙醚溶出脂溶性生物碱，再以冷苯处理溶出粉防己碱，与其结构类似的防己诺林碱比前者少一甲基而有一酚羟基，不溶于冷苯而得以分离。利用中草药化学成分，在不同极性溶剂中的溶解度进行分离纯化，是最常用的方法。 　　广而言之，自中草药提取溶液中加入另一种溶剂，析出其中某种或某些成分，或析出其杂质，也是一种溶剂分离的方法。中草药的水提液中常含有树胶、粘液质、蛋白质、糊化淀粉等，可以加入一定量的乙醇，使这些不溶于乙醇的成分自溶液中沉淀析出，而达到与其它成分分离的目的。例如自中草药提取液中除去这些杂质，或自白及水提取液中获得白及胶，可采用加乙醇沉淀法；自新鲜括楼根汁中制取天花粉素，可滴人丙酮使分次沉淀析出。目前，提取多糖及多肽类化合物，多采用水溶解、浓缩、加乙醇或丙酮析出的办法。 　　此外，也可利用其某些成分能在酸或碱中溶解，又在加碱或加酸变更溶液的pH后，成不溶物而析出以达到分离。例如内酯类化合物不溶于水，但遇碱开环生成羧酸盐溶于水，再加酸酸化，又重新形成内酯环从溶液中析出，从而与其它杂质分离；生物碱一般不溶于水，遇酸生成生物碱盐而溶于水，再加碱碱化，又重新生成游离生物碱。这些化合物可以利用与水不相混溶的有机溶剂进行萃取分离。一般中草药总提取物用酸水、碱水先后处理，可以分为三部分：溶于酸水的为碱性成分（如生物碱），溶于碱水的为酸性成分（如有机酸），酸、碱均不溶的为中性成分（如甾醇）。还可利用不同酸、碱度进一步分离，如酸性化台物可以分为强酸性、弱酸性和酷热酚性三种，它们分别溶于碳酸氢钠、碳酸钠和氢氧化钠，借此可进行分离。有些总生物碱，如长春花生物碱、石蒜生物碱，可利用不同rH值进行分离。但有些特殊情况，如酚性生物碱紫董定碱（corydine）在氢氧化钠溶液中仍能为乙醚抽出，蝙蝠葛碱（dauricins）在乙醚溶液中能为氢氧化钠溶液抽出，而溶于氯仿溶液中则不能被氢氧化钠溶液抽出；有些生物碱的盐类，如四氢掌叶防己碱盐酸盐在水溶液中仍能为氯仿抽出。这些性质均有助于各化合物的分离纯化。 　　（二）两相溶剂萃取法： 　　1．萃取法：两相溶剂提取又简称萃取法，是利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。萃取时如果各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高、如果在水提取液中的有效成分是亲脂性的物质，一般多用亲脂性有机溶剂，如苯、氯仿或乙醚进行两相萃取，如果有效成分是偏于亲水性的物质，在亲脂性溶剂中难溶解，就需要改用弱亲脂性的溶剂，例如乙酸乙酯、丁醇等。还可以在氯仿、乙醚中加入适量乙醇或甲醇以增大其亲水性。提取黄酮类成分时，多用乙酸乙脂和水的两相萃取。提取亲水性强的皂甙则多选用正丁醇、异戊醇和水作两相萃取。不过，一般有机溶剂亲水性越大，与水作两相萃取的效果就越不好，因为能使较多的亲水性杂质伴随而出，对有效成分进一步精制影响很大。 　　两相溶剂萃取在操作中还要注意以下几点： 　　1）先用小试管猛烈振摇约1分钟，观察萃取后二液层分层现象。如果容易产生乳化，大量提取时要避免猛烈振摇，可延长萃取时间。如碰到乳化现象，可将乳化层分出，再用新溶剂萃取；或将乳化层抽滤，或将乳化层稍稍加热；或较长时间放置并不时旋转，令其自然分层。