蛋白质印迹处理系统

蛋白质印迹实验具体操作步骤 蛋白质印迹免疫分析的过程包括蛋白质经凝胶电泳分离后，在电场作用下将凝胶上的蛋白质条带转移到硝酸纤维素膜上，经封闭后再用抗待检蛋白质的抗体 作为探针与之结合，经洗涤后，再将滤膜与二级试剂-放射性标记的或辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶 偶联抗免疫球蛋白抗体 结合，进一步洗涤后，通过放射自显影或原位酶反应来确定抗原-抗体-抗抗体复合物在滤膜上的位置和丰度。 【蛋白质印迹实验所需试剂】 1.IgG 标准品 2.羊抗人辣根过氧化物酶（HRP）标记的IgG 抗体 3.转移buffer:Tris 3.03g,Gly14.4g,甲醇200ml,加三蒸水至 1000ml充分溶解，4℃冰箱贮存。 4.Tris buffer（TBS）：Tris 2.42g,NaCl 29.2g,溶于600ml三蒸水，再用1N HCl调至pH7.5,然后补加三蒸水至1000ml. 5.漂洗液（TTBS）：TBS液500ml,加 Tween20 250ul. 6.封闭液：5%脱脂奶粉。 7.抗体buffer:1.5g BSA溶于50ml TTBS. 8.显色液DAB（3.3-diaminobenzidine,3.3-二氨基联苯胺）配制：5mg DAB溶于10ml 柠檬酸buffer（0.01mol/L 柠檬酸2.6ml,0.02 mol/L Na2HPO4 17.39ml），加30% H2O2 10 &mu l（临用时现配）。 9.脱色液：甲醇250ml,冰醋酸100ml,加蒸馏 水至1000ml. 10.氨基黑染色液（0.1%氨基黑 -10B）：0.2g 氨基黑-10B 溶于200ml 脱色液中，充分搅拌溶解，滤纸 过滤。 【蛋白质印迹实验操作步骤】 一、样品的SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳 按实验四操作步骤进行。加样时，注意在同一块胶上按顺序做一份重复点样，以备电泳结束时，一份用于免疫鉴定，一份用于蛋白染色显带，以利相互对比，分析实验结果。 二、转移印迹 1.转移前准备：将滤纸，硝酸纤维素膜（NC）剪成与胶同样大小，NC膜浸入蒸馏 水中 10-20min 后浸入转移buffer中平衡30min . 2.凝胶平衡：将电泳后的SDS -PAGE胶板置于转移buffer 中平衡 30-60min. 3.按图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。 4.开始转移，连接正负极，盖好盖子，接上电源，恒流 0.8mA/cm,室温下转移1h,转移后的凝胶再用氨基黑10B染色液染色20min ,然后脱色检测转移效果。 三、免疫染色 1.转移后的NC膜于5%脱脂奶粉中封闭，4℃过夜。 2.TBS洗膜1-2次，10min/次。 3.加HRP标记的抗体，室温1h . 4.TBS 洗3次，10min/次。 5.NC膜再转入DAB显色液中，置暗处反应，待显色反应达到最佳程度时，立即用三蒸水洗涤终止反应。

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张丽华　　申请发明专利50余项，其中30余项获得授权，7项获得实施转化，主持或参加的科研项目共20余项。作为国家重大科学研究计划的首席科学家，中国科学院大连化学物理研究所研究员张丽华是名副其实的高产“大户”。　　她带领课题组深耕“蛋白质定性和定量新方法和相关技术研究”，为发现与生命活动密切相关的重要蛋白质提供了关键技术支撑，并将发展的新材料、新方法应用于肝癌等重大疾病的研究。　　从蛋白质入手　　在如今这个“谈癌色变”的年代，每年中国有300万新增癌症患者，有220万人因癌症而死亡。国际癌症研究机构预计，至2030年中国每年癌症患者将达到500万人，因此而死亡的人数达到350万人。　　当前，癌症患者求医时大多处于中晚期，病人的存活率也十分堪忧。相比之下，很多早期癌症患者的治愈率在80%以上，“早发现、早治疗”是最行之有效的方法。　　然而，想要在癌症扩散前就作出准确诊断绝非易事。张丽华带领团队从蛋白质下手，捕捉着肿瘤高低转移细胞株中发生变化的蛋白质。作为生命活动的主要执行体，蛋白质承载着重要的信息，其种类繁多、无处不在——催化反应的酶、提供免疫的抗体、跨膜运输的载体统统都是蛋白质。　　“以肝癌高低转移细胞株为例，我们利用自己发展的规模化蛋白质定量分析技术，发现高转移细胞株与低转移细胞株之间有100多个蛋白质存在差异表达，其中就有促进和抑制肝癌转移的重要蛋白质。”张丽华说，“只要能调控这些蛋白质的表达，就有希望降低肿瘤细胞的侵润和转移能力，提高患者的生存力。我们将对其中一些重要的蛋白质进行大量临床样本的验证，期待能推出精准的检测试剂盒，有助于医生评估癌症的转移风险。”　　但看似简单的检测分析过程背后却充满了挑战，要想将这些与疾病发生发展密切相关的蛋白质从海量的蛋白质中筛选出来，定量的准确度和分析速度的快慢至关重要。　　建立分析新方法　　酶解是蛋白质组样品预处理中不可或缺的环节。传统在自由溶液中的酶解方法通常需要消耗十几个小时 不仅严重制约分析速度，而且离线的操作会影响定量结果的准确度。张丽华团队提出了扬长避短的解决之道——固定化酶 通过提高单位面积上酶的浓度，既能加快蛋白质的酶解，又能降低酶的自降解几率。　　固定化技术必须既让酶“死心塌地”，又不能让蛋白质“恋恋不舍”。为此，过去10年间，张丽华带领的团队没少在固载材料上花心思。“球形的、颗粒的、整体的̷̷各种各样的固载材料和修饰方式都进行了优化和选择。”她介绍道，从十几小时缩短到几秒，就像魔术师对酶施了魔力一样。这项技术通用性极强，不仅提高了蛋白质样品预处理的速度，还解决了国内外众多研究蛋白质的同行的“痛点”——实现与分离鉴定系统的在线联用，显著提高了蛋白质组样品的酶解效率和分析通量。　　此外，她带领的团队还取得了一批成果：研制出了新型蛋白质印迹材料、固定化金属亲和色谱材料等，将鉴定灵敏度提高了2～3个数量级 建立了基于质量亏损的准等重标记技术，以及集成化定量分析平台，将蛋白质组相对定量的偏差由40%～50%缩小为10%以内，提高了定量的准确度、精确度和通量。　　恩师的引领　　如今，张丽华谈起蛋白质来头头是道，谁又能想到她其实并没有生命科学的相关教育背景。张丽华读博士期间主攻环境小分子，是在导师张玉奎院士的建议下转向潜力巨大的生物分析领域的。“作为一种生物大分子，蛋白质的分离分析更具有挑战性。”她说。　　从儿时对科学懵懂的梦想，到真正走上科研的道路，张丽华遇到的每一位导师都将严谨的态度和创新的精神传授给她。在张丽华读博士期间，由于她所在的团队重新组建，在急需用人的情况下，导师张玉奎义无反顾地把她送到了国外，在德国DAAD资助下开展博士生联合培养研究，并随后让她继续在日本从事博士后研究。　　导师的胸怀，对学生的无私奉献，让张丽华深深感动。回国后，在对学生的培养过程中，她也希望能够秉承恩师的这种精神，给学生创造更好的机会，让他们具有更好的发展空间。　　中国科学院大连化学物理研究所、德国国家环境健康研究中心生态化学所、日本德岛大学药学院̷̷一路走来，有恩师们的指引和帮助，有团队成员和学生们的辛勤工作，有研究所创造的优异的科研环境，张丽华坦言自己是幸运的，只希望能在这条路上走得更扎实、更久更远。　　“现在我最大的业余爱好就是陪儿子。”张丽华笑称。她会在下班后尽早回家，陪儿子阅读和游戏。她希望在兼顾事业的同时，也能陪伴孩子一同成长。

p 　“十二五国家重大科学仪器设备开发专项” 由基金委组织的重大科研仪器设备研制专项负责，其目的是为了提高我国科学仪器设备的自主创新能力和自我装备水平，支撑科技创新，服务经济和社会发展。该专项强调面向市场、面向应用、面向产业化，重点支持具有市场推广前景的重大科学仪器设备开发。在此次BCEIA2015展会上，大连依利特分析仪器有限公司展示了其“十二五国家重大科学仪器设备开发专项(2012YQ120044)”研发的最新成果——ASF自动进馏器和IPPI—100蛋白质在线预处理仪。 /p p 　　大连依利特分析仪器有限公司技术部副部长孙元社谈到了ASF自动进馏器设计之初的想法。孙元社讲到，传统的样品前处理过程耗时长，实验过程繁琐，存在很多人为干扰实验结果的因素。因此，是否可以设计一种便捷和高效的前处理设备从而提高实验效率和结果呢?在“十二五国家重大科学仪器设备开发专项(2012YQ120044)”的支持下，大连依利特分析仪器有限公司开始研发自动进馏器。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" IMG_9045_meitu_1.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201510/insimg/bf89f6ab-5a42-4f7d-be2b-570db44e4737.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" ASF自动进馏器 /p p 　　孙元社介绍到，ASF自动进馏器既可以实现单独的自动进样和馏分收集功能，也可以实现馏分收集——自动进样、自动进样——馏分收集——自动进样的复合功能，从而提高了仪器的自动化程度，避免了实验过程中人为因素的影响，使得更高层次的自动化收集与分析成为可能。同时，ASF自动进馏器可作为二维液相色谱系统的接口，衔接第一维和第二维的分析。 /p p 　　此外，在设计方面，ASF自动进馏器将馏分收集、自动进样两种功能集成化，减少了机械传导模块和电路控制模块的使用，降低了仪器的制造成本，同时也减少了不可控部件的数量，提高了仪器运转的可靠性。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" IMG_9047_meitu_2.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201510/insimg/e1ae1345-8bed-4328-89c9-9e57506399ab.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" IPPI—100蛋白质在线预处理仪 /p p 　　孙元社还介绍了 “十二五国家重大科学仪器设备开发专项(2012YQ120044)”另一项目科研成果——IPPI—100蛋白质在线预处理仪，该项目是由第一技术支撑单位——中国科学院大连化学物理研究所1810组自主研制的。孙元社介绍到，蛋白样品进入样品预处理系统后，首先进行高温变性和还原，然后再通过溶剂置换器和酶反应器进行在线除盐和酶解，酶解产生的肽段可以直接通过质谱进行检测。IPPI—100蛋白质在线预处理仪是一种集蛋白质在线变性和还原、除盐以及在线酶解为一体的样品预处理系统。与传统离线方法相比，IPPI—100蛋白质在线预处理仪使得整个样品预处理过程只需要6min，为传统方法的1/200。由于IPPI—100蛋白质在线预处理仪减少了手工操作，从而使蛋白质的定量覆盖度和精密度得到了明显提高。 /p

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，mNeuCode Empowers Targeted Proteome Analysis of Arginine Dimethylation1，文章的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的李灵军教授和国家蛋白质科学中心的常乘、贾辰熙教授。　　蛋白质精氨酸甲基化是一种广泛存在于真核生物中且相对保守的翻译后修饰，参与包括RNA加工、DNA修复、染色体组织、蛋白质折叠和基因表达在内的多种生物学过程。蛋白质精氨酸二甲基化在生物过程和人类疾病中发挥着重要作用，但与此同时，精氨酸二甲基化的相对丰度和化学计量通常很低，并且表现出较宽的动态变化范围，这些问题都给分析带来了巨大的挑战。在这篇文章中，作者设计了一种用于二甲基精氨酸代谢标记的mNeuCode标签，并开发了一个名为NeuCodeFinder的软件工具，用于在MS全扫描中筛选NeuCode信号，从而能够在蛋白质组范围内对蛋白质二甲基化进行靶向LC-MS/MS分析。作者将该方法应用到HeLa细胞精氨酸二甲基化的全蛋白质组分析中，证实了该方法的有效性：在70种蛋白质上鉴定到176个精氨酸二甲基化位点，其中38%是新位点。　　图1 用于细胞培养代谢标记的mNeuCode的化学设计。含有由稳定同位素标记的甲硫氨酸和精氨酸的不同组合的mNeuCode-I(红色)和mNeuCode-II(蓝色)分别用于两组细胞培养。同位素标记的甲硫氨酸经过代谢转化为甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet ),随后由蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)催化转移到精氨酸侧链的甲基上。细胞裂解后，将两种样品混合并制备用于高分辨率LC-MS分析。含有二甲基精氨酸的肽的NeuCode同源物被解析后，将显示出43 mDa的质量差异并作为诊断峰。　　图2 基于mNeuCode的精氨酸二甲基化靶向蛋白质组分析。(A)NeuCodeFinder从高分辨率质谱数据中筛选NeuCode同位素峰对的工作流程。从原始数据文件中提取全扫描质谱。单峰被配对以形成NeuCode等值线簇。最终的NeuCode对列表与提取的离子色谱(XIC)值一起导出。(B)靶向LC-MS/MS分析的工作流程，包括样品制备、富集以及MS1和MS2分析。　　在mNeuCode-I标记组中，使用含有正常L-精氨酸和同位素标记L-蛋氨酸[D3]的培养基 在mNeuCode-Ⅱ标记组中，则使用同位素标记的L-精氨酸[15N4]和L-甲硫氨酸[13C]进行培养(图1)。收集两组全细胞蛋白提取物并等量混合，蛋白经还原烷基化与酶切后，得到的肽段通过StageTip分级分离和HILIC tip富集，以提高样品肽段的识别率。处理的样品先进行LC-MS全扫描，通过作者的自制软件NeuCodeFinder生成包含列表，此包含列表用于辅助进一步的平行反应监测(PRM)模式分析(图2)。　　　　图3 已鉴定的精氨酸甲基化位点的生物信息学分析。(A)鉴定的精氨酸二甲基化位点和(B)精氨酸二甲基化蛋白质。橙色柱表示未报道的精氨酸二甲基化位点或蛋白质。绿色柱表示只有单甲基化是已知的，但是二甲基化还没有报道。(C)韦恩图显示，通过使用胰蛋白酶和镜像胰蛋白酶作为消化试剂，从两组实验中鉴定的精氨酸二甲基化位点。(D)蛋白质上位点数目的分布。每个蛋白质上精氨酸二甲基化位点的数量显示在饼图周围，蛋白质的数量列在饼图中。鉴定的精氨酸-二甲基化蛋白质的(E) GO富集和(F)KEGG途径分析。(G)使用STRING数据库将二甲基化蛋白质映射到蛋白质相互作用网络上。综合得分 0.4。(H)已鉴定的精氨酸二甲基化位点中-6和+6氨基酸残基的序列标志。　　通过对数据结果的分析，最终共鉴定到70种蛋白质上的176个精氨酸二甲基化位点，其中37-38%的精氨酸二甲基化位点是新的修饰位点，29%的精氨酸二甲基化蛋白没有被报道过，这证明了mNeuCode方法的有效性。与常规的鸟枪法蛋白质组学策略所获得的数据相比，mNeuCode方法在鉴定低丰度精氨酸二甲基化肽方面具有独特的优势，并且能够补充许多传统鸟枪法蛋白质组学所无法鉴定到的精氨酸二甲基化位点。对mNeuCode方法鉴定到的精氨酸二甲基化蛋白进行生物信息学分析后，发现这些蛋白质主要与RNA的加工、剪接和稳定性相关，参与了RNA的代谢过程。　　图4 FAM98A上精氨酸二甲基化位点的突变抑制了细胞迁移。(A)通过蛋白质印迹检测FAM98A在HeLa细胞中敲除和重建的效果。用siFAM98A-1和siFAM98-2沉默HeLa细胞，然后用Flag标记的WT或突变的FAM98A质粒重建。Anti-FAM98A显示内源性FAM98A的干扰。Anti-Flag显示外源FAM98A的重建。(B)图像和(C)柱状图显示了HeLa细胞的细胞迁移。　　FAM98A是一种微管相关蛋白，与结直肠癌和非小细胞肺癌的增殖有关。有研究者发现FAM98A是PRMT1的底物，但未能确定确切的甲基化位点。而在作者的研究结果中，成功鉴定到FAM98A上五个新的精氨酸二甲基化位点。为了验证这些二甲基化位点是否参与细胞迁移的调节，作者使用FAM98A敲除和FAM98A WT或突变重建细胞系进行了伤口愈合试验。将HeLa细胞的FAM98A基因敲除后，分别用WT或突变的flag-FAM98A重建FAM98A沉默细胞，其中突变的flag-FAM98A将二甲基化位点R351、R360、R363、R371和R375突变为赖氨酸以抑制甲基化。实验结果显示，当FAM98A基因被敲除时，细胞的迁移能力受到抑制，WT FAM98A的重建挽救了FAM98A敲除导致的细胞迁移缺陷，但是突变型FAM98A的重建却不能挽救。该结果证实了FAM98A上的二甲基化位点在细胞迁移中起到的作用。　　总之，在这篇文章中作者发明了一种mNeuCode方法，并开发了NeuCodeFinder软件，使得能够以全蛋白质组的方式进行精氨酸二甲基化的靶向MS/MS分析。实验结果证明了mNeuCode技术对于精氨酸二甲基化的靶向蛋白质组分析的能力和有效性，并证实HeLa细胞FAM98A上新的精氨酸二甲基化位点在细胞迁移调节中的功能，有助于更好地理解癌症发展的潜在机制，为蛋白质组分析的方法学提供了新的思路。　　撰稿：梁梓欣　　编辑：李惠琳　　文章引用：mNeuCode Empowers Targeted Proteome Analysis of Arginine Dimethylation　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　Wang, Q., Yan, X., Fu, B., Xu, Y., Li, L., Chang, C., & Jia, C. (2023). mNeuCode Empowers Targeted Proteome Analysis of Arginine Dimethylation. Analytical chemistry

