数字课程单目显微镜

• Katharina Eser病理学实验室作为一个机构正在发生变化。即使有一段时间的滞后，这门至关重要的医学学科也正在转向数字化：实验室正在变得虚拟。这个过程的一部分也是虚拟显微镜，它支持向数字病理学的转变。许多病理学家仍然通过模拟显微镜观察，同时决定作为切片制剂位于他们面前的一小段组织是否注入了肿瘤细胞。在其他实验室，这项任务已经由一个自动化系统完成，该系统将切片制剂独立放置在扫描显微镜下，扫描样本，最后由人工智能识别、标记和计数肿瘤细胞。要采取这一步骤，你不仅需要合适的设备，还需要实验室中的新工作流程和经过培训的人员。本文将有助于强调这一过程中的挑战和出现的问题。全球病理学家短缺如今，癌症发病率正在上升，同时，能够治疗和检测癌症的人数正在减少。世界上许多地方的医疗服务不足，但即使在最富裕的国家，也缺乏病理学家等专家。造成这种情况的原因包括医学院期间的教育和广告太少，以及在实验室工作是孤立的情绪因素，与患者的接触往往仅限于观察他们的组织。但也有一个事实是，大多数疾病观察的时间越长，就会变得越复杂。人类无法提供识别某些相关性所需的数据量。因此，病理学实验室的数字化带来的可能性是无限有吸引力的。病理学的一个重要支柱是在显微镜下观察组织样本。虚拟显微镜为用户提供了独立于时间和位置对标本进行数字显微镜检查的能力。为此，显微镜制剂被数字化，因此可以在以后的屏幕上查看和处理，而不考虑位置和/或工作站。这些数字制剂可以存储在数据库中，并与无限数量的用户共享。为了生成样本的数字图像，可以使用配有额外摄像头的模拟显微镜。然而，病理学的发展趋向于使用数字显微镜。根据模型的不同，这些显微镜通常不仅可以产生标本的实时图像，还可以对其进行扫描。数字显微镜不仅可以显示单个视场，还可以扫描整个标本。数字化显微镜载玻片可以称为虚拟载玻片、扫描或全载玻片图像。这些术语描述了完全数字化的显微镜标本。为了产生数字图像，该仪器逐片扫描载玻片上的整个样本。该软件将生成的高分辨率单个图像合并为一个完整的图像。这个过程叫做缝合。在电脑上，用户可以浏览样本，放大并分析。图1：虚拟显微镜为用户提供了独立于时间和位置对标本进行数字显微镜检查的能力。©Precision股份有限公司试样质量至关重要与所有显微镜手术一样，标本的质量在虚拟显微镜中也起着重要作用。样品必须尽可能均匀地切割，因为软件在扫描过程中会自动设置焦点。过大的高度差异可能导致平面跳跃和完成扫描中的模糊区域，并且无法校正。样本也必须在仪器的固定扫描区域内。样本必须均匀染色，以正确表示所有细胞结构。此外，应避免样品出现气穴、重叠和其他污染。在特殊情况下，样本的性质会退隐到背景中。例如，在肿瘤手术过程中，通常会在手术过程中对切除的组织进行切片，即所谓的冷冻切片。然后在显微镜下只观察样品的某些区域。数字样本的质量也取决于所用相机的质量。模拟显微镜上的相机附件通常不能提供高质量，因为这些系统不是为数字化过程设计的。数字显微镜是为这一过程设计的，除了扫描功能外，它还具有实时视图，因此可以在屏幕上实时观察样本。纯幻灯片扫描设备为用户提供了在速度和分辨率之间进行选择的可能性。较高的扫描速度会导致图像质量的损失。然而，由于这些设备是自主操作的，因此也可以通过调整扫描仪的工作时间来调整时间损失，例如在晚上。为了充分利用显微镜扫描，需要合适的图像查看软件。根据图像格式的不同，只有非常专业的程序才能处理病理切片的图像。所谓的查看软件也提供了评估图像的不同可能性。例如，使用不同的注释工具，可以绘制直线和圆，也可以附加书面注释。此外，还可以将人工智能集成到此类程序中。在集成人工智能的帮助下，对某些结构或细胞的自动评估成为可能。理想情况下，可以根据图像来存储注释和评估。可以将查看软件集成到云中。这样一来，扫描不仅可以通过网络服务器与其他用户共享，还可以直接在平台上查看。此外，通常可以提供关于图像的特定信息。在大多数云服务中，图像存储、图像共享和图像查看设施都是可用的。任何终端设备都可以查看扫描结果。不管是大屏幕、智能手机、平板电脑还是笔记本电脑。