紫外可见法测量方法

据国外研究报告显示 2021年全球在线紫外-可见光谱市场规模为10.5亿美元，预计2022年至2030年的复合年增长率（CAGR）为6.50%，2022年市场规模预计达11.4亿美元，2030年预计将达18.8亿美元。在线光谱仪的应用不断扩大，相关技术不断进步，再加上政府和监管机构的积极参与，都是推动行业增长的一些主要因素。例如，多年度国家控制计划（MNKP）和国家监测计划（BÜP）等预计将推动在线紫外-可见光谱方法的使用。紫外-可见光谱的应用非常广泛，其中包括分析各种重要的疫苗，例如狂犬病和流感。该技术在COVID-19疫苗的研究中也具有显著优势。紫外-可见分光光度法在COVID-19研究中提供了准确、简单和快速的成分表征，如添加剂、防腐剂、蛋白质和核酸（即DNA/RNA）等。在线紫外-可见光谱技术还可以影响上游和下游过程的结果时间，包括质量控制。例如，梅特勒-托利多紫外-可见卓越分光光度计UV5Bio和UV5Nano是获得可靠和准确定量的重要工具，可成为疫苗研究在开发和合成期间的有效工具。此外，它们还可以为上游工艺、下游工艺和质量控制提供纯度检查。比如化妆品、食品和饮料行业的全球公司对制造商提出了更高的标准。随着产品质量检测要求的增加，与专家合作以确保产品的开发符合最终用户的期望非常重要。例如，2020年3月，岛津公司在UV-i Selection品牌下推出了六种新的紫外可见光分光光度计型号，这些系统便于在更广泛的领域使用，包括制药、化工和学术界，它们提供各种样品的自动分析、用户友好型操作性和附加功能以满足广泛客户需求。在离线测量中，过程监测被认为是一个耗时的步骤。此外，一次只能做一次测量，而且采样点之间的颜色质量仍然未知。在线测量有效地解决了这些挑战，因为它能在出现任何颜色变化时立即进行干预，并实时提供结果，从而推动了这个市场。在线采样是符合FDA标准的过程分析技术的首选。紫外可见光毫秒级的快速整合时间提供了快速的结果和高灵敏度。实时监测和快速的结果使得改变和识别参数变得很容易，从而减少了测试结果和重要质量参数的重复时间。在应用方面，2021年，色彩测量业务占总收入的比例最高，超过33.00%。该业务预计将以最快的增长率进一步扩大，在整个预测期内保持领先地位。这可归因于其在涂料、制药和食品行业等各个领域的应用不断扩大，再加上运营商为引入在线颜色测量解决方案而不断增加的投资。颜色测量是一种被广泛接受的方法，用于评估生产过程中颜色值的质量。在线颜色测量的出现解决了使用离线测量方法评估产品质量时出现的与时间相关的挑战，从而促进了行业增长。例如，X-Rite GmbH生产ERX56，这是一种用于颜色在线测量的非接触式分光光度计。同样，由Kemtrak制造的DCP007是一种工业光纤光度计，用于在线、实时测量过程样品的颜色浓度，该仪器配备高性能、长寿命LED和工业级光纤，可提供高精度的噪声和无漂移测量。在线彩色UV-Vis传感器还用于监测发酵过程中红酒颜色的变化。在用户方面，据估计，在预测年内，油漆和涂料行业的复合年增长率最快，超过8.65%。油漆和涂料行业对在线紫外-可见光谱的广泛采用是推动该领域增长的主要因素。在线紫外分光光度计技术可以让油漆和涂料行业用户每10秒或更短时间直接在过程中连续测量制造物质，无需采样延迟，也无需中断生产线，这反过来提高了制造过程的生产率，同时降低了成本。此外，在预测期内，化学工业部门也有望以显著的复合年增长率增长。在化学工业中，湿化学过程的在线监测包括监测碱性和酸性制绒、漂洗、亲水化、氢氟酸、硝酸、氟硅酸、硫酸、碱度、酸度和过氧化氢。在区域市场方面，北美在2021年主导了全球行业，占总收入的35.60%以上，份额最大。预计该地区将在整个预测期内继续主导全球行业。这可以归因于提供在线紫外-可见光谱设备的主要公司在该地区的强大影响力、仪器技术的进步，以及涉及这些设备广泛使用的食品分析需求的增加。