仪器信息网讯，2010年5月15日，蛋白质组数据处理暨全国生物质谱学术交流会”在云南省丽江市召开。会议为期两天，主要讨论了蛋白质组学技术和应用、数据挖掘和生物质谱等方面的现状及其进展。在所有的大会报告中，除一些关于蛋白质组学技术最新研究进展的大会特邀报告外，第一天的专家报告集中讨论了糖蛋白组的最新分析技术与研究进展，第二天的报告集中讨论了蛋白质数据处理技术，包括蛋白质组生物数据库及分析平台的构建、数据统计分析方法的研究等方面。 　　蛋白质组数据库被认为是蛋白质组知识的储存库，包含所有鉴定的蛋白质信息。而基于质谱技术的蛋白质组学数据分析，是识别新型生物标记物模式的有效手段。质谱仪检测的数据含有大量潜在信息，因此，建立完善的蛋白质组学数据库，开发实用性强的数据处理软件工具，以及提供良好的蛋白质组数据分析、处理方对蛋白质组学的发展至关重要。在本次大会上，中国科学院计算技术研究所贺思敏研究员、浙江大学生物医学工程与仪器科学学院段会龙教授、国防科技大学机电工程与自动化学院谢红卫教授等专家学者作了关于此方面最新研究进展的报告，本文作简要报道： 　　报告题目： 蛋白质组数据分析软件pFind系统新进展 　　报告人：中国科学院计算技术研究所贺思敏研究员 贺思敏研究员 　　pFind系统是中国科学院计算技术研究所自2002年开始持续研发的蛋白质组数据分析软件，可以替代同类国际主流软件，已安装在国内多家蛋白质组学重点研究单位，并在ABRF组织的国际评测以及核心岩藻糖化修饰位点鉴定等科研实战中表现出色。 　　贺思敏研究员在报告中首先介绍pFind系统不同于国际同类软件的核心算法设计和系统实现，然后介绍pFind系统近期在开放式修饰类型发现、高精度一级质谱分析、新型碎裂方式串联质谱分析、肽序列从头测序、标记定量分析以及并行加速系统研制等方面的进展，最后介绍了pFind系统的下一步研究设想。 　　报告题目：构建心血管蛋白质组生物医学数据库及分析平台 　　报告人：浙江大学生物医学工程与仪器科学学院段会龙教授 段会龙教授 　　心血管疾病是威胁人类健康的主要疾病。以高分辨率质谱技术为基础的心脏蛋白质组研究是发展心血管研究的一个重要方向。段会龙课题组通过对心血管医学和生物学、蛋白质组学和生物医学信息学的多学科交叉研究，构建了心血管生物医学数据库，重点在心血管蛋白质组数据集成、处理和分析，生物医学数据库体系构建、数据共享和发布等诸多关键技术上进行突破。 　　该课题组目前已完成了如下工作： 　　(1)心血管蛋白质组数据体系结构：构建了以蛋白质组信息为主体的数据库体系结构，以心脏线粒体蛋白质组为基础建立了核心数据集，该核心数据集包含了1663种心脏线粒体蛋白质以及与之相对应的2万7千多个生物质谱谱图。 　　(2)心血管蛋白质组数据库搜索引擎：初步建立了数据搜索引擎，可通过蛋白、肽段序列等信息对相应的生物质谱谱图进行检索，实现了与欧洲生物信息学研究所 (EBI) 的IPI蛋白质数据库间的数据关联。 　　(3)心血管生物医学数据库平台：研究和开发了相应的数据库网络公共平台。该网络平台的首个版本将在2010年末面向全世界发布，通过对心血管生物医学数据信息和资源的实时共享，服务于全世界心血管研究群体。 　　报告题目：大规模蛋白质组研究中的质谱数据定量分析方法 　　报告人：国防科技大学机电工程与自动化学院谢红卫教授 谢红卫教授 　　谢红卫教授利用一系列大规模定量分析的数据集，包括稳定同位素标记和进行重复实验的无标记定量数据，进行了一系列分析和研究，目前取得了很大的结果： 　　(1)总结了无标记和稳定同位素标记定量数据分析的典型流程，并且结合实际的数据分析结果，初步研究了各种分析流程优势和问题。 　　(2)针对丁来那个信息提取问题，利用重复实验数据集，比较优化了其关键步骤。 　　(3)利用实际实验数据，初步研究了同位素分布实验误差和质荷比误差等对定量分析参数选择有重要影响的问题。 　　(4)针对定量计算速度慢的问题，提出了索引文件和基于hash表的信息检索方式，将定量计算的时间缩短为原来的1/10。 　　(5)设计了一种可逆的色谱保留时间对齐模型，大大缩短了无标记定量数据处理中色谱保留时间对齐的计算复杂度。 　　(6)提出了一种以信号强度为参量的差异分布模型，能够提高差异检验的灵敏度。 　　(7)开发了无标记定量软件LFQuant、标记定量软件SILVER，已经无鉴定定量分析工具XICFinder。其中SILVER能够支持自定义标记方法，提供了图形化界面。LFQuant速度和定量精度等性能经过了多次优化。 　　报告题目：多层次蛋白质磷酸化分析中的数据处理方法研究 　　报告人：中国科学院大连化学物理研究所叶明亮研究员 叶明亮研究员 　　叶明亮研究员在报告中提到，根据研究目的的不同，蛋白质磷酸化的分析可以划分为三个层次：信号转导通路中关键节点蛋白质的磷酸化、生物体内的所有蛋白质的磷酸化(即磷酸化蛋白质组)、生物体内的所有激酶与底物的相互作用(磷酸化调控网络)。不同层次的分析有不同的目的，样品的复杂度也不同，因此需要不同的数据处理方法。 　　在节点蛋白质的磷酸化分析方面，为实现对某一感兴趣蛋白质中磷酸化位点的全面分析鉴定，发展了一种基于改进的目标-伪数据库用于数据检索，来高覆盖率、高可靠鉴定简单蛋白样品中的磷酸化位点信息的方法。并且从搜库耗时上，允许用多种低特异性的酶来提高简单蛋白样品的序列鉴定的覆盖度，从而更加全面的鉴定样品的磷酸化位点信息。 　　在磷酸化蛋白质组层次上要实现在保持较高可信度和灵敏度的情况下对海量质谱数据以及检索数据进行自动化处理。针对磷酸化蛋白质组学中磷酸化肽段鉴定难，假阳性率高，主要依赖于人工验证的现状，发展了一种结合MS2和MS3图谱以及正伪数据库检索的自动磷酸化肽段鉴定方法。该方法结合了MS2和MS3的鉴定信息，提高了磷酸化肽段鉴定的灵敏度和可信度，可以自动的对磷酸化肽段进行鉴定而无需进一步的人工验证。利用这种方法，结合磷酸肽的多维分析已经可以从人肝组织中鉴定超过8000个磷酸化位点。最近，其课题组还发展了一种基于分类筛选的磷酸化肽段鉴定方法，该方法结合了MS2/MS3方法的高可信度，并且考虑了部分不易发生中性丢失的磷酸化肽段的鉴定，进一步提高了磷酸化肽段鉴定的灵敏度。 　　在磷酸化调控网络层次主要是揭示激酶与底物蛋白质上磷酸化位点的对应关系，叶明亮研究员表示，这是该课题组今后研究的一个重要方向，目前已经在与合作者利用生物信息学的方法模拟构建磷酸化网络图。

仪器信息网讯，2010年5月15日，蛋白质组数据处理暨全国生物质谱学术交流会”在云南省丽江市召开。会议为期两天，主要讨论了蛋白质组学技术和应用、数据挖掘和生物质谱等方面的现状及其进展。在所有的大会报告中，除一些关于蛋白质组学技术最新研究进展的大会特邀报告外，第一天的专家报告集中讨论了糖蛋白组的最新分析技术与研究进展，第二天的报告集中讨论了蛋白质数据处理技术，包括蛋白质组生物数据库及分析平台的构建、数据统计分析方法的研究等方面。 　　近年来蛋白质组学发展迅速，其相应的方法学研究也取得了巨大的进步，一系列新技术融入了的蛋白质组学技术当中，极大的促进了这门学科的发展。在本届大会上，中国科学院北京基因组研究所的刘斯奇研究员、复旦大学的张祥民教授、中国科学院大连化学物理研究所张丽华研究员等专家的报告介绍了许多应用到蛋白质组学之中的新技术、新方法，本文作简要概述： 　　报告题目：基于质谱的线粒体GST蛋白质组定性和定量分析 　　报告人：中国科学院北京基因组研究所的刘斯奇研究员 刘斯奇研究员 　　刘斯奇研究员在报告中首次提出了“线粒体GSTs蛋白质组”的概念，系统地研究了属肝线粒体中的GSTs。可采用亲和色谱法及SDS-PAGE富集GST蛋白，使用MALDI Tof/Tof MS 和LC tandem MS/MS鉴别蛋白。研究结果表明，属肝线粒体中存在5种GSTs，分别为GSTA3, GSTM1, GSTP1, GSTK1 以及GSTZ1。 　　为了对线粒体GSTs的相对丰度进行定量分析，其采用了质谱结合免疫印迹的综合分析方法：利用质谱对GSTs进行定性分析时，根据质谱谱图的多反应监测(MRM)推断GSTs结构 使用重组的GST蛋白作为标准物，建立了蛋白浓缩物的线性回归方程和胰蛋白酶GST多肽的MS/MS强度，同时，通过校准估算出了鼠肝线粒体中的GSTs含量。通过对特定GSTs抗体的强度识别，使用免疫印迹对GSTs进行了定量分析 获得了GST重组蛋白的5种单克隆抗体，将其用于GST浓度校准和免疫印迹强度分析 通过免疫印迹分析获得的定性分析结果基本与MRM数据获得的结果一致。 　　报告题目：蛋白质水平的色谱分离与生物质谱鉴定新方法研究 　　报告人：复旦大学张祥民教授 张祥民教授 　　张祥民教授在报告中表示，蛋白质的分离鉴定有更多困难。一方面，蛋白质分子量大，结构与构型上的变化导致分离效率下降，对色谱填料的孔径、分布与非特异性吸附等因素有更高要求 另一方面，蛋白质鉴定需要先进行酶解以得到质谱鉴定信息。 　　在报告中，他给出了较好的解决方法，通过对液相色谱分离系统的优化，在实际蛋白质样品考察优化了系统的分离性能，构建了液相色谱分离蛋白质鉴定方法与平台。研制了蛋白水平富集预柱，并将其应用于蛋白质捕集。在离子交换色谱柱和反向色谱优化选择上，实现了蛋白质分析所需的高分辨分离。色谱分离组分点样至靶板上，利用发展的快速酶解技术完成蛋白质酶解，再通过MALDI-TOFTOFMS或LC-LTQMS进行蛋白质鉴定。该方法使得蛋白质的理论分离能力达到5000个以上，蛋白质组分能够得到浓度信息，质谱鉴定可以同时利用肽指纹图谱PMFs信息和串级序列信息，使得蛋白质鉴定的可靠性大为提高。 　　报告题目：基于离子液体的新型膜蛋白质组预处理及分离鉴定技术 　　报告人：中国科学院大连化学物理研究所张丽华研究员 张丽华研究员 　　膜蛋白质存在于细胞内环境、细胞与细胞外环境的界面，对执行细胞内外物质交换、信息转换、细胞识别、代谢调节、免疫应答等功能起着重要作用。深入开展膜蛋白质组学研究对于揭示细胞功能、寻找药物靶点以及研制癌症治疗药物等具有重要意义。然而，由于膜蛋白质具有疏水性强、溶解性差、易沉淀、难酶解、含量低等特点，因此在采用通常用于可溶性蛋白质组分离鉴定的方法对膜蛋白质组进行研究时遇到了很大的挑战。 　　张丽华研究员在报告中指出，要提高膜蛋白质组的分析能力，必须发展可显著改善膜蛋白质组溶解性，又不影响后续分离鉴定的新方法。她在近期研究工作中，采用离子液体作为膜蛋白质组的增溶剂，并结合纳升二维液相色谱-质谱联用系统，对鼠脑和人肝内质网提取的膜蛋白质进行了分析。结果表明，离子液体不仅可以提高膜蛋白的溶解性，而且不用影响后续酶解过程中酶的活性。此外，在样品进入质谱鉴定前，易于在除盐步骤去除，不会影响质谱鉴定。与其他膜蛋白质组研究中常用的增溶剂相比，离子液体在膜蛋白质组样品预处理中表现出明显的优势。

2014年11月30日，国际学术期刊《分子与细胞蛋白质组学》molecular & Cellular Proteomics在线发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所系统生物学重点实验室曾嵘研究组与美国范德堡大学定量科学中心石瑜研究组的最新合作研究成果，揭示了稳定同位素化学标记高精度质谱数据中高丰度、高频率噪音离子的去除可以显著提高蛋白质鉴定率。在定量蛋白质组学研究中，稳定同位素标签结合高精度质谱仪可以在一次实验中对多个样品进行相对定量比较，这种策略比非标记定量具有更高的精确性。另一方面，体外化学标记相对于体内标记方法如SILAC，具有更高的样品通量和普适性，使得体外化学标记在定量蛋白质组学研究中得到了广泛的应用。对于该策略得到的肽段二级质谱谱图，其中的报告离子用于定量，而其他离子则用于鉴定该肽段。但报告离子以及其伴生离子并未包含多肽序列信息，这些离子会降低数据库搜索鉴定的敏感性和准确性。由于定量是建立在数据库鉴定的基础之上，在数据库搜索前对质谱数据的预处理就尤为重要。在曾嵘研究员和石瑜教授的共同指导下，盛泉虎，李荣霞和戴捷等人对稳定同位素化学标记数据首先进行了高丰度、高频率离子的分析，然后进行了16种不同组合的数据预处理，最后用5种不同搜索引擎进行了数据库搜索分析。研究表明，在高精度质谱数据中，存在大量稳定同位素标签相关的高丰度、高精度离子。结合各种预处理方法，判别和去除这些离子可以提高四标数据16.3%的鉴定谱图，13.9%的鉴定肽段以及6.6%的双肽段鉴定蛋白质。对于八标复杂数据，预处理方法则可提高50.2%的鉴定谱图，39.5%的鉴定肽段以及25.2%的双肽段鉴定蛋白质。这表明，标记通道的增加，在提高样品通量的同时，也引入了更多的伴生离子，判别和去除这些离子可以更显著提高鉴定的敏感性。基于组学大数据和系统生物学平台，曾嵘研究组通过多年努力自主开发了一系列蛋白质组数据分析技术，该工作建立的方法与此前的Buildsummary，ProteomicsTools, SRMBuilder 等工具一起 (Sheng et al., J Proteome Res 2012 Su et al., JMCB, 2014)，形成了更加完善的蛋白质组学工作流程。该研究工作得到了国家科技部和国家自然科学基金资助。示意图：预处理可以显著提高谱图、肽段和可靠蛋白质的鉴定率

蛋白质分析仪是一种用于测定蛋白质含量和结构的精密仪器，广泛应用于生物、医学、食品等领域。了解蛋白质分析仪的结构和使用注意事项，能够帮助用户更好地使用设备，提高实验结果的准确性和可靠性。本文将详细介绍该仪器的结构和使用注意事项，帮助用户全面认识这一重要设备。　　一、结构　　该仪器主要由以下几个部分组成：　　样品室：用于放置待测样品，通常由高质量的光学玻璃制成，以确保样品在测量过程中不受外界干扰。　　光源：提供测量所需的光束，通常使用紫外线或可见光作为光源。光源的稳定性直接影响测量结果的准确性。　　分光器：将光源发出的光分成不同波长的光束，通常使用棱镜或光栅作为分光元件。分光器的精度决定了分析仪的测量范围和分辨率。　　检测器：用于接收经过样品室后的光信号，并将其转换成电信号。常用的检测器包括光电管和光电二极管。　　数据处理系统：将检测器产生的电信号进行放大、处理和分析，较终生成蛋白质含量和结构的相关数据。数据处理系统通常包括放大器、模数转换器和计算机。　　控制和显示系统：用于设置测量参数、监控测量过程和显示测量结果。控制和显示系统通常由触摸屏或液晶显示屏组成。　　二、使用注意事项　　样品准备：在使用仪器之前，务必确保样品的纯净度和均一性。样品中不应含有影响测量的杂质和气泡。样品的浓度应在分析仪的测量范围内，以确保测量结果的准确性。　　校准仪器：在每次使用之前，应对该仪器进行校准。校准方法通常包括零点校准和标准曲线校准。具体校准步骤可以参考设备的使用说明书。　　保持清洁：样品室和检测器是该仪器的核心部件，应保持清洁，避免样品和杂质的污染。测量结束后，应及时清洗样品室，并用干燥的软布擦干。　　避免过载：在使用过程中，应避免设备长时间满负荷运行，以防止光源、分光器和检测器等关键部件过热或过载。　　定期维护：为了延长设备的使用寿命，用户应定期对仪器进行维护和保养。具体维护方法可以参考设备的使用说明书。　　记录数据：在测量过程中，应记录测量时间、样品编号和测量结果等数据，以便后续分析和总结。　　蛋白质分析仪是生物、医学、食品等领域的重要设备，掌握其结构和使用注意事项，能够帮助用户更好地使用设备，提高实验结果的准确性和可靠性。希望本文的介绍能够为您提供有价值的参考，帮助您全面认识蛋白质分析仪。如果您在使用过程中遇到问题，建议及时咨询设备的售后服务人员，获取专业指导。

随着高通量、高灵敏度、高分辨率生物质谱技术的出现，蛋白质组学技术取得飞速发展，蛋白质组学（Proteomics）是蛋白质（protein）与 基因组学（genomics）两个词的组合体，表示“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学研究，就是要把一个基因组表达的绝大多数蛋白质或一个复杂的混合体系中绝大多数蛋白质进行精确的定量和鉴定。蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组学研究主要包括蛋白质分离、鉴定与生物信息学分析，其中样品中蛋白质的分离至关重要，会直接影响后续的分析结果。对比传统的柱层析分离方式，磁珠法提取蛋白质能轻松实现高通量和多样品平行处理。磁珠法提取蛋白质与提取核酸原理类似，都需经过“结合-洗涤-洗脱”等过程，蛋白纯化后，还需经过裂解、二硫键还原、酶解等多步预处理才能将蛋白样品裂解为可检测的肽段，这些过程同样涉及多次移液、加热、震荡等步骤。Vitae 100全自动液体处理工作站● 睿科Vitae 100全自动液体处理工作站整合移液、磁吸、震荡、加热功能于一体，可全自动完成磁珠法蛋白纯化，可替代蛋白酶解实验过程中大部分手工操作，实现高通量、高效率、高一致性的蛋白纯化。Vitae 100配置了可选4或8通道的空气注射泵移液器，机械定位准确至0.05mm，高通量提取时准确性、均一性均优于手工操作。另外Vitae 100创新性的整合了“磁吸-加热-震荡”三合一模块，节省盘面空间，减少移液步骤，利用自动化操作来减少人为实验操作带来的误差，提升实验结果的稳定性，减少污染的可能性，同时利用自动化精准的时间控制和操作，来优化实验流程，提高实验室运行效率。▲蛋白质组学自动化前处理解决方案睿科生化科技公司睿科生化科技公司是睿科集团旗下专注研发生产生命科学领域样品前处理设备的高科技企业。公司提供自动化的生物样品前处理设备，服务于生物/药物分析、分子诊断、临床检测、蛋白组学、代谢组学等领域。公司核心团队拥有10多年丰富的行业经验，掌握自主核心技术，系统化架构和集成式开发，可提供灵活的定制化服务，为客户提供个性化的产品和服务。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章Quantitative Structural Proteomics Unveils the Conformational Changes of Proteins under the Endoplasmic Reticulum Stress1，文章的通讯作者是来自美国佐治亚理工学院的Ronghu Wu助理教授。在真核细胞中，内质网(endoplasmic reticulum，ER)负责蛋白质组中40%蛋白质的合成和成熟。蛋白质合成或折叠过程中的变化都将影响内质网的稳态，进而导致未折叠蛋白的积累和蛋白分泌效率的降低。在过去几十年的研究中，内质网应激反应被广泛研究，但是内质网应激反应后蛋白质折叠状态的变化却没有被深入研究。基于丰度的蛋白质组学方法不能直接用于分析蛋白质状态的变化，在这篇文章中，作者整合了半胱氨酸(cysteine，Cys)共价标记、选择性富集和定量蛋白质组学，称为半胱氨酸靶向共价蛋白绘制(cysteine targeted covalent protein painting，Cys-CPP)，用于研究蛋白质组范围内的蛋白质结构和变化(图1A)。　　使用CPP分析蛋白质结构，需要一种具有高反应活性的探针。作者设计了一种针对半胱氨酸的探针，其中包含半胱氨酸反应基团、用于富集的生物素部分和用于生成半胱氨酸特异性识别位点标签的可裂解连接部分(图1B)。以变性处理后的蛋白样品作为蛋白质展开形式的参考，计算肽段在原始样本和变性样本中的比例从而获得宝贵的蛋白质结构信息。　　图1.利用半胱氨酸反应探针定量分析人细胞蛋白质组中半胱氨酸暴露率的原理。(A)Cys-CPP的一般工作流程。(B)半胱氨酸残基与探针之间的反应。富集后，进行紫外裂解，在修饰的半胱氨酸上留下一个小标记，用质谱进行位点特异性分析。　　半胱氨酸暴露率Rexpo通过每条肽段在原始样本和变性样本中的比值进行计算。结果显示：(1)半胱氨酸的暴露率和溶剂可及性呈现正相关(图2C) (2)在丝氨酸和苏氨酸等极性氨基酸残基旁边的半胱氨酸具有相对较高的暴露率，这与人们普遍认为亲水残基更有可能暴露在蛋白质表面的观点一致 (3)甘氨酸和脯氨酸附近的半胱氨酸具有更高的暴露率，这是因为这两种氨基酸通常出现在蛋白质的转角和环结构中，对半胱氨酸的空间位阻较小 (4)半胱氨酸暴露率与其有/无序区(图2D)或所处二级结构(图2E)的相关性分析均表明，较低的暴露率与更稳定和结构化的局部环境有很好的相关性。这些数据结果共同证明目前的方法可以准确地测得半胱氨酸暴露率，并为蛋白质结构提供有价值的信息。　　图2.HEK293T细胞中半胱氨酸暴露率的分析。(A) VAHALAEGLGVIAC#IGEK(#代表标记位点)的串联质谱样本。报告离子的强度使我们可以准确定量一个半胱氨酸的暴露率(左框为报告离子强度的放大视图)。(B)蛋白CCT3中被定量半胱氨酸的定位和暴露率演示(PDB代码：6qb8)。(C−E)比较不同的溶剂可及性(C)、预测无序区(D)和二级结构(E)的半胱氨酸暴露率。　　衣霉素(Tunicamycin，Tm)可抑制 N-糖基化并阻断 GlcNAc 磷酸转移酶 (GPT)。由于蛋白质的N-糖基化经常发生在共翻译过程中，在蛋白质折叠的调节中起着至关重要的作用，所以衣霉素会引起细胞内质网中未折叠蛋白的积累并诱导内质网应激。基于此，作者用衣霉素对细胞进行处理，计算并对比了衣霉素处理样本和正常样本中的半胱氨酸暴露率。正如预期的那样，Tm处理样本中许多半胱氨酸的暴露率升高，且Tm对于蛋白质不稳定区域的作用尤为显著。根据Tm处理样本和正常样本之间半胱氨酸暴露率的差值，作者将所有位点划分为5个部分，在Tm处理下，近三分之一的半胱氨酸定位区域没有明显的结构变化(差值在-0.05~0.05之间)，而28%的位点则高度暴露(差值0.15)(图3B)。对这两种蛋白质进行基因本体(GeneOntology，GO)功能富集分析(图3C)，结果显示：差值在-0.05~0.05之间的蛋白通常是糖异生或折叠过后具有良好结构区域的蛋白，而差值0.15的蛋白则是与囊泡转运相关的蛋白。这表明抑制N-糖基化主要影响经典分泌途径中的蛋白质，与预期相符。　　图3.利用Tm抑制蛋白质N-糖基化对蛋白质折叠影响的系统研究。(A)Tm处理和对照样品之间半胱氨酸暴露率的比较。(B) 不同暴露率变化范围内的蛋白质数量。(C)在具有高度展开或稳定区域半胱氨酸的蛋白之间进行GO功能富集分析。　　由于Tm对于预先存在的、折叠良好的蛋白质所产生的影响可能远小于对新合成蛋白的影响，分别研究Tm对这两种蛋白的影响是必要的。作者通过将目前的方法Cys-CPP与细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记(pSILAC)结合(图4A)，探究了细胞中已存在蛋白和新合成蛋白在内质网应激作用下的不同变化。结果显示：(1)抑制N-糖基化对新合成蛋白的去折叠影响比对已存在蛋白的影响更显著(图4C) (2)N-糖基化除了调节蛋白质的二级结构外，在蛋白质三级或四级结构的形成中起着更重要的作用(图4D)。　　图4. 抑制N-糖基化对新合成蛋白和已存在蛋白折叠状态影响的研究。(A)量化新合成蛋白和已存在蛋白折叠状态变化的实验设置。(B) 经Tm处理和未经处理的细胞中新合成和已存在蛋白质的重叠。括号内为每组蛋白质数。(C)不同蛋白质组中暴露率的分布。(D) 在有或没有Tm处理的细胞中、在不同的二级结构下，新合成和已存在蛋白之间半胱氨酸暴露率的差值分布。　　本文通过设计一种半胱氨酸靶向探针，定量半胱氨酸残基的暴露率，系统地研究了蛋白质的结构以及结构的变化。结果表明，半胱氨酸暴露率与蛋白质局部结构的相关性非常好。利用该方法，作者研究了Tm引起的内质网应激反应下细胞中蛋白质的结构变化。此外，通过将Cys-CPP与pSILAC结合，研究了在内质网应激反应下原有蛋白和新合成蛋白的结构变化差异，并详细分析了内质网应激对蛋白质去折叠的影响，深入和准确地了解内质网应激下的蛋白质结构变化，有助于深入了解蛋白质的功能和细胞活性。　　参考文献：[1] Yin K, Tong M, Sun F, et al. Quantitative Structural Proteomics Unveil the Conformational Changes of Proteins under the Endoplasmic Reticulum Stress[J]. Analytical Chemistry, 2022,