然而，屏幕的性质对于再现的图像质量是决定性的[1]。表1：拥有数字工作流程可以使病理实验室的工作更快、更高效，并为创新腾出空间。©Precision股份有限公司今天的病理学是手工工作目前，在大多数情况下，需要在病理学实验室进行检查的样本都会带着一张提交单到达，上面会手工注明如何处理。这些信息由工作人员传输到实验室信息系统。在病理学家对组织进行宏观检查后，医疗技术人员准备样品进行进一步检查。这些标本有时需要大量的手工制作、切割、在煤油中固定，并使用各种组织化学和免疫组织学技术进行染色；它们被切割，安装在载玻片上，并用玻璃覆盖。然后将标本分类到文件夹中，并提交给病理学家进行检查。在某些情况下，标本也会被扫描。为此，还必须手动插入样本并进行登记。如果存在质量缺陷，则必须重复该过程。这个工作流程在这里只是粗略地概述，涉及许多手册和小规模的工作步骤，其中有许多错误来源。在向完全数字化病理学实验室发展的另一端，大量切片制剂的自动扫描、诊断的数字提供以及临床数据以及数字报告文本生成即将到来。该系统可以在输入样本注册后对订单进行优先级排序和处理，并处理质量控制。此外，人工智能用于支持组织病理学诊断。此外，该系统可以将分析的图像数据和分子信息集成到工作流程中。与此同时，几个研究项目正在接近实现这一愿景，揭示了这一理论的实际机遇和挑战。图2：有了数字样本，算法就有可能取代昂贵的计数和注释工作。©Precision股份有限公司算法打开了广泛的可能性尽管数字图像有很多优点，但它并不能解决用户的许多问题和要求。然而，数字化为使用算法进行图像分析开辟了广泛的可能性。经典算法可以检测和计数定义明确的结构，如肿瘤细胞。这使得病理学家能够通过具体的测量值进行量化。在这样做的过程中，算法有效地进行并且没有偏差。压力或时间压力以及影响人类的视错觉的影响等因素在这里不会发生。现在市场上有许多产品可以用于不同的分析方法。这些程序可以快速有效地找到预定义的结构，并可重复地对其进行量化。有许多研究描述了算法在不同器官和各种疾病的组织学制备中的应用[3]。通常，对这些算法进行训练，以便专家在组织学切片中标记定义的结构。该算法用一系列类似的部分进行训练，直到它自己识别出标记的结构。市场上常见的程序通常专门针对特定的疾病模式；他们的任务是识别和量化预定义的结构。一个算法只能和它所训练的数据集的质量一样好[4]。所寻求的结构的数量越多，变化越大，评估就越好、越可靠。这就是目前正在世界各地建立的生物库发挥重要作用的地方。这些不仅提供了许多物理样本，而且还提供了许多已经数字化的样本。下一步是专门针对用户的应用需求进行训练的算法。在这里，一系列有趣的产品也在开发[2]。挑战在于将获得的数据集转换成什么格式，以及如何最终将其整合到实验室信息系统和相关部门的系统中。当然，还有实验室人员和工作流程的问题。图3：正确的样品制备是虚拟显微镜的关键。©Precision股份有限公司结论病理学实验室向数字化病理学实验室的转变只能循序渐进。该过程的开始是所有过程的文档化和可视化，必须根据各种参数（如人员、机器和开发程度）以及IT和过程支持级别对其进行分析。由此可以产生有意义的转型规划。其中一部分是虚拟显微镜、满足要求的设备以及支持这项工作的算法。现在有许多公司专门帮助实验室进行这种转变。这是一项非常明智的服务，因为这种转变很复杂，需要时间和金钱，而且还必须在人员方面得到很好的支持才能发挥作用。References[1] Brochhausen C. et al (2015) A virtual microscope for academic medical education: the pate project. Interact J Med Res. 4: e11. [2] Li Z et al. (2021) Deep Learning Methods for Lung Cancer Segmentation in Whole-Slide Histopathology Images – The ACDC@LungHP Challenge 2019. IEEE J Biomed Health Inform 25: 429-440[3] Mun SK et al. Artificial Intelligence for the Future Radiology Diagnostic Service. Front Mol Biosci. 