乳化现象较严重时，可以采用二相溶剂逆流连续萃取装置。 　　2） 水提取液的浓度最好在比重1．1～1．2之间，过稀则溶剂用量太大，影响操作。 　　3） 溶剂与水溶液应保持一定量的比例，第一次提取时，溶剂要多一些，一般为水提取液的1/3，以后的用量可以少一些，一般1/4-1/6。 　　4）一般萃取3～4次即可。但亲水性较大的成分不易转入有机溶剂层时，须增加萃取次数，或改变萃取溶剂。 　　萃取法所用设备，如为小量萃取，可在分液漏斗中进行；如系中量萃取，可在较大的适当的下口瓶中进行。在工业生产中大量萃取，多在密闭萃取罐内进行，用搅拌机搅拌一定时间，使二液充分混合，再放置令其分层；有时将两相溶液喷雾混含，以增大萃取接触，提高萃取效率，也可采用二相溶剂逆流连续萃取装置。 　　2．逆流连续萃取法：是一种连续的两相溶剂萃取法。其装置可具有一根、数根或更多的萃取管。管内用小瓷圈或小的不锈钢丝圈填充，以增加两相溶剂萃取时的接触面。例如用氯仿从川楝树皮的水浸液中萃取川楝素。将氯仿盛于萃取管内，而比重小于氯仿的水提取浓缩液贮于高位容器内，开启活塞，则水浸液在高位压力下流入萃取管，遇瓷圈撞击而分散成细粒，使与氯仿接触面增大，萃取就比较完全。如果一种中草药的水浸液需要用比水轻的苯、乙酸乙酯等进行萃取，则需将水提浓缩液装在萃取管内，而苯、乙酸乙酯贮于高位容器内。萃取是否完全，可取样品用薄层层析、纸层析及显色反应或沉淀反应进行检查。 　　3．逆流分配法（CounterCurrentDistribution，CCD）：逆流分配法又称逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法与两相溶剂逆流萃取法原理一致，但加样量一定，并不断在一定容量的两相溶剂中，经多次移位萃取分配而达到混合物的分离。本法所采用的逆流分布仪是由若干乃至数百只管子组成。若无此仪器，小量萃取时可用分液漏斗代替。预先选择对混合物分离效果较好，即分配系数差异大的两种不相混溶的溶剂。并参考分配层析的行为分析推断和选用溶剂系统，通过试验测知要经多少次的萃取移位而达到真正的分离。逆流分配法对于分离具有非常相似性质的混合物，往往可以取得良好的效果。但操作时间长，萃取管易因机械振荡而损坏，消耗溶剂亦多，应用上常受到一定限制。 　　4．液滴逆流分配法：液滴逆流分配法又称液滴逆流层析法。为近年来在逆流分配法基础上改进的两相溶剂萃取法。。对溶剂系统的选择基本同逆流分配法，但要求能在短时间内分离成两相，并可生成有效的液滴。由于移动相形成液滴，在细的分配萃取管中与固定相有效地接触、摩擦不断形成新的表面，促进溶质在两相溶剂中的分配，故其分离效果往往比逆流分配法好。且不会产生乳化现象，用氮气压驱动移动相，被分离物质不会因遇大气中氧气而氧化。本法必须选用能生成液滴的溶剂系统，且对高分子化合物的分离效果较差，处理样品量小（1克以下），并要有一定设备。应用液滴逆流分配法曾有效地分离多种微量成分如柴胡皂甙原小檗碱型季铵碱等。液滴逆流分配法的装置，近年来虽不断在改进，但装置和操作较繁。目前，对适用于逆流分配法进行分离的成分，可采用两相溶剂逆流连续萃取装置或分配柱层析法进行。