大家好，本周为大家分享一篇发表在J Proteome Res.上的文章，Systematic Identification of Proteins Binding with Cisplatin in Blood by Affinity Chromatography and a Four-Dimensional Proteomic Method，该文章的通讯作者是华中科技大学药学院的杜支凤教授。以顺铂为代表的铂类抗癌药物广泛应用于治疗多种癌症肿瘤，如胃肠道癌、头颈部癌和卵巢癌等。在静脉滴注后，这些药物水解形成活性分子，与DNA结合并抑制DNA链的合成与复制，最终致使细胞死亡。然而，由于铂与硫醇的高亲和力，大多数铂在静脉注射后会与血液中的蛋白质结合；例如，人血清白蛋白 (HSA) 是含量最丰富的血清蛋白，也是血液中铂类药物的主要结合蛋白；另外，在红细胞中负责运输氧气的血红蛋白 (HB) 也被发现与铂结合，因此，有必要研究铂类药物在血液中的蛋白结合行为。先前的研究已经证明，利用质谱方法可以实现对高丰度蛋白质的可靠鉴定；然而，由于高丰度蛋白的干扰，占总蛋白的 80% 以上的低丰度蛋白则很少被鉴定。此外，由于缺乏足够信息，以及在胰蛋白酶消化过程中还原和烷基化剂的使用导致蛋白上的铂化位点无法被确定。更重要的是，目前排除假阳性结果的唯一方法是根据铂化肽的特征同位素模式，人工对比理论同位素和实验同位素，从而导致鉴定过程非常耗时并且具有较强的主观性。因此，有必要开发一种可靠、高效的方法来鉴定血液中铂类药物的结合蛋白质组。在血液蛋白质组学研究中，免疫亲和层析常用于消耗高丰度蛋白并富集低丰度蛋白。它有利于低丰度蛋白的鉴定和定量，从而可以提高血液中的蛋白质组覆盖范围。除了色谱分离外，离子淌度质谱 (IM−MS) 根据离子的迁移率差异进行分离，同样有助于低丰度蛋白质的分析。在金属化蛋白的鉴定中，金属化肽和游离肽的同位素分布模式明显具有差异，这有助于确定这些肽是否与金属药物结合。已经开发了一些数据处理软件程序来自动分配金属药物在已知蛋白质上的结合位点，如智能数字注释程序 (SNAP) 算法和 Apm2s 。本文结合高丰度蛋白分离和4D蛋白质组学方法 (IM-MS) ，系统、全面地鉴定了血液中顺铂的结合蛋白，并利用铂化肽的特征同位素模式和相似性算法来消除假阳性的识别。如图1所示，首先用超滤去除游离药物，然后使用多亲和去除柱分离血液样本中的高丰度和低丰度蛋白；用FAIMS Pro界面的nano-LC−MS/MS进行消化和分析；用MaxQuant对铂化的多肽和蛋白进行鉴定，用相似性算法Apm2s排除假阳性结果。在此基础上，采用基于平行反应监测 (PRM) 的方法测定了血浆中多肽与顺铂的结合率。本研究为系统鉴定血液中金属药物的结合蛋白提供了一种新方法，鉴定出的蛋白可能有助于了解铂类抗癌药物的毒性。图1 铂化蛋白的分离和鉴定以及用蛋白质组学方法测定顺铂与多肽之间的结合率的示意图本研究采用顺铂与人血浆的反应混合物建立了一种分析方法。为了与文献进行比较，样品的制备方法与文献中的制备方法相同1。选择CID作为碎裂方式，结果表明，从低丰度部分共鉴定出212个蛋白，从高丰度部分共鉴定出169个蛋白。在低丰度部分，共鉴定出1192个游离肽和208个铂化肽。其中，154个铂化肽被排除为假阳性结果，如文中表S1所示。高丰度部分的游离肽数和铂化肽数分别为1124个和169个，其中，144个铂化肽被排除为假阳性，如表S2所示。低丰度结合蛋白的鉴定在以往的研究中，由于高丰度蛋白的干扰，很少发现低丰度蛋白与铂的结合。本研究在高丰度蛋白被消耗后，从29个蛋白中共鉴定出54个铂化肽。APOA4中铂化肽的理论和实际质谱如图2所示，前体离子和铂化产物离子表现出特征的同位素峰。图片显示了关键的碎片离子的质谱图，用于分配铂化位点。在鉴定出的铂化蛋白中，CERU、FETUA、ITIH1和B4E1Z4有4个或更多的含铂肽，这表明铂可以与这些蛋白质的多条肽段结合。虽然低丰度蛋白只占血液中蛋白的一小部分，但它们具有非常重要的功能，对于维持正常生理活动不可或缺。例如，CERU可以将Fe2+氧化为Fe3+，并在铁代谢中发挥重要作用；B4E1Z4与补体激活相关。顺铂与这些蛋白的结合是否会对其功能产生影响仍有待进一步研究。图2 从低丰度蛋白部分鉴定出的铂化蛋白APOA4。(A)铂化肽的理论（左）和实验质谱（右）；(B)铂化肽的MS/MS和指示铂化位点的关键碎片离子的质谱图高丰度结合蛋白的鉴定IGHG1中一个铂化肽的理论和实验质谱如图3所示，其前体离子和铂化产物离子表现出特征同位素峰。根据关键的碎片离子确定了铂化位点。在已鉴定的蛋白中，ALBU（白蛋白）和CO3（补体C3）有4个或更多的含铂多肽。HSA负责血液中药物和小分子的运输，CO3在补体系统的激活中起着重要作用。高丰度蛋白与顺铂的结合已被用于提高肿瘤化疗的疗效和选择性，而新发现的高丰度结合蛋白有助于相关研究。与低丰度组分鉴定的铂化蛋白相比，大部分与低丰度组分蛋白不同，两个组分中仅共同检测到FETUA和CFAH作为铂化蛋白，这表明亲和层析对高丰度蛋白和低丰度蛋白的分离效果较好。图3 从高丰度蛋白部分鉴定出铂化蛋白IGHG1。(A)铂化肽的理论（左）和实验质谱（右）；(B)铂化肽的MS/MS和指示铂化位点的关键碎片离子的质谱图IM−MS分离铂化肽异构体如图4所示，通过nano-LC−IM−MS/MS成功分离了低丰度蛋白组分中FETUA的铂化肽异构体。同分异构体a和b是典型的铂化肽，由质谱图的同位素模式显示，它们被很好地分离。它们的MS/MS不同，根据关键碎片离子，异构体a和b的铂化位点分别被划分为M和H/T。这个例子显示了IM−MS对复杂样品的分辨能力。图4 用nanoLC−IM−MS/MS分离的低丰度蛋白组分中FETUA的铂化肽异构体。(A)m/z=764.67提取离子色谱和异构体a、b的质谱，理论质谱见中间；(B)异构体的MS/MS和关键碎片离子的质谱图结合蛋白的铂化位点在本文的两项研究中，His 和 Met 是首选的铂结合位点。此外，D、E、S和Y也被发现是铂结合位点。这也是合理的，因为血清蛋白的供氧氨基酸已被证明是顺铂的动力学首选结合位点。很少有Cys残基被鉴定为结合位点，这可能是由于没有还原和烷基化。肽的半胱氨酸常形成二硫键，不经还原和烷基化就无法识别，因此，序列覆盖率会很低。在未来的研究中，应使用替代还原剂来提高肽序列覆盖率。生物信息学分析 为了揭示铂化蛋白质的定位、功能和途径，将从高丰度和低丰度部分中鉴定的蛋白质组合起来并通过生物信息学工具进行分析。如图5A所示，GO分析表明大部分结合蛋白位于细胞外区域，发挥蛋白结合、金属离子结合、酶抑制剂等功能；因此，镀铂蛋白的定位证实了鉴定的可靠性。此外，这些蛋白质参与内肽酶活性、免疫系统过程、补体激活、炎症反应和凝血的负调节。为了阐明所涉及的途径，对鉴定的蛋白质进行了KEGG途径富集分析，结果表明最显着的富集途径是补体和凝血级联途径（图5B）。补体和凝血级联途径已被证明在造血干/祖细胞的动员中发挥关键作用，这对造血具有重要意义。顺铂的血液学毒性与其在补体和凝血级联途径中与血液蛋白的结合之间的相关性值得进一步研究。图5 (A)通过GO 分析确定的铂化蛋白的定位、分子功能和生物学过程；(B)铂化蛋白的富集途径血液蛋白与顺铂的结合率 由于未检测到一些铂化肽的游离形式，因此仅使用高丰度组分中的13种肽进行亲和力研究。可靠地计算了属于五种蛋白质的六种铂化肽的结合率。PRM分析中这些肽的信息见表S5，定量结果见图6。其中，富含组氨酸的糖蛋白的一种肽与顺铂的结合率最高，这可能是由于顺铂对含组氨酸和带负电荷的生物分子的高亲和力。Apoa1 蛋白的一个肽与顺铂的结合率最低。在本研究中可以确定结合率的铂化肽数量较少，这主要是由于某些肽的质谱响应低以及某些肽存在氧化形式。因此，这些肽的结合比率不能通过 PRM 方法确定。然而，与以往的研究相比，根据属于同一蛋白质的肽的质谱计数粗略估计某种蛋白质的丰度，这种方法可以更准确地确定高丰度肽与铂的结合率。图6 根据PRM分析多肽与顺铂的结合亲和力顺铂与血液蛋白的结合与其药代动力学、活性、毒性和副作用密切相关。然而，血液蛋白质组的复杂性限制了低丰度结合蛋白的鉴定。在本研究中，基于亲和色谱和nanoLC-IM-MS/MS 的 4D 蛋白质组学方法被用于分离低丰度和高丰度蛋白质并分析这两个部分。基于铂化肽的特征同位素分布和相似性算法，排除了假阳性鉴定。结果，共有 39 种蛋白质被鉴定为铂化蛋白质，这比之前研究中的数量要高得多。随后的生物信息学分析表明，这些结合蛋白位于细胞外区域，主要参与内肽酶活性、免疫系统过程、补体激活、炎症反应和凝血的负调控。最显着的富集途径是补体和凝血级联，这可能与顺铂的血液学毒性有关。高丰度部分的 PRM 分析表明，富含组氨酸的糖蛋白中的肽与高丰度组分中的顺铂的结合率最高。综上所述，本研究揭示了人类血液中与顺铂结合的蛋白质组，并计算了顺铂与血液蛋白的结合率。这种方法虽然在数据分析方面比较耗时，但它可以识别复杂系统中金属药物的低丰度结合蛋白，并且可以准确测量药物与血液蛋白的结合率。