此外，美国国家标准与技术研究所的存在向最终用户提供了关于光谱学的详细要求，这鼓励了北美市场的发展。另一方面，预计亚太地区在预测年内的增长率最快。中国和印度等亚洲国家快速发展的绘画和制药行业预计将推动该区域市场的产品消费。此外，人们对食品安全和环境污染的担忧日益加剧，跨多个行业的研发活动不断增加，以及主要公司逐步进入亚太地区，预计将在未来几年推动该地区的增长。在全球，在线紫外-可见光谱市场运营的一些知名公司包括：Agilent Technologies, Inc.、Shimadzu Corp.、Thermo Fisher Scientific Inc.、X-Rite、ColVisTec AG Inc.、Hunter Associates Laboratory, Inc.、Applied Analytics, Inc.、AMETEK, Inc.、Guided Wave, Inc.、Kemtrak AB、Endress+Hauser Management AG、Color Consult、Equitech Int'l Corp.、Uniqsis Ltd、Advanced Vision Technology Ltd. 等。

1.吸光度测量原理当入射光频率与物质分子的震动频率一致，或者入射光引起物质分子电子能级跃迁，都会产生光学吸收现象。溶液的浓度越高，穿过溶液的分子也会相应地被吸收越多。当一定强度的光线通过物体的时候，被吸收部分越少，透过部分越多反之也然。1852年比耳确定了吸光度与液浓度及液层厚度之间的关系，建立了光吸收的基本定律，称为朗伯-比耳定律。朗伯比尔定律是吸光度测量的基本定律，是描述物质对某一波长光吸收的强弱与吸收物质的浓度及其液层厚度间的关系。当一束平行单色光通过液层厚度为b、吸光物质的浓度为c的单一均匀的，非散射的有色溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度成正比。A=kcb=lg(I0/I)A: 为吸光度k：为摩尔吸收系数（常用单位 L/(mol*mm)）c：为浓度（常用单位 mol/L）b：为光程（常用单位 mm）I0：入射光强度I：透射光强度图1 吸光度原理图2.应用系统介绍(1)发光源：能够输出稳定功率以及且连续光谱的辐射源，紫外波段实验室常使用脉冲氙灯或氘灯，可见波段实验室常使用卤钨灯。(2)样品池：用于放置待检测样品，常用直接盛放样品的器件为石英比色皿，厚度一般为10mm，适用于紫外到可见光波段范围。(3)检测设备：又称分光光度计，将光学分光器件和能实现光电转化的探测器集成。本此测量应用使用的系鉴知技术的SR50C光纤光谱仪，光谱仪内置脉冲氙灯同步触发功能，除了可搭配如下图一样的比色皿样品固定架进行测试，同时也可根据实际需求搭配侵入式光纤探头或流通池进行取样。 (4)显示器：连接光谱仪和笔记本电脑，显示测量过程中的数据，本此测量应用使用的系鉴知技术自主研发的上位机软件。图2 脉冲氙灯吸光度检测系统图3.实验示例鉴知技术拥有自主研发的整套光谱吸光度测量系统和相关的配件，本次实验采用KNO3溶液，光谱仪采用北京鉴知技术有限公司的微型光纤光谱仪SR50C，在室温环境下进行测试，实验结果如下表所示：光谱仪型号：SR50C（200-400 nm）波长范围nm分辨率 nm可根据客户需要定制:波长范围，分辨力大小，光谱仪尺寸大小200-4000.5比色皿光程KNO3 浓度mg/L220nm 吸光度275nm 吸光度相关系数R210mm0.20.0432780.0446110.99780.30.0672250.0658580.40.0873060.087540.50.1150570.1081420.80.1664770.1617651.00.2072560.20099表1 KNO3溶液在220nm,275nm处的吸光度根据表中数据，绘制硝酸钾溶液吸光度随浓度变化的线性关系曲线，如下图所示。