全自动层析分离纯化系统和制备液相是一样的吗?有什么区别?

[font=宋体]链接：[/font]https://bbs.instrument.com.cn/topic/2112837问题描述：[font=宋体]膜分离系统应用澄清纯化技术－超[/font][font='Times New Roman','serif']/[/font][font=宋体]微滤膜系统及优点？[/font]解答：[font=宋体][color=black][back=white]澄清纯化分离所采用的膜主要是超[/back][/color][/font][color=black][back=white]/[/back][/color][font=宋体][color=black][back=white]微滤膜，由于其所能截留的物质直径大小分布范围广，被广泛应用于固液分离、大小分子物质的分离、脱除色素、产品提纯、油水分离等工艺过程中。超[/back][/color][/font][color=black][back=white]/[/back][/color][font=宋体][color=black][back=white]微滤膜分离可取代传统工艺中的自然沉降、板框过滤、真空转鼓、离心机分离、溶媒萃取、树脂提纯、活性炭脱色等工艺过程。澄清纯化技术可采用的膜分离组件主要有：陶瓷膜、平板膜、不锈钢膜、中空纤维膜、卷式膜、管式膜。[/back][/color][/font][font=宋体][color=black][back=white]采用膜分离澄清纯化的优点：[/back][/color][/font][color=black][back=white]a) [/back][/color][font=宋体][color=black][back=white]可得到绝对的真溶液，产品稳定性好。[/back][/color][/font][color=black][back=white]b) [/back][/color][font=宋体][color=black][back=white]过滤分离收率高。[/back][/color][/font][color=black][back=white]c) [/back][/color][font=宋体][color=black][back=white]分离效果好，产品质量高，运行成本低。[/back][/color][/font][color=black][back=white]d) [/back][/color][font=宋体][color=black][back=white]缩短生产周期，降低生产成本。[/back][/color][/font][color=black][back=white]e) [/back][/color][font=宋体][color=black][back=white]过程无需添加化学药品、溶媒溶剂，不带入二次污染物质。[/back][/color][/font][color=black][back=white]f) [/back][/color][font=宋体][color=black][back=white]操作简便，占地面积小，劳动力成本低。[/back][/color][/font][color=black][back=white]g) [/back][/color][font=宋体][color=black][back=white]可拓展性好，容易实现工业化扩产需求。[/back][/color][/font][color=black][back=white]h) [/back][/color][font=宋体][color=black][back=white]设备可自动运行，稳定性好，维护方便。[/back][/color][/font]以上内容来自仪器信息网《样品前处理实战宝典》

[font=宋体]蛋白质纯化系统是一种用于从混合物中纯化目标蛋白的设备和方法。它结合了多种技术和步骤，可以有效地分离和纯化蛋白质，提供高纯度和高活性的目标蛋白。蛋白质纯化系统是实现蛋白质纯化的关键装置，它结合了各种分离、富集和纯化方法，帮助科研工作者实现蛋白质的高纯度提取。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]蛋白质纯化系统的基本原理[/b][/font][font=宋体]蛋白质纯化系统主要依据蛋白质的特性利用不同的物理化学方法进行分离和纯化。下面将介绍几种常见的蛋白质纯化系统的基本原理。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析[/b][/url][/font][/font][font=宋体]亲和层析是一种基于蛋白质的特异性与配体的亲和性相互作用来实现分离和纯化的方法。在亲和层析过程中，蛋白质溶液通过填充有配体的柱子，与配体结合形成复合物，而非特异性结合的其他组分被洗脱。最后，通过改变条件来破坏蛋白质与配体的结合，从而使得目标蛋白质得以纯化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②凝胶过滤层析[/font][font=宋体]凝胶过滤层析是一种基于蛋白质大小差异来进行分离的方法。在凝胶过滤层析中，待纯化的蛋白质溶液通过一系列的凝胶层析柱，大分子的蛋白质不能进入凝胶颗粒的内部，而小分子的蛋白质则可以进入凝胶颗粒内部。通过调整凝胶的孔径，可以实现对目标蛋白质的选择性分离和纯化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]③[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-iec][b]离子交换层析[/b][/url][/font][/font][font=宋体][font=宋体]离子交换层析是一种基于蛋白质与固定在柱子上的离子交换基的电荷相互作用来实现分离和纯化的方法。在离子交换层析中，蛋白质溶液通过带有离子交换基的柱子，与柱子上的离子交换基之间发生相互作用。通过改变溶液的离子浓度和[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]值，可以实现对蛋白质的选择性吸附和洗脱。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]④逆流层析[/font][font=宋体]逆流层析是一种基于分子质量和电荷差异来实现蛋白质分离和纯化的方法。在逆流层析中，蛋白质溶液通过填充有逆流层析介质的柱子，溶液在反向流动的情况下通过层析柱。由于不同蛋白质之间的分子质量和电荷差异，它们在逆流层析介质中的移动速度不同，从而实现对蛋白质的分离和纯化。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]蛋白质纯化系统的应用[/b][/font][font=宋体]蛋白质纯化系统在生物医药领域有着广泛的应用，下面将介绍几个常见的应用场景。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①药物研发[/font][font=宋体]蛋白质纯化系统在药物研发中起到了非常重要的作用。通过蛋白质纯化系统，科研人员可以从复杂的生物样品中高效纯化出目标蛋白质，为药物研发提供了可靠的原料和工具。蛋白质纯化系统不仅可以提高药物研发的效率，还可以确保药物的纯度和质量，从而提高药物的疗效和安全性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②生物学研究[/font][font=宋体]在生物学研究中，蛋白质纯化系统被广泛应用于蛋白质相互作用研究、蛋白质结构解析和功能分析等方面。通过蛋白质纯化系统，科研人员可以从不同的细胞和组织中提取目标蛋白质，进一步研究它们之间的相互关系和作用机制。蛋白质纯化系统还可以用于蛋白质结构解析，帮助科学家揭示蛋白质的三维结构以及其功能。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③临床诊断[/font][font=宋体]蛋白质纯化系统在临床诊断中也起到了重要的作用。通过蛋白质纯化系统，医生可以从患者的生物样本中纯化出特定的蛋白质标志物，用于疾病早期诊断、病情监测和治疗评估等方面。蛋白质纯化系统在临床诊断中的应用可以帮助医生及早发现疾病，提高诊断的准确性和效率。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]蛋白质纯化系统是实现蛋白质纯化的重要装置，它结合了多种分离、富集和纯化方法，帮助科研人员高效地提取目标蛋白质。蛋白质纯化系统的应用广泛，不仅在药物研发、生物学研究和临床诊断等领域发挥重要作用，还为科学家揭开蛋白质的结构和功能提供了有力的支持。通过不断的技术创新和优化，蛋白质纯化系统将更好地满足科研和临床的需求，推动生物医药领域的发展。[/font][font=Calibri] [/font]

