蛋白质聚集体成像计

目的：动态成像粒子分析（DIPA）是一种较新的技术，已被证明可以更好地表征基于蛋白质的药物中的亚可见颗粒，而不是使用光阻法等传统技术。 这是因为在这些配方中发现的大多数亚可见颗粒实际上是蛋白质聚集体，它们是无定形的半透明颗粒，其可能被错误表征或甚至不被光阻法系统看到。 DIPA系统能够通过调整光强度阈值从背景中分割非常透明的粒子，创建用于所有粒子测量的二值图像，因此阈值技术的选择对于测量的有效性是至关重要的。 本文将表明，改变阈值方法可以极大地改变粒度分布，并包括对所用方法的建议。

检测蛋白质聚集状态对了解生物医药产品的稳定性和功效是至关重要的。当有蛋白质聚集体时，对产品的质量的生物活性和原免疫性两方面有很大的影响。很多聚集体遇到生物样品会按照大小和特性排列（如：可溶的和不可溶的，共价的和非共价的或者可逆的和不可逆的）。蛋白质聚集体的范围跨度很大，从小型的低聚体（纳米级）到包含成百万的单体单元构成的不可溶的微米级的聚集体。在制造过程（细胞培养、提纯、形成）、贮存、分配和产品处理过程中的任何一步都可能产生蛋白质聚集体。它可能是由于各种压力引起的，比如，搅拌、暴露在极端的pH下、温度、离子强度或者各种界面（如，气-液界面）。在高蛋白含量（像单克隆抗体形成的情况）情况下，会出现进一步增加聚集体的可能性。因此，在开发、制造以及药物的后续贮存和描述产物时都必须仔细描述和控制聚集体。同样地，可以通过监测聚集体的状态，修改或者优化生产过程来实现。现在NanoSight提供一种以激光为基础的纳米粒子跟踪分析（NTA）的新系统，它可以使纳米粒子（如蛋白质聚集物）直接在液相中实时地观测到单个的颗粒并且对其计数。此外还可以获得高分辨率的粒度分布图。该技术具有快速、可靠、准确并且成本低，正因为这些特点使之成为现存纳米颗粒分析方法（如DLS（又称电子相关光谱PCS，）或者电子显微镜（EM））的很好的替代或者补足。

Dan Berdovich（Micro Measurement Laboratories）了解他客户的注射剂样品中有蛋白质聚集体，但尽管有各种各样的高科技仪器可供他使用，但他仍然无法完全确信他能看到它们或获得精确计数。对于颗粒分析的权威机构，他们获得了关于注射药物产品目视检查标准的同行评审论文奖。 然而，虽然在工业市场中，使用颗粒成像技术的应用不到十年，但是Berdovich仍努力解决客户的问题以至他自己的业务获得成功。

AB BioTechnologies，Inc。位于印第安纳州布卢明顿，是一家私营实验室，提供药品有偿服务。 创始人兼首席执行官Jeff Schwegman博士在配方开发，冻干（冷冻干燥）循环开发和优化，热表征以及注射药物产品开发的教育和培训方面拥有丰富的经验。“我们将冷冻和冷冻干燥等应力条件应用于配方，然后将测量和表征初始解决方案以获得基线，”Schwegman博士说。 “我们添加稳定的辅料，然后我们将其再次冷冻干燥并重新检查样品颗粒，看看我们这么做是否产生什么聚集体。” 蛋白质聚集体很容易被检测到并且它们有可能变性并形成聚集体，因此找到它们是开发过程中的关键步骤。 Schwegman博士需要能够确定客户配方中可能出现的问题的进展。

