细胞生成干燥试验箱

喷雾干燥 & 冷冻干燥技术制备白细胞介素粉体研究趋化因子是一种小的(8-12 kDa)细胞因子，参与许多病理过程，因此是重要的靶点。它们通常由不同类型的细胞(如白细胞)分泌，并通过与同源 G 蛋白偶联受体的细胞表面结合来介导生物学效应。趋化因子配体和受体有 50 多种，根据其初级氨基酸序列的半胱氨酸残基排列进行分类和命名。趋化因子可用于(慢性)炎症性疾病、癌症和感染性疾病的治疗应用。目前，市场上有两种基于白介素的产品，即重组白介素-11预白介素(Neumega)和重组人白细胞介素-2醛白介素(Proleukin)。Neumega 是一种由大肠杆菌重组 DNA 技术产生的血小板生成生长因子，可静脉给药。皮下应用的 Proleukin 是一种淋巴因子，也是通过转基因大肠杆菌的重组 DNA 技术产生的。为了增加储存的稳定性、保持药物的生物活性，Neumega 和 Proleukin 都采用冷冻干燥的工艺，制成冻干粉制剂使用。虽然冷冻干燥（FD）是一种广泛使用的技术，具有多种优点，可以快速、温和干燥，但喷雾干燥(SD)可以缩短工艺周期，并可以在常压下进行加热处理。同时，颗粒的性质，如粒径、固体状态和残余水含量可以通过参数进行调节。这里必须指出的是，蛋白质的变性或/和展开也可能发生在 SD 过程中，SD 过程的放大是复杂和高成本的。SD 的另一个重要挑战是粉体回收率低于 100%，这对于高成本疗法和工艺开发来说是一个问题，特别是放大到最终设备上。对于白细胞介素，已经有了一些成功的冷冻干燥研究案例。然而，据我们所知，SD 作为一种替代方法尚未被研究过。这项工作的目的是开发一种 SD 工艺，使模型白介素以一种保留白介素结合亲和力和生物活性的方式干燥。为此，我们使用了模型白细胞介素，探索喷雾干燥工艺的潜在可行性，并对比分析冷冻干燥和喷雾干燥工艺对白细胞介素活性影响。1材料在磷酸盐缓冲盐水中提供野生型CXCL8（CXCL8，72个氨基酸，8.4kDa）、CXCL8的突变体（dnCXCL8，66个氨基酸，7.7kDa）等各种试剂。将蛋白质溶液用PBS稀释至最终蛋白质浓度为1mg/ml，即1% w/w。冷冻干燥机喷雾干燥仪：BUCHI B-90 HP▲ 步琦纳米喷雾干燥仪 B-90 HP2实验过程配方溶液分别采用如下冻干程序（表1）和喷干程序（表2）进行样品制备。干燥后的样品在 4-8℃ 的氩气干燥器中保存 12 周。并进行粉体的物性表征。表1，适用于所有配方中 FD 程序。箭头表示间隔内的压力或温度增减。间隔冻干工艺时间间隔[hh：mm]温度[℃] 压力[mbar]0速冻，放入小瓶～00:20-196atm.1冻结，平衡02:00-20atm.2初级干燥00:30↑ -15↓ 0.0453_01:00-150.0454_10:00↑ 00.0455_08:0000.0456二级干燥01:30↑ +200.0457_02:30+200.0458结束，封装小瓶_～+25atm.表2，SD 工艺参数及由此产生的过程变量。通过使用纯缓冲液进行测量来确定以 ml/min 为单位的喷射速率。实验过程中喷嘴温度升高，喷嘴温度是在 SD 过程结束时观察到的温度 。进口温度[℃]喷雾速率[%]空气流量[l/min] 粒度[μm]6030（～0.51ml/min）100±27.0过程变量出口温度[℃]压力[mbar]喷头温度[℃]29±131±152±23实验结果1、 通过激光衍射分析测定粒径SD 蛋白粉通过 HELOS 系统的激光衍射分析进行筛选。在 SD 后和第4周、第8周和第12周将粉末直接湿分散在甲苯中进行分析。通过对同一批次 SD 粉的三个样品进行测量，确定了 PSD 分析的标准误差。不分析 FD 粉末的粒度，因为冻干物通常是最终的药物剂型，没有对饼状进行研磨或破碎，只分析了 SD 粉。图1 通过激光衍射分析测定粉体粒径，在 10 次超声脉冲后进行测量，SD 粉末的 PSD 随储存时间的变化不大。除了在第0周分析的 SD dnCXCL8 喷雾粉末和在第8周分析的 SD HSA-dnCXCL8 外，所有干粉的跨度都小于 2.8。