【序号】：【作者】： 赵丰丽 张云鸽 宁良丹【题名】：红菇多糖的提取分离及其抗氧化活性的研究【期刊】：中国酿造 【年、卷、期、起止页码】：2009年11期 【全文链接】：http://61.164.36.250:8001/asp/Detail.asp

分离纯化：有一种以上的微生物培养物称为混和培养物（Mixed culture）。如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养（Pure culture）。在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称为分离纯化.

本人是新手，以前从未做过分离纯化。现在感觉很困难·····我是这样设计的，先用跑板的方法分离，刮下斑点后溶解制成样品液。下一步纯化的话该选用什么方法呢？我的预期目标是纯化成单一组分，主要想除去的是其中的蛋白质和盐分，烦请各位专业人士多提意见啊，谢谢~~

化学小白，想问一下各位大神实验室没有凝胶色谱，用HPLC-ELSD 想测一下多糖纯度，分析柱TSK-GEL G3000PWXL和shodex KS-805有什么啊

想请教一下大家，像deae纤维素柱和葡聚糖凝胶柱纯化多糖，能洗脱下来的组分，一般几个柱体积可以洗脱得差不多？

[em0809] 大家好，我提取的多糖想上液相前纯化一下，买的酸性氧化铝针筒式预柱，但是不知道活化，洗涤，洗脱液都用什么，那些原理我都看了，只是不知道具体到操作步骤怎么弄， 哪位帮帮忙啊，谢谢[em0808]