蛋白质药物中聚集体的数量、类型和大小对药物的安全性和有效性有很重要的影响。蛋白质聚集体的形成涉及多种机理，包括疏水基团之间的非共价键相互作用以及二硫键的形成等。蛋白质药物中任何一种聚集体的存在都是有害应当避免的，这是因为聚集体可能导致免疫原性反应（小的聚集体）或者可能影响给药（微粒）。不可逆的聚集体对蛋白质药物潜在的影响最大，尤其是在长期储存和运输过程中产生的不可逆聚集体。常用于聚集体分析的方法有高速离心、体积排阻色谱（光散射检测），以及非变性凝胶电泳。中性pH 条件下的非变性凝胶电泳可用于研究蛋白质的构像、自结合或聚集体。SDS-PAGE（SDS 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）也可用于分离聚集体，但该技术非常耗时且不能很好地分离分子量接近的聚集体或潜在杂质。安捷伦2100 生物分析仪和高灵敏度Protein 250 Assay 可以快速分离完整蛋白质、聚集体和低分子量的杂质，如非糖基化的完整单克隆抗体和游离的轻链和重链。这个分析方法具有很高的重现性 (%CV 6%)，并很容易用于开发和生产过程中的质量控制。

注射药物开发和生产中的颗粒一直是一个严重的问题。 在包括蛋白质制剂在内的生物制药中，通过聚集体和颗粒对产品功效，安全性和免疫原性的影响对产生的问题进行总结。 FDA法规强烈建议深入描述蛋白质制剂中颗粒的特性和数量。 颗粒问题在FDA意见书中越来越常见，并且在某些情况下，颗粒问题直接导致药物召回。

本应用简报介绍了一套完整的聚集体分析工作流程，它能够：• 优化单克隆抗体高性能体积排阻色谱 (SEC) 的流动相条件• 表征包括单体、二聚体和高阶聚集体等物质的聚集特征我们使用安捷伦缓冲液顾问软件自动进行复杂的 SEC 优化实验，实验中充分利用 Agilent 1260 Infinity II 生物惰性液相色谱系统的功能，在一系列快速液相色谱运行中对各种缓冲液组分进行自动实时混合。Agilent 1260 Infinity Bio-MDS 多检测器套装提供了动态光散射检测功能，能够检测高阶蛋白质聚集体、测定绝对分子量并扩大紫外检测系统的测量范围。

由于聚集体会对药物安全性产生显著影响并且可能引发抗原反应，因此蛋白质聚集是生物治疗药物蛋白质的关键质量属性 [1]。聚集体还可能会降低生物治疗药物的药效并大幅降低生产工艺的经济效益。蛋白质通常在暴露于压力条件下时发生聚集，例如 pH、温度或浓度的变化，因此不同生产阶段均有可能发生聚集。目前人们已经确定选择体积排阻色谱 (SEC) 方法进行聚集体的定量分析。在生物治疗药物开发过程中（例如在克隆选择过程中或在通过严格的“实验设计”法优化发酵条件时）监视聚集体的形成情况，这些过程可能产生大量需要进行体积排阻分析的样品。SEC 常用条件的分析时间往往需要 20 min 甚至更长，这极大限制了对大量样品的分析能力。Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱具有高度优化的粒径和孔径设计，可实现更快速的分离，从而显著减少分析瓶颈问题。本应用简报介绍的技术可提高样品通量而不影响分析的准确性。

单克隆抗体 (mAbs) 是制药公司广泛生产的重要生物制品。随着 mAbs 在生物过程中的应用不断增加，对其进行详细表征的技术引起制药公司的极大关注。由于蛋白质聚集体影响生物活性，因此是监管机构、学术界和制造商之间激烈讨论的话题之一。亚可见蛋白质聚集体可能暴露出当蛋白质处于稳定形式时可能不存在的表位。可靠地鉴定聚集体的存在对于 mAbs 表征至关重要。聚集体的形成在生产、纯化、制剂和存储过程中受到众多因素的影响。因此，采用快速 QC 方法鉴定蛋白质聚集体的存在极具优势。该方法可用于抗体生产生命周期中的许多阶段（例如克隆筛选），以及在存储过程中对产品进行持续监测。作为检测蛋白质聚集体的分析方法之一，紫外光谱的优势在于它是一种无损方法。此外，该方法所需样品量少，并且仅需极少的样品前处理，样品分析更加简单。本研究的结果表明，使用 Agilent Cary 60 紫外-可见分光光度计可以监测单克隆抗体溶液中聚集体的存在。尽管该方法无法分离不同形式的聚集体，但是在采用 SEC 分离这些聚集体之前，可以将该方法作为一种快速筛选方法来鉴定是否存在聚集体。结果还表明，Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱与 Agilent1260 生物惰性液相色谱系统结合使用，能够在较短的运行时间内实现 mAb 聚集体的高分离度分析。

