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做了20多年的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url],在以前大多数使用的是填充柱,并且基本上是自己制作填充料,所以只是简单说说填充柱的制备。 [color=#DC143C][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]填充柱的制备[/color][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]柱一般分为填充柱和毛细管柱,填充柱适合常规样品的定量分析,尤其是高纯度的样品;毛细管柱适合分离组成比较复杂或微量样品以及残留分析等。目前来说,在常规样品和高纯样品的定量分析时,经常使用的还是填充柱。毛细管柱一般为商品柱,买来后,接上仪器,老化一下即可直接使用。填充柱,大多是自己制备的,填充柱的柱效,和柱的制备有很大的关系,尤其是填充物的制备。下面就以制备5%OV-101/Chromosorb W HP玻璃色谱柱为例,简单说说填充柱的制备。一、色谱柱的制备1、固定液的涂渍:称取0.5g OV-101于200mL烧杯中,加入适量三氯甲烷溶解,将10 g干燥的Chromosorb W HP载体徐徐倾入,使载体完全浸没。将烧杯置于通风柜中,在红外灯下干燥,并不断搅拌至溶剂挥发干,然后移至110℃烘箱中干燥2h,备用。2、色谱柱的填充: 将一小漏斗接已经洗涤干燥的色谱柱的出口,分次把制备好的填充物填入柱内,同时不断轻敲柱壁,直至填到离柱口1.5cm处为止。将玻璃漏斗移至色谱柱的入口,在出口端塞一小团经硅烷化处理的玻璃棉,并包以薄层棉花或2层纱布,通过橡皮管接到真空泵上,开启真空泵,从漏斗处,继续缓缓加入制备好的填充物,并不断轻敲柱壁使其填充得均匀紧密。填充完毕,在入口端也塞一小团经硅烷化处理的玻璃棉,并适当压紧以保持柱内填充物不被移动。3、色谱柱的老化:将色谱柱入口与气化室相连,出口端先不接检测器,以15mL/min流量通入载气(N2)。分阶段升温至250℃,并在此温度下至少老化24 h。以上是采用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]法检测一个农药有效成分的色谱柱制备典型操作。二、注意事项1、色谱柱的处理玻璃柱:新柱,接上胶管用清水直接冲洗约20分钟,然后依次用蒸馏水、乙醇冲洗,于烘箱中干燥。注:冲洗方法:用一个干净的洗耳球吸入蒸馏水或乙醇,然后将液体用力挤入柱管中。旧柱(指使用过的柱):接上胶管先用清水直接冲洗约20分钟,然后将稀酸(一般为0.1mol/L硝酸或盐酸溶液)灌入柱管中,让其浸泡2小时以上,再用清水冲洗至洗出液为中性,再以同样方法注入乙醇或丙酮,浸泡2小时以上,然后依次用蒸馏水、乙醇冲洗,于烘箱中干燥。不锈钢柱:新柱:洗涤、干燥方法同玻璃柱。旧柱:洗涤、干燥方法同玻璃柱,但是,需把稀酸换为稀碱,一般为0.1mol/L氢氧化钠溶液。2、固定液涂渍时的溶剂量 固定液涂渍时的溶剂量是最不容易掌握的,通常资料介绍“取所需量的固定液,用适量(能浸过担体)的溶剂溶解”,而“适量(能浸过担体)的溶剂”到底是多少,一般很难掌握。在这里,告诉大家一个简单的方法,将所需要的载体称量后,置于量筒中,量出其体积,这就是溶解固定液的溶剂的量。采用此方法溶解固定液后,再徐徐倾入载体,一般正好能浸没载体,只要稍加搅拌,这样制成的填充物涂布均匀,不会有涂层厚薄不匀,以致产生柱效差。如果溶剂过多,容易造成上层的载体涂层较厚,因为上层液体挥发较快。3、填柱的方法填柱时,要注意柱内填充物的均匀紧密,一般不锈钢柱比较好填,因为在敲打柱时,用力较大也可。而玻璃柱就不容易了,敲打轻了,松紧度不够,通入载气后,柱内会出现较大的空隙,造成死体积大,影响柱效;重了,不小心会将玻璃柱损坏,所以要注意敲打的力度。有时候,也会在柱子老化后,从入口处再次补加填充物。4、色谱柱老化色谱柱老化时,千万要注意不能接检测器,否则,检测器容易被污染。老化温度必须大于使用时的柱温,这样在做分析时基线会比较稳。老化时间,一般为连续24小时,如果有困难,也可以分时间段老化,只要基线稳定即可。