在测量这两个 PSD 时，一些较大的团块将分布分别向 517μm 和 129μm 的 x90 方向移动(图1b、图1c)，导致 PSD 变宽。2、 圆二色光谱测定结构利用圆二色谱(CD)对 SD 和 FD 后的蛋白质二级结构的变化进行评价，并将其与未处理蛋白质的光谱进行比较。CD 光谱在设备上记录，波长为 190-250nm，使用 1mm 石英比色皿，响应时间 4s。5 次扫描取平均值，并用 PBS 校正背景，计算平均残基椭圆率，并绘制不同曲线。由 图4 显示，经过 SD 和 FD 后的 CD 光谱显示只有轻微的结构变化。液体白细胞介素制剂在 90℃ 温度下热处理5分钟，SD 温度在 60℃ 温度下热处理 5 分钟，会产生轻微的沉淀，但结构保持完整 (图4A)。dnCXCL8 也出现类似的结果。SD 和 FD 均未引起二级结构的改变。即使加热蛋白质也未引起二级结构的变化(图4B)。虽然 HSA-dnCXCL8 具有更明确的α-螺旋结构，但 SD 和 FD 后没有变化。在 90℃ 热处理 5min 后二级结构发生了完全损失 (图4C)。3、 离液展开测定稳定性采用荧光光谱检测gdmhcl在0-6M范围内诱导展开，并在SD和FD后和储存3个月后测定蛋白质稳定性。将样品稀释至0.7μM，并在室温下平衡5min。CXCL8 和dnCXCL8 的激发波长为 280nm, HSA-dnCXCL8 的激发波长为 290nm。在 300-400nm 范围内测量所有3种蛋白的发射光谱，并将狭缝宽度设置为 5nm。蛋白质展开的特征是波长移位，并使用 Origin 2019b 的玻尔兹曼进行计算得到如下图谱。图5 显示，展开的过渡中点和 CXCL8 的相对协同性在很大程度上没有变化。对于 dnCXCL8，无法建立明确的过渡点。对于 FD HSA-dnCXCL8 也观察到了同样的情况。对于参考光谱和 FD 光谱（HSA-dnCXCL8 除外），显示了标准偏差，如图中的误差条所示。4、 趋化性测试：博伊登室测定为了检测 SD 和 FD 后以及储存三个月后的白细胞介素的活性，进行了趋化试验测定中性粒细胞的活化和迁移，预计 CXCL8 具有促迁移作用，而 dnCXCL8 和HSA-dnCXCL8 不应表现出任何中性粒细胞迁移激活。使用 NIS-Elements BR 3.2 软件进行细胞计数，计算每种情况下的平均值和标准偏差。上图显示储存 12 周后 SD CXCL8 的 CI 较对照显著增加 (图6a, p = 0.05)。SD 和 FD CXCL8 在中性粒细胞活化和迁移方面没有变化。对于 dnCXCL8, SD 和 FD 样本的 CI 与各自的参考 CI 相当。HSA-dnCXCL8 在 SD 后 (即W0) 的 CI 显著增加 (图6c, p = 0.04)。4结论本研究针对磷酸盐缓冲盐水配制的白细胞介素（未添加额外添加剂）采用 SD 和 FD 两种干燥方式分别进行深入评估。用纯缓冲液进行的 DoE 确定了一种最佳的 SD 工艺，在 60℃ 的干燥空气温度、100 L/min 的空气流速和 30% 的喷雾速率下具有较高产率，这表明即使是热不稳定的蛋白质也可以喷雾干燥。此外，SD 工艺比 FD 更快、更有效，理论上导致每分钟产量比 FD 高 130 倍（甚至考虑到 SD 的产量仅 63% 和 77% 之间）。FD 粉末呈现饼状结构，而 SD 粉末的粒度为 X5020μm。这为粒子工程提供了定义粒子特性的可能性，允许更广泛的应用。RM 是可比较的，同样二级结构没有改变，结合亲和力和活性保持至少 12 周，这些结果表明白细胞介素的 SD 是可行的。未来，将继续优化本研究中的工艺参数，并将其转移到具有工业型台式喷雾干燥器中，以更大规模地系统考察粉体产量和工艺时间，从而对 SD 进行全面评估，作为 FD 的替代方案，实现经济快捷高效的生产！5文献来源Comparing freeze drying and spray drying of interleukins using model protein CXCL8 and its variants