图3 KNO3溶液浓度与吸光度线性关系结论：由图得知硝酸钾溶液的吸光度与其浓度具有较大的线性相关关系，线性拟合系数R2=0.9978，标准曲线的方程式是：A = 0.1985.74C + 0.0048可根据拟合的标准曲线，将未知浓度样品的吸光度代入标准曲线的方程式中，得出未知样品的浓度。因此，鉴知紫外可见光谱仪能够在吸光度测量中有较好的测量结果满足客户的需求。4.SR50C光纤光谱仪优势体积小，重量轻，分辨率高；灵敏度高，适用于微量元素分析；测量准确性和一致性高；价格优惠。5.典型行业应用参考行业或典型应用光源光谱仪附件高校或实验室代替分光光度计氘卤组合SR50C，SR75C, ST90S10mm 紫外石英比色皿样品池抗紫外光纤在线水质仪器分析脉冲氙灯/氘卤组合SR50C，SR75C10mm 紫外石英比色皿样品池抗紫外光纤衰减器烟气在线仪器分析脉冲氙灯ST90S光纤、气室超微量分光光度计脉冲氙灯SR50C，SR75C，ST90S-便携式多参数水质分析仪脉冲氙灯SR50C，SR75C-北京鉴知技术有限公司，简称“鉴知技术”， 是一家以光谱检测技术为核心的专业公司，产品已广泛应用于缉私缉毒、液体安检、食品安全、药品检测等诸多领域，公司致力于为客户提供更先进的产品和更快捷的物质识别方案。

李昌厚(中国科学院上海营养与健康研究所 上海 200233)李菁菁（上海中医药大学公共健康学院 上海 201203）摘要：本文根据仪器学理论[3]并结合作者的实践，对紫外可见分光光度计的最佳吸光度范围（或最佳浓度范围）和最佳光谱带宽的选择方法进行了研究，并对有关问题进行了讨论。本文可供从事紫外可见分光光度计研发、制造、使用和维修的科技工作者参考。0、前言紫外可见分光光度计是目前国际上使用最多的常规分析仪器之一，但如何选择紫外可见分光光度计的最佳吸光度范围（最佳浓度范围）和光谱带宽，很多从事分析工作的科技工作者没有引起重视。对使用者来说，选择紫外可见分光光度计的最佳吸光度范围（或最佳浓度范围）和最佳光谱带宽，是用好紫外可见分光光度计最关键的问题之一，也是一门很深的学问。作者根据仪器学理论和自己的长期实践，对如何选择最佳吸光度范围（或最佳浓度范围）和选择最佳光谱带宽及有关问题进行了研究，提出了选择的方法，并对有关问题进行了讨论。1、吸光度范围（或试样浓度范围）的选择1．1、认真选择最佳吸光度（Absorbance－Abs）范围的重要性[1] 、[2]根据比耳定律[3]，吸光度（Abs）与试样的浓度（C）成正比。所以，不同的浓度范围内测量(即不同的吸光度范围内测量)，会引起不同的误差。这一点，所有使用紫外可见分光光度计的分析工作者，都必须高度重视。有时，很多科技工作者，在工作中往往忽视这个问题，例如：作者曾看到有一位分析人员，用一台光度噪声为0.005Abs的紫外可见分光光度计分析小于吸光度为0.005Abs的样品。她的工作做了很长时间，一是测试结果不稳定，二是结果比标准值小很多，总是得不到可靠的结果。于是，她开始怀疑所用的紫外可见分光光度计仪器有问题，后来，请制造厂的工程师来维修仪器，维修工程师一到现场，稍加检查，就立即指出仪器没有问题。但这位使用者仍坚持仪器有问题，制造厂的工程师经过反复检查，断定仪器肯定没有问题，并指出是样品太稀。后来，对样品稍加浓缩，很快就得到了令人满意的测试结果，所测得的数据，与标准值完全一致。还有一位科研工作者，他使用一台中档偏下的紫外可见分光光度计分析食品中的添加剂，他发现所测得的样品含量总是偏低。后来，也怀疑仪器有问题。结果，经维修工程师检修，认为仪器没有问题。最后，发现被分析的样品浓度太高，被测量样品的吸光度值达到2.5Abs。在把样品稀释到0.8Abs后，再反复多次测量，结果非常准确，与文献值完全一致。这两个例子，充分说明在使用紫外可见分光光度计时，对被分析样品的吸光度范围的选择非常重要。