2021 Jan 28 7:614258. DOI: 10.3389/fmolb.2020.614258 [4] Cui, M., Zhang. D.Y. Artificial intelligence and computational pathology. Lab Invest 101, 412-422 (2021). DOI: 10.1038/s41374-020-00514-0 .关于作者Katharina Eser在学习艺术史之前曾在一家日报担任编辑。2021年，她加入PrecisPoint，担任业务创新经理，现在是该公司的自由职业者。来源：Going digital in pathology——Introducing Virtual Microscopy and what questions to askMicroscopy Light Microscopy Lab Automation Image Processing ， 17 May 2023供稿：符 斌，北京中实国金国际实验室能力验证研究有限公司

研究人员对线虫有着复杂的情感，崇敬、亲密，执着。几十年来，科学家已经鉴定并绘制了所有959个成年雌雄同体细胞和1031个成年雄性细胞的发育图。布伦纳称秀丽隐杆线虫为“大自然馈赠给科学的礼物”。线虫是常见的土壤线虫，线虫其个体小，体长仅1-2mm，体态透明，繁殖速度快且数量多，2-3天一代，有雌雄同体和雄虫，平均每代可产生300-500个线虫，可为实验提供大量且均一的样本。线虫在遗传与发育生物学、行为与神经生物学、衰老与寿命、人类遗传性疾病、病原体与生物机体的相互作用、药物筛选、动物的应急反应、环境生物学和信号传导等领域已经得到广泛应用。明场中的线虫筛查在常规解剖镜下可观察到虫体外形结构，使用体视显微镜可以实现对线虫的有效筛选以提高数量。配备灯架或小型照明底座的常规体视显微镜非常适用于线虫筛查,当与辅助物镜一起使用时，它可以实现更高的放大倍率和分辨率,可以轻松制作具有高对比度的线虫图像，即使在低放大倍率下也是如此。对于教学人员来说，它们也是特别好的解决方案。(型号推荐：MHZ101/MHZ201)MHZ101/MHZ201体视显微镜在明场中进行线虫筛查的优势:居中 LED，标本成像具有良好的对比度和均匀的照明；易于存放，体积紧凑轻巧，不使用时可直接置放于壁橱架子上；空间大，有足够的空间让用户用于取虫、显微注射等操作；标本处理简化，最大限度地减少了平板意外掉落的可能性；没有外部灯、电缆，也没有可能从底座上掉下来的设备，适用于学生课程。 转基因线虫育种及荧光筛选 由于转基因通常与绿色荧光蛋白 (GFP)结合，因此可以使用荧光体视显微镜对其进行选择。其他荧光标记如 DsRed在高表达水平下可能有毒，因此通常选择 GFP 标记。使用广州明慧的MHZF700和NSZ818体视荧光显微镜，可以对线虫进行高效荧光筛查。MHZF700和NSZ818体视荧光显微镜优势：搭配BGUV三色荧光模块，支持特殊波段需求定制；极佳的信噪比和清晰的荧光图像，数字成像时最为出色；具备适用于各种常规观察和检查任务从宏观到微观的灵活性；纤薄底座和高亮度LED，方便样品的取放和操作，减少样本转移耗费的时间。