记第四届中国计算蛋白质组学研讨会（CNCP-2016）新技术　　仪器信息网讯 2016年8月10日-11日，第四届中国计算蛋白质组学研讨会(CNCP-2016)在中国科学院大连化学物理研究所盛大召开。(相关新闻：第四届中国计算蛋白质组学研讨会(CNCP-2016)在大连开幕)。本届研讨会邀请了26个大会报告，报告嘉宾是来自国内外的计算蛋白组学领域专家和奋战在第一线的青年科研工作者，嘉宾中的绝大多数是首次登上CNCP讲坛。报名参加本届会议的人员首次超过了200人。CNCP2016C参会代表合影张丽华研究员为研讨会致开幕辞　　本届会议的开幕式只有简短的5分钟，没有领导讲话，没有任何仪式，充分体现了会议的简洁办会特色。开幕式由中国科学院大连化学物理研究所的张丽华研究员致欢迎词，她提到：“中国计算蛋白质组学研讨会在业界享有很高盛誉。每次会议的演讲嘉宾都是由会议发起者和主办方——中国科学院计算技术研究所贺思敏研究员、北京蛋白质组研究中心徐平研究员、北京生命科学研究所董梦秋研究员等资深学者以及往届会议报告人鼎力推荐的。本次研讨会的26个报告将由来自国内外相关领域的顶级专家和奋战在科研第一线的青年才俊精彩呈现。相信在这两天的会议中，大家不仅能够收获知识，也能收获友谊。”研讨现场　　CNCP-2016会议邀请的26个报告多数都是最近一两年的研究成果，部分还没有发表，新技术频繁现身，特别是在交联质谱技术与蛋白质复合体，蛋白质相互作用、翻译后修饰技术、蛋白质鉴定数据处理、定量蛋白质组技术等领域报告较多，下面对这26个报告的内容逐一进行简介总结。　　UCI(美国加利福尼亚大学尔湾分校)黄岚博士 报告题目《Developing Cross-Linking Mass Spectrometry (XL-MS) Strategies to Define Interaction and Structural Dynamics of Protein Complexes》　　了解蛋白质复合物的相互作用和结构动力学对于揭示病理的分子学细节非常有帮助。交联质谱(XL-MS) 是目前研究大量多亚基蛋白复合物PPIs的重要技术，而精确的肽段鉴别是XL-MS分析一直以来面临的挑战。为了促进这方面的研究，黄岚博士研究组研发了DSSO 及一系列含亚砜(sulfoxide-containing)可分裂质谱交联剂以揭示蛋白质复合物表面相互作用机理。研究者通过这些(MS-cleavable reagents)质谱可分裂试剂在多级串联质谱上建立了实用的XL-MS工作流，快速、准确的鉴别交联肽段去研究体内和体外的PPIs。同时，研究者也研发了新的定量XL-MS途径，用以分析多种生理条件下蛋白质间的相互作用和蛋白质复合体的结构动态变化。据介绍，该课题组最近研发了新的羧基交联剂DHSO主要用来与酸性氨基酸反应，反应中需要DMTMM共同作用。 这样可以得到更广的蛋白相互作用信息。北京生命科学研究所 谭丹博士 报告题目《Trifunctional Cross-Linker for Mapping Protein-Protein Interaction Networks and Comparing Protein Conformational States》　　该研究组最近有一项研究工作围绕一种含生物素标签的赖氨酸富集交剂Leiker，谭丹博士在报告中详细展示了课题组的相关研究，研究表明Leiker能够有效改进蛋白质化学交联质谱技术(CXMS)。研究组将以Leiker为交联剂的CXMS用于E.coli全细胞裂解液的分析，发现了3656种相互作用，是之前已有研究方法的10倍。Leiker CXMS比BS3得到的信息要立体很多，能得到更全面的蛋白质相互作用网络。研究者还将Leiker为基础的CXMS用于RNA结合位点鉴定与定量，该方法能够深入揭示蛋白质构象变化。在将Leiker CXMS用于大肠杆菌和秀丽线虫裂解液中的研究中，分别鉴定出3130和893个互补赖氨酸对，并各自发现了677和121种PPIs。Utrecht University (荷兰乌德勒支大学) 刘凡博士 报告题目《Charting the Cellular Interactome by Proteome-Wide Cross-Linking Mass Spectrometry》　　据刘凡博士介绍，针对交联数据分析的n-square和交联肽段低效裂解这两大难题，该研究组建立了一种新XL-MS工作流-质谱可分裂交联剂法。该法是一种混合MS2-MS3裂解途径与专用的交联搜索数据库结合的方法。研究者将质谱裂解交联剂DSSO应用于测定每个交联肽段的前体质量，解决了n-square问题。交联裂解前体离子可通过质量差异确定数据的MS3采集方向，这些工作都可以在Oribitrap Fusion 和 Lumos Tribrid质谱上完成。这种采集途径提高了MS3实验的成功率，能够解决低效裂解问题和显著改善数据质量。与先前方法相比，报告中介绍的新方法包含以下三个优势。1)能够完成整体蛋白组数据库的交联鉴别 2)包括多种翻译后修饰的交联鉴别 3)在MS2和 MS3水平都有高质量范围。该研究组将此新XL-MS方法用于多种复杂样本，包括大肠杆菌裂解物、HeLa裂解物、排阻色谱分馏的HeLa细胞核提取物与细胞器。采用这种方法能够从每种样本得到成千上万个交联点。中国科学院计算技术研究所 刘超博士 报告题目《Development of the Cross-Linked Peptides Identificationin Large Scales》　　由于检索空间过于庞大，蛋白组范围内交联肽段(双肽)的鉴定一直都是一项挑战。刘超博士和其团队考察了用于大范围交联肽段鉴定的普通搜索工具的应用效果，并开发了一种新的计算软件技术pLink 2.0。此技术比先前技术有三方面的改进：1)提高了双肽中单同位素鉴定的精度 2)由肽段索引升级为离子索引 3)引入机器学习(SVM在线训练)。该团队研究表明，通过使用离子索引pLink2.0检索人类数据库，在一小时以内可以完成5000张谱图的检索。干湿结合方法在人库检索1万张二级谱图仅用时不到2分钟。将pLink 2.0与美国西雅图研究人员研发的Kojak相比较，pLink2.0的分析速度约为Kojak的6倍，在精度方面也有一定优势。pLink2.0支持可碎裂交联，可减少可搜索空间和减少谱图数目。华中师范大学 万翠红博士 报告题目《Mapping Conserved Metazoan Protein Complexes with Biochemical Fractionationand LC/MS/MS》　　对多蛋白复合物的了解对于生理进程探索非常重要。然而，对多蛋白复合物种类的分布特别是大规模网状图的发现比较困难。万翠红博士研究组通过高分辨生化分离与定量质谱直接分析了可溶性多蛋白复合物的组成，分析C.elegans、D.melanogaster、M.musculus、S.purpuratus和人类的可溶性细胞提取物。研究组采用以人类为中心的综合计算分析，鉴别出2153种蛋白，并新鉴定出7699种成对相互作用和981种共复合作用。这些相互作用能够反映后生动物生理过程相关的核心生理基础。重建的生理作用网有助于深入了解特殊的分子生物机理以及动物细胞的进化。国家蛋白质科学中心 郑勇博士 报告题目《Scaffold Protein-Mediated Dynamic Assembly of Protein Complexes in Normal and Cancer Cells》　　很多细胞表面受体通过催化多组分蛋白复合物的形成开始信号传导过程。这个过程通过与受体结合的scaffold蛋白来传导。然而，目前这种scaffold的生物学基本原理仍不明晰。针对这个问题，郑勇博士研究组通过以IP-MRM为基础的方法，根据Shc1复合信号跟踪其空间和实时变化。研究人员进一步将这种方法与生化和基因技术结合，研究组发现Shc1以特殊的方式对EGF有即时的反应，包括明显的磷酸化和蛋白质相互作用。研究人员成功发现Shc1与一种抑制蛋白产生相互作用，是一种快速绑定蛋白基团能够激活促有丝分裂/存活通路，蛋白复合物围绕Shc1的装配变化在细胞间非常显著。对EGFR/Shc1复合物蛋白组分析能为以pTyr为基础的致肿瘤信号导致的乳腺癌提供诊断依据。暨南大学 张弓博士 报告题目《High-Throughput De Novo Proteome Identification Aided by Translatome Sequencing》　　De novo肽段序列鉴定能够避免依赖数据库的检索法的缺点，但由于由于没有背景库，无法评估FDR，且极易受到干扰信号误导，因此长期以来无法应用于复杂样品的大规模鉴定。张弓教授介绍了研究团队研发的利用翻译组测序数据作为蛋白质de novo鉴定质量控制新方法，使肽段de novo鉴定能首次应用在蛋白质组复杂样品的实用化鉴定。研究人员在HCD质谱上应用此方法检测三种肝癌细胞(Hep3B, MHCC97H, MHCCLM3)，单次实验鉴定出12000-13000种蛋白质，其灵敏度几乎达到了翻译组测序的水平 而用6种搜库软件鉴定到的真阳性蛋白并集也才7000-8000种。只能用新策略鉴定的4000余蛋白中随机挑选几十个进行MRM验证，几乎都能验证成功。这证明翻译组指导的de novo鉴定效能很高，能鉴定到大量搜索库法无法鉴定到的肽段和蛋白。De novo鉴定的大规模化可引致一系列新的蛋白质组应用。上海生命科学院　李辰博士 报告题目《De Novo Identification and Quantification of Single Amino-Acid Variants in Human Hepatocellular Carcinoma Tissues》　　肿瘤蛋白质组-基因组学研究非常关注变异的发现。单核苷酸的多变性(SNPs) 数据库能够给单个氨基酸变体(SAVs)的检测提供依据。李辰博士在报告中介绍了一种在蛋白组水平发现SAVs的新方法。该法基于de novo算法，肽段的可能候选者可被鉴别并与理论蛋白数据库比较。在人类肝癌(HCC)组织中，研究者成功的应用此方法鉴别和定量已知和新的突变蛋白。在肝组织当中，在细胞核内的突变比较低，突变在内质网和线粒体的富集比例较高。这种新方法为病人提供了高通量的定制检测途径，可能为潜在临床生物标志物发现和机理研究提供帮助。中山大学 肖传乐博士 报告题目《Improving Peptide Identification for Tandem Mass Spectrometry by Incorporating Translatomics Informatio》　　目前很多数据库检索方法是利用谱学数据而忽略能用于肽段鉴定的生物系统的其他信息。最近，转录物组RNA-seq的界面信息能提高肽段鉴别的灵敏度已经证实。与转录物组信息相比，翻译物组体现出与蛋白质的关系更为紧密，所以其可能对肽段鉴别更有效。在此报告中，肖传乐博士介绍了该研究组设计的高灵敏度肽段鉴定手段IPomics，其以翻译组学信息为主要蛋白鉴定参考。方法得到的推荐蛋白质优先性整合进了新的评分功能。与Mascot和pFind相比，IPomics方法蛋白质鉴定准确度更高，并能够增加整体肽段的鉴定率、谱学信息利用率，并已经利用LC-MS/MS数据集在人类和小鼠蛋白鉴定取得了显著效果。华大基因(BGI-Shenzhen) 闻博 报告题目《Protein Identification and Quantification based on Multiple Search Engines》　　闻博在报告中介绍了团队有关以多搜索引擎为基础的蛋白鉴定和定量软件的研究进展。目前，串联质谱技术产生的质谱数据解析率往往不高，不同蛋白质鉴定软件由于谱图预处理、打分算法不同等原因导致对同一个数据的解析结果往往存在一定的互补性。虽然有一些开源的软件可以通过精巧的运算将多个鉴定引擎的鉴定结果整合起来取得与单引擎相比更好的鉴定效果，但由于操作往往较为复杂、下游软件比较缺乏等原因，故没有在蛋白鉴定与定量中推广开来。为了促进多引擎整合方法在蛋白鉴定和定量中的应用，该研究组研发了一种多引擎综合鉴定的开源软件IPeak和同重同位素(如iTRAQ、TMT)标记定量软件IQuant，并将IQuant升级到IQuant2。IQuant2采用精妙的算法和mzIdentML标准，整合多引擎搜索结果进行蛋白质定量。在分析水稻蛋白样品(用Q-Exactive分析)和人细胞系蛋白(用TripleTOF 5600分析)样本时，与单个引擎定量结果相比，IQuant2定量的蛋白能提高28.8%，检测的差异蛋白数量能提高多大40%。多引擎搜索不但能够提高蛋白鉴定效果，也能提高蛋白定量效果。中国科学院水生生物研究所 葛峰博士 报告题目《GAPP: a Proteogenomic Software for Genome Annotation and Global Profiling of Posttranslational Modifications in Prokaryotes》　　葛峰博士在前期蓝细菌的蛋白基因组学研究工作的基础上，开发了一种用于原核生物的基因组注释和翻译后修饰全局发现的蛋白基因组分析软件GAPP。该软件最大的特点就是简单高效，具备初步生物信息学知识的研究者就能应用该软件进行原核生物的蛋白基因组数据的深度分析，利用该软件可以高效完成原核生物的全蛋白质组解析和翻译后修饰的全局发现的工作，该软件的开发和应用将有助于原核生物的基因组的精准鉴定，并有望成为原核生物基因组注释的一项标准流程。今后研究组还将根据用户的要求和体验继续对该软件进一步升级。复旦大学 周峰博士 报告题目《Genome-Wide Quantitative Proteomic and Transcriptomic Analysis Reveals Post-Transcriptional Regulation of Mitochondrial Biogenesis in Human Hematopoiesis》　　蛋白质组学样品分析需要高分辨分离平台，周峰博士研究组搭建了一种长色谱柱三维蛋白组学定量分析平台(GWPQ), 整套系统完全在线和实现操作自动化。研究者将在此平台建立的蛋白质组学方法与Ribosome profiling相比较，水平相当，在分析模型样品时有80%的重叠。研究者还用此方法开展了人体造血相关细胞的研究，二代测序与应用该平台的蛋白质组方法重叠率达到92%。研究团队利用此方法比较了人体最重要的造血干细胞和红细胞发育中14502个基因蛋白表达变化和17127个基因mRNA表达变化。mTORC1信号极大的促进了红细胞进化中线粒体蛋白的翻译，线粒体和mTORC1的遗传和药理学干扰削弱了体内和体外的红细胞生成。该研究支持了线粒体理论机理，可能与线粒体疾病和老化相关的血液缺陷有关。研究者用模式生物小鼠实验验证了线粒体在血红细胞发育中起到关键作用，找到了全新控制血红细胞发育的通路。Johns Hopkins University(美国约翰霍普金斯大学) 张会博士 报告题目《Comprehensive Analyses of Glycoproteins》　　已有不少实验证明，糖蛋白的变化与很多疾病相关。张会博士介绍了糖蛋白的生物合成、结构和功能以及分析糖蛋白的最新方法。糖蛋白的分析是蛋白质分析中最复杂的一种。研究者常把糖和蛋白分开分析，如已有的SPEG(固相提取糖基位点肽)法。该研究组建立了N-糖蛋白数据库，该库可用于检索已鉴定蛋白、通过精确质量数检索候选肽段、鉴定糖蛋白源等。该研究组最近还建立了分析N-linked糖链，糖基化位点，糖基化位点特异糖链，及O-linked糖链分析方法和软件，并探索了用糖基化酶推测多糖的方法。中国科学院大连化学物理研究所 于龙博士 报告题目《Isolation and Structural Analysisof N-Linked Glycansby Using Two-dimensional Chromatography, Mass Spectrometry and Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy》　　糖蛋白糖链的纯化合物对糖链的结构分析、精准检测以及功能研究都具有十分重要的意义。然而，目前糖链纯化合物仍处于严重匮乏的状态。来自大连化物所的于龙博士介绍了该团队根据自身优势，采用纯化制备方法来获取N-糖链纯化合物并对其结构进行解析的相关研究进展。研究者首先介绍了糖链的结构特点并对其分离分析中存在的难点问题进行了阐述。针对这些难点问题，研究者结合课题组的材料优势，构建了以二维亲水作用色谱分离体系为核心的糖链纯化制备流程，该流程包括糖蛋白糖链的释放、富集、二维分离、质谱表征以及核磁结构分析等技术单元。在二维色谱分离体系中，第一维度主要根据糖链的羟基数量而实现不同聚合度糖链的分离，第二维度主要用于同分异构体的分离。由于串联质谱技术并不能得到糖链准确的结构信息，因此，研究者目前正在探索核磁共振技术进行准确结构的分析。以现有的糖链纯化合物为基础，研究者接下来将分别在功能、结构和定量三方面开展相关研究以拓展糖链样品库的应用。青岛大学 李磊博士 报告题目《Ultra-Deep Tyrosine Phosphoproteomics Enabled by a Phosphotyrosine Superbinder》　　酪氨酸磷酸化网络应用在蛋白组学中不容忽视，如何找到pY尤为重要,但之前方法需要大量抗体才能富集pY。为解决业内这一问题，李磊博士研究组做了不少相关研究，团队研发的Superbinder(超亲体)易于制备，能够有效减轻实验室经济负担。研究者合成了pTyr1和pTyr2两个肽段，比较了SH2 superbinder法与其他几种方法的效果，又增加了Ti4+IMAX的去噪功能，证明其能有效富集pY。与抗体相比，src和grb2超亲体都能有效发现更多pTyr位点。研究者还应用superbinder富集方法进行了Tyr 磷酸化蛋白组学研究。如探索人细胞磷酸化蛋白不同功能分类和Tyrosine kinase (TK)的生物活性等。该项研究是与中科院大连化学物理研究所邹汉法团队、加拿大西安大略大学李顺成团队多方合作完成的。University of Minnesota (美国明尼苏达大学) 陈悦博士 报告题目《Discovery and Characterization of Short-chain Lysine Acylations with Mass Spectrometry and Quantitative Proteomics》　　赖氨酸是细胞内蛋白质翻译后修饰的重要靶点。最近，除了赖氨酸乙酰化以外还有一些短链酰基化修饰逐渐被发现。在陈悦博士的早期研究工作中，他从细致的质谱分析中发现了组蛋白赖氨酸丙酰化和丁酰化，两种新的短链酰基化修饰。进一步的研究表明，这两类短链酰基化修饰都是广泛存在的，并可以被特定的酶所调控。最近最新的研究表明赖氨酸丁酰化在Bromo domain识别和精子发育过程中起到重要的调控作用。为了进一步探索质谱信息中隐藏的其他新的修饰，研究者设计了PTMap软件,用来分析非限定性搜索，得到了一些可靠的新蛋白质修饰鉴定，包括琥珀酰化，巴豆酰化，羟基丁酰化等。在定量研究方面，该团队比较关心蛋白质修饰丰度，因为普遍使用的相对定量的分析方法对解释蛋白质修饰的生物学意义有一定的局限性，但是质谱分析得到的离子峰强度并不能直接比较来计算蛋白质修饰的丰度。研究者针对此问题开发了稳定同位素标记为主的新的蛋白质修饰丰度定量方法，可以直接比较离子峰强度，通缩计算得到每个位点上赖氨酸位点丰度，准确性和重现性都很好。中国科学院昆明动物研究所 赖仞博士 报告题目《Mite Allergen Diversity Identification by Proteomics Coupling with Pharmacological Testing》　　螨虫、马蜂、牛虻和蟑螂等带有很多种过敏原，一些过敏甚至会导致死亡。过敏的标准治疗方式就是利用过敏原进行脱敏治疗，现在很多机构希望把过敏原纯化出来进行过敏治疗，因此对过敏原发现和提取纯化都有更多要求。屋尘螨(HDM) 是最常见的室内过敏原。赖仞博士希望结合蛋白质组学、药理和病理学手段来进行过敏原的多样性研究。过敏原蛋白组学研究一般是将分离提取出的过敏原与病人血清进行IgE反应。赖仞研究组将蛋白组学技术和二维免疫印迹法结合，从粉尘螨提取物中鉴定出分属于12个组群的17种过敏原，由Edman降解、质谱分析和cDNA克隆等技术鉴定出其一级结构。通过酶联免疫吸附试验抑制测试、免疫印迹、粒细胞活化试验、皮肤点刺试验测定，该研究组发现了8种新的尘螨过敏原。中国医学科学院基础医学研究所 邵晨博士 报告题目《Opportunities and Challenges for Urinary Biomarker Discovery Using Proteomic Approaches》　　邵晨博士对业内目前围绕尿蛋白质组生物标志物的发现研究进展进行了综述。据介绍，现在很多科研和医疗开始倾向于做尿液，因其具有易得性和稳定性，且含有丰富蛋白信息。邵晨博士研究组曾通过二维液相与串联质谱鉴定做了一些尿中蛋白质组的研究，尿液蛋白质组可以包括其他体液70%的蛋白质。研究组也通过3DLC-MS/MS鉴定出尿液中的6400多种蛋白，并发现与尿蛋白重合率最高的是脑组织中的高表达蛋白。尿蛋白能够反映很多远端的变化，如帕金森症和脑肿瘤等脑部疾病。在肾脏病中，肾小球损伤病人的肾小球会失去过滤功能而造成尿蛋白显著上升。目前很多研究发现尿蛋白中的生物标记物与一些疾病相关，主要集中在泌尿系统疾病的发现，如膀胱癌和急性肾损伤的标志物已获FDA批准，也有在消化系统疾病、肿瘤等疾病中的相关发现。其中，肺癌的研究比较成熟且已进入临床阶段。

布鲁克在第64届美国质谱年会(ASMS 2016)宣布推出布鲁克HDX Solution —氢氘交换解决方案。BHDX解决方案将LEAP H/D-X PAL自动样品处理系统与布鲁克maXis II ETD UHR-QTOF质谱系统以及HDExaminer软件相结合，提供了一套自动可靠的HDX-MS工作流。Bruker HDX解决方案通过H/D比值获得单一同位素精确定量分析结果，为深入了解生物分子结构提供可靠依据。　　这些年来，生物制药表征分析需要对生物蛋白的空间构象有更加深入的了解，还要了解多种因素如pH值、温度和压力等对蛋白的影响。对于这一挑战，HDX-MS已经成为了一种有价值的分析技术。生物制药分析方法需要运用强大的分析统计工具，自动化的提供高质量数据。HDX-MS已成为生物制药领域的常规而可靠的分析方法。　　关键结构的鉴定、药物/蛋白的解析以及蛋白之间相互作用、蛋白质构象变化等是目前生物治疗发展过程中面临的关键问题。Bruker HDX解决方案使得液相分离和MS/MS检测自动化，简化数据分析和解析工作，并能获得可靠的蛋白结构解析结果。　　布鲁克道尔顿生物制药副总裁Bob Galvin博士评论说：“最新Bruker HDX解决方案的推出，进一步加强了布鲁克生物表征产品系列，使得生物制药领域的研究者能够更快、更准确的深入了解到蛋白质构象和相互作用。”关于HDX解决方案　　Bruker HDX解决方案提供了完整的工作流程，将LEAP H / DX PAL自动进样器应用于预定标记实验，并结合了UHPLC系统与高分辨质谱系统。maXis II ETD UHR-QTOF质谱系统的质量准确度达到ppm级以下，高灵敏度与同位素保真度提高了系统获取准确H/D比值的能力。再加上HDX-MS解析软件Sierra Analytics HDExaminer的应用，创造了更大的应用空间与简便的应用环境。LEAP H / DX PAL自动进样器与maXis II ETD UHR-QTOF质谱系统　　在市场处于领先的超高质量分辨率QTOF质谱与ETD(电子转移解离)能力结合，开创了布鲁克maXis II系统HDX-MS实验的新纪元。比起在肽段水平的研究，在更微量水平的探索能更容易的提供特异性识别位点。LEAP H/D-X PAL自动进样设备将稳健可靠的样品处理整合到布鲁克HDX 解决方案。革新的时间安排软件能够自动安排样品处理步骤，包括贴标签、培养、消化和灭活等，提高LC的效率与整个实验室效率。　　用HDExaminer软件获得的信息可用于研究在干扰状态下蛋白质的构象变化。通过数据输出，有关这些变化的数据信息可被容易的可视化，也可通过导入如PyMol的晶体结构可视化程序更深入的了解这些变化。　　海德堡大学分子生物学中心的Matthias P. Mayer教授表示：“通过布鲁克HDX解决方案，我们能够以高精度、高重复性和最小的动手时间测量氢交换反应动力学。系统的自动安排软件帮助我们充分利用仪器使用时间，从而提高我们的实验室效率”编译：郭浩楠

p style=" text-indent: 2em " RedShift& #8482 BioAnalytics公司推出了一款新型蛋白质表征平台——AQS3& reg PRO，这一平台结合了强大的、高度集成的自动化生物分析软件，为生物医疗行业带来了高灵敏度的光谱分析。 /p p style=" text-indent: 2em " 用户通过这一平台可以观察浓度范围在0.1至200 mg/mL的蛋白质二级结构变化，并能进行集成性、可量化、稳定的结构检测和相似性检测，为用药的安全性和有效性提供重要支撑。它能够提供多种属性的测量，减少甚至消除了使用不同工具进行各种单一属性测量的需要。此外，AQS3pro还具有先进的自动化多样本分析功能，大大简化了生物医疗产业的分析工作流程。 /p p style=" text-indent: 2em " RedShift& #8482 BioAnalytics公司的首席技术官Eugene Ma表示：“ AQS3prois是生物物理表征领域的一项重大进展——将红外光谱应用在生物医疗领域的诊断分析上。这一平台是我们内部一流研发团队与大量行业专家、学术专家倾力合作的结晶。其检测的准确性、重复性和重现性已在数百个样本中得到验证，这些样本包含有数千种尺寸量度的蛋白质。有力的数据支撑和合作伙伴的热情增强了我们对AQS3Pro的信心，我们相信这一成果具有相当大的产业化价值。” /p p style=" text-indent: 2em " AQS3Pro新系统使用了RedShift& #8482 BioAnalytics公司的微流控调制光谱学（MMS）专利技术，这一技术将针对微流体的中红外激光光谱分析与先进的信号处理相结合，对蛋白质的二级结构进行测量。它能够在0.01至200mg/mL的浓度范围内对蛋白质直接进行无需标记的测量，在生物医药研发和制造过程经常遇到的各种条件下，无需样品稀释，就可以进行样品表征。其检测是高度自动化的，其多样品检测功能、便捷化操作设置和最先进的生物分析软件进一步提升了检测流程的效率。创新而灵活的分析套件也使得光谱数据的常规分析高度自动化，其先进的检测分析工具能够方便地获得样品的结构性变化，并对这些变化的影响进行深入分析。 /p p style=" text-indent: 2em " “我与RedShift& #8482 BioAnalytics一直在AQS3PRO的验证性测试中合作。”美国特拉华大学的Christopher Roberts教授说， “这一平台将MMS和红外光谱应用在蛋白质溶液的分析中，让我们能够对多种样本、多种浓度范围蛋白质的二次结构性变化，进行同时的原位量化测量。无论是对从事蛋白质基础性研究的科学家，还是负责生物产品开发的工程师，AQS3PRO都将带来极大的助益。” /p