1、2、最佳吸光度范围（或最佳试样浓度）选择的原则1．2、1 吸光度范围不能太小（或试样浓度范围不能太稀）为什么吸光度范围不能太小？因为噪声是主要分析误差的来源之一[2] 、[3] ，它限制被分析试样吸光度值的下限。吸光度太小（或试样太稀）时，有用的信号会被仪器的噪声淹没；当光度噪声大到一定程度或样品吸光度小到一定程度时，吸光度就根本不与样品的浓度成正比。甚至会产生试样浓度变稀时，吸光度值反而增大（噪声所致）的现象，以致无法得到稳定的测量数据，产生很大的分析误差。例如：作者曾用某紫外可见分光光度计测试黄曲霉素，因为仪器的噪声太大，测试数据从0.4Abs就开始超过1％的相对误差。作者的实践表明，一般常规分析时，对大多数试样浓度取10µg/ml～100µg/ml（相当0.3～0,7Abs）左右为最佳。1．2．2、最佳吸光度值范围（或最佳试样浓度范围）不能太大为什么吸光度不能太大？因为杂散光是分析误差的主要来源之一[2]、[3]，它限制被分析试样吸光度值的上限，如果试样的吸光度太大，因为杂散光的原因，可能会使分析误差增大。因为杂散光会使分析测试结果严重偏离比耳定律（分析测试结果的数据可能偏小，也可能偏大；若杂散光被试样吸收则测量数据偏小，若杂散光不被试样吸收则测量数据偏大）。如果仪器的杂散光很大、被分析的试样吸光度值太大，吸光度就根本不与试样的浓度成正比，甚至会产生试样浓度增大时，吸光度值反而减小等反常现象。1．3、 试样浓度的选择原则1．3．1、试样不能太稀（理由如1．2、1所述）1．3．2、试样不能太浓（理由如1．2、2所述）1．3．3、在试样量允许时，试样的浓度应选择靠近最佳吸光度值（0.434Abs）。因为，从理论上讲，比耳定律在吸光度值为最佳值0.434Abs时，分析误差最小 。所以，如果被测试样太浓时，应向靠近0.434Ab的方向稀释。假设被测试试样太浓，达到2Abs左右，这时，应稀释到1Abs以下，但要注意不能太稀。在不同的吸光度上测试，相对误差和绝对误差都不同；作者研究的结果如下：（设仪器给出的△T=0.3%T；目前，国际上的高档紫外可见分光光度计一般都给出△T=0.3%T）。2、最佳光谱带宽的选择[4]、[5]、 [6]2．1、认真选择光谱带宽（Spectrum Band width）的重要性光谱带宽是紫外可见分光光度计主要分析误差的来源。我国广大的分析测试工作者，对紫外可见分光光度计光谱带宽的重要性并没有引起重视。甚至，有的分析工作者，根本就没有认识到光谱带宽会影响分析误差，这是影响我国紫外可见分光光度计仪器和应用水平提高的重要原因之一。作者在长期的实践中深深体会到，光谱带宽是非常重要的技术指标，并对它进行了认真研究[2]、[4]。作者为了研究光谱带宽对分析误差的影响，曾对青霉素钠、青霉素钾进行过测试研究。我国药典规定对青霉素钠、青霉素钾的分析测试用1nm光谱带宽，但作者对同一种浓度的青霉素钠测试用2nm光谱带宽测试时，吸光度值为0.805Abs；用1nm光谱带宽测试时，吸光度值为0.825Abs；用0.3nm光谱带宽测试时， 吸光度值为0.865Abs；用0.2nm光谱带宽测试时，吸光度值为0.823Abs。实践证明，0.3nm光谱带宽测试时吸光度值最大，2nm光谱带宽测试的结果比0.3nm光谱带宽测试时吸光度值小0.060 Abs，1nm光谱带宽测试时，吸光度值比0.3nm光谱带宽测试时吸光度值小0.04Abs，说明0.3nm光谱带宽是最佳光谱带宽。2nm光谱带宽测试时的吸光度值和0.3nm光谱带宽测试时的吸光度值绝对误差△A为0.06Abs，相对误差为△A/A＝0.06/0.865=0.69(6.9%)；1nm光谱带宽测试时的吸光度值和0.3nm光谱带宽测试时的吸光度值绝对误差△A为0.040Abs，相对误差为△A/A＝0.046(4.6%)。由此可见，光谱带宽的重要性是不言而喻的。