定量分析相差显微镜

相差显微镜　　•1940年荷兰学者F.Zernik巧妙地应用光的衍射和干涉原理提高标本细节的折光率的差异，创造了相差显微镜(phase contrast microscope)。从此非常简便而有效地观察体外培养细胞的生长过程，记录细胞分裂周期中的染色体的移动。近年来细胞学家和生物学家所拍摄的生活细胞生长、分裂过程的非常出色的记录影片，都是利用相差显微镜的优秀性能完成的。因此相差显微镜、倒置相差显微镜已成为细胞学、细菌学、寄生虫学、免疫学和海洋生物学的实验室必备仪器。　　•相差显微镜是用于观察组织培养中活细胞形态结构的。活细胞无色透明，一般显微镜下不易分辨细胞轮廓及其结构。　　•相差显微镜的特点是将活细胞不同厚度及细胞内各种结构对光产生的不同折射作用，转换为光密度差异(明暗差)，使镜下结构反差明显，影像清楚。　　相差显微镜的优点http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/02/201102161815_278026_2961690_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/02/201102161816_278027_2961690_3.jpg　　相差显微镜成像光路http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/02/201102161817_278028_2961690_3.jpg　　相差显微镜的部件　　•相差显微镜的关键性部件为位相板(phase plate)、环状光阑(anular diaphragm)和中心调节望远目镜(centring telescope)。　　环状光阑　　•环状光阑是在玻璃片上喷涂金属薄膜借以挡光，只留下环形透光窄缝的光阑。它能使来自反光镜的直射光只能从环状部分通过，形成一个空心圆筒状的光柱，经聚光器并照射到标本以后，就产生两部分光，一部分是直射光，另一部分是经过标本后产生的衍射光，这两部分光经物镜内相板的作用而改变了光的相位和振幅。　　•在相差聚光器下面装有一个转盘，盘上镶有宽狭不同的环状光阑，在不同光阑边上刻有10×、 20×，40×等字样，这表示当用不同放大倍数的物镜时，必须配合相应的环状光阑。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/02/201102161819_278029_2961690_3.jpg　　相板　　•相板安装在物镜的后焦平面上，带有相板的物镜称为相差物镜(蔡司厂用红色“PH”表示)。　　•相板上有一灰色的环状圈，称为共轭面。面上涂有吸光物质，直射光从这部分通过，并吸收了约80%的直射光，以降低它的透光度。在共轭面的内，外侧部分称为补偿面，面上涂有减速速物质，使衍射光的相们发生改变，因此这两者相结合就能分别改变直射光和衍射光的振幅和相位。　　相板分类　　•A型位相板 凡是共轭面即环形相板上涂有吸收层的相板均为A型。A型相板又分为二型：　　•(1)A十型位相板：这是在共扼面上既涂吸收层又涂有电解质的相板。这种相板能吸收其共轭面的60一90%直射光，而透过其20一40%。市场出售的位相板型号分类时，都以数字表示其透射率和推迟位相的数据(图10-12，表10—1)。　　•(2)A一型位相板是共扼面上涂有吸收层。同时在补偿面上涂有电解质。　　•B型位相板凡是在补偿面上涂有吸收层而在共轭面上有电解质的位相板，均属此类。　　•(1)B十型位相板是在补偿面上涂有吸收层共轭面上有电解质的相板。　　•(2)B一型位相板是在补偿面上涂有吸收层加电解质的相板。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/02/201102281441_279896_2961690_3.jpg　　对焦望远目镜　　对焦望远目镜(centring telescope)又叫合轴望远镜或校正望远目镜。这是一种场透镜和接目透镜之间的距离可变的目镜。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/02/201102281443_279897_2961690_3.jpg　　相差显微镜的成像原理　　•从波动光学的角度可把物体细节即生物标本的细节，看成是成像光束的障碍物。它可以改变相干光束的振幅、位相和光强分布。　　•从变换光学的频谱转换角度，可把物体细节看成是不同空间信息的集合物。它可改变光信息的空间频谱。　　•在显微镜下标本细节的光密物质、光疏物质和无结构的介质的折射率不同，因此相干光束通过光密物质(t)时，必然产生衍射，使光程延长，推迟位相(图10—21P)。这时衍射光(P)和直射光(S)之间的位相出现d/λ差异。但是标本的吸收程度近似，所以振幅未变即光强末变。这种直射光和衍射光到达像平面重叠成像时，其合成波的振幅与通过无结构介质的直射光的振幅几乎近似，即其光强相似。这就是未染标本在普通显微镜下反差很小的基本原因(图10—22)。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/02/201102281447_279898_2961690_3.jpg　　暗相差　　•在被检物的折射率大于介质的情况下，透过共轭面的直射光被吸收80%后亮度变暗，衍射光在通过被检物后其相位己推迟1/4波长，再在位相板的补偿面的电解质又推迟了1/4波长。由于这两束光的相位不同(差1/2波长)，其合成波的振幅为两者之差，所以光线就更加暗。　　•与此同时，通过无结构介质的衍射光的光程只被补偿面的电介质推迟l/4波长。这就造成通过光密物质的光强远比通过无结构介质(背景)的光强减衰得多。相差显微镜下标本细节的反差加大丁。光密结构比背景暗得多了。这种反差叫暗反差也叫正反差。　　明相差　　•如果相板的共轭面上涂的是减速物质，推迟直射光1/4波长，而补偿面涂的是吸光物质，结果就是直射光与衍射光的相位相同(衍射光通过物体时相位推迟了1/4波长)，其合成波的振幅为两者之和，结果物体是明亮的而背景是暗的，这称为明相差或负相差。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/02/201102281450_279899_2961690_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/02/201102281450_279900_2961690_3.jpg　　相差显微镜实验方法和步骤　　•安放相差装置取下原有聚光器和物镜，分别安上相差聚光器和相差物镜，并将转盘转到“0”标记的位置。用10×相差物镜调光。　　•调节光源。　　•合轴调节取下原有目镜，换上合轴调整望远镜。上下移动望远镜筒，至能看清物镜中的相板环为止。　　•放回目镜取下合轴调整望远镜，放回目镜即可进行观察。更换不同放大倍数的相差物镜时，每次都要按上述方法重新调节。