[color=#444444] 由于填充柱用量大,我打算自己制备[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]填充柱。按照网上的方法填充DNP柱子(中等极性柱),担体选择的是红色釉化担体301(40—60目),固定液为20%DNP和7%的PEG,溶剂为丙酮。利用抽气机填充紧密,加入玻璃毛塞紧后老化后,[/color][b]进样一点峰都不出。这是为什么呢?[/b][color=#444444]应该不至于一个峰也没有啊。[/color][color=#444444]第一次填充色谱柱,求各位高手指教啊![/color][color=#444444]我总结了下自己可能的问题所在1担体涂抹上固定液自然风干后,在烘箱中干燥了2h左右(约100℃)(这个按理来说应该没什么大问题吧)[/color][color=#444444]2填料时进样口端和检测器口端留的空柱距离较小(进样时进样针有1cm左右都插进色谱柱填料里了)[/color][color=#444444]3填的玻璃毛较多(怕柱材料泄露,所以多填了一些)[/color][color=#444444]4选择的担体不对?(按照要求应该是用80目左右的白色担体,但太贵了,没买那种)[/color][color=#444444]但是究竟是因为什么原因呢[/color][color=#444444] 将制备的填充柱安装在机器上,老化后接检测器端,能闻到有一股较为浓郁的塑料味;此外,虽然色谱柱能通气,但感觉好像有点堵(调大载气压力后只能达到0.2 MP左右,但换了购买别人的柱子柱压能上去到0.3 MP)[/color]
1.什么是制备色谱?很多初接触色谱领域的朋友对制备色谱这个名词比较陌生。其实,在化学化工医药等广泛采用的层析法以及薄层色谱就是最为典型的制备色谱,换句话说,将分析色谱的进样量增大,同时得出大量的所需物质(馏分)的过程就可以称为制备色谱。分析色谱的目的,是分析出混合物中一个(或者几个)纯物质的含量。制备色谱的目的,是从混合物中得到纯物质。而制备色谱系统则是利用制备色谱的思想高效能得到纯化物质的多个分析测试设备联用的总称。2.制备色谱的构成传统的制备色谱一般由一台可以连续输送液体的恒流泵、紫外检测仪与色谱柱构成,其中最重要的部件是价格不一,款式多样的色谱柱,这也是影响最终制备效果的关键性环节。柱子有多种类型,不仅材质不一,填料也有很多学问,下面简要的说说关于柱子的一些情况: 各种规格的玻璃柱子在实验室里头很容易得到,而且价格低廉,但玻璃柱子致命的弱点是它能承受的压力很小,且非常容易破碎。当由于压力太小而导致流动相流速很慢的时候,高位液面或加高压空气(或者氮气)的采用是一个简单的解决办法。在底下加真空,也能在一定程度上解决这个问题。 不锈钢柱子具有良好的耐腐蚀、抗压力性能,但其价格相对很贵。如果,只有很小的分离任务且经费也允许,市面上直径为1cm的小型制备柱就是首选。 有机玻璃柱子也能抗压力耐腐蚀,相对不锈钢柱子而言,它是半透明的,可以看到液体的运行状态,对有色的物质其特点就更为突出。 硅胶、键合固定相(如C18)、离子交换树脂 、聚酰胺、 氧化铝、 凝胶等都可以作为色谱柱的填料。 有不少文献报道,对填料可以进行一下处理提高了分离效果,如,对硅胶进行的硝酸银(或缓冲液)处理。 1 制备色谱到底是什么? (1)分析色谱的目的,是分析出混合物中一个(或者几个)纯物质的含量。制备色谱的目的,是从混合物中得到纯物质。 为了加快分离的时间与提高分离的效率,制备色谱的的进样品量很大,导致制备色谱柱子的分离负荷的相应加大,也就必须加大色谱柱填料,增大制备色谱的直径和长度,使用的相对多的流动相。 然而,当色谱柱上样品负载加大的时候,往往导致柱效急剧下降而得不到纯的产品。制备色谱,要解决容量与柱子效果之间的矛盾,对重现性也要考虑。从经济上来说。制备色谱要争取少用填料,少用溶剂,要尽可能多的得到产品。 (2)样品的前处理: 制备色谱柱子由于处理的样品多,比分析柱子更容易受污染,所以,必要的前处理就显得非常的必要。萃取、过滤、结晶、固相萃取等简单的分离方法,如果用得上,而且还不是很麻烦,就要尽可能多的采用以去掉杂质。 (3)制备色谱柱的材质及其特点 下面介绍一下,制备色谱柱常用的材质及其特点。 各种规格的玻璃柱子在实验室里头很容易得到,而且价格低廉,但玻璃柱子致命的弱点是它能承受的压力很小,且非常容易破碎。当由于压力太小而导致流动相流速很慢的时候,高位液面或加高压空气(或者氮气)的采用是一个简单的解决办法。在底下加真空,也能在一定程度上解决这个问题。 不锈钢柱子具有良好的耐腐蚀、抗压力性能,但其价格相对很贵。如果,只有很小的分离任务且经费也允许,市面上直径为1cm的小型制备柱就是首选。 有机玻璃柱子也能抗压力耐腐蚀,相对不锈钢柱子而言,它是半透明的,可以看到液体的运行状态,对有色的物质其特点就更为突出。 (4)固定相的选择 硅胶、键合固定相(如C18)、离子交换树脂、聚酰胺、 氧化铝、 凝胶等都可以作为色谱柱的填料。 有不少文献报道,对填料可以进行一下处理提高了分离效果,如,对硅胶进行的硝酸银(或缓冲液)处理。 (5)装柱方法的选择 根据固定相颗粒度和柱子的尺寸,采用不同的装柱方法,往往装填越好分离效果越好。装柱效果跟填料的颗粒度关系很大,颗粒度的减少会导致装柱的难度。一般来说,颗粒直径小于20-30um的固定相采用湿法装填。所谓“敲击-装填”技术适用于颗粒直径大于25um的固定相。湿法的目的是迫使相对稀松的 固定相悬浆以高速装入色谱柱子,从而减少空隙的形成。然而,当柱直径大于20mm,所加压力为30-40bar时,高压悬浆装填技术就变得十分复杂。为将小颗粒固定相装入更大得制备型色谱柱,可采用柱长压缩技术。这种方法,先将固定相悬浆(或偶尔是干填充物)装入柱中加压,利用物理方法将其压紧。压紧的方法有两种:径向压缩和轴向压缩。 湿法装柱需要一定的设备,在柱子填完后,应用有柱效的测量,对柱效低的柱子应该重填。 (6)流动相的选择 除了和分析色谱同样的考虑外,在选用流动相时,要考虑色谱分离后面加有旋转蒸发等二次分离操作。一般来说,不宜采用高毒性溶剂,对多元溶剂要尽可能的少用。 如果产品中含有大量溶剂,溶剂的纯度也要考虑在其中。 (7)加样的方法 可以采用以下方法之一进样。-用注射器进样-用旋转阀进样-通过六通阀进样-通过主泵进样-通过辅泵进样-固体上样 (8) 泵的选用 生产制备色谱泵的厂商很多。根据有无脉冲、能承受的最大压力、控制的精度、售后服务等来选择泵。 (9)检测器的选用 一般的分析池的最大允许流速仅为5 mL/min 或者10mL/min。而专门的制备池的最大允许流速可为150mL/min。有时,采用旁路分离管,将少量流体导入分析池进行检测,是一个不错的办法,但其浓度的误差会相对较大。 (10)组分保留时间的估计 用分析柱子在同等色谱条件下(同样的固定相和流动相)测定保留时间后,按照单一组分的线流速(不是体积流速)一定,通过计算可以知道组分的大致保留时间区域。 分析谱图的峰形状,对确定保留时间也有很大的参考价值。 (11)产品的收集 手工馏分收集费时费力,自动馏分收集器有很大的方便。许多实验室和工厂都采用了馏分收集器。 (12)超载、边缘切割、中心切割、放大技术与非线性效用 在制备色谱中,因为没有必要达到分析色谱那样的分离度,可以在一定范围内大大加大进样的浓度和体积。在做分离的时候,也有一些分析色谱的时候,不能用到的技巧。因为篇幅关系,不在这里叙述。 (13)柱转换技术 通过接头或者阀门,实现柱子的简单延长,或者比较方便地实现对其中一个(或几个)组分的精制。 (14)比较新的制备色谱技术 模拟移动床可以连续进样,并可以利用边缘切割效用,而且采用了柱切换技术,能更好的利用溶剂和填料,已经应用于工业化生产。其理论和技术也日益完善。 迎头色谱、超临界流体色谱、逆流色谱环形色谱、气相制备色谱等在科研和工业生产中也得到了应用3.制备色谱的全新方法 高速逆流色谱★( high-speed countercurrent chromatography , HSCCC )是 20 世纪 80 年代发展起来的一种连续高效的液—液分配色谱分离技术, 它不用任何固态的支撑物或载体。 它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡,当其中一相作为固定相,另一相作为流动相,在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。 由于不需要固体支撑体,物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现,因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等,不仅使样品能够全部回收,回收的样品更能反映其本来的特性,特别适合于天然生物活性成分的分离。而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触,使得样品的制备量大大提高,是一种理想的制备分离手段。 它相对于传统的固—液柱色谱技术,具有适用范围广、操作灵活、高效、快速、制备量大、费用低等优点。目前 HSCCC 技术正在发展成为一种备受关注的新型分离纯化技术,已经广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等领域, 特别在天然产物行业中已被认为是一种有效的新型分离技 术;适合于中小分子类物质的分离纯化。 我国是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家,俄罗斯、法国、英国、瑞士等国也都开展了此项研究。美国 FDA 及世界卫生组织( WHO )都引用此项技术作为抗生素成分的分离检定, 90 年代以来,高速逆流色谱被广泛地应用于天然药物成分的分离制备和分析检定中。