p style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="font-family: " times new roman" "适应温度环境试验箱的制冷剂显然应该满足温度环境试验的基本要求，包括： /span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="font-family: " times new roman" "strong1）标准气化温度（ts)/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="font-family: " times new roman" "制冷剂从液态蒸发成为气态的温度由其工作压力所决定，在标准大气压下制冷剂由液态蒸发成为气态的温度称为制冷剂的标准气化温度（ts)，如R22的标准气化温度ts=-40.8° C；R502的标准气化温度ts=-45.6° C；R404A的标准气化温度ts=-47.6° C；R23的标准气化温度ts=-82.2° C。制冷剂工作压力越低，其气化温度也越低，反之，如果要求某制冷剂（如R12）的蒸发温度到达某个低温值（-40° C），则必须调整其工作压力低于某个相应的压力（如0.6MPa)，称该压力值为饱和蒸汽压力。/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="font-family: " times new roman" "为了避免空气渗入到制冷系统内降低制冷效率，温度试验箱制冷系统正常运行压力(如蒸发压力，冷凝压力，吸气压力等）一般都应稍高于当地的大气环境压力，因此制冷剂的标准气化温度（ts）是温度试验箱可能达到的最低极限温度。考虑到蒸发器传热的温差要求，温度试验箱可能达到的最低温度一般应比制冷剂的标准气化温度(ts)高3° C~7° C。 /span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="font-family: " times new roman" "strong2）冷凝压力Pk不能太高/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="font-family: " times new roman" "冷凝压力Pk是从压缩机排出的高温高压的蒸汽在冷凝中被冷却为液态的工作压力，这个压力受冷却介质的温度和压缩机排气压力所制约。压缩机排气压力越高，冷却介质的温度越低，则制冷剂的蒸气越容易冷凝。但是提高压缩机的排气压力不仅会加大压缩机的功耗，缩短压缩机的工作寿命，而且容易出现工质的泄漏。另一方面，冷却介质的温度受大气环境温度（风冷）和冷却水温度（水冷）的限制不可能太低，通常情况下，冷却介质进入冷凝器的入口温度为24° C~29° C，冷凝器出口处冷却的温度为40° C~50° C，冷却介质的平均温度在30° C~50° C范围内，例如制冷剂R502的冷凝压力Pk大体是1.5MPa~2.0MPa,由于工质在管道内流动的压阻损失，压缩机的排气压力必须高于冷凝压力Pk，所以使用制冷剂R502的压缩机排气压力必须是1.8MPa~2.2MPa。/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="font-family: " times new roman" "strong 3）制冷剂的溶油性与溶水性/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="font-family: " times new roman" "制冷剂应该有一定的溶油性和溶水性。制冷剂中溶入润滑油后，有利于制冷系统中各种运转零部件的润滑，特别是在冷凝器中具有溶油性的液态制冷剂会带走因冷凝效应凝聚在冷凝器内壁上的油膜，可以降低贴符在冷凝器内壁上油膜对冷凝器热交换效率的影响。