由于聚集体会对药物安全性产生显著影响并且可能引发抗原反应，因此蛋白质聚集是生物治疗药物蛋白质的关键质量属性。聚集体还可能会降低生物治疗药物的药效并大幅降低生产工艺的经济效益。蛋白质通常在暴露于压力条件下时发生聚集，例如pH、温度或浓度的变化，因此不同生产阶段均有可能发生聚集。目前人们已经确定选择体积排阻色谱(SEC) 方法进行聚集体的定量分析。在生物治疗药物开发过程中（例如在克隆选择过程中或在通过严格的“实验设计”法优化发酵条件时）监视聚集体的形成情况，这些过程可能产生大量需要进行体积排阻分析的样品。SEC 常用条件的分析时间往往需要20 min 甚至更长，这极大限制了对大量样品的分析能力。Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱具有高度优化的粒径和孔径设计，可实现更快速的分离，从而显著减少分析瓶颈问题。本应用简报介绍的技术可提高样品通量而不影响分析的准确性。

使用了美国怀雅特技术公司的MALS（DAWN HELEOS）与Optilab rEX 检测器以及UV 检测器联，来监测不同流动相中蛋白聚集体的状态。使用这些检测器，可以追踪蛋白随盐浓度和缓冲液条件的改变而发生的变化，这有利于我们更深入了解我们所要研究的蛋白的性质和可预测性

预灌封注射器（PFS）中形成的治疗性蛋白质的稳定性可能会因蛋白质分子暴露于硅油-水界面和空气-水界面而受到负面影响。另外，诸如在运输过程中经历的搅动可能增加蛋白质与界面的相互作用的有害作用（即，蛋白质聚集和颗粒形成）。在这项研究中，将含有单克隆抗体或溶菌酶的无表面活性剂的制剂在PFS中孵育，将其暴露于硅油-水界面（硅化的注射器壁），空气-水界面（气泡）和搅拌应力（发生在首尾翻转期间）。使用流动显微镜，在所有条件下都可以检测到颗粒（直径≥ 2 m）。在装有气泡的搅拌式硅化注射器中发现了最高的颗粒浓度。在这种条件下形成的颗粒由硅油滴和聚集的蛋白质以及蛋白质聚集体和硅油的附聚物组成。我们提出了一种在PFS中产生颗粒的界面机制，其中三相（硅油-水-空气）接触线上的毛细作用力从界面上去除了硅油和胶凝的蛋白聚集体，并将其运输到主体中。这种机制解释了硅油-水界面，空气-水界面和搅拌在蛋白质配方中颗粒生成中的协同作用。

mRNA聚集体检测是指使用特定的分析技术来识别、量化并表征mRNA分子在生产或存储过程中可能形成的聚集体。mRNA（信使核糖核酸）是一种单链RNA分子，它携带遗传信息，指导细胞合成特定的蛋白质。在mRNA疫苗或药物的生产过程中，mRNA分子可能会因为多种因素（如温度变化、pH值波动、物理或化学应力等）而形成聚集体。聚集体的存在可能会影响mRNA的稳定性、活性以及最终的疫苗或药物效果。因此，检测mRNA聚集体对于确保产品质量、安全性和有效性至关重要。本应用采用全新推出的Biozen dSEC-7建立了一种分析mRNA聚集体的方法，并评估加热处理对聚集体的影响。通过分子排阻色谱法（SEC-HPLC）研究人员可以更好地理解和控制mRNA聚集体的形成，从而优化mRNA疫苗和药物的生产工艺，提高产品质量。

有许多技术可用于分析亚可见颗粒 - 颗粒表征是许多工艺的关键组成部分。 在注射制剂中，流动成像粒子分析可以帮助您优化蛋白质聚集体的检测。阅读流动成像显微镜终极指南，您将了解到：?分析颗粒的方法，以及每种方法的优势和缺点。?FIM如何工作，并允许您查看样本中可能缺少的内容。?该技术如何帮助改善生物制剂中蛋白质，硅胶液滴和其他颗粒的表征。