近期，浙江大学化学系方群教授团队在国际权威期刊《Nature Communications》上发表了题为“Pick-up single-cell proteomic analysis for quantifying up to 3000 proteins in a Mammalian cell”的研究成果，创新性地提出了PiSPA（Pick-up Single-cell Proteomic Analysis）技术用于单细胞蛋白组分析。该工作流程利用纳升级微流控液滴操控机器人，可以实现单细胞精准捕获、样本前处理以及自动进样，利用布鲁克tims TOF Pro质谱仪在单个哺乳动物细胞内实现了超过3000种蛋白的定量深度。作者通过此项技术对三种不同的哺乳动物细胞（HeLa、A549和U2OS细胞）进行单细胞蛋白质组学研究，以及研究了HeLa细胞在迁移过程中的细胞异质性，均展现了超高的定量分析深度。PiSPA平台的单细胞捕获过程是基于SODA（Sequential Operation Droplet Array）技术开发的微流控液体处理系统，可在“点取式”操作模式下实现自动化纳升级单细胞分选，并且能够基于细胞的明场形态特征或是标记的荧光信号灵活地选择单细胞，具有很高的捕获成功率和指向性。此外，研究人员将商品化的锥形底部内插管改造成阵列化的纳升级微反应器，兼容后续的液相色谱自动进样，可大大提高整个工作流程的可操作性、可靠性和成功率。PiSPA平台可自动完成单细胞捕获、样品前处理、色谱分离、质谱检测等一系列操作，最大程度降低样品的损失。研究人员利用PiSPA工作流程，对多种哺乳动物单细胞实现了深度覆盖的定量分析。采用优化的胰蛋白酶/蛋白比例和色谱梯度，分别通过DDA和DIA扫描模式对A549、HeLa和U2OS三种细胞进行单细胞蛋白组分析，所有质谱数据均使用布鲁克4D蛋白质组学平台——timsTOF Pro进行采集。布鲁克独特的捕集离子淌度技术（TIMS）带了额外一维离子淌度信息，可大大降低样品分析复杂度，极大提高峰容量和分析物鉴定可靠性，最新一代平行累积连续碎裂技术（PASEF® ）可以实现极高的二级扫描速度和灵敏度，只需要很少量样本就可以达到组学鉴定新深度。在本研究中，timsTOF Pro更是展示了探索单细胞蛋白质组学的能力，在DIA扫描模式下，利用DIA-NN（MBR算法）进行library-free数据检索，可在A549、HeLa和U2OS三种细胞的单细胞样本中，分别平均定量到3008、2926和2259种蛋白质，展现了PiSPA平台在单细胞蛋白组定量分析中的覆盖深度；此外，有2869、2772和1889种蛋白质在至少80%的A549、HeLa和U2OS单细胞样本中被重复定量到，说明了PiSPA平台有很高的重复性和可靠性。为了证明PiSPA平台的实际应用价值，研究人员分析了迁移过程中HeLa单细胞的蛋白质组表达情况。通过细胞划痕实验，选取有明显迁移（n=46）和未发生迁移（n=43）的HeLa单细胞进行定量分析。采用DIA扫描模式，分别平均鉴定到了2544和2893种蛋白质，后续生物信息学分析发现Cdc42、Rac1和RhoA等蛋白在发生迁移的HeLa细胞中发生显著上调，揭示了迁移过程中的焦点粘附和肌动蛋白骨架调节通路发生激活，说明了PiSPA可以作为细胞迁移研究和抗癌药物靶点研究的有效工具。PiSPA工作流程包含了高精度的液体操控、单细胞的精确前处理，结合布鲁克先进的液相色谱-捕集离子淌度谱-四极杆飞行时间质谱仪（LC-TIMS-QTOF MS）进行蛋白质组分析，突破了传统质谱分析在单细胞蛋白组研究领域的技术瓶颈，实现在单个哺乳动物细胞中定量超过3000种蛋白，重新定义了单细胞蛋白质组学分析。这项成果也再次向我们证明了单细胞蛋白质组学在疾病诊断和预防、药物开发、癌症基因组学等精准医学研究中的应用潜力。参考文献：1. Wang Y, Guan ZY, Shi SW, et al. Pick-up single-cell proteomic analysis for quantifying up to 3000 proteins in a Mammaliancell. Nat Commun. 2024 15(1):1279.2. Meier F, Brunner AD, Koch S, et al. Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Mol Cell Proteomics. 2018 17(12):2534-2545.3. Meier F, Brunner AD, Frank M, et al. diaPASEF: parallel accumulation-serial fragmentation combined with data-independent acquisition. Nat Methods. 2020 17(12):1229-1236.

2013年9月5日，中国上海&mdash &mdash 科学服务领域的世界领导者赛默飞世尔科技（以下简称:赛默飞）宣布将参加于2013年9月7日至10日在重庆举办的第八届中国蛋白质组学大会，并成为铂金级赞助商，这代表了赛默飞对该领域不断提升的重视程度。赛默飞将携几款最新产品出席本届大会，并着重展示在蛋白质组学研究领域的完整解决方案和领先技术。基于在分析测试领域的丰富经验和雄厚实力，赛默飞将始终致力于推动蛋白质组学研究的发展，促进人类健康事业蓬勃发展。 随着人类基因组计划的完成和功能基因组时代的到来，蛋白质结构与功能研究变得日趋重要。本届大会以&ldquo 人类蛋白质组计划：让人类更健康&rdquo 为主题，计划为生物化学与分子生物学、蛋白质组学等研究领域相关的仪器、设备、试剂和新技术提供绝佳的展示平台。 作为分析检测领域的领军者，赛默飞始终密切关注蛋白质组学、生物信息学等相关学科的动态与发展，并积极为蛋白质组学研究提供全球领先的整体解决方案，包括化学试剂、高效分离产品、色谱质谱技术、以及蛋白质组学数据处理软件产品等。借助此次蛋白质组学大会契机，赛默飞将展示Orbitrap Fusion Tribrid 液相色谱质谱仪、TSQ Quantiva三重四极杆质谱仪和TSQ Endura三重四极杆质谱仪等明星产品，旨在帮助该领域的研究人员大幅提高研究效率，助力应对蛋白质组学研究面临的挑战。 Orbitrap Fusion Tribrid 液相色谱质谱仪集成三种质量分析器：四极杆、Orbitrap和线性离子阱，为复杂生物样品提供无可比拟的分析深度。四极杆用于母离子选择，分辨率最高达0.4 amu，具有出色的灵敏度和选择性。超高场Orbitrap拥有超过450,000的分辨率和15 Hz的扫描速率，以及无法逾越的分析选择性和速度。而多极杆离子回旋通道及双压线性离子阱则提供 MSn HCD、CID和ETD裂解，同步的母离子选择增强仪器信噪比。 TSQ Quantiva三重四极杆质谱仪利用主动离子管控技术(Active Ion Management) 优化离子生成及从离子源至检测器的传输，最终获得极限灵敏度。与市场上最高端的三重四级杆质谱相比，灵敏度的提高改善了诸如肽段定量、复杂生物样本分析等应用领域的结果。 TSQ Endura三重四极杆质谱仪拥有TSQ Quantiva MS的多项先进技术，与同类其他竞争仪器相比具有更长运行时间。其设计用于痕量水平定量，如食品检验、环境分析和DMPK等应用领域。 Pierce G2 Fast Blotter 转印系统将高性能与高速度相结合，能实现分子量为10-300 kDa 的蛋白质从凝胶到印迹膜的快速、高效转移。 仅需5至10 分钟，且转印前无需对凝胶进行平衡处理。可兼容不同品牌的预制 SDS-PAGE 凝胶和常规自制凝胶。 MYECL Imager 成像系统只需轻轻一点便可完成化学发光、凝胶成像。同时还兼具强大的文件管理系统，令人惊叹的高灵敏度，简单、快捷、直观、轻便、小巧。 F1-ClipTip移液系统采用舒适的人体工效学设计，移液器重量显著减轻，120° 可旋转舒适靠指，拥有专利设计超强吹出以及轻触吸头推杆，量程锁定设计。 更多关于赛默飞参加第八届中国蛋白质组学大会的信息，请点击：活动专题网页 http://www.thermo.com.cn/CNHUPO2013 关于中国蛋白质组学大会 中国蛋白质组学大会由中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业委员会(CNHUPO)主办，军事医学科学院放射与辐射医学研究所、重庆医科大学、蛋白质组学国家重点实验室、北京蛋白质组研究中心共同承办，旨在积极促进蛋白质组学的研究与发展，增进国际间合作与交流。大会至今已经成功举办了七届，邀请众多国际蛋白质组领域杰出科学家出席，汇聚国内蛋白质组和功能基因组学研究领域的著名科学家和研究团队。 关于赛默飞世尔科技 赛默飞世尔科技（纽约证交所代码： TMO）是科学服务领域的世界领导者。我们的使命是帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。公司年销售额130亿美元，员工约39,000人。主要客户类型包括：医药和生物技术公司、医院和临床诊断实验室、大学、科研院所和政府机构，以及环境与过程控制行业。借助于Thermo Scientific、Fisher Scientific和Unity&trade Lab Services三个首要品牌，我们将创新技术、便捷采购方案和实验室运营管理的整体解决方案相结合，为客户、股东和员工创造价值。我们的产品和服务帮助客户解决在分析领域所遇到的复杂问题与挑战，促进医疗诊断发展、提高实验室生产力。欲了解更多信息，请浏览公司网站：www.thermofisher.com 关于赛默飞世尔科技中国 赛默飞世尔科技进入中国发展已有30多年，在中国的总部设于上海，并在北京、广州、香港、台湾、成都、沈阳、西安、南京、武汉等地设立了分公司，员工人数超过2400名。我们的产品主要包括分析仪器、实验室设备、试剂、耗材和软件等，提供实验室综合解决方案，为各行各业的客户服务。为了满足中国市场的需求，现有5家工厂分别在上海、北京和苏州运营。我们在北京和上海共设立了5个应用开发中心，将世界级的前沿技术和产品带给国内客户，并提供应用开发与培训等多项服务；位于上海的中国创新中心结合国内市场的需求和国外先进技术，研发适合中国的技术和产品；我们拥有遍布全国的维修服务网点和特别成立的中国技术培训团队，在全国有超过400 名经过培训认证的、具有专业资格的工程师提供售后服务。我们致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。欲了解更多信息，请登录网站：www.thermofisher.cn

2013年9月5日，中国上海 &mdash &mdash 科学服务领域的世界领导者赛默飞世尔科技(以下简称:赛默飞)宣布将参加于2013年9月7日至10日在重庆举办的第八届中国蛋白质组学大会，并成为铂金级赞助商，这代表了赛默飞对该领域不断提升的重视程度。赛默飞将携几款最新产品出席本届大会，并着重展示在蛋白质组学研究领域的完整解决方案和领先技术。基于在分析测试领域的丰富经验和雄厚实力，赛默飞将始终致力于推动蛋白质组学研究的发展，促进人类健康事业蓬勃发展。 　　随着人类基因组计划的完成和功能基因组时代的到来，蛋白质结构与功能研究变得日趋重要。本届大会以&ldquo 人类蛋白质组计划：让人类更健康&rdquo 为主题，计划为生物化学与分子生物学、蛋白质组学等研究领域相关的仪器、设备、试剂和新技术提供绝佳的展示平台。 　　作为分析检测领域的领军者，赛默飞始终密切关注蛋白质组学、生物信息学等相关学科的动态与发展，并积极为蛋白质组学研究提供全球领先的整体解决方案，包括化学试剂、高效分离产品、色谱质谱技术、以及蛋白质组学数据处理软件产品等。借助此次蛋白质组学大会契机，赛默飞将展示Orbitrap Fusion Tribrid 液相色谱质谱仪、TSQ Quantiva三重四极杆质谱仪和TSQ Endura三重四极杆质谱仪等明星产品，旨在帮助该领域的研究人员大幅提高研究效率，助力应对蛋白质组学研究面临的挑战。 　　Orbitrap Fusion Tribrid 液相色谱质谱仪集成三种质量分析器：四极杆、Orbitrap和线性离子阱，为复杂生物样品提供无可比拟的分析深度。四极杆用于母离子选择，分辨率最高达0.4 amu，具有出色的灵敏度和选择性。超高场Orbitrap拥有超过450,000的分辨率和15 Hz的扫描速率，以及无法逾越的分析选择性和速度。而多极杆离子回旋通道及双压线性离子阱则提供 MSn HCD、CID和ETD裂解，同步的母离子选择增强仪器信噪比。 　　TSQ Quantiva三重四极杆质谱仪利用主动离子管控技术(Active Ion Management) 优化离子生成及从离子源至检测器的传输，最终获得极限灵敏度。与市场上最高端的三重四级杆质谱相比，灵敏度的提高改善了诸如肽段定量、复杂生物样本分析等应用领域的结果。 　　TSQ Endura三重四极杆质谱仪拥有TSQ Quantiva MS的多项先进技术，与同类其他竞争仪器相比具有更长运行时间。其设计用于痕量水平定量，如食品检验、环境分析和DMPK等应用领域。 　　Pierce G2 Fast Blotter 转印系统将高性能与高速度相结合，能实现分子量为10-300 kDa 的蛋白质从凝胶到印迹膜的快速、高效转移。 仅需5至10 分钟，且转印前无需对凝胶进行平衡处理。可兼容不同品牌的预制 SDS-PAGE 凝胶和常规自制凝胶。 　　MYECL Imager 成像系统只需轻轻一点便可完成化学发光、凝胶成像。同时还兼具强大的文件管理系统，令人惊叹的高灵敏度，简单、快捷、直观、轻便、小巧。 　　F1-ClipTip移液系统采用舒适的人体工效学设计，移液器重量显著减轻，120° 可旋转舒适靠指，拥有专利设计超强吹出以及轻触吸头推杆，量程锁定设计。 　　更多关于赛默飞参加第八届中国蛋白质组学大会的信息，请点击：活动专题网页http://www.thermo.com.cn/CNHUPO2013 　　关于中国蛋白质组学大会 　　中国蛋白质组学大会由中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业委员会(CNHUPO)主办，军事医学科学院放射与辐射医学研究所、重庆医科大学、蛋白质组学国家重点实验室、北京蛋白质组研究中心共同承办，旨在积极促进蛋白质组学的研究与发展，增进国际间合作与交流。大会至今已经成功举办了七届，邀请众多国际蛋白质组领域杰出科学家出席，汇聚国内蛋白质组和功能基因组学研究领域的著名科学家和研究团队。 　　关于赛默飞世尔科技 　　赛默飞世尔科技(纽约证交所代码： TMO)是科学服务领域的世界领导者。我们的使命是帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。公司年销售额130亿美元，员工约39,000人。主要客户类型包括：医药和生物技术公司、医院和临床诊断实验室、大学、科研院所和政府机构，以及环境与过程控制行业。借助于Thermo Scientific、Fisher Scientific和Unity&trade Lab Services三个首要品牌，我们将创新技术、便捷采购方案和实验室运营管理的整体解决方案相结合，为客户、股东和员工创造价值。我们的产品和服务帮助客户解决在分析领域所遇到的复杂问题与挑战，促进医疗诊断发展、提高实验室生产力。欲了解更多信息，请浏览公司网站：www.thermofisher.com 　　关于赛默飞世尔科技中国 　　赛默飞世尔科技进入中国发展已有30多年，在中国的总部设于上海，并在北京、广州、香港、台湾、成都、沈阳、西安、南京、武汉等地设立了分公司，员工人数超过2400名。我们的产品主要包括分析仪器、实验室设备、试剂、耗材和软件等，提供实验室综合解决方案，为各行各业的客户服务。为了满足中国市场的需求，现有5家工厂分别在上海、北京和苏州运营。我们在北京和上海共设立了5个应用开发中心，将世界级的前沿技术和产品带给国内客户，并提供应用开发与培训等多项服务 位于上海的中国创新中心结合国内市场的需求和国外先进技术，研发适合中国的技术和产品 我们拥有遍布全国的维修服务网点和特别成立的中国技术培训团队，在全国有超过400 名经过培训认证的、具有专业资格的工程师提供售后服务。我们致力于帮助客户使世界更健康、更清洁、更安全。欲了解更多信息，请登录网站www.thermofisher.cn