但是当液态制冷剂带着溶油进入蒸发器后，随着液态制冷剂的蒸发，气化，会在蒸发器内在实际的制冷系统中，压缩机的排气口之后都加装有油气分离器，限制制冷剂中的溶油量。同时在蒸发器的安装中采取一些回油的措施，如复叠式制冷机组中的蒸发冷凝器通常采用盘管式蒸发器，液态制冷剂从盘管的上部进入蒸发冷凝器，气化后的蒸汽从下部返回压缩机吸气口，吸附在蒸发器的内壁的油液也会在重力与压缩机吸气负压的作用下返回压缩机的油池中。/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="font-family: " times new roman" "对于壳管式蒸发器，回气管道安装时必须向压缩机吸气口方向有一定的倾斜度，便于残留的油液依靠重力的集油作用，被压缩机的吸气负压吸回压缩机内。制冷系统中渗入水汽会在低温段的局部地方形成“冰塞”，阻挡制冷剂的顺利流动，所以在制冷系统中无一例外地在冷凝器之前都安装有“干燥过虑器”，吸收可能渗入制冷系统中的水分，并且在安装和维修制冷系统时，适当增加抽真空的时间，以有利于制冷系统中残留水分在真空状态下加速蒸发、排除。但这些措施不能完全清除渗入制冷系统中的水汽。为确保制冷系统正常工作，采用具有溶水性的制冷剂可以携带极少量残余的水汽循环运行。例如采用溶水性能好的氨作为制冷工质的制冷系统，基本上无“冰塞”之忧，而采用溶水性能差的氟利昂作为制冷工质的制冷系统必须特别重视“干燥”除水的要求，及时更换“干燥”过滤器的滤芯。/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="font-family: " times new roman" "strong4） 制冷剂单位容积的制冷量/strong/span/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "span style="font-family: " times new roman" "此外，还希望制冷剂单位容积的制冷量大，可减小制冷机组的尺寸；具有较高的导热系数，可减少冷凝器和蒸发器的换热的面积；黏度低且密度较小，可降低管道流动中的阻力，减少管路压降；化学及物理性能稳定，无腐蚀性，无毒，不燃烧，不爆炸，具有一定的抗电性能等。在实际工程中，温度环境试验箱最低极限温度一般为：-40° C~-35° C或-75° C~-70° C，采用大气环境温度的风和地表的水为冷却介质的冷凝器进口温度通常不高于30° C，故温度试验箱制冷系统最常使用的制冷剂是R404A和R23(R508B)。/span/p

高温老化试验箱试验时注意事项：1.高温老化试验箱应安放在室内干燥和水平处，防止振动和腐蚀。2.要注意安全用电，根据烘箱耗电功率安装足够容量的电源闸刀。选用足够的电源导线，并应有良好的接地线。3.带有电接点水银温度计式温控器的烘箱应将电接点温度计的两根导线分别接至箱顶的两个接线柱上。另将一支普通水银温度计插入排气阀中，(排气阀中的温度计是用来校对电接点水银温度计和观察箱内实际温度用的)打开排气阀的孔。调节电接点水银温度计至所需温度后紧固钢帽上的螺丝，以达到恒温的目的。但必须注意调节时切勿将指示铁旋至刻度尺外。4.当一切准备工作就绪后方可将试品放入烘箱内，然后连接并开启电源，红色指示灯亮表示箱内已加热。当温度达到所控温度时，红灯熄灭绿灯亮，开始恒温。为了防止温控失灵，还必须照看。5.放入试品时应注意排列不能太密。散热板上不应放试品，以免影响热气流向上流动。禁止烘焙易燃、易爆、易挥发及有腐蚀性的物品。6.当需要观察工作室内样品情况时，可开启外道箱门，透过玻璃门观察。但箱门以尽量少开为好，以免影响恒温。特别是当工作在200℃以上时，开启箱门有可能使玻璃门骤冷而破裂。7.有鼓风的烘箱，在加热和恒温的过程中必须将鼓风机开启，否则影响工作室温度的均匀性和损坏加热元件。8 工作完毕后应及时切断电源，确保安全。9 高温老化试验箱内外要保持干净。