在蛋白质溶液中聚集已被证明有有害的影响。对于较大的聚集体，可以测量这些聚集体，但是在0.150 nm至2微米范围内的较小聚集体具有很难量化。Nicomp动态光散射(DLS)技术可以证明聚集体的存在，但不能提供任何关于聚集体绝对浓度的信息。

在各个领域，溶液中的蛋白质的绝对表征都是很重要的，也是必须的。例如：在药品和生物技术中，以蛋白质为基础的产品都必须很准确，不存在聚集。多角激光光散射（MALS）是测量溶液中蛋白质分子量的理想方法。这是一种非常灵敏的方法，可以检测到是否有聚集存在，形成了多少聚集体，因为光散射的反应直接正比于被测量样品的重均分子量，是浓度的倍数。

基于治疗的蛋白质溶液聚集可能产生有害的免疫原性。对于较大尺寸的团聚体，可以测量这些团聚体，但在0.15至2微米范围内的较小团聚体很难量化。动态光散射(DLS)技术可以证明聚集体的存在，但不能提供任何关于聚集体的绝对浓度的信息。单粒光写传感器技术(SPOS)现在可以测量聚集蛋白的大小和浓度，并成为这一应用的首选技术。

本文应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF）对蛋白质类药物的分子量进行检测，在m/z 10000-100000范围内，除了样品的双电荷离子峰、单电荷离子峰外，成功检测到该蛋白质药物的二聚体、三聚体、四聚体离子峰。结果表明MALDI-TOF适用于蛋白质类药物及其聚集体分子量表征，分析过程具有无需样品前处理、分析速度快、分析成本低的特点。

分子间距是决定有机物质光电性能的关键因素。传统有机发光分子通常以聚集体形式存在或作为单个分子分散在外部基质中。近几十年来，这些分子在发光二极管、激光器和量子技术等多种应用中引起了广泛的研究兴趣。然而，对于这些分子在聚集和分散状态之间的行为特性仍存在认知空白。最新一期Nature 由普渡大学窦乐天团队提出了一种在二维混合钙钛矿超晶格中形成的新型分子聚集相，其分子间距接近平衡距离，並将其命名为类单分子聚集体（SMA）。通过构建二维超晶格，有机发射体被维持在相对接近的位置，惊讶的发现，它们在电子上仍然保持独立，从而实现了接近单分子的光致发光量子产率。此外，钙钛矿超晶格中的发射体呈现出强烈的定向排列和密集堆积，类似于聚集体，这导致了显着的定向发射、增强的辐射复合和高效的激光输出。大量研究集中于有机基团的引入如何提高无机层的发光效率、电荷传输能力和稳定性，这已在高性能钙钛矿电子和光电器件方面取得了重大突破。然而，利用无机子晶格来调控有机分子的分子间相互作用、分子排列和发射特性的研究仍然较为有限。自1990年代末以来，一些研究小组报道了有机半导体-钙钛矿超晶格的形成，并确认发射物种可以是有机染料。然而，可以纳入分层钙钛矿的有机分子发射体系范围相对有限，它们的PLQY通常较低（通常低于10%）。研究团队展示了一种新型分子聚集相_SMA，通过将2D无机子晶格与经过精心设计的有机染料相结合，在接近平衡状态下实现。在这种混合超晶格中，有机发射体的行为与单个分子非常相似，表现为相似的发射波长和寿命，以及接近1的PLQY。理论和实验研究强调了有机发射体骨架二面角在维持这种单分子行为中的关键作用。

体积排阻色谱(SEC) 是监测生物治疗蛋白质样品（包括单克隆抗体及其衍生物）中单体、二聚体、聚集体和潜在降解物的重要工具。由于聚集体被视为一项关键质量属性，因此需要对其进行定量分析。本应用简报介绍了一种利用Agilent AdvanceBio SEC 300Å , 7.8 × 300 mm, 2.7 μ m 色谱柱和Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱对生物治疗mAb 和抗体药物偶联物 (ADC) 中的聚集体进行定量分析的简单而灵敏的方法。该方法采用相同的水相流动相，无需添加有机改性剂即可对mAb 和疏水性更强的ADC 进行分析。优化方法还可监测经 pH/温度处理形成的聚集体和降解物。该方法操作简单且具有良好重现性，与仪器的抗腐蚀性相结合后极其适用于生物制药行业中mAb 和ADC 的常规QA/QC 分析。