p & nbsp /p p 　　层析纯化技术由于其高选择性、灵活性、易放大性等优点，已经成为蛋白质药物纯化中不可或缺的技术。传统的层析填料为多糖基质，孔径一般在100 nm以下。1970年代出现了大孔和微孔无机材料硅填料，虽然增大了孔道、提高了层析的分辨率和流速，但只能在PH2-7.5范围内稳定，不利于分离纯化在碱性范围内稳定的蛋白质或是需要碱性层析条件的分离，从而限制了其在大规模快速分离蛋白质层析上的应用。多孔聚合物微球由于其高的比表面积、高的机械强度和多样的表面特征，常被用作层析分离纯化的填料。目前已发展出了多种表面基团、基质种类的层析填料，成功用于疫苗、病毒、抗体、酶、细胞因子等的分离纯化。 /p p 　 span style=" color: rgb(0, 176, 240) " strong 　层析纯化病毒、病毒样颗粒等生物大分子的瓶颈问题 /strong /span /p p 　　随着病毒、病毒样颗粒在疫苗、肿瘤治疗、免疫治疗中的地位越来越重要，这类复杂生物大分子的分离纯化需求也逐渐增加。然而传统填料由于孔径较小，蛋白质只能以扩散方式通过填料，传质速率慢，处理量低，造成分离时间长、容易失活等问题[1]。当蛋白质体积较大时，填料表面在吸附一层蛋白后，由于体积位阻以及静电排斥作用，会阻碍其它的蛋白质进一步进入孔内，造成填料的载量下降。另一个限制是病毒或疫苗，尤其是带有包膜的病毒或疫苗，在狭窄的填料孔径内发生吸附时非常容易发生结构变化，破坏其整体结构。在乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的纯化中发现这种病毒样颗粒在层析时会发生解聚[2]，经过离子交换层析分离后，疫苗的回收率通常不到50%[3, 4]。而抗原的结构发生变化以后，就会对其免疫原性产生影响，所以需要在纯化过程中尽可能维持抗原的结构。 /p p 　　为了解决针对病毒及病毒样颗粒纯化的瓶颈问题，目前已有采用膜色谱、超大孔贯穿孔颗粒填料及整体柱的策略进行纯化的案例，成功纯化了包括人乳头瘤病毒、番茄花叶病毒、流感病毒、腺病毒、慢病毒及各种病毒样颗粒。 /p p span style=" color: rgb(0, 176, 240) " strong 　　病毒及病毒样颗粒的分离纯化 /strong /span /p p 　　根据文献报道，超大孔填料相比传统层析填料不仅在载量及处理速度上有极大的优势，还更有利于病毒及病毒样颗粒的结构保持。 /p p 　　例如，在重组乙肝病毒表面抗原的分离纯化中，采用具有120nm及280nm超大孔径的离子交换填料DEAE-AP-120 nm和DEAE-AP-280 nm(商品名为中科森辉的Giga系列)具有比传统填料DEAE-FF高7倍以上的动态载量[1]。此外，采用ELISA测定抗原收率，发现采用超大孔填料能够减少重组乙肝病毒表面抗原在层析过程中的裂解，从而显著提高活性抗原的收率。 /p p style=" text-align: center " img width=" 576" height=" 450" title=" 1.jpg" style=" width: 415px height: 282px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/3b67db18-4291-4ab6-9874-209cd57644af.jpg" / 　　 /p p style=" text-align: center " 重组乙肝病毒表面抗原在不同孔径离子交换填料上 /p p style=" text-align: center " 　　的吸附动力学[1] /p p style=" text-align: center " img width=" 497" height=" 345" title=" 2.jpg" style=" width: 387px height: 289px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/07fdf233-77a5-4c30-8d20-faf7f044b54a.jpg" / 　 /p p style=" text-align: center " 　重组乙肝病毒表面抗原从不同孔径的填料上洗脱下来的 /p p style=" text-align: center " 　　ELISA回收率[1] /p p 　　对病毒的分离纯化同样有类似的效果。例如在灭活口蹄疫病毒的纯化中，DEAE-FF导致严重的病毒裂解。而采用具有100nm以上孔径的超大孔填料，不仅载量提高10倍以上，还能显著提高病毒在填料上吸附时的热稳定性，从而减少病毒的裂解，具有更高的收率。最终的分离纯化单步收率达90%以上[5]。 /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" font-size: 14px " strong 灭活口蹄疫病毒在传统填料与超大孔填料上的吸附解离过程 /strong /span /p p 　　与商品填料的小孔道填料相比，超大孔结构可能从以下几方面提高对蛋白质构象的稳定性： /p p 　　1)增大孔道(受限空间)：根据蛋白质折叠行为计算显示，蛋白质的折叠速率与空腔大小、形状密切相关，也即当填料孔道与蛋白的相对尺寸超过某一阈值后，蛋白的折叠行为将不受空腔大小影响。与数十纳米中孔结构的传统填料的相比，数百纳米超大孔结构会因孔道增大、与蛋白接触面积减小，从而对某一尺寸下蛋白质的变构行为有所改善。 /p p 　　2)界面曲率：小孔径填料孔道曲率大，填料与蛋白质接触面积大，因此受更大吸附力影响，蛋白质二级结构变化越严重。而曲率更大的超大孔孔道对蛋白二级结构的保护比狭窄孔道更有优势。 /p p style=" text-align: center " 　 span style=" font-size: 14px " strong 　表面曲率变化对蛋白接触面积的影响 /strong /span /p p 　　3)改善配基与蛋白活性区域的接触面积：超大孔微球内部数百纳米孔道在修饰配基后可能会有效改善传统填料狭窄孔道内由于配基拥挤造成的蛋白质失活现象。 /p p 　　4)减少蛋白在孔道内的静电排斥作用：有研究者认为，在离子交换填料上蛋白质起初会在孔道入口处形成一圈静电层，这一静电层会对后来蛋白继续进入孔道产生排斥作用从而使孔道关闭，动态载量下降。如果将超大孔填料修饰为离子交换树脂，由于孔道尺寸显著扩大可能会有效改善蛋白吸附静电层对孔道的封闭作用，从而有效引导蛋白质进入超大孔道，提高回收率。 /p p span style=" color: rgb(0, 176, 240) " strong 　　快速分离蛋白质及pDNA /strong /span /p p 　　除了应用于病毒及病毒样颗粒的分离纯化的分离纯化，利用超大孔填料传质速度快的优势，将超大孔填料镀上亲水表层，再接上不同配基制成多种形式的层析填料，用于快速高分辨率的纯化蛋白混合物或质粒。超大孔填料制备成的亲和层析、反相层析和离子交换层析填料广泛的应用在蛋白质的分离纯化方向，显示出超大孔填料比传统分离填料高速高分辨率的蛋白质纯化优势。 /p p 　　例如以肌红蛋白、转铁蛋白和牛血清白蛋白的混合溶液为模拟体系，考察不同流速下超大孔聚苯乙烯阴离子交换介质(DEAE-AP，商品名为Giga系列)的分离效果，并与DEAE 4FF介质进行了对比。实验结果(图2)显示，作为对照的DEAE-4FF介质在流速达到361 cm/h时，分离效果已明显降低，而超大孔介质可以在流速高达1084 cm/h的条件下操作，分离效果良好，能够在6 min内实现三种生物大分子的快速分离。 /p p style=" text-align: center " img width=" 588" height=" 170" title=" 3.jpg" style=" width: 473px height: 144px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/65df31ac-bd00-4a08-8a5a-feedfa1aa990.jpg" / /p p 　 span style=" color: rgb(0, 176, 240) " strong 　超大孔填料应用前景与展望 /strong /span /p p 　　近年来，随着生命科学的发展，生物样品越来越复杂，如人的血样、尿样、组织样品等，对生物分离分析技术提出更高的要求。根据超大孔填料固有的诸多优点，通过合成不同种类的超大孔固定相及在固定相上做不同功能的衍生，超大孔填料已经被广泛应用于生物分离分析中，但也存在一些问题。因此，发展新的制备手段，优化制备条件和过程，探索制备和分离机理，对于开辟新的应用领域以及开展实际样品的分离分析有更大的理论和现实意义。 /p p 　　根据已有的文献报道，我们可以预测今后几年的相关工作仍会集中在以下几个方面： /p p 　　(1)规则的聚合物整体材料内部形态。如获得规则的3D网络骨架，可控的孔径尺寸和分布。 /p p 　　(2)继续在微分离系统中扩展其应用。如在加压电色谱、微流控芯片材料、微流色谱和纳流色谱系统，甚至纳米器件开发等诸多方面大显身手。 /p p 　　(3)表面物理化学性质的调控向功能化、智能化方向发展。如基于分子印迹技术、温度响应以及pH响应的表面智能化的整体材料。 /p p 　　(4)制备规模整体柱的开发及其在生物下游技术中的应用。 /p p 　　目前，已经有一部分整体柱实现了商品化，但种类有限，还无法与种类繁多的颗粒型填充柱相提并论，也远未能满足分离分析的需求。而颗粒型的超大孔填料，由于其制备较困难、批次间重复性较差、价格昂贵等，也没有得到广泛的应用。相对于超大孔填充柱，有机相整体柱存在因流动相变会发生溶胀或收缩、机械强度差、比表面积小、柱容量差以及聚合过程中产生的微孔不利于小分子样品的分析等问题，现有报道大都用于生物大分子的分离。硅骨架整体柱也存在必须预先聚合好装入套管中，制备繁琐，比表面积较小的问题。因此，如何以更简便、有效的方式制备高效新型的超大孔填料并将其应用于实际样品的分离分析仍然是今后工作的重心。在实际工作中所面临的层出不穷的问题也是推动新型超大孔填料制备技术和方法发展的源源不竭的动力，在诸多的尝试中很可能就会出现某些性质优良的超大孔填料，这也预示着将来商品化的超大孔会越来越多。 /p p span style=" color: rgb(0, 176, 240) " strong 　　部分商品化的超大孔层析介质 /strong /span /p p 　　 strong 超大孔填料因其具有独特的多孔结构，与传统填料相比具有更加优良的渗透性和传质速率，可以在较低的操作压力下实现高效和快速的分离，已成为继多聚糖、交联与涂渍、单分散之后的第四代分离填料。可以预测，随着制备技术的不断提升，超大孔填料在生命科学、医药、环境和化学化工等领域必将大有可为。 /strong /p p 　　参考文献 /p p 　　[1] M.R. Yu, Y. Li, S.P. Zhang, X.N. Li, Y.L. Yang, Y. Chen, G.H. Ma, Z.G. Su, Improving stability of virus-like particles by ion-exchange chromatographic supports with large pore size: Advantages of gigaporous media beyond enhanced binding capacity, Journal of Chromatography A, 1331 (2014) 69-79. /p p 　　[2] P.M. Kramberger P, Boben J, Ravnikar M, ?trancar, A.S.m.c.a.b. in, p.a.f.q.o.t.m. virus., J. Chromatogr. A 1144(1). /p p 　　[3] W. Zhou, J. Bi, J.-C. Janson, A. Dong, Y. Li, Y. Zhang, Y. Huang, Z. Su, Ion-exchange chromatography of hepatitis B virus surface antigen from a recombinant Chinese hamster ovary cell line, Journal of Chromatography A, 1095 (2005) 119-125. /p p 　　[4] W. Zhou, J. Bi, J.C. Janson, Y. Li, Y. Huang, Y. Zhang, Z. Su, Molecular characterization of recombinant Hepatitis B surface antigen from Chinese hamster ovary and Hansenulapolymorpha cells by high-performance size exclusion chromatography and multi-angle laser light scattering, Journal of Chromatography B, 838 (2006) 71-77. /p p 　　[5] S.Q. Liang, Y.L. Yang, L.J. Sun, Q.Z. Zhao, G.H. Ma, S.P. Zhang, Z.G. Su, Denaturation of inactivated FMDV in ion exchange chromatography: Evidence by differential scanning calorimetry analysis, BiochemEng J, 124 (2017) 99-107. /p p /p

项目编号：0811-234DSITC0247项目名称：蛋白质组学质谱分析系统预算金额：790.0000000 万元（人民币）最高限价（如有）：790.0000000 万元（人民币）采购需求：蛋白质组学质谱分析系统/壹套（项目预算：人民币790万元，可以采购进口产品）合同履行期限：合同签订之日起至合同内容履行完毕止本项目( 不接受 )联合体投标。获取招标文件时间：2023年02月20日 至 2023年02月27日，每天上午9:00至11:30，下午13:00至16:30。（北京时间，法定节假日除外）地点：微信公众号“东松投标”方式：关注微信公众号“东松投标”，完成信息注册，即可购买招标文件售价：￥700.0 元，本公告包含的招标文件售价总和对本次招标提出询问，请按以下方式联系。1.采购人信息名称：同济大学地址：上海市四平路1239号联系方式：袁老师 021-659856142.采购代理机构信息名称：上海东松医疗科技股份有限公司地址：上海市宁波路1号申华金融大厦11楼联系方式：刘韵、王悦 0086-21-63230480转8606、86273.项目联系方式项目联系人：刘韵、王悦电话：0086-21-63230480转8606、8627

11月18日凌晨，神舟八号飞船搭载的生物培养箱在神八落地后几乎是刻不容缓地被送回北京。据介绍，培养箱中装载样品33种，开展了17项空间生命科学实验。如今实验有了什么进展?我们就从中选取几项实验，介绍给您—— 　　神八实验揭秘 　　线虫的太空之旅 　　我是一条线虫,但不是你想象中的寄生虫，你可以叫我的英文名字：C.elegans。我坐着神八飞船，在太空进行了长达十六天半的旅行。 　　自然状态下，我生活在泥土中，以细菌为食。成年后身长约1毫米，人类在显微镜下才能看清。我通体透明，长得不好看。可大连海事大学环境系统生物学研究所孙野青教授和同事们，却常夸我是“可爱美丽的小天使”，还给我起了个好听的名字：秀丽隐杆线虫。 　　不是吹牛，我是天生的“航天员”。在空间生命科学领域，我的家族可谓声名远播。从1975年开始，我的同类就先后搭载美国国家航空航天局的航天飞机邀游太空。 　　为什么选择我们呢?一是因为我们在-80℃长期冻存后仍能恢复活力，是目前已知的唯一能低温冻存的多细胞真核动物。我在逆境时进入休眠期，像熊冬眠一样，不发育、不吃东西，时间可以长达2个月左右。二是我们基因组很小，仅为人类基因组的3%，但有约40%的基因与人类同源。据科学家们说，我们身上很多调控发育的基因和人类很相似，一旦研究清楚在空间辐射环境或空间辐射和微重力同时存在的环境下，我们的这些基因是如何变化的，将给航天医学及空间辐射损伤预警做出巨大贡献。 　　因此，我们在太空中要接受辐射，再把这些辐射损伤的印记带回来。所以我们在地面不能有任何损伤，坐飞机时都不能过安检，临上太空前还要在航天城“集训”两周，看我们能否顺利登舱。 　　这次上太空，我的“房子”是德国航空航天中心DLR研制的SIMBOX(生物支持系统实验盒)内的38个小盒子之一，大约18ml。这么小的空间，却住了十万伙伴。SIMBOX可不简单，它的里面安装了1g的离心装置，模拟地球的引力。我们分成两组，分别被装入在1g的离心机上和附近固定的房子里，有些伙伴只接受空间辐射，有的既接受空间辐射又感受微重力的。当返回地球后，我们就可以被比较分析变化的差别。我们屏住呼吸，停止发育，把空间环境影响的印记尽量留在身上。 　　接下来我们将继续配合孙教授课题组，给人类带来更多惊喜，大家拭目以待吧! 　　放线菌勇闯无重力空间 　　放线菌是“神八”的另一位旅客，它们比缝衣针尖还要小100倍，却是中科院微生物所黄英教授的心肝宝贝们。 　　别小瞧了放线菌!知道抗生素吧?70%是放线菌产生的。它们还是环境保卫者——难降解的塑料、化学除草剂、杀虫剂，可能都是放线菌的“美餐”，只要很短的时间，它们就能消灭这些顽固有机物。 　　黄英说，这次送上太空的有三种微生物，第一种是放线菌里的经典“美人”，它产生的色素像天空般蔚蓝，因此叫天蓝色链霉菌，正是出于颜色易于观察的原因，它是这次上太空的首选“模特” 第二种是放线菌里的“新人类”，它生命力旺盛，产生抗生素的能力又强又稳定，它有个暂定的名字叫卷须链霉菌C 第三种不是放线菌，叫枯草芽孢杆菌，有些洗衣粉里的酶，就是从它的分泌物中提取的。这次，它的命运是被两个同伴杀死，从而测试它们在太空环境下的抑菌能力。 　　放线菌被小心翼翼地放进通用生物培养箱，箱子保持23℃恒温和恒定的湿度，连空气成分都是照搬地球的，并且准备了充分的营养物。 　　送上太空，为什么又模拟地球环境呢?这叫微重力效应实验。地球引力对生物的影响，经常被人们忽视，但确实存在。比如，树木之所以能将根深深扎进土地里，就是因为地球引力的影响。对于放线菌而言，没有了地球引力，又会发生什么样的变化?这就是送放线菌上太空的原因所在。 　　此前科研人员曾在地面模拟微重力效应实验，结果发现它们产生抗生素的周期从1周缩短到4—5天，抗生素的产量也有所增加。 　　将它们送入太空，就是要看看在真实的微重力环境中，它们会发生什么变化。事实证明，在太空的微重力环境下，放线菌的生长和模拟微重力效应环境下相似，甚至效果更好一些。天蓝色链霉菌和卷须链霉菌C在太空中肆无忌惮的生长，杀死了更多的枯草芽孢杆菌，这说明它们释放出的抗生素浓度高于地球上的同类。 　　中科院微生物所接下来的工作，是进一步比对这些从太空中回来的“贵客”们的细微模样和抑菌能力，分析它们的基因性状，抓紧让它们“传宗接代”，看看下一代中会不会出现更美更壮的“佼佼者”。 　　太空中长出蛋白质 　　大约10厘米长、4厘米宽、5厘米厚——这个小黑盒就是由神八携带的、用于蛋白质晶体生长研究的“秘密武器”。打开这个“秘密武器”，可以看到120个排列整齐、大小一致的“小抽屉”，中科院生物物理所研究员仓怀兴解释说，每个“小抽屉”都装满了实验溶液，实验溶液中“漂浮”着一根内径1毫米、长12毫米的玻璃毛细管，毛细管里装着蛋白质溶液。“我们这个实验的主要目的，就是要在太空环境中让蛋白质溶液与实验溶液发生反应，看看能不能生长出质量更好的蛋白质晶体。” 　　蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。蛋白质分子是由氨基酸构成的，氨基酸的不同排列方式、也就是蛋白质分子的不同结构导致其产生不同的功能。 　　“要想知道哪种蛋白质有何功能，必须先了解它的结构。”仓怀兴说：“研究蛋白质分子的结构有两种方法，一是让其长出晶体，再用X射线照射 二是用核磁共振。”但当蛋白质分子比较大时，“比如一些病毒的蛋白质结构，核磁共振就看不到了。” 　　研究蛋白质分子结构是国际学界的热点。“近些年比较热门的应用是生物制药领域，因为很多病毒的外壳都是蛋白质。”仓怀兴介绍说，美、日、欧盟等发达国家早就将蛋白质分子送入太空，以便获得质量更好的蛋白质晶体，从而更加精细地了解蛋白质的结构。“据我了解，到目前为止，大概有25种蛋白质分子的高分辨率结构，是利用在空间实验中获得的蛋白质晶体取得的。我相信还有更多，不过很多制药公司都将其视为机密，在新药研制成功之前不会对外宣布。” 　　虽然有120个“小抽屉”，但此次实验只携带了14种蛋白质溶液。仓怀兴解释说：“蛋白质是种很奇怪的物质，不是说两种溶液相反应就必然能得到晶体，因此我们都做了充分的‘后备’。”仓怀兴说，得到的晶体已经被研究人员带到上海同步辐射光源进一步研究，“很快就会有结果了!” 空间微重力样品 　　神八里的绿色植物 　　“我们利用神八搭载水稻种子，进行高等植物在空间的代谢生物学研究。”中科院植物所的温晓刚说。水稻是空间生命支持系统中重要的食物来源，也是高等植物研究的模式植物，这是“神八”选择水稻种子的原因。 　　这些水稻种子被放置在植物生长容器中，以透光、透气、不透水的生物膜覆盖。“这些水稻种子在太空中萌发，生长成水稻幼苗。”温晓刚说，这些情况与地面上同一温度、湿度情况下生长的水稻种子进行对比，中科院植物所的研究人员就能够分析水稻幼苗在空间环境下的生长发育情况，考察空间飞行对植物代谢过程的影响。 　　温晓刚说：“经过空间飞行，水稻幼苗生长状态良好，发芽率达到91%以上，与地面实验一致。初步的光合生理实验结果显示，水稻幼苗在微重力等空间环境下，其光合系统的活性受到一定程度的影响，其中对光系统Ⅰ的影响大于对光系统Ⅱ的影响。”温晓刚解释，空间微重力会造成高等植物光合机构叶绿体中的类囊体膜结构发生改变，比如类囊体膜垛叠的基粒组分减少等，这种变化可能对植物光合系统的功能造成一定的影响。“实验结果正在进行进一步研究分析中。”接下来科学家们将深入分析得到的光合生理数据，并进行水稻幼苗叶片和根尖的亚显微结构分析，以及水稻叶片的蛋白质组学研究，同时研究空间飞行对水稻幼苗蛋白质组学的影响，特别是与光合作用相关的代谢过程以及与光合能量传递相关的蛋白的影响，分析空间环境下植物光合系统的变化规律。 　　神八中的“生物圈” 　　如果能在飞船密闭的空间里，建立这样一个“生物圈”：让食物产生、氧气供给、二氧化碳去除和废物再循环都变成现实，那宇航员们长期居住太空将不再是梦想。神八里就有一项空间简单密闭生态系统探索研究，我国科学家迈出了在太空自主建立受控生态生命保障系统(简称CELSS)的重要一步。 　　CELSS是生命科学、空间科学、环境科学、自动化和遥感科学诸多高新技术的集成。首先要在空间飞行器上进行模型实验，积累基本数据。神八飞船上，中科院水生生物研究所的科学家们构建了一个简单水生态系统，以纤细裸藻和小球藻作为主要生产者，澳洲水泡螺作为主要消费者，同时以自组织形式共培养细菌作为分解者。在硬件设计上，除了提供藻类生长与产氧所需的光源外，还增加了藻类生长密度检测装置，即时传送生长状态数据进行监控 并以特定的技术进行系统内的气体传质分布，增进气体在不同腔室的传递，以期在系统中实现气体、食物与废物处理的良性循环。中科院水生生物研究所的李小燕介绍，从目前得到的数据来看，藻与螺的生长都符合预期目标和已知规律，系统中的各要素基本实现自循环、自组织的功能。同时从神舟八号返回的样品中，可以在生物的空间飞行效应、空间共培养系统的物种相互关系，空间封闭生态系统的结构与功能三个方面剖析出重要的科学信息。