日前，“双校记：透过显微镜看哈佛与清华”线上展览正式开幕，该展览由清华大学科学史系、清华大学科学博物馆与哈佛大学科学史系、哈佛历史科学仪器收藏馆联合举办，是清华大学科学博物馆与国外著名大学博物馆合作举办的线上系列展览之一。显微镜是近代科学的标志仪器。1665年，伦敦大瘟疫暴发，胡克出版了《显微图谱》一书，他使用的显微镜可以把标本放大30多倍，此后，荷兰的列文虎克研制了独具风格的、可放大200多倍的单式显微镜。18世纪之后，显微镜逐渐流通到世界各地，满足了人们的好奇心，揭开了自然界隐藏的奥秘，极大地促进了现代科学的进步。显微镜也进入了大学的课堂、实验室和博物馆。该线上展览展示了哈佛大学与清华大学所使用、制造和收藏的众多类型的显微镜，从一个侧面折射了这两所世界著名大学在科学教育、科学研究以及历史收藏等方面的发展轨迹。两代哈佛人的显微镜本次展览展出了一套生产于1720年前后的威尔逊螺旋筒型和圆规型单式显微镜，开发这类仪器的初衷是为了满足人们对小型便携式仪器日益增长的需求。这套显微镜原属于哈佛大学第9任校长爱德华霍利奥克。他在任期间，加强了哈佛大学（当时还是哈佛学院）在数学和科学方面的学术课程，并进行了一系列的学术改革，将学术成就作为哈佛大学的录取标准。此外，他还建立了北美第一个物理学实验室。哈佛大学在他长达32年的任期内得到了蓬勃发展。1730年前后，英国科学仪器制造商、工匠埃德蒙卡尔佩珀设计和制造了一种安装在三角支架上的显微镜，此款显微镜很快成为18世纪上半叶最流行的复式显微镜，并且持续生产了大约一百年。此外，展览还展出了一台卡尔佩珀型显微镜，生产于18世纪50年代， 其所有者和使用者是爱德华奥古斯都霍利奥克。他是爱德华霍利奥克的儿子，1746年毕业于哈佛大学，后来投身医疗事业，成为美国治疗天花的先驱，为成百上千的人接种了天花疫苗。霍利奥克活了100岁，在他漫长而辉煌的职业生涯中，为人看病达25万次。他也是马萨诸塞州医学会和美国艺术与科学院的创始成员，并担任过美国艺术与科学院的主席。马克吐温与留美幼童展览还展出了美国著名作家马克吐温的一台单目复式显微镜。马克吐温1835年出生于美国密苏里州佛罗里达，他的原名是塞缪尔兰霍恩克莱门斯。马克吐温字面意思是指十二英尺水深，是当时密西西比河安全水上航行的最低深度。马克吐温因旅行叙事小说享誉国际，尤其是《傻子出国记》《苦行记》《密西西比河上的生活》，以及他关于童年的冒险故事，如《汤姆索亚历险记》和《哈克贝利费恩历险记》。1868年，马克吐温从巴法罗迁到康涅狄格州哈特福德。当时耶鲁大学毕业生、投身洋务运动的容闳也在四处奔走，倡议清廷实行留学计划，最终清政府在1872—1876年派遣4批共120名幼童赴美留学，他们主要住在哈特福德，所以马克吐温与这些幼童成为了邻居，有的幼童还与马克吐温的女儿成为同学，并一起跳过舞。马克吐温住在哈特福德时，把显微镜交给了他的秘书富兰克林惠特莫尔保管。惠特莫尔在马克吐温去世后，又将显微镜交给了他的孙子约翰富兰克林恩德斯。恩德斯于1922年获得哈佛大学博士学位，1939年，恩德斯把这台显微镜捐赠给哈佛大学。1954年，在波士顿儿童医院工作的恩德斯因“发现了脊髓灰质炎病毒在多种类型组织中培育生长的能力”，获得了当年的诺贝尔生理学或医学奖。这台显微镜在近80年的时间里，从与中国留美幼童交往过的一代文豪传至著名的科学家，最后回到哈佛大学，完成了一段传奇之旅。“新”“老”显微镜的接力20世纪50年代购自其他国家的显微镜工具，如苏联产的МИМ-7型显微镜和民主德国产的耶拿蔡司牌大型工具显微镜，也是展览展出的一部分。这些显微镜在清华大学“服役”超过50年，为机械、材料和精密仪器学科的科研教学发挥了重要作用。展览以新型冠状病毒SARS-CoV-2的三维结构高分辨率渲染图结尾，这是清华大学和浙江大学的研究人员在2020年利用高分辨冷冻电镜断层成像方法首次解析出的。遥想1665年伦敦暴发鼠疫时，列文虎克还未开始对显微镜的研究；而到2020年，新型冠状病毒感染疫情防控形势严峻，科学家则利用电子显微镜等现代科学仪器，迅速查明了病毒的真面目。从哈佛大学和清华大学所使用、制造和收藏的显微镜中，我们可以一瞥几百年来科技的迅猛发展，并且通过展览我们也能感受到，不同文明之间的交流互鉴、不同国家的沟通合作，会带来更大的希望与福祉。（作者系清华大学科学史系助理教授、“双校记：透过显微镜看哈佛与清华”展览策展人）