本文介绍了一种使用小粒径体积排阻色谱柱快速高效地分析抗体类蛋白聚集体的方法。 该方法使用 Agilent AdvanceBio SEC 色谱柱，使聚集体峰与单体峰得到良好的分离。考 察了色谱柱粒径和柱长对分离和分析效率的影响。结果表明，缩短色谱柱柱长，在保证 满足分离需求的前提下，可以将分析效率提高至常规方法的 3.5 倍

本文介绍了使用岛津尺寸排阻色谱柱“Shim-pack™ Bio Diol”，分析mAb和ADC聚集体的案例。使用“Nexera XS inert”系统，该系统对高浓度盐的流动相具有耐腐蚀性，可抑制管道内样品的吸附。

使用 Agilent Cary 630 FTIR 光谱仪测量浓缩样品中的利妥昔单抗聚集体

药物开发的主要挑战之一是蛋白质聚集——这种现象不仅可能对药物质量产生负面影响，还可能影响药物安全。 在最近的一项研究中，提出的结果可以更深入地了解油水界面上蛋白质吸附和聚集之间的关系。 新的见解可以帮助设计更稳定的治疗配方，而 QSense QCM-D 是帮助解决难题的分析方法之一。

过去，体积排阻色谱 (SEC)是评估重组蛋白生物治疗药物中非共价蛋白质聚集体 (高分子量物质[HMWS])时应用最广泛的方法1。但近年来，由于SEC色谱柱和LC系统的性能提升，使用SEC对这些样品中的蛋白质片段(低分子量物质[LMWS]) 在非变性的条件下进行分析的方法也越来越受到人们的关注。其中最受关注的， 是针对铰链区水解降解所产生IgG单克隆抗体(mAb)片段的分析方法2。相较于将单体(约150 KDa)与二聚体和更高分子量形式HMWS(≥ 300 KDa)分离的传统分离方法，LMWS片段(分子量为mAb单体分子量三分之二(约100 KDa)的mAb主 要形式)的分离可能更具挑战性。这是由于LMWS与单体的大小 (流体动力学半径)相比于单体与HMWS蛋白质的大小更加接近。由于蛋白质洗脱顺序中低浓度LMWS峰作为主(单体)峰上的拖尾肩峰洗脱，使分离难度进一 步增加。 虽然使用粒径为亚2 µ m的SEC色谱柱能够提高效率，从而提高HMWS和LMWS的分析通量，但由于色谱柱硬件和填料的限制，这些高柱效SEC颗粒仅适用于内径为4.6 mm或更小的色谱柱。使用HPLC色谱系统时，通常因SEC粒径为3 µ m及以上，可以选择7.8 mm内径的色谱柱。虽然许多HPLC系统也能够在这些内 径为4.6mm的SEC色谱柱所需流速和背压下运行，但存在一个经常被忽视的事实，即典型HPLC配置的柱外扩散相对大于这些UPLC SEC色谱柱所产生的峰体积，导致观察到的峰分离度明显降低。柱外扩散可以看作是样品在通过不含色谱柱的LC系统流路时发生的体积增加现象。