[font=宋体]蛋白质是包括人类在内的各种生物有机体的重要组成成分，是生命的物质基础之一。生物体的生长、发育、遗传和繁殖等一切生命活动都离不开蛋白质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的不断深入，人们意识到仅仅依靠基因组的序列分析来试图阐明生命活动的现象和本质是远远不够的。只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究，才能更科学地掌握生命现象和活动规律，更完善地揭示生命的本质。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]由此许多学者将生命科学领域的研究焦点从基因转向蛋白质，使蛋白质成为揭示生命活动现象和分子生物学机理的重要研究对象。研究蛋白质首要的步骤是将目的蛋白从复杂的大分子混合物中分离纯化出来，得到高纯度具有生物学活性的目的物。因此，高效的纯化技术和手段是蛋白质研究的重要基础和关键之一。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的目的[/font] [/font][/b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的目的是将目标蛋白质从细胞裂解液的全部组分中分离出来，同时仍保留蛋白的生物学活性及化学完整性。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，需根据蛋白的特性选择合适的纯化方法来提高获得的蛋白制品的纯度。[/font] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]蛋白纯化的原理[/font] [/font][/b][font=宋体][font=宋体]不同蛋白质的氨基酸序列及空间结构不同，导致其在物理、化学、生物学等性质上存在差异，利用待分离蛋白质与其它蛋白质性质上的差异，即可以设计出一套合理的蛋白纯化方案。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段两个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如[/font] [font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]DNA [/font][font=宋体]等分开，常用的方法为硫酸铵沉淀法。精细纯化阶段的目的是把目的蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来，[/font][/font][b][font=宋体][font=宋体]常用的方法有：凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析等。[/font] [/font][/b][font=宋体] [/font][b][font=宋体]①[/font][font=宋体]凝胶过滤层析[/font][/b][font=宋体]凝胶过滤层析（又叫做分子筛）是根据样品的分子大小对样品进行分离的一种简单温和的层析技术。凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析，是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。不同于离子交换层析和亲和层析，凝胶过滤的层析样品不与层析柱料结合，因此，缓冲液成分不直接影响分辨率。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]原理：层析柱中的填料是球状颗粒的惰性的多孔网状结构的柱料，多是交联的聚糖[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]如葡聚糖或琼脂糖[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]类物质。在加入样品之后，样品中的小分子物质能进入球状填料内部，在柱子中停留时间较长；而大分子物质不能进入球状填料内部，停留时间较短。所以当样品经过凝胶过滤层析柱分离后，样品中的不同分子大小的物质就可以被分离开了。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]根据分子大小和形状进行分离[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]是一种非吸附的分离方式[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]缓冲液成分不直接影响分辨率，只需要一种缓冲液[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]操作便捷[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]②[/font][font=宋体]离子交换层析[/font][/b][font=宋体]离子交换层析是目前蛋白质分离纯化中应用最广泛的方法之一。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]原理：不同蛋白等电点差异，分子大小差异，在同一个流动相中电荷密度分布不同，电荷量不等，与具有相反电荷的离子交换介质结合强度不同，在流动相洗脱时保留时间不同，从而得以分离。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]根据分子大小和等电点差异进行分离[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]灵敏度高，重复性，选择性好，分析速度快[/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]③[/font][font=宋体]疏水层析[/font][/b][font=宋体]原理：疏水层析是依据蛋白质疏水性差异分离的。即根据蛋白质和疏水介质表面的疏水基团的可逆相互作用进行分离。蛋白的疏水性在高离子强度下被增强，因此在高离子强度环境中结合，通常采用降低离子强度的方式进行洗脱。独特的吸附分离模式使得疏水层析成为硫酸铵盐析后或离子交换高盐洗脱后理想的纯化方式。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]特点：[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]采用了盐的水溶液作为流动相，色谱条件温和，生物大分子的活性回收率很高。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]蛋白质在[/font][font=Calibri]HIC[/font][font=宋体]操作过程中是高盐上样，低盐洗脱（高盐浓度的样品不必作处理就可直接上样）。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]在一次色谱中可同时实现出去盐酸胍、蛋白质复性和分离三个目的。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]温度升高，蛋白质天然折叠伸展，暴露出更多内部疏水集团，使蛋白质的[/font][font=Calibri]HIC[/font][font=宋体]保留发生变化。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]色谱填料稳定性好，盐水体系作流动相无环境污染。[/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体]④[/font][font=宋体]亲和层析[/font][/b][font=宋体][font=宋体]原理：[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-by-ac][b]亲和层析[/b][/url]是应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配基的空间结构的识别。常用的生物亲和关系有酶[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]底物、底物类似物、抑制剂、激活剂、辅因子，抗体[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗原，激素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]受体蛋白、载体蛋白，外源凝集素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]多糖、糖蛋白、细胞表面受体，核酸[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]互补核苷酸序列、组蛋白、核酸结合蛋白等，具有高效、简单、快速的优点，是当前最为理想的分离纯化蛋白的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以参看蛋白纯化技术[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]方法：[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-purification-techniques[/font][/font][font=Calibri] [/font]