但是，在实际工作中，有许多科技工作者很不重视光谱带宽问题。例如：我国某地的某某制药厂，采用国外某公司的紫外可见分光光度计作为质检仪器，该仪器的光谱带宽为5nm，根本不符合我国和世界各国药典规定用于药品检验的紫外可见分光光度计，其光谱带宽应为2nm的要求。作者从理论上计算，5nm光谱带宽的紫外可见分光光度计，若要用于药品检验，其测试误差为3%，而很多药品检验时，药典规定要求其分析误差在1％以内。所以，使用者一定要高度重视紫外可见分光光度计的光谱带宽的选择。2．2、光谱带宽选择的原则[2]2．2．1、根据分析工作的误差要求选择光谱带宽因为不同的光谱带宽对同一种药品进行分析测试有不同的误差，所以，不同行业应对光谱带宽有不同的要求。使用者应根据分析工作的误差要求来选取不同的光谱带宽。特别是制药行业、科研工作或要求较高的使用者，更应如此。2．2．2、光谱带宽不能过大或过小的原因我们应根据被分析样品对误差的要求，选用不同的光谱带宽来进行分析测试。一般来讲，不同的试样要求用不同的光谱带宽来分析，并且，我们应该选择最佳光谱带宽或选择靠近最佳光谱带宽的光谱带宽来分析，才能得到最佳分析结果。有些科研工作者以为光谱带宽越小越好（分辨率高），也有科研工作者以为光谱带宽越大越好（能量大，灵敏度高）。其实不然，如前所述，作者对同一浓度的青霉素钠、青霉素钾的测试就很好的说明了问题。2．3、光谱带宽与分析误差的关系在理想状态下[7]、 [8]，光谱带宽与分析误差的关系如表2：表2 在理想条件下，A obs与SBW在吸收极大时的关系[4]RBWA obs/ARBWA obs/ARBWA obs/A0.01000.99950.06000.99830.20000.98190.02000.99950.07000.99770.30000.96040.03000.99950.08000.99700.40000.93210.04000.0.99920.09000.99620.50000.89870.05000.99880.10000.9954表2中：RBW 为相对带宽；RBW＝SBW/NBW；NBW为被测样品的吸收带半宽度，指样品的吸收值达到最高峰值之半的两点间的波长间隔；A obs为吸光度实际测量值；A为吸光度理论值。表2 可供分析工作者用来修正实验值，但只适用于吸光度实际测量值小于1.0时的情况。因为一般的常规分析中，被测样品的实际测量吸光度值基本上都小于1.0，所以，表2具有实际参考价值。有学者对光谱带宽与分析测试误差的关系进行过研究，如Owen[5] 研究后指出：当仪器的光谱带宽（SBW）与被测样品的自然带宽（NBW，即吸收带半宽度，一般为20nm）之比小于或等于1时（即SBW/NBW≦0.1时），该光谱仪器可满足99％的样品的分析测试工作，且分析测试的准确度在99.5%以上。这也是我国和世界各国药典规定用于药检的紫外可见分光光度计的光谱带宽要求≦2nm的原因。曾有文献[6] 报道过光谱带宽对分析测试误差的影响，此不赘述。作者研究过光谱带宽对青霉素钠、青霉素钾定量分析的影响，发现青霉素钠定量分析的最佳光谱带宽与药典规定不一致（药典规定:取本品加水制成1ml含1.80mg的溶液，… … ，用1nm光谱带宽、在264nm处测试，吸光度应为0.80-0.88）。笔者在药典规定的条件下，将光谱带宽从1nm开始减小，一直减到0.3nm,其峰高一直在增高！但低于0.3nm时，峰高就开始下降。这说明青霉素钠的最佳光谱带宽是0.3nm，而不是1nm。为此，作者向当时国家药典委员会的专家张淑良先生（上海药检所）反映，他们接收了此意见。所以，今天的药典委员会已经去掉了每一种药品，一定要采用多大的光谱带宽检测了。笔者根据表2计算：当SBW为2nm以下时，由于SBW引起的分析测试的相对误差小于0.5%；但是，当SBW为5nm时，分析测试的相对误差将达到2.7%。