基因决定着个体的生命特征，但仅根据基因序列无法完整地阐明生物体的功能。蛋白质是生命活动的具体执行者，人体的许多疾病和蛋白的变化息息相关，包括它的丰度、修饰、结合等方面的变化。基于质谱（或者色谱-质谱）的蛋白质组学是一门既受技术推动又同时受技术限制的发现科学。过去十年间，蛋白质组学相关技术发展迅速，尤其是质谱仪器的进步，包括灵敏度、扫描速度、碎裂方式等，极大的推动了生物医学研究的发展。但生物样品复杂多样，如何更有效充分以及更简捷快速的将蛋白样品送入质谱是蛋白质组学研究的前提，同时也是蛋白质发展的瓶颈之一。莱伯泰科联合诺禾致源于2022年4月29日9:30共同推出“蛋白质组学样品前处理新技术网络研讨会”。本次讲座将专注于讨论生物及临床样品的前期处理和制备方法。通过结合讲者本人的研究经验，讲座将重点介绍基于膜片的组学反应器及相关技术在蛋白质组学样品处理过程中的应用。如果大家对这项技术感兴趣，欢迎扫描海报下方二维码，报名参与本次直播，届时，我们不见不散！

p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　詹显全，中南大学教授、博士研究生导师、博士后合作导师，英国皇家医学会会士(FRSM)、美国科学促进会(AAAS)会员、欧洲预测预防个体化医学协会(EPMA)的会士和国家代表、美国肿瘤学会(ASCO会士、欧洲科技合作组织(e-COST)的海外评审专家，中国抗癌药物国家地方联合工程实验室技术委员会委员、技术带头人和副主任，临床蛋白质组学与结构生物学学科学术带头人和学科负责人，国家临床重点专科建设项目重点实验室建设项目学科带头人，湖南省百人计划专家、湖南省高层次卫生人才“225”工程医学学的学科带头人、中南大学“531”人才工程专家。目前正致力于从多参数系统策略角度阐述肿瘤的分子机理、发现肿瘤分子标志物，研究并整合基因组、转录组、蛋白质组和代谢组的变异来实现肿瘤的预测、预防与个体化治疗及精准医学。已发表学术论文130 余篇，主编国际学术专著3 本，参编国际学术专著16 本，获得美国发明专利2 个。受邀在中科院1 区影响因子9.068 MassSpectrometry Reviews 和中科院2 区影响因子3.65 Frontiers in Endocrinology 的国际期刊上客座主编了3 个专刊。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em text-indent: 2em " 本篇文章仪器信息网获得授权转载，来源中国科技成果杂志。 /p p style=" text-align: center line-height: 1.75em " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 深入剖析蛋白质组学技术最新进展与应用 /strong /span /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　詹显全：人类结构基因组测序接近尾声，人们就从结构基因组学研究转向功能基因组学研究，即对转录组和蛋白质组进行研究。1995 年正式提出了”蛋白质组”和”蛋白质组学”的概念，距今已有25 年历史了。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em text-indent: 2em " 蛋白质组学的主要技术包括蛋白质组的分离技术、鉴定技术和蛋白质组信息学技术。 span style=" text-indent: 2em " 蛋白质组的分离技术主要有双向凝胶电泳(2DE)和多维液相色谱(2DLC)。蛋白质组的鉴定技术主要是基于质谱(MS)的技术，主要分为肽质指纹(PMF)和串联质谱(MS/MS)分析技术，其用于蛋白质大分子分析的两大离子源主要有MALDI 和ESI。质谱技术发展很快，主要朝向高灵敏度、高通量和高精度方向发展。 /span /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　蛋白质组信息学技术主要是用来构建蛋白质相互用网络的相关技术。蛋白质组的分离技术和质谱技术的不同联合就形成了各种类型的蛋白质组学分析技术：如2DE-MS和2DLC-MS。2DE-MS 又有2DE-MALDI-PMF 和2DE-ESI-LC-MS/MS, 该技术在蛋白质组学研究的头10-15 年是其主要技术，然而常规概念认为2DE 的通量不高，即一个2D 胶点中一般仅含有1 ～ 2 个蛋白质，通常一次实验其通量仅能鉴定几十到一千个蛋白质，这样其在蛋白质组学中的地位逐渐被淡化。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em text-indent: 2em " 2DLC-MS 主要有iTRAQ or TMT-based SCX-LC-MS/MS and labelfree LC-LC-MS/MS, 这就是人们通常说的“Bottomup”蛋白质组学，该技术在最近10 ～ 15 年在蛋白质组学中起着核心技术的作用，因为其通量明显增加，一次实验其通量可达到几千到一万的蛋白质能被鉴定，但该法鉴定的结果是一个protein group, 实质上鉴定的是编码蛋白质的基因, 而并没有鉴定到真正意义上的蛋白质，即蛋白质存在形式(Proteoforms 或Protein species)。蛋白质存在形式(Proteoforms)是蛋白质组的基本单元。人类基因大约2 万个，人类转录本至少10 万个，每个转录本指导核糖体按三联密码子决定一个氨基酸残基来合成氨基酸序列，刚合成出来的蛋白质氨基酸序列是没有功能的，它必须到达其指定的位置如胞内、胞外，和不同的亚细胞器等，形成特定的三位空间结构，并与其周围的相关分子相互作用，形成一个复合物(complex)才能发挥其功能作用。从核糖体刚合成出来到其指定的位置过程中有很多的蛋白质翻译后修饰(PTMs 据估计人体有400 ～ 600 种PTMs)。我们最近对蛋白质存在形式的概念给出了最新最完整的定义：蛋白质的氨基酸序列+ 翻译后修饰+ 空间构型+ 辅助因子+ 结合伴侣分子+ 空间位置+ 特定的功能。而蛋白质的概念被定义为：由同一个基因编码的所有蛋白质存在形式的集合体。这样，人类蛋白质组中的蛋白质存在形式(Proteoforms)至少有100 万或甚至达10 亿 (图1)。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 427px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/1d18fad3-b010-4ea5-a812-432853ad4ec6.jpg" title=" 1111111.png" alt=" 1111111.png" width=" 600" height=" 427" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center line-height: 1.75em " 　　图1 ：Proteoforms 的概念及形成模式 (Zhan et al,Med One, 2018 Zhan et al., Proteomes, 2019) /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　如此庞大数量的Proteoforms/Protein species, 如何对其进行大规模的探测、鉴定和定量，是一个至关重要的事情。目前关于Proteoforms 的研究有两套策略一是“Top-down”MS 技术， 二是“Top-down” 和“Bottom-up”相结合的技术即2DE-LC/MS 技术(图2)。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 415px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/94f48c94-fd0b-4959-90fb-dd399cebf074.jpg" title=" 2.png" alt=" 2.png" width=" 600" height=" 415" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center line-height: 1.75em " 　　图2 ：Proteoforms 研究技术比较(Zhan et al., Med One, 2018 Zhan et al., Proteomes, 2019) /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　“Top-down”MS 技术能探测、鉴定和定量Proteoforms，获得蛋白质的氨基酸序列和PTMs 信息，然而该技术的通量较低，目前最大通量鉴定到5700 个Proteoforms, 对应到860 蛋白质。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　最近，詹显全教授团队发现2DE-LC/MS 技术是一超高通量的技术平台，在探测、鉴定和定量Proteoforms方面, 可以鉴定达几十万至上100 万的Proteoforms。随着质谱灵敏度的显著提高，自2015 年以来，詹显全教授团队就发现每个2D 胶点包含了平均至少50 个甚至达几百个Proteoforms，并且大多数是低丰度的 并在近1 ～ 2 年来发表了相关论文来全面阐述2DE-LC/MS 的新理念和实践，完全打破了40 多年来人们对双向电泳的传统认识 (即一个2D 胶点中一般仅含有1 ～ 2 蛋白质)，为大规模的Proteoforms 研究提供了技术基础。Proteoforms/Protein species 概念的发展极大的丰富了蛋白质组的内涵，是蛋白质组学研究的更高层次，是国际科学发展的前沿，必将影响着整个生命科学和医学科学的研究和实践，有助于发现可靠而有效的疾病标志物，用于深度理解疾病分子机制和决定药物靶点，或者用于有效的预测、诊断、预后评估。另外，蛋白质组是表型组的重要成分，是基因组功能的最终执行者，是基因组和转录组研究所不能替代的，要实现真正的个性化医学和精准医学，蛋白质组学研究是不能绕过去的。 /p p style=" text-align: center line-height: 1.75em " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 基于整合组学发现疾病标志物才是精准发展之重 /strong /span /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　1. 您一直专注于肿瘤蛋白质组学的研究，例如垂体瘤、卵巢癌等相关恶性肿瘤结合组学的研究，请谈谈在这方面的最新的研究成果，以及过程中的主要挑战和解决方案 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　詹显全： 垂体瘤是颅内常见肿瘤，绝大多数是良性的，只有少数具有侵袭性和恶性，并能引起激素分泌紊乱和颅内压迫症状，出现严重的临床症状，危害人体健康。临床上分为功能性垂体瘤和非功能性垂体瘤，并且非功能性垂体瘤不表现血中激素水平增加，不易早期诊断，经常是当肿瘤体积增加到压迫周围组织器官产生压迫综合征时才被诊断，这时已经是中晚期了，且其分子 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　机制并不清楚，缺乏早期诊断标志物和药物治疗靶标。因此，非功能性垂体瘤被选为主要研究对象。虽然垂体瘤是在颅内，但我们认为垂体瘤是一种多病因、多过程、多结果的全身性的慢性疾病，并且还具有肿瘤的异质性 它涉及到一系列的分子改变，包括发生在基因组、转录组、蛋白质组、代谢组和相互作用组水平上的改变，而这些不同水平改变的分子和信号通路又不是孤零零的起作用，而是相互间具有千丝万缕的联系。因此，我们很难用一种单一因素来解决其预测、预防、诊断、治疗和预后评估 而必须从单因素模式转向多参数系统思维模式。垂体瘤的多病因、多过程、多结果、全身性、慢性、分子网络系统性给其“同病同治”提出了严峻挑战，同时为实现其个性化的精准预测、精准预防、精准诊断和精准治疗提供了机遇和条件。多组学(基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、影像组学)和系统生物学技术的发展驱动了这一多参数系统思维模式的转变、推进了其个性化医学和精准医学的研究和实践。因此，我们认为多参数系统策略观和多组学是进行垂体瘤个性化医学和精准医学的研究和实践的重要理念和技术方案。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　我们从2001 开始进行垂体瘤的蛋白质组学及其翻译后修饰组学研究，从2008 年开始进行多组学和分子网络研究，及预测预防个体化医学(PPPM)和精准医学(PM)研究。经过过去近20 年未间断的研究，我们在垂体瘤的蛋白质组学、翻译后修饰组学、多组学、分子网络和系统生物学研究方面在国际上处于了主导地位。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　在我们研究过程中，我深深体会到一个重大思转变就是从以前的单参数模式转向了多参数系统思维模式，这符合肿瘤的真实情况。另外，就是多组学技术促进了这一模式的转变，并是其主要的解决方案。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　2. 从您的研究方向及重点出发，您认为多组学研究在精准医学中接下来的研究应当侧重于哪些方面，以及如何才能比较好的实现从研究到临床的转化落地? /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　詹显全：我的研究对象是肿瘤(垂体瘤、卵巢癌、肺癌、胶质瘤)，研究理念是肿瘤的多参数系统策略观，技术手段是多组学和系统生物学，研究的目标是要解决肿瘤的预测预防个体化医学(PPPM)和精准医学(PM)。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　我们认为多组学中的不同组学对PPPM/PM 的贡献是不平衡的，即个性化的表型组是基因组通向PPPM/PM 应用实践的桥梁，而蛋白质组和代谢组是表型组中两重要成分。蛋白质组的内涵包括蛋白质的拷贝数变化、剪切变化、翻译后修饰、转位、再分布、空间构型、与周围分子相互作用、及信号通路网络问题。代谢组的内涵涉及到体内所有物质(包括糖、脂、蛋白质、核酸)的代谢产物及其代谢网络问题。要真正实现PPPM 和PM，蛋白质组和代谢组的贡献是基因组所不能替代的是不能绕过去的。人们应从以基因组为中心的研究和实践转向以表型组为中心的研究和实践。其中蛋白质组的研究又应以翻译后修饰和蛋白质存在形式(Proteoforms)作为今后的研究方向。Proteoforms 的研究必将影响着整个生命科学和医学科学。从临床转化研究来看，基于多组学的整合生物标志物是发展方向。对于这里的生物标志物，我们将其分为两类：一类是解决疾病分子机制和药物靶点的生物标志物，这类生物标志物一定要有因果关系 一类是解决预测、诊断、预后评估的生物标志物，这类标志物不一定要求有因果关系，但必要要有量的变化。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　3. 作为EPMA(欧洲预测预防个体化医学协会)的中国代表，想请您分享下国际上对于组学研究在精准医疗中的应用现状、趋势以及发展规划 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　詹显全：欧洲预测预防个体化医学协会(EPMA)是国际个体化医学领域领头的学术协会，由来自全球55 个国家和地区的专家学者组成，其创办的官方杂志EPMA Journal( 中科院2 区，ESI IF5.661) 涵盖了24 个专题内容，较全面地反映了预测预防个体化医学(PPPM)和精准医学(PM)的研究、实践与最新动态，还涉及到PPPM 和PM 的政策、伦理、卫生经济和社会保障等许多方面，为PPPM 和PM 的科研、实践提供了一个很好的交流平台。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em text-indent: 2em " 我本人作为EPMA 的中方代表(National Representative of EPMA in China) 和其官方杂志EPMA Journal 的副主编，参与了其经历的重要活动。我从2008 开始起在EPMA 中主要负责多组学和创新技术方面，在EPMA 白皮书中的“肿瘤预测预防个体化医学的多参数系统策略观”这部分最早就是我写的，之后我们写了一系列文章来论述基于多组学的多参数系统策略的研究和实践。因此，在EPMA，我们的基于多组学的多参数系统策略观还是比较早的，近五六年来多组学研究在EPMA 圈内(55 个国家和地区)发展得很快，已经深入到PPPM 的各个领域。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em " 　　另外，我认为，精准医学在理念上没错，严格意义上的精准医学是个理想化的概念，人们只能无限去逐步接近它。现阶段搞精准医学还是要回归到人类健康的保护过程，即预测、预防、诊断、治疗和预后评估，这里应该是针对个人来说而不是针对群体，严格说来应该是个性化的精准预测、精准预防、精准诊断、精准治疗和精准预后评估。对于人类健康保护过程来说，预测、预防还是上策，其次就是早诊断、早治疗。多组学研究已渗入到人类健康保护过程的每个环节，主要用来寻找基于多组学的生物标志物，当然这里的生物标志物应泛指前面说的两类：一类是解决疾病机制和治疗靶点的标志物，一类是解决预测、诊断、预后评估的标志物。 /p p style=" text-align: justify line-height: 1.75em text-indent: 2em " 因此，基于多组学的PPPM/PM 的研究和实践一定是今后发展的一个长远趋势。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 802px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202008/uepic/581ff7cf-5c3e-4fd6-8f5f-805989791ee5.jpg" title=" 詹.jpg" alt=" 詹.jpg" width=" 600" height=" 802" border=" 0" vspace=" 0" / /p p br/ /p

目的 以单克隆抗体完整蛋白的UPLC® /MS分析为例，展示UNIFI&trade 科学信息系统这个平台在精确质量测定、数据处理和报告方面的强大功能。 背景 生物治疗药物得到了越来越多的关注，无论是药监部门还是生物制药企业，有效剖析单克隆抗体(mAb)尤为重要。在同一软件平台中实现数据采集和处理，并同时满足审计追踪的要求，是符合法规要求的重要因素。 蛋白质药物会发生翻译后修饰，如糖基化等，由于糖基化在生物系统中有几项重要的功能，因此，准确鉴定抗体药物的糖基化情况是蛋白药物监管指导原则中的一部分。为确保生物药物的安全性和有效性，快速、准确地对糖蛋白进行分析是十分必要的。 ACQUITY UPLC® H-Class Bio系统的高分辨生物分子分离能力与Xevo® G2 Tof 高质量精度的高分辨飞行时间质谱检测技术相结合，为生物药物分析实验室提供了常规分析用的UPLC/MS系统。 基于UN IFI的完全一体化分析平台突破了以往采集、处理色谱及质谱数据的局限性，并可自动生成报告。 每个mAb分析都会产生一个非常庞大的数据组，需要对各种不同的糖基化修饰进行阐释，以便对最终产品进行综合鉴定。这个步骤会限制其它高通量分析过程的效率，并且很难实现自动化。 基于UN IFI的完全一体化分析平台突破了以往采集、处理色谱及质谱数据的局限性，并可自动生成报告。 解决方案为解决数据分析耗时长的问题，促进治疗用单克隆抗体（mAb）的数据处理，基于UNIFI的生物制药系统解决方案专门配置了完整蛋白分析方案。 这是一个完整的方案：采集了UPLC/MS数据后，以高通量方式进行全自动的数据处理和结果标注，得到的数据结果可在导出后进行数据管理。 曲妥珠单抗的UPLC/MS分析以全自动的方式进行，使用0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液分别用作流动相液A和B。为成功进行色谱分离，色谱柱的温度必须设定至80 ° C。这套完整的生物制药系统解决方案包括如下要素：ACQUITY UPLCH-Class Bio系统，ACQUITY UPLC BEH300 C4 色谱柱和Xevo G2 Tof质谱系统，UNIFI科学信息系统用于数据的采集、处理和报告。 完整蛋白分析报告可显示不同的报告内容，用户可以自主设置具体的报告内容：TIC色谱图；原始质谱数据、去卷积处理后的数据和棒状质谱图；及LC/MS数据分析结果的总表（图-1）。该详细视图为在特定质量范围及以本方法设定的参数范围内的去卷积处理后数据。去卷积图谱反映了抗体药物的几个主要的糖型，与葡萄糖残基数量和岩藻糖基化程度对应。另一个报告的格式是表格，该表列出了完整单克隆抗体（mAb）的质量测定结果和不同糖型（图-2）。报告还列出了曲妥珠单抗不同糖型的质谱峰的测量值以及与理论值之间的误差，并列出了TIC色谱图的色谱保留时间。这样一种完整的LC/MS分析方法使用户可灵活运用原始数据和处理后的数据，并进行快速而有效的数据管理。 总结 本应用通过单克隆抗体（mAb）完整蛋白分析应用展示了基于UNIFI的生物制药系统解决方案的强大功能。 现代仪器系统和先进的分析技术突破了生物制药企业以往的限制，能够对其生产过程进行严格的监控。 高效而经济的UPLC/MS分析方法，结合UNIFI科学信息系统进行数据处理和报告，不仅可满足法规的要求，还有助于完整蛋白鉴定。UPLC/MS平台可覆盖从详细的蛋白结构鉴定到复杂的数据管理整个过程。