过去，体积排阻色谱 (SEC)是评估重组蛋白生物治疗药物中非共价蛋白质聚集体 (高分子量物质[HMWS])时应用最广泛的方法。但近年来，由于SEC色谱柱和LC系统的性能提升，使用SEC对这些样品中的蛋白质片段(低分子量物质[LMWS]) 在非变性的条件下进行分析的方法也越来越受到人们的关注。其中最受关注的，是针对铰链区水解降解所产生IgG单克隆抗体(mAb)片段的分析方法。相较于将单体(约150KDa)与二聚体和更高分子量形式HMWS(≥ 300 KDa)分离的传统分离方法，LMWS片段(分子量为mAb单体分子量三分之二(约100 KDa)的mAb主要形式)的分离可能更具挑战性。这是由于LMWS与单体的大小(流体动力学半径)相比于单体与HMWS蛋白质的大小更加接近。由于蛋白质洗脱顺序中低浓度LMWS峰作为主(单体)峰上的拖尾肩峰洗脱，使分离难度进一步增加。虽然使用粒径为亚2µ m的SEC色谱柱能够提高效率，从而提高HMWS和LMWS的分析通量，但由于色谱柱硬件和填料的限制，这些高柱效SEC颗粒仅适用于内径为4.6mm或更小的色谱柱。使用HPLC色谱系统时，通常因为SEC粒径为3µ m 及以上，可以选择7.8mm内径的色谱柱。虽然许多HPLC系统也能够在这些内 径为4.6mm的SEC色谱柱所需流速和背压下运行，但存在一个经常被忽视的事实，即典型HPLC配置的柱外扩散相对大于这些UPLC SEC色谱柱所产生的峰体积，导致观察到的峰分离度明显降低。柱外扩散可以看作是样品在通过不含色谱柱的LC系统流路时发生的体积增加现象。

通过聚乙二醇化能够改变治疗性蛋白质的物理化学和生物性质（如提高溶解度、降低免疫原性、延长半衰期以及防止蛋白酶破坏），从而显著提高其价值。体积排阻色谱法 (SEC) 是检测分子量大于聚乙二醇化蛋白质杂质的首选方法。由于聚乙二醇介导的与硅胶固定相的相互作用会导致回收率降低、峰形变差以及过度拖尾，因此聚乙二醇化蛋白质的 SEC 分析面临着很大挑战。本应用简报描述了一种用于检测聚乙二醇粒细胞集落刺激因子 (PEG GCSF) 的简单而灵敏的 SEC 方法。采用 AdvanceBio SEC, 130Å , 7.8 × 300 mm, 2.7 μ m 色谱柱在水相流动相下进行 PEG GCSF 的分离和定量分析。线性曲线在 12.5-2000 μ g/mL 的范围内具有优异的相关系数，表明该方法适用于定量分析。该方法具有出色的保留时间和峰面积精度，证明了该方法的适用性。此外，AdvanceBio SEC 还可对强制应激研究中得到的聚集体进行分离与定量分析。

人促血红细胞生成素 (Erythropoietin, EPO) 是最早用于治疗贫血症的商业化糖蛋白之一。与其它生物治疗蛋白一样，聚集体监测是评价 EPO 的关键质量属性之一。在欧洲药典 (European Pharmacopoeia, EP) 10.0版[2] 中，详细规定了使用体积排阻色谱 (Size Exclusion Chromatography, SEC) 结合峰面积归一化法分析 EPO 样品中的二聚体及其它大于主成分分子量的有关蛋白比例的方法。

Cary Eclipse 多孔板读数器和 PEPBOPS 染料可组成估算 mAb 聚集体含量的高通量工作流程。该工作流程可对高分子量聚集体进行半定量估算，每个样品只需约 5 秒。相比之下，更常规的测量技术通常需要约 5 分钟之久。本研究使用两种治疗性 mAb（利妥昔单抗和曲妥珠单抗）和抗体标准品 NISTmAb RM 8671 对该工作流程进行测试。结果表明，该工作流程得到的结果与使用体积排阻色谱对相同样品进行正交测量得到的结果之间具有良好的相关性。本研究还表明，PEPBOPS 染料作为荧光探针加入样品中，并不会影响聚集。

本文使用岛津LCMS-Q-TOF液质联用系统结合尺寸排阻色谱法，开发了一种定性检测多肽类药物生长抑素中聚集体的方法，使用岛津LabSolutions Insight Explore软件对色谱峰进行解析，并对多电荷结果进行解卷积分析。实验结果显示，该方法可以分离多肽类药物生长抑素的主成分和聚集体，分离出的4个色谱峰分别为生长抑素的四聚体，三聚体，非共价二聚体和共价二聚体。