可惜，我国有很多分析工作者不注重这个问题，有些药厂用SBW为5nm的UVS来作质量控制，其仪器本身的误差就远远超过我国药典规定的1％的要求，这必须要引起我国广大药检工作者重视。3、讨论3．1目前，国内外很多科技工作者经常将光谱带宽和狭缝宽度混为一谈,很多仪器制造商经常在自己的说明书中说：“狭缝宽度为XXXnm”，这是不对的。因为在光谱仪器中，狭缝宽度以mm计，而光谱带宽以nm计,二者相差一百万倍（106）。所以只能说“光谱带宽为XXXnm”，而不能说“狭缝宽度为XXXnm”。同时还必须注意，光谱仪器的狭缝宽度制造商一般是不会告诉使用者的，因为它涉及到仪器设计时所选用的准直镜焦距、光栅和物镜的焦距等指标。所以，我们对仪器的技术指标描述应该注意科学性、国际接轨和规范性。3．2 有许多紫外可见分光光度计使用者，很不注重对吸光度范围的选择,他们不了解不同浓度（或吸光度）分析时，有不同的分析误差。因此，往往在样品前处理上有时比较马虎,。他们此外，也不大注意或不懂得将样品稀释到最佳浓度范围,这是很多使用紫外可见分光光度计的分析工作者应该特别引起重视的问题。3．3目前，国外有些紫外可见分光光度计制造商,在自己的说明书中写某某最高级的紫外可见分光光度计，仪器的最大光谱带宽为8nm（特别是在招标时，作为仪器的“特点”提出)，这完全在误导使用者。因为，从文献[2]可以非常简单计算出，光谱带宽为8nm时，分析测试结果的相对误差达到了6.79%。而紫外吸收光谱分析是一种精密分析，有些样品（如药品）分析时，要求相对误差小于1%。例如：世界上许多国家的药典规定，用于药品检验的紫外仪器，要求的光谱带宽为2nm，此时的相对误差只有0.5%。所以，在高档（或最高级）的紫外可见光分光光度计中，写出光谱带宽为8nm是不合适的。4、主要参考文献[1]陈国珍主编，紫外可见光分光光度法，原子能出版社（北京），1983.[2]李昌厚著，紫外可见分光光度计，北京：化学工业出版社，2005[3]李昌厚著，仪器学理论与实践，北京：科学出版社，2008[4]李昌厚，光谱带宽对分析误差影响的研究，分析测试技术与仪器，，10(2)，65～67，2004[5]T. Owen, Fundamentals of UV-Visible Spectroscopy,© Copyright Hewlett-Packard Company, Printed in Germany 09/96，Hewlett-Packard publication number 12-5965-5123E[6]E.disbury, J. R. Practical Hints on Absorption Spectrometry,UV/Visible,NewYork, Plenum Press,1967作者简介李昌厚，中国科学院上海营养与健康研究所研究员、教授、博士生导师、国务院政府津贴终身享受者；原仪器分析室主任、生命科学仪器及其应用研究室主任；曾任华东理工大学等兼职教授、上海化工研究院院士专家工作站专家委员会成员、中国仪器仪表学会理事、中国仪器仪表学会分析仪器分会第五届和第六届副理事长、全国光谱仪器专业委员会副主任、全国高速分析专业委员会副主任、原国家认监委实验室计量认证/审查认可国家级常任评审员、《生命科学仪器》副主编、《光谱仪器与分析》副主编、国家科技部多项重大仪器及其应用专项的专家组组长等职。主要从事各类光谱和色谱仪器及其应用研究；在仪器学理论、分析仪器性能指标的测试方法、光电技术等方面有精深研究；以第一完成者身份，完成了15项科研成果，其中5项获得省部级以上科技奖励（含国家发明奖1项）；发表论文280篇（退休后97篇）、出版了：仪器学理论与实践、光谱仪器及其应用、色谱仪器及其应用等的专著5本。曾先后任北京普析、美国ISCO等国内外十多家高科技公司的专家组、顾问组组长、《仪器信息网》、等多个高科技学术团体的技术专家顾问或专家委员会成员等学术团体的领导职务。