研究蛋白质热稳定性的几种方法蛋白跟核酸不一样，核酸都是由四个碱基组成，只是组成的顺序不一样，但是整体的结构都是类似的双螺旋结构。而蛋白由20多种不同氨基酸组成，需要折叠成正确的三维结构才能发挥自身作用。所以每个不同功能的蛋白长得样子其实都是不同的。蛋白的高级结构决定其功能，行使功能需要正确折叠。蛋白由20多种不同氨基酸组成，需要折叠成正确的三维结构才能发挥自身作用。蛋白质在一定的物理和化学条件（加热、加压、脱水、振荡、紫外线照射、超声波、强酸、强碱、尿素、重金属盐、十二烷基硫酸钠）下，其空间构象容易发生改变而失活，因此研究蛋白的构象和构型变化对其应用有重要的价值。蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。热变性是蛋白质变性中最常见的一类现象。蛋白质的热稳定性是指蛋白质多肽链在温度影响下的形变能力，主要体现在温度改变时多肽链独特的化学特性和空间构象的变化，变化越小热稳定性越高。蛋白质的热稳定性受到不同温度、pH值、离子强度等外界因素的影响，在生物技术、药物研发以及食品工业等领域，具有重要意义。蛋白质变性温度是生物学家们研究蛋白质的热稳定性的一个重要的概念，是指蛋白质在特定温度条件下受到热力作用时，其结构发生变化的温度点，一般温度较高时，蛋白质从稳定的三维结构变化成松散的无序结构。蛋白质的热稳定性一般使用热变性中点温度(meltingtemperature，Tm)来表示，即蛋白质解折叠50%时的温度。蛋白质的热变性过程与其空间构象的改变密切相关，Tm值能反映变温过程中蛋白质构象改变的趋势，是衡量蛋白质热稳定性的一个重要指标。蛋白质Tm值的测定在生物医药行业具有广泛的应用，如嗜热蛋白、工业酶等的改造与筛选，蛋白质药物与配体、制剂或辅料的相互作用，蛋白质药物的缓冲液稳定条件筛选等。目前，许多多种方法可以用来测量蛋白质的变性温度，如圆二色光谱法(circulardichroism，CD)、差示扫描量热法(differentialscanningcalorimetry，DSC)、动态光散射法（DynamicLightScattering）和差示扫描荧光法(differentialscanningfluorimetry，DSF)等。 目前，许多多种方法可以用来测量蛋白质的变性温度，如圆二色光谱法(circulardichroism，CD)、差示扫描量热法(differentialscanningcalorimetry，DSC)、动态光散射法（DynamicLightScattering）和差示扫描荧光法(differentialscanningfluorimetry，DSF)等。 01 圆二色谱法（CD）圆二色光谱（简称CD），或红外（傅里叶变换红外（FourierTransformInfrared，FTIR）光谱），是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单的方法。圆二色谱法诞生于20世纪60年代，其原理是利用左、右两束偏振光透过具有手性结构的生物大分子等活性介质，获得的圆二色谱来分析其结构特点，是蛋白质、核酸、糖类等生物大分子二级结构分析的常规手段之一。蛋白由α螺旋和β折叠构成，α螺旋和β折叠在红外和紫外光段有特异的光吸收。蛋白质对左旋和右旋圆偏振光的吸收存在差异，利用远紫外区（190~260nm）的光谱特征能够快速分析出溶液中蛋白质的二级结构，进而分析和辨别出蛋白质的三级结构类型，变温过程中测量蛋白等物质的圆二色谱，能反映其随温度升高结构变化的趋势。此外，通过测定蛋白质在不同温度下的平均残基摩尔椭圆度[θ]可以获得蛋白质的Tm值。特点：圆二色光谱（CD）适用于测定稀释溶液的热稳定性，操作相对简单，成本较低。但是相关仪器很昂贵，对缓冲液要求也高，要求溶液不能有任何的紫外吸收，也很难做到高通量检测。 02差示扫描量热法（DSC） 蛋白变性时会有温度变化，检测温度变化就能知道蛋白变性程度。差示扫描量热法的应用始于20世纪60年代，是在程序控温下，通过测量输给待测物和参比物的功率差与温度的关系，以获得吸放热量的技术。差示扫描量热法能定量测量热力学参数，可提供与蛋白质热变性过程中构象变化有关的热效应信息。差示扫描量热法（DSC）是一个很经典的一个技术，基于的蛋白变性过程中对热量的吸收。蛋白是有三维结构的，比如氢键，疏水键，范德华力。一旦通过加热然后把结构破坏掉，需要吸收热量。所以可以测量热量变化，就是加热结构变化过程中的热量吸收。通过对参照物和样品同时进行升温或冷却处理，测定两者为保持相同温度所产生的热量差，从而计算蛋白质的Tm值。特点：差示扫描量热法（DSC）能够提供直接的热量变化数据，定量准确、操作简便。但检测通量低、耗时较长，需要的样品体积和浓度比较大。相关仪器中最核心的部件是样品池，对周围环境要求极高。 03 动态光散射法（DLS）动态光散射是基于光学的方法，检测的是蛋白变性之后会发生聚集，导致颗粒的大小发生改变，对散射信号的影响。蛋白在变性过程中，从一个规则高级折叠结构打开，变成一个线性的松散结构。本来外部是亲水的氨基酸，内部是疏水的氨基酸。一旦打开之后，这些疏水的氨基酸会相互就是结合到一起。就是因为疏水的一个相互作用，然后变成一个球状聚集体。此过程会引起这个光的散射的变化。基于动态光散射的信号随着加热的过程的变化就代表粒径的变化，可以计算出蛋白质的Tm值。动态光散射用于表征蛋白质、高分子、胶束、糖和纳米颗粒的尺寸。如果系统是单分散的，颗粒的平均有效直径可以求出来，这一测量取决于颗粒的心，表面结构，颗粒的浓度和介质中的离子种类。DLS也可以用于稳定性研究，通过测量不同时间的粒径分布，可以展现颗粒随时间聚沉的趋势。随着微粒的聚沉，具有较大粒径的颗粒变多。同样，DLS也可以用来分析温度对稳定性的影响。特点：动态光散射可以做到孔板式的检测，具有比较高的通量。但是对于某些样品的检测有限制，因为并不是所有的蛋白在变异之后都会形成这种聚集体，而有一些可能需要很高的浓度才会提升，浓度较低条件下，就观察不到粒径的变化。 04 外源差示扫描荧光法（DSF）差示扫描荧光（DSF）也被称为热荧光法（ThermoFluor），是一种经济高效且易于使用的生物物理技术，通过检测当温度升高或变性剂存在时荧光发射光谱的相应变化来确定蛋白质的变性温度(热变性温度Tm值或化学变性Cm值)。Pantoliano等最先应用此技术测定了上百种蛋白质的热稳定性。差示扫描荧光法分为添加外源荧光染料与不添加荧光染料两种方式，都是利用加热使蛋白内部疏水基团暴露这一特点进行检测Tm值。传统DSF经常使用350/330比值法来进行数据分析根据荧光源不同分为内源荧光DSF和外源荧光染料DSF。基于外源染料荧光的DSF其原理是利用能与蛋白内部疏水基团相互作用的染料为荧光源。蛋白质加热变性后疏水基团暴露，疏水基团与亲和性染料结合产生荧光信号，检测荧光强度变化测定蛋白质的Tm值。特点：借助荧光定量PCR适用于高通量筛选，信号强度可控，灵敏度和准确性都较高。但添加的外源染料可能会对蛋白质结构和功能产生影响，且操作较复杂，不适用于所有蛋白研究。比如做膜蛋白研究时，溶液环境中需要添加双亲性的分子，一端疏水一端亲水。这种情况荧光分子会直接结合到疏水端，导致直接产生荧光信号。并且染料种类的选择、浓度的选择也很繁琐。外源荧光染料DSF也可能会产生背景荧光以及非特异吸附等假阳性结果。 05 内源差示扫描荧光法（inDSF）内源差式扫描荧光inDSF，基于蛋白质中特定氨基酸的荧光特性。这些氨基酸的荧光强度与其所处的微环境密切相关，因此，当蛋白质的结构发生变化时，这些氨基酸的荧光信号也会随之改变。不需要额外的荧光染料加入到检测体系中，利用蛋白内部芳香族氨基酸的自发光原理。不需要任何额外的标记或固定步骤，避免引入结果的不确定性。研究发现，蛋白质分子中芳香环氨基酸在处于不同极性的微环境时(如疏水或亲水环境中)，其被激发的内源荧光的最大发射光谱会发生位移。蛋白质中内源荧光主要来自含芳香环氨基酸如色氨酸(Trp)，苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)，其中以色氨酸内源荧光最强。当它在蛋白内部时，发射光主要在330波段，当蛋白一旦去折叠，暴露在溶剂中，发出的光就会从330波长红移到350。所以通过280激发，检测330/350的比值变化，就能测量蛋白质的Tm值。以色氨酸为例，在蛋白质疏水的内核微环境中，其内源荧光最大发射波长在330nm左右，而在亲水的极性微环境中，色氨酸的内源荧光最大发射波长则出现在350nm左右。蛋白质热变性或者化学变性通常会导致色氨酸残基周围微环境的极性发生变化，使通常被包埋于蛋白质疏水内核的色氨酸逐渐暴露于亲水的环境中，从而导致发射内源荧光最大发射波长发生红移(RedShift)，即向更大的波长区域移动。特点：内源差式扫描荧光DSF无需复杂的样品处理或标记步骤，实验过程简单方便。但不是所有蛋白质都含有足够的荧光基团，所以对于部分样品检测灵敏度不够，且检测可能会受其他基团影响。 06 技术对比总结总得来说，DSF和DLS法在样品用量及测定效率上更有优势，比较适合进行高通量筛选。但DSF法需要样品含有色氨酸、酪氨酸或额外添加荧光染料，这可能会对样品测量范围带来一定限制，DLS对样品浓度有要求。DLS还可以获取聚集体粒径大小的信息。DSC法虽然在样品用量与检测效率上不及DSF，但作为量热的经典方法仍是不可缺少的Tm值测量手段，在进行批量样品的热稳定性筛选时，可以使用DSF法初筛，DSC法复筛。此外，DSC能测定蛋白质变性过程中的热容变化ΔCp、焓变ΔH、解折叠自由能ΔG、玻璃态转变温度、分子流动临界温度等其他重要热力学参数。CD作为检测蛋白二级结构的经典方法，在Tm值测定方面具有其独特优势和一定的局限性，也是研究加热过程中蛋白结构改变的重要方法。蛋白质Tm值测定具有重要的实际应用价值，例如辅助生物药物开发、生产和质量控制，评估生物相似性、优化蛋白药物配方等，还可以作为探索蛋白质高级结构的手段之一指导蛋白质工程，如比较不同突变对蛋白质稳定性的影响，研究结构域改变与功能活性改变关联性等。比较不同Tm值测定方法，全面了解技术特点及测量效果对于Tm值测定的实际应用具有一定的指导意义，在科研或生产工作中可以灵活选用或联用多种技术来阐明不同条件下的结构变化特点。 07 国产蛋白稳定性分析仪PSA-16 北京佰司特科技有限责任公司于2023-10-01日推出了自主研发的第一款国产蛋白稳定性分析仪，该设备性能和参数达到进口设备的水平，价格却远低于进口产品，弥补了目前国产自主设备在蛋白稳定性专业研究分析领域的空白。多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16是一款无需荧光染料、高通量、低样品消耗量的检测蛋白质稳定性的设备。该设备基于内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF），通过检测温度变化/变性剂浓度变化过程中蛋白内源紫外荧光的改变，获得蛋白质的热稳定性(Tm值)、化学稳定性（Cm值）等参数。可应用于蛋白缓冲液条件筛选及优化、小分子与蛋白结合情况的定性测定、蛋白质修饰及改造后的稳定性测定、蛋白变/复性研究、不同批次间蛋白稳定性对比等多个方面。 多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16应用涵盖植物、生物学、动物科学、动物医学、微生物学、工业发酵、环境科学、农业基础、蛋白质工程等多学科领域。蛋白质是最终决定功能的生物分子，其参与和影响着整个生命活动过程。现代分子生物学、环境科学、动医动科、农业基础等多种学科研究的很多方向都涉及蛋白质功能研究，以及其下游的各种生物物理、生物化学方法分析，提供稳定的蛋白质样品是所有蛋白质研究的先决条件。因此多功能蛋白稳定性分析仪PSA-16在各学科的研究中都有重要的意义。1. 抗体或疫苗制剂、酶制剂的高通量筛选2. 抗体或疫苗、酶制剂的化学稳定性、长期稳定性评估、等温稳定性研究等3. 生物仿制药相似性研究（Biosimilar Evaluation）4. 抗体偶联药物（ADC）研究5. 多结构域去折叠特性研究6. 物理和化学条件强制降解研究7. 蛋白质变复性研究（复性能力、复性动力学等）8. 膜蛋白去垢剂筛选，膜蛋白结合配体筛选（Thermal Shift Assay）9. 基于靶标的高通量小分子药物筛选（Thermal Shift Assay）10. 蛋白纯化条件快速优化等

2010年3月23日-25日，由中国医药生物技术协会主办，大连百奥泰生物技术有限公司承办的&ldquo 第四届蛋白质和多肽大会暨生命科学仪器展览会&rdquo 在北京国家会议中心举行。大会以&ldquo 蛋白质与多肽领域的新领军者&rdquo 为主题，旨在为全球从事蛋白质和多肽研究的科学工作者、研究机构和企业搭建学术、技术和商务自由交流的平台。会议共吸引了世界40多个国家和地区的1000余人参加。 天美（中国）科学仪器公司参与了此次盛会，并展出德国IMPLEN Nanophotometer Pearl核酸蛋白分析仪及日立Hitachi CT15E微量超速离心机。市场部生化产品专家史晓春博士在大会中做了专题报告：Introduction of Implens Nanophotometer and Kurabos Nucleic Acid Extraction System。 展品介绍： 【Implen】微量核酸蛋白分析仪Nanophotometer Pearl (珍珠版) 1． 目前市场上样品使用量最少，仅需0.3微升，且新型的样品室设计使得对超微量样品的核酸、蛋白质和肽的浓度可进行精确检测。波长范围从190nm到1100nm。 2． 极宽的样品检测范围，从2ng/ul 到18750ng/ul（dsDNA)。使用不同光程的样品盖，样品可自动稀释为5倍、10倍、50倍、100倍、250倍，故无需担心稀释误差。 3． 开机无需等待，即开即用。操作时间最少，3.5秒即可完成 200nm-950nm波长的数据采集 4． 除了使用超微量比色池，也可选择使用常量比色皿（10mm光程） 5． 精度高且机器终身准确。具有密封的光路系统且无拆开部件，免去了昂贵的校正费用。使用了专利的样品压缩技术，避免样品的挥发及待测样品种类的受限。 6． 可选择不同的数据输出方式：通过内置打印机、SD-RAM卡、USB、或蓝牙输出。便于携带，可用于户外操作。 详见链接：http://www.instrument.com.cn/netshow/SH100322/C116281.htm

Postnova场流分离系统应用举例——蛋白质聚集体分离的理想解决方案 蛋白质聚集体已经成为药学发展和质检上一个重要的问题。其活性，生物利用度和可能的消极免疫响应等性能直接与不同程度的聚集态的存在有关。因此不仅FDA, 更多的官方和私人研究机构都对聚集态结构产生越来越大的兴趣。他们研究的目标是确定精确的聚集情况，即药物中的蛋白质中某个时间有多少聚集态结构形成以及如何避免这种情况。 场流分离技术是分离技术的一种，它可以与液相色谱（LC）相比。就像液相主要用来分离小分子一样，场流分离主要用来分离大分子或粒子（可称为：粒子色谱）。场流分离技术是一个独特的分离技术，所有场流分离技术都使用相同的基本分离的原则，但采用不同的分离场。根据不同分离场，场流分离技术可分为流动场流分离，沉淀场流分离，热场流分离等。 当样品注射到场流分离通道时，分离应力作用于聚合物或粒子强迫它们向通道底层移动，通道底层就被称为聚集壁。样品不能透过聚集壁，所以它们再次扩散到通道中心。扩散应力被分离应力抵消，在很短的时间（一般是30～120秒）内两种力之间就建立起一个稳定的动态平衡。大小不同的颗粒有着不同的扩散系数，所以它们在通道内由于速度梯度而被分离。注射后的粒子/聚合物由于“垂直场力”的存在，受迫向垂直于流动相流动的方向移动。小粒子由于具有较大的扩散系数将会比大粒子在通道内扩散的更深远。结果就是，小粒子在通道内被“层流”更快的定位，并因此而被洗脱出来；而大粒子则定位较慢，后洗脱出来。 上图是使用AF4非对称场流分离单克隆抗体的结果。在20分钟内，不同程度的聚集态被分开，整个分离过程由于没有固定相存在，因此蛋白质的空间结构不会被破坏。样品不需要前处理，更可以通过联用多种在线检测器（LS, UV, RI, SEM, DLS），方便迅速得到需要的数据。 场流分离技术具有以下优点： • 快速、温和的分离，可以兼容任何溶剂和缓冲液 • 超高的分辨率（±1nm） • 没有任何固定相的分离通道 • 宽分离范围：粒径1nm~100mm /分子量1000Da~1012Da • 无需前处理及过滤，直接进样复杂基质样品 • 可收集所需要的样品，方便升级至制备级 • 能够连接各种检测器，如在线串联紫外、光散射、荧光、质谱等检测器 • 可同时测定分子的分子量及粒子的粒径。 这些优点使场流分离技术在蛋白质及其聚集体分离方面可以发挥巨大的作用。 更多产品详情，敬请登陆：www.tegent.com.cn 德祥热线：4008 822 822 info@tegent.com.cn

蛋白质是细胞功能的执行者，是一切生命的物质基础。然而人们对蛋白质和蛋白质组的了解还远远不够，蛋白质分析被认为是一项复杂而艰巨的任务。2015年是蛋白质领域的关键一年，有可能决定着蛋白质分析的未来走向。 　　1.人类蛋白互作图谱取得更大的成果。最近Cell杂志上发表了一项大规模的蛋白质研究，科学家们鉴定了一万四千个蛋白相互作用，获得了迄今为止最大规模的人类蛋白互作图谱。他们计划将在未来六年中逐步完成人类基因组的全部互作图谱。这种图谱可以帮助人们更全面的了解人类互作组，进一步理解疾病的发生和发展。对新发现的蛋白互作进行研究，能够揭示基因型和表型之间的真实关系。我们期待在2015年看到这类研究结出更多硕果。 　　2.人造环境为蛋白质分析提供便利。今年八月Roy Bar-Ziv及其同事在Science杂志上发表文章，展示了以微流体DNA隔室为基础的人造细胞。这些二维的人造细胞可以实现预编程的蛋白合成、代谢和通讯，是一种非常灵活的蛋白合成系统。研究显示，人造细胞能够更好的模拟蛋白表达的动态模式，维持蛋白信号的梯度。人们可以利用这一系统来评估蛋白质的活性和相互作用，这种方法将对蛋白质功能研究产生重要的影响。 　　3. 一个时代的终结&mdash &mdash 蛋白质结构计划PSI收官。PSI项目在运行了十五年后，正逐步走向自己的终点。PSI项目已经确定了六千三百多个蛋白结构，为蛋白质分析做出了重要的贡献。那些为PSI而建的高通量蛋白生产中心可能会继续维持下去，给其他结构生物学实验室使用。结构生物学家们也可能启动与数据处理有关的中、大型项目，作为PSI的延续。 　　不管怎样，对于蛋白质领域来说明年都是特别的一年，研究者们需要决定PSI之后的前进方向。我们希望未来能有更多类似人类互作组图谱的大型项目，增进我们对蛋白质结构和功能的理解。

十一五国家科技支撑计划项目《科学仪器设备研制与开发》中 “高通量蛋白质分离检测系统的研制与开发”课题顺利通过验收 　7月9日，由国家质检总局科技司和科技部条件与财务司组织验收专家组，对中科院大连化学物理研究所主持承担，北京理工大学、大连依利特分析仪器有限公司参加的十一五国家科技支撑计划项目《科学仪器设备研制与开发》中“高通量蛋白质分离检测系统的研制与开发”课题进行了验收。国家科技部条件与财务司副司长吴学梯、国家质检总局科技司司长侯玲林、大连化物所副所长冯埃生出席了验收会。 验收会现场 课题样机 　　验收专家组成员包括北京蛋白组学研究中心钱小红研究员(组长)、科技部国家图书文献信息中心吴波尔研究员(副组长)、复旦大学张祥民教授、中国科学院化学研究所陈义研究员、大连理工大学贾凌云教授、大连医科大学王立明教授、科技部国家科技基础条件平台中心张渝英研究员、中科院遗传发育所朱祯研究员、总装军事医学研究所胡文祥研究员、中国特种设备检验研究院高云芳高级会计师、工业与信息产业部电信研究所郭士萍高级会计师、中国科学技术信息研究所吴家喜副研究员。 　　验收专家组认真、全面地听取了课题的总体执行情况报告、技术研究报告和测试专家组的技术测试报告，审阅了课题验收材料，查看了样机演示。专家组一致认为：该项目研究计划、技术路线和课题设置合理，项目实施和管理规范，经费使用合理，完成了课题合同书的各项任务指标，一致同意通过验收，同时建议国家有关部门继续给予大力支持，实现课题成果的产业化。 　　验收会后，与会领导、专家以及有关企业负责人针对高通量蛋白质分离检测系统的研制与开发的发展目标、研究方向、产品规模化生产等问题进行了深入探讨，理清了下一步研究思路，明确了后续发展方向，为高通量蛋白质分离检测系统产业化的实现奠定了良好基础。

p 　　早前，美国ProteinSimple公司推出全球第一款可以对循环肿瘤细胞、外泌体等微量样本进行蛋白质表达水平定量检测的Milo系统。一经推出，此产品立即获得《The Scientist》杂志年度创新产品第一名、生物通2016年度生命科学十大创新产品奖、中国仪器协会年度创新新产品奖等。它的发明人之一Kelly Gardner博士也获得MIT Technology Review 35岁以下创新人才奖。 /p p style=" text-align: center " img width=" 400" height=" 284" title=" 1.jpg" style=" width: 400px height: 284px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/b89d84ca-1b3f-49c0-b5b1-82a689442e01.jpg" border=" 0" vspace=" 0" hspace=" 0" / /p p 　　通过检测血液中的循环肿瘤细胞(CTC)及循环肿瘤DNA发展起来的液体活检，对于肿瘤病人无痛诊断及靶向治疗有非常重要的意义。各国科学家在CTC富集、DNA测序和DNA分析方面做了很多的工作，但是CTC蛋白质研究一直因为检测灵敏度问题停滞不前，影响CTC在肿瘤诊断及治疗中发挥更重要的作用。 /p p 　　美国ProteinSimple Milo系统的推出解决了这一问题。最近，加州大学伯克利分校和斯坦福大学医学院的研究人员利用Milo系统在《Nature Communications》上发表文章，证实在一次普通的抽血后(2-4 ml血液)，可对血样中罕见的CTC进行蛋白质表达水平分析，以检测其中一组与癌症相关的蛋白质。 /p p 　　实验方案如下：科学家们从乳腺癌患者的血液中分离出循环肿瘤细胞，然后将循环肿瘤细胞接种到Milo芯片western blot细胞捕获孔中。微流体设备裂解细胞，让其内容物流出，之后进行电泳将蛋白质根据分子量大小进行分离。然后在凝胶中原位捕获蛋白，再进行抗体孵育杂交，最后通过荧光信号值进行定量，检测了癌症蛋白标志物的含量。 /p p style=" text-align: center " img title=" 2.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/1045381e-1f3a-40c1-a07f-82df916660d6.jpg" / /p p style=" text-align: center " (图片来自Nature Communications) /p p 　　这项研究检测的蛋白靶标有12个，包括已被用于癌症分型(如ER、HER2、EGFR)、循环肿瘤细胞鉴定(如EpCAM、panCK、CK8)、白细胞标记(如CD45)的蛋白和普遍表达于哺乳动物细胞的蛋白(GAPDH、β-tubulin、mTOR、ERK-1/2、eIF4E)。研究者计划将这一名单继续扩大，以便最终能够更精确地对癌细胞进行分类，选择针对的靶向治疗药物。 /p p style=" text-align: center " img title=" 3.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/60121d8a-3a5f-4b8b-9f0f-453af71e6bed.jpg" / /p p style=" text-align: center " (图片来自Nature Communications) /p p 　　这篇文章的通讯作者、加州大学伯克利分校的Amy Herr表示：“微流体设计是本研究的关键。我们能够将每个阶段所需的功能整合在一起。这样，我们才能很快、很快地开展每一步。如果慢一点，细胞中的蛋白质将